EP2576608A1 - Fraction de protéines et peptides issus du blanc d'oeuf et protéine issue du blanc d'oeuf et leur utilisation comme agent anti-listeria - Google Patents

Fraction de protéines et peptides issus du blanc d'oeuf et protéine issue du blanc d'oeuf et leur utilisation comme agent anti-listeria

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Publication number
EP2576608A1
EP2576608A1 EP11723948.3A EP11723948A EP2576608A1 EP 2576608 A1 EP2576608 A1 EP 2576608A1 EP 11723948 A EP11723948 A EP 11723948A EP 2576608 A1 EP2576608 A1 EP 2576608A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fraction
protein
egg white
heparin
molecule
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11723948.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sophie Rehault-Godbert
Yves Nys
Joël GAUTRON
Valérie LABAS
Emmanuelle Helloin
Cindy Slugocki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP2576608A1 publication Critical patent/EP2576608A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a fraction of proteins and / or peptides derived from egg white and having anti Listeria monocytogenes activity.
  • the invention also relates to a specific molecule, derived from the egg white, namely the OVAX protein, for its antimicrobial action and more particularly for its targeted action against Listeria monocytogenes.
  • the invention finds applications particularly in the field of agri-food, for example during the development of food products for everyday consumption, such as cold cuts and cheeses, in order to eliminate all traces of Listeria monocytogenes in these products. products.
  • the invention also has applications in the pharmaceutical field, for example for the preparation of medicaments for treating and / or preventing conditions related to Listeria monocytogenes, such as Listeriosis.
  • Listeria monocytogenes is a bacterium found in soil, vegetation, water, wastewater, silage products and human and animal feces. Some animals may carry the bacteria without their knowledge, without being sick. These healthy carriers can be the source of food contamination, such as milk and meat, and by-products. In particular, this bacterium is found repeatedly in cold cuts and raw milk cheeses. Listeria monocytogenes can then cause a condition called Listeriosis, related to food poisoning. Listeriosis can have serious consequences, especially in pregnant women and the elderly or whose immune system is weakened.
  • Listeria monocytogenes is known to be sensitive to certain antibiotics, including ampicillin and arnoxicillin. Since persons receiving listeriosis treatment in case of illness are fragile individuals, it is known to treat them via a pool of antibiotics, and in particular penicillin, streptomycin and sulphonamides. This treatment can be prolonged with lactams.
  • the invention proposes to use a molecule having antimicrobial activity against Listeria monocytogenes.
  • the molecule according to the invention is derived from a protein present in the egg, in particular of hen, and more particularly in egg white, known to contain numerous proteins and peptides having effects against bacteria, and in particular enzymes, such as lysozyme.
  • the protein of interest hereafter called OVAX, for "ovalbumin-related protein X" has also been identified, in smaller amounts, in egg yolk, eggshell, yolk sac, etc.
  • OVAX The corresponding amino acid sequence of OVAX has been identified, so that it is possible to use the native protein, that is to say isolated from the chicken egg, but also the protein recombinant.
  • the invention has also made it possible to demonstrate that a fraction of peptides and / or proteins derived from chicken egg white and able to bind heparin-sepharose (or heparin coupled to any other resin), has an activity anti Listeria monocytogenes.
  • the invention made it possible to identify the peptides and proteins of this fraction, fifteen in number, and which comprises in particular OVAX which advantageously represents at least 50%, more precisely at least 56%, in proportion to this fraction.
  • the anti Listeria monocytogenes activity of the OVAX protein and of the fraction according to the invention is preserved after digestion by certain digestive enzymes and in particular by trypsin or chymotrypsin.
  • trypsin is a digestive enzyme present in gastric juice in humans and in mammals
  • chymotrypsin is a digestive enzyme present in the pancreas of men and mammals. Both participate in the digestion of proteins contained in the diet ingested by the animal, human or non-human.
  • the invention therefore relates to a molecule of amino acid sequence SEQ ID No. 1, for its antimicrobial activity, and more particularly against Listeria monocytogenes.
  • sequence SEQ ID No. 1 corresponds to the amino acid sequence of the OVAX protein.
  • the inventors have discovered that the molecule according to SEQ ID No. 1 has a particular affinity for heparin, a negatively charged glycosaminoglycan, and could therefore bind to negatively charged surfaces such as the lipopolysaccharide of certain Gram-negative bacteria. , and the peptidoglycan of certain Gram-positive bacteria (due to the presence of teichoic acid).
  • the bond between at least one of these positively charged sequences and the surface of a negatively charged microorganism results in destabilization of the wall of said microorganism, leading to its lysis.
  • the molecule according to the invention is therefore able to inhibit the growth of such microorganisms.
  • the invention is particularly directed to the molecule of sequence SEQ ID No. 1 for its anti-Listeria monocytogenes action, as is more specifically set out below.
  • the invention also relates to a composition comprising a molecule of sequence SEQ ID No. 1, as an antimicrobial active principle and especially as an anti-Listeria monocytogenes active ingredient.
  • composition according to the invention comprising the antimicrobial molecule of amino acid sequence SEQ ID No. 1, may especially be intended for the manufacture of an anti-Listeria monocytogenes drug.
  • a composition may in particular be a solution intended to be ingested, and comprising the required excipients. Otherwise, the composition may be a powder to be suspended later, or to be packaged such as, in capsule form.
  • composition according to the invention can also be used for the manufacture of food, intended for animal feed, human or non-human, as an anti-Listeria monocytogenes food additive.
  • the composition is then used during the method of manufacturing the food product, said composition being added to the preparation intended to form the food product, during its preparation.
  • the composition can be used as a food additive during the preparation of sausages such as pâtés, rillettes, sausages, etc.
  • the composition may also be added to milk for use in making cheese.
  • the composition is added to the preparation after any cooking step and / or any step in which said preparation is subjected to temperatures above 60 ° C.
  • SEQ ID No. 1 in the composition may be between 15 g / mL and 400 g / mL, and preferably between 20 g / mL and 100 g / mL. Even more preferably, the concentration of the molecule of sequence SEQ ID No. 1 in the composition is between 25 g / ml and 60 g / ml.
  • the invention also relates to a fraction of peptides and / or proteins, derived from egg white and able to bind heparin, for its action against Listeria monocytogenes.
  • egg white it is meant that the peptides and proteins present in the fraction according to the invention are all in the egg white, and can be obtained from the egg white.
  • these peptides and proteins may have been obtained otherwise than by purification from egg white, and in particular by chemical synthesis or produced in recombinant form.
  • the fraction according to the invention is likely to comprise all or part of the peptides and / or proteins derived from egg white that can bind to heparin.
  • This fraction may contain some contaminating molecules of ovalbumin, a major protein of egg white, which represents more than 50% of the total protein present in the egg white, and which does not have any affinity for the egg white. heparin.
  • peptide and protein molecules were isolated directly from chicken egg white, by affinity chromatography using heparin-sepharose beads, then identified by mass spectrometry.
  • the fraction according to the invention thus comprises at least one of the peptides and proteins below (the references G1 below are extracted from the NCBI database, updated in April 2011):
  • the OVAX with a molecular weight of approximately 45 kDa, more precisely approximately 44 kDa, of sequence SEQ ID No. 1, and which has 1 HBS binding site heparin;
  • Lysozyme C (Gl: 229157), with a molecular weight of approximately
  • beta-defensin 11 (Gl: 49169808), with a molecular weight of approximately 12 kDa; this molecule seems to have no binding HBS consensus site heparin, which also suggests that it has one or more conformational binding sites to heparin;
  • the TENP protein (Gl: 46048814) with a molecular weight of approximately 47 kDa; this molecule seems to have no heparin-binding HBS consensus site, which suggests that it also has one or more conformational binding sites to heparin;
  • cyclophilin B (peptidylprolyl isomerase B) (Gl: 45382027) with a molecular weight of about 22 kDa and having a heparin-binding HBS consensus site;
  • Vmo-I protein for "vitelline membrane Outer Layer Protein I"
  • ovotransferrin Conalbumin
  • Gl 71274075
  • ovocleidine 17 (Gl: 31615312), with a molecular weight of approximately 15 kDa and having no heparin-binding HBS consensus site, which suggests that it also has one or more conformational binding sites at heparin;
  • ovalbumin (Gl: 28566340), with a molecular weight of approximately 43 kDa and having a heparin binding HBS consensus site;
  • Clusterin (Gl: 45382467), with a molecular weight of about 51 kDa and having 2 heparin binding HBS sites;
  • heparin conformational binding site is meant a specific exposure of positively charged amino acids, when the molecule is shaped, and forming a site capable of binding to heparin.
  • the fraction according to the invention comprises at least the molecule of sequence SEQ ID No. 1 which corresponds to the sequence of OVAX as isolated from the egg white.
  • the fraction may otherwise or also comprise the OVAX molecule of sequence SEQ ID No. 2, which corresponds to the known sequence which has been predicted from the bioinformatic analysis of the chicken genome, and which is identified in FIG. NCBI database by the reference XP_418984.2, in the name of the similar to Ovalbumin-related protein Y (Gene Y protein), named OVAXdb in Figure 3.
  • the fraction according to the invention may advantageously comprise all of the peptides and proteins derived from egg white and able to bind heparin, as listed above.
  • the molecule with the sequence SEQ ID No. 1 and / or sequence SEQ ID No. 2 represents at least 50% in proportion to the molecules of the fraction.
  • Such a fraction can then be obtained directly by passing the egg white on heparin-sepharose affinity chromatography (or heparin-agarose), and used such that.
  • the fraction resulting from this chromatography comprises, in fact, more than 50%, and even more than 56%, of OVAX ( Figure 1, track 5 -HB-EW, task around 45-50 kDa). It is the quantification of the pixels of the 50 kDa band of the gel relative to the total pixel number of the well which made it possible to estimate the quantity of the OVAX molecule in this fraction at least 50%, and even at least 56%, in proportion.
  • OVAX in the other bands, but the OVAX being then with other molecules, we can not quantify the part due to the OVAX
  • this fraction in the food industry or in the medical field, may be direct, since the egg is a foodstuff commonly used by humans, and whose safety, except for people with allergies, is recognized.
  • all or part of the molecules of the fraction according to the invention can also be obtained by chemical synthesis or in the form of a recombinant protein, in particular from the sequence corresponding peptide, since the genome of the hen has already been fully sequenced.
  • the subject of the invention is also a composition comprising the fraction of peptides and / or proteins according to the invention as active principle against Listeria monocytogenes.
  • the fraction of peptides and / or proteins according to the invention can be used as an active ingredient against Listeria monocytogenes, for the production of a medicinal, food or other composition.
  • the total concentration of peptides and / or proteins derived from egg white and able to bind the heparin in the composition may be between 15 g / mL and 400 ⁇ g / mL, and preferably between 20 g / mL and 100 g / mL. Even more preferably, the concentration of these molecules in the composition is between 25 g / ml and 60 g / ml.
  • total concentration is meant the cumulative concentration of each of the peptides and / or proteins according to the invention present in the fraction used to produce the composition.
  • the fraction present in the composition is digested with at least one digestive enzyme, preferably with trypsin or with chymoptrypsin, prior to its use.
  • composition based on the peptide and / or protein fraction according to the invention may in particular be intended for the manufacture of an anti-Listeria monocytogenes drug.
  • a composition may be a solution intended to be ingested, and containing the required excipients.
  • the composition may be a powder, and in particular an egg white powder optionally enriched in the fraction according to the invention, to be subsequently suspended, or to be packaged in capsule form.
  • composition according to the invention can also be used for the manufacture of food, intended for animal feed, human or non-human, as an anti-Listeria monocytogenes food additive.
  • the composition is then used during the method of manufacturing the food product, said composition being added to the preparation intended to form the food product, during its preparation.
  • the composition can be used as a food additive during the preparation of sausages such as pâtés, rillettes, sausages, etc.
  • the composition may also be added to milk for use in making cheese.
  • the composition is added to the preparation after any cooking step and / or any step in which said preparation is subjected to temperatures above 60 ° C.
  • Figure 1 is a photograph of an SDS-PAGE gel showing protein migration from chicken egg white; thus, trypsin alone (T-lane), chymotrypsin alone (CT-lane), egg-white proteins as a whole (EW-lane), proteins of egg-white fraction not binding heparin (HUB-EW lane), proteins of the heparin-binding egg-white fraction (HB-EW lane), proteins of the heparin-binding egg white fraction after digestion with trypsin ( HB-EW-T lane), and heparin-binding proteins of the egg white fraction after chymotrypsin digestion (HB-EW-CT lane).
  • Figure 2 is a photograph of an SDS-PAGE gel of the different steps of a first mode of OVAX purification; the first track (1) represents the egg white; the second track (2) the eluted fraction of heparin-sepharose; the third lane (3), the unbound fraction of biotin-sepharose; and the fourth track (4) the peak corresponding to the OVAX after molecular sieving.
  • FIG. 3 is an alignment of amino acid sequences between the OVAX sequence from the NCBI database (OVAXdb, XP_418984.2 Gl: 118086485) and the sequence predicted by the Genemark software of the Institute of Technology. from Georgia (http://exon.gatech.edu/eukhmm.cgi) (OVAXgs) from the nucleotide sequence corresponding to the OVAX gene (reference NW_001471638.1 in the NCBI database).
  • FIG. 4 comprises two graphs (FIGS. 4A and 4B) respectively showing the antimicrobial activity in liquid medium of Ovalbumin and of OVAX resulting from the first purification mode with respect to Listeria monocytogenes.
  • the growth of Listeria monocytogenes was followed at 600 nm for 20 hours without Ovalbumin / OVAX or with increasing concentrations of Ovalbumin / OVAX.
  • Figure 5 shows five graphs ( Figures 5A to 5E) showing the anti Listeria monocytogenes activity, in liquid medium, of different egg white samples at different concentrations.
  • Figure 5A shows the anti Listeria monocytogenes activity of pure egg white
  • Figure 5B shows the anti Listeria monocytogenes activity of the non-heparin-binding egg white fraction
  • Figure 5C shows the anti Listeria monocytogenes activity of the heparin-binding egg white fraction
  • Figure 5D shows the anti Listeria monocytogenes activity of the heparin-binding egg white fraction, after digestion with trypsin
  • Figure 5E shows the anti Listeria monocytogenes activity of the heparin-binding egg white fraction after digestion with chymotrypsin.
  • FIG. 6 is a photograph of an SDS-PAGE gel made at the end of a second purification mode of the OVAX, the only track representing the final fraction obtained.
  • FIG. 7 is a photograph of an agar medium showing the anti Listeria monocytogenes activity of the OVAX from the second purification mode, at different concentrations, relative to Beta-defensin 11 (positive control) and Ovalbumin (negative control)
  • the egg whites were collected from several eggs from laying hens (Isa-Hendrix, St Brieuc, France) and diluted 1 ⁇ 2 in 50 mM Tris-HCl buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4.
  • the sample was gently homogenized and centrifuged at 14,000 g for 10 minutes at 4 ° C.
  • Heparin-Sepharose chromatography was performed using the "batch” technique according to the supplier's instructions (GE Healthcare brand, distributed by Fischer Scientific, W7346E).
  • the proteins without affinity for heparin-sepharose are removed by successive washings in 50 mM Tris-HCl buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4 and centrifugation of the beads for 5 minutes at 1500 g. at 4 ° C.
  • the beads are then loaded onto two 5-mL polypropylene columns (Qiagen, Courtaboeuf, France, 34964).
  • the elution of the affine proteins is carried out in 50 mM Tris-HCl buffer,
  • the most concentrated elution fractions are pooled and dialyzed for 24 hours against 50 mM Na Phosphate buffer, 50 mM NaCl, pH 7.4 (PBS) in dialysis membranes (3500 Da exclusion) (Brand Spectrum, distributed by Fischer Scientific, 132720).
  • the sample is centrifuged at 10000 g for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is then loaded onto a 1 mL polypropylene column, in which 1.5 mL of agarose beads coupled to biotin (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France, B0519) were previously equilibrated in buffer PBS.
  • the non-fixed column is recovered and concentrated on 3500 Da exclusion cell (Millipore, UFC900324). This step allows the elimination of avidin from the sample, the latter having a high affinity for biotin.
  • the concentrated sample is then injected onto a TSK-gel filtration exclusion chromatography G3000SW (Tosoh Bioscience, Hampton, UK) pre-equilibrated in PBS buffer.
  • the major peak corresponding to OVAX is collected and concentrated on 3500 Da exclusion cell (Millipore, UFC900324).
  • Proteins were separated by SDS-PAGE under reducing conditions and stained with Coomassie blue.
  • the 45 kDa major band was extracted from the gel and rinsed with water and acetonitrile.
  • Proteins were reduced with dithiothreithiol, alkylated with iodoacetamide and digested with trypsin (12.5 ng / L) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) overnight at 37 ° C in 25 mM NH 2 HCO 3 buffer. according to the protocol described by Shevchenko et al.
  • the peptide extracts were then dried.
  • MALDI-TOF mapping (Matrix Assisted Laser Desorption-lonization-Time of Flight)
  • NanoLC-MS / MS analysis was conducted using a CapLC system coupled to a quadrupole time-of-flight hybrid mass spectrometer (Q-TOF Ultima Global, Waters, Manchester Great Britain) equipped with a source of Z-spray ion.
  • the device is calibrated with a solution of GluF at 500 fmol / L (50% of an acid solution formic 1% / 50% acetonitrile, v / v).
  • the samples are desalted and concentrated in line by a precolumn (Monolithic trap column, 200 ⁇ id X 5mm (PS-DVB), Dionex, ref 163972).
  • the peptides were separated on a reverse phase capillary column (Acclaim PepMap 100 C18, 5 ⁇ , 75 ⁇ m I.D., 25 cm long, Dionex) with a flow rate of 200 nL / min.
  • the gradient profile is as follows: Equilibration of the columns with 95% solvent A (0.1% formic acid / 2% acetonitrile / 98% H2O, v / v) and 5% solvent B (0.1% formic acid / 20% H2O / 80% acetonitrile, v / v), Gradient from 5 to 55% B in 80 min; Bearing at 95% B for 10 min.
  • the acquisition of data is done automatically between the MS and MS / MS (fragmentation) modes: an MS survey scan is followed by three MS / MS scans on the three peaks detected the most intense.
  • the collision energy is selected based on the mass and charge of the ion.
  • the raw data is processed by ProteinLynx Global Server V 2.2.5 (PLGS) software to create .pkl files with all precursors selected for fragmentation as well as the list of associated fragment ions.
  • PLGS ProteinLynx Global Server V 2.2.5
  • the sample is sonicated a few minutes before depositing on the target.
  • the matrix used is a solution of CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid) at 5 mg / ml in 50% ethanol / 50% acetonitrile / 0.1% TFA / 10 mM 18-C-6 crown ether.
  • the MALDI-TOF device was calibrated externally with peptides from tryptic digestion of BSA (Bovine Serum Albumin) at 300 fmol / L.
  • the MALDI-TOF spectra are obtained using a MALDI L / R P / N mass spectrometer (Waters, Manchester, UK).
  • the analyzes were carried out: in positive mode, in reflectron mode, with an acceleration voltage of 15 KV, draws Voltage: 2226, with a mass range (m / z) of 500 Da to 5000 Da.
  • the computer processing of the spectra is done using the software MassLynx V4.0 (Waters).
  • MS / MS were confronted with a non-redundant database (NCBInr 20071102, then 20110403) and using the MASCOT software (Matrix Science UK, http://www.matrixscience.com).
  • Enzymatic specificity was established as trypsin, including two missing cleavages.
  • variable modifications were selected: carbamidomethylcysteine and oxidation of methionine.
  • the search was performed in all taxonomies. Mass accuracy was set to ⁇ 0.3 Da.
  • the candidate proteins were validated when the individual scores of the ions had a level of significance greater than p ⁇ 0.05.
  • Proteins were separated by SDS-PAGE under reducing conditions and transferred to polyvinylidene membrane.
  • the major band (40 kDa) was excised from the gel and analyzed by Edman sequencing.
  • amino-terminal sequence of the protein was determined by automatic degradation of Edman using the LF 3000 sequencer (Beckman / Porton) equipped with an on-line Gold HPLC System HPLC system, Beckman Coulter) for the detection of derivatives amino-acids-Phenylthiohydantoin.
  • the prediction of the OVAX sequence was made from the gene sequence available on the site "Ensembl” (http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/lnfo/lndex, ENSGALG00000019551), then later from the sequence referenced in the NCBI database under number NW_001471638.1, using the Genemark software (Georgia Institute of Technology (http://exon.biology.gatech.edu/).
  • EW Egg white
  • HAB-EW non-heparin binding
  • HB-EW heparin binding
  • the protein concentration was determined using the Protein DC test (Biorad, Saint-Quentin, France) with bovine serum albumin (Interchim, Montlucon, France) as a control.
  • HB-EW samples (0.9 mg / mL) were digested with either 5.5 ⁇ trypsin (HB-EW-T) or 1 ⁇ M chymotrypsin (HB-EW-CT).
  • the bacterial strain EGD of Listeria monocytogenes was preserved by freezing in liquid nitrogen in the medium Broth Brain Heart (Oxoid, Hampshire, England) containing 15% (v / v) glycerol.
  • the bacterial strain was cultured overnight at 37 ° C in Tryptone Soy broth (TSB, Oxoid) without shaking.
  • the culture was then incubated at 37 ° C with shaking and the optical density was measured regularly at 600 nm to obtain mid-exponential phase bacteria (about 1. 8 CFU.mL- 1 after about 5 hours). 'incubation).
  • bacterial growth was monitored in the presence of different concentrations of Ovalbumine or OVAX (0-400 g / mL) using Bioscreen C plate reader coupled to Biolink (Oy Growth Curves Ab) software. Ltd.) in the TSB culture medium.
  • Each egg white fraction (EW, HUB-EW, HB-EW, HB-EW digested with trypsin or chymotrypsin) was added at different concentrations.
  • EW, HUB-EW, HB-EW, HB-EW digested with trypsin or chymotrypsin was added at different concentrations.
  • increasing concentrations of trypsin were added after two successive dilutions of the heparin-binding egg-white fraction (HB-EW) to obtain concentration of 0.9 g / ml of HB-EW and 5.5 ⁇ of trypsin.
  • Figure 1 is a photograph of a gel of egg white proteins, at different levels of purification.
  • the third track (EW) represents the migration of egg white proteins as a whole.
  • the fifth track represents a fraction according to the invention, namely the fraction of heparin-sepharose-binding proteins and peptides of egg white.
  • This first purification makes it possible in particular to eliminate ovalbumin, a major protein in the egg white (the fourth track, HUB-EW, shows the proteins of the egg white that does not bind heparin). It appears that this fraction contains mainly a protein of molecular weight of about 45 kDa.
  • the same band at approximately 45 kDa is obtained during the successive steps of purification of the protein fraction and peptides from the egg white and binding the heparin, as can be seen in FIG. 2.
  • the purification on heparin-sepharose ( lane 2), followed by purification on biotin-agarose (lane 3) and gel filtration (lane 4) allows the protein of molecular weight 45 kDa to be isolated.
  • Lane 4 represents a 92% pure protein, identified as OVAX.
  • the majority of contaminants in this fraction represent OVAX multimers (high masses appearing on the gel).
  • a western-blot analysis has shown that they react with anti-ovalbumin antibodies and disappear after reduction in the presence of beta-mercaptoethanol.
  • the concentration of OVAX is estimated at about 0.5 mg / mL of egg white as a minimum, which makes it possible to envisage numerous applications, particularly in the field of the food industry, directly by purification of the protein from egg white. 1 / 3.2- Identification of the OVAX
  • the identification by mass spectrometry and sequencing made it possible to isolate and identify a protein of sequence SEQ ID No. 1, corresponding to the previously isolated OVAX, which has a sequence that is almost identical to the predicted sequence already known (SEQ ID No. 2) from the bioinformatic analysis of the chicken genome, and available in the NCBI databases.
  • sequence SEQ ID No. 1 (OVAXgs) has a difference over five amino acid residues with respect to the sequence SEQ ID No. 2 ( OVAXdb).
  • the graphs in FIG. 4 make it possible to draw a parallel between the action over time of Ovalbumin (FIG. 4A) and OVAX (FIG. 4B) against Listeria monocytogenes, at increasing concentrations of these molecules, in a liquid medium. .
  • Ovalbumin for concentrations below 400 g / mL.
  • the effect observed at 400 g / mL is very weak.
  • OVAX is observed to have an anti-Listeria monocytogenes activity of 25 mg / ml, at least during the first 10 hours of the test. With 50 g / mL of OVAX, the anti-Listeria monocytogenes activity persists beyond 15 hours.
  • the graphs in FIG. 5 make it possible to draw a parallel between the anti-Listeria monocytogenes activity of the egg white (FIG. 5A-EW) and the fraction of egg white that does not bind heparin (FIG. 5B-HUB).
  • -EW of the heparin-binding egg-white fraction
  • FIG. 5D-HB-EW of the heparin-binding egg-white fraction
  • Figure 5E-HB-EW-CT the fraction of heparin-binding egg white after digestion with chtmotrypsin
  • Egg white like the egg-white fraction that does not bind heparin, have similar activity profiles. No significant anti-Listeria monocytogenes activity was observed, even at concentrations above 400 g / mL.
  • An intermediate action against Listeria monocytogenes is obtained from 28 pg / ml, this action being near-optimal at 56 g / ml.
  • a second mode of purification of the OVAX protein has been implemented, in order to obtain the protein with a higher degree of purity.
  • the antimicrobial activity thus obtained was tested in agar medium, as detailed below.
  • OVAX was purified from chicken egg white.
  • Freshly laid chicken eggs (ISA Brown, Hendrix Genetics, Saint-Brieuc, France) were collected, broken, whites and yellows were independently sampled.
  • the egg whites were pooled and the resulting mixture was diluted 1/2 in 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4 and homogenized. The mixture was then centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C for 10 minutes to remove the viscous proteins. The supernatant was stored at -20 ° C.
  • the first purification step is a heparin-Sepharose type affinity chromatography: 30 ml of the supernatant obtained from egg whites prepared as indicated above were diluted by 1 ⁇ 2 in 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.4, and incubated overnight at 4 ° C with heparin-coupled sepharose beads (GE Healthcare, Uppsala, Sweden).
  • the sepharose beads were washed extensively with a buffer
  • the eluted fractions were concentrated on concentration membrane (Millipore, Ireland, UFC800324) and the resulting sample was injected onto a Sephacryl S-100 High Resolution column, Hi-prep 16/60 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) pre-equilibrated in 50 mM Tris-HCl buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4.
  • the major peak containing OVAX was then passed on a biotin-Sepharose type affinity column pre-equilibrated in 50 mM Tris-HCl buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4, in order to remove all traces of avidin in the sample, the OVAX being recovered in the unbound fraction of the biotin beads.
  • the results show a heterogeneous band of 40 to 50 kDa apparent mass, the theoretical mass of the OVAX being 44.2 kDa.
  • the peptides resulting from this digestion were analyzed by a nanoHPLC CapLC system (Waters, Manchester, UK) coupled to a Q-TOF Ultima Global mass spectrometer (Waters Micromass, Manchester, UK) equipped with a Z-ion source. -Spray.
  • the apparatus was calibrated with a solution of GluF at 500 ⁇ mol / ⁇ l (50% of a 1% formic acid / 50% acetonitrile solution, v / v).
  • the tubes containing the digestion products were brought to dryness and 15 ⁇ l of buffer A (0.1% formic acid / 2% acetonitrile / 98% H 2 O, v / v) were added. Samples were desalinated and concentrated online by a precolumn (Monolithic trap column, 200 ⁇ id X 5mnn (PS-DVB), Dionex, ref 163972).
  • the peptides were separated on a reverse phase capillary column (Acclaim PepMap 100 C18, 5 ⁇ , 75 ⁇ I.D., 25 cm long, Dionex) with a flow rate of 200 nL / min.
  • the gradient profile is as follows:
  • the raw data was processed by ProteinLynx Global Server V 2.2.5 software (PLGS) to create .pkl files containing all precursors selected for fragmentation as well as the list of associated fragment ions.
  • PLGS ProteinLynx Global Server V 2.2.5 software
  • the experimental data was compared to a database using the MASCOT software available on the local server.
  • the anti-L activity / 'ster / a monocytogenes OVAX purified as described above was measured by the radial diffusion test according to the method described by Lehrer et al.
  • Beta-defensin 11 was used as a positive control (Hervé et al).
  • Bacteria Listeria monocytogenes were incubated overnight with shaking at 37 ° C. The preculture obtained was then diluted in TSB (Tryptone Soy Broth) until the optical density measured at 600 or 620 nm was 0.02 so as to standardize the culture conditions. The culture was incubated for 4 hours at 37 ° C. with stirring to to obtain a culture in exponential growth phase. The bacteria were then centrifuged at 900 g for 10 min at 4 ° C., then washed once with cold 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) and resuspended in 10 ml of this same buffer.
  • TSB Teryptone Soy Broth
  • This bacterial suspension was then measured so as to determine the volume to be taken to obtain 7.5.10 6 cfu of bacteria.
  • This latter volume was mixed with 25 ml of "underlay" medium (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.03% [w / v] BH I, 1% [w / v] agarose weak electro-endosmosis [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France] and 0.02% Tween-20) preheated to 46 ° C.
  • underlay medium 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.03% [w / v] BH I, 1% [w / v] agarose weak electro-endosmosis [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France] and 0.02% Tween-20
  • the agarose solution containing 7.5 ⁇ 10 6 cfu of bacteria was cast into a petri dish to form a uniform 1 mm layer. 36 wells (3 mm in diameter) regularly spaced were dug into the agar using a punch.
  • the petri dish was incubated at 37 ° C for 3h, to allow the molecules to diffuse into the gelose medium containing the bacteria.
  • the first layer of agar medium (underlay) was then covered with 25 ml of "overlay" medium (10 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, containing 6% [weight / volume] BHI and 1% [weight / volume] agarose ). After overnight incubation at 37 ° C, the diameter in mm of the inhibition zone around each well was determined by the difference between the diameter of the clear zone around the well and the diameter of the well. The larger the diameter, the more active the molecule is against Listeria monocytogenes.
  • ovalbumin gene family Structure of the X gene and evolution of duplicated gene split. Cell 20: 625-37.

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Abstract

L'invention concerne une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, pour son action anti- Listeria monocytogenes. L'invention concerne également une molécule de séquence SEQ ID n°1 pour son action anti-microbienne, et notamment anti- Listeria monocytogenes.

Description

FRACTION DE PROTÉINES ET PEPTIDES ISSUS DU BLANC D'ŒUF ET PROTÉINE ISSUE DU BLANC D'ŒUF ET LEUR UTILISATION
COMME AGENT ANTI-LISTERIA
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne une fraction de protéines et/ou peptides issus du blanc d'oeuf et présentant une activité anti Listeria monocytogenes. L'invention concerne également une molécule spécifique, issue du blanc d'œuf, à savoir la protéine OVAX, pour son action anti-microbienne et de manière plus particulière pour son action ciblée contre Listeria monocytogenes.
L'invention trouve des applications notamment dans le domaine de l'agro-alimentaire, par exemple lors de l'élaboration de produits alimentaires de consommation courante, tels que les charcuteries et les fromages, afin d'éliminer toute trace de Listeria monocytogenes dans ces produits. L'invention trouve également des applications dans le domaine pharmaceutique, par exemple pour la préparation de médicaments destinés à traiter et/ou prévenir les affections liées à Listeria monocytogenes, telles que la Listériose.
ETAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLEMES RENCONTRES
Listeria monocytogenes est une bactérie présente dans le sol, la végétation, l'eau, les eaux usées, les produits d'ensilage et les matières fécales humaines et animales. Certains animaux peuvent être porteurs de la bactérie à leur insu, sans être malades. Ces porteurs sains peuvent être à l'origine de la contamination d'aliments, tels que le lait et la viande, et les produits dérivés. Notamment, on retrouve de manière récurrente cette bactérie dans les charcuteries et les fromages au lait cru. Listeria monocytogenes peut alors être à l'origine d'une affection appelée Listériose, apparentée à une intoxication alimentaire. La Listériose peut avoir des conséquences graves, notamment chez les femmes enceintes et les personnes âgées ou dont le système immunitaire est affaibli.
Jusqu'à présent, hormis par des règles d'hygiène strictes, et une cuisson à cœur des aliments et denrées susceptibles d'être porteurs du germe, il n'est pas possible de garantir l'absence de Listeria monocytogenes dans un aliment.
On sait que Listeria monocytogenes est sensible à certains antibiotiques, et notamment à l'ampicilline et l'arnoxicilline. Dans la mesure où les personnes devant recevoir un traitement contre la Listériose en cas d'affection sont des personnes fragiles, il est connu de les traiter via un pool d'antibiotiques, et en particulier la pénicilline, la streptomycine et les sulfamides. Ce traitement peut être prolongé avec des lactamines.
Malgré ce traitement lourd, et souvent long, les résultats restent aléatoires et dépendent surtout de l'état du système immunitaire du patient.
Par ailleurs, dans la mesure où la résistance, voire la multi résistance, des bactéries aux antibiotiques est de plus en plus fréquente, il est important de trouver une alternative à ce traitement, afin de pallier une telle éventualité et/ou éviter qu'elle ne s'installe pour Listeria monocytogenes.
EXPOSE DE L'INVENTION
Dans l'invention, on cherche à résoudre au moins partiellement au moins un des problèmes exposés ci-dessus, en fournissant un nouveau composé susceptible d'agir contre Listeria monocytogenes.
Pour cela, l'invention propose d'utiliser une molécule ayant une activité antimicrobienne dirigée contre Listeria monocytogenes. La molécule selon l'invention est issue d'une protéine présente dans l'œuf, notamment de poule, et plus particulièrement dans le blanc d'œuf, connu pour comporter de nombreuses protéines et des peptides ayant des effets contre les bactéries, et notamment des enzymes, tel que le lysozyme. La protéine d'intérêt, appelée par la suite OVAX, pour « ovalbumin-related protein X » a également été identifiée, dans des quantités moindres, dans le jaune d'œuf, la coquille d'œuf, la membrane vitelline etc.
La séquence d'acides aminés correspondante de l'OVAX a été identifiée, de sorte qu'il est possible d'utiliser la protéine native, c'est-à-dire isolée à partir de l'œuf de poule, mais également la protéine recombinante.
L'invention a également permis de démontrer qu'une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf de poule et aptes à lier l'héparine-sépharose (ou l'héparine couplée à toute autre résine), présente une activité anti Listeria monocytogenes. L'invention a permis d'identifier les peptides et protéines de cette fraction, au nombre de quinze, et qui comporte notamment de l'OVAX qui représente avantageusement au moins 50 %, plus précisément au moins 56 %, en proportion de cette fraction.
De manière surprenante, il a été observé que l'activité anti Listeria monocytogenes de la protéine OVAX et de la fraction selon l'invention, est conservée après digestion par certaines enzymes digestives et notamment par la trypsine ou la chymotrypsine. Or, la trypsine est une enzyme digestive présente dans le suc gastrique chez l'homme et chez les mammifères, tandis que la chymotrypsine est une enzyme digestive présente dans le pancréas des hommes et mammifères. Toutes deux participent à la digestion des protéines contenues dans l'alimentation ingérée par l'animal, humain ou non humain. De tels résultats permettent donc d'envisager chez l'animal, humain ou non humain l'utilisation de cette molécule d'OVAX et/ou de la fraction dans une composition alimentaire, thérapeutique et/ou prophylactique devant être ingérée, dans la mesure où l'activité anti- Listeria monocytogenes est conservée après action de la trypsine et/ou de la chymotrypsine.
L'invention a donc pour objet une molécule de séquence d'acides aminés SEQ ID N°1 , pour son activité anti-microbienne, et plus particulièrement anti Listeria monocytogenes.
La séquence SEQ ID N°1 correspond à la séquence d'acides aminés de la protéine OVAX.
En effet, les inventeurs ont découvert que la molécule selon SEQ ID N°1 possède une affinité particulière pour l'héparine, un glycosaminoglycane chargé négativement, et pourrait par conséquent se lier à des surfaces chargées négativement telles que le lipopolysaccharide de certaines bactéries Gram négatif, et le peptidoglycane de certaines bactéries Gram positif (dû à la présence de l'acide téichoïque). La liaison entre au moins une de ces séquences chargées positivement et la surface d'un microorganisme chargée négativement entraîne une déstabilisation de la paroi dudit microorganisme, conduisant à sa lyse. La molécule selon l'invention est donc apte à inhiber la croissance de tels microorganismes.
Ainsi, l'invention vise tout particulièrement la molécule de séquence SEQ ID N°1 pour son action anti- Listeria monocytogenes, comme cela est plus spécifiquement exposé ci-dessous. L'invention concerne également une composition comportant une molécule de séquence SEQ ID N°1 , en tant que principe actif anti-microbien et notamment comme principe actif anti- Listeria monocytogenes.
La composition selon l'invention, comportant la molécule antimicrobienne de séquence amino acide SEQ ID N°1 , peut notamment être destinée à la fabrication d'un médicament anti- Listeria monocytogenes. Une telle composition peut notamment être une solution destinée à être ingérée, et comportant les excipients requis. Autrement, la composition peut être une poudre destinée à être mise en suspension ultérieurement, ou à être conditionnée telle que, sous forme de gélules.
La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la fabrication d'aliments, destinés à l'alimentation animale, humaine ou non humaine, en tant qu'additif alimentaire anti- Listeria monocytogenes.
Avantageusement, la composition est alors utilisée lors du procédé de fabrication du produit alimentaire, ladite composition étant ajoutée dans la préparation destinée à former le produit alimentaire, au cours de son élaboration.
Notamment, la composition peut être utilisée comme additif alimentaire lors de la préparation de charcuteries telles que les pâtés, rillettes, saucisses etc. La composition peut également être ajoutée à du lait destiné à être utilisé pour fabriquer du fromage.
Préférentiellement, la composition est ajoutée à la préparation après toute étape de cuisson et/ou toute étape lors de laquelle ladite préparation est soumise à des températures supérieures à 60°C.
Selon l'invention, la concentration en la molécule de séquence
SEQ ID N°1 dans la composition peut être comprise entre 15 g/mL et 400 g/mL, et préférentiellement comprise entre 20 g/mL et 100 g/mL. De manière encore plus préférée, la concentration en la molécule de séquence SEQ ID N°1 dans la composition est comprise entre 25 g/mL et 60 g/mL.
L'invention concerne également une fraction de peptides et/ou protéines, issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine, pour son action anti- Listeria monocytogenes.
Par issus du blanc d'œuf, on entend que les peptides et protéines présents dans la fraction selon l'invention se trouvent tous dans le blanc d'œuf, et peuvent être obtenus à partir du blanc d'œuf. Bien entendu, ces peptides et protéines pourront avoir été obtenus autrement que par purification à partir du blanc d'œuf, et notamment par synthèse chimique ou produite sous forme recombinante.
Par action anti Listeria monocytogenes, ou action dirigée contre Listeria monocytogenes, on entend que cette fraction est apte à inhiber la croissance de cette bactérie et/ou la détruire.
Toutes les molécules de ladite fraction sont aptes à lier l'héparine. Ainsi, la fraction selon l'invention est susceptible de comporter tout ou partie des peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf pouvant se lier à l'héparine. Cette fraction peut comporter quelques molécules contaminantes d'ovalbumine, protéine majeure du blanc d'oeuf, qui représente plus de 50% en proportion des protéines totales présentes dans le blanc d'œuf, et qui elle ne présente pas d'affinité pour l'héparine.
Ces molécules peptidiques et protéiques ont été isolées directement à partir de blanc d'œuf de poule, par chromatographie d'affinité utilisant des billes d'héparine-sépharose, puis identifiées par spectrométrie de masse.
La fraction selon l'invention comporte ainsi au moins une des molécules parmi les peptides et protéines ci-dessous (les références Gl ci- après sont extraites de la base de données NCBI, mise à jour en avril 2011 ) :
- l'OVAX, de poids moléculaire d'environ 45 kDa, plus précisément d'environ 44 kDa, de séquence SEQ ID N°1 , et qui présente 1 site consensus HBS liant l'héparine ;
- une protéine similaire à la protéine MGC82112 (Gl :118083274), de poids moléculaire d'environ 170 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine ;
- l'Avidine (Gl :45384354), de poids moléculaire d'environ 17 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- le Lysozyme C (Gl :229157), de poids moléculaire d'environ
14 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente également un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- la beta-defensine 11 (Gl :49169808), de poids moléculaire d'environ 12 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse également penser qu'elle présente un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- la protéine TENP (Gl :46048814) de poids moléculaire d'environ 47 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- la cyclophiline B (peptidylprolyl isomerase B) (Gl :45382027) de poids moléculaire d'environ 22 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine ;
- la protéine Vmo-I (pour « vitelline membrane Outer Layer Protein I »
(Gl :576329)) de poids moléculaire d'environ 18 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine ;
- l'ovotransferrine (Conalbumine) (Gl :71274075) de poids moléculaire d'environ 78 kDa et ne présentant aucun site consensus HBS liant l'héparine ;
- l'ovocléidine 17 (Gl :31615312), de poids moléculaire d'environ 15 kDa et ne présentant aucun site consensus HBS liant l'héparine , ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- l'ovoglycoprotéine (Gl :45383093), de poids moléculaire d'environ
22 kDa et ne présentant aucun site consensus HBS liant l'héparine , ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- l'ovalbumine (Gl :28566340), de poids moléculaire d'environ 43 kDa et présentant un site consensus HBS liant l'héparine ;
- la protéine prédite « plasma protease C1 inhibitor-like (Gl :326920260), de poids moléculaire d'environ 52 kDa, présentant un site consensus HBS liant l'héparine ;
- la Clusterine (Gl :45382467), de poids moléculaire d'environ 51 kDa et présentant 2 sites consensus HBS liant l'héparine ; et
- une protéine prédite « hypothetical protein » (Gl :50728948) similaire à la pléiotrophine (facteur de croissance 8 liant l'héparine) de poids moléculaire d'environ 18,5 kDa et présentant 5 sites consensus HBS liant l'héparine. Par site de liaison conformationnel à l'héparine, on entend une exposition spécifique d'acides aminés chargés positivement, lorsque la molécule est conformée, et formant un site capable de se lier à l'héparine.
La fraction selon l'invention comporte au moins la molécule de séquence SEQ ID N°1 qui correspond à la séquence de l'OVAX telle qu'isolée à partir du blanc d'oeuf. La fraction peut autrement, ou également comporter la molécule d'OVAX de séquence SEQ ID N°2, qui correspond à la séquence connue qui a été prédite à partir de l'analyse bioinformatique du génome de la poule, et qui est identifiée dans la base de données NCBI par la référence XP_418984.2, au nom de la similar to Ovalbumin-related protein Y (Gene Y protein), nommée OVAXdb sur la Figure 3.
La fraction selon l'invention peut avantageusement comporter l'ensemble des peptides et protéines issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine, tels que listés ci-dessus.
Dans ce cas, il est intéressant de prévoir que la molécule de séquence SEQ ID N°1 et/ou de séquence SEQ ID N°2 représente au moins 50% en proportion des molécules de la fraction.
Une telle fraction peut alors être obtenue directement par passage du blanc d'œuf sur chromatographie d'affinité de type héparine-sépharose (ou héparine-agarose), et utilisée telle que. En effet, la fraction issue de cette chromatographie comporte, de fait, plus de 50 %, et même plus de 56 %, d'OVAX (Fig. 1 , piste 5 -HB-EW, tâche autour de 45-50 kDa). C'est la quantification des pixels de la bande de 50 kDa du gel rapportée au nombre de pixel total du puits qui a permis d'estimer la quantité de la molécule d'OVAX dans cette fraction à au moins 50 %, et même au moins 56 %, en proportion. On retrouve également de l'OVAX dans les autres bandes, mais l'OVAX étant alors avec d'autres molécules, on ne peut pas quantifier la part due à l'OVAX
Ainsi, l'utilisation de cette fraction en agro-alimentaire ou dans le domaine médical, peut être directe, puisque l'œuf est une denrée alimentaire communément utilisée par l'homme, et dont l'innocuité, hormis pour les personnes allergiques, est reconnue.
Bien entendu, tout ou partie des molécules de la fraction selon l'invention peut également être obtenue par synthèse chimique ou sous forme de protéine recombinante, notamment à partir de la séquence peptidique correspondante, puisque le génome de la poule a déjà été entièrement séquencé.
L'invention a également pour objet une composition comportant la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention en tant que principe actif anti- Listeria monocytogenes. Autrement dit, la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention peut être utilisée en tant que principe actif anti- Listeria monocytogenes, pour la réalisation d'une composition médicinale, alimentaire ou autre.
Selon l'invention, la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine dans la composition peut être comprise entre 15 g/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement comprise entre 20 g/mL et 100 g/mL. De manière encore plus préférée, la concentration en ces molécules dans la composition est comprise entre 25 g/mL et 60 g/mL.
Par concentration totale, on entend la concentration cumulée de chacun des peptides et/ou protéines selon l'invention présents dans la fraction utilisée pour réaliser la composition.
Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, la fraction présente dans la composition est digérée par au moins une enzyme digestive, de préférence par la trypsine ou par la chymoptrypsine, préalablement à son utilisation.
La composition à base de la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention peut notamment être destinée à la fabrication d'un médicament anti- Listeria monocytogenes. Une telle composition peut être une solution destinée à être ingérée, et comportant les excipients requis. Autrement, la composition peut être une poudre, et notamment une poudre de blanc d'œuf éventuellement enrichie en la fraction selon l'invention, pour être mise en suspension ultérieurement, ou être conditionnée sous forme de gélules.
La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la fabrication d'aliments, destinés à l'alimentation animale, humaine ou non humaine, en tant qu'additif alimentaire anti- Listeria monocytogenes.
Avantageusement, la composition est alors utilisée lors du procédé de fabrication du produit alimentaire, ladite composition étant ajoutée dans la préparation destinée à former le produit alimentaire, au cours de son élaboration. Notamment, la composition peut être utilisée comme additif alimentaire lors de la préparation de charcuteries telles que les pâtés, rillettes, saucisses etc. La composition peut également être ajoutée à du lait destiné à être utilisé pour fabriquer du fromage.
Préférentiellement, la composition est ajoutée à la préparation après toute étape de cuisson et/ou toute étape lors de laquelle ladite préparation est soumise à des températures supérieures à 60°C.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 est une photographie d'un gel SDS-PAGE montrant la migration des protéines du blanc d'œuf de poule ; ainsi, on peut voir la trypsine seule (piste T), la chymotrypsine seule (piste CT), les protéines du blanc d'œuf dans leur ensemble (piste EW), les protéines de la fraction du blanc d'œuf ne liant pas l'héparine (piste HUB-EW), les protéines de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine (piste HB-EW), les protéines de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine après digestion à la trypsine (piste HB-EW-T), et les protéines de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine après digestion à la chymotrypsine (piste HB-EW-CT).
La figure 2 est une photographie d'un gel SDS-PAGE des différentes étapes d'un premier mode de purification de l'OVAX ; la première piste (1 ) représente le blanc d'œuf ; la deuxième piste (2) la fraction éluée de l'héparine-sépharose ; la troisième piste (3), la fraction non-fixée de la biotine-sépharose ; et la quatrième piste (4) le pic correspondant à l'OVAX après tamisage moléculaire.
La figure 3 est un alignement de séquences d'acides aminés entre la séquence de l'OVAX issue de la base de données NCBI (OVAXdb, XP_418984.2 Gl :118086485) et la séquence prédite par le logiciel Genemark de l'Institut de technologie de Géorgie (http://exon.gatech.edu/eukhmm.cgi) (OVAXgs) à partir de la séquence nucléotidique correspondant au gène de l'OVAX (référence NW_001471638.1 dans la base de données NCBI).
La figure 4 comporte deux graphiques (Figures 4A et 4B) montrant respectivement l'activité antimicrobienne en milieu liquide de l'Ovalbumine et de l'OVAX issu du premier mode de purification vis-à-vis de Listeria monocytogenes. La croissance de Listeria monocytogenes a été suivie à 600 nm pendant 20 heures sans Ovalbumine/OVAX ou avec des concentrations croissantes d'Ovalbumine/OVAX.
La figure 5 comporte cinq graphiques (Figures 5A à 5E) montrant l'activité anti Listeria monocytogenes, en milieu liquide, de différents échantillons de blanc d'œuf, à différentes concentrations. Ainsi, la figure 5A montre l'activité anti Listeria monocytogenes du blanc d'œuf pur ; la figure 5B montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'œuf ne liant pas l'héparine ; la figure 5C montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine ; la figure 5D montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine, après digestion par la trypsine ; la figure 5E montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine, après digestion par la chymotrypsine.
La figure 6 est une photographie d'un gel SDS-PAGE réalisé à l'issue d'un second mode de purification de l'OVAX, l'unique piste représentant la fraction finale obtenue.
La figure 7 est une photographie d'un milieu gélosé montrant l'activité anti Listeria monocytogenes de l'OVAX issu du second mode de purification, à différentes concentrations, par rapport à la Beta-defensine 11 (témoin positif) et à l'Ovalbumine (témoin négatif).
EXPERIMENTATION 1 1/1 - MATERIEL
Collecte et préparation du blanc d'œuf.
Les blancs d'œufs ont été collectés à partir de plusieurs œufs provenant de poules pondeuses (Isa-Hendrix, St Brieuc, France) et dilués au ½ dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4.
L'échantillon a été homogénéisé délicatement et centrifugé à 14 000 g pendant 10 minutes à 4°C.
Le surnageant obtenu a été congelé jusqu'à utilisation ultérieure. Bien entendu, il est autrement possible de procéder directement aux étapes de purification, sans congélation préalable. 1/2- METHODES
1/2.1 - Purification de l'OVAX.
Une chromatographie de type héparine-sépharose a été effectuée en utilisant la technique en « batch » suivant les instructions du fournisseur (Marque GE-Healthcare, distribué par Fischer Scientific, W7346E).
On équilibre quatre fois 0,6 g de billes d'héparine-sépharose dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7,4 dans des tubes Falcon de 50 ml_.
On ajoute dans chaque tube 15 mL de blanc d'œuf préparé comme décrit ci-dessus et 15 mL de Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4.
On incube, sous agitation douce, toute une nuit à 4°C.
A l'issue de l'incubation, les protéines sans affinité pour l'héparine- sépharose sont éliminées par lavages successifs en tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4 et centrifugation des billes pendant 5 minutes à 1500 g à 4°C.
L'efficacité des lavages est vérifiée en mesurant l'absorbance à 280 nm, une absorbance de 0 attestant de l'élimination totale de ces protéines.
Les billes sont alors chargées sur deux colonnes de polypropylène de 5 mL (Qiagen, courtaboeuf, France, 34964).
L'élution des protéines affines est réalisée en tampon Tris-HCI 50 mM,
NaCI 1 M, pH 7,4 par pas de 1 mL sur les deux colonnes en parallèle (l'expérience a montré que le rendement était meilleur en chargeant sur deux colonnes plutôt qu'une) et est suivie en mesurant l'absorbance à 280 nm.
Les fractions d'élution les plus concentrées sont regroupées et dialysées pendant 24 heures contre du tampon Phosphate de Na 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7.4 (PBS) dans des membranes de dialyse (exclusion de 3500 Da) (Marque Spectrum, distribuées par Fischer Scientific, 132720).
A l'issue de la dialyse, l'échantillon est centrifugé à 10000 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est alors chargé sur une colonne de polypropylène de 1 mL, dans laquelle 1 ,5 mL de billes d'agarose couplées à la biotine (Sigma-AIdrich, Saint Quentin Fallavier, France, B0519) ont été au préalable équilibrées dans du tampon PBS.
Le non-fixé de la colonne est récupéré et concentré sur cellule de concentration d'exclusion 3500 Da (Millipore, UFC900324). Cette étape permet d'éliminer l'avidine de l'échantillon, cette dernière présentant une forte affinité pour la biotine.
L'échantillon concentré est alors injecté sur une chromatographie d'exclusion TSK-gel filtration G3000SW (Tosoh Bioscience, Hampton, UK) préquilibréé en tampon PBS.
Le pic majeur correspondant à l'OVAX est collecté et concentré sur cellule de concentration d'exclusion 3500 Da (Millipore, UFC900324).
Les différentes étapes de purification ont été analysées par gel SDS- PAGE 4-20% en conditions non-réductrices après coloration au bleu de Coomassie afin de vérifier la pureté de la protéine.
1/2.2- Identification de l'OVAX par spectrométrie de masse.
Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en conditions réductrices et colorées au bleu de Coomassie.
La bande majeure de 45 kDa a été extraite du gel et rincée avec de l'eau et de l'acétonitrile.
Les protéines ont été réduites avec du dithiothreithiol, alkylées avec de l'iodoacétamide et digérées par la trypsine (12,5 ng/ L) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) une nuit à 37°C dans du tampon NH HCO3 25 mM, selon le protocole décrit par Shevchenko et al.
Les extraits peptidiques ont ensuite été séchés.
Plusieurs techniques de spectrométrie de masse ont été utilisées pour identifier l'OVAX et obtenir une couverture de séquence maximale :
la cartographie MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption lonisation-Time of Flight) et
la nanochromatographie liquide capillaire monodimensionnelle couplée à de la spectrométrie de masse en tandem (NanoLC-MS/MS).
L'identification par l'approche protéomique dite « bottom up » a été réalisée sur un extrait peptidique en solution dans 8 μί d'un mélange d'acide formique O.1 %/ acétonitrile 2%.
L'analyse NanoLC-MS/MS a été conduite en utilisant un système CapLC couplé à un spectromètre de masse hybride de type « Quadrupole time-of-flight » (Q-TOF Ultima Global, Waters, Manchester Grande-Bretagne) équipé d'une source d'ion en Z-spray. L'appareil est calibré à l'aide d'une solution de GluF à 500 fmol/ L (50% d'une solution d'acide formique 1 % / 50 % acétonitrile, v/v). Les échantillons sont dessalés et concentrés en ligne par une précolonne (Monolithic trap colonne, 200 μιτι i.d X 5mm (PS-DVB), Dionex, ref 163972).
La séparation des peptides est réalisée sur une colonne capillaire phase réverse (Acclaim PepMap 100 C18, 5μηη, 75 μιτι I.D., 25 cm de longueur, Dionex) avec un débit de 200 nL/min.
Le profil du gradient est le suivant : Equilibration des colonnes avec 95% de solvant A (0.1 % acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) et 5% de solvant B (0.1 % acide formique / 20% H2O/ 80% acétonitrile, v/v), Gradient de 5 à 55% de B en 80 min ; Palier à 95% de B pendant 10 min.
L'acquisition des données se fait de façon automatique entre les modes MS et MS/MS (fragmentation) : un MS survey scan est suivi par trois MS/MS scans sur les trois pics détectés les plus intenses.
Seuls les ions bi et trichargés sont sélectionnés comme précurseurs dans une gamme de masse m/z entre 400 et 1300.
L'énergie de collision est sélectionnée en fonction de la masse et la charge de l'ion.
Les données brutes sont traitées par le logiciel ProteinLynx Global Server V 2.2.5 (PLGS) pour créer des fichiers .pkl comportant l'ensemble des précurseurs sélectionnés à la fragmentation ainsi que la liste des ions fragments associés.
L'échantillon est soniqué quelques minutes avant le dépôt sur la cible.
1 L d'échantillon a été déposé sur la cible avec 1 L de matrice selon la méthode de dépôt dite de la goutte séchée.
La matrice utilisée est une solution de CHCA (a-cyano-4-hydroxy— cinnamic acid) à 5 mg/mL dans 50% éthanol / 50% acétonitrile/TFA 0.1 %/10 mM de 18-C-6 crown éther. L'appareil MALDI-TOF a été calibré en externe à l'aide de peptides issus de la digestion tryptique de la BSA (Bovine Sérum Albumin) à 300fmol/ L.
Les spectres MALDI-TOF sont obtenus à l'aide d'un spectromètre de masse MALDI L/R P/N (Waters, Manchester, UK).
Les analyses ont été réalisées : en mode positif, en mode réflectron, avec une tension d'accélération de 15 KV, puise Voltage : 2226, avec une gamme de masse (m/z) de 500 Da à 5000 Da. Le traitement informatique des spectres (substract, smooth, centroid) se fait à l'aide du logiciel MassLynx V4.0 (Waters).
Toutes les masses ont été relevées manuellement pour toutes les cartographies.
Les données expérimentales issues de l'analyse MALDI et NanoLC-
MS/MS ont été confrontées à une banque de données non redondantes (NCBInr 20071102, puis 20110403) et à l'aide du logiciel MASCOT (Matrix Science UK, http://www.matrixscience.com).
La spécificité enzymatique a été établie comme étant la trypsine, en incluant deux clivages manquants.
Les modifications variables suivantes ont été sélectionnées : la carbamidométhylcystéine et l'oxydation de la méthionine.
La recherche a été effectuée dans toutes les taxonomies. La précision de masse a été fixée à ± 0.3 Da. Les protéines candidates ont été validées quand les scores individuels des ions présentaient un niveau de significativité supérieur à p<0.05.
1/2.3- Séquençage d'Edman
18 g d'OVAX ont été digérés par la trypsine (1 ,2 μΜ, Sigma-AIdrich, Saint-Quentin Fallavier) ou la chymotrypsine (1 ,2 μΜ, Sigma-AIdrich, Saint- Quentin Fallavier) en présence d'héparine (10 pg/mL, Sigma-AIdrich, Saint- Quentin Fallavier, France) pendant 1 heure à 37°C.
Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en conditions réductrices et transférées sur membrane de polyvinylidène.
La bande majeure (40 kDa) a été excisée du gel et analysée par séquençage d'Edman.
La séquence amino-terminale de la protéine a été déterminée par dégradation automatique d'Edman en utilisant le séquenceur LF 3000 (Beckman/Porton) équipé d'un système HPLC « on-line Gold HPLC System, Beckman Coulter) pour la détection des dérivés acides-aminés- Phénylthiohydantoine.
1/2.4- Prédiction de la séquence protéique de l'OVAX
La prédiction de la séquence de l'OVAX a été réalisée à partir de la séquence du gène disponible sur le site « Ensembl » (http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/lnfo/lndex, ENSGALG00000019551 ), puis ultérieurement à partir de la séquence référencée dans la base de données NCBI sous le numéro NW_001471638.1 , en utilisant le logiciel Genemark (Georgia Institute of Technology (http://exon.biology.gatech.edu/).
1/2.5- Analyse de l'activité antimicrobienne de l'OVAX
Les échantillons de blanc d'œuf (EW), de fractions ne liant pas l'héparine (HUB-EW), et de fractions liant l'héparine (HB-EW) ont été dilués dans du tampon Tris 50 mM, NaCI 150 mM à pH 7,4, afin d'obtenir des échantillons contenant 1 ,8 mg/mL de protéines. La concentration en protéines a été déterminée en utilisant le test Protein DC (Biorad, Saint- Quentin, France) avec du l'albumine sérique bovine (Interchim, Montluçon, France) comme contrôle. Les échantillons HB-EW (0,9 mg/mL) ont été digérés soit par de la trypsine à 5,5 μΜ (HB-EW-T) soit par de la chymotrypsine à 1 ,2 μΜ (HB-EW-CT) dans du tampon Tris-HCL 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4 pendant 1 heure à 37°C. La réaction a été stoppée par refroidissement et les produits de la digestion (5 μί pour les échantillons de trypsine, chymotrypsine, EW, HUB-EW, HB-EW, ou 10 μί pour les échantillons de HB-EW-T et HB-EW-CT) ont été analysés par SDS-PAGE 4- 20% (figure 1 ). L'activité anti-microbienne de ces différents échantillons en milieu liquide a été ensuite analysée.
La souche bactérienne EGD de Listeria monocytogenes a été conservée par congélation dans l'azote liquide dans le milieu de culture Bouillon Cœur Cervelle (Oxoid, Hampshire, England) contenant 15% (v/v) de glycérol.
La souche bactérienne a été mise en culture une nuit à 37°C dans le bouillon Tryptone Soja (TSB, Oxoid), sans agitation.
On a ensuite dilué cette préculture et on l'a utilisée pour inoculer les milieux de culture (TSB) de manière à obtenir une densité bactérienne initiale d'environ 1 .107 CFU.mL"1.
La culture a alors été incubée à 37°C sous agitation et la densité optique a été mesurée régulièrement à 600 nm jusqu'à obtenir des bactéries en phase mi-exponentielle (environ 1 . 108 CFU.mL"1 après environ 5 heures d'incubation). Dans une première expérimentation, on a suivi la croissance bactérienne en présence de différentes concentrations d'Ovalbumine ou d'OVAX (0-400 g/mL) à l'aide du lecteur de plaque Bioscreen C couplé au logiciel Biolink (Oy Growth Curves Ab Ltd.) dans le milieu de culture TSB.
La croissance bactérienne, la stérilité des milieux de culture et de l'échantillon d'OVAX ou d'Ovalbumine ont été vérifiées sur chaque plaque.
La croissance bactérienne a été enregistrée pendant 24 heures en continu à 37°C, une lecture de la densité optique à 600 nm étant effectuée toutes les 45 minutes (figure 4).
Dans une seconde expérimentation, on a suivi la croissance bactérienne en présence de différentes fractions de blanc d'œuf à l'aide du lecteur de plaque Bioscreen C couplé au logiciel Biolink (Oy Growth Curves Ab Ltd.) dans le milieu de culture TSB.
La croissance bactérienne, la stérilité des milieux de culture des fractions de blanc d'œuf, de la trypsine et de la chymotrypsine ont été vérifiées sur chaque plaque.
Chaque fraction de blanc d'œuf (EW, HUB-EW, HB-EW, HB-EW digérée par la trypsine ou la chymotrypsine) a été ajoutée à différentes concentrations. Pour les tests portant sur la fraction liant l'héparine après digestion par la trypsine, des concentrations croissantes de trypsine ont été ajoutées, après deux dilutions successives de la fraction de blanc d'œuf liant l'héparine (HB-EW) pour obtenir une concentration de 0,9 g/mL de HB-EW et 5,5 μΜ de trypsine.
La croissance bactérienne a été enregistrée pendant 24 heures en continu à 37°C, une lecture de densité optique à 600 nm étant effectuée toutes les 45 minutes (figure 5).
1/3- RESULTATS
1/3.1 - Purification de l'OVAX à partir du blanc d'œuf
Les deux chromatographies d'affinité successives héparine-sépharose et biotine-agarose, suivies par une chromatographie d'exclusion ont permis d'éliminer les protéines majeures du blanc d'œuf, et d'isoler l'OVAX. La figure 1 est une photographie d'un gel des protéines du blanc d'œuf, aux différents niveaux de purification.
Ainsi, la troisième piste (EW) représente la migration des protéines du blanc d'œuf dans leur ensemble.
La cinquième piste (HB-EW) représente une fraction selon l'invention, à savoir la fraction de protéines et peptides du blanc d'œuf liant l'héparine- sépharose. Cette première purification permet notamment d'éliminer l'ovalbumine, protéine majeure dans le blanc d'œuf (la quatrième piste, HUB- EW, montre les protéines du blanc d'œuf ne liant pas l'héparine). Il ressort que cette fraction contient majoritairement une protéine de poids moléculaire d'environ 45 kDa.
La digestion de la fraction d'intérêt par la trypsine (Sixième piste - HB- EW-T) et par la chymotrypsine (septième piste - HB-EW-CT) montre que la protéine d'intérêt, de poids moléculaire d'environ 45 kDa, correspondant à l'OVAX, est bien clivée en une pluralité de peptides par ces enzymes.
La même bande à environ 45 kDa est obtenue lors des étapes successives de purification de la fraction de protéines et peptides issue du blanc d'œuf et liant l'héparine, comme cela est visible sur la figure 2. La purification sur héparine-sépharose (piste 2), suivie d'une purification sur biotine-agarose (piste 3) et d'une filtration sur gel (piste 4) permet d'isoler la protéine de poids moléculaire 45 kDa.
La piste 4 représente une protéine pure à 92%, identifiée comme étant l'OVAX. La majorité des contaminants de cette fraction représente des multimères de l'OVAX (hautes masses apparaissant sur le gel). En effet, une analyse par western-blot a montré qu'ils réagissent avec des anti-corps anti- ovalbumine et disparaissent après réduction en présence de beta- mercaptoéthanol.
Ainsi, environ 7,5 mg de protéines pures d'OVAX ont pu être obtenus à partir de 50 mL de blanc d'œuf.
La concentration en OVAX est estimée à environ 0,5 mg/mL de blanc d'œuf au minimum, ce qui permet d'envisager de nombreuses applications notamment dans le domaine de l'agro-alimentaire, directement par purification de la protéine à partir du blanc d'œuf. 1/3.2- Identification de l'OVAX
L'identification par spectrométrie de masse et séquençage a permis d'isoler et identifier une protéine de séquence SEQ ID N°1 , correspondant à l'OVAX précédemment isolée, qui présente une séquence quasi-identique à la séquence prédite déjà connue (SEQ ID N°2) à partir de l'analyse bioinformatique du génome du poulet, et disponible dans les banques de données NCBI.
En effet, comme cela est visible sur la figure 3, qui compare les deux séquences d'acides aminés, la séquence SEQ ID N°1 (OVAXgs) présente une différence sur cinq résidus aminoacides par rapport à la séquence SEQ ID N°2 (OVAXdb).
Ces résultats ont été confirmés par séquençage amino terminal de l'OVAX digéré à la trypsine.
Plus précisément, après protéolyse limitée à la trypsine, on a procédé au séquençage d'Edman (donc par l'extrémité N-terminale), à deux reprises. Les séquences VQKPKXGKSVNIHLLFXELL / VQKPXXGKSV ont respectivement été obtenues, dans lesquelles X est un résidu qui n'a pas pu être déterminé avec certitude, ce qui est souvent observé avec les cystéines.
Parmi les cinq résidus (KVQKP) qui ont été mis en évidence par Genemark, 4 (VQKP) ont pu être confirmés. Cependant, la trypsine est connue pour couper spécifiquement les séquences peptidiques après les lysines (K) ou les arginines (R). Cette spécificité tend à valider le résidu K qui précède ces quatre résidus.
Aucun séquençage d'Edman n'a pu être effectué sur l'OVAX native, ce qui laisse penser qu'elle contient une amino-acétylation, bloquant l'extrémité N-terminale de la molécule.
1/3.3- Activité anti-microbienne
Les graphiques de la figure 4 permettent de faire le parallèle entre l'action dans le temps de l'Ovalbumine (Figure 4A) et de l'OVAX (figure 4B) contre Listeria monocytogenes, à des concentrations croissantes en ces molécules, en milieu liquide.
Ainsi, on constate qu'aucune action spécifique contre Listeria monocytogenes n'est observée avec l'Ovalbumine pour des concentrations inférieures à 400 g/mL. L'effet observé à 400 g/mL est très faible. A l'inverse, on observe que l'OVAX présente une activité anti- Listeria monocytogenes dès 25 Mg/rnL, au moins pendant les 10 premières heures du test. Avec 50 g/mL d'OVAX, l'activité anti- Listeria monocytogenes perdure au-delà de 15 heures.
Les graphiques de la figure 5 permettent de faire le parallèle entre l'activité anti- Listeria monocytogenes du blanc d'œuf (figure 5A - EW), de la fraction du blanc d'œuf ne liant pas l'héparine (figure 5B - HUB-EW), de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine (figure 5C - HB-EW), de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine, après digestion par la trypsine (figure 5D - HB- EW-T), et de la fraction du blanc d'œuf liant l'héparine, après digestion par la chtmotrypsine (figure 5E - HB-EW-CT).
Le blanc d'œuf, tout comme la fraction issue du blanc d'oeuf et ne liant pas l'héparine présentent des profils d'activité similaires. Aucune activité significative anti- Listeria monocytogenes n'est observée, même à des concentrations supérieures à 400 g/mL.
A l'inverse, on observe un profil d'activité anti- Listeria monocytogenes similaire entre la fraction liant l'héparine et la fraction liant l'héparine digérée par la trypsine.
Une action intermédiaire contre Listeria monocytogenes est obtenue dès 28 pg/mL, cette action étant quasi-optimale à 56 g/mL.
28 pg/mL de l'une ou l'autre de ces fractions suffisent à réduire de plus de 50% la croissance de la bactérie. A cette concentration, pendant les 16 premières heures, les fractions HB-EW et HB-EW-T semblent interférer avec la croissance des bactéries, et semblent agir contre celle-ci, la croissance bactérienne étant réduite de plus de 50%. Après 16 heures, on observe une nouvelle dégradation de la croissance du pathogène.
L'action de la trypsine pure contre Listeria monocytogenes a également été étudiée (figure 5D). On observe un léger effet sur la croissance de Listeria monocytogenes. Il faut soustraire cet effet à celui observé pour l'OVAX à la plus forte concentration. En effet, dans l'échantillon le plus concentré d'OVAX, il y a de la trypsine concentrée. Cet échantillon est ensuite dilué de 2 en 2, la concentration en trypsine diminuant donc d'autant et son activité antimicrobienne propre aussi. Ici, la trypsine sert de contrôle. Des résultats comparables ont été obtenus avec la fraction liant l'héparine et digérée par chymotrypsine (Figure 5E). Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus avec l'OVAX seule (Figure 4B), qui sont comparables. Dans ces trois cas, on observe un effet dose dépendant de la fraction ou de la molécule sur Listeria monocytogenes. EXPERIMENTATION 2
Un second mode de purification de la protéine OVAX a été mis en œuvre, afin d'obtenir la protéine avec un degré de pureté plus élevé. L'activité antimicrobienne ainsi obtenue a été testée en milieu gélosé, comme détaillé ci-après.
2/1 - Collecte et préparation du blanc d'œuf
L'OVAX a été purifiée à partir du blanc d'œufs de poule.
Les œufs de poules (ISA Brown, Hendrix Genetics, Saint-Brieuc, France) fraîchement pondus ont été collectés, cassés, les blancs et les jaunes ont été indépendamment échantillonnés.
Les blancs d'œufs ont été réunis et le mélange résultant a été dilué au ½ dans du Tris-HCI 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7,4 et homogénéisé. Le mélange a ensuite été centrifugé à 14 000 rpm, à 4°C pendant 10 minutes afin d'éliminer les protéines visqueuses. Le surnageant a été conservé à -20°C.
2/2- Purification de l'OVAX
La purification de l'OVAX à partir du blanc d'œuf a été réalisée en trois étapes.
La première étape de purification est une chromatographie d'affinité de type Héparine-Sépharose : 30 mL du surnageant issu de blancs d'œufs préparés comme indiqué ci-dessus ont été dilués au ½ dans du Tris-HCI 50 mM, NaCI 300 mM, pH 7,4, et incubés sur la nuit à 4 °c avec des billes de sépharose couplées à l'héparine (GE Healthcare, Uppsala, Suède).
Les billes de sépharose ont été lavées extensivement avec un tampon
Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4, afin d'éliminer les peptides/protéines non fixés, et les protéines affines ont ensuite été éluées avec un tampon Tris- HCI 50 mM, NaCI 1 M, pH 7,4.
Les fractions éluées ont été concentrées sur membrane de concentration (Millipore, Ireland, UFC800324) et l'échantillon résultant a été injecté sur une colonne Sephacryl S-100 High Resolution, Hi-prep 16/60 (GE Healthcare, Uppsala, Suède) prééquilibrée dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4.
Le pic majeur contenant l'OVAX a ensuite été passé sur une colonne d'affinité type biotine-sépharose prééquilibrée dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4, afin d'éliminer toute trace d'avidine dans l'échantillon, l'OVAX étant recouvrée dans la fraction non fixée aux billes de biotine.
La fraction non fixée aux billes de biotine, contenant l'OVAX, a été analysée par électrophorèse en SDS-PAGE en conditions non réductrices après coloration au bleu de Coomassie.
Comme montré sur la Figure 6, les résultats montrent une bande hétérogène de 40 à 50 kDa de masse apparente, la masse théorique de l'OVAX étant de 44,2 kDa.
2/3 - Identification de l'OVAX par spectrométrie de masse
5 g (10 L) d'échantillon d'OVAX purifié comme indiqué ci-dessus ont été digérés par la trypsine pendant 16h à 37°C dans les conditions suivantes.
10 μί d'échantillon, 10 μί de bicarbonate d'ammonium 100 mM et 1 μί de dithiothréithiol 100 mM, ont été mélangés et incubés pendant 30 min à 56°C.
1 L d'iodoacétamide 250 mM ont été ajoutés, et la solution a été incubée pendant 30 min dans le noir à température ambiante.
2 iL de trypsine à 0,1 pg/pL dans TFA 0.01 % ont été ajoutés.
Les peptides issus de cette digestion ont été analysés par un système nanoHPLC CapLC (Waters, Manchester, UK) couplé à un spectromètre de masse Q-TOF Ultima Global (Waters Micromass, Manchester, UK) équipé d'une source d'ion en Z-spray. L'appareil a été calibré à l'aide d'une solution de GluF à 500 imol/pL (50% d'une solution d'acide formique 1 % / 50 % acétonitrile, v/v)
Les tubes contenant les produits de digestion ont été portés à sec et 15 μί de tampon A (0.1 % acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) ont été ajoutés. Les échantillons ont été dessalés et concentrés en ligne par une précolonne (Monolithic trap colonne, 200 μηη i.d X 5mnn (PS-DVB), Dionex, ref 163972).
La séparation des peptides a été réalisée sur une colonne capillaire phase réverse (Acclaim PepMap 100 C18, 5μηη, 75 μηη I.D., 25 cm de longueur, Dionex) avec un débit de 200 nL/min.
Le profil du gradient est le suivant :
- Equilibration des colonnes avec 95% de solvant A (0.1 % acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) et 5% de solvant B (0.1 % acide formique / 20% H2O / 80% acétonitrile, v/v)
- Gradient de 5 à 50% de B en 60 min
- Palier à 95% de B pendant 10 min.
L'acquisition des données s'est faite de façon automatique entre les modes MS et MS/MS (fragmentation) : un MS survey scan a été suivi par 4 MS/MS scans sur les 4 pics détectés les plus intenses.
Les données brutes ont été traitées par le logiciel ProteinLynx Global Server V 2.2.5 (PLGS) pour créer des fichiers .pkl comportant l'ensemble des précurseurs sélectionnés à la fragmentation ainsi que la liste des ions fragments associés.
Les données expérimentales ont été confrontées à une banque de donnée à l'aide du logiciel MASCOT disponible sur le server local.
Les recherches ont été réalisées en sélectionnant les critères suivants :
- banque de donnée : nr NCBI
- enzyme : trypsine
- peptide charge : 2+ et 3+
- 2 miss cleavages
- 0.3 Da de précision de masse sur MS et MS/MS
- Data format : pkl
- Instrument : ESI-QUAD-TOF
- carbamidométhylation et oxydation des méthionines en modifications partielles
- taxonomie : Chordata Les résultats ont permis d'identifier l'OVAX (NCBI Référence Séquence: XP_418984.2) avec 6 peptides uniques identifiés :
AGLETVNFK ALHFDSIAGLGGSTQTK QLINSWVEKQTEGQIK SVNIHLLFKELLSDITASK ILELPFASGDLSMLVLLPDEVSGLER VQHTNENILYSPLSIIVALAMVYMGAR.
Aucune autre espèce moléculaire n'a été identifiée dans l'échantillon. Ces résultats indiquent que l'échantillon contient de l'OVAX avec un degré de pureté très élevé (sinon pure).
Un séquençage d'Edman, selon la méthode exposée ci-dessus pour l'Expérimentation 1 , a confirmé que cette protéine présente la séquence d'acides aminés SEQ ID N°1 .
2/4 - Analyse de l'activité antimicrobienne de l'OVAX
L'activité anti-L/'ster/a monocytogenes de l'OVAX purifiée comme décrit ci-dessus a été mesurée par le test de diffusion radiale selon la méthode décrite par Lehrer et al.
La beta-defensine 11 a été utilisée comme témoin positif (Hervé et al).
L'ovalbumine de blanc d'œuf a été utilisée comme témoin négatif, les séquences de cette protéine et de l'OVAX étant très proches (61 % d'identité de séquence) et leurs poids moléculaires étant comparables (44,2 kDa pour l'OVAX et 42,9 kDa pour l'ovalbumine).
Un témoin H2O et un témoin TBS NaCI 150 mM, ne contenant aucun peptide / protéine ont également été utilisés.
La concentration de l'ovalbumine (Sigma-AIdrich, Saint-Quentin Fallavier, A7641 ) et de l'OVAX a été déterminée en utilisant les réactifs DC Biorad (Biorad, Marnes la Coquette, France) et l'albumine sérique bovine (Sigma-AIdrich, Saint-Quentin Fallavier, P0834) pour établir la courbe étalon.
Les bactéries (Listeria monocytogenes) ont été incubées toute la nuit sous agitation à 37 °C. La préculture obtenue a ensuite été diluée dans du TSB (Bouillon Tryptone Soja) jusqu'à ce que la densité optique mesurée à 600 ou 620 nm soit égale à 0,02 de façon à standardiser les conditions de culture. La culture a été incubée pendant 4h à 37°C sous agitation pour obtenir une culture en phase de croissance exponentielle. Les bactéries ont ensuite été centrifugées à 900 g pendant 10 min à 4°C, puis lavées une fois avec un tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,4) froid, et resuspendues dans 10 ml de ce même tampon. La densité optique de cette suspension bactérienne a alors été mesurée de façon à déterminer le volume à prélever permettant d'obtenir 7,5.106 cfu de bactéries. Ce dernier volume a été mélangé avec 25 mL de milieu « underlay » (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4, contenant 0,03% [poids/volume] de BH I, 1 % [poids/volume] d'agarose de faible électro-endosmose [Sigma-AIdrich, St Quentin Fallavier, France] et 0,02% de Tween-20) préchauffé à 46°C.
La solution d'agarose contenant 7,5.106 cfu de bactéries a été coulée dans une boîte de pétri pour former une couche uniforme de 1 mm. 36 puits (3 mm de diamètre) régulièrement espacés ont été creusés dans la gélose à l'aide d'un emporte-pièce.
Des solutions d'OVAX, de beta-defensine 11 et d'ovalbumine, à différentes concentrations, ont été réalisées.
5 il de chacune de ces solutions ont été déposés dans deux des puits.
La boîte de pétri a été incubée à 37°C pendant 3h, pour permettre aux molécules de diffuser dans le milieu gelosé contenant les bactéries.
La première couche de milieu gélosé (underlay) a ensuite été recouverte avec 25 mL de milieu « overlay » (tampon phosphate de sodium 10mM pH 7,4, contenant 6% [poids/volume] BHI et 1 % [poids/volume] agarose). Après une incubation d'une nuit à 37°C, le diamètre en mm de la zone d'inhibition autour de chaque puits a été déterminé par la différence entre le diamètre de la zone claire autour du puits et le diamètre du puits. Plus ce diamètre est grand, plus la molécule est active à encontre de Listeria monocytogenes.
Les résultats sont montrés sur la Figure 7. On y observe clairement une activité antimicrobienne de l'OVAX sensiblement pure, de manière dose- dépendante vis-à-vis de Listeria monocytogenes, alors qu'aucune activité n'est visible pour l'ovalbumine. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Molécule antimicrobienne présentant la séquence amino acide SEQ ID N°1 pour son action anti-L/'ster/'a monocytogenes.
2- Composition comportant la molécule antimicrobienne selon la revendication 1 en tant que principe actif anti-L/'ster/a monocytogenes, pour son utilisation en tant que médicament anti-L/'ster/a monocytogenes.
3- Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la concentration en la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 est comprise entre 15 g/mL et 400 Mg/mL, et préférentiellement entre 20 g/mL et 100 g/mL et de manière encore plus préférée entre 25 g/mL et 60 Mg/mL.
4- Utilisation d'une composition comportant la molécule antimicrobienne selon la revendication 1 en tant que principe actif anti- Listeria monocytogenes, comme additif alimentaire anti-L/'ster/'a monocytogenes.
5- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la concentration en la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 dans la composition est comprise entre 15 g/mL et 400 Mg/mL, et préférentiellement entre 20 g/mL et 100 g/mL et de manière encore plus préférée entre 25 g/mL et 60 g/mL.
6- Composition comportant une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine, et comportant au moins la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 selon la revendication 1 , en tant que principe actif anti-L/'ster/'a monocytogenes, pour son utilisation en tant que médicament anti-L/'ster/'a monocytogenes.
7- Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi une protéine similaire à la protéine MGC82112, l'Avidine, le Lysozyme C, la beta- defensine 11 , la protéine TENP, la cyclophiline B, la protéine Vmo-I, et la Clusterine.
8- Composition selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi l'Ovotransferrine, l'ovocléidine 17, l'ovoglycoprotéine, l'ovalbumine, la « plasma protease C1 inhibitor-like » et la « hypothetical protein » similaire à la pléiotrophine.
9- Composition selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 représente au moins 50% en proportion de la fraction.
10- Composition selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine est comprise entre 15 g/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 g/mL et 100 g/mL et de manière encore plus préférée entre 25 g/mL et 60 g/mL.
11 - Composition selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que la fraction est digérée par au moins une enzyme digestive.
12- Composition selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une trypsine.
13- Composition selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une chymotrypsine.
14- Utilisation d'une composition comportant une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine, et comportant au moins la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 , en tant que principe actif anti-L/'ster/a monocytogenes, comme additif alimentaire anti- Listeria monocytogenes.
15- Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi une protéine similaire à la protéine MGC82112, l'Avidine, le Lysozyme C, la beta- defensine 11 , la protéine TENP, la cyclophiline B, la protéine Vmo-I, et la Clusterine.
16- Utilisation selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi l'Ovotransferrine, l'ovocléidine 17, l'ovoglycoprotéine, l'ovalbumine, la « plasma protease C1 inhibitor-like » et la « hypothetical protein » similaire à la pléiotrophine.
17- Utilisation selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N°1 représente au moins 50% en proportion de ladite fraction. 18- Utilisation selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'œuf et aptes à lier l'héparine dans la composition est comprise entre 15 g/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 g/mL et 100 g/mL et de manière encore plus préférée entre 25 g/mL et 60 g/mL.
19- Utilisation selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que la fraction est digérée par au moins une enzyme digestive.
20- Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une trypsine.
21 - Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une chymotrypsine.
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