EP2464742A2 - Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa) - Google Patents

Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa)

Info

Publication number
EP2464742A2
EP2464742A2 EP10761051A EP10761051A EP2464742A2 EP 2464742 A2 EP2464742 A2 EP 2464742A2 EP 10761051 A EP10761051 A EP 10761051A EP 10761051 A EP10761051 A EP 10761051A EP 2464742 A2 EP2464742 A2 EP 2464742A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mrsa
medium
alpha
reaction medium
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP10761051A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
EP2464742B1 (fr
Inventor
Gilles Zambardi
Jean-Marc Roche
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2464742A2 publication Critical patent/EP2464742A2/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP2464742B1 publication Critical patent/EP2464742B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus

Definitions

  • the present invention relates to a reaction medium for the detection of Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA or MRSA).
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria
  • the invention also relates to the use of this medium, as well as a method for identifying MRSA bacteria.
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus
  • Oxacillin an antibiotic
  • MRSA bacteria represent a high percentage of nosocomial infections, and are often the cause of serious and potentially fatal health problems. Most often transmitted cross-over between patients via the nursing staff, MRSA is responsible for endemic infections very difficult to control.
  • screening for MRSA carriers and isolation of colonized patients is the most effective method now recommended by official bodies such as the Society for Healthcare Epidemiology of America (American Society for Epidemiology). hospital). Early and systematic screening is therefore essential.
  • the detection of MRSA can be done by different techniques.
  • MRSA Staphylococcus aureus
  • the detection of MRSA is carried out in an additional step, by a specific agglutination test, (Slidex MRSA, bioMérieux) or by an agar diffusion method in the presence of an Oxacillin disk of Cefoxitine or Latamoxef (recommendations of the Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology and the Clinical Laboratory Standard Institute).
  • the invention proposes to solve the deficiencies of the state of the art by presenting a new reaction medium, sensitive, specific, and allowing isolation and rapid identification of Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus
  • reaction medium means a medium comprising all the elements necessary for the survival and / or growth of microorganisms, such as Staphylococcus aureus.
  • This reaction medium can either serve only as a revelation medium or a culture medium and revelation.
  • the culture of the microorganisms is carried out before inoculation and, in the second case, the reaction medium also constitutes the culture medium.
  • the reaction medium may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • the medium according to the invention is a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use other gelling agents such as for example gelrite, gelatin or agarose.
  • a number of preparations are commercially available, such as Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Chapman agar, Sabouraud agar or more generally those described in the Handbook of Microbiological Media (CRC). Press).
  • the reaction medium according to the invention may contain any other additives, for example: peptones, one or more growth factors, carbohydrates, one or more selective agents, buffer solutions, one or more gelling agents, etc.
  • This reaction medium may be in the form of a liquid, a ready-to-use gel, that is to say ready for seeding in a tube, a bottle, or on a petri dish.
  • a regeneration passage at 100 ° C. of the medium is preferably carried out before the medium is cast in a petri dish.
  • the medium according to the invention is a selective medium, that is to say a medium comprising inhibitors which favor the growth of Staphylococcus aureus bacteria.
  • Lithium Chloride (LiCl), Sodium Azide (NaN 3), Colistin, Amphotericin, Aztreonam, Colimicine, Sodium Chloride (NaCl), Deferoxamine, vibriostatic compound 0/129 may be mentioned in particular.
  • the substrate of an enzymatic or metabolic activity is chosen from any substrate that can be hydrolysed into a product that allows the direct or indirect detection of an enzymatic activity or a metabolism, such as, in particular, a osidase activity, preferably a glucuronidase, glucosidase or galactosidase activity.
  • the metabolism of the substrate causes a variation in the physicochemical properties of the reaction medium or the cells of organisms.
  • This variation can be detected by physicochemical methods, especially optical methods by the eye of the operator or by means of instruments, spectrometric, electrical, magnetic, ...
  • it is a question of a change in optical properties, such as a change in absorption, fluorescence or luminescence.
  • staining is used to cover staining, light absorption in the visible spectrum, or fluorescence, absorption at a wavelength ( ⁇ ex) and emission at a longer wavelength ( ⁇ em, ⁇ em > ⁇ ex).
  • chromogenic substrate is intended to mean any substrate that can be hydrolysed to a product that enables the direct or indirect detection of an enzymatic activity, such as in particular an osidase activity, preferably an alpha glucosidase, esterase activity, preferentially a phosphatase activity, peptidase, preferably a coagulase activity.
  • an enzymatic activity such as in particular an osidase activity, preferably an alpha glucosidase, esterase activity, preferentially a phosphatase activity, peptidase, preferably a coagulase activity.
  • substrates based on indoxyl flavone, alizarin, acridine, phenoxazine, nitrophenol, nitroaniline, naphthol, catechol, hydroxyquinoline, coumarin, hydroxyphenyl-quinoxazol-4-one.
  • the substrate (s) used in the present invention is (are) based on indoxyl.
  • alpha-glucosidase substrate there may be mentioned more particularly 5- Bromo-6-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside substrates; Dihydroxyflavone-alpha-glucoside; 3,4-Cyclohexenesculetin-alpha-glucoside; 8-Hydroxiquinoline-alpha-glucoside; 5-Bromo-4- chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside; 6-Chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside; 5-Bromo-3-indoxyl-alpha-glucoside; 5-Iodo-3-indoxyl-alpha-glucoside; 6-Fluoro-3-indoxyl-alpha-glucoside; Alizarin-alpha-glucoside; Nitrophenyl-alpha-glucoside; 4-Methylumbelliferyl-alpha-gluco
  • Aminophenyl-alpha-glucoside Dichloroaminophenylglucoside-alpha-glucoside.
  • the alpha glucosidase substrate used is 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside or 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside.
  • phosphatase substrate there may be mentioned more particularly 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-phosphate substrates; 3,4-Cyclohexenesculin-phosphate; 5-Bromo-4-chloro-
  • 6-Fluoro-3-indoxylphosphate Nitrophenyl phosphate; 4-Methylumbelliferyl phosphate;
  • Indoxyl-N-methyl-phosphate Naphthyl phosphate, ELF97-phosphate.
  • the phosphatase substrate used is 6-chloro-3-indoxylphosphate.
  • the substrate used in the present invention may be in combination with other substrates, such as an osidase substrate, esterase and in particular phosphatase or phospholipase, peptidase and in particular coagulase.
  • the medium may comprise two substrates of alpha glucosidase.
  • the substrates of the invention are usable over a wide pH range, in particular between pH 5.5 and 10, preferably between 6.5 and 9.
  • an antibiotic which belongs to the cephalosporin family is an antibiotic preferentially chosen from
  • cephalosporin such as Cefalexin, Cefaloridine, Cefalotine, Cefazolin, Cefadroxil, Cefazedone, Cefatrizine, Cefapirine, Cefradine,
  • cephalosporin such as Cefoxitin, Cefuroxime, Cefamandole, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicide, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazole, Cefprozil, Ceforanide, Cefminox
  • cephalosporins such as Cefotaxime, Ceftazidime
  • the antibiotic which belongs to the cephalosporin family is preferably Cefminox or Cefdinir.
  • an antibiotic which belongs to the aminoglycoside family is an antibiotic preferentially chosen from Amikacin, Gentamicin, Isepamicine, Kanamycin, Netilmicin, Streptomycin, Tobramycin.
  • the antibiotic which belongs to the aminoglycoside family is preferably Amikacin or Kanamycin.
  • a biological sample is a clinical specimen derived from a bronchial, tracheal or pulmonary aspiration sample, pleural fluid, bronchoalveolar lavage, sputum, blood or lung biopsy, articular or pericardial fluid; biological fluid or a food sample, from any type of food, or a surface sample.
  • This sample may thus be liquid or solid and may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of blood, plasma, urine, faeces, nose samples, perineum, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a food sample.
  • sample we mean the collection itself (swab, stool, food, ...) as well as colonies of microorganisms from said sample (for example after isolation on a gelled culture medium, or in a broth of enrichment seeded with said sample).
  • the invention relates to a reaction medium for the detection and / or identification of Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA) comprising a chromogenic substrate, a first antibiotic which belongs to the cephalosporin family and a second antibiotic which belongs to the aminoglycoside family.
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria
  • said first antibiotic is Cefminox or Cefdinir.
  • concentration of Cefminox is between 10 and 35 mg / l, preferably between 12 and 28 mg / l.
  • Cefdinir concentration is between 0.1 and 1 mg / l, preferably between 0.2 and 0.6 mg / l.
  • said second antibiotic is Kanamycin or Amikacme.
  • the concentration of Kanamycin is between 0.2 and 1.5 mg / l, preferably between 0.5 and 1.25 mg / l.
  • the Amikacin concentration is between 0.5 and 5 mg / l, preferably between 1 and 2 mg / l.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefminox and Kanamycin.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefminox and Amikacme.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefdinir and Kanamycin.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefdinir and Amikacin.
  • said chromogenic substrate enables the detection of an osidase, esterase or peptidase activity.
  • said osidase activity is an alpha-glucosidase activity.
  • Said substrate with alpha-glucosidase activity is preferably an indoxyl-alpha-glucoside.
  • the substrate used is 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside (X-alpha-glucoside) or 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside (GreenA-alpha-glucoside).
  • this substrate is present in the medium at a concentration of between 0.01 and 0.2 g / l, preferably between 0.03 and 0.15 g / l. In fact, at this concentration of substrate, a better color contrast is obtained.
  • said esterase activity is a phosphatase activity.
  • the substrate used is 6-chloro-3-indoxyl-phosphate (Rose-Phosphate).
  • this substrate is present in the medium at a concentration of between 0.05 and 0.5 g / l, preferably between 0.1 and 0.4 g / l. In fact, at this concentration of substrate, a better color contrast is obtained.
  • said reaction medium further comprises a second enzymatic substrate.
  • said second substrate is an alpha-glucosidase substrate.
  • said first substrate is an alpha-glucosidase substrate, preferentially X-alpha-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside) and said second substrate is an alpha-glucosidase substrate. preferentially GreenA-alpha-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside).
  • the medium further comprises at least one inhibitor which favors the growth of Staphylococcus aureus bacteria, such as lithium chloride (LiCl), sodium azide (NaN3), colistin, amphotericin , Aztreonam, Polymixins, Sodium Chloride (NaCl) and Deferoxamine.
  • at least one inhibitor which favors the growth of Staphylococcus aureus bacteria such as lithium chloride (LiCl), sodium azide (NaN3), colistin, amphotericin , Aztreonam, Polymixins, Sodium Chloride (NaCl) and Deferoxamine.
  • the medium further comprises a mixture of inhibitors, comprising four inhibitors, which favors the growth of Staphylococcus aureus bacteria, which are LiCl, vibriostatic compound 0/129, Aztreonam, and . Amphotericin.
  • the invention also relates to the in vitro use of a reaction medium as defined above for isolating and identifying Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteria.
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus
  • the invention also relates to a method for detecting and / or identifying Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA) in a biological sample according to which
  • the biological sample likely to contain Maphylococcus aureus bacteria resistant to Meticillin MRSA is inoculated on a reaction medium as defined above
  • the incubation is preferably carried out at a temperature of between 30 ° C. and 42 ° C.
  • the MRSA are preferably detected by one or two ⁇ -glucosidase activities or a phosphatase activity which makes it possible to obtain colored or fluorescent colonies.
  • Other species of Staphylococcus appear colorless or of a different color or fluorescence than that of S. aureus colonies.
  • Step a) may be preceded by a step of pre-enrichment in a selective or non-selective medium.
  • the invention also relates to a reaction medium for the detection and / or identification of Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA) comprising a substrate of an enzymatic or metabolic activity, a first antibiotic chosen from Cefdinir and Cefminox, and a second antibiotic that belongs to the aminoglycoside family.
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria
  • the concentration of Cefminox is between 10 and 35 mg / l, preferably between 12 and 28 mg / l.
  • the Cefdinir concentration is between 0.1 and 1 mg / l, preferably between 0.2 and 0.6 mg / l.
  • said second antibiotic is Kanamycin or Amikacin.
  • the concentration of Kanamycin is between 0.2 and 1.5 mg / l, preferably between 0.5 and 1.25 mg / l.
  • the Amikacin concentration is between 0.5 and 5 mg / l, preferably between 1 and 2 mg / l)
  • the combination of two antibiotics comprises Cefminox and Kanamycin.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefminox and Amikacin.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefdinir and Kanamycin.
  • the combination of two antibiotics comprises Cefdinir and Amikacin.
  • said substrate with an enzymatic or metabolic activity enables the detection of an osidase, esterase or peptidase activity.
  • said osidase activity is an alpha-glucosidase activity.
  • Said substrate with alpha-glucosidase activity is preferably an indoxyl-alpha-glucoside.
  • the substrate used is 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside (X-alpha-glucoside) or 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside (GreenA-alpha-glucoside).
  • this substrate is present in the medium at a concentration of between 0.01 and 0.2 g / l, preferably between 0.03 and 0.15 g / l. In fact, at this concentration of substrate, a better color contrast is obtained.
  • said esterase activity is a phosphatase activity.
  • the substrate used is 6-chloro-3-indoxyl-phosphate (Rose-Phosphate).
  • this substrate is present in the medium at a concentration of between 0.05 and 0.5 g / l, preferably between 0.1 and 0.4 g / l. In fact, at this concentration of substrate, a better color contrast is obtained.
  • said reaction medium further comprises a second enzymatic substrate.
  • said second substrate is an alpha-glucosidase substrate.
  • said first substrate is an alpha-glucosidase substrate, preferably X alpha glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside) and said second substrate is an alpha-glucosidase substrate, preferentially GreenA-alpha-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside).
  • the medium comprises, in addition, at least an inhibitor that favors the growth of Staphylococcus aureus bacteria, such as lithium chloride (LiCl), sodium azide (NaN3), colistin, amphotericin, aztreonam, polymixin, sodium chloride (NaCl) and deferoxamine.
  • an inhibitor that favors the growth of Staphylococcus aureus bacteria such as lithium chloride (LiCl), sodium azide (NaN3), colistin, amphotericin, aztreonam, polymixin, sodium chloride (NaCl) and deferoxamine.
  • the medium further comprises a mixture of inhibitors, comprising four inhibitors, which favors the growth of Staphylococcus aureus bacteria, which are LiCl, vibriostatic compound 0/129, Aztreonam, and . Amphotericin.
  • the invention also relates to the in vitro use of a reaction medium as defined above for isolating and identifying Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteria.
  • MRSA Meticillin-resistant Staphylococcus aureus
  • the invention also relates to a method for detecting and / or identifying Meticillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria (MRSA) in a biological sample according to which
  • the biological sample likely to contain methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria MRSA is seeded on a reaction medium as defined above
  • the incubation is preferably carried out at a temperature of between 30 ° C. and 42 ° C.
  • the MRSA are preferably detected by one or two alpha-glucosidase activities or a phosphatase activity which makes it possible to obtain colored or fluorescent colonies.
  • Other species of Staphylococcus appear colorless or of a different color or fluorescence than that of S. aureus colonies.
  • Step a) may be preceded by a step of pre-enrichment in a selective or non-selective medium.
  • Medium T ChromD TM MRSA Control Medium (P / N 43,451)
  • Medium A T-medium, cefoxitin being substituted with a combination of Cefmmox antibiotics (Daewoo Chemical, A8060902, 16 mg / l) / kanamycin (Sigma, ref K4000, 1 mg / l), the chromogenic substrate being Rose-phosphate (Biosynth, reference C-5100, 0.25 g / 1)
  • Medium B Medium T, with cefoxitin being substituted with a combination of antibiotics
  • Medium C medium T, cefoxitin being substituted by a combination of Cefminox antibiotics (16 mg / l) / kanamycin (0.75 mg / l), the chromogenic substrates being the
  • the medium A made it possible to detect all the MRSA.
  • Medium T ChromD TM MRSA Control Medium (P / N 43,451)
  • Medium D medium T, cefoxitin being substituted with a combination of cefininox antibiotics (antibiotic identical to that used in example 1) / kanamycin (antibiotic identical to that used in example 1), at different concentrations, the substrates chromogens being the X-alpha-glucoside (substrate identical to that used in Example 1, 0.045 g / l) and the Green A-alpha-glucoside (substrate identical to that used in Example 1, 0.08 g / 1)
  • Medium E medium T, cefoxitin being substituted by a combination of antibiotics Cefminox (antibiotic identical to that used in Example 1, 16 mg / l) / amikacyne (Sigma, ref 2324, 2 mg / l), the substrate chromogen being Rosephosphate (Biosynth, C-5100, 0.25 g / 1)
  • Medium F T-medium, cefoxitin being substituted by a combination of Cefminox antibiotics (16 mg / l) / amikacyne (2.5 mg / l), the chromogenic substrates being X-alpha-glucoside (substrate identical to that used in Example 1: 0.045 g / l) and Green A-alpha-glucoside (substrate identical to that used in Example 1, 0.08 g / l)
  • Medium G medium T, cefoxitin being substituted by a combination of antibiotics cefdinir (CDR 0806007) / amikacin (antibiotic identical to that used in example 3) at different concentrations, the chromogenic substrate being the phosphate-pink (substrate identical to that used in Example 3, 0.25 g / 1)
  • Medium H Medium T, cefoxitin being substituted with a combination of cefdinir / amikacin antibiotics, at different concentrations, the chromogenic substrate being X-alpha-glucoside (substrate identical to that used in Example 1, 0.045 g / l ) and Green A-alpha-Glu (substrate identical to that used in Example 1, 0.08 g / l)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) comprenant un substrat chromogène, un premier antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines et un deuxième antibiotique qui appartient à la famille des aminosides.

Description

Milieu réactionnel pour les bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la
Méticilline (MRSA)
La présente invention concerne un milieu réactionnel pour la détection des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (SARM ou MRSA). L'invention concerne également l'utilisation de ce milieu, ainsi qu'un procédé pour identifier des bactéries MRSA.
Les Staphylococcus aureus résistants à la Méticilline (MRSA) sont des souches de Staphylococcus aureus, caractérisées par leur résistance à un antibiotique, la Méticilline, et aux antibiotiques apparentés telle que l'Oxacilline. Les bactéries MRSA représentent un fort pourcentage des infections nosocomiales, et sont souvent à l'origine de problèmes de santé graves et potentiellement mortels. Transmis le plus souvent de façon croisée entre les patients via le personnel soignant, les MRSA sont responsables d'infections endémiques très difficiles à contrôler. Outre un traitement adapté, le dépistage des porteurs de MRSA, et l'isolement des patients colonisés constituent la méthode la plus efficace, aujourd'hui recommandée par des organismes officiels tels que la Society for Healthcare Epidemiology of America (Société Américaine pour l'Epidémiologie Hospitalière). Un dépistage précoce et systématique est donc essentiel.
La détection des MRSA peut se faire par différentes techniques.
II est ainsi possible de détecter des MRSA par des techniques de biologie moléculaire. A ce titre, on peut citer notamment la demande EP887424. De telles méthodes restent toutefois coûteuses en test de routine, et requièrent un personnel qualifié.
Il est également possible d'utiliser des milieux de culture conventionnels pour détecter les Staphylococcus aureus, tel que le milieu décrit dans la demande EP 1390524. La détection de MRSA se fait lors d'une étape supplémentaire, par un test d'agglutination spécifique, (Slidex MRSA, bioMérieux) ou par une méthode de diffusion sur gélose en présence d'un disque Oxacilline de Céfoxitine ou de Latamoxef (recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie et du Clinical Laboratory Standard Institute).
Il est également possible de mettre en culture les bactéries susceptibles d'être des MRSA sur milieux géloses en présence d'antibiotiques. De tels milieux peuvent être également chromogènes, ce qui facilite la lecture et la détection des MRSA. On peut citer notamment le milieu décrit dans la demande EP1543147. Toutefois, la détection d'une activité phosphatase dans les conditions décrites étant peu spécifique, il est nécessaire de la combiner avec la détection de plusieurs autres activités enzymatiques ce qui réduit la fertilité du milieu et accroît son coût.
L'invention se propose de résoudre les lacunes de l'état de la technique en présentant un nouveau milieu réactionnel, sensible, spécifique, et permettant un isolement et une identification rapide des Staphylococcus aureus résistants à la Méticilline (MRSA).
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation d'une combinaison particulière d'antibiotiques, comprenant une céphalosporine et un aminoside, permettait d'obtenir un excellent milieu réactionnel pour isoler et identifier des Staphylococcus aureus résistants à la Méticilline (MRSA).
Avant d'aller plus avant, les définitions suivantes, nullement limitatives, permettront de mieux comprendre l'invention.
Au sens de la présente invention, on entend par milieu réactionnel, un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microorganismes, telles que les Staphylococcus aureus.
Ce milieu réactionnel peut soit servir uniquement de milieu de révélation, soit de milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu réactionnel constitue également le milieu de culture.
Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. Préférentiellement, le milieu selon l'invention est un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser d'autres agents gélifiants comme par exemple la gelrite, la gélatine ou l'agarose. Un certain nombre de préparations sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Chapman, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
Le milieu réactionnel selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple : des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des solutions tampons, un ou plusieurs gélifiants... Ce milieu réactionnel peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est à dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Pétri. Lorsque la présentation est sous forme de gel en flacon, on réalise préférentiellement une régénération (passage à 1000C) préalable du milieu avant de couler en boîte de Pétri.
Préférentiellement, le milieu selon l'invention est un milieu sélectif, c'est à dire un milieu comprenant des inhibiteurs qui privilégient la croissance des bactéries Staphylococcus aureus. On peut citer notamment le Chlorure de Lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Colimicine, Chlorure de Sodium (NaCl), Déféroxamine, composé vibriostatique 0/129.
Au sens de la présente invention, le substrat d'une activité enzymatique ou métabolique est choisi parmi tout substrat pouvant être hydrolyse en un produit qui permet la détection, directe ou indirecte d'une activité enzymatique ou d'un métabolisme, telle que notamment une activité osidase, préférentiellement une activité glucuronidase, glucosidase ou galactosidase.
Il peut s'agir d'un substrat naturel ou synthétique. Le métabolisme du substrat provoque une variation des propriétés physico-chimiques du milieu réactionnel ou des cellules d'organismes. Cette variation peut être détectée par des méthodes physico-chimiques, notamment des méthodes optiques par l'œil de l'opérateur ou à l'aide d'instruments, spectrométriques, électriques, magnétiques, ... Préférentiellement, il s'agit d'une variation des propriétés optiques, telles qu'une modification d'absorption, de fluorescence ou de luminescence.
Dans la présente demande, le terme coloration est employé pour couvrir une coloration, absorption de lumière dans le spectre visible, ou une fluorescence, absorption à une longueur d'onde (λex) et émission à une longueur d'onde supérieure (λem, λem > λex).
Au sens de la présente invention, on entend par substrat chromogène, tout substrat pouvant être hydrolyse en un produit qui permet la détection, directe ou indirecte d'une activité enzymatique, telle que notamment une activité osidase, préférentiellement une activité alpha glucosidase, estérase, préférentiellement une activité phosphatase, peptidase, préférentiellement une activité coagulase.
On peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl, flavone, alizarine, acridine, phénoxazine, nitrophénol, nitroaniline, naphtol, catéchol, hydroxyquinoline, coumarine, hydroxyphenyl-quinoxazol-4-one. Préférentiellement, le(s) substrat(s) utilisé(s) dans la présente invention est(sont) à base d'indoxyl.
Comme substrat d'alpha glucosidase, on peut citer plus particulièrement les substrats 5- Bromo-6-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside; Dihydroxyflavone-alpha-glucoside ; 3,4- Cyclohexénoesculétine-alpha-glucoside ; 8-Hydroxiquinoline-alpha-glucoside ; 5-Bromo-4- chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-alpha-glucoside ; 6-Chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; 5-Bromo-3-indoxyl-alpha-glucoside ; 5-Iodo-3- indoxyl-alpha-glucoside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; Alizarine-alpha-glucoside ; Nitrophényl-alpha-glucoside ; 4-Méthylumbelliferyl-alpha-glucoside ; Naphtholbenzein- alpha-glucoside ; Indoxyl-N-méthyl-alpha-glucoside ; Naphtyl-alpha-glucoside ;
Aminophényl-alpha-glucoside ; Dichloroaminophényl-alpha-glucoside. Préférentiellement, le substrat d'alpha glucosidase utilisé est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-alpha- glucoside ou le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside.
Comme substrat de phosphatase, on peut citer plus particulièrement les substrats 5-Bromo- 6-chloro-3-indoxyl-phosphate ; 3,4-Cyclohexénoesculétine-phosphate ; 5-Bromo-4-chloro-
3-indoxyl-phosphate ; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-phosphate ; 6-Chloro-
3-indoxyl-phosphate ; 5-Bromo-3-indoxyl-phosphate ; 5-Iodo-3-indoxyl-phosphate ;
6-Fluoro-3-indoxyl-phosphate ; Nitrophényl-phosphate ; 4-Méthylumbelliferyl-phosphate ;
Indoxyl-N-méthyl-phosphate ; Naphtyl-phosphate, ELF97 -phosphate. Préférentiellement, le substrat de phosphatase utilisé est le 6-Chloro-3-indoxyl-phosphate.
Le substrat utilisé dans la présente invention peut être en combinaison avec d'autres substrats, tels qu'un substrat d'osidase, estérase et notamment phosphatase ou phospholipase, peptidase et notamment coagulase. En particulier, le milieu peut comprendre deux substrats d'alpha glucosidase.
Les substrats de l'invention sont utilisables dans une large gamme de pH, notamment entre pH 5,5 et 10, préférentiellement entre 6,5 et 9.
Au sens de la présente invention, un antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines est un antibiotique préférentiellement choisi parmi
o Une céphalosporine de première génération, telle que: Cefalexine, Cefaloridine, Cefalotine, Cefazoline, Cefadroxil, Cefazedone, Cefatrizine, Cefapirine, Cefradine,
Cefacetrile, Cefrodaxine, Ceftezole
o Une Céphalosporine de deuxième génération, telle que : Cefoxitine, Cefuroxime, Cefamandole, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicide, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazole, Cefprozil, Ceforanide, Cefminox
o Une céphalosporines de troisième génération, telle que : Cefotaxime, Ceftazidime,
Cefsulodine, Ceftriaxone, Cefmenoxime, Latamoxef, Ceftizoxime, Cefixime, Cefodizime, Cefetamet, Cefpiramide, Cefoperazone, Cefpodoxime, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxone, Cefoperazone, Cefbuperazone, Cefdinir o Une céphalosporine de quatrième génération, telle que Cefepime, Cefpirome Dans le cadre de la présente invention, l'antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines est préférentiellement le Cefminox ou le Cefdinir.
Au sens de la présente invention, un antibiotique qui appartient à la famille des aminosides est un antibiotique préférentiellement choisi parmi Amikacine, Gentamicine, Isepamicine, Kanamycine, Netilmicine, Streptomycine, Tobramycine.
Dans le cadre de la présente invention, l'antibiotique qui appartient à la famille des aminosides est préférentiellement l' Amikacine ou la Kanamycine.
Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement d'aspiration bronchique, trachéale ou pulmonaire, de liquide pleural, d'un lavage broncho- alvéolaire, d'expectorations, du sang ou d'une biopsie pulmonaire, de liquide articulaire ou péricardique ; liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment, ou un prélèvement de surface. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de périnée, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo- rachidien, un échantillon alimentaire.
Par échantillon, on entend donc le prélèvement en lui même (écouvillon, selles, aliments, ...) aussi bien que des colonies de microorganismes issus dudit prélèvement (par exemple après isolement sur un milieu de culture gélifié, ou dans un bouillon d'enrichissement ensemencé avec ledit prélèvement).
A ce titre, l'invention concerne un milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) comprenant un substrat chromogène, un premier antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines et un deuxième antibiotique qui appartient à la famille des aminosides.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit premier antibiotique est la Cefminox ou le Cefdinir. Préférentiellement, la concentration en Cefminox est comprise entre 10 et 35 mg/1, préférentiellement entre 12 et 28 mg/1. Préférentiellement, la concentration en Cefdinir est comprise entre 0,1 et 1 mg/1, préférentiellement entre 0,2 et 0,6 mg/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième antibiotique est la Kanamycine ou l'Amikacme.
Préférentiellement, la concentration en Kanamycine est comprise entre 0,2 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1,25 mg/1. Préférentiellement, la concentration en Amikacine est comprise entre 0,5 et 5 mg/1, préférentiellement entre 1 et 2 mg/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend la Cefminox et la Kanamycine.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend la Cefminox et l'Amikacme.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend le Cefdinir et la Kanamycine.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend le Cefdinir et l'Amikacine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat chromogène permet la détection d'une activité osidase, estérase ou peptidase
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite activité osidase est une activité alpha-gluco sidase .
Ledit substrat d'une activité alpha-glucosidase est préférentiellement un indoxyl-alpha- glucoside. Préférentiellement, le substrat utilisé est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha- glucoside (X-alpha-glucoside) ou le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-alpha-glucoside (GreenA-alpha-glucoside). Préférentiellement, ce substrat est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 0,01 et 0,2 g/1, préférentiellement entre 0,03 et 0,15 g/1. En effet, à cette concentration de substrat, on obtient un meilleur contraste de coloration.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite activité estérase est une activité phosphatase. Préférentiellement, le substrat utilisé est le 6-Chloro-3-indoxyl-phosphate (Rose-Phosphate). Préférentiellement, ce substrat est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 0,05 et 0,5 g/1, préférentiellement entre 0,1 et 0,4 g/1. En effet, à cette concentration de substrat, on obtient un meilleur contraste de coloration.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu réactionnel comprend, en outre, un deuxième substrat enzymatique. Préférentiellement, ledit deuxième substrat est un substrat d' alpha-glucosidase. Préférentiellement, ledit premier substrat est un substrat d'alpha-glucosidase, préférentiellement le X-alpha-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- alpha-glucoside) et ledit deuxième substrat est un substrat d'alpha-glucosidase, préférentiellement le GreenA-alpha-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-alpha- glucoside).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend, en outre, au moins un inhibiteur qui privilégie la croissance des bactéries Staphylococcus aureus, tel que Chlorure de lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Polymixines, Chlorure de sodium(NaCl) et Déféroxamine.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend, en outre, un mélange d'inhibiteurs, comprenant quatre inhibiteurs, qui privilégie la croissance des bactéries Staphylococcus aureus, qui sont LiCl, composé vibriostatique 0/129, Aztréonam, et. Amphotéricine.
L'invention concerne également l'utilisation in vitro d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant pour isoler et identifier des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA).
L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) dans un échantillon biologique selon lequel
a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline MRSA sur un milieu réactionnel tel que défini ci avant
b) on incube
c) on identifie les colonies comme étant des colonies de MRSA.
L'incubation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre 3O0C et 42°C. Les MRSA sont préférentiellement détectées par une ou deux activités α-glucosidase ou une activité phosphatase qui permet d'obtenir des colonies colorées ou fluorescentes. Les autres espèces de Staphylococcus apparaissent incolores ou d'une couleur ou fluorescence différente de celle des colonies de S. aureus.
L'étape a) peut être précédée d'une étape de pre-enrichissement en milieu sélectif ou non sélectif. L'invention concerne également un milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) comprenant un substrat d'une activité enzymatique ou métabolique, un premier antibiotique choisi parmi le Cefdinir et le Cefminox, et un deuxième antibiotique qui appartient à la famille des aminosides.
Préférentiellement, la concentration en Cefminox est comprise entre 10 et 35 mg/1, préférentiellement entre 12 et 28 mg/1. Préférentiellement, la concentration en Cefdinir est comprise entre 0,1 et 1 mg/1, préférentiellement entre 0,2 et 0,6 mg/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième antibiotique est la Kanamycine ou l'Amikacine. Préférentiellement, la concentration en Kanamycine est comprise entre 0,2 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1,25 mg/1. Préférentiellement, la concentration en Amikacine est comprise entre 0,5 et 5 mg/1, préférentiellement entre 1 et 2 mg/1)
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend la Cefminox et la Kanamycine.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend la Cefminox et l' Amikacine.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend le Cefdinir et la Kanamycine.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques comprend le Cefdinir et l'Amikacine.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit substrat d'une activité enzymatique ou métabolique permet la détection d'une activité osidase, estérase ou peptidase
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite activité osidase est une activité alpha-glucosidase.
Ledit substrat d'une activité alpha-glucosidase est préférentiellement un indoxyl-alpha- glucoside. Préférentiellement, le substrat utilisé est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha- glucoside (X-alpha-glucoside) ou le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-alpha-glucoside (GreenA-alpha-glucoside). Préférentiellement, ce substrat est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 0,01 et 0,2 g/1, préférentiellement entre 0,03 et 0,15 g/1. En effet, à cette concentration de substrat, on obtient un meilleur contraste de coloration.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite activité estérase est une activité phosphatase. Préférentiellement, le substrat utilisé est le 6-Chloro-3-indoxyl-phosphate (Rose-Phosphate). Préférentiellement, ce substrat est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 0,05 et 0,5 g/1, préférentiellement entre 0,1 et 0,4 g/1. En effet, à cette concentration de substrat, on obtient un meilleur contraste de coloration.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu réactionnel comprend, en outre, un deuxième substrat enzymatique. Préférentiellement, ledit deuxième substrat est un substrat d' alpha-glucosidase. Préférentiellement, ledit premier substrat est un substrat d'alpha-glucosidase, préférentiellement le X alpha glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- alpha-glucoside) et ledit deuxième substrat est un substrat d'alpha-glucosidase, préférentiellement le GreenA-alpha-glucoside (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-alpha- glucoside).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend, en outre, au moins un inhibiteur qui privilégie la croissance des bactéries Staphylococcus aureus, tel que Chlorure de lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Polymixines, Chlorure de sodium(NaCl) et Déféroxamine.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend, en outre, un mélange d'inhibiteurs, comprenant quatre inhibiteurs, qui privilégie la croissance des bactéries Staphylococcus aureus, qui sont LiCl, composé vibriostatique 0/129, Aztréonam, et. Amphotéricine.
L'invention concerne également l'utilisation in vitro d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant pour isoler et identifier des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA).
L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) dans un échantillon biologique selon lequel
a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline MRSA sur un milieu réactionnel tel que défini ci avant
b) on incube
c) on identifie les colonies comme étant des colonies de MRSA.
L'incubation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre 3O0C et 420C. Les MRSA sont préférentiellement détectées par une ou deux activités alpha-glucosidase ou une activité phosphatase qui permet d'obtenir des colonies colorées ou fluorescentes. Les autres espèces de Staphylococcus apparaissent incolores ou d'une couleur ou fluorescence différente de celle des colonies de S. aureus.
L'étape a) peut être précédée d'une étape de pré-enrichissement en milieu sélectif ou non sélectif.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. EXEMPLE 1 - MILIEU MRSA COMPRENANT UNE COMBINAISON D'ANTIOBIOTIQUES
CEFMINOX - KANAMYCINE ET DIFFERENTS SUBSTRATS CHROMOGENES
1. Préparation du milieu selon l'invention
Les milieux testés dans les expériences étaient les suivants:
Milieu T : milieu témoin chromlD™ MRSA (réf. 43 451) Milieu A : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques Cefmmox (Daewoo Chemical, A8060902; 16 mg/1) / kanamycine (Sigma, réf K4000; 1 mg/1), le substrat chromogène étant le Rose-phosphate (Biosynth, réf. C- 5100 ; 0,25 g/1)
Milieu B : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques
Cefminox (16 mg/1) / kanamycine (0,75 mg/1), le substrat chromogène étant le X- alpha-glucoside (Biosynth, B7230; 0,045 g/1) et le Green A-alpha-glucoside (Inalco, réf. 1758-0730)
Milieu C : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques Cefminox (16 mg/1) / kanamycine (0,75 mg/1), les substrats chromogènes étant le
X-alpha-glucoside (Biosynth, B7230; 0,045 g/1) et le Green A-alpha-glucoside (Inalco, réf. 1758-0730, 0.08 g/1)
2. Ensemencement et lecture des milieux
Différentes souches de bactéries S aureus, résistantes (MRSA) ou non résistantes à la méticilline (MSSA) et des souches de staphylocoques à coagulase négative (SCN), toutes issues de la collection de la Demanderesse, ont été mises en suspension dans de l'eau physiologique, puis ensemencées sur le milieu, selon la technique des quatre quadrants. Les boîtes ont été incubées à 37 0C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18h et 24 heures d'incubation.
3. Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1.
Ces résultats montrent une excellente sensibilité des milieux selon l'invention. En particulier, le milieu A permettait de détecter l'ensemble des MRSA.
EXEMPLE 2 - MILIEU MRSA COMPRENANT DE LA CEFMINOX ET DE LA KANAMYCINE A
DIFFERENTES CONCENTRATIONS
1. Préparation du milieu selon l'invention
Les milieux testés dans les expériences étaient les suivants:
Milieu T : milieu témoin chromlD™ MRSA (réf. 43 451) Milieu D : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques cefininox (antibiotique identique à celui utilisé dans l'exemple 1) / kanamycine (antibiotique identique à celui utilisé dans l'exemple 1), à différentes concentrations, les substrats chromogènes étant le X-alpha-glucoside (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 1 ; 0,045 g/1) et le Green A-alpha- glucoside (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 1 ; 0,08 g/1)
2. Ensemencement et lecture des milieux
Cette étape a été réalisée comme dans l'exemple 1
3. Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci dessous
Ces résultats montrent qu'une concentration en Cefminox de 16 mg/1 et une concentration de Kanamycine de 0,75 mg/1 permettait d'obtenir une excellente spécificité et sensibilité.
EXEMPLE 3 - MILIEU MRSA COMPRENANT UNE COMBINAISON D'ANTIOBIOTIQUES CEFMINOX - AMIKACINE ET DIFFÉRENTS SUBSTRATS CHROMOGENES
1. Préparation du milieu selon l'invention
Les milieux testés dans les expériences étaient les suivants:
Milieu T : milieu témoin chromlD™ MRSA (réf. 43 451)
Milieu E : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques Cefminox (antibiotique identique à celui utilisé dans l'exemple 1; 16 mg/1) / amikacyne (Sigma, réf 2324; 2 mg/1), le substrat chromogène étant le Rose- Phosphate (Biosynth, C-5100; 0,25 g/1) Milieu F : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques Cefminox (16 mg/1) / amikacyne (2,5 mg/1), les substrats chromogènes étant le X- alpha-glucoside (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 1; 0,045 g/1) et le Green A-alpha-glucoside (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 1; 0,08 g/1)
2. Ensemencement et lecture des milieux
Cette étape a été réalisée comme dans l'exemple 1.
3. Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci dessus
Ces résultats montrent que la combinaison d'antibiotiques selon l'invention permettait d'obtenir une excellente sensibilité, et ce quel que soit le substrat utilisé.
EXEMPLE 4 - MILIEU MRSA COMPRENANT DE LA CEFDINIR ET DE L'AMIKACINE
1. Préparation du milieu selon l'invention
Les milieux testés dans les expériences étaient les suivants:
Milieu T : milieu témoin chromlD™ MRSA (réf. 43 451)
Milieu G : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques cefdinir (CDR 0806007) / amikacine (antibiotique identique à celui utilisé dans l'exemple 3) à différentes concentrations, le substrat chromogène étant le Rose-phosphate (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 3; 0,25 g/1)
Milieu H : milieu T, la céfoxitine étant substituée par une combinaison d'antibiotiques cefdinir / amikacine , à différentes concentrations, le substrat chromogène étant le X-alpha-glucoside (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 1; 0,045 g/1) et le Green A-alpha-Glu (substrat identique à celui utilisé dans l'exemple 1, 0.08 g/1)
2. Ensemencement et lecture des milieux
Cette étape a été réalisée comme dans l'exemple 1
3. Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 4 ci dessous.
Ces résultats montrent que la combinaison d'antibiotiques Cefdinir / Amikacine selon l'invention permettait d'obtenir une excellente sensibilité et spécificité, et ce, quelle que soit la concentration utilisée.
EXEMPLE 5 - ANALYSES DE PRELEVELEMENTS CLINIQUE SUR DES MILIEUX MRSA SELON
L'INVENTION
1. Préparation du milieu selon l'invention
Les milieux testés dans les expériences étaient les suivants:
Milieu T : milieu témoin chromlD™ MRSA (réf. 43 451)
Lot 1 : Green A- alpha -Glu 0.08 g/1 + X-alpha -Glu 0.045 g/1, cefmmox 16 mg/1 + kanamycine 0.75 mg/1
Lot 2 : Green A- alpha -Glu 0.08 g/1 + X-alpha-Glu 0.045 g/1, cefdinir 0.3 mg/1 + amikacine 2 mg/1
Lot 3 : Rose-Phosphate 0.25 g/1, cefmmox 16 mg/1 + amikacine 2 mg/1
Lot 4 : Rose-Phosphate 0.25 g/1, cefdinir 0.3 mg/1 + amikacine 2 mg/1
Les substrats et antibiotiques utilisés étaient les mêmes que ceux utilisés dans les exemples précédents. 2. Ensemencement et lecture des milieux
Deux études ont été réalisées en parallèle à partir de différents prélèvements cliniques (nez, gorge, périnée, plaie), qui ont été mis en suspension dans de l'eau physiologique, et ensemencés pour donner des colonies isolées sur le milieu, selon la technique des quatre quadrants. Les boîtes ont été incubées à 37 0C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18h et 24 heures d'incubation. 3. Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux ci dessous.
Première étude:
Ces résultats montrent que les combinaisons d'antibiotiques selon l'invention présentaient une excellente sensibilité de détection, et ceci dès 18h.

Claims

REVENDICATIONS
1) Milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) comprenant un substrat chromogénique, un premier antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines et un deuxième antibiotique qui appartient à la famille des aminosides.
2) Milieu réactionnel selon la revendication 1 selon lequel ledit premier antibiotique est la Cefminox ou le Cefdinir.
3) Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 selon lequel ledit deuxième antibiotique est la Kanamycine ou l'Amikacine.
4) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 selon lequel ledit substrat chromogène permet la détection d'une activité osidase, estérase ou peptidase
5) Milieu réactionnel selon la revendication 4, selon lequel ladite activité osidase est une activité alpha-glucosidase. 6) Milieu réactionnel selon la revendication 5, selon lequel ladite activité estérase est une activité phosphatase.
7) Utilisation in vitro d'un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour isoler et identifier des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA).
8) Procédé de détection et/ou d'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) dans un échantillon biologique selon lequel
a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline MRSA sur un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 6
b) on incube
c) on identifie les colonies comme étant des colonies de MRSA.
EP10761051.1A 2009-08-13 2010-08-12 Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa) Active EP2464742B1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0903944A FR2949119B1 (fr) 2009-08-13 2009-08-13 Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa)
PCT/FR2010/051705 WO2011018589A2 (fr) 2009-08-13 2010-08-12 Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EP2464742A2 true EP2464742A2 (fr) 2012-06-20
EP2464742B1 EP2464742B1 (fr) 2017-10-04

Family

ID=41815018

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP10761051.1A Active EP2464742B1 (fr) 2009-08-13 2010-08-12 Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa)

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP2464742B1 (fr)
JP (1) JP5816177B2 (fr)
CN (2) CN102482710A (fr)
BR (1) BR112012003249B8 (fr)
ES (1) ES2653243T3 (fr)
FR (1) FR2949119B1 (fr)
IN (1) IN2012DN00740A (fr)
MX (1) MX2012001684A (fr)
WO (1) WO2011018589A2 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103290094B (zh) * 2013-05-30 2016-01-27 广州绿洲生化科技股份有限公司 一种金黄色葡萄球菌显色培养基及其测试片
JP6733324B2 (ja) * 2016-01-29 2020-07-29 大日本印刷株式会社 黄色ブドウ球菌を検出するための培地及び該培地を有する黄色ブドウ球菌検出シート、並びにそれらを用いる黄色ブドウ球菌の検出方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3298932B2 (ja) * 1992-06-18 2002-07-08 極東製薬工業株式会社 多剤耐性ブドウ球菌を選択的に培養するための培地
JP3957338B2 (ja) * 1996-02-23 2007-08-15 株式会社カイノス 診断薬
FR2822847B1 (fr) * 2001-03-30 2003-05-09 Bio Merieux Milieux de detection specifique de staphylococcus aureus et procede d'identification et/ou de denombrement utilisant de tels milieux
FR2844807B1 (fr) * 2002-09-23 2005-11-11 Rambach Alain Procede de detection de microorganismes resistants a la meticilline
CA2504056A1 (fr) * 2003-01-10 2004-07-29 Becton, Dickinson And Company Methode de detection de resistance a un antibiotique dans des micro-organismes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ENGELS W ET AL: "Rapid and direct staphylocoagulase assay that uses a chromogenic substrate for identification of Staphylococcus aureus.", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY NOV 1981, vol. 14, no. 5, November 1981 (1981-11), pages 496-500, ISSN: 0095-1137 *
LANGLET S ET AL: "[A chromogenic method for rapid identification of Staphylococcus aureus].", ANNALES DE BIOLOGIE CLINIQUE 1999 MAR-APR, vol. 57, no. 2, March 1999 (1999-03), pages 191-196, ISSN: 0003-3898 *
See also references of WO2011018589A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011018589A3 (fr) 2011-04-07
CN102482710A (zh) 2012-05-30
FR2949119A1 (fr) 2011-02-18
BR112012003249B1 (pt) 2020-12-08
CN106834415A (zh) 2017-06-13
FR2949119B1 (fr) 2011-08-26
EP2464742B1 (fr) 2017-10-04
BR112012003249B8 (pt) 2021-07-27
JP2013501513A (ja) 2013-01-17
MX2012001684A (es) 2012-03-14
JP5816177B2 (ja) 2015-11-18
IN2012DN00740A (fr) 2015-06-19
BR112012003249A2 (pt) 2016-03-01
WO2011018589A2 (fr) 2011-02-17
ES2653243T3 (es) 2018-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2344663B1 (fr) Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus
EP1390524B1 (fr) Milieux de detection specifique de staphylococcus aureus et procedes d'identification et/ou de denombrement utilisant de tels milieux
EP2344662B1 (fr) Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa)
EP2459732A1 (fr) Milieux pour la detection specifique de bacteries gram negatives resistantes aux betalactamines
EP1789573A1 (fr) Procede de detection de streptococcus agalactiae en utilisant l'activite alpha-glucosidase
EP2464742B1 (fr) Milieu reactionnel pour les bacteries staphylococcus aureus resistantes a la meticilline (mrsa)
CA2878112A1 (fr) Procede de detection de bacteries productrices de carbapenemases de type oxa-48
US8497086B2 (en) Reaction medium for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteria
EP2487235B1 (fr) Milieu de detection de Streptococcus agalatiae en utilisant l'activité esterase

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20120125

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20130103

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20170518

GRAS Grant fee paid

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: B1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: FG4D

Free format text: NOT ENGLISH

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: EP

REG Reference to a national code

Ref country code: AT

Ref legal event code: REF

Ref document number: 934075

Country of ref document: AT

Kind code of ref document: T

Effective date: 20171015

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FG4D

Free format text: LANGUAGE OF EP DOCUMENT: FRENCH

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R096

Ref document number: 602010045756

Country of ref document: DE

REG Reference to a national code

Ref country code: ES

Ref legal event code: FG2A

Ref document number: 2653243

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: T3

Effective date: 20180206

REG Reference to a national code

Ref country code: NL

Ref legal event code: MP

Effective date: 20171004

REG Reference to a national code

Ref country code: LT

Ref legal event code: MG4D

REG Reference to a national code

Ref country code: AT

Ref legal event code: MK05

Ref document number: 934075

Country of ref document: AT

Kind code of ref document: T

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: NO

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20180104

Ref country code: SE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: FI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: BG

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20180104

Ref country code: IS

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20180204

Ref country code: LV

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: AT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: HR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: GR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20180105

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R097

Ref document number: 602010045756

Country of ref document: DE

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: EE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: SK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: CZ

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PLBE No opposition filed within time limit

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

REG Reference to a national code

Ref country code: FR

Ref legal event code: PLFP

Year of fee payment: 9

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: SM

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: RO

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: PL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

26N No opposition filed

Effective date: 20180705

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: MT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: SI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: MC

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LU

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20180812

REG Reference to a national code

Ref country code: BE

Ref legal event code: MM

Effective date: 20180831

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: MM4A

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20180812

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: BE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20180831

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: TR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: HU

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT; INVALID AB INITIO

Effective date: 20100812

Ref country code: PT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CY

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

Ref country code: MK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20171004

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: AL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20171004

P01 Opt-out of the competence of the unified patent court (upc) registered

Effective date: 20230524

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: ES

Payment date: 20250901

Year of fee payment: 16

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DE

Payment date: 20250827

Year of fee payment: 16

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IT

Payment date: 20250820

Year of fee payment: 16

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Payment date: 20250827

Year of fee payment: 16

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Payment date: 20250825

Year of fee payment: 16

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CH

Payment date: 20250901

Year of fee payment: 16