EP2440673A2 - Verfahren, zusammensetzungen und vorrichtungen zur steuerung einer chemischen reaktion mittels druck unter verwendung von hochdruck-optimierten biokomponenten - Google Patents

Verfahren, zusammensetzungen und vorrichtungen zur steuerung einer chemischen reaktion mittels druck unter verwendung von hochdruck-optimierten biokomponenten

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Publication number
EP2440673A2
EP2440673A2 EP10725044A EP10725044A EP2440673A2 EP 2440673 A2 EP2440673 A2 EP 2440673A2 EP 10725044 A EP10725044 A EP 10725044A EP 10725044 A EP10725044 A EP 10725044A EP 2440673 A2 EP2440673 A2 EP 2440673A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
pressure
optimized
biocomponents
mpa
reaction
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10725044A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Günter R. FUHR
Frank Bier
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Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Filing date
Publication date
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Publication of EP2440673A2 publication Critical patent/EP2440673A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0093—Microreactors, e.g. miniaturised or microfabricated reactors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J3/00—Processes of utilising sub-atmospheric or super-atmospheric pressure to effect chemical or physical change of matter; Apparatus therefor
    • B01J3/04—Pressure vessels, e.g. autoclaves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • biochemical reactions in particular enzymatic reactions
  • can be controlled at least partly by temperature since many biological macromolecules, in particular enzymes, have distinct pronounced maxima of their functionality and efficiency at certain temperatures.
  • this control is usually limited to a relatively narrow temperature range and larger temperature changes up or down usually lead to the termination of the reaction. Only a few biomolecules are functional even at significantly different operating temperatures, so that cyclic bioreactions at least outside an organism are difficult to control via temperature.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the denatured double strands are denatured again by increasing the temperature in single strands, which can then be cooled after cooling bind new primers and the process repeats itself. If two such primers are inserted in each PCR batch, one of the ones on the sense strand and the second one which binds to the antisense strand, a doubling (chain reaction) of the DNA present between the primers is obtained with each cycle of new synthesis and denaturation. section. If you use a temperature-stable polymerase, as it can be obtained from organisms from hot springs, the reaction proceeds without interruption, if you run temperature cycles. As a rule, one begins between 92-98 0 C with the Denatur réelle of the DNA.
  • PCR has become indispensable as a central bioanalytical method in biotechnology and medicine.
  • light cyclers and other devices that implement alternative principles for rapid temperature jumps makes the PCR technique robust and fast.
  • the high temperatures and also the temperature changes are significant limitations. So far, no other bioreactions have been implemented on a similar principle, since not many macromolecules have the broad temperature stability and reversibility to temperature jumps.
  • thermocycling analog control principles for biochemical reactions derived from the success of the temperature-controlled PCR process, the desire and the demand for further, in particular for thermocycling analog control principles for biochemical reactions derived. Since all components in the PCR-analogous process undergo the T cycles, they must at least tolerate the highest temperature without damage and may only be chemically active at their cycle temperature. This limits the macromolecular candidate list strong one, because most of the high temperatures are not tolerated (> 7O 0 C) from normal temperature species taken macromolecules. So far, apart from the temperature-controlled reaction cycles, there are only traditional principles, such as the pH control or the change in the ionic strength of the solution. However, such parameters are not possible without considerable technical measurement effort and above all not without changing the solution composition and volumes. Both are serious disadvantages.
  • biocomponents for example macromolecules, such as enzymes, proteins and / or sugars, organelles, such as ribosomes or mitochondrial components, are required which have as little as possible a single technically simple and non-contaminating or altering physical quantity at the operating point Reactants, as they should be called more generally in the following, can be clearly shifted.
  • These processes must be Hezu completely, at least long-term reversible.
  • the spectrum of usable molecules and components should be significantly wider than that of the PCR technique.
  • the modification of this or this parameter should not damage the molecules but only significantly shift their chemical activity (working points). Especially welcome would be a threshold behavior (on / off).
  • the present invention is based on the recognition that the above-mentioned physical quantity can also be the pressure and that a control of biochemical reactions can be realized by means of pressure.
  • the membrane composition and its transport properties and stability also proved to be highly pressure-dependent (see Pressure-regulated metabolism in microorganisms, Fumiyoshi Abe, Chiaki Kato and Koki Horikoshi, TRENDS IN MICROBIOLOGY 447, Volume 7, No. 11, November 1999).
  • 3T3 mouse fibroblasts die at 70 MPa (equivalent to a depth of 7000 m) in culture.
  • reaction rate of any chemical reaction that occurs faster or slower as pressure or pressure increases, as system volume increases or decreases, as the relevant thermodynamic quantity.
  • Pressure-dependent changes in the thermodynamic system volume should not be confused with volume changes of the organism or a cell. Rather, it is, for example, changes in the attachment of water to macromolecules, ions and membranes.
  • the object on which the present invention is based namely the provision of an alternative route for the simple and efficient control of biochemical reactions, is thus achieved according to the invention by providing the method for controlling a chemical reaction by means of pressure using high-pressure-optimized biocomponents, in particular one Combination of high-pressure-optimized biocomponents and low-pressure-optimized biocomponents according to claim 1, and providing the composition of claim 15 and the device of claim 30. Further aspects and preferred embodiments are the subject of the further claims.
  • high pressure optimized biocomponents means that the respective biocomponents have an optimum of their activity, functionality, and / or efficiency at a significantly higher pressure than normal pressure Pressure in the range of about 11 to 200 MPa, preferably from about 21 to 200 MPa, more preferably from 30 to 150 MPa, more preferably from 50 to 120 MPa.
  • the term "low pressure optimized biocomponents” means that these biocomponents exhibit the optimum of their activity, performance and / or efficiency at a significantly lower pressure compared to the high pressure optimized biocomponents Typically, the low pressure optimized biocomponents become one Optimum at a pressure in the range of 0.1 to 20 MPa, preferably 1 to 10 MPa.
  • biocomponents with a functional optimum in a middle range of about 11 to 20 MPa as both low pressure and high pressure optimized biocomponents.
  • the use of biocomponents with function maxima at greatly varying pressures will naturally facilitate the control of reactions by pressure and, inter alia, for the reasons already stated, the isolation of biocomponents having these characteristics is most promising when using such starting organisms adapted to very different pressures are.
  • the high-pressure-optimized biocomponents are therefore preferably derived from deep-sea organisms or from a cell culture obtained therefrom, while the low-pressure-optimized biocomponents preferably originate from normal-pressure organisms or from a cell culture obtained therefrom.
  • These organisms each contain functional macromolecules and higher-level structures constructed therefrom, such as organelles, etc., which are pressure-adapted, ie the effectiveness, the working range of the macromolecules, organelles or cells, has a pressure-dependent optimum. All organisms on the earth's surface are adapted to the atmospheric pressure (about 1 atm.). Increasing the pressure, they lose continuously or even leaps in responsiveness to inactivity at pressures in the range of 10 to 100 MPa.
  • a mixture of high pressure optimized biocomponents eg high pressure molecules, organelles or cells isolated from deep sea organisms
  • low pressure optimized biocomponents eg low pressure molecules, organelles or cells
  • this principle provides a means of slowing down or completely shutting off individual reactions of one cycle over another. If the pressure is changed, the other (inverse) reactions are slowed down or stopped altogether, and only the first mentioned run off optimally.
  • an essential concept of the method according to the invention is to mix or spatially separate two or more macromolecule types or organelles, ultimately also cell lysates or functional cell populations (hereinafter referred to as reactors) that some of the reactors are high-pressure adapted (hereinafter with the Addition "HP") other normal pressure optimized (“NP”) are.
  • reactors cell lysates or functional cell populations
  • HP high-pressure adapted
  • NP normal pressure optimized
  • the chemical or biochemical reaction to be controlled is an enzymatic reaction, in particular a PCR reaction or another reaction for the amplification or manipulation of nucleic acid.
  • control of a (bio) chemical reaction by pressure basically includes any manner of influencing the course of a chemical reaction by prescribing a particular pressure and / or by pressure changes, typically such control involves speed the chemical reaction can be adjusted by a pressure change and / or that the chemical reaction can be switched on or off by a pressure change
  • the reaction can be temporarily or permanently stopped, for example, for the removal of reaction products or removal / supply of reactants.
  • continuous or periodic pressure changes are made, including pressure changes affecting certain predetermined functions, e.g. Functions with sinusoidal, ramp-shaped, rectangular, triangular or trapezoidal progressions follow.
  • Intermediate states via MP can also be defined in the methods according to the invention and systems having a plurality of pressure states, eg tristate or multistate (HP, MP1, MP2,..., NP), can be defined.
  • biocomponents which are adapted to such middle levels, ie have a functional optimum there. Suitable organisms of origin for such ' Pressure-optimized "biocomponents can be obtained, for example, from depths that correspond to the respective pressure ranges, eg 1000 to 3000 m for pressures of 10 to 30 MPa.
  • the high pressure optimized biocomponents typically have a functional optimum at a pressure in the range of about 11 to 200 MPa, preferably about 21 to 200 MPa, more preferably 30 to 150 MPa, even more preferably 50 to 120 or 150 MPa, and the low-pressure-optimized biocomponents have an optimum at a pressure in the range of 0.1 to 20 MPa, preferably 1 to 10 MPa.
  • a blend of high pressure optimized biocomponents and low pressure optimized biocomponents may include components having a functional optimum at a pressure in the range of 0.1 to 10 MPa or 1 to 10 MPa and components having a functional optimum at a pressure in the range of 11 to 200 MPa or may include components having a functional optimum at a pressure in the range of 0.1 to 20 MPa and components having a functional optimum at a pressure in the range of 21 to 200 MPa, eg 30-200 MPa or 50-120 MPa.
  • even biocomponents with a functional optimum at an average pressure between the respective "low pressure” and "high pressure” can be used.
  • the method according to the invention is basically pressure-controlled, in certain embodiments it may be advantageous to additionally at different temperatures work and optionally make an additional temperature control.
  • a second aspect of the present invention relates to a composition of components, in particular for carrying out at least one (bio) -chemical reaction, which comprises a combination of high-pressure-optimized and low-pressure-optimized biocomponents, which may be present next to one another or spatially separated from one another ,
  • the high pressure optimized biocomponents typically have a functional optimum at a pressure in the range of about 11 to 200 MPa, preferably about 21 to 200 MPa, more preferably 30 to 200 MPa, even more preferably 50 to 120 MPa, and the low-pressure optimized biocomponents have an optimum at a pressure in the range of 0.1 to 20 MPa, preferably 1 to 10 MPa.
  • biocomponents are preferably selected from the group of biological macromolecules, molecular aggregates, organelles, cells, cell membranes or cell lysates.
  • the biocomponents may in principle comprise all cell constituents and biological materials which may be involved in a biochemical reaction and in particular comprise biological catalysts, e.g. Enzymes and coenzymes, membrane components, nucleic acids, proteins or sugars.
  • the high-pressure-optimized biocomponents of the composition are preferably derived from a deep-sea organism or a cell culture obtained therefrom.
  • suitable deep-sea organisms in principle, all organisms from depths of more than 1000 m, preferably more than 2000 m, more preferably more than 3000 m, more preferably more than 5000 m, in particular a range of 5000-10,000 m in question.
  • Organisms from depths of more than 5000 m will, as a rule, be obligatory for the above-mentioned reasons.
  • Suitable organisms include both macroorganisms (animals, plants, generally multicellular) and microorganisms (especially archaebacteria, bacteria and yeasts). As a rule, microorganisms will be preferred because they are particularly robust and tolerate extreme conditions and are easier to grow and cultivate alive.
  • Roundworm nematode
  • Indian Ocean Shrimp-like crustaceans amphipods
  • Suitable barophilic microorganism is the archaebacterium Methanococcus jannaschii already described and cultured in the literature.
  • Suitable normal-pressure or low-pressure organisms likewise include macroorganisms (animals, plants, in general multicellular organisms) as well as microorganisms, in particular archaebacteria, bacteria and yeasts.
  • compositions e.g. Mixtures of HP and NP fractions obtained from cells of HP and NP organisms or in vitro cell cultures find use.
  • the compositions may also be formed by replacement of one or more components of an NP fraction with HP components or replacement of one or more components of an HP fraction with NP components.
  • HP and NP cell lysates or fractions made therefrom are used for biosynthesis (described in more detail in the following section "Cell-free biosynthesis").
  • the composition according to the invention comprises complete or partial fusions of high-pressure-optimized and low-pressure-optimized cells.
  • "Partial” in this context means the fusion of only membrane components of a cell species with membrane components or whole cells of the other cell species.
  • Another related aspect of the invention relates to the use of the process or composition of the invention for the manufacture and / or operation of a pressure controllable system and this system itself.
  • the pressure-controllable system is a system for storing and processing information, a transport system, a system for generating, Storage or conversion of energy, a membrane system, a sensor, or a switch.
  • this system which includes a combination of high pressure optimized and low pressure optimized biocomponents, includes a plurality of adjustable pressure states, wherein the different pressure states each determine a further parameter of the system.
  • this additional system parameter may include or represent a particular charge or conformation, a particular information or energy state, etc. of system components.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a device for carrying out the pressure-controlled method according to the invention, in particular a pressure-controlled biosynthesis method according to the invention.
  • Such a general device comprises at least one synthesis chamber (1), a pressure generating system (2), at least one inflow (3), and at least one outflow (4).
  • the device will typically still include sensors (5), and means (6) for detecting and processing the data received from the sensors.
  • the synthesis chamber comprises two adjustable walls (11,13), the distance of which is adjustable with a spacing system (12), the pressure generating system (2) two adjusting elements (24, 25) connected to a voltage generator (211) and a sturdy frame (212) as an abutment.
  • the adjusting elements are piezoelements.
  • at least one wall of the synthesis chamber is transparent, eg a pressure-resistant glass plate, for example to allow easy observation of the synthesis reaction.
  • the adjustable walls form the lower and upper boundaries of the synthesis chamber and the maximum distance of the adjustable walls is less than the length and width of the adjustable walls.
  • FIG. 7 shows an example of such a synthesis chamber with the basic elements for pressure detection and control.
  • the actual chamber consists of two plates (71, 73), which can also be thick glass plates, so that the reaction may be observed or light can be radiated. These plates are kept at a distance via a spacer system (72).
  • the pressure generation in the more shallow than high synthesis chamber (76) via two piezoverstellelemente (74, 75), which are connected to a voltage generator (711). When energized, they compress the plates (71, 73) of the synthesis chamber, creating the required high pressure in the closed system. In a stable frame (712) these elements find their counter bearing.
  • the reaction chamber there may still be sensors (79, pressure, temperature, reactant concentrations, etc.) which are read out via an electronic system (710) and the data are processed. This can be done not only for the purpose of monitoring but also for rule reasons. In particular, the change in pressure in this way becomes programmable and adaptable to the state of the reaction.
  • the synthesis chamber has inflows (77a and b) and outflows (78), with two inflows (for example for mixing the HP and NP Reactants) and an outflow are shown.
  • the inflows and outflows can be opened and closed with high-pressure valves (713).
  • Fig. 8 shows schematically the pressure control in a synthesis device according to the invention (reaction chamber with pressure periphery).
  • a reaction chamber (1) is connected via a line system (2) with components for pressure generation and measurement. Individual areas are separated by valves (3).
  • the base pressure p ° is introduced from the outside and measured on a first manometer (4).
  • a hydraulic amplifier (5) multiplies this pressure by a fixed amplification factor A. This pressure is introduced into the reaction chamber.
  • a time-variable pressure p 1 can be superimposed additively with a motorized pump (6).
  • the resulting total pressure is measured in a second manometer (7).
  • Reaction products can be discharged to the outside via outlets (8 and 9).
  • FIG. 9 shows a variant of this synthesis device in which the reaction chambers are double-walled. Between the inner reaction volume (11) and the outer volume (12) can then additionally diffusion window (13) are provided become. Via these, reactants and products can be supplied or removed via a further shut-off valve (3).
  • Such devices are suitable both for microsystems (such as typically used for PCR reactions) and for large reaction volumes in the range of milliliters to cubic meters, since pressure is an intrinsic parameter that sets very rapidly throughout the volume (as distinct from temperature, ion concentration or pH). This is an additional advantage over conventional methods.
  • FIG. 1 Schematic representation of the control of a reaction with different pressure states
  • Fig. 2 Schematic of the preparation of a composition with high pressure and low pressure optimized biocomponents
  • FIG. 3 Schematic representation of a pressure-controlled PCR
  • FIG. 4 Schematic representation of a tristate primitive for a biocomputer
  • FIG. 5 Schematic representation of a membrane system with low pressure and high pressure components
  • FIG. 6 Schematic representation of a pressure-controlled biobattery
  • FIG. 7 Schematic representation of a synthesis device according to the invention with pressure control
  • FIG. 8 Schematic representation of the pressure control in a synthesis device according to the invention
  • FIG. 9 Schematic representation of a synthesis device with pressure control and diffusion openings
  • An HP reactant will remain an HP reactant, even if it undergoes a reaction and is changed.
  • An NP reactant has a very low reaction rate at HP.
  • An NP reactant has its maximum reaction rate at NP.
  • An HP reactant has a very low reaction rate in NP.
  • An HP reactant has its maximum reaction rate at HP.
  • An NP reactant has a reduced reaction rate at MP (pressure between HP and NP), but it still reacts.
  • An HP reactant has a reduced reaction rate in MP, but it still reacts.
  • Biocomponents which as reactants meet the above basic requirements, can be obtained from high pressure or low pressure adapted organisms, tested in routine procedures and then used.
  • HP high pressure between 50 and 200 MP, 500 to 2000 atm
  • MP - intermediate pressure between 10 and 50 MPa, 100 to 500 atm
  • NP - low pressure between 0.1 and 10 MPa, 1 to 100 atm
  • a cell lysate from a deep-sea organism in which then many or all components are HP-optimized.
  • This can also be an in vitro cell culture produced from such an organism or by adaptation, which is cultured under high pressure and delivers the cytoplasmic lysate.
  • the DNA-related reaction processes are very strongly pressure-dependent. This means that in an organism from 6000 - 10000 m depth, the optimal working range of the macromolecular components at a pressure of 60 to 100 MPa (600 to 1000 atm). For many of these reaction components, their reactivity at atmospheric pressure is reduced to a few percent or less or completely impossible.
  • a reactive multicomponent system or else a cell organelle system can be switched on and off via a simple pressure change between, for example, 80 MPa and 0.1 MPa (FIG. 2A). If no such large pressure change is made, the reactions can also be manipulated gradually. This would be the case, for example, if you work in the MP range.
  • it is still possible to control the temperature. Deep-sea organisms are usually adapted to very constant temperatures at about 4 0 C. Since changes are in the degree range or less, they are less temperature tolerant than comparative molecules, organelles, etc. isolated from surface organisms.
  • the temperature (lower or higher) can be used in this case in addition to connecting or disconnecting the reactions.
  • HP cell lysate its reactivity, in addition to the principles already used, can be almost completely controlled by the pressure change.
  • NP the system is locked in response and starts to work when the pressure is increased in steps or slowly (HP mode). In this way, cell lysates can be prevented from unwanted or early reaction.
  • FIG. 2C Further embodiments represent various admixtures of HP components isolated from deep-sea organisms to cell lysates from NP organisms. These may be, for example, isolated components which are required for the energy supply in the cell lysate (eg ATP / ADP, NADPH / NADH, but also organelles such as mitochondria or living cells, here designated A 1 ) or energy transport (Figure 2B). Furthermore, mixtures of complete cell lysates from HP and NP organisms in a variety of percentages are applicable. In such mixtures, different reaction rates could be set, so that, for example, the accumulation of one or more intermediates is possible (Fig. 2C).
  • isolated components which are required for the energy supply in the cell lysate eg ATP / ADP, NADPH / NADH, but also organelles such as mitochondria or living cells, here designated A 1
  • Figure 2B energy transport
  • mixtures of complete cell lysates from HP and NP organisms in a variety of percentages are applicable. In such mixture
  • a further embodiment represents the isolation of certain HP components from an HP cell lysate and the removal or at least depletion of these components in the NP lysate. In this way one or more reactions can be stopped and started by pressure changes (FIG. , Finally, replacement of one or more components in both HP cell lysate and NP cell lysate can be accomplished. In this case, a variety of cyclic reactions can be performed.
  • HP and NP components can be isolated from the respective cell lysates and mixed with other basic media, which may be cell lysates or even artificial compositions (FIG. 2 E). In this way mixtures can be put together arbitrarily, in which the reactants freely after the Preselection HP- or NP- are active, which allows various switchable operations in bioreactors.
  • Another more specific embodiment are PCR-like systems in pressure-controlled form. Between the individual stages, annealing, polymerase reaction and single-strand production, no temperature changes are made, but only the pressure is changed as described above.
  • a variant is shown schematically in FIG.
  • the entire duplication cycle can be cycled over periodic pressure changes. This requires that one eliminates the melting of the double strands by heating, which is possible by inserting the helicase. To cycle through the cycle, it cycles from NP to HP and back. Since pressure changes are technically very easily controllable and can be done quickly, it is also possible to work with very small quantities or, secondly, in large volumes. Especially large volumes are problematic for thermocycling.
  • FIG. 6 formally shows an example of a regenerable biobattery based on such components.
  • the system consists of three compartments (I, II, III) separated by a membrane (dotted vertical lines).
  • the membranes contain pressure-sensitive transporters (T) which can carry one component (A) from compartment I to II and back and one component (B) from compartment I to III and back.
  • T pressure-sensitive transporters
  • component (A) or (B) is transferred to a charged state or otherwise excited so that they can give off energy.
  • This compartment is occasionally refilled with reactant mixtures (chemical charging of the battery). Only at HP, the high-energy or charged reactants are transported from I to II or III through the membrane. Only at NP, they can be transported back in the lower-energy form (A, B). The energy is extracted in compartments II and III via a reaction (K) which shows an NP characteristic.
  • contamination and decontamination can be reduced or eliminated by pressure changes and by stopping the reaction chains and restarting.
  • Another application example is pressure-dependent light-driven processes.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen zur Steuerung einer (bio)chemischen Reaktion mittels Druck unter Verwendung von hochdruck-optimierten Biokomponenten. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen wird vorzugsweise eine Kombination von hochdruck-optimierten und niederdruck-optimierten Biokomponenten, welche nebeneinander oder räumlich getrennt voneinander vorliegen können, eingesetzt. Vorzugsweise weisen die hochdruck-optimierten Biokomponenten ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von 11 bis 200, insbesondere 30 bis 200 MPa, und die niederdruckoptimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 10 MPa auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammen die hochdruck-optimierten Biokomponenten aus Tiefseeorganismen, insbesondere obligat barophilen Tiefseeorganismen.

Description

Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen zur Steuerung einer chemischen Reaktion mittels Druck unter Verwendung von hochdruck-optimierten Biokomponenten
Es ist seit langem bekannt, dass biochemische Reaktionen, insbesondere enzymatische Reaktionen, wenigstens teilweise über die Temperatur gesteuert werden können, da viele biologische Makromoleküle, insbesondere Enzyme, deutliche ausgeprägte Maxima ihrer Funktionsfähigkeit und Effizienz bei bestimmten Temperaturen aufweisen. Allerdings ist diese Steuerung meist auf einen relativ engen Temperaturbereich beschränkt und größere Temperaturänderungen nach oben oder unten führen in der Regel zum Abbruch der Reaktion. Nur wenige Biomoleküle sind auch bei deutlich verschiedenen Arbeitstemperaturen funktionsfähig, so dass zyklische Bioreaktionen wenigstens außerhalb eines Organismus nur schwer über die Temperatur steuerbar sind.
Eine Ausnahme und das Paradebeispiel für die Temperatursteuerung einer komplexen zyklischen Reaktion ist jedoch die sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren, insbesondere DNA. Bei dieser Reaktion macht man sich die Eigenschaft der DNA-Polymerase zunutze, DNA-Stänge zu duplizieren. Dazu beginnt man mit einem oder mehreren kurzen Abschnitten doppelsträngiger DNA. Diese wird durch Erwärmung in Einzelstränge zerlegt und mit einem Primer mit einem freien 3'-OH-Ende gekoppelt. Diese Bindung und erste Phase wird als Annealing bezeichnet. Danach wird durch die Wirkung der DNA-Polymerase am Primer beginnend erneut ein Doppelstrang erzeugt. Denaturiert man anschließend die geschaffenen Doppelstränge wieder durch eine Temperaturerhöhung in Einzelstränge, können an diesen nach Abkühlung neue Primer binden und der Prozess wiederholt sich. Setzt man in jedem PCR-Ansatz zwei solche Primer ein, einen der am sense-Strang der zweite, der am antisense-Strang bindet, so erhält man mit jedem Zyklus von Neusynthese und Denaturierung eine Verdopplung (Kettenreaktion) des zwischen den Primern befindlichen DNA-Abschnittes. Verwendet man eine temperaturstabile Polymerase, wie sie aus Organismen aus heißen Quellen gewonnen werden kann, so läuft die Reaktion ohne Unterbrechung ab, wenn man Temperaturzyklen fährt. In der Regel beginnt man zwischen 92-980C mit der Denaturierung der DNA. Dann folgt eine Temperatur, die das Ankoppeln der Primer erlaubt. Diese ist auf den Primer abgestimmt und liegt bei etwa 500C. Nach dem Annealing erhöht man auf die optimale Arbeitstemperatur der Taq-DNA-Polymerase, die bei ca. 72 0C liegt. Dann folgt wieder die Erhöhung über 9O0C usw.
Wesentlich für dieses Prinzip der Amplifizierung ist das Vorhandensein von Molekülen mit verschiedenen Arbeitstemperaturen, die gleichzeitig bis zur höchsten und niedrigsten Temperatur stabil bleiben müssen. Im Falle der DNA fordert das sichere Aufschmelzen in Einzelstränge die höchsten Temperaturen (> 90°C) , auf die die Stabilität der Primer abgestimmt werden muß. Die DNA-Polymerase arbeitet bei 720C optimal und bleibt ebenfalls bei der Aufschmelztemperatur stabil. Auf der Basis dieser temperatur-gesteuerten Reaktionen wurden nach ihrer Einführung vor mehr als 20 Jahren die verschiedensten Modifikationen des Grundprinzips realisiert (RNA-Amplifikation, Kompetitive (RT-) PC, Nested-PCR, Multi- plex-PCR, RACE-PCR, Inverse PCR, Vektoretten-PCR oder AIu-PCR sowie verschiedene Priming-Methoden) . Die PCR ist inzwischen als zentrale bioanalytische Methode aus der Biotechnologie und Medizin nicht mehr wegzudenken. Durch den Einsatz von Light-Cyclern und anderen Geräten, die alternative Prinzipien zur Durchführung rascher Temperatursprünge realisieren, ar- beitet die PCR-Technik robust und schnell. Dennoch stellen die hohen Temperaturen und auch die Temperaturänderungen deutliche Einschränkungen dar. So sind bislang keine weiteren Bioreaktionen nach einem ähnlichen Prinzip umgesetzt worden, da nicht viele Makromoleküle über die breite Temperaturstabilität und Reversibilität gegenüber Temperatursprüngen verfügen.
Aus dem Erfolg der temperatur-gesteuerten PCR-Verfahren leitet sich der Wunsch und die Forderung nach weiteren, insbesondere zum Thermocycling analogen Steuerprinzipien für biochemische Reaktionen ab. Da bei den PCR-analogen Verfahren alle Komponenten die T-Zyklen durchlaufen, müssen sie zumindest die höchste Temperatur ohne Schädigung tolerieren und dürfen nur bei ihrer Zyklustemperatur chemisch aktiv sein. Das schränkt die makromolekulare Kandidatenliste stark ein, denn meistens werden hohe Temperaturen (> 7O0C) von Normaltemperaturspezies entnommen Makromolekülen nicht toleriert. Bisher gibt es neben den temperaturgesteuerten Reaktionszyklen nur traditionelle Prinzipien, wie die pH-Steuerung oder etwa die Veränderung der Ionenstärke der Lösung. Derartige Parameter sind jedoch nicht ohne erheblichen technischen Messaufwand und vor allem nicht ohne Veränderung der Lösungszusammensetzung und Volumina möglich. Beides sind gravierende Nachteile.
Für eine alternative Steuerung von biochemischen Reaktionen werden Biokomponenten, z.B. Makromoleküle, wie Enzyme, Proteine und/oder Zucker, Organellen wie Ribosomen oder Mitochond- rienkomponenten, benötigt, die über möglichst eine einzige technisch einfache und die Lösung nicht kontaminierende oder verändernde physikalische Größe im Arbeitspunkt der Reaktan- ten, wie sie im Folgenden allgemeiner genannt werden sollen, deutlich verschoben werden können. Diese Prozesse müssen na- hezu vollständig, zumindest langzeit-reversibel sein. Das Spektrum der verwendbaren Moleküle und Komponenten sollte deutlich breiter als das der PCR-Technik sein. Die Änderung dieses oder dieser Parameter soll die Moleküle nicht schädigen sondern nur ihre chemische Wirksamkeit (Arbeitspunkte) deutlich verschieben. Besonders willkommen wäre ein Schwellwertverhalten (Ein/Aus) .
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die oben genannte physikalische Größe auch der Druck sein kann und eine Steuerung biochemischer Rektionen mittels Druck realisierbar ist.
Die Druckabhängigkeit von Stoffwechselvorgängen wurde bei Normaldruckorganismen (1 atm) , insbesondere Bakterien und Hefe, bereits in einzelnen Studien, allerdings noch nicht systematisch, untersucht. Bereits untersucht worden sind unter anderem Konformationsänderungen von Proteinen unter hohem Druck und es wurde gezeigt, dass die Funktion dieser Makromoleküle prinzipiell druckabhängig ist. Erhöht man beispielsweise den Druck auf normaldruckadaptierte Mikroorganismen, so kommen die Lebensprozesse bei etwa 10 bis 50 MPa zum Erliegen. Die DNA-Synthese erweist sich dabei neben anderem als am empfindlichsten und ausschlaggebend, während die RNA-Synthese erstaunlich drucktolerant zu sein scheint. Die Dissoziation von Ribosomen scheint ebenfalls wesentlich die Hochdrucktoleranz von Normaldruckorganismen zu limitieren (Yayanos, A.A. und Pollard, E. C. (1969) Biophysics 9, 1464-1482; Gross M. u.a. (1993) Eur. J. Biochem. 218, 463-468).
Die Druckabhängigkeit der Genregulation ist mehrfach nachgewiesen worden. Es verwundert daher nicht, dass sich bei Druckerhöhung an Flachwasserorganismen eine starke Beeinträchtigung der Translations- und Transkriptionsvorgänge zeigt (Kato, C. u.a. (1997), J. Mar. Biotechnol. 5, 210-218; Nakasone, K. u.a. (1999) FEMS Microbiol . Lett. 176, 351-356; Kato C. u.a. (1996), J. Biochem. 120, 301-305; Pole, R. K., Gibson, F. und Wu, G. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 117, 214- 224) .
Auch die Membrankomposition und deren Transporteigenschaften und Stabilität erwiesen sich als stark druckabhängig (siehe Pressure-regulated metabolism in microorganisms, Fumiyoshi Abe, Chiaki Kato und Koki Horikoshi, TRENDS IN MICROBIOLOGY 447, Band 7, Nr. 11, November 1999).
3T3-Mausfibroblasten sterben bei 70 MPa (entspricht einer Tiefe von 7000 m) in Kultur.
Anderseits lassen sich Bakterien aus der Tiefsee zwar bergen, zeigen aber optimale Wachstumsbedingungen erst bei hohen Drücken (je nach Tiefe des Lebensraumes 20 bis 50 MPa) . (Bart- lett, D.H. u.a. (1989) Nature 342, 572-574; Welch, T. J. und Bartlett, D.H. (1996) J. Bacteriol. 178, 5027-5031; Michels, P.C., und Clark, D.S. (1997) Appl . Environ. Microbiol . 63, 3985-3991; Welch, T. J. und Bartlett, D.H. (1998) Mol. Microbiol. 27, 977-985; Allen, E.E., Facciotti, D. und Bartlett, D.H. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65, 1710-1720; Bidle, K. und Bartlett, D.H. (1999) J. Bacteriol. 181, 2330-2337.)
Schon bei reduzierten Drücken von 10 MPa sind Inhibitionen der StoffWechselvorgänge von 80% und mehr zu verzeichnen. Auch Proteine aus Tiefseeorganismen, die tot geborgen wurden, konnten isoliert werden und zeigen je nach Tiefe der Herkunft ihrer Spenderorganismen stark oder weniger stark ausgeprägte druckspezifische Abhängigkeiten. Aus physikalischer Sicht beeinflussen im Wesentlichen drei Effekte druckabhängig chemische Reaktionen auch in biologischen Systemen:
1. Die bereits genannte Druckabhängigkeit der Konformati- onszustände von Makromolekülen.
2. Die Reaktionsgeschwindigkeit jedweder chemischen Reaktion, die je nach Zu- oder Abnahme des Systemvolumens als der relevanten thermodynamischen Größe durch Druckänderungen schneller oder langsamer ablaufen.
3. Die Dissoziationsneigung, die mit steigendem Druck wächst, so dass mehr ionisierte Moleküle vorliegen. Das bedeutet auch, dass Multiproteincomplexe instabil werden.
Thermodynamisch wird dies über die nachfolgenden Gleichungen beschrieben:
wobei K die Gleichgewichtskonstante ist, k die Geschwindigkeitskonstante, p der Druck (in Atmosphären) , T die absolute Temperatur (Kelvin) und R die Gaskonstante (ml atm K"1 mol'1) ; ΔV die Differenz zwischen dem Anfangs- und Endvolumen im Gesamtsystem bei Gleichgewicht (Reaktionsvolumen) , ΔV* die scheinbare Volumenänderung der Aktivierung (Aktivierungsvolumen) und den Volumenunterschied zwischen den Reaktanten und dem Übergangszustand repräsentiert: ist eine Reaktion von einer Volumenerhöhung begleitet, wird sie durch erhöhten Druck gehemmt, während eine von einer Volumenverringerung begleitete Reaktion durch erhöhten Druck gefördert wird. Druckabhängige Änderungen des thermodynamischen Systemvolumens sind nicht mit Volumenänderungen des Organismus oder einer Zelle zu verwechseln. Es handelt sich vielmehr beispielsweise um Änderungen der Anlagerung von Wasser an Makromoleküle, Ionen und Membranen.
Allein aus der Thermodynamik chemischer Reaktionen kann also abgeleitet werden, dass die Druckabhängigkeit der metabolischen Reaktionen in Zellen die Lebens- und Stoffwechselvorgänge entscheidend beeinflusst. Bedenkt man, dass, wie sich aus den obigen Gleichungen ergibt, eine chemische Reaktion bei 1000 atm bis zu 200 000 Mal schneller ablaufen kann als bei 1 atm, allerdings ebenso entsprechende Verlangsamungen auftreten können, so ist sofort einsichtig, dass ständig unter hohem Druck lebende Organismen wie Tiefseeorganismen eine Anpassung und Abstimmung aller Reaktionen im Laufe der evolutionären Anpassung an die Tiefe vorgenommen haben müssen und schlechterdings nicht einfach unter Druckentlastung weiter zu leben vermögen. Es ist ebenfalls ersichtlich (und durch Untersuchungen belegt) , dass solche Organismen aufgrund der erforderlichen Anpassung hochdruck-optimierte Zellbestandteile und Makromoküle enthalten, welche zwar bei hohem Druck, nicht jedoch bei niedrigen Druck funktionsfähig sind, und damit als biologische Komponenten einer druckgesteuerten Reaktion geeignet sind.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, nämlich die Bereitstellung eines alternativen Wegs zur einfachen und effizienten Steuerung biochemischer Reaktionen, wird somit erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung des Verfahrens zur Steuerung einer chemischen Reaktion mittels Druck unter Verwendung von hochdruck-optimierten Biokomponenten, insbesondere einer Kombination von hochdruck-optimierten Biokomponenten und niederdruck-optimierten Biokomponenten nach Anspruch 1, sowie die Bereitstellung der Zusammensetzung nach Anspruch 15 und der Vorrichtung nach Anspruch 30. Weitere Aspekte und bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der weiteren Ansprüche.
Der Begriff „hochdruck-optimierte Biokomponenten", wie hier verwendet, bedeutet, dass die entsprechenden Biokomponenten ein Optimum ihrer Aktivität, Funktionsfähigkeit und/oder Effizienz bei einem deutlich höheren Druck als Normaldruck aufweisen. Die hochdruck-optimierten Biokomponenten werden typischerweise ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von etwa 11 bis 200 MPa, vorzugsweise von etwa 21 bis 200 MPa, bevorzugter von 30 bis 150 MPa, noch bevorzugter von 50 bis 120 MPa, aufweisen.
Der Begriff „niederdruck-optimierte Biokomponenten", wie hier verwendet, bedeutet dass diese Biokomponenten im Vergleich zu den hochdruck-optimierten Biokomponenten das Optimum ihrer Aktivität, Funktionsfähigkeit und/oder Effizienz bei einem deutlich niedrigeren Druck zeigen. Typischerweise werden die niederdruck-optimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 20 MPa, vorzugsweise 1 bis 10 MPa, aufweisen.
Wie aus den obigen Bereichsangaben hervorgeht, kann man Biokomponenten mit einem funktionellen Optimum in einem mittleren Bereich von etwa 11 bis 20 MPa sowohl als niederdruck- wie auch als hochdruck-optimierte Biokomponenten betrachten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kommt es bei einer Mischung von Hochdruck- und Niederdruckkomponenten in erster Linie darauf an, dass die beiden unterschiedlichen Komponenten klar abgegrenzte Funktionsmaxima bei unterschiedlichen Drücken aufweisen (wobei der höhere Druck dann die „Hochdruckkomponenten" definiert) , und weniger auf die absoluten Werte der Druckmaxima. Allerdings wird die Verwendung von Biokomponenten mit Funktionsmaxima bei stark unterschiedlichen Drücken die Steuerung von Reaktionen mittels Druck naturgemäß erleichtern und u.a. aus den bereits angeführten Gründen ist die Isolierung von Biokomponenten mit diesen Charakteristika am erfolgversprechendsten, wenn solche Ausgangsorganismen verwendet werden, die an sehr unterschiedliche Drücke angepasst sind.
Die hochdruck-optimierten Biokomponenten stammen daher vorzugsweise aus Tiefseeorganismen oder einer daraus erhaltenen Zellkultur, während die niederdruck-optimierten Biokomponenten vorzugsweise aus Normaldruckorganismen oder einer daraus erhaltenen Zellkultur stammen. Diese Organismen enthalten jeweils funktionale Makromoleküle und daraus aufgebaute übergeordnete Strukturen wie Organellen etc., die druckadaptiert sind, d.h. die Effektivität, der Arbeitsbereich der Makromoleküle, Organellen oder Zellen, besitzt ein druckabhängiges Optimum. Alle Organismen auf der Erdoberfläche sind an den Luftdruck (ca. 1 atm) angepasst. Erhöht man den Druck, verlieren sie kontinuierlich oder auch sprunghaft an Reaktionsfähigkeit bis hin zur Inaktivität bei Drücken im Bereich von 10 bis 100 MPa. Genau umgekehrt verhält es sich bei Tiefseeorganismen. Ab einer Tiefe von 5000 m, wahrscheinlich schon ab 3000 m, treten obligat barophile Organismen auf. Diese können vor allem aus den genannten molekularen Gründen nicht an Normaldruck adaptiert werden. Einer der Gründe liegt in den auf die entsprechende Tiefe abgestimmten Optima der Arbeitsbereiche der Makromoleküle und nachfolgend höheren Strukturen, bis hin zu den Zellen und Geweben. Beispielsweise sind nahezu alle Membrantransportprozesse deutlich druckabhängig und folglich tiefseeoptimiert . In einer typischen Ausführungsform der Erfindung wird daher eine Mischung von hochdruck-optimierten Biokomponenten, z.B. Hochdruckmolekülen, Organellen oder Zellen, die aus Tiefseeorganismen isoliert wurden, mit niederdruck-optimierten Biokomponenten, z.B. Niederdruckmolekülen, Organellen oder Zellen, aus Normaldruckorganismen für druckgesteuerte biochemische oder chemische Reaktionen, insbesondere zyklische Reaktionen, verwendet. Zur Steuerung zyklischer Reaktionsfolgen, aber auch bei der Verwendung von Zelllysaten oder anderen komplexen Reaktionsmischungen stellt dieses Prinzip ein Mittel dar, Einzelreaktionen eines Zyklus gegenüber anderen zu verlangsamen oder vollständig abzuschalten. Wird der Druck verändert, werden die anderen (inversen) Reaktionen verlangsamt oder ganz angehalten und nur die zuerst genannten laufen optimal ab. So besteht ein wesentliches Konzept des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, zwei oder mehrere Makromolekültypen oder Organellen, letztendlich auch Zellysate oder auch funktionsfähige Zellpopulationen (im folgenden Reaktoren genannt) so zu mischen oder räumlich getrennt anzuordnen, dass einige der Reaktoren hochdruck-adaptiert (im Folgenden mit dem Zusatz „HP") andere normaldruckoptimiert („NP") sind.
Nimmt man den Extremfall eines obligat barophilen Tiefseeorganismus mit einem Optimum des Arbeitspunktes der in Frage kommenden molekularen oder zellulären Komponente bei 50 - 110 MPa und nahezu keiner Aktivität der Biosynthesekomponenten bei Normaldruck, aus dem man die entsprechenden Makromoleküle, Organellen oder auch Zellen funktionsfähig isoliert und diese mit anderen Komponenten, isoliert aus Normaldruckorganismen, mischt, so kann man die jeweiligen Reaktionen über Druckänderungen an- und abschalten oder auch bei dazwischen liegendem Druck (MP) gemeinsam verlangsamt ablaufen lassen. Prinzipien der Reaktionsabläufe sind in Fig. 1 dargestellt. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der zu steuernden chemischen oder biochemischen Reaktion um eine enzymatische Reaktion, insbesondere eine PCR- Reaktion oder eine andere Reaktion zur Vervielfältigung oder Manipulation von Nukleinsäure.
Der Begriff „Steuerung einer (bio) chemischen Reaktion mittels Druck", wie hier verwendet, beinhaltet grundsätzlich jede Art des Beeinflussung des Ablaufs einer chemischen Reaktion durch die Vorgabe eines bestimmten Drucks und/oder durch Druckänderungen. Typischerweise beinhaltet eine solche Steuerung, dass die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion durch eine Druckänderung eingestellt werden kann und/oder dass die chemische Reaktion durch eine Druckänderung an- oder abgeschaltet werden kann. Die Reaktion kann z.B. zur Entnahme von Reaktionsprodukten oder Entnahme/Zufuhr von Reaktionspartnern vorübergehend oder dauerhaft gestoppt werden.
In spezielleren Ausführungsformen der Erfindung werden kontinuierliche oder periodische Druckänderungen vorgenommen, einschließlich Druckänderungen, die bestimmten vorgegebenen Funktionen, z.B. Funktionen mit sinusförmigen, rampen- förmigen, rechteckigen, dreieckigen oder trapezförmigen Verläufen, folgen.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können auch Zwischenzustände über MP (mittlere Druckniveaus zwischen HP und NP) definiert werden und Systeme mit mehreren Druckzuständen, z.B. Tristate oder Multistate (HP, MPl, MP2,..., NP), definiert werden. Insbesondere für Systeme und Verfahren, bei denen solche mittleren Druckniveaus realisiert werden, können auch Biokomponenten, die an solche mittleren Niveaus adaptiert sind, d.h. dort ein funktionelles Optimum aufweisen, eingesetzt werden. Geeignete Herkunftsorganismen für solche „mit- teldruck-optimierten" Biokomponenten können beispielsweise aus Tiefen, die den jeweiligen Druckbereichen entsprechen, z.B. 1000 bis 3000 m für Drücke von 10 bis 30 MPa, gewonnen werden.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen werden die hochdruck-optimierten Biokomponenten typischerweise ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von etwa 11 bis 200 MPa, vorzugsweise von etwa 21 bis 200 MPa, bevorzugter von 30 bis 150 MPa, noch bevorzugter von 50 bis 120 oder 150 MPa, aufweisen und die niederdruckoptimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 20 MPa, vorzugsweise 1 bis 10 MPa, aufweisen.
Eine Mischung von hochdruck-optimierten Biokomponenten und niederdruck-optimierten Biokomponenten kann beispielsweise Komponenten mit einem funktionellen Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 10 MPa oder 1 bis 10 MPa und Komponenten mit einem funktionellen Optimum bei einem Druck im Bereich von 11 bis 200 MPa umfassen oder kann Komponenten mit einem funktionellen Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 20 MPa und Komponenten mit einem funktionellen Optimum bei einem Druck im Bereich von 21 bis 200 MPa, z.B. 30- 200 MPa oder 50-120 MPa, umfassen. Insbesondere bei Systemen und Verfahren, bei denen mehrere stabile Druckzustände realisiert werden sollen, können auch noch Biokomponenten mit einem funktionellen Optimum bei einem mittleren Druck zwischen dem jeweiligen „Niederdruck" und „Hochdruck" eingesetzt werden.
Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren grundsätzlich druckgesteuert wird, kann es in bestimmten Ausführungsformen vorteilhaft sein, zusätzlich bei verschiedenen Temperaturen zu arbeiten und gegebenenfalls eine zusätzliche Temperatursteuerung vorzunehmen.
Wie bereits oben erwähnt, betrifft ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung von Komponenten, insbesondere zur Durchführung mindestens einer (bio)- chemischen Reaktion, die eine Kombination von hochdruckoptimierten und niederdruck-optimierten Biokomponenten, welche nebeneinander oder räumlich getrennt voneinander vorliegen können, umfasst.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen werden die hochdruck-optimierten Biokomponenten typischerweise ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von etwa 11 bis 200 MPa, vorzugsweise von etwa 21 bis 200 MPA, bevorzugter 30 bis 200 MPa, noch bevorzugter von 50 bis 120 MPa, und die niederdruck-optimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 20 MPa, vorzugsweise 1 bis 10 MPa, aufweisen.
Diese Biokomponenten sind vorzugsweise aus der Gruppe aus biologischen Makromolekülen, Molekülaggregaten, Organellen, Zellen, Zellmembranen oder Zelllysaten ausgewählt. Die Biokomponenten können grundsätzlich alle Zellbestandteile und biologische Materialien umfassen, die an einer biochemischen Reaktion beteiligt sein können und umfassen insbesondere biologische Katalysatoren, z.B. Enzyme und Coenzyme, Membrankomponenten, Nukleinsäuren, Proteine oder Zucker.
Vorzugsweise stammen die hochdruck-optimierten Biokomponenten der Zusammensetzung von einem Tiefseeorganismus oder einer daraus erhaltenen Zellkultur. Als geeignete Tiefseeorganismen kommen grundsätzlich alle Organismen aus Tiefen von mehr als 1000 m, vorzugsweise mehr als 2000 m, bevorzugter mehr als 3000 m, noch bevorzugter mehr als 5000 m, insbesondere einem Bereich von 5000-10.000 m, in Frage. Organismen aus Tiefen von mehr als 5000 m werden aus den oben angeführten Gründen in der Regel obligat ba- rophil sein. Geeignete Organismen umfassen sowohl Makroorganismen (Tiere, Pflanzen, allgemein Vielzeller) als auch Mikroorganismen (insbesondere Archaebakterien, Bakterien und Hefen) . Mikroorganismen werden in der Regel bevorzugt sein, da diese besonders robust extreme Bedingungen tolerieren und leichter lebend zu gewinnen und zu kultivieren sind.
Einige nicht-beschränkende Beispiele für geeignete Organismen und deren Herkunftsorte sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Tabelle 1
Bezeichnung Tiefe Ort des Vorkommens
Seegurke (Holothuroidea) 10.911 m Marianengraben, westl. Pazifik Abyssobrotula Galathea 9.600 m Marianengraben, westl. Pazifik Gießkannenschwamm 5.000 m Westlicher Pazifik (Euplectella Aspergillum)
Versch. Mikroorganismen, 10.897 m Marianengraben, westl. Pazifik Hefen und Bakterien
Fadenwurm (Nematode) 5.000 m Indischer Ozean Garnelenartige Krustentiere (Amphipoden) 10.000 m Marianengraben, westl. Pazifik Versch. Krabben, Würmer 5.000 m Atlantik, westl. d. kapv. Ins. und Spuren von Holothurien (Seewalzen oder Seegurken) sowie 30 cm Rattenschwanzfisch (Macrouridae) .
Ein spezielles Beispiel für einen geeigneten barophilen Mikroorganismus ist das bereits in der Literatur beschriebene und kultivierte Archaebakterium Methanococcus jannaschii. Geeignete Normaldruck- oder Niederdruckorganismen umfassen ebenfalls sowohl Makroorganismen (Tiere, Pflanzen, allgemein Vielzeller) als auch Mikroorganismen, insbesondere Archaebak- terien, Bakterien und Hefen.
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen können z.B. Gemische aus HP- und NP-Fraktionen, gewonnen aus Zellen von HP- und NP-Organismen oder in vitro-Zellkulturen Verwendung finden. Die Zusammensetzungen können auch durch Ersatz von einer oder mehreren Komponenten einer NP-Fraktion durch HP- Komponenten oder Ersatz von einer oder mehreren Komponenten einer HP-Fraktion durch NP-Komponenten gebildet werden.
In einer Ausführungsform werden HP- und NP-Zelllysate oder aus diesen hergestellte Fraktionen für die Biosynthese genutzt (ausführlicher im folgenden Abschnitt „zellfreie Biosynthese" beschrieben) .
In einer speziellen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung vollständige oder partielle Fusionen von hochdruck-optimierten und niederdruck-optimierten Zellen. „Partiell" bedeutet in diesem Zusammenhang die Verschmelzung von lediglich Membrankomponenten einer Zellspezies mit Membrankomponenten oder ganzen Zellen der anderen Zellspezies.
Ein weiterer verwandter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung und/oder zum Betrieb eines durch Druck steuerbaren Systems und dieses System selbst .
Spezieller handelt es sich bei dem durch Druck steuerbaren System um ein System zur Speicherung und Verarbeitung von Informationen, ein Transportsystem, ein System zur Erzeugung, Speicherung oder Umwandlung von Energie, ein Membransystem, einen Sensor, oder einen Schalter.
In einer grundsätzlichen Ausführungsform beinhaltet dieses System, das eine Kombination von hochdruck-optimierten und niederdruck-optimierten Biokomponenten enthält, mehrere einstellbare Druckzustände, wobei die verschiedenen Druckzustände jeweils einen weiteren Parameter des Systems bestimmen.
Dieser weitere Systemparameter kann beispielsweise eine bestimmte Ladung oder Konformation, einen bestimmten Informati- ons- oder Energiezustand etc. von Systemkomponenten umfassen oder repräsentieren.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen druckgesteuerten Verfahrens, insbesondere eines erfindungsgemäßen druckgesteuerten Biosyntheseverfahrens.
Eine solche allgemeine Vorrichtung umfasst mindestens eine Synthesekammer (1), ein Druckerzeugungssystem (2), mindestens einen Zufluss (3), und mindestens einen Abfluss (4).
Weiterhin wird die Vorrichtung typischerweise noch Sensoren (5), und eine Einrichtung (6) zur Erfassung und Verarbeitung der von den Sensoren erhaltenen Daten umfassen.
In einer spezielleren Ausführungsform der Vorrichtung umfasst die Synthesekammer zwei verstellbare Wände (11,13), deren Abstand mit einem Abstandssystem (12) regelbar ist, das Druckerzeugungssystem (2) zwei Verstellelemente (24, 25), die an einem Spannungsgenerator (211) angeschlossen sind, sowie einen stabilen Rahmen (212) als Gegenlager. Vorzugsweise handelt es sich bei den Verstellelementen um Piezoelemente . Es ist ebenfalls bevorzugt, dass mindestens eine Wand der Synthesekammer transparent ist, z.B. eine druckfeste Glasplatte darstellt, um z.B. eine leichte Beobachtung der Synthesereaktion zu gestatten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung bilden die verstellbaren Wände die untere und die obere Begrenzung der Synthesekammer und der maximale Abstand der verstellbaren Wände ist geringer als die Länge und Breite der verstellbaren Wände.
Figur 7 zeigt beispielhaft eine solche Synthesekammer mit den Grundelementen zur Druckerfassung und -Steuerung. Die eigentliche Kammer besteht aus zwei Platten (71, 73) , die auch dicke Glasplatten sein können, so dass die Reaktion ggf. beobachtet bzw. Licht eingestrahlt werden kann. Diese Platten werden über ein Abstandssystem (72) auf Distanz gehalten. Die Druckerzeugung in der mehr flachen als hohen Synthesekammer (76) erfolgt über zwei Piezoverstellelemente (74, 75), die an einen Spannungsgenerator (711) angeschlossen sind. Werden sie mit einer Spannung beaufschlagt, drücken sie die Platten (71, 73) der Synthesekammer zusammen, wodurch im geschlossenen System der erforderlich hohe Druck erzeugt wird. In einer stabilen Rahmen (712) finden diese Elemente ihr Gegenlager. In der Reaktionskämmer können sich noch Sensoren (79, Druck, Temperatur, Reaktantenkonzentrationen etc.) befinden, die ü- ber eine Elektronik (710) ausgelesen und die Daten verarbeitet werden. Dies kann nicht nur zum Zwecke der Überwachung sondern auch aus Regelgründen erfolgen. Insbesondere wird die Änderung des Druckes auf diese Weise programmierbar und dem Stand der Reaktion anpassbar. Die Synthesekammer verfügt über Zuflüsse (77a und b) sowie Abflüsse (78), wobei hier beispielhaft zwei Zuflüsse (z.B. zum Mischen der HP- und NP- Reaktanten) und ein Ausfluss dargestellt sind. Die Zu- und Abflüsse sind mit Hochdruckventilen (713) offen- und schließbar.
Mit den erfindungsgemäßen Vorrichtungen können Einzelreaktionen oder Reaktionsfolgen, vor allem auch in zyklischer Weise, ausgeführt werden und dabei Drucksprünge oder -änderungen im Bereich von typischerweise 0,1 bis 200 MPa vorgenommen werden. Die Druckverläufe können vorgegeben und überwacht werden und können beliebigen Funktionen folgen (sinusförmiger Verlauf, Rechteck oder Rampen, Trapezverläufe etc.). Entsprechende Kammern sollten keine Gasräume enthalten und sind weitestgehend geschlossen auszuführen, zumindest, wenn die Hochdruckreaktionen ablaufen.
Fig. 8 zeigt schematisch die Drucksteuerung in einer erfindungsgemäßen Synthesevorrichtung (Reaktionskammer mit Druckperipherie) . Eine Reaktionskammer (1) ist über ein Leitungssystem (2) mit Komponenten zur Druckerzeugung und -Messung verbunden. Einzelne Bereiche sind über Ventile (3) getrennt. Der Basisdruck p° wird von außen eingeleitet und an einem ersten Manometer (4) gemessen. Ein hydraulischer Verstärker (5) vervielfältigt diesen Druck mit einer festen Verstärkungsfaktor A. Dieser Druck wird in die Reaktionskammer eingeleitet. Gleichzeitig kann mit einer motorisierten Pumpe (6) ein zeitlich variabler Druck p1 additiv überlagert werden. Der resultierende Gesamtdruck wird in einem zweiten Manometer (7) gemessen. Reaktionsprodukte können über Auslässe (8 und 9) nach außen abgeleitet werden.
Fig. 9 zeigt eine Variante dieser Synthesevorrichtung, bei der die Reaktionskämmer doppelwandig ausgeführt ist. Zwischen dem inneren Reaktionsvolumen (11) und dem äußeren Volumen (12) können dann zusätzlich Diffusionsfenster (13) vorgesehen werden. Über diese können Edukte und Produkte über ein weiteres Absperrventil (3) zu- oder abgeführt werden.
Solche Vorrichtungen eignen sich sowohl für Mikrosysteme (wie z.B. typischerweise für PCR-Reaktionen eingesetzt) als auch für große Reaktionsvolumina im Bereich von Millilitern bis Kubikmetern, da Druck ein intrinsischer Parameter ist, der sich sehr rasch im gesamten Volumen einstellt (im Unterschied zur Temperatur, der Ionenkonzentration oder dem pH-Wert) . Dies stellt einen zusätzlichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Verfahren dar.
Bei den erfindungsgemäßen druckgesteuerten Biosyntheseverfahren wird vorzugsweise mit periodischen Druckänderungen, z.B. im Bereich von 0,1 MPa bis 200 MPa, gearbeitet. Die Druckänderungen können dabei in Zeitintervallen von Mikrosekunden bis Stunden vorgenommen werden. Mit gegenläufigen Spritzensystemen wie aus der HPLC-Technik bekannt und beispielhaft in Fig. 8 und 9 dargestellt, ist eine solche Feineinstellung des Drucks problemlos möglich.
Kurzbeschreibung der Figuren
Fig. 1 Schematische Darstellung des Steuerung einer Reaktion mit verschiedenen Druckzuständen
Fig. 2 Schema der Herstellung einer Zusammensetzung mit hochdruck- und niederdruck-optimierten Biokomponenten
Fig. 3 Schematische Darstellung einer druckgesteuerten PCR
Fig. 4 Schematische Darstellung eines Tristate-Grundelements für einen Biocomputer
Fig. 5 Schematische Darstellung eines Membransystems mit Niederdruck- und Hochdruckkomponenten Fig. 6 Schematische Darstellung einer druckgesteuerten Biobatterie
Fig. 7 Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Synthesevorrichtung mit Drucksteuerung
Fig. 8 Schematische Darstellung der Drucksteuerung in einer erfindungsgemäßen SyntheseVorrichtung
Fig. 9 Schematische Darstellung einer Synthesevorrichtung mit Drucksteuerung und Diffusionsöffnungen
Im Folgenden werden verschiedene Anwendungsbeispiele beschrieben, welche die vorliegende Erfindung näher erläutern und das breite Spektrum der unterschiedlichen Nutzungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen aufzeigen, jedoch nicht darauf beschränken sollen.
Die Anwendungsbeispiele basieren auf den folgenden Grundannahmen: l.Alle Reaktanten (z.B. Makromoleküle, Molekülcluster, Organellen, Zellen) halten sowohl HP- als auch NP- Belastung aus und sind reversibel in ihren Veränderungen.
2. Ein HP-Reaktant bleibt ein HP-Reaktant, auch wenn er eine Reaktion durchläuft und verändert wird.
3. Gleiches gilt für NP-Reaktanten.
4. Folgendes Verhalten der Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten wird angenommen:
- Ein NP-Reaktant hat bei HP eine sehr geringe Reaktionsgeschwindigkeit .
- Ein NP-Reaktant hat bei NP seine maximale Reaktionsgeschwindigkeit .
- Ein HP-Reaktant hat bei NP eine sehr geringe Reaktionsgeschwindigkeit . Ein HP-Reaktant hat bei HP seine maximale Reaktionsgeschwindigkeit .
- Ein NP-Reaktant hat bei MP (zwischen HP und NP liegender Druck) eine verringerte Reaktionsgeschwindigkeit, er reagiert jedoch noch. Ein HP-Reaktant hat bei MP eine verringerte Reaktionsgeschwindigkeit, er reagiert jedoch noch.
Mit diesen Grundannahmen werden im Folgenden idealisierte und vereinfachte Systeme beschrieben. Es gibt mit hoher Wahrscheinlichkeit auch Reaktanten, die nach einer Reaktion von HP- in MP- oder sogar in NP-Reaktanden übergehen, weil sie in der neuen Konfiguration weniger druckabhängig sind. Es wird auch Reaktanten geben, die kaum oder vollständig druckabhängig sind. Solche Reaktanten könnten für komplexere und eventuell noch wirkungsvollere Anwendungen ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden.
Biokomponenten, welche als Reaktanten den obigen Grundannahmen bzw. Voraussetzungen entsprechen, können aus hochdruck- bzw. niederdruck-adaptierten Organismen gewonnen, in Routineverfahren getestet und dann eingesetzt werden.
Die für die folgenden Ausführungsbeispiele typischerweise nutzbaren Druckbereiche sind:
HP - Hochdruck (zwischen 50 und 200 MP, 500 bis 2000 atm) MP - Mitteldruck (zwischen 10 und 50 MPa, 100 bis 500 atm) NP - Niederdruck (zwischen 0,1 und 10 MPa, 1 bis 100 atm) .
Dabei handelt es sich jedoch nur um beispielhafte und generalisierte Bereiche, die im Einzelfall in ihren Grenzen verschoben und auf die jeweiligen Reaktanten abgestimmt festgelegt werden müssen und können. Es ist auch zu berücksichtigen, dass bestimmte Biokomponenten (z.B. solche aus Tiefsee- Organismen, welche aus einer relativ mäßigen Tiefe von etwa 3000 m geborgen wurden) voraussichtlich weder bei HP noch NP sondern nur bei MP ihre größte Aktivität aufweisen werden. Auch mit solchen Komponenten lassen sich analoge, in mehreren Druckstufen gestaffelte Reaktionssysteme entwickeln.
Zellfreie Synthese
In den letzten 10 Jahren hat sich das Feld der zellfreien Biosynthese rapid entwickelt. Dazu werden Zelllysate benutzt, gewonnen aus Hefen, E. coli, aber auch höheren Zellen, die durch geeignete Handhabung (niedrige Temperaturen, pH- Änderung, Energie-Verarmung oder Blockierung des Stoffwechsels) reaktionsfähig gehalten werden. Hebt man diese Blockierungen oder Reduzierungsmaßnahmen auf, so reagiert das System durch, um im thermodynamischen Gleichgewicht zu enden. Diese letzte geordnete Reaktionskette wird genutzt, in dem man ein oder mehre mRNA-Typen in großer Menge zugibt, deren codierten Proteine dann in dem Zelllysat produziert werden. Auf diesem Wege wurden bereits mehrere hundert Proteintypen synthetisiert, die durchaus auch toxische Eigenschaften aufweisen können, da keine lebende Zelle zur Synthese benutzt wird. Das Prinzip ist allerdings bisher von einer Vielzahl technologischer Schwierigkeiten begleitet. Das sind einmal der schnelle Verfall der Reaktionsfreudigkeit des Zelllysats, zum anderen die mangelnde Kontrolle der Reaktionen, wenn diese einmal in Gang gekommen sind, letztendlich auch die Einmaligkeit der Nutzung. Des Weiteren bereitet die Skalierung hin zu größeren Volumina und Mengen der Produkte Schwierigkeiten. Insbesondere wäre es sehr hilfreich, wenn man die Inaktivie- rung/Aktivierung der Zelllysate und entsprechend komplexer Reaktionsgemische auf einfache Weise steuern könnte. Ähnlich kurzlebigen Isotopen ist die Handhabung der Reaktionsgemische nur zeitlich sehr begrenzt möglich und daher jede Art von Steuerung und Synchronisation willkommen. Dies ist erfin- dungsgemäß über die Beimengung oder auch komplette Nutzung von Komponentenketten oder Zelllysaten aus hochdruckadaptierten Tiefseeorganismen gelöst.
Im einfachsten Fall nutzt man ein Zelllysat aus einem Tiefseeorganismus, in dem dann sehr viele oder alle Komponenten HP-optimiert sind. Das kann auch eine aus einem solchen Organismus oder durch Adaptierung erzeugte in vitro Zellkultur sein, die unter Hochdruck kultiviert wird und das Zellplasma- lysat liefert. Es ist bekannt, dass insbesondere die DNA- bezogenen Reaktionsabläufe sehr stark druckabhängig sind. Das bedeutet, bei einem Organismus aus 6000 - 10000 m Tiefe, liegt der optimale Arbeitsbereich der makromolekularen Komponenten bei einem Druck von 60 bis 100 MPa (600 bis 1000 atm) . Für viele dieser Reaktionskomponenten ist deren Reaktionsfähigkeit bei Normaldruck auf wenige Prozent oder darunter reduziert bzw. komplett unmöglich. Ungeachtet dessen tolerieren sie eine derartige Druckänderung über zwei Dekaden nahezu reversibel für bestimmte Zeiten (Stunden bis Tage) . Somit kann ein derartiges Zelllysat, ein reaktives Vielkomponentensystem oder auch ein Zellorganellensystem über einfachen Druckwechsel zwischen z.B. 80 MPa und 0,1 MPa an- und abgeschaltet werden (Fig. 2A). Wird kein so großer Druckwechsel vorgenommen, lassen sich die Reaktionen auch graduell manipulieren. Dies wäre z.B. der Fall, wenn man im MP-Bereich arbeitet. Zusätzlich kann noch über die Temperatur gesteuert werden. Tiefseeorganismen sind in der Regel an sehr konstante Temperaturen bei etwa 40C angepasst. Da Änderungen im Grad-Bereich oder darunter liegen, sind sie weniger stark temperaturtolerant als Vergleichsmoleküle, Organellen etc., die aus Oberflächenorganismen isoliert wurden. Die Temperatur (geringere oder höhere) kann in diesem Fall zusätzlich zur Anschaltung oder Abschaltung der Reaktionen verwendet werden. Im Fall der Nutzung eines HP-Zelllysats kann dessen Reaktionsfähigkeit neben den bereits genutzten Prinzipen nahezu vollständig über die Druckänderung gesteuert werden. Bei NP ist das System reaktionsblockiert und beginnt zu arbeiten, wenn der Druck sprungweise oder langsam erhöht wird (HP- Modus) . Auf diese Weise lassen sich Zelllysate an unerwünschter oder zu früher Reaktion hindern.
Weitere Ausführungsformen stellen verschiedenste Zumischungen von HP-Komponenten isoliert aus Tiefseeorganismen zu Zellly- saten aus NP-Organismen dar. Dies können z.B. isolierte Komponenten sein, die für die Energiebereitstellung im Zelllysat erforderlich sind (z.B. ATP/ADP, NADPH/NADH, aber auch Organellen, wie Mitochondrien oder lebende Zellen, hier mit A1 bezeichnet) oder den Energietransport betreffen (Fig. 2B) . Des Weiteren sind Mischungen kompletter Zelllysate aus HP- und NP-Organismen in den verschiedensten prozentualen Anteilen anwendbar. In derartigen Gemischen ließen sich verschiedene Reaktionsgeschwindigkeiten einstellen, so dass beispielsweise die Akkumulation eines oder mehrerer Zwischenprodukte möglich wird (Fig. 2C). Eine weitere Ausführungsform stellt die Isolation von bestimmten HP-Komponenten aus einem HP-Zelllysat und die Entfernung oder zumindest Verarmung dieser Komponenten im NP-Lysat dar. Auf diese Weise können eine oder mehrer Reaktionen über Druckänderungen gestoppt und angefahren werden (Fig.l D). Letztendlich kann der Ersatz einer oder mehrere Komponenten sowohl im HP-Zelllysat als auch im NP-Zelllysat vorgenommen werden. In diesem Fall lassen sich eine Vielzahl von zyklischen Reaktionen durchführen. In analoger Weise lassen sich HP- und NP-Komponenten aus den jeweiligen Zelllysaten isolieren und anderen Grundmedien, die Zelllysate, oder auch künstlichen Kompositionen sein können, zumischen (Fig.2 E). Auf diesem Wege lassen sich Gemische beliebig zusammenstellen, in denen die Reaktanten frei nach der Vorauswahl HP- oder NP- aktiv sind, was vielfältig schaltbare Vorgänge in Bioreaktoren erlaubt.
Vorteile der Druckmodulation sind des Weiteren die Synchronisation von Reaktionsfolgen sowie das Stoppen und Anfahren derselben, beispielsweise zum Auskoppeln von Reaktionsprodukten aus dem Reaktionszyklus.
Druck-PCR
Ein weiteres spezielleres Ausführungsbeispiel stellen PCR- ähnliche Systeme in druckgesteuerter Form dar. Zwischen den einzelnen Stufen, Annealing, Polymerase-Reaktion und Einzelstrangerzeugung, werden keine Temperaturänderungen mehr vorgenommen, sondern lediglich der Druck wie oben beschrieben geändert. Eine Variante ist in Fig. 3 schematisch dargestellt. Wird ein HP-Primer und eine HP-Polymerase sowie eine NP-Helicase verwendet, kann der gesamte Duplizierungszyklus über periodische Druckänderungen gefahren werden. Dies setzt voraus, dass man das Aufschmelzen der Doppelstränge durch Erwärmen eliminiert, was durch das Einfügen der Helicase möglich ist. Zum Durchlaufen des Zyklus wird zyklisch von NP auf HP und zurück geschaltet. Da Druckänderungen technisch sehr leicht steuerbar sind und schnell erfolgen können, kann auch mit kleinsten Mengen oder zum anderen in großen Volumina gearbeitet werden. Gerade große Volumina sind für das Thermo- cycling problematisch.
Biocomputer
Biocomputer auf der Basis von Makromolekülreaktionen, z.B. über DNA-Replikation, wurden bereits im Grundansatz experimentell demonstriert. Über die Verwendung von HP- und NP- Komponenten lassen sich a) logische Operatoren, b) Speichereinheiten als auch c) ein Grundtakt, mit dem die Reaktionen gestartet und gestoppt werden können, realisieren. In Fi- gur 4 ist das Prinzip eines derartigen Grundelements, eines Tristate-Elements, dargestellt. In einer Membran befinden sich hierfür in gleichem Verhältnis Ionentransporter für Ani- onen als auch für Kationen. Die einen sind HP- die anderen NP-aktiv. Wird dieses System mit HP beaufschlagt, wird die Membran stark positiv geladen, bei NP hingegen negativ. Dieses binäre Prinzip kann durch weitere Druckwerte dazwischen auf Tristate oder Multistate erweitert werden. Über Kaskadie- rung lassen sich Verstärkersysteme aufbauen.
Analog zu diesem Beispiel lassen sich weitere, im Prinzip alle für einen Biocomputer erforderlichen Grundelemente realisieren.
MembrankompositJonen
Ein weiteres Anwendungsbeispiel stellen Membransysteme auf der Basis von Biomembranen aber auch künstlichen Lipid- oder Feststoffmembranen dar. In diese können sowohl HP- als auch NP-Makromoleküle der verschiedensten Funktionen eingebracht werden (Fig. 5) . Analog zum Bau von logischen Elementen, können auf diesem Weg sehr rasch schaltbare Sensorsystem (umschalten von einem Sensor auf den anderen, Transportsysteme (Transport der Substanzen Ai) oder auch Kombinationen aus Ionensystemen mit Sensor oder Transportsystemen aufgebaut werden. In diesem Zusammenhang ist vor allem die chemisch, e- lektrisch, optisch oder auch viral induzierte Fusion lebender Zellen eine Möglichkeit der Mischung beider Komponenten (HP und NP) . Hierfür sind Pärchen, Triplets oder höhere Fusionsprodukte aus HP- und NP-Zellen möglich. Über das Verhältnis der Fusionspartner (HP zu NP) lassen sich Mischungsverhältnisse erzeugen. Auch wenn derartige Fusionsprodukte wahrscheinlich nicht langzeitstabil und lebensfähig sind, eignen sie sich doch für die Biosynthese und die zellfrei Biotechnologie. Energiequellen
Nachteilig an biologischen Energiequellen ist der stets bei physiologischer Temperatur ablaufende Stoffwechsel. Insbesondere energiereiche Moleküle werden daher abgebaut oder in der Konzentration reduziert bzw. reagieren unerwünscht mit anderen Komponenten. Da man Biobatterien in einem breiten physiologischen Temperaturbereich benutzen möchte, wäre es hilfreich, bei Nichtnutzung der Energie, die Reaktionen zu stoppen. Zudem sollten die üblichen Lade- und Pflegeprozesse abgekoppelt werden können. Dies ist über die Verwendung von zyklischen HP/MP/NP-Reaktionselementen möglich. Nur wenn das System in einem dieser Modi oder einem permanenten Wechsel zwischen HP und NP oder auch MP betrieben wird, kann Energie entnommen werden. In Figur 6 ist ein Beispiel einer auf solchen Komponenten beruhenden regenerierbaren Biobatterie formal gezeigt. Das System besteht aus drei Kompartimenten (I, II, III) , die durch jeweils eine Membran voneinander getrennt sind (gepunktete vertikale Linien) . In den Membranen befinden sich druckabhängige Transporter (T) , die eine Komponente (A) vom Kompartiment I nach II und zurück, sowie eine Komponente (B) von Kompartiment I in III und zurück befördern können. Im Zentralraum (Kompartiment I) findet eine chemische oder lichtgetriebene zyklische HP-Reaktion statt. Die Komponente (A) bzw. (B) wird in einen geladenen Zustand überführt oder anderweitig angeregt, so dass sie Energie abgeben können. Dieses Kompartiment wird von Zeit zu Zeit neu mit Reaktanten- gemischen befüllt (chemisches Laden der Batterie) . Nur bei HP werden die energiereichen oder geladenen Reaktanten von I nach II bzw. III durch die Membran transportiert. Nur bei NP können sie in der energieärmeren Form (A, B) zurück transportiert werden. Die Auskopplung der Energie erfolgt in Kompartiment II und III jeweils über eine Reaktion (K) die eine NP- Charakteristik zeigt. Die Ladungsübergabe erfolgt letztendlich wie bekannt auf Elektroden (El. 1 und 2), an denen die Potentialdifferenz abgegriffen werden kann. Alle HP- Reaktionen sind mit hellen Pfeilen, alle NP-Reaktionen mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. Im Einzelnen lassen sich die Folgenden Modi fahren: a) „Laden" = HP:
Nur die HP-Reaktionen laufen ab. Angeregtes A und angeregtes B werden im Kompartiment I gebildet und nach Komparti- ment II bzw. III transportiert. Dort kann jedoch keine Auskopplung der Energie erfolgen. Folglich werden A* und B* in II und III angereichert, was einem Ladevorgang entspricht . b) „Arbeitsbetrieb = MP oder zyklischer Wechsel zwischen HP und NP:
Wechselt man beständig zwischen HP und NP oder wählt man MP, einen Mitteldruck an dem alle Reaktionen mit ausreichender Effektivität ablaufen, dann liefert das System Strom, regeneriert sich dazu noch gleichzeitig. Die Regeneration und der Transport der Komponenten speist sich aus dem eingebrachten Potential der Ausgangskomponenten. Eine Zelle muss bekanntlich von Zeit zu Zeit spaltbare Grundkomponenten aufnehmen und Abbauprodukte heraus transportieren. Dies ist in analoger Weise auch hier der Fall und durch die senkrechten breiten schraffierten Pfeile veranschaulicht. In diesem Modus laufen alle Prozesse ab, die Dauer der Energiebereitstellung ist optimal. c) „Entladen" = NP :
Betreibt man das System im NP-Modus, kann einmal der in den Kompartimenten II und III angereicherte Energieanteil mit maximaler Effizienz ausgekoppelt und an die Elektroden gebracht werden. Die Reaktanten A und B werden auch zurück in das Kompartiment I transportiert. Alle anderen Vorgänge stehen jedoch. Dies entspricht einem einmaligen Entladen, allerdings mit besonders hoher Lastfähigkeit. Da die HP- Reaktanten A und B bei NP entladen werden, ist diese Reak- tion bei NP nicht optimal. Da ggf. im System Reaktionswärme frei wird, ist dies für das Entladen einer Batterie mit hoher Kapazität sogar günstig (innere Kurzschlussfestigkeit) .
Es sollte noch angemerkt werden, dass es sich nicht um das einfachste mögliche Batteriesystem handelt. So kann das System auch ohne Rücktransport zum einmaligen Nutzen der im Kom- partiment I eingebrachten Reaktanten aufgebaut werden. Des Weiteren genügen zwei Kompartimente, wenn man eine der Elektrodenreaktionen in Kompartiment I ablaufen lässt.
Dekontamination chemischer Synthesesysteme
In analoger Weise lassen sich Kontamination und Dekontamination durch Druckwechsel und durch das Stoppen der Reaktionsketten und erneute Anfahren verringern oder beseitigen.
Lichtkomplexe unter HP und NP
Als weiteres Anwendungsbeispiel sind druckabhängige lichtgetriebene Prozesse zu nennen.
Im NP-Bereich gibt es eine Vielzahl von Rezeptor- und Energieumwandlungssysteme, die NP-optimiert arbeiten. Bei HP ist dies nicht der Fall. Andererseits sind aus der Tiefsee chemo- lumineszente Reaktionen und Reaktionskomponenten bekannt, wozu auch HP-Rezeptorsysteme gehören. Auch hier lassen sich wieder in analoger Weise HP- und NP-Komponenten mischen oder räumlich getrennt anordnen, z.B. um schaltbare Sensoren und zyklische Energieeinkopplung zu ermöglichen. Ein Anwendungsfeld bilden auch die Reaktionen im Kompartiment I der Biobatterien (Fig. 6) .

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Steuerung einer chemischen Reaktion mittels Druck unter Verwendung von hochdruck-optimierten Biokomponenten, wobei eine Kombination von hochdruckoptimierten und niederdruck-optimierten Biokomponenten, welche nebeneinander oder räumlich getrennt voneinander vorliegen können, verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hochdruck-optimierten Biokomponenten ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von 11 bis 200, insbesondere 30 bis 200 MPa, und die niederdruckoptimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 10 MPa aufweisen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Biokomponenten aus der Gruppe aus biologischen Makromolekülen, Molekülaggregaten, Organellen, Zellen oder Zelllysaten ausgewählt sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Biokomponenten biologische Katalysatoren, insbesondere Enzyme und Coenzyme, Membrankomponenten, Proteine oder Zucker umfassen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die hochdruck-optimierten Biokomponenten von einem Tiefseeorganismus oder einer daraus erhaltenen Zellkultur stammen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chemischen Reaktion um eine enzymatische Reaktion, z.B. eine PCR-Reaktion oder eine andere Reaktion zur Vervielfältigung oder Manipulation von Nukleinsäure, handelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion durch eine Druckänderung eingestellt werden kann.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Reaktion durch eine Druckänderung an- oder abgeschaltet werden kann.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, das die Abschaltung zur Entnahme von Reaktionsprodukten oder Entnahme/Zufuhr von Reaktionspartnern genutzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass periodische Druckänderungen vorgenommen werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass Druckänderungen vorgenommen werden, die bestimmten vorgegebenen Funktionen, z.B. Funktionen mit sinusförmigen, rampenförmigen, rechteckigen oder trapezförmigen Verläufen, folgen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere definierte verschiedene Druckzustände realisiert werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Druckzustände einen mittleren Druck, vorzugsweise in einem Bereich von 11 bis 30 MPa, umfasst und zusätzlich für diesen mittleren Druck optimierte Biokomponenten verwendet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine Temperatursteuerung erfolgt.
15. Zusammensetzung von Komponenten, insbesondere zur Durchführung mindestens einer chemischen Reaktion, die eine Kombination von hochdruck-optimierten und nieder- druck-optimierten Biokomponenten, welche nebeneinander oder räumlich getrennt voneinander vorliegen können, umfasst .
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die hochdruck-optimierten Biokomponenten ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von 11 bis 200, insbesondere 30 bis 200 MPa, und die nieder- druck-optimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 10 MPa aufweisen.
17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Biokomponenten aus der Gruppe aus biologischen Makromolekülen, Molekülaggregaten, Organellen, Zellen oder Zelllysaten ausgewählt sind.
18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15-17, dadurch gekennzeichnet, dass die Biokomponenten biologische Katalysatoren, insbesondere Enzyme und Coenzyme, Membrankomponenten, Proteine oder Zucker umfassen.
19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15-18, dadurch gekennzeichnet, dass die hochdruck-optimierten Biokompo- nenten von einem Tiefseeorganismus oder einer daraus erhaltenen Zellkultur stammen.
20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15-19, dadurch gekennzeichnet, dass sie vollständige oder partielle Fusionen von hochdruck-optimierten und niederdruckoptimierten Zellen enthält.
21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15-20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chemischen Reaktion um eine enzymatische Reaktion, z.B. eine PCR-Reaktion oder eine andere Reaktion zur Vervielfältigung oder Manipulation von Nukleinsäure, handelt.
22. Verwendung einer Kombination von hochdruck-optimierten und niederdruck-optimierten Biokomponenten zur Steuerung einer chemischen Reaktion mittels Druck.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die hochdruck-optimierten Biokomponenten ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich von 50 bis 200 MPa und die niederdruck-optimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 10 MPa aufweisen.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-14 oder der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15-21 zur Herstellung und/oder zum Betrieb eines durch Druck steuerbaren Systems.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, das es sich bei den durch Druck steuerbaren System um ein System zur Speicherung und Verarbeitung von Informationen, ein Transportsystem, ein System zur Erzeugung, Speicherung oder Umwandlung von Energie, ein Membransystem, einen Sensor, oder einen Schalter handelt.
26. System, welches eine Kombination von hochdruckoptimierten und niederdruck-optimierten Biokomponenten enthält, mit mehreren einstellbaren Druckzuständen, wobei die verschiedenen Druckzustände jeweils einen weiteren Parameter des Systems bestimmen.
27. System nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die hochdruck-optimierten Biokomponenten ein funktionelles Optimum bei einem Druck im Bereich . von 30 bis 200 MPa und die niederdruck-optimierten Biokomponenten ein Optimum bei einem Druck im Bereich von 0,1 bis 10 MPa aufweisen.
28. System nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Systemparameter eine bestimmte Ladung, Konformation, einen bestimmten Informations- oder Energiezustand etc. von Systemkomponenten umfasst oder repräsentiert.
29. System nach einem der Ansprüche 26-28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein System zur Speicherung und Verarbeitung von Informationen, ein Transportsystem, ein System zur Erzeugung, Speicherung oder Umwandlung von Energie, ein Membransystem, einen Sensor, oder einen Schalter handelt.
30. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-14, umfassend eine Synthesekammer (1) ein Druckerzeugungssystem (2), mindestens einen Zufluss (3), und mindestens einen Abfluss (4).
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, welche ferner noch
Sensoren (5) , und eine Einrichtung (6) zur Erfassung und Verarbeitung der von den Sensoren erhaltenen Daten umfasst.
32. Vorrichtung nach Anspruch 30 oder 31, wobei die Synthesekammer zwei verstellbare Wände (11,13) umfasst, deren Abstand mit einem Abstandssystem (12) regelbar ist, und das Druckerzeugungssystem (2) zwei Verstellelemente (24, 25) , die an einem Spannungsgenerator (211) angeschlossen sind, sowie einen stabilen Rahmen (212) als Gegenlager umfasst .
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30-32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Verstellelementen um Piezoelemente handelt.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30-33, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Wand der Synthesekammer transparent ist.
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30-34, dadurch gekennzeichnet, dass die verstellbaren Wände die untere und die obere Begrenzung der Synthesekammer bilden und der maximale Abstand der verstellbaren Wände geringer ist als die Länge und Breite der verstellbaren Wände.
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