CA2801129A1 - Fraction de proteines et peptides issus du blanc d'oeuf et proteine issue du blanc d'oeuf et leur utilisation comme agent anti-listeria - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'uf et aptes à lier l'héparine, pour son action anti- Listeria monocytogenes. L'invention concerne également une molécule de séquence SEQ ID n°1 pour son action anti-microbienne, et notamment anti- Listeria monocytogenes.

Description

FRACTION DE PROTÉINES ET PEPTIDES ISSUS DU BLANC
D'CEUF ET PROTÉINE ISSUE DU BLANC D'CEUF ET LEUR UTILISATION
COMME AGENT ANTI-LISTERIA
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne une fraction de protéines et/ou peptides issus du blanc d'oeuf et présentant une activité anti Listeria monocytogenes.
L'invention concerne également une molécule spécifique, issue du blanc d'oeuf, à savoir la protéine OVAX, pour son action anti-microbienne et de manière plus particulière pour son action ciblée contre Listeria monocytogenes.
L'invention trouve des applications notamment dans le domaine de l'agro-alimentaire, par exemple lors de l'élaboration de produits alimentaires de consommation courante, tels que les charcuteries et les fromages, afin d'éliminer toute trace de Listeria monocytogenes dans ces produits.
L'invention trouve également des applications dans le domaine pharmaceutique, par exemple pour la préparation de médicaments destinés à traiter et/ou prévenir les affections liées à Listeria monocytogenes, telles que la Listériose.

ETAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLEMES RENCONTRES
Listeria monocytogenes est une bactérie présente dans le sol, la végétation, l'eau, les eaux usées, les produits d'ensilage et les matières fécales humaines et animales. Certains animaux peuvent être porteurs de la bactérie à leur insu, sans être malades. Ces porteurs sains peuvent être à
l'origine de la contamination d'aliments, tels que le lait et la viande, et les produits dérivés. Notamment, on retrouve de manière récurrente cette bactérie dans les charcuteries et les fromages au lait cru. Listeria monocytogenes peut alors être à l'origine d'une affection appelée Listériose, apparentée à une intoxication alimentaire. La Listériose peut avoir des conséquences graves, notamment chez les femmes enceintes et les personnes âgées ou dont le système immunitaire est affaibli.
Jusqu'à présent, hormis par des règles d'hygiène strictes, et une cuisson à coeur des aliments et denrées susceptibles d'être porteurs du

2 PCT/EP2011/059126 germe, il n'est pas possible de garantir l'absence de Listeria monocytogenes dans un aliment.
On sait que Listeria monocytogenes est sensible à certains antibiotiques, et notamment à l'ampicilline et l'amoxicilline. Dans la mesure où les personnes devant recevoir un traitement contre la Listériose en cas d'affection sont des personnes fragiles, il est connu de les traiter via un pool d'antibiotiques, et en particulier la pénicilline, la streptomycine et les sulfamides. Ce traitement peut être prolongé avec des lactamines.
Malgré ce traitement lourd, et souvent long, les résultats restent aléatoires et dépendent surtout de l'état du système immunitaire du patient.
Par ailleurs, dans la mesure où la résistance, voire la multi résistance, des bactéries aux antibiotiques est de plus en plus fréquente, il est important de trouver une alternative à ce traitement, afin de pallier une telle éventualité
et/ou éviter qu'elle ne s'installe pour Listeria monocytogenes.
EXPOSE DE L'INVENTION
Dans l'invention, on cherche à résoudre au moins partiellement au moins un des problèmes exposés ci-dessus, en fournissant un nouveau composé susceptible d'agir contre Listeria monocytogenes.
Pour cela, l'invention propose d'utiliser une molécule ayant une activité antimicrobienne dirigée contre Listeria monocytogenes. La molécule selon l'invention est issue d'une protéine présente dans l'oeuf, notamment de poule, et plus particulièrement dans le blanc d'oeuf, connu pour comporter de nombreuses protéines et des peptides ayant des effets contre les bactéries, et notamment des enzymes, tel que le lysozyme. La protéine d'intérêt, appelée par la suite OVAX, pour ovalbumin-related protein X a également été identifiée, dans des quantités moindres, dans le jaune d'oeuf, la coquille d'oeuf, la membrane vitelline etc.
La séquence d'acides aminés correspondante de l'OVAX a été
identifiée, de sorte qu'il est possible d'utiliser la protéine native, c'est-à-dire isolée à partir de l'oeuf de poule, mais également la protéine recombinante.
L'invention a également permis de démontrer qu'une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf de poule et aptes à lier l'héparine-sépharose (ou l'héparine couplée à toute autre résine), présente une activité anti Listeria monocytogenes. L'invention a permis d'identifier les

3 PCT/EP2011/059126 peptides et protéines de cette fraction, au nombre de quinze, et qui comporte notamment de l'OVAX qui représente avantageusement au moins 50 %, plus précisément au moins 56 %, en proportion de cette fraction.
De manière surprenante, il a été observé que l'activité anti Listeria monocytogenes de la protéine OVAX et de la fraction selon l'invention, est conservée après digestion par certaines enzymes digestives et notamment par la trypsine ou la chymotrypsine. Or, la trypsine est une enzyme digestive présente dans le suc gastrique chez l'homme et chez les mammifères, tandis que la chymotrypsine est une enzyme digestive présente dans le pancréas des hommes et mammifères. Toutes deux participent à la digestion des protéines contenues dans l'alimentation ingérée par l'animal, humain ou non humain. De tels résultats permettent donc d'envisager chez l'animal, humain ou non humain l'utilisation de cette molécule d'OVAX et/ou de la fraction dans une composition alimentaire, thérapeutique et/ou prophylactique devant être ingérée, dans la mesure où l'activité anti- Listeria monocytogenes est conservée après action de la trypsine et/ou de la chymotrypsine.
L'invention a donc pour objet une molécule de séquence d'acides aminés SEQ ID N 1, pour son activité anti-microbienne, et plus particulièrement anti Listeria monocytogenes.
La séquence SEQ ID N 1 correspond à la séquence d'acides aminés de la protéine OVAX.
En effet, les inventeurs ont découvert que la molécule selon SEQ ID N 1 possède une affinité particulière pour l'héparine, un glycosaminoglycane chargé négativement, et pourrait par conséquent se lier à des surfaces chargées négativement telles que le lipopolysaccharide de certaines bactéries Gram négatif, et le peptidoglycane de certaines bactéries Gram positif (dû à la présence de l'acide téichoïque). La liaison entre au moins une de ces séquences chargées positivement et la surface d'un microorganisme chargée négativement entraîne une déstabilisation de la paroi dudit microorganisme, conduisant à sa lyse. La molécule selon l'invention est donc apte à inhiber la croissance de tels microorganismes.
Ainsi, l'invention vise tout particulièrement la molécule de séquence SEQ ID N 1 pour son action anti- Listeria monocytogenes, comme cela est plus spécifiquement exposé ci-dessous.

4 PCT/EP2011/059126 L'invention concerne également une composition comportant une molécule de séquence SEQ ID N 1, en tant que principe actif anti-microbien et notamment comme principe actif anti- Listeria monocytogenes.
La composition selon l'invention, comportant la molécule antimicrobienne de séquence amino acide SEQ ID N 1, peut notamment être destinée à la fabrication d'un médicament anti- Listeria monocytogenes. Une telle composition peut notamment être une solution destinée à être ingérée, et comportant les excipients requis. Autrement, la composition peut être une poudre destinée à être mise en suspension ultérieurement, ou à être conditionnée telle que, sous forme de gélules.
La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la fabrication d'aliments, destinés à l'alimentation animale, humaine ou non humaine, en tant qu'additif alimentaire anti- Listeria monocytogenes.
Avantageusement, la composition est alors utilisée lors du procédé de fabrication du produit alimentaire, ladite composition étant ajoutée dans la préparation destinée à former le produit alimentaire, au cours de son élaboration.
Notamment, la composition peut être utilisée comme additif alimentaire lors de la préparation de charcuteries telles que les pâtés, rillettes, saucisses etc. La composition peut également être ajoutée à du lait destiné à être utilisé pour fabriquer du fromage.
Préférentiellement, la composition est ajoutée à la préparation après toute étape de cuisson et/ou toute étape lors de laquelle ladite préparation est soumise à des températures supérieures à 60 C.
Selon l'invention, la concentration en la molécule de séquence SEQ ID N 1 dans la composition peut être comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement comprise entre 20 pg/mL et 100 pg/mL. De manière encore plus préférée, la concentration en la molécule de séquence SEQ ID N 1 dans la composition est comprise entre 25 pg/mL et 60 pg/mL.
L'invention concerne également une fraction de peptides et/ou protéines, issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, pour son action anti- Listeria monocytogenes.
Par issus du blanc d'oeuf, on entend que les peptides et protéines présents dans la fraction selon l'invention se trouvent tous dans le blanc d'oeuf, et peuvent être obtenus à partir du blanc d'oeuf. Bien entendu, ces

5 PCT/EP2011/059126 peptides et protéines pourront avoir été obtenus autrement que par purification à partir du blanc d'oeuf, et notamment par synthèse chimique ou produite sous forme recombinante.
Par action anti Listeria monocytogenes, ou action dirigée contre Listeria monocytogenes, on entend que cette fraction est apte à inhiber la croissance de cette bactérie et/ou la détruire.
Toutes les molécules de ladite fraction sont aptes à lier l'héparine.
Ainsi, la fraction selon l'invention est susceptible de comporter tout ou partie des peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf pouvant se lier à
l'héparine. Cette fraction peut comporter quelques molécules contaminantes d'ovalbumine, protéine majeure du blanc d'oeuf, qui représente plus de 50%
en proportion des protéines totales présentes dans le blanc d'oeuf, et qui elle ne présente pas d'affinité pour l'héparine.
Ces molécules peptidiques et protéiques ont été isolées directement à
partir de blanc d'oeuf de poule, par chromatographie d'affinité utilisant des billes d'héparine-sépharose, puis identifiées par spectrométrie de masse.
La fraction selon l'invention comporte ainsi au moins une des molécules parmi les peptides et protéines ci-dessous (les références GI ci-après sont extraites de la base de données NCBI, mise à jour en avril 2011) :
- l'OVAX, de poids moléculaire d'environ 45 kDa, plus précisément d'environ 44 kDa, de séquence SEQ ID N 1, et qui présente 1 site consensus HBS liant l'héparine , - une protéine similaire à la protéine MGC82112 (GI :118083274), de poids moléculaire d'environ 170 kDa et présentant 1 site consensus HBS
liant l'héparine ;
- l'Avidine (GI :45384354), de poids moléculaire d'environ 17 kDa cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine , - le Lysozyme C (GI:229157), de poids moléculaire d'environ 14 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente également un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine , - la beta-defensine 11 (GI :49169808), de poids moléculaire d'environ 12 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant

6 PCT/EP2011/059126 l'héparine, ce qui laisse également penser qu'elle présente un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine , - la protéine TENP (GI :46048814) de poids moléculaire d'environ 47 kDa ; cette molécule semble ne présenter aucun site consensus HBS liant l'héparine, ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine , - la cyclophiline B (peptidylprolyl isomerase B) (GI :45382027) de poids moléculaire d'environ 22 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine , - la protéine Vmo-I (pour vitelline membrane Outer Layer Protein I
(GI :576329)) de poids moléculaire d'environ 18 kDa et présentant 1 site consensus HBS liant l'héparine , - l'ovotransferrine (Conalbumine) (GI :71274075) de poids moléculaire d'environ 78 kDa et ne présentant aucun site consensus HBS liant l'héparine ;
- l'ovocléidine 17 (GI :31615312), de poids moléculaire d'environ 15 kDa et ne présentant aucun site consensus HBS liant l'héparine , ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- l'ovoglycoprotéine (GI :45383093), de poids moléculaire d'environ 22 kDa et ne présentant aucun site consensus HBS liant l'héparine , ce qui laisse penser qu'elle présente elle aussi, un ou plusieurs sites de liaison conformationnels à l'héparine ;
- l'ovalbumine (GI :28566340), de poids moléculaire d'environ 43 kDa et présentant un site consensus HBS liant l'héparine ;
- la protéine prédite plasma protease Cl inhibitor-like (GI :326920260), de poids moléculaire d'environ 52 kDa, présentant un site consensus HBS liant l'héparine , - la Clusterine (GI :45382467), de poids moléculaire d'environ 51 kDa et présentant 2 sites consensus HBS liant l'héparine ; et - une protéine prédite hypothetical protein (GI :50728948) similaire à la pléiotrophine (facteur de croissance 8 liant l'héparine) de poids moléculaire d'environ 18,5 kDa et présentant 5 sites consensus HBS liant l'héparine.

7 PCT/EP2011/059126 Par site de liaison conformationnel à l'héparine, on entend une exposition spécifique d'acides aminés chargés positivement, lorsque la molécule est conformée, et formant un site capable de se lier à l'héparine.
La fraction selon l'invention comporte au moins la molécule de séquence SEQ ID N 1 qui correspond à la séquence de dOVAX telle qu'isolée à partir du blanc d'oeuf. La fraction peut autrement, ou également comporter la molécule d'OVAX de séquence SEQ ID N 2, qui correspond à
la séquence connue qui a été prédite à partir de l'analyse bioinformatique du génome de la poule, et qui est identifiée dans la base de données NCBI par la référence XP_418984.2, au nom de la similar to Ovalbumin-related protein Y (Gene Y protein), nommée OVAXdb sur la Figure 3.
La fraction selon l'invention peut avantageusement comporter l'ensemble des peptides et protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, tels que listés ci-dessus.
Dans ce cas, il est intéressant de prévoir que la molécule de séquence SEQ ID N 1 et/ou de séquence SEQ ID N 2 représente au moins 50% en proportion des molécules de la fraction.
Une telle fraction peut alors être obtenue directement par passage du blanc d'oeuf sur chromatographie d'affinité de type héparine-sépharose (ou héparine-agarose), et utilisée telle que. En effet, la fraction issue de cette chromatographie comporte, de fait, plus de 50 %, et même plus de 56 %, d'OVAX (Fig. 1, piste 5 -HB-EW, tâche autour de 45-50 kDa). C'est la quantification des pixels de la bande de 50 kDa du gel rapportée au nombre de pixel total du puits qui a permis d'estimer la quantité de la molécule d'OVAX dans cette fraction à au moins 50 %, et même au moins 56 %, en proportion. On retrouve également de dOVAX dans les autres bandes, mais dOVAX étant alors avec d'autres molécules, on ne peut pas quantifier la part due à dOVAX
Ainsi, l'utilisation de cette fraction en agro-alimentaire ou dans le domaine médical, peut être directe, puisque l'oeuf est une denrée alimentaire communément utilisée par l'homme, et dont l'innocuité, hormis pour les personnes allergiques, est reconnue.
Bien entendu, tout ou partie des molécules de la fraction selon l'invention peut également être obtenue par synthèse chimique ou sous forme de protéine recombinante, notamment à partir de la séquence

8 PCT/EP2011/059126 peptidique correspondante, puisque le génome de la poule a déjà été
entièrement séquencé.
L'invention a également pour objet une composition comportant la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention en tant que principe actif anti- Listeria monocytogenes. Autrement dit, la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention peut être utilisée en tant que principe actif anti-Listeria monocytogenes, pour la réalisation d'une composition médicinale, alimentaire ou autre.
Selon l'invention, la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'ceuf et aptes à lier l'héparine dans la composition peut être comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement comprise entre pg/mL et 100 pg/mL. De manière encore plus préférée, la concentration en ces molécules dans la composition est comprise entre 25 pg/mL et 60 pg/mL.
15 Par concentration totale, on entend la concentration cumulée de chacun des peptides et/ou protéines selon l'invention présents dans la fraction utilisée pour réaliser la composition.
Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, la fraction présente dans la composition est digérée par au moins une enzyme 20 digestive, de préférence par la trypsine ou par la chymoptrypsine, préalablement à son utilisation.
La composition à base de la fraction de peptides et/ou protéines selon l'invention peut notamment être destinée à la fabrication d'un médicament anti- Listeria monocytogenes. Une telle composition peut être une solution destinée à être ingérée, et comportant les excipients requis. Autrement, la composition peut être une poudre, et notamment une poudre de blanc d'ceuf éventuellement enrichie en la fraction selon l'invention, pour être mise en suspension ultérieurement, ou être conditionnée sous forme de gélules.
La composition selon l'invention peut également être utilisée pour la fabrication d'aliments, destinés à l'alimentation animale, humaine ou non humaine, en tant qu'additif alimentaire anti- Listeria monocytogenes.
Avantageusement, la composition est alors utilisée lors du procédé de fabrication du produit alimentaire, ladite composition étant ajoutée dans la préparation destinée à former le produit alimentaire, au cours de son élaboration.

9 PCT/EP2011/059126 Notamment, la composition peut être utilisée comme additif alimentaire lors de la préparation de charcuteries telles que les pâtés, rillettes, saucisses etc. La composition peut également être ajoutée à du lait destiné à être utilisé pour fabriquer du fromage.
Préférentiellement, la composition est ajoutée à la préparation après toute étape de cuisson et/ou toute étape lors de laquelle ladite préparation est soumise à des températures supérieures à 60 C.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 est une photographie d'un gel SDS-PAGE montrant la migration des protéines du blanc d'ceuf de poule ; ainsi, on peut voir la trypsine seule (piste T), la chymotrypsine seule (piste CT), les protéines du blanc d'oeuf dans leur ensemble (piste EW), les protéines de la fraction du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine (piste HUB-EW), les protéines de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine (piste HB-EW), les protéines de la fraction du blanc d'ceuf liant l'héparine après digestion à la trypsine (piste HB-EW-T), et les protéines de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine après digestion à la chymotrypsine (piste HB-EW-CT).
La figure 2 est une photographie d'un gel SDS-PAGE des différentes étapes d'un premier mode de purification de l'OVAX ; la première piste (1) représente le blanc d'oeuf ; la deuxième piste (2) la fraction éluée de l'héparine-sépharose ; la troisième piste (3), la fraction non-fixée de la biotine-sépharose ; et la quatrième piste (4) le pic correspondant à l'OVAX
après tamisage moléculaire.
La figure 3 est un alignement de séquences d'acides aminés entre la séquence de l'OVAX issue de la base de données NCBI (OVAXdb, XP418984.2 GI :118086485) et la séquence prédite par le logiciel Genemark de l'Institut de technologie de Georgie (http://exon.gatech.edu/eukhmm.cgi) (OVAXgs) à partir de la séquence nucléotidique correspondant au gène de l'OVAX (référence NW_001471638.1 dans la base de données NCBI).
La figure 4 comporte deux graphiques (Figures 4A et 4B) montrant respectivement l'activité antimicrobienne en milieu liquide de l'Ovalbumine et de l'OVAX issu du premier mode de purification vis-à-vis de Listeria monocytogenes. La croissance de Listeria monocytogenes a été suivie à

10 PCT/EP2011/059126 600 nm pendant 20 heures sans Ovalbumine/OVAX ou avec des concentrations croissantes d'Ovalbumine/OVAX.
La figure 5 comporte cinq graphiques (Figures 5A à 5E) montrant l'activité anti Listeria monocytogenes, en milieu liquide, de différents échantillons de blanc d'oeuf, à différentes concentrations. Ainsi, la figure montre l'activité anti Listeria monocytogenes du blanc d'oeuf pur, la figure montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine ; la figure 5C montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine ; la figure 5D montre l'activité
anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la trypsine ; la figure 5E montre l'activité anti Listeria monocytogenes de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la chymotrypsine.
La figure 6 est une photographie d'un gel SDS-PAGE réalisé à l'issue d'un second mode de purification de l'OVAX, l'unique piste représentant la fraction finale obtenue.
La figure 7 est une photographie d'un milieu gélosé montrant l'activité
anti Listeria monocytogenes de l'OVAX issu du second mode de purification, à différentes concentrations, par rapport à la Beta-defensine 11 (témoin positif) et à l'Ovalbumine (témoin négatif).

Collecte et préparation du blanc d'oeuf.
Les blancs d'oeufs ont été collectés à partir de plusieurs oeufs provenant de poules pondeuses (Isa-Hendrix, St Brieuc, France) et dilués au 1/2 dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4.
L'échantillon a été homogénéisé délicatement et centrifugé à 14 000 g pendant 10 minutes à 4 C.
Le surnageant obtenu a été congelé jusqu'à utilisation ultérieure. Bien entendu, il est autrement possible de procéder directement aux étapes de purification, sans congélation préalable.

11 PCT/EP2011/059126 1/2.1- Purification de I'OVAX.
Une chromatographie de type héparine-sépharose a été effectuée en utilisant la technique en batch suivant les instructions du fournisseur (Marque GE-Healthcare, distribué par Fischer Scientific, W7346E).
On équilibre quatre fois 0,6 g de billes d'héparine-sépharose dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7,4 dans des tubes Falcon de 50 mL.
On ajoute dans chaque tube 15 mL de blanc d'ceuf préparé comme décrit ci-dessus et 15 mL de Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4.
On incube, sous agitation douce, toute une nuit à 4 C.
A l'issue de l'incubation, les protéines sans affinité pour l'héparine-sépharose sont éliminées par lavages successifs en tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4 et centrifugation des billes pendant 5 minutes à 1500 g à 4 C.
L'efficacité des lavages est vérifiée en mesurant l'absorbance à 280 nm, une absorbance de 0 attestant de l'élimination totale de ces protéines.
Les billes sont alors chargées sur deux colonnes de polypropylène de 5 mL (Qiagen, courtaboeuf, France, 34964).
L'élution des protéines affines est réalisée en tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 1M, pH 7,4 par pas de 1 mL sur les deux colonnes en parallèle (l'expérience a montré que le rendement était meilleur en chargeant sur deux colonnes plutôt qu'une) et est suivie en mesurant l'absorbance à 280 nm.
Les fractions d'élution les plus concentrées sont regroupées et dialysées pendant 24 heures contre du tampon Phosphate de Na 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7.4 (PBS) dans des membranes de dialyse (exclusion de 3500 Da) (Marque Spectrum, distribuées par Fischer Scientific, 132720).
A l'issue de la dialyse, l'échantillon est centrifugé à 10000 g pendant 10 minutes à 4 C. Le surnageant est alors chargé sur une colonne de polypropylène de 1 mL, dans laquelle 1,5 mL de billes d'agarose couplées à
la biotine (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France, B0519) ont été au préalable équilibrées dans du tampon PBS.
Le non-fixé de la colonne est récupéré et concentré sur cellule de concentration d'exclusion 3500 Da (Millipore, UFC900324). Cette étape

12 PCT/EP2011/059126 permet d'éliminer l'avidine de l'échantillon, cette dernière présentant une forte affinité pour la biotine.
L'échantillon concentré est alors injecté sur une chromatographie d'exclusion TSK-gel filtration G3000SW (Tosoh Bioscience, Hampton, UK) préquilibréé en tampon PBS.
Le pic majeur correspondant à l'OVAX est collecté et concentré sur cellule de concentration d'exclusion 3500 Da (Millipore, UFC900324).
Les différentes étapes de purification ont été analysées par gel SDS-PAGE 4-20% en conditions non-réductrices après coloration au bleu de Coomassie afin de vérifier la pureté de la protéine.

1/2.2- Identification de I'OVAX par spectrométrie de masse.
Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en conditions réductrices et colorées au bleu de Coomassie.
La bande majeure de 45 kDa a été extraite du gel et rincée avec de l'eau et de l'acétonitrile.
Les protéines ont été réduites avec du dithiothreithiol, alkylées avec de l'iodoacétamide et digérées par la trypsine (12,5 ng/pL) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) une nuit à 37 C dans du tampon NH4HCO3 25 mM, selon le protocole décrit par Shevchenko et al.
Les extraits peptidiques ont ensuite été séchés.
Plusieurs techniques de spectrométrie de masse ont été utilisées pour identifier l'OVAX et obtenir une couverture de séquence maximale :
- la cartographie MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight) et - la nanochromatographie liquide capillaire monodimensionnelle couplée à de la spectrométrie de masse en tandem (NanoLC-MS/MS).
L'identification par l'approche protéomique dite bottom up a été
réalisée sur un extrait peptidique en solution dans 8 pL d'un mélange d'acide formique 0.1 %/ acétonitrile 2%.
L'analyse NanoLC-MS/MS a été conduite en utilisant un système CapLC couplé à un spectromètre de masse hybride de type Quadrupole time-of-flight (Q-TOF Ultima Global, Waters, Manchester Grande-Bretagne) équipé d'une source d'ion en Z-spray. L'appareil est calibré à l'aide d'une solution de GIuF à 500 fmol/pL (50% d'une solution d'acide

13 PCT/EP2011/059126 formique 1% / 50 % acétonitrile, v/v). Les échantillons sont dessalés et concentrés en ligne par une précolonne (Monolithic trap colonne, 200 pm i.d X 5mm (PS-DVB), Dionex, ref 163972).
La séparation des peptides est réalisée sur une colonne capillaire phase réverse (Acclaim PepMap 100 C18, 5pm, 75 pm I.D., 25 cm de longueur, Dionex) avec un débit de 200 nL/min.
Le profil du gradient est le suivant : Equilibration des colonnes avec 95% de solvant A (0.1 % acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) et 5% de solvant B (0.1% acide formique / 20% H20/ 80% acétonitrile, v/v), Gradient de 5 à 55% de B en 80 min ; Palier à 95% de B pendant 10 min.
L'acquisition des données se fait de façon automatique entre les modes MS et MS/MS (fragmentation) : un MS survey scan est suivi par trois MS/MS scans sur les trois pics détectés les plus intenses.
Seuls les ions bi et trichargés sont sélectionnés comme précurseurs dans une gamme de masse m/z entre 400 et 1300.
L'énergie de collision est sélectionnée en fonction de la masse et la charge de l'ion.
Les données brutes sont traitées par le logiciel ProteinLynx Global Server V 2.2.5 (PLGS) pour créer des fichiers pkl comportant l'ensemble des précurseurs sélectionnés à la fragmentation ainsi que la liste des ions fragments associés.
L'échantillon est soniqué quelques minutes avant le dépôt sur la cible.
1 pL d'échantillon a été déposé sur la cible avec 1 pL de matrice selon la méthode de dépôt dite de la goutte séchée.
La matrice utilisée est une solution de CHCA (a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid) à 5 mg/mL dans 50% éthanol / 50% acétonitrile/TFA
0.1%/10 mM de 18-C-6 crown éther. L'appareil MALDI-TOF a été calibré en externe à l'aide de peptides issus de la digestion tryptique de la BSA (Bovine Serum Albumin) à 300fmol/pL.
Les spectres MALDI-TOF sont obtenus à l'aide d'un spectromètre de masse MALDI L/R P/N (Waters, Manchester, UK).
Les analyses ont été réalisées : en mode positif, en mode réflectron, avec une tension d'accélération de 15 KV, pulse Voltage : 2226, avec une gamme de masse (m/z) de 500 Da à 5000 Da.

14 PCT/EP2011/059126 Le traitement informatique des spectres (substract, smooth, centroid) se fait à l'aide du logiciel MassLynx V4.0 (Waters).
Toutes les masses ont été relevées manuellement pour toutes les cartographies.
Les données expérimentales issues de l'analyse MALDI et NanoLC-MS/MS ont été confrontées à une banque de données non redondantes (NCBInr 20071102, puis 20110403) et à l'aide du logiciel MASCOT (Matrix Science UK, http://www.matrixscience.com).
La spécificité enzymatique a été établie comme étant la trypsine, en incluant deux clivages manquants.
Les modifications variables suivantes ont été sélectionnées : la carbamidométhylcystéine et l'oxydation de la méthionine.
La recherche a été effectuée dans toutes les taxonomies. La précision de masse a été fixée à 0.3 Da. Les protéines candidates ont été validées quand les scores individuels des ions présentaient un niveau de significativité
supérieur à p<0.05.

1/2.3- Séquençage d'Edman 18 pg d'OVAX ont été digérés par la trypsine (1,2 pM, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier) ou la chymotrypsine (1,2 pM, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier) en présence d'héparine (10 pg/mL, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) pendant 1 heure à 37 C.
Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE en conditions réductrices et transférées sur membrane de polyvinylidène.
La bande majeure (40 kDa) a été excisée du gel et analysée par séquençage d'Edman.
La séquence amino-terminale de la protéine a été déterminée par dégradation automatique d'Edman en utilisant le séquenceur LF 3000 (Beckman/Porton) équipé d'un système HPLC on-line Gold HPLC system, Beckman Coulter) pour la détection des dérivés acides-aminés-Phénylthiohydantoine.

1/2.4- Prédiction de la séquence protéique de I'OVAX
La prédiction de la séquence de l'OVAX a été réalisée à partir de la séquence du gène disponible sur le site Ensembl

15 PCT/EP2011/059126 (http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/Info/Index, ENSGALG00000019551), puis ultérieurement à partir de la séquence référencée dans la base de données NCBI sous le numéro NW 001471638.1, en utilisant le logiciel Genemark (Georgia Institute of Technology (http://exon.biology.gatech.edu/).
1/2.5- Analyse de l'activité antimicrobienne de l'OVAX
Les échantillons de blanc d'oeuf (EW), de fractions ne liant pas l'héparine (HUB-EW), et de fractions liant l'héparine (HB-EW) ont été dilués dans du tampon Tris 50 mM, NaCI 150 mM à pH 7,4, afin d'obtenir des échantillons contenant 1,8 mg/mL de protéines. La concentration en protéines a été déterminée en utilisant le test Protein DC (Biorad, Saint-Quentin, France) avec du l'albumine sérique bovine (Interchim, Montluçon, France) comme contrôle. Les échantillons HB-EW (0,9 mg/mL) ont été
digérés soit par de la trypsine à 5,5 pM (HB-EW-T) soit par de la chymotrypsine à 1,2 pM (HB-EW-CT) dans du tampon Tris-HCL 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4 pendant 1 heure à 37 C. La réaction a été stoppée par refroidissement et les produits de la digestion (5 pL pour les échantillons de trypsine, chymotrypsine, EW, HUB-EW, HB-EW, ou 10 pL pour les échantillons de HB-EW-T et HB-EW-CT) ont été analysés par SDS-PAGE 4-20% (figure 1). L'activité anti-microbienne de ces différents échantillons en milieu liquide a été ensuite analysée.
La souche bactérienne EGD de Listeria monocytogenes a été
conservée par congélation dans l'azote liquide dans le milieu de culture Bouillon Coeur Cervelle (Oxoid, Hampshire, England) contenant 15% (v/v) de glycérol.
La souche bactérienne a été mise en culture une nuit à 37 C dans le bouillon Tryptone Soja (TSB, Oxoid), sans agitation.
On a ensuite dilué cette préculture et on l'a utilisée pour inoculer les milieux de culture (TSB) de manière à obtenir une densité bactérienne initiale d'environ 1.107 CFU.mL-1.
La culture a alors été incubée à 37 C sous agitation et la densité
optique a été mesurée régulièrement à 600 nm jusqu'à obtenir des bactéries en phase mi-exponentielle (environ 1. 108 CFU.mL-' après environ 5 heures d'incubation).

16 PCT/EP2011/059126 Dans une première expérimentation, on a suivi la croissance bactérienne en présence de différentes concentrations d'Ovalbumine ou d'OVAX (0-400pg/mL) à l'aide du lecteur de plaque Bioscreen C couplé au logiciel Biolink (Oy Growth Curves Ab Ltd.) dans le milieu de culture TSB.
La croissance bactérienne, la stérilité des milieux de culture et de l'échantillon d'OVAX ou d'Ovalbumine ont été vérifiées sur chaque plaque.
La croissance bactérienne a été enregistrée pendant 24 heures en continu à 37 C, une lecture de la densité optique à 600 nm étant effectuée toutes les 45 minutes (figure 4).
Dans une seconde expérimentation, on a suivi la croissance bactérienne en présence de différentes fractions de blanc d'ceuf à l'aide du lecteur de plaque Bioscreen C couplé au logiciel Biolink (Oy Growth Curves Ab Ltd.) dans le milieu de culture TSB.
La croissance bactérienne, la stérilité des milieux de culture des fractions de blanc d'ceuf, de la trypsine et de la chymotrypsine ont été
vérifiées sur chaque plaque.
Chaque fraction de blanc d'oeuf (EW, HUB-EW, HB-EW, HB-EW
digérée par la trypsine ou la chymotrypsine) a été ajoutée à différentes concentrations. Pour les tests portant sur la fraction liant l'héparine après digestion par la trypsine, des concentrations croissantes de trypsine ont été
ajoutées, après deux dilutions successives de la fraction de blanc d'ceuf liant l'héparine (HB-EW) pour obtenir une concentration de 0,9 pg/mL de HB-EW
et 5,5 pM de trypsine.
La croissance bactérienne a été enregistrée pendant 24 heures en continu à 37 C, une lecture de densité optique à 600 nm étant effectuée toutes les 45 minutes (figure 5).

1/3.1- Purification de dOVAX à partir du blanc d'oeuf Les deux chromatographies d'affinité successives héparine-sépharose et biotine-agarose, suivies par une chromatographie d'exclusion ont permis d'éliminer les protéines majeures du blanc d'ceuf, et d'isoler dOVAX.

17 PCT/EP2011/059126 La figure 1 est une photographie d'un gel des protéines du blanc d'oeuf, aux différents niveaux de purification.
Ainsi, la troisième piste (EW) représente la migration des protéines du blanc d'oeuf dans leur ensemble.
La cinquième piste (HB-EW) représente une fraction selon l'invention, à savoir la fraction de protéines et peptides du blanc d'oeuf liant l'héparine-sépharose. Cette première purification permet notamment d'éliminer l'ovalbumine, protéine majeure dans le blanc d'oeuf (la quatrième piste, HUB-EW, montre les protéines du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine). Il ressort que cette fraction contient majoritairement une protéine de poids moléculaire d'environ 45 kDa.
La digestion de la fraction d'intérêt par la trypsine (Sixième piste - HB-EW-T) et par la chymotrypsine (septième piste - HB-EW-CT) montre que la protéine d'intérêt, de poids moléculaire d'environ 45 kDa, correspondant à
IOVAX, est bien clivée en une pluralité de peptides par ces enzymes.
La même bande à environ 45 kDa est obtenue lors des étapes successives de purification de la fraction de protéines et peptides issue du blanc d'oeuf et liant l'héparine, comme cela est visible sur la figure 2. La purification sur héparine-sépharose (piste 2), suivie d'une purification sur biotine-agarose (piste 3) et d'une filtration sur gel (piste 4) permet d'isoler la protéine de poids moléculaire 45 kDa.
La piste 4 représente une protéine pure à 92%, identifiée comme étant IOVAX. La majorité des contaminants de cette fraction représente des multimères de IOVAX (hautes masses apparaissant sur le gel). En effet, une analyse par western-blot a montré qu'ils réagissent avec des anti-corps anti-ovalbumine et disparaissent après réduction en présence de beta-mercaptoéthanol.
Ainsi, environ 7,5 mg de protéines pures d'OVAX ont pu être obtenus à partir de 50 mL de blanc d'oeuf.
La concentration en OVAX est estimée à environ 0,5 mg/mL de blanc d'oeuf au minimum, ce qui permet d'envisager de nombreuses applications notamment dans le domaine de l'agro-alimentaire, directement par purification de la protéine à partir du blanc d'oeuf.

18 PCT/EP2011/059126 1/3.2- Identification de I'OVAX
L'identification par spectrométrie de masse et séquençage a permis d'isoler et identifier une protéine de séquence SEQ ID N 1, correspondant à
l'OVAX précédemment isolée, qui présente une séquence quasi-identique à
la séquence prédite déjà connue (SEQ ID N 2) à partir de l'analyse bioinformatique du génome du poulet, et disponible dans les banques de données NCBI.
En effet, comme cela est visible sur la figure 3, qui compare les deux séquences d'acides aminés, la séquence SEQ ID N 1 (OVAXgs) présente une différence sur cinq résidus aminoacides par rapport à la séquence SEQ ID N 2 (OVAXdb).
Ces résultats ont été confirmés par séquençage amino terminal de l'OVAX digéré à la trypsine.
Plus précisément, après protéolyse limitée à la trypsine, on a procédé
au séquençage d'Edman (donc par l'extrémité N-terminale), à deux reprises.
Les séquences VQKPKXGKSVNIHLLFXELL / VQKPXXGKSV ont respectivement été obtenues, dans lesquelles X est un résidu qui n'a pas pu être déterminé avec certitude, ce qui est souvent observé avec les cystéines.
Parmi les cinq résidus (KVQKP) qui ont été mis en évidence par Genemark, 4 (VQKP) ont pu être confirmés. Cependant, la trypsine est connue pour couper spécifiquement les séquences peptidiques après les lysines (K) ou les arginines (R). Cette spécificité tend à valider le résidu K
qui précède ces quatre résidus.
Aucun séquençage d'Edman n'a pu être effectué sur l'OVAX native, ce qui laisse penser qu'elle contient une amino-acétylation, bloquant l'extrémité
N-terminale de la molécule.

1/3.3- Activité anti-microbienne Les graphiques de la figure 4 permettent de faire le parallèle entre l'action dans le temps de l'Ovalbumine (Figure 4A) et de l'OVAX (figure 4B) contre Listeria monocytogenes, à des concentrations croissantes en ces molécules, en milieu liquide.
Ainsi, on constate qu'aucune action spécifique contre Listeria monocytogenes n'est observée avec l'Ovalbumine pour des concentrations inférieures à 400 pg/mL. L'effet observé à 400 pg/mL est très faible.

19 PCT/EP2011/059126 A l'inverse, on observe que dOVAX présente une activité anti- Listeria monocytogenes dès 25 pg/mL, au moins pendant les 10 premières heures du test. Avec 50 pg/mL d'OVAX, l'activité anti- Listeria monocytogenes perdure au-delà de 15 heures.
Les graphiques de la figure 5 permettent de faire le parallèle entre l'activité anti- Listeria monocytogenes du blanc d'oeuf (figure 5A - EW), de la fraction du blanc d'oeuf ne liant pas l'héparine (figure 5B - HUB-EW), de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine (figure 5C - HB-EW), de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la trypsine (figure 5D - HB-EW-T), et de la fraction du blanc d'oeuf liant l'héparine, après digestion par la chtmotrypsine (figure 5E - HB-EW-CT).
Le blanc d'oeuf, tout comme la fraction issue du blanc d'oeuf et ne liant pas l'héparine présentent des profils d'activité similaires. Aucune activité
significative anti- Listeria monocytogenes n'est observée, même à des concentrations supérieures à 400 pg/mL.
A l'inverse, on observe un profil d'activité anti- Listeria monocytogenes similaire entre la fraction liant l'héparine et la fraction liant l'héparine digérée par la trypsine.
Une action intermédiaire contre Listeria monocytogenes est obtenue dès 28 pg/mL, cette action étant quasi-optimale à 56 pg/mL.
28 pg/mL de l'une ou l'autre de ces fractions suffisent à réduire de plus de 50% la croissance de la bactérie. A cette concentration, pendant les 16 premières heures, les fractions HB-EW et HB-EW-T semblent interférer avec la croissance des bactéries, et semblent agir contre celle-ci, la croissance bactérienne étant réduite de plus de 50%. Après 16 heures, on observe une nouvelle dégradation de la croissance du pathogène.
L'action de la trypsine pure contre Listeria monocytogenes a également été étudiée (figure 5D). On observe un léger effet sur la croissance de Listeria monocytogenes. Il faut soustraire cet effet à celui observé pour IOVAX à la plus forte concentration. En effet, dans l'échantillon le plus concentré d'OVAX, il y a de la trypsine concentrée. Cet échantillon est ensuite dilué de 2 en 2, la concentration en trypsine diminuant donc d'autant et son activité antimicrobienne propre aussi. Ici, la trypsine sert de contrôle.
Des résultats comparables ont été obtenus avec la fraction liant l'héparine et digérée par chymotrypsine (Figure 5E).

20 PCT/EP2011/059126 Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus avec lOVAX seule (Figure 4B), qui sont comparables. Dans ces trois cas, on observe un effet dose dépendant de la fraction ou de la molécule sur Listeria monocytogenes.

Un second mode de purification de la protéine OVAX a été mis en oeuvre, afin d'obtenir la protéine avec un degré de pureté plus élevé.
L'activité antimicrobienne ainsi obtenue a été testée en milieu gélosé, comme détaillé ci-après.
2/1- Collecte et préparation du blanc d'oeuf L'OVAX a été purifiée à partir du blanc d'oeufs de poule.
Les oeufs de poules (ISA Brown, Hendrix Genetics, Saint-Brieuc, France) fraîchement pondus ont été collectés, cassés, les blancs et les jaunes ont été indépendamment échantillonnés.
Les blancs d'oeufs ont été réunis et le mélange résultant a été dilué au 1/2 dans du Tris-HCI 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7,4 et homogénéisé. Le mélange a ensuite été centrifugé à 14 000 rpm, à 4 C pendant 10 minutes afin d'éliminer les protéines visqueuses. Le surnageant a été conservé à
-20 C.

2/2- Purification de LOVAX
La purification de LOVAX à partir du blanc d'oeuf a été réalisée en trois étapes.
La première étape de purification est une chromatographie d'affinité
de type Héparine-Sépharose : 30 mL du surnageant issu de blancs d'oeufs préparés comme indiqué ci-dessus ont été dilués au 1/2 dans du Tris-HCI
50 mM, NaCI 300 mM, pH 7,4, et incubés sur la nuit à 4 c avec des billes de sépharose couplées à l'héparine (GE Healthcare, Uppsala, Suède).
Les billes de sépharose ont été lavées extensivement avec un tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4, afin d'éliminer les peptides/protéines non fixés, et les protéines affines ont ensuite été éluées avec un tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 1 M, pH 7,4.
Les fractions éluées ont été concentrées sur membrane de concentration (Millipore, Ireland, UFC800324) et l'échantillon résultant a été

21 PCT/EP2011/059126 injecté sur une colonne Sephacryl S-100 High Resolution, Hi-prep 16/60 (GE
Healthcare, Uppsala, Suède) prééquilibrée dans du tampon Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4.
Le pic majeur contenant l'OVAX a ensuite été passé sur une colonne d'affinité type biotine-sépharose prééquilibrée dans du tampon Tris-HCI
50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4, afin d'éliminer toute trace d'avidine dans l'échantillon, l'OVAX étant recouvrée dans la fraction non fixée aux billes de biotine.
La fraction non fixée aux billes de biotine, contenant dOVAX, a été
analysée par électrophorèse en SDS-PAGE en conditions non réductrices après coloration au bleu de Coomassie.
Comme montré sur la Figure 6, les résultats montrent une bande hétérogène de 40 à 50 kDa de masse apparente, la masse théorique de l'OVAX étant de 44,2 kDa.
2/3 - Identification de l'OVAX par spectrométrie de masse 5 pg (10pL) d'échantillon d'OVAX purifié comme indiqué ci-dessus ont été digérés par la trypsine pendant 16h à 37 C dans les conditions suivantes.
10 pL d'échantillon, 10 pL de bicarbonate d'ammonium 100 mM et 1 pL
de dithiothréithiol 100 mM, ont été mélangés et incubés pendant 30 min à
56 C.
lpL d'iodoacétamide 250 mM ont été ajoutés, et la solution a été
incubée pendant 30 min dans le noir à température ambiante.
2pL de trypsine à 0,1 pg/pL dans TFA 0.01 % ont été ajoutés.
Les peptides issus de cette digestion ont été analysés par un système nanoHPLC CapLC (Waters, Manchester, UK) couplé à un spectromètre de masse Q-TOF Ultima Global (Waters Micromass, Manchester, UK) équipé
d'une source d'ion en Z-spray. L'appareil a été calibré à l'aide d'une solution de GIuF à 500 fmol/pL (50% d'une solution d'acide formique 1% / 50 %
acétonitrile, v/v) Les tubes contenant les produits de digestion ont été portés à sec et 15 pL de tampon A (0.1% acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) ont été ajoutés. Les échantillons ont été dessalés et concentrés en ligne par

22 PCT/EP2011/059126 une précolonne (Monolithic trap colonne, 200 pm i.d X 5mm (PS-DVB), Dionex, ref 163972).

La séparation des peptides a été réalisée sur une colonne capillaire phase réverse (Acclaim PepMap 100 C18, 5pm, 75 pm I.D., 25 cm de longueur, Dionex) avec un débit de 200 nL/min.
Le profil du gradient est le suivant :
- Equilibration des colonnes avec 95% de solvant A (0.1% acide formique / 2% acétonitrile / 98% H2O, v/v) et 5% de solvant B (0.1% acide formique / 20% H2O / 80% acétonitrile, v/v) - Gradient de 5 à 50% de B en 60 min - Palier à 95% de B pendant 10 min.

L'acquisition des données s'est faite de façon automatique entre les modes MS et MS/MS (fragmentation) : un MS survey scan a été suivi par 4 MS/MS scans sur les 4 pics détectés les plus intenses.
Les données brutes ont été traitées par le logiciel ProteinLynx Global Server V 2.2.5 (PLGS) pour créer des fichiers pkl comportant l'ensemble des précurseurs sélectionnés à la fragmentation ainsi que la liste des ions fragments associés.
Les données expérimentales ont été confrontées à une banque de donnée à l'aide du logiciel MASCOT disponible sur le server local.
Les recherches ont été réalisées en sélectionnant les critères suivants :
- banque de donnée : nr NCBI
- enzyme : trypsine - peptide charge : 2+ et 3+
- 2 miss cleavages - 0.3 Da de précision de masse sur MS et MS/MS
- Data format : pkl - Instrument : ESI-QUAD-TOF
- carbamidométhylation et oxydation des méthionines en modifications partielles - taxonomie : Chordata

23 PCT/EP2011/059126 Les résultats ont permis d'identifier l'OVAX (NCBI Reference Sequence: XP_418984.2) avec 6 peptides uniques identifiés :
AGLETVNFK
ALHFDSIAGLGGSTQTK
QLINSWVEKQTEGQIK
SVNIHLLFKELLSDITASK
ILELPFASGDLSMLVLLPDEVSGLER
VQHTNEN ILYSPLSI IVALAMVYMGAR.
Aucune autre espèce moléculaire n'a été identifiée dans l'échantillon.
Ces résultats indiquent que l'échantillon contient de l'OVAX avec un degré de pureté très élevé (sinon pure).
Un séquençage d'Edman, selon la méthode exposée ci-dessus pour l'Expérimentation 1, a confirmé que cette protéine présente la séquence d'acides aminés SEQ ID N 1.
2/4 - Analyse de l'activité antimicrobienne de l'OVAX
L'activité anti-Listeria monocytogenes de l'OVAX purifiée comme décrit ci-dessus a été mesurée par le test de diffusion radiale selon la méthode décrite par Lehrer et al.
La beta-defensine 11 a été utilisée comme témoin positif (Hervé et al).
L'ovalbumine de blanc d'oeuf a été utilisée comme témoin négatif, les séquences de cette protéine et de l'OVAX étant très proches (61 % d'identité
de séquence) et leurs poids moléculaires étant comparables (44,2 kDa pour l'OVAX et 42,9 kDa pour l'ovalbumine).
Un témoin H2O et un témoin TBS NaCI 150 mM, ne contenant aucun peptide / protéine ont également été utilisés.
La concentration de l'ovalbumine (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, A7641) et de l'OVAX a été déterminée en utilisant les réactifs DC
Biorad (Biorad, Marnes la Coquette, France) et l'albumine sérique bovine (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, P0834) pour établir la courbe étalon.
Les bactéries (Listeria monocytogenes) ont été incubées toute la nuit sous agitation à 37 C. La préculture obtenue a ensuite été diluée dans du TSB (Bouillon Tryptone Soja) jusqu'à ce que la densité optique mesurée à
600 ou 620 nm soit égale à 0,02 de façon à standardiser les conditions de culture. La culture a été incubée pendant 4h à 37 C sous agitation pour

24 PCT/EP2011/059126 obtenir une culture en phase de croissance exponentielle. Les bactéries ont ensuite été centrifugées à 900 g pendant 10 min à 4 C, puis lavées une fois avec un tampon phosphate de sodium 10 mM (pH 7,4) froid, et re-suspendues dans 10 ml de ce même tampon. La densité optique de cette suspension bactérienne a alors été mesurée de façon à déterminer le volume à prélever permettant d'obtenir 7,5.106 cfu de bactéries. Ce dernier volume a été mélangé avec 25 mL de milieu underlay (tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4, contenant 0,03% [poids/volume] de BHI, 1%
[poids/volume] d'agarose de faible électro-endosmose [Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France] et 0,02% de Tween-20) préchauffé à 46 C.
La solution d'agarose contenant 7,5.106 cfu de bactéries a été coulée dans une boite de pétri pour former une couche uniforme de 1 mm. 36 puits (3 mm de diamètre) régulièrement espacés ont été creusés dans la gélose à
l'aide d'un emporte-pièce.
Des solutions d'OVAX, de beta-defensine 11 et d'ovalbumine, à
différentes concentrations, ont été réalisées.
5 pL de chacune de ces solutions ont été déposés dans deux des puits.
La boite de pétri a été incubée à 37 C pendant 3h, pour permettre aux molécules de diffuser dans le milieu gelosé contenant les bactéries.
La première couche de milieu gélosé (underlay) a ensuite été
recouverte avec 25 mL de milieu overlay (tampon phosphate de sodium lOmM pH 7,4, contenant 6% [poids/volume] BHI et 1% [poids/volume]
agarose). Après une incubation d'une nuit à 37 C, le diamètre en mm de la zone d'inhibition autour de chaque puits a été déterminé par la différence entre le diamètre de la zone claire autour du puits et le diamètre du puits.
Plus ce diamètre est grand, plus la molécule est active à l'encontre de Listeria monocytogenes.
Les résultats sont montrés sur la Figure 7. On y observe clairement une activité antimicrobienne de dOVAX sensiblement pure, de manière dose-dépendante vis-à-vis de Listeria monocytogenes, alors qu'aucune activité
n'est visible pour l'ovalbumine.

25 PCT/EP2011/059126 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Agents Chemother. 54(10) : 4401-4408

Claims (21)

1- Molécule antimicrobienne présentant la séquence amino acide SEQ ID N~1 pour son action anti-Listeria monocytogenes.

2- Composition comportant la molécule antimicrobienne selon la revendication 1 en tant que principe actif anti-Listeria monocytogenes, pour son utilisation en tant que médicament anti-Listeria monocytogenes.

3- Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la concentration en la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N~1 est comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 pg/mL
et 100 pg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 pg/mL et 60 pg/mL.

4- Utilisation d'une composition comportant la molécule antimicrobienne selon la revendication 1 en tant que principe actif anti-Listeria monocytogenes, comme additif alimentaire anti-Listeria monocytogenes.

5- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la concentration en la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N~1 dans la composition est comprise entre 15 pg/mL et 400 pg/mL, et préférentiellement entre 20 pg/mL et 100 pg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 pg/mL et 60 pg/mL.

6- Composition comportant une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, et comportant au moins la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N~1 selon la revendication 1, en tant que principe actif anti-Listeria monocytogenes, pour son utilisation en tant que médicament anti-Listeria monocytogenes.

7- Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi une protéine similaire à la protéine MGC82112, l'Avidine, le Lysozyme C, la beta-defensine 11, la protéine TENP, la cyclophiline B, la protéine Vmo-I, et la Clusterine.

8- Composition selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi l'Ovotransferrine, l'ovocléidine 17, l'ovoglycoprotéine, l'ovalbumine, la plasma protease C1 inhibitor-like et la hypothetical protein similaire à

la pléiotrophine.

9- Composition selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N o 1 représente au moins 50% en proportion de la fraction.

10- Composition selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine est comprise entre 15 µg/mL et 400 µg/mL, et préférentiellement entre 20 µg/mL et 100 µg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 µg/mL et 60 µg/mL.

11- Composition selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisée en ce que la fraction est digérée par au moins une enzyme digestive.

12- Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une trypsine.

13- Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une chymotrypsine.

14- Utilisation d'une composition comportant une fraction de peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine, et comportant au moins la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N o 1, en tant que principe actif anti-Listeria monocytogenes, comme additif alimentaire anti-Listeria monocytogenes.

15- Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi une protéine similaire à la protéine MGC82112, l'Avidine, le Lysozyme C, la beta-defensine 11, la protéine TENP, la cyclophiline B, la protéine Vmo-I, et la Clusterine.

16- Utilisation selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce que ladite fraction comporte en outre au moins une molécule parmi l'Ovotransferrine, l'ovocléidine 17, l'ovoglycoprotéine, l'ovalbumine, la plasma protease C1 inhibitor-like et la hypothetical protein similaire à

la pléiotrophine.

17- Utilisation selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que la molécule antimicrobienne de séquence SEQ ID N o 1 représente au moins 50% en proportion de ladite fraction.

18- Utilisation selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que la concentration totale en peptides et/ou protéines issus du blanc d'oeuf et aptes à lier l'héparine dans la composition est comprise entre 15 µg/mL et 400 µg/mL, et préférentiellement entre 20 µg/mL et 100 µg/mL et de manière encore plus préférée entre 25 µg/mL et 60 µg/mL.

19- Utilisation selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que la fraction est digérée par au moins une enzyme digestive.

20- Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une trypsine.

21- Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'au moins une enzyme digestive est une chymotrypsine.