SUBSTITUIERTE 3- (1 , 2 , 4-OXADIAZOL-5-YL) -5-PHENYL-PIPERIDINE
Die Erfindung betrifft neue substituierte Piperidine, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und von Tumorerkrankungen.
Thrombozyten (Blutplättchen) sind ein wesentlicher Faktor sowohl in der physiologischen Blutstillung (Hämostase) als auch bei thromboembolischen Erkrankungen. Insbesondere im arteriellen System kommt Thrombozyten eine zentrale Bedeutung in der komplexen Interaktion zwischen Blutkomponenten und Gefäßwand zu. Unerwünschte Thrombozytenaktivierung kann durch Bildung plättchenreicher Thromben zu thromboembolischen Erkrankungen und thrombotischen Komplikationen mit lebensbedrohlichen Zuständen führen.
Einer der potentesten Plättchenaktivatoren ist die Blutgerinnungsprotease Thrombin, die an verletzten Blutgefäß wänden gebildet wird und neben der Fibrinbildung zur Aktivierung von Thrombozyten, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen führt (Vu TKH, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR, Cell 1991, 64, 1057-1068). An Thrombozyten in vitro und in Tiermodellen hemmen Thrombin-Inhibitoren die Plättchenaggregation bzw. die Bildung plättchenreicher Thromben. Beim Menschen können arterielle Thrombosen erfolgreich mit Inhibitoren der Thrombozytenfunktion sowie Thrombin-Inhibitoren verhindert oder behandelt werden (Bhatt DL, Topol EJ3 Nat. Rev. Drug Discov. 2003, 2, 15-28). Deshalb besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Antagonisten der Thrombinwirkung auf Blutplättchen die Bildung von Thromben und das Auftreten von klinischen Folgen wie Herzinfarkt und Schlaganfall vermindern. Weitere zelluläre Thrombinwirkungen, z.B. auf Gefäßendothel- und -glattmuskelzellen, Leukozyten und Fibroblasten, sind möglicherweise für entzündliche und proliferative Erkrankungen verantwortlich.
Die zellulären Effekte von Thrombin werden zumindest teilweise über eine Familie G-Protein- gekoppelter Rezeptoren (Protease Activated Receptors, PARs) vermittelt, deren Prototyp der PAR- 1 -Rezeptor darstellt. PAR-I wird durch Bindung von Thrombin und proteolytische Spaltung seines extrazellulär liegenden N-Terminus aktiviert. Durch die Proteolyse wird ein neuer N-Terminus mit der Aminosäurensequenz SFLLRN... freigelegt, der als Agonist („Tethered Ligand") zur intramolekularen Rezeptoraktivierung und Übertragung intrazellulärer Signale führt. Von der Tethered- Ligand Sequenz abgeleitete Peptide können als Agonisten des Rezeptors eingesetzt werden und führen auf Thrombozyten zur Aktivierung und Aggregation. Andere Proteasen sind ebenfalls in der Lage, PAR-I zu aktivieren, hierunter z.B. Plasmin, Faktor VIIa, Faktor Xa, Trypsin, aktiviertes Protein C (aPC), Tryptase, Cathepsin G, Proteinase 3, Granzyme A, Elastase und Matrixmetalloprotease 1 (MMP-I).
Im Gegensatz zur Inhibition der Proteaseaktivität von Thrombin mit direkten Thrombin-Inhibitoren sollte eine Blockade des PAR-I zur Hemmung der Thrombozytenaktivierung ohne Verminderung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes (Antikoagulation) führen.
Antikörper und andere selektive PAR-I -Antagonisten hemmen die Thrombin-induzierte Aggregation von Thrombozyten in vitro bei niedrigen bis mittleren Thrombinkonzentrationen
(Kahn ML, Nakanishi-Matsui M, Shapiro MJ, Ishihara H, Coughlin SR, J. Clin. Invest. 1999, 103,
879-887). Ein weiterer Thrombinrezeptor mit möglicher Bedeutung für die Pathophysiologie thrombotischer Prozesse, PAR-4, wurde auf humanen und tierischen Thrombozyten identifiziert. In experimentellen Thrombosen an Tieren mit einem dem Menschen vergleichbaren PAR- Expressionsmuster reduzieren PAR-I -Antagonisten die Bildung plättchenreicher Thromben
(Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang H-C,
Maryanoff BE, Andrade-Gordon P, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304, 855-861).
In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Substanzen auf ihre plättchenfunktionshemmende Wirkung geprüft, in der Praxis haben sich aber nur wenige Plättchenfunktionshemmer bewährt. Es besteht daher ein Bedarf an Pharmazeutika, die spezifisch eine gesteigerte Plättchenreaktion hemmen ohne das Blutungsrisiko erheblich zu erhöhen und damit das Risiko von thrombo- embolischen Komplikationen vermindern.
Effekte von Thrombin, die über den Rezeptor PAR-I vermittelt werden, haben Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf während und nach operativer koronarer Bypassanlage (CABG) sowie anderer Operationen und insbesondere Operationen mit extrakorporalem Kreislauf (z. B. Herz- Lungenmaschine). Im Verlauf der Operation kann es aufgrund der prä- oder intraoperativen Medikation mit gerinnungshemmenden und/oder plättchenhemmenden Substanzen zu Blutungskomplikationen kommen. Aus diesem Grunde muss beispielsweise eine Medikation mit Clopidogrel mehrere Tage vor einer CABG pausiert werden. Außerdem kann es wie erwähnt (z.B. aufgrund des ausgedehnten Kontaktes zwischen Blut und künstlichen Oberflächen bei Einsatz einer extrakorporalen Zirkulation oder bei Bluttransfusionen) zur Ausbildung einer disseminierten intravaskulären Gerinnung oder Verbrauchskoagulopathie (DIC) kommen, die sekundär zu Blutungskomplikationen führen kann. Im weiteren Verlauf kommt es häufig zur Restenose der angelegten venösen oder arteriellen Bypässe (bis hin zum Verschluß) aufgrund von Thrombose, Intimafibrose, Arteriosklerose, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, Arrhythmien, transitorische ischämische Attacke (TIA) und/oder Schlaganfall.
Der Rezeptor PAR-I wird im Menschen auch auf anderen Zellen exprimiert, hierunter z.B. Endothelzellen, glatte Gefäßmuskelzellen und Tumorzellen. Bösartige Tumorerkrankungen (Krebs) haben eine hohe Inzidenz und sind im Allgemeinen mit einer hohen Sterblichkeit
verbunden. Gegenwärtige Therapien erreichen nur in einem Bruchteil der Patienten eine Vollremission und sind typischerweise mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Daher besteht ein hoher Bedarf an effektiveren und sichereren Therapien. Der PAR-I -Rezeptor trägt zur Entstehung, dem Wachstum, der Invasivität und der Metastasierung von Krebs bei. Außerdem vermittelt auf Endothelzellen exprimiertes PAR-I Signale, die in Gefäßwachstum münden („Angiogenese"), ein Vorgang, der zur Ermöglichung von Tumorwachstum über ca. 1 mm3 hinaus unerläßlich ist. Angiogenese trägt auch zur Enstehung oder Verschlimmerung anderer Erkrankungen bei, hierunter z.B. hämatopoetische Krebserkrankungen, die zur Erblindung führende Makuladegeneration und diabetische Retinopathie, entzündliche Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Colitis.
Sepsis (oder Septikämie) ist eine häufige Erkrankung mit hoher Letalität. Anfängliche Symptome der Sepsis sind typischerweise unspezifϊsch (z.B. Fieber, reduziertes Allgemeinbefinden), im weiteren Verlauf kann es jedoch zur generalisierten Aktivierung des Gerinnungssystems kommen ("Disseminated Intravascular coagulation" oder "Verbrauchskoagulopathie" (DIC)) mit Mikrothrombosierung in verschiedenen Organen und sekundärer Blutungskomplikationen. DIC kann auch unabhängig von einer Sepsis auftreten, z.B. im Rahmen von Operationen oder bei Tumorerkrankungen .
Die Therapie der Sepsis besteht einerseits in der konsequenten Beseitigung der infektiösen Ursache, z.B. durch operative Herdsanierung und Antibiose. Andererseits besteht sie in der temporären intensivmedizinischen Unterstützung der beeinträchtigten Organsysteme. Therapien der verschiedenen Stadien dieser Erkrankung sind z.B. in folgender Publikation beschrieben (Dellinger et al., Crit. Care Med. 2004, 32, 858-873). Für die DIC existieren keine erwiesenermaßen effektive Therapien.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue PAR-I -Antagonisten zur Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen und thromboembolischen Erkrankungen, sowie Tumorerkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
WO 2006/012226, WO 2006/020598, WO 2007/038138, WO 2007/130898, WO 2007/101270 und US 2006/0004049 beschreiben strukturell ähnliche Piperidine als 11-ß HSDl Inhibitoren zur Behandlung von unter anderem Diabetes, thromboembolischen Erkrankungen und Schlaganfall.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel
in welcher
R für Trifluormethyl, Trifluormethoxy oder Ethyl steht,
R2 für 2-Methoxyeth- 1 -yl, 2-Ethoxyeth- 1 -yl oder Cyclopropyl steht,
R für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze; die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
Sofern die erfϊndungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung sämtliche tautomere Formen.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan- sulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifiuor- essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kalium- salze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl- morpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin, N-Methylpiperidin und Cholin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Ver- bindungen. Der Begriff "Prodrugs" umfasst Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
In der Formel der Gruppe, die für R3 stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, neben der ein * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH2-Gruppe, sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem Atom, an das R3 gebunden ist.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 für Trifluormethyl oder Ethyl steht,
R2 für 2-Methoxyeth-l-yl oder Cyclopropyl steht,
R3 für eine Gruppe der Formel
steht, wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist, und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze. Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Trifluormethyl oder Ethyl steht, R2 für 2-Methoxyeth- 1 -yl steht, R3 für eine Gruppe der Formel
steht, wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist, und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze. Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Trifluormethoxy oder Ethyl steht, R2 für 2-Ethoxyeth-l-yl steht,
R für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 für Trifluormethyl, Trifluormethoxy oder Ethyl steht,
R2 für 2-Ethoxyeth- 1 -yl steht,
R3 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher der Phenyl-Substituent und der l,2,4-Oxadiazol-5-yl-Substituent, welche an den Piperidinring gebunden sind, in cis-Position zueinander stehen.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher das Kohlenstoffatom, an das der Phenyl-Substituent gebunden ist, eine S-Konfiguration hat und das Kohlenstoffatom, an das der l,2,4-Oxadiazol-5-yl-Substituent gebunden ist, ebenfalls eine S-Konfiguration hat.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Trifluormethyl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Ethyl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für 2-Methoxyeth-l-yl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für 2-Ethoxyeth-l-yl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R3 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R3 für eine Gruppe der Formel
steht,
wobei
* die Anknüpfstelle an die Carbonylgruppe ist.
Die in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt.
Ganz besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der oben genannten Vor- zugsbereiche.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei entweder
[A] Verbindungen der Formel
in welcher
R1 und R2 die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
mit Verbindungen der Formel
O
R3Λχ, (-.).
in welcher
R3 die oben angegebene Bedeutung aufweist, und
X1 für Halogen, bevorzugt Brom oder Chlor, oder Hydroxy steht,
umgesetzt werden
oder
[B] Verbindungen der Formel (II) in der ersten Stufe mit 4-Nitrophenylchloroformat und in der zweiten Stufe mit Verbindungen der Formel
R3— H (IV),
in welcher
R3 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
umgesetzt werden
oder
[C] Verbindungen der Formel
in welcher
R1 und R3 die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
mit Verbindungen der Formel
HO.
N
(VI),
H2N'
in welcher
R2 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung nach Verfahren [A] erfolgt, wenn X1 für Halogen steht, im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -300C bis 500C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Pyridin, Dioxan oder Dimethylformamid, bevorzugt ist Methylenchlorid.
Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, bevor- zugt ist Triethylamin oder Diisopropylethylamin.
Die Umsetzung nach Verfahren [A] erfolgt, wenn X1 für Hydroxy steht, im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -300C bis 500C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder
Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.
Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. NN- Diethyl-, NN -Dipropyl-, NN'-Diisopropyl-, NN'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Di- methylaminoisopropyO-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'- propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimida- zol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert- Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxy- carbonyl-l,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol- 1 -yl)-NNN',N'-tetra-methyluronium- hexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo- 1 -(2H)-pyridyl)- 1 , 1 ,3 ,3 -tetramethyluroniumtetrafluoro- borat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-NNN',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1 -Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hy- drogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.
Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt.
Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
Die Umsetzung der ersten Stufe nach Verfahren [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 500C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan, bevorzugt ist Methylenchlorid.
Basen sind beispielsweise organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methyl- morpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Triethylamin.
Die Umsetzung der zweiten Stufe nach Verfahren [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, gegebenenfalls in einer Mikrowelle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 500C bis 2000C bei Normaldruck bis 5 bar.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder N- Methylpyrrolidon, bevorzugt ist Dimethylformamid.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, bevorzugt ist Kaliumcarbonat.
Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
Die Umsetzung nach Verfahren [C] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Tri- chlormethan oder 1,2-Dichlorethan, Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, oder andere Lösemittel wie Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, 2-Butanon oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Bevorzugt ist Dimethylformamid oder ein Gemisch aus Dioxan und Dimethylformamid.
Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N1N'- Diethyl-, NN'-Dipropyl-, NN'-Diisopropyl-, NN'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylamino- isopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'- propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimida- zol, oder 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-
Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxy- carbonyl-l,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol- 1 -yl)-NN,N',N'-tetra-methyluronium- hexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l -(2H)-pyridyl)- 1 , 1 ,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoro- borat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-NN,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder Benzotriazol-l-yloxy-tris(pyrrolidino)-
phosphonium-Hexafluorophosphat (PYBOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hy- drogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Diisopro- pylethylamin.
Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU in Gegenwart von Diisopropylethylamin oder als Alternative nur mit Carbonyldiimidazol durchgeführt.
Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder und können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R1 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
in der ersten Stufe mit Verbindungen der Formel (VI) und in der zweiten Stufe mit einer Säure umgesetzt werden.
Die Umsetzung der ersten Stufe erfolgt wie für Verfahren [C] beschrieben.
Die Umsetzung der zweiten Stufe erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 600C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1 ,2-Dichlorethan, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, bevorzugt ist Methylenchlorid.
Basen sind beispielsweise Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff in Dioxan, bevorzugt ist Trifluoressigsäure.
Die Verbindungen der Formel (VIT) sind bekannt oder und können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R1 die oben angegebene Bedeutung aufweist, und
R4 für Methyl oder Ethyl steht,
in der ersten Stufe mit Di-tert-butyldicarboxylat und
in der zweiten Stufe mit einer Base umgesetzt werden.
Die Umsetzung der ersten Stufe erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 50°C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1 ,2-Dichlorethan, bevorzugt ist Methylenchlorid.
Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, bevor- zugt ist Triethylamin oder Diisopropylethylamin.
Die Umsetzung der zweiten Stufe erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan, Ether wie Diethylether, Methyl-tert- butylether, 1 ,2-Dimethoxyethan, Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Acetonitril oder Pyridin, oder Gemische von Lösungsmitteln, oder Gemische von Lösungsmittel mit Wasser, bevorzugt ist ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser.
Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, bevorzugt ist Lithiumhydroxid.
Die Verbindungen der Formel (VTH) sind bekannt oder und können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R1 und R4 die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
hydriert werden.
Die Hydrierung erfolgt im Allgemeinen mit einem Reduktionsmittel in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls unter Zusatz von Säure wie Mineralsäuren und Carbonsäuren, bevorzugt Essigsäure, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel und in einem Druckbereich von Normaldruck bis 100 bar, bevorzugt bei 50-80 bar.
Als Reduktionsmittel ist bevorzugt Wasserstoff mit Palladium auf Aktivkohle, mit Rhodium auf Aktivkohle, mit Ruthenium auf Aktivkohle oder daraus gemischte Katalysatorn, oder Wasserstoff mit Palladium auf Aluminiumoxid oder mit Rhodium auf Aluminiumoxid, bevorzugt ist Wasserstoff mit Palladium auf Aktivkohle oder mit Rhodium auf Aktivkohle.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso- Propanol, n-Butanol oder tert-Butanol, bevorzugt ist Methanol oder Ethanol.
Die Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder und können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R4 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R1 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines Zusatzreagenzes, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss des Lösungsmittels bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2- Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder andere Lösungsmittel wie Nitrobenzol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder N- Methylpyrrolidon, gegebenenfalls wird diesen Lösungsmitteln etwas Wasser zugesetzt. Bevorzugt ist Toluol mit Wasser oder eine Mischung aus 1 ,2-Dimethoxyethan, Dimethylformamid und Wasser.
Katalysatoren sind beispielsweise für Suzuki-Reaktionsbedingungen übliche Palladium- Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z.B. Dichlorbis(triphenylphosphin)-palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(O), Palladium(II)acetat oder Bis-(diphenylphosphan- ferrocenyl)-palladium-(II)-chlorid.
Zusatzreagenzien sind beispielsweise Kaliumacetat, Cäsium-, Kalium- oder Natriumcarbonat, Bariumhydroxid, Kalium-tert-butylat, Cäsiumfluorid, Kaliumfluorid oder Kaliumphosphat, bevorzugt sind Kaliumfluorid oder Natriumcarbonat.
Die Verbindungen der Formeln (X) und (XI) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder und können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R1 und R3 die oben angegebene Bedeutung aufweisen, und
R4 für Methyl oder Ethyl steht,
mit einer Base umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1 ,2-Dichlorethan, Ether wie Diethylether, Methyl-tert- butylether, 1 ,2-Dimethoxyethan, Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Acetonitril oder Pyridin, oder Gemische von Lösungsmitteln, oder Gemische von Lösungsmittel mit Wasser, bevorzugt ist ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser.
Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, bevorzugt ist Lithiumhydroxid.
Die Verbindungen der Formel (XII) sind bekannt oder und können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel (VIII) mit Verbindungen der Formel (EI) umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt wie für Verfahren [A] beschrieben.
In einem alternativen Verfahren können die Verbindungen der Formel (XII) hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel (VJB) in der ersten Stufe mit 4-Nitrophenylchloroformat und in der zweiten Stufe mit Verbindungen der Formel (FV) umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt wie für Verfahren [B] beschrieben.
Die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) kann durch folgendes Syntheseschema verdeutlicht werden.
Schema:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches und pharmakokinetisches Wirkspektrum. Es handelt sich dabei um selektive Antagonisten des PAR-I -Rezeptors, die insbesondere als Thrombozytenaggregationshemmer, als Hemmer der Endothelproliferation und als Hemmer des Tumorwachstums wirken.
Sie eigenen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbin- düngen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von thromboembo- lischen Erkrankungen und/oder thromboembolischen Komplikationen.
Zu den „thromboembolischen Erkrankungen" im Sinne der vorliegenden Erfindung zählen insbesondere Erkrankungen wie Herzinfarkt mit ST-Segment-Erhöhung (STEMI) und ohne ST- Segment-Erhöhung (non-STEMI), stabile Angina Pectoris, instabile Angina Pectoris, Reokklusio- nen und Restenosen nach Koronarinterventionen wie Angioplastie, Stentimplantation oder aortokoronarem Bypass, periphere arterielle Verschlusskrankheiten, Lungenembolien, tiefe venöse Thrombosen und Nierenvenenthrombosen, transitorische ischämische Attacken sowie thrombotischer und thromboembolischer Hirnschlag.
Die Substanzen eignen sich daher auch zur Prävention und Behandlung von kardiogenen Thrombo- embolien, wie beispielsweise Hirn-Ischämien, Schlaganfall (Stroke) und systemischen Thromboembolien und Ischämien, bei Patienten mit akuten, intermittierenden oder persistierenden Herzarrhythmien, wie beispielsweise Vorhofflimmern, und solchen, die sich einer Kardioversion unterziehen, ferner bei Patienten mit Herzklappen-Erkrankungen oder mit intravasalen Körpern, wie z. B. künstlichen Herzklappen, Kathetern, intraaortale Ballongegenpulsation und Schrittmachersonden.
Thromboembolische Komplikationen treten ferner auf bei mikroangiopathischen hämolytischen Anämien, extrakorporalen Blutkreisläufen, wie z. B. Hämodialyse, Hämofiltration, ventricular assist devices und Kunstherz, sowie Herzklappenprothesen.
Außerdem kommen die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Beeinflussung der Wundheilung, für die Prophylaxe und/oder Behandlung von atherosklerotischen Gefäßerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen wie rheumatische Erkrankungen des Bewegungsapparats, koronaren Herzkrankheiten, von Herzinsuffizienz, von Bluthochdruck, von entzündlichen Erkrankungen, wie z.B. Asthma, COPD, entzündlichen Lungenerkrankungen, Glomerulonephritis und entzündlichen Darmerkrankungen in Betracht, darüber hinaus ebenso für die Prophylaxe und/oder Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung, Autoimmunerkrankungen, Morbus Crohn und Kolitis Ulzerosa.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Inhibition des Tumorwachstums und der Metastasenbildung, bei Mikroangiopathien, altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Retinopathie, diabetischer Nephropathie und anderen mikrovaskulären Erkrankungen sowie zur Prävention und Behandlung thromboembolischer Komplikationen, wie beispielsweise venöser Thromboembolien, bei Tumorpatienten, insbesondere solchen, die sich größeren chirurgischen Eingriffen oder einer Chemo- oder Radiotherapie unterziehen, eingesetzt werden.
Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Krebs. Krebserkrankungen schließen unter anderem ein: Karzinome (hierunter Brustkrebs, hepatozelluläre karzinome, Lunkenkrebs, kolorektaler Krebs, Kolonkrebs und Melanome), Lympohome (z.B. Non-
Hodgkin-Lymphome und Mykosis fiingoides), Leukämien, Sarkome, Mesotheliome, Hirnkrebs (z.B. Gliome), Germinome (z.B. Hodenkrebs und Ovarialkrebs), Choriokarzinome, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Endometrieum-Krebs, Zervix-Krebs, Blasenkrebs, Magenkrebs und multiples Myelom.
Außerdem vermittelt auf Endothelzellen exprimiertes PAR-I Signale, die in Gefäßwachstum münden („Angiogenese"), ein Vorgang, der zur Ermöglichung von Tumorwachstum über ca. 1 mm3 hinaus unerläßlich ist. Induktion der Angiogenese ist auch bei anderen Erkrankungen relevant, hierunter Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises (z.B. rheumatoide Arthritis), bei Lungenerkrankungen (z.B. Lungenfibrose, pulmonale Hypertonie, insbesondere pulmonalarterielle Hypertonie, Erkrankungen, die durch Lungengefäßverschlüsse charakterisiert sind), Arteriosklerose, Plaqueruptur, diabetische Retinopathie und feuchte Makuladegeneration.
Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Sepsis geeignet. Sepsis (oder Septikämie) ist eine häufige Erkrankung mit hoher Letalität. Anfängliche Symptome der Sepsis sind typischerweise unspezifisch (z.B. Fieber, reduziertes Allgemeinbefinden), im weiteren Verlauf kann es jedoch zur generalisierten Aktivierung des Gerinnungssystems kommen ("Disseminated Intravascular coagulation", oder "Verbrauchskoagulopathie", nachfolgend als "DIC" bezeichnet) mit Mikrothrombosierung in verschiedenen Organen und sekundärer Blutungskomplikationen. Außerdem kann es zur endothelialen Schädigung mit Erhöhung der Gefäßpermeabilität und Austritt von Flüssigkeit und Proteinen in den Extravasalraum kommen. Im weiteren Verlauf kann es zur Dysfunktion oder dem Versagen eines Organs (z.B. Nierenversagen, Leberversagen, Atemversagen, zentralnervöse Defizite und Herz-/Kreislaufversagen) bis hin zum Multiorganversagen kommen. Hiervon kann prinzipiell jedes Organ betroffen sein, am häufigsten tritt Organdysfunktion und -Versagen bei der Lunge, der Niere, dem Herz-Kreislaufsystem, dem Gerinnungssystem, dem zentralnervösen System, endokrinen Drüsen und der Leber auf. Eine Sepsis kann mit einem „Acute Respiratory Distress Syndrome" (nachfolgend als ARDS bezeichnet) einhergehen. Ein ARDS kann auch unabhängig von einer Sepsis auftreten. "Septischer Schock" bezeichnet das Auftreten einer behandlungspflichtigen Blutdruckerniedrigung, die eine weitere Organschädigung begünstigt und mit einer Verschlechterung der Prognose einhergeht.
Krankheitserreger können Bakterien (gram-negativ und gram-positiv), Pilze, Viren und/oder Eukaryonten sein. Eintrittspforte bzw. Primärinfektion können z.B. Pneumonie, Harnwegsinfekt, Peritonitis sein. Die Infektion kann, muß aber nicht zwingend, mit einer Bakteriämie einhergehen.
Sepsis wird definiert als das Vorliegen einer Infektion und eines "systemic inflammatory response Syndrome" (nachfolgend mit "SIRS" bezeichnet). SIRS tritt im Rahmen von Infekten, aber auch von anderen Zuständen wie Verletzungen, Verbrennungen, Schock, Operationen, Ischämie,
Pankreatitis, Reanimation oder Tumoren auf. Nach der Definition des ACCP/SCCM Consensus Conference Committee von 1992 (Crit. Care Med. 1992, 20, 864-874) werden die zur Diagnose "SIRS" erforderlichen Symptome zur Diagnose und Meßparameter beschrieben (u.a. veränderte Körpertemperatur, erhöhte Herzfrequenz, Atemschwierigkeiten und verändertes Blutbild). In der späteren (2001) SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference wurden die Kriterien im Wesentlichen beibehalten, in Details jedoch verfeinert (Levy et al., Crit. Care Med. 2003, 31, 1250-1256).
DIC und SIRS können im Rahmen einer Sepsis, aber auch infolge von Operationen, Tumorerkrankungen, Verbrennungen oder anderen Verletzungen auftreten. Bei der DIC kommt es an der Oberfläche von geschädigten Endothelzellen, Fremdkörperoberflächen oder verletztem extravaskulärem Gewebe zur massiven Aktivierung des Gerinnungssystems. Als Folge kommt es zur Gerinnung in kleinen Gefäßen verschiedener Organe mit Hypoxie und anschließender Organdysfunktion. Sekundär kommt es zum Verbrauch von Gerinnungsfaktoren (z.B. Faktor X, Prothrombin, Fibrinogen) und Plättchen, wodurch die Gerinnungsfähigkeit des Blutes herabgesetzt wird und schwere Blutungen auftreten können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können darüber hinaus auch zur Verhinderung von Koagulation ex vivo eingesetzt werden, z.B. zur Konservierung von Blut- und Plasmaprodukten, zur Reinigung/Vorbehandlung von Kathetern und anderen medizinischen Hilfsmitteln und Geräten, einschließlich extrakorporaler Kreisläufe, zur Beschichtung künstlicher Oberflächen von in vivo oder ex vivo eingesetzten medizinischen Hilfsmitteln und Geräten oder bei biologischen Proben, die Blutplättchen enthalten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Beschichtung von medizinischen Instrumenten und Implantaten, z.B. Kathetern, Prothesen, Stents oder künstlichen Herzklappen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dabei fest an die Oberfläche gebunden sein oder über einen bestimmten Zeitraum aus einer Trägerbeschichtung in die unmittelbare Umgebung zur lokalen Wirkung freigesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend eine erfindungs- gemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:
Kalziumkanalblocker, z.B. Amlodipin Besilat (z.B. Norvasc®), Felodipin, Diltiazem, Verapamil, Nifedipin, Nicardipin, Nisoldipin und Bepridil;
Iomerizin;
Statine, z.B. Atorvastatin, Fluvastatin, Lovastatin, Pitavastatin, Pravastatin, Rosuvastatin, und Simvastatin;
Cholesterinabsoφtion-Inhibitoren, z.B. Ezetimibe und AZD4121;
Cholesteryl Ester Transfer Protein ("CETP") Inhibitoren, z.B. Torcetrapib;
Niedrigmolekualre Heparine, z.B. Dalteparin Natrium, Ardeparin, Certoparin, Enoxaparin, Parnaparin, Tinzaparin, Reviparin und Nadroparin;
Weitere Antikoagulanzien, z.B. Warfarin, Marcumar, Fondaparinux;
Antiarrhythmika, z.B. Dofetilid, Ibutilid, Metoprolol, Metoprololtartrat, Propranolol, Atenolol, Ajmalin, Disopyramid, Prajmalin, Procainamid, Quinidin, Spartein, Aprindine, Lidocain, Mexiletin, Tocamid, Encamid, Flecamid, Lorcamid, Moricizin, Propafenon, Acebutolol, Pindolol, Amiodaron, Bretylium-Tosylat, Bunaftin, Sotalol, Adenosin, Atropin und Digoxin;
Alpha-adrenerge Agonisten, z.B. Doxazosin-Mesylat, Terazoson und Prazosin;
Beta-adrenerge Blocker, z.B. Carvedilol, Propranolol, Timolol, Nadolol, Atenolol, Metoprolol, Bisoprolol, Nebivolol, Betaxolol, Acebutolol und Bisoprolol;
Aldosteron-Antagonisten, z.B. Eplerenon und Spironolacton;
Angiotensin-converting-enzyme Inhbitoren ("ACE-Inhibitoren"), z.B. Moexipril, Quinapril- Hydrochlorid, Ramipril, Lisinopril, Benazepril-Hydrochlorid, Enalapril, Captopril, Spirapril, Perindopril, Fosinopril und Trandolapril,;
Angiotensin II Receptorblockers ("ARBs"), z.B. Olmesartan-Medoxomil, Candesartan, Valsartan, Telmisartan, Irbesartan, Losartan und Eprosartan,;
Endothelinantagonisten, z.B. Tezosentan, Bosentan und Sitaxsentan-Natrium;
Neutral Endopeptidaseinhibitoren, z.B. Candoxatril und Ecadotril;
Phosphodiesteraseinhibitoren, z.B. Milrinoon, Theophyllin, Vinpocetin, EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)adenine), Sildenafil, Vardenafil und Tadalafil;
Fibrinolytika, z.B. Reteplase, Alteplase und Tenecteplase;
GP πb/IHa- Antagonisten, z.B. Integrillin, Abciximab und Tirofiban;
Direkte Thrombininhibitoren, z.B. AZD0837, Argatroban, Bivalirudin und Dabigatran;
Indirekte Thrombininhibitoren, z.B. Odiparcil;
Direkte und indirekte Faktor Xa Inhibitoren, z.B. Fondaparinux-Natrium, Apixaban, Razaxaban, Rivaroxaban (BAY 59-7939), KFA-1982, DX-9065a, AVE3247, Otamixaban (XRP0673), AVE6324, SAR377142, Idraparinux, SSR126517, DB-772d, DT-831J, YM- 150, 813893, LY517717 und DU-1766.;
Direkte und indirekte Faktor Xa/IIa Inhibitoren, z.B. Enoxaparin-Natrium, AVE5026, SSR128428, SSRl 28429 und BIBT-986 (Tanogitran);
Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 ("LpPLA2") Modulatoren;
Diuretika, z.B. Chlorthalidon, Ethacrynsäure, Furosemid, Amilorid, Chlorothiazid, Hydrochlorothiazid, Methylchtothiazid und Benzthiazid;
Nitrate, z.B. Isosorbide-5-Mononitrat;
Thromboxan- Antagonisten, z.B. Seratrodast, Picotamid und Ramatroban;
Plättchenaggregations-Inhibitoren, z.B. Clopidogrel, Tiklopidin, Cilostazol, Aspirin, Abciximab, Limaprost, Eptifibatide und CT-50547;
Cyklooxygenase-Inhibitoren, z.B. Meloxicam, Rofecoxib und Celecoxib;
B-Typ Natriuretic Peptide, z.B. Nesiritid und Ularitide;
NVIFGF-Modulatoren, z.B. XRP0038;
HTlB/5-HT2A-Antagonisten, z.B. SL65.0472;
Guanylatcyclase-Aktivatoren, z.B. Ataciguat (HMRl 766), HMRl 069, Riociguat und Cinaciguat;
e-NOS Transkriptions-Enhancers, z.B. AVE9488 and AVE3085;
Anti-atherogene Substanzen, z.B. AGI-1067:
CPU-Inhibitoren, z.B. AZD9684;
Renininhibitoren, z.B. Aliskirin und VNP489;
Inhibitoren der Adenosindiphosphat-induzierten Plättchenaggregation, z.B. Clopidogrel, Tiklopidin, Prasugrel, AZD6140, Ticagrelor und Elinogrel;
NHE-I Inhibitoren, z.B. AVE4454 und AVE4890.
Antibiotische Therapie: Verschiedene Antibiotika oder antifungale Medikamenten-Kombinationen kommen in Frage, entweder als kalkulierte Therapie (vor Vorliegen des mikrobiellen Befundes) oder als spezifische Therapie; Flüssigkeitstherapie, z.B. Kristalloide oder kolloidale Flüssigkeiten; Vasopressoren, z.B. Norepinephrine, Dopamine oder Vasopressin; Inotrope Therapie, z.B. Dobutamin; Kortikosteroide, z.B. Hydrokortison, oder Fludrokortison; rekombinantes humanes aktivierte Protein C, Xigris; Blutprodukte, z.B. Erythrozytenkonzentrate, Thrombozyten- konzentrate, Erythropietin oder Fresh Frozen Plasma; Maschinelle Beatmung bei sepsisinduziertem Acute Lung Injury (ALI) bzw. Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), z.B. Permissive Hyperkapnie, niedrigere Tidalvolumina; Sedierung: z.B. Diazepam, Lorazepam, Midazolam oder Propofol. Opioide: z.B. Fentanyl, Hydromorphon, Morphin, Meperidin oder Remifentanil. NSAIDs: z.B. Ketorolac, Ibuprofen oder Acetaminophen. Neuromuskuläre Blockade: z.B. Pancuronium; Glukose-Kontrolle, z.B. Insulin, Glukose; Nierenersatzverfahren, z.B. kontinuierliche veno-venöse-Hämofiltration oder intermittierende Hämodialyse. Dopamin niedrig-dosiert zur renalen Protektion; Antikoagulantien, z.B. zur Thromboseprophylaxe oder bei Nierenersatzverfahren, z.B. unfraktionierte Heparine, low molecular weight Heparine, Heparinoide, Hirudin, Bivalirudin oder Argatroban; Bikarbonat-Therapie; Streßulkusprophylaxe, z.B. H2-Rezeptorinhibitoren, Antazida
Medikamente bei proliferativen Erkrankungen: Urazil, Chlormethin, Cyklophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylenemelamin, Triethylenethiophosphoramin, Busulfan, Carmustine, Lomustine, Streptozocin, Dacarbazine, Methotrexate, 5- Fluorouracil, Floxuridine, Cytarabine, 6-Mercaptopurine, 6-Thioguanine, Fludarabine phosphate, Pentostatine, Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin,
Epirubicin, Idarubicin, Paclitaxel, Mithramycin, Deoxycoformycin, Mitomycin-C, L- Asparaginase, Interferons, Etoposide, Teniposide 17.alpha.- Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol, Testosterone, Prednisone, Fluoxymesterone, Dromostanolone propionate, Testolactone, Megestrolacetate, Tamoxifen, Methylprednisolone, Methyltestosterone, Prednisolone, Triamcinolone, Chlorotrianisene, Hydroxyprogesterone, Aminoglutethimide, Estranrustine, Medroxyprogesteroneacetate, Leuprolide, Flutamide, Toremifene, Goserelin, Cisplatin, Carboplatin, Hydroxyurea, Amsacrine, Procarbazine, Mitotane, Mitoxantrone, Levamisole, Navelbene, Anastrazole, Letrazole, Capecitabine, Reloxafine, Droloxafine, Hexamethylmelamine, Oxaliplatin (Eloxatin®), Iressa (gefmitib, Zdl839), XELODA® (capecitabine), Tarceva® (erlotinib), Azacitidine (5-Azacytidine; 5-AzaC), Temozolomide (Temodar®), Gemcitabine (e.g., GEMZAR® (gemcitabine HCl)), Vasostatin oder eine Kombination zweier oder mehrerer der oben genannten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verhinderung der Blutkoagulation in vitro, insbesondere bei Blutkonserven oder biologischen Proben, die Blutplättchen enthalten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine antikoagulatorisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindung zugegeben wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctivae otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die
parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Bevorzugt ist die orale Applikation.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überfuhrt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige PoIy- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natrium- dodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren inerten nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg je 24 Stunden zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg je 24 Stunden.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse
und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. Die Angabe "w/v" bedeutet "weight/volume" (Gewicht/Volumen). So bedeutet beispielsweise "10% w/v": 100 ml Lösung oder Suspension enthalten 10 g Substanz.
A) Beispiele
Abkürzungen:
ca. circa
CDI Carbonyldiimidazol d Tag(e), Dublett (bei NMR)
DC Dünnschicht-Chromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS) dd Doppeltes Dublett (bei NMR)
DMAP 4-Dimethylaminopyridin
DMF NN-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DPPA Diphenylphosphorazidat
DSC Disuccinimidylcarbonat d. Th. der Theorie (bei Ausbeute) eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS) h Stunde(n)
HATU O-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-N,NN',N -tetramethyluronium
Hexafluoφhosphat
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDA Lithiumdiisopropylamid m Multiple« (bei NMR) min Minute(n)
MS Massenspektroskopie
NMR Kernresonanzspektroskopie
PYBOP Benzotriazol- 1 -yloxy-tris(pyrrolidino)phosphonium-
Hexafluorophosphat q Quartett (bei NMR)
RP reverse phase (bei HPLC)
RT Raumtemperatur
R. Retentionszeit (bei HPLC)
S Singulett (bei NMR) t Triplett (bei NMR)
THF Tetrahydrofuran
HPLC-Methoden:
Methode IA: Instrument: HP 1 100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil 100 RP-18, 60 mm x 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure (70%-ig) / 1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B → 0.5 min 2% B → 4.5 min 90% B → 6.5 min 90% B → 6.7 min 2% B → 7.5 min 2% B; Fluss: 0.75 ml/min; Säulentemperatur: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
LC-MS-Methoden:
Methode IB: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Gemini 3 μ, 30 mm x 3.0 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 2B: Instrument: Micromass QuattroPremier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ, 50 mm x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A — > 0.1 min 90%A → 1.5 min 10%A → 2.2 min 10%A; Ofen: 500C; Fluss: 0.33 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3B: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2.5 μ MAX-RP 100A Mercury, 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 0.1 min 90%A → 3.0 min 5%A → 4.0 min 5%A → 4.01 min 90%A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 4B: Gerätetyp MS: Waters ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Onyx Monolithic C18, 100 mm x 3 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2 min 65%A → 4.5 min 5%A → 6 min 5%A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 400C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 5B: Instrument: Micromass Quattro Micro MS mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A — > 3.0 min 10%A → 4.0 min 10%A → 4.01 min 100%A → 5.00 min 100%A; Ofen: 500C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 6B: Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 1.2 min 5%A → 2.0 min 5%A; Ofen: 500C; Fluss: 0.40 ml/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.
Methode 7B: Gerätetyp MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Gerätetyp HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A → 3.0 min 10%A → 4.0 min 10%A → 4.01 min 100%A (Fluss 2.5 ml/min) → 5.00 min 100%A; Ofen: 500C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Präparative Diastereomerentrennung:
Methode IC: Phase: Xbrdge C18, 5 μm OBD 19 mm x 150 mm, Eluent: Acetonitril/0.1% Ammoniaklösung 55:45; Fluss: 25 ml/min, Temperatur: 28°C; UV-Detektion: 210 nm.
Präparative Enantiomerentrennung:
Methode ID: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 20 mm, Eluent: iso- Hexan/Isopropanol 40:60; Fluss: 15 ml/min, Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Methode 2D: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 20 mm, Eluent: iso-Hexan/Ethanol 25:75; Fluss: 15 ml/min, Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Methode 3D: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 20 mm; Eluent: Isopropanol/iso- Hexan 50:50; Fluss: 18 ml/min; Temperatur: 24°C; UV-Detektion: 230 nm.
Methode 4P: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 20 mm; Eluent: Isopropanol/iso- Hexan 50:50; Fluss: 15 ml/min; Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Methode 5D: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 20 mm, Eluent: Ethanol 100%; Fluss: 12 ml/min, Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Methode 6D: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 20 mm, Eluent: iso-Hexan/Ethanol 30:70; Fluss: 15 ml/min, Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Analytische Enantiomerentrennung:
Methode IE: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 4 mm; Eluent: Isopropanol/iso- Hexan: 50:50; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 24°C; UV-Detektion: 230 nm.
Methode 2E: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 4.6 mm; Eluent: iso-Hexan/ Isopropanol 25:75 + 0.2% Trifluoressigsäure + 1% Wasser; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 45°C; UV-Detektion: 235 nm.
Methode 3E: Phase: Daicel Chiralpak AD-H, 5 μm 250 mm x 4.6 mm; Eluent: Ethanol 100%; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Methode 4E: Phase: Daicel Chiralpak AS-H, 5 μm 250 mm x 4.6 mm; Eluent: iso-Hexan/Ethanol 30:70; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 400C; UV-Detektion: 220 nm.
Als Mikrowellenreaktor wurde ein "single mode" Gerät vom Typ Emrys Optimizer verwendet.
Ausgangsverbindungen
Allgemeine Methode IA: Suzuki-Kupplung
Eine Mischung des entsprechenden Brompyridins in Toluol (1.8 ml/mmol) wird unter Argon bei
RT mit Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium (0.02 eq.), mit einer Lösung der entsprechenden Arylboronsäure (1.2 eq.) in Ethanol (0.5 ml/mmol) und mit einer Lösung aus Kaliumfluorid
(2.0 eq.) in Wasser (0.2 ml/mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird mehrere Stunden bis zur weitgehend vollständigen Umsetzung unter Rückfluß gerührt. Nach Zugabe von
Essigsäureethylester und Phasentrennung wird die organische Phase einmal mit Wasser und einmal mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, getrocknet (Magnesiumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels Flash-Chromatographie
(Kieselgel-60, Eluent: Dichlormethan-Methanol-Gemische) aufgereinigt.
Allgemeine Methode 2A: Hydrierung des Pyridins
Eine Lösung des Pyridins in Ethanol (9 ml/mmol) wird unter Argon mit Palladium auf Aktivkohle (angefeuchtet mit ca. 50% Wasser, 0.3 g/mmol) versetzt und bei 600C über Nacht in einer 50 bar Wasserstoff- Atmosphäre hydriert. Anschließend wird der Katalysator über eine Filterschicht abfiltriert und mehrmals mit Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum eingeengt.
Allgemeine Methode 3A: Umsetzung mit Carbamoylchloriden oder Carbonylchloriden
Eine Lösung des Piperidins in Dichlormethan (2.5 ml/mmol) wird unter Argon bei 00C tropfenweise mit NN-Diisopropylethylamin (1.2 eq.) und dem entsprechenden Carbamoylchlorid oder Carbonylchlorid (1.2 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Phasentrennung wird die organische Phase dreimal mit Wasser und einmal mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt.
Allgemeine Methode 4A: Verseifung
Eine Lösung des entsprechenden Esters in einem Gemisch aus Tetrahydrofuran/Wasser (3: 1, 12.5 ml/mmol) wird bei RT mit Lithiumhydroxid (2 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 600C gerührt und anschließend mit wässriger, 1 N Salzsäure-Lösung auf pH 1 gestellt. Nach Zugabe von Wasser/Essigsäureethylester wird die wässrige Phase dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt.
Allgemeine Methode 5A: iV-Hydroxyimidamidbildung
Eine Lösung aus dem entsprechenden Nitril (1.0 eq) in Ethanol (1.2 ml/mmol) wird bei RT mit Hydroxylammoniumchlorid (1.5 eq.) und Triethylamin (1.2 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird Ethanol im Vakuum entfernt, das Reaktionsgemisch mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
Allgemeine Methode 6A: Λ"-Hydroxyimidamidbildung
Eine Lösung aus dem entsprechenden Nitril (1.0 eq) in einem Gemisch aus Ethanol (1.9 ml/mmol) und Wasser (0.5 ml/mmol) wird bei RT mit Hydroxylammoniumchlorid (1.08 eq.) und Natriumhydroxid (1.12 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt, mit Dichlormethan versetzt und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand ohne weitere Aufreinigung umgesetzt.
Allgemeine Methode 7A: Umsetzung mit Carbonylchloriden
Die Carbonsäure wird in Dioxan/Dimethylformamid (3: 1, 1 ml/mmol) gelöst und auf 600C erwärmt. Nach Zugabe von NN-Carbonyldümidazol (1.5 eq.), gelöst in Dioxan/Dimethylformamid (4: 1, 1.6 ml/mmol), wird 3 h bei 600C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wird das Carboximidamid, gelöst in Dioxan/Dimethylformamid 1 :1, zugetropft und über Nacht bei 400C gerührt. Danach wird das Dioxan im Vakuum entfernt. Der in Dimethylformamid gelöste Rückstand wird anschließend für 1 h bei 115°C gerührt. Die Reaktionsmischung wird nach dem Abkühlen mit Wasser verdünnt. Nach Extraktion mit Dichlormethan wird die organsiche Phase über Natriumsulfat getrocknet und das Rohprodukt mittels präparativer HPLC gereinigt.
Allgemeine Methode 8A: Harnstoffbildung
Eine Lösung des Nitrophenylcarbamates (1.0 eq.) in Dimethylformamid (10 ml/mmol) wird bei RT mit dem entsprechenden Amin (2.0-3.0 eq.) und Kaliumcarbonat (1.0 eq.) versetzt und in 15 ml- Portionen in einer Single Mo cfe-Mikrowelle (Emrys Optimizer) für 0.5-1 h bei 1500C gerührt. Die Reaktionslösung wird filtriert und das Filtrat mittels präparativer HPLC aufgereinigt.
Allgemeine Methode 9A: Methylesterverseifung/Epimerisierung
Zu einer Lösung des entsprechenden Methylesters (1.0 eq.) in Methanol (35-40 ml/mmol) wird bei RT Kalium-tert.-butylat (10 eq.) gegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 600C gerührt. Bei
unvollständiger Umsetzung wird Wasser (1.0 eq.) zugesetzt und bis zum vollständigen Umsatz bei 600C gerührt. Zur Aufarbeitung wird im Vakuum das Methanol entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt und mit wässriger 1 N Salzsäure-Lösung sauer (pH 1) gestellt. Die Mischung wird mit Essigsäureethylester extrahiert, die organische Phase mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Beispiel IA
5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3-carbonsäuremethylester
Nach der Allgemeinen Methode IA wurden 32 g (148 mmol) 5-Bromnicotinsäuremethylester und 27 g (178 mmol, 1.2 eq.) 4-Ethylphenylboronsäure umgesetzt. Ausbeute: 24 g (64% d. Th.)
LC-MS (Methode 3B): R, = 2.03 min; MS (ESIpos): m/z = 242 [M+H]+.
Beispiel 2A
5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäuremethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 2A wurden 24 g (94 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3- carbonsäuremethylester hydriert. Ausbeute: 20 g (77% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R, = 1.43 min; MS (ESIpos): m/z = 248 [M+H]+.
Beispiel 3A
5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3-carbonsäureethylester
Nach der Allgemeinen Methode IA wurden 29 g (126 mmol) 5-Bromnicotinsäureethylester und 23 g (152 mmol, 1.2 eq.) 4-Ethylphenylboronsäure umgesetzt. Ausbeute: 32 g (82% d. Th.)
LC-MS (Methode 4B): R, = 3.80 min; MS (ESIpos): m/z = 256 [M+H]+.
Beispiel 4A
5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 2A wurden 24 g (71 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3- carbonsäureethylester hydriert. Ausbeute: 15 g (81% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R, = 1.78 min und 1.91 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 262 [M+H]+.
Beispiel 5A
5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester [racemisch cis-Isomer]
Die Diastereomerentrennung von 15 g (124 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A nach Methode IC ergab 2.5 g (17% d. Th.) des cis-Isomers (Beispiel 5A).
LC-MS (Methode 3B): R, = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 262 [M+H]+.
Beispiel 6A
5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester [racemisches trans-Isomer]
Die Diastereomerentrennung von 15 g (124 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A nach Methode IC ergab 3.0 g (20% d. Th.) des trans-Isomers (Beispiel 6A).
LC-MS (Methode 3B): R1 = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 262 [M+H]+.
Beispiel 7A
3-Ethyl-l-(4-nitrophenyl)-5-(4-ethylphenyl)piperidin-l,3-dicarboxylat [racemisch cis-Isomer]
Zu 2.5 g (9.57 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester (Beispiel 5A) und 1.94 g (19.1 mmol) Triethylamin in 292 ml Dichlormethan wurden langsam bei 00C 1.93 g (9.57 mmol) 4-Nitrophenylchloroformat gegeben. Die Mischung wurde für 2 h bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch erst mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogen- carbonatlösung, dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 2.66 g (64% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R, = 1.57 min; MS (ESIpos): m/z = 427 [M+H]+.
Beispiel 8A
Ethyl-5-(4-ethylphenyl)-l-[(4-hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]piperidin-3-carboxylat [racemisches cis-Isomer]
370 mg (0.81 mmol) 3-Ethyl-l-(4-nitrophenyl)-5-(4-ethylphenyl)piperidin-l,3-dicarboxylat, 245 mg (2.42 mmol) 4-Hydroxypiperidin und 112 mg (0.81 mmol) Kaliumcarbonat wurden in 9 ml DMF gegeben und bei 1500C für 15 min in einer Single Mocfe-Mikrowelle (Emrys Optimizer) erhitzt. Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung mit Wasser versetzt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 208 mg (66% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R4 = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 389 [M+H]+.
Beispiel 9A
5-(4-Ethylphenyl)-l-[(4-hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis- Isomer]
880 mg (2.24 mmol) Ethyl-5-(4-ethylphenyl)-l-[(4-hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]piperidin-3- carboxylat wurden in einem Gemisch von 15.5 ml Dioxan und 7.7 ml Wasser gelöst und mit 215 mg (8.97 mmol) Lithiumhydroxid versetzt und bei RT über Nacht gerührt. Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, danach mit Wasser versetzt und mit IN Salzsäure sauer gestellt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Filtrat wurde mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinten
organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Die beiden Feststoffe ergaben eine Gesamtausbeute von 764 mg (95% d. Th.).
LC-MS (Methode 3B): R, = 1.49 min; MS (ESIpos): m/z = 361 [M+H]+.
Beispiel IQA
3-Methyl-l-(4-nitrophenyl)-5-(4-ethylphenyl)piperidin-l,3-dicarboxylat [racemisches cis-/trans- Isomerengemisch]
3.0 g (12.1 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2A wurden in 30 ml Dichlormethan vorgelegt, auf 00C abgekühlt und mit 3.4 ml (2.4 g, 12.1 mmol) Triethylamin sowie 2.4 g (12.1 mmol) Chlorameisensäure-4-nitrophenylester versetzt. Das Reaktionsgemisch ließ man langsam auf RT erwärmen und rührte 16 h bei RT. Es wurde mehrmals mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieslegel aufgereinigt (Laufmittel Dichlormethan — > Dichlormethan/Methanol 100:2). Ausbeute: 4.7 g (83% d. Th., 89% Reinheit)
HPLC (Methode IA): R, = 4.94 min und 5.00 min (cis-/trans-Isomer); MS (ESIpos): m/z = 413
[M+H]+.
Beispiel IIA
5-(4-Ethylphenyl)-l-[(3-hydroxyazetidin-l-yl)carbonyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
0.3 g (0.7 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1OA, 0.2 g (2.18 mmol) 3-Hydroxyazetidin- Hydrochlorid und 0.2 g (1.4 mmol) Kaliumcarbonat wurden in 6 ml DMF vorgelegt und 30 min bei 1500C in einer Single Mocfe-Mikrowelle (Emrys Optimizer) umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Ausbeute: 105 mg (40% d. Th.)
LC-MS (Methode 3B): R, = 1.76 min und 1.85 [cis-/trans-Isomere]; MS (ESIpos): m/z = 361 [M+H]+.
Beispiel 12A
5-(4-Ethylphenyl)-l -[(3 -hydroxyazetidin-l-yl)carbonyl]piperidin-3 -carbonsäure [racemisches cis- Isomer]
300 mg (0.83 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1 IA wurden nach der Allgemeinen Methode 9A umgesetzt. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 250 mg (90% d. Th.)
LC-MS (Methode 3B): R, = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 333 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6): δ = 12.42 (br s, COOH), 7.18-7.13 (m, 4H), 5.54 (br s, OH), 4.39- 4.33 (m, IH), 4.08-3.97 (m, 3H), 3.68-3.62 (m, 3H), 2.78-2.70 (m, 2H), 2.68-2.54 (m, 3H), 2.48- 2.42 (m, IH), 2.08 (br d, IH), 1.71 (q, IH), 1.15 (t, 3H).
Beispiel 13A
5 - [4-(Trifluormethoxy)pheny 1] pyridin-3 -carbonsäuremethy lester
Nach der Allgemeinen Methode IA wurden 23 g (105 mmol) 5-Bromnicotinsäuremethylester und 26 g (126 mmol, 1.2 eq.) 4-Trifluormethoxyphenylboronsäure umgesetzt. Ausbeute: 14 g (41% d. Th.)
LC-MS (Methode IB): R, = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+.
Beispiel 14A
5-[4-(Trifluormethoxy)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester [racemisches cis-/trans- Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 2A wurden 14 g (45 mmol) 5-[4-(Trifluormethoxy)- phenyl]pyridin-3-carbonsäuremethylester hydriert. Ausbeute: 8 g (59% d. Th.)
LC-MS (Methode IB): R, = 1.29 min und 1.33 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 304 [M+H]+.
Beispiel 15A
3-Methyl-l-(4-nitrophenyl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l,3-dicarboxylat [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Zu 8.0 g (26.4 mmol) 5-(4-(Trifluormethoxy)phenyl)piperidin-3-carbonsäuremethylester (Beispiel 15A) und 5.34 g (26.3 mmol) Triethylamin in 666 ml Dichlormethan wurden langsam bei 0°C 5.32 g (26.4 mmol) 4-Nitrophenylchloroformat gegeben. Die Mischung wurde für 2 h bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch erst mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung, dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Flashchromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Essigsäureethylester 1:2 bis 1 : 1) gereinigt. Ausbeute: 7.32 g (54% d. Th.)
LC-MS (Methode 3B): R, = 2.47 min; MS (ESIpos): m/z = 469 [M+H]+.
Beispiel 16A
Methyl-1 -[(4-hydroxypiperidin- 1 -yl)carbonyl]-5-[4-(trifluorrnethoxy)phenyl]piperidin-3- carboxylat [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
1780 mg (3.80 mmol) 3-Methyl-l-(4-nitrophenyl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l,3- dicarboxylat, 1153 mg (11.40 mmol) 4-Hydroxypiperidin und 525 mg (3.80 mmol) Kaliumcarbonat wurden in 37 ml DMF gegeben und in 2 Portionen bei 1500C für 15 min in einer Single Mocfe-Mikrowelle (Emrys Optimizer) erhitzt. Zur Aufarbeitung wurden die beiden Reaktionslösungen vereint, mit Wasser versetzt und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die
organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 849 mg (50% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R, = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 431 [M+H]+.
Beispiel 17A
l-[(4-Hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer]
828 mg (1.92 mmol) Methyl-5-(4-(trifluormethoxy)phenyl)-l-[(4-hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]- piperidin-3-carboxylat wurden in 70 ml Methanol gelöst, mit 2159 mg (19.24 mmol) Kalium-tert.- butylat versetzt und bei 600C über Nacht gerührt. Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung mit Wasser verdünnt und mit IN Salzsäure sauer gestellt (pH 1). Das Gemisch wurde mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 749 mg (94% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R, = 1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 417 [M+H]+.
Beispiel 18A
Methyl-l-[(3-hydroxyazetidin-l-yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-3-carboxylat [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 8 A wurden 300 mg (0.38 mmol) der Verbindung aus Beispiel 15A und 89 mg (1.15 mmol) 3-Hydroxyazetidin umgesetzt. Ausbeute: 100 mg (63% d. Th.).
LC-MS (Methode 6B): R, = 0.97 min und 0.99 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 403 [M+H]+.
Beispiel 19A
l-[(3-Hydroxyazetidin-l-yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 9A wurden 700 mg (1.43 mmol) der Verbindung aus Beispiel 18A und 1.61 g (14.3 mmol) Kalium-/er/-butylat umgesetzt. Die Reaktion führte selektiv zum cis- Isomer. Ausbeute: 700 g (99% d. Th., 84% Reinheit)
LC-MS (Methode 6B): R, = 0.87 min ; MS (ESIpos): m/z = 389 [M+H]+.
Beispiel 2OA
5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-3-carbonsäuremethylester
Nach der Allgemeinen Methode IA wurden 28 g (132 mmol) 5-Bromnicotinsäuremethylester und 30 g (158 mmol, 1.2 eq.) 4-Trifluormethylphenylboronsäure umgesetzt. Ausbeute: 32 g (85% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R4 = 2.27 min; MS (ESIpos): m/z = 282 [M+H]+.
Beispiel 21A
5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester [racemisches cis-/trans- Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 2A wurden 32 g (1 12 mmol) 5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]- pyridin-3-carbonsäuremethylester (Beispiel 20A) hydriert. Ausbeute: 26 g (82% d. Th.)
LC-MS (Methode IB): R, = 1.35 und 1.41 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 288 [M+H]+.
Beispiel 22A
3-Methyl-l-(4-nitrophenyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l,3-dicarboxylat [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
20.0 g (69.6 mmol) Methyl-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carboxylat (Beispiel 21A) wurden in 1.0 1 Dichlormethan gelöst und bei 00C mit 14.1 g (139 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wurden 14.0 g (69.6 mmol) 4-Nitrophenylchlorocarbonat zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h bei 00C und anschließend 16 h bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Es wurden 31.3 g Rohprodukt erhalten, welches ohne weitere Reinigungsoperationen umgesetzt wurde.
LC-MS (Methode 3B): R, = 2.44 min und 2.48 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 453 [M+H]+.
Beispiel 23A
Methyl- l-[(4-hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethyl) phenyl]piperidin-3-carboxylat [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 8A wurden 4.00 g (8.84 mmol) 3-Methyl-l-(4-nitrophenyl)-5-[4- (trifluormethyl)phenyl]piperidin-l,3-dicarboxylat (Beispiel 22A) und 2.68 g (26.5 mmol) 4- Hydroxypiperidin umgesetzt. Ausbeute: 3.10 g (83% d. Th.).
LC-MS (Methode 3B): R, = 2.72 min und 2.78 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 415 [M+H]+.
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6): δ = 7.69 (d, 2H), 7.53 (t, 2H), 4.67 (br d, IH), 3.91-3.78 (m, IH), 3.66-3.34 (m, 7H), 3.15-3.05 (m, IH), 2.96-2.65 (m, 5H), 2.25-2.11 (m, IH), 1.96-1.63 (m, 3H), 1.38-1.18 (m, 2H).
Beispiel 24A
l-[(4-Hydroxypiperidin-l-yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 9A wurden 2.10 g (5.07 mmol) Methyl- l-[(4-hydroxypiperidin-l- yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carboxylat (Beispiel 23A) umgesetzt. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 2.02 g (99% d. Th.).
LC-MS (Methode 2B): R, = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
Beispiel 25A
Methyl-l-^S-hydroxyazetidin-l-y^carbonylj-S-^^trifluormethyOphenyljpiperidin-S-carboxylat [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 8A wurden 4.00 g (8.84 mmol) 3-Methyl-l-(4-nitrophenyl)-5-[4- (trifluormethyl)phenyl]piperidin-l,3-dicarboxylat (Beispiel 22A), 2.91 g (26.5 mmol) 4-Azetidin- 3-ol Hydrochlorid und Kaliumcarbonat (2.5 eq.) umgesetzt. Ausbeute: 2.48 g (70% d. Th.).
LC-MS (Methode 2B): R, = 1.08 min und 1.10 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 387 [M+H]+.
Beispiel 26A
l-[(3-Hydroxyazetidin-l-yl)carbonyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 9A (Reaktionszeit: 2 h) wurden 2.48 g (6.42 mmol) Methyl-l-[(3- hydroxyazetidin-l-ytycarbonylJ-S-^-^rifluormethyOpheny^piperidin-S-carboxylat (Beispiel 25A) umgesetzt. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 2.33 g (94% d. Th.).
LC-MS (Methode IB): R, = 1.84 min; MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]+.
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6): δ = 12.4 (br s, IH), 7.69 (d, 2H), 7.53 (d, 2H), 5.57 (d, IH), 4.42- 4.32 (m, IH), 4.11-3.95 (m, 3 H), 3.77-3.63 (m, 3H), 3.32 (verdeckt, IH), 2.88-2.76 (m, 3H), 2.14 (br d, IH), 1.85-1.72 (m, 1 H).
Beispiel 27A
l-rer/-Butyl-3-methyl-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l,3-dicarboxylat [racemisches cis- /trans-Isomerengemisch]
1.0 g (3.40 mmol) der Verbindung aus Beispiel 14A und 0.47 ml (0.34 g, 3.40 mmol) Triethylamin wurden in 50 ml Dichlormethan vorgelegt und bei RT mit 0.78 ml (0.74 g, 3.40 mmol) Di-tert-butyldicarboxylat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 h bei RT gerührt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch an Kieselgel aufgereinigt (Laufmittel Dichlormethan/Methanol 50:1 bis 20:1). Ausbeute: 1.32 g (78% d. Th., 81% Reinheit)
LC-MS (Methode 5B): R, = 2.66 min und 2.72 min [cis-/trans-Isomere]; MS (ESIpos): m/z = 404 [M+H]+.
Beispiel 28A
l-(ter/-Butoxycarbonyl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis- Isomer]
1.3 g (3.27 mmol) der Verbindung aus Beispiel 27A wurden nach der Allgemeinen Methode 9A umgesetzt. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 1.31 g (87% d. Th., 85% Reinheit)
LC-MS (Methode 5B): R, = 2.46 min; MS (ESIpos): m/z = 390 [M+H]+.
Beispiel 29A
/er/-Butyl-3-(3-cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l- carboxylat [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 7A wurden 2.37 g (5.05 mmol) 1 -(ter/-Butoxycarbonyl)-5-[4- (trifluormethoxy)phenyl]piperidin-3-carbonsäure (Beispiel 28A) und 0.76 g (7.58 mmol, 1.5 eq.) N-Hydroxycyclopropancarboximidamid umgesetzt. Es wurden 2.46 g Rohprodukt erhalten, welches ohne weitere Reinigungsoperationen umgesetzt wurde.
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 454 [M+H]+.
Beispiel 3OA
3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin Trifluoracetat [racemisches cis-Isomer]
Zu einer Lösung von 3.0 g (ca. 6.62 mmol) der Verbindung aus Beispiel 29A in 405 ml Dichlormethan wurden 7.50 ml (99.2 mmol) Trifluoressigsäure zugegeben, und die Mischung wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt, mit Dichlormethan versetzt und wieder eingeengt. Es wurden 3.0 g Rohprodukt erhalten, welches ohne weitere Reinigungsoperationen umgesetzt wurde.
LC-MS (Methode 6B): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 354 [M+H-TFA]+.
Beispiel 31A
4-Nitrophenyl-3-(3-cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l- carboxylat [racemisches cis-Isomer]
3.0 g (ca. 6.42 mmol) 3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl] piperidin Trifluoracetat (Beispiel 30A) wurden in 122 ml Dichlormethan gelöst und bei 00C mit 2.60 g (25.6 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wurden 1.29 g (6.42 mmol) A- Nitrophenylchlorocarbonat zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h bei 00C und anschließend 16 h bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Es wurden 3.19 g Rohprodukt erhalten, welches ohne weitere Reinigungsoperationen umgesetzt wurde.
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 519 [M+H]+.
Beispiel 32A
N'-Hydroxy-3-methoxypropanimidamid
Nach der Allgemeinen Methode 6A wurden 20.0 g (235.0 mmol) 3-Methoxypropionitril umgesetzt. Ausbeute: 18.1 g (49% d. Th., 74% Reinheit)
HPLC (Methode IA): R4 = 0.35 min; MS (ESIpos): m/z = 1 19 [M+H]+.
Beispiel 33A
3-Ethoxy-N'-hydroxypropanimidamid
Nach der Allgemeinen Methode 5 A wurden 5.0 g (50.4 mmol) 3-Ethoxypropionitril umgesetzt. Ausbeute: 0.6 g (8% d. Th., 90% Reinheit)
HPLC (Methode IA): R1 = 0.60 min; MS (ESIpos): m/z = 133 [M+H]+.
Beispiel 34A
N'-Hydroxycyclopropancarboximidamid
Nach der Allgemeinen Methode 5 A wurden 7.2 g (107.3 mmol) Cyclopropancarbonsäurenitril umgesetzt. Ausbeute: 4.8 g (44% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R, = 0.16 min; MS (ESIpos): m/z = 101 [M+H]+.
Ausführungsbeispiele
Allgemeine Methode 1: Oxadiazolbildung
Eine Lösung aus der entsprechenden Piperidin-3 -carbonsäure in Dimethylformamid (10 ml/mmol) wird unter Argon bei RT mit HATU (1.2 eq.), N,N-Diisopropylethylamin (2.2 eq.) und dem entsprechenden N-Hydroxyimidamid (1.1 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt bis zur kompletten Bildung der Zwischenstufe, dann bei 1200C weiter gerührt bis zur Bildung des gewünschten Produktes aus dieser Zwischenstufe. Das Reaktionsgemisch wird anschließend mittels präparativer HPLC aufgereinigt.
Allgemeine Methode 2: Oxadiazolbildung
Die Carbonsäure wird in Dioxan/Dimethylformamid (3: 1, 1 ml/mmol) gelöst und auf 600C erwärmt. Nach Zugabe von NN-Carbonyldiimidazol (1.5 eq.), gelöst in Dioxan/Dimethylformamid (4:1, 1.6 ml/mmol), wird 3 h bei 600C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wird das Carboximidamid, gelöst in Dioxan/Dimethylformamid 1: 1, zugetropft und über Nacht bei 400C gerührt. Danach wird das Dioxan im Vakuum entfernt. Der in Dimethylformamid gelöste Rückstand wird anschließend für 1 h bei 115°C gerührt. Die Reaktionsmischung wird nach dem Abkühlen mit Wasser verdünnt. Nach Extraktion mit Dichlormethan wird die organsiche Phase über Natriumsulfat getrocknet und das Rohprodukt mittels präparativer HPLC gereinigt.
Allgemeine Methode 3: Oxadiazolbildung
Eine Lösung aus der entsprechenden Piperidin-3-carbonsäure in Dimethylformamid (10 ml/mmol) wird unter Argon bei RT mit HATU (1.2 eq.), N,N-Diisopropylethylamin (2.2 eq.) und dem entsprechenden N-Hydroxyimidamid (1.1 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt bis zur kompletten Bildung der Zwischenstufe. Der Kolbeninhalt wird mit
Essigsäureethylester versetzt. Die organische Phase wird mit IN Natriumhydroxid-Lösung, Wasser und gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Reaktionsgemisch wird mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Die Produktfraktionen werden im Vakuum eingeengt, in DMF gelöst und in der Mikrowelle für 3 Minuten bei 1800C umgesetzt. Der
Kolbeninhalt wird mit Essigsäureethylester versetzt. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Reaktionsgemisch wird mittels präparativer HPLC aufgereinigt.
Beispiel 1
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 3 wurden 300 mg (0.7 mmol) der Verbindung aus Beispiel 19A und 191 mg (1.4 mmol, 2.0 eq.) der Verbindung aus Beispiel 33A umgesetzt. Ausbeute: 82 mg (22% d. Th.)
HPLC (Methode 6B): R, = 1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 485 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, DMSOd6): δ = 7.51-7.42 (m, 2H), 7.33 (d, 2H), 5.62-5.50 (m, IH), 4.43-4.32 (m, IH), 4.20-4.04 (m, 3H), 3.79-3.60 (m, 5H), 3.43 (q, 2H), 3.07-2.84 (m, 5H), 2.35-2.24 (m, 2H), 1.99 (q, IH), 1.07 (t, 3H).
Beispiel 2
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 70 mg des Racemates aus Beispiel 1 nach Methode ID ergab 23 mg der Titelverbindung aus Beispiel 2 (Enantiomer 1) und 29 mg der Titelverbindung aus Beispiel 3 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode IE): R, = 4.94 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 485 [M+H]+.
Beispiel 3
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 70 mg des Racemates aus Beispiel 1 nach Methode ID ergab 23 mg der Titelverbindung aus Beispiel 2 (Enantiomer 1) und 29 mg der Titelverbindung aus Beispiel 3 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode IE): R, = 6.14 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 485 [M+H]+.
Beispiel 4
{3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 200 mg (0.489 mmol) der Carbonsäure aus Beispiel 26A und 53.8 mg (0.538 mmol) N-Hydroxycyclopropancarboximidamid aus Beispiel 34A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde anschließend mittels präperativer HPLC gereinigt. Enantiomerentrennung des Racemats nach Methode 4D ergab 28 mg der Titelverbindung aus Beispiel 4 und 30 mg der Titelverbindung aus Beispiel 5.
HPLC (Methode 2E): R, = 4.53 min, >99.0% ee;
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 437 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-</6): δ = 7.70 (d, 2 H), 7.56 (d, 2 H), 5.58 (d, 1 H), 4.38 (d, 1 H), 4.20- 4.03 (m, 3 H), 3.83-3.63 (m, 3 H), 3.30-3.20 (m, 2 H), 3.05-2.87 (m, 3 H), 2.28 (d, 1 H), 2.17-2.07 (m, 1 H), 2.06-1.93 (m, 1 H), 1.14-0.98 (m, 2 H), 0.89 (br s, 2 H).
Beispiel 5
{3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 200 mg (0.489 mmol) der Carbonsäure aus Beispiel 26A und 53.8 mg (0.538 mmol) N-Hydroxycyclopropancarboximidamid aus Beispiel 34A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde anschließend mittels präperativer HPLC gereinigt. Enantiomerentrennung des Racemats nach Methode 4D ergab 28 mg der Titelverbindung aus Beispiel 4 und 30 mg der Titelverbindung aus Beispiel 5.
HPLC (Methode 2E): R, = 5.74 min, >99.0% ee;
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 437 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-J6): δ = 7.70 (d, 2 H), 7.56 (d, 2 H), 5.58 (d, 1 H), 4.38 (d, 1 H), 4.20- 4.03 (m, 3 H), 3.83-3.63 (m, 3 H), 3.30-3.20 (m, 2 H), 3.05-2.87 (m, 3 H), 2.28 (d, 1 H), 2.17-2.07 (m, 1 H), 2.06-1.93 (m, 1 H), 1.14-0.98 (m, 2 H), 0.89 (br s, 2 H).
Beispiel 6
{3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 8A wurden 2.55 g (ca. 3.69 mmol) 4-Nitrophenyl-3-(3- cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-carboxylat (Beispiel
31A), 1.23 g (1 1.07 mmol) 4-Azetidin-3-ol Hydrochlorid und Kaliumcarbonat (2.0 eq.) umgesetzt. Ausbeute: 850 mg (51% d. Th.).
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 453 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6): δ = 7.45 (d, 2H), 7.35 (d, 2H), 5.52 (d, IH),. 4.42-4.33 (m, IH), 4.15-4.04 (m, 3H), 3.76-3.65 (m, 3H), 3.24 (tt, IH), 3.01-2.82 (m, 3H), 2.25 (dm, IH), 2.15-2.07 (m, IH), 1.95 (q, IH); 1-08-1.02 (m, 2H), 0.90-0.86 (m, 2H).
Beispiel 7
{3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 850 mg des Racemates aus Beispiel 6 nach Methode 6D ergab 480 mg der Titelverbindung aus Beispiel 7 und 538 mg der Titelverbindung aus Beispiel 8.
HPLC (Methode 4E): R, = 4.94 min, >99.5% ee;
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 453 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6): δ = 7.44 (d, 2H), 7.32 (d, 2H), 5.59 (bs, IH),. 4.41-4.35 (m, IH), 4.13-4.04 (m, 3H), 3.75-3.65 (m, 3H), 3.01-2.85 (m, 3H), 2.25 (dm, IH), 2.14-2.08 (m, IH), 1.95 (q, IH); 1-09-1.01 (m, 2H), 0.92-0.85 (m, 2H).
Beispiel 8
{3-(3-Cyclopropyl-l,2,4-oxadiazol-5-yl)-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 850 mg des Racemates aus Beispiel 6 nach Methode 6D ergab 480 mg der Titelverbindung aus Beispiel 7 und 538 mg der Titelverbindung aus Beispiel 8.
HPLC (Methode 4E): R, = 11.89 min, >99.5% ee;
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 453 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.44 (d, 2H), 7.32 (d, 2H), 5.59 (bs, IH),. 4.41-4.35 (m, IH), 4.13-4.04 (m, 3H), 3.75-3.65 (m, 3H), 3.01-2.85 (m, 3H), 2.25 (dm, IH), 2.14-2.08 (m, IH), 1.95 (q, IH); 1-09-1.01 (m, 2H), 0.92-0.85 (m, 2H).
Beispiel 9
(3-Hydroxyazetidin-l-yl){3-[3-(2-methoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethoxy)- phenyl]piperidin-l-yl}methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 2 wurden 150 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 19A und 77 mg (0.649 mmol) Nl-Hydroxy-3-methoxypropanimidamid umgesetzt. Ausbeute: 23 mg (15% d. Th.). Enantiomerentrennung von 1.06 g des Racemates nach Methode 5D ergab 716 mg der Titelverbindung aus Beispiel 9 und 675 mg der Titelverbindung aus Beispiel 10.
HPLC (Methode 3E): R, = 5.88 min, >99.5% ee;
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 441 [M+H]+.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.46 (d, 2H), 7.33 (d, 2H), 5.56 (d, IH), 4.42-4.35 (m, IH), 4.20-4.05 (m, 3H), 3.77-3.65 (m, 5H), 3.23 (s, 3H), 3.05-2.85 (m, 5H), 2.30 (dm, IH), 1.99 (q, IH).
Beispiel 10
(3-Hydroxyazetidin-l-yl){3-[3-(2-methoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethoxy)- phenyl]piperidin-l-yl}methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 2 wurden 150 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 19A und 77 mg (0.649 mmol) N-Hydroxy-3-methoxypropanimidamid umgesetzt. Ausbeute: 23 mg (15% d. Th.). Enantiomerentrennung von 1.06 g des Racemates nach Methode 5D ergab 716 mg der Titelverbindung aus Beispiel 9 und 675 mg der Titelverbindung aus Beispiel 10.
HPLC (Methode 3E): R, = 12.83 min, >99.5% ee;
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 441 [M+H]+.
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6): δ = 7.46 (d, 2H), 7.33 (d, 2H), 5.56 (d, IH), 4.42-4.35 (m, IH), 4.20-4.05 (m, 3H), 3.77-3.65 (m, 5H), 3.23 (s, 3H), 3.05-2.85 (m, 5H), 2.30 (dm, IH), 1.99 (q, IH).
Beispiel 11
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 2 wurden 300 mg (0.81 mmol) der Verbindung aus Beispiel 26A und 173 mg (0.1.21 mmol, 1.5 eq.) der Verbindung aus Beispiel 33A umgesetzt. Enantiomerentrennung von 133 mg des Racemates nach Methode 3D ergab 61 mg der Titelverbindung aus Beispiel 11 (Enantiomer 1) und 60 mg der Titelverbindung aus Beispiel 12 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 6B): R, = 1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 469 [M+H]+;
HPLC (Methode IE): R, = 5.23 min, >99.5% ee;
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 7.71 (d, 2H), 7.56 (d, 2H), 5.59 (d, IH), 4.38 (s, IH), 4.16 (d, IH), 4.09 (q, 2H), 3.80-3.65 (m, 5H), 3.43 (q, 2H), 3.09-2.95 (m, 3H), 2.93 (t, 2H), 2.36-2.27 (m, IH), 2.10-1.96 (m, IH), 1.13-1.01 (m, 3H).
Beispiel 12
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(3- hydroxyazetidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 2 wurden 300 mg (0.81 mmol) der Verbindung aus Beispiel 26A und 173 mg (0.1.21 mmol, 1.5 eq.) der Verbindung aus Beispiel 33A umgesetzt. Enantiomerentrennung von 133 mg des Racemates nach Methode 3 D ergab 61 mg der Titel Verbindung aus Beispiel 1 1 (Enantiomer 1) und 60 mg der Titelverbindung aus Beispiel 12 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode IE): R, = 8.20 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 497 [M+H]+.
Beispiel 13
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-(4-ethylphenyl)piperidin-l-yl}(4-hydroxypiperidin- l-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 3 wurden 360 mg (1.0 mmol) der Verbindung aus Beispiel 9A und 264 mg (2.0 mmol, 2.0 eq.) der Verbindung aus Beispiel 33A umgesetzt. Ausbeute: 1 13 mg (25% d. Th.)
HPLC (Methode 6B): R, = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 457 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, DMSOd6): δ = 7.32-7.07 (m, 4H), 4.73-4.58 (m, IH), 4.00-3.88 (m, IH), 3.71 (t, 2H), 3.61 (dt, IH), 3.56-3.37 (m, 6H), 3.17 (d, IH), 3.03-2.76 (m, 4H), 2.60 (q, 2H), 2.34- 2.24 (m, 2H), 2.04-1.87 (m, IH), 1.81-1.64 (m, 2H), 1.38-1.24 (m, 2H), 1.16 (t, 3H), 1.10-1.02 (m, 3H).
Beispiel 14
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-(4-ethylphenyl)piperidin-l-yl}(4-hydroxypiperidin- 1 -yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 113 mg des Racemates aus Beispiel 13 nach Methode 2D ergab 50 mg der Titelverbindung aus Beispiel 14 (Enantiomer 1) und 47 mg der Titelverbindung aus Beispiel 15 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 2E): R, = 4.83 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 457 [M+H]+.
Beispiel 15
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-(4-ethylphenyl)piperidin-l-yl}(4-hydroxypiperidin- l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 113 mg des Racemates aus Beispiel 13 nach Methode 2D ergab 50 mg der Titelverbindung aus Beispiel 14 (Enantiomer 1) und 47 mg der Titelverbindung aus Beispiel 15 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 2E): R, = 5.52 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 457 [M+H]+.
Beispiel 16
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l ,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(4- hydroxypiperidin-l-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 2 wurden 100 mg (0.25 mmol) der Verbindung aus Beispiel 24A und 54 mg (0.38 mmol, 1.5 eq.) der Verbindung aus Beispiel 33 A umgesetzt. Ausbeute: 82 mg (63% d. Th.)
HPLC (Methode 7B): R, = 2.19 min; MS (ESIpos): m/z = 497 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 7.70 (d, 2H), 7.62-7.51 (m, 2H), 4.68 (d, IH), 4.01-3.89 (m, IH), 3.71 (t, 2H), 3.65-3.53 (m, 2H), 3.52-3.36 (m, 5H), 3.10-2.98 (m, 3H), 2.98-2.91 (m, 4H), 2.39-2.29 (m, IH), 2.01 (q, IH), 1.79-1.65 (m, 2H), 1.38-1.21 (m, 2H), 1.12-1.01 (m, 3H).
Beispiel 17
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(4- hydroxypiperidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 270 mg des Racemates aus Beispiel 16 nach Methode 2D ergab 139 mg der Titelverbindung aus Beispiel 17 (Enantiomer 1) und 112 mg der Titelverbindung aus Beispiel 18 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 2E): R1 = 5.55 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 497 [M+H]+.
Beispiel 18
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-l-yl}(4- hydroxypiperidin-l-yl)methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 270 mg des Racemates aus Beispiel 16 nach Methode 2D ergab 139 mg der Titelverbindung aus Beispiel 17 (Enantiomer 1) und 112 mg der Titelverbindung aus Beispiel 18 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 2E): R, = 12.72 min, >99.5% ee; MS (ESIpos): m/z = 497 [M+H]+.
Beispiel 19
{3-[3-(2-Ethoxyethyl)-l,2,4-oxadiazol-5-yl]-5-[4-(trifluormethoxy)phenyl]piperidin-l-yl}(4- hydroxypiperidin-l-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 3 wurden 350 mg (0.70 mmol) der Verbindung aus Beispiel 17A und 186 mg (1.41 mmol, 2.0 eq.) der Verbindung aus Beispiel 33A umgesetzt. Ausbeute: 81 mg (33% d. Th.)
LC-MS (Methode 6B): R, = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 513 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, DMSOd6): δ = 7.46 (d, 2H), 7.33 (d, 2H), 4.67 (d, IH), 4.00-3.90 (m, IH), 3.71 (t, 2H), 3.64-3.52 (m, 2H), 3.51-3.36 (m, 5H), 3.07-2.85 (m, 5H), 2.32 (d, IH), 2.04-1.90 (m, IH), 1.78-1.64 (m, 2H), 1.38-1.23 (m, 2H), 1.07 (t, 3H).
B) Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
Abkürzungen:
BSA Rinderserum-Albumin
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
EGTA Ethylenglykol-glykol-bis-(2-aminoäthyl)-N,N,N',N'-tetra-essigsäure
FCS Fetal CaIf Serum
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)- 1 -piperazinethansulfonsäure
[3H]haTRAP tritiated high affinity thrombin receptor activating peptide
PRP Plättchenreiches Plasma
Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen kann in folgenden Assaysystemen gezeigt werden:
1.) In vitro Assays
l.a) Zellulärer, funktioneller in vitro-Test
Die Identifizierung von Antagonisten des humanen Protease Aktivierten Rezeptors 1 (PAR-I) sowie die Quantifizierung der Wirksamkeit der hier beschriebenen Substanzen erfolgt mit Hilfe einer rekombinanten Zelllinie. Die Zelle leitet sich ursprünglich von einer embryonalen Νierenzelle des Menschen (HEK293; ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, USA) ab. Die Testzelllinie exprimiert konstitutiv eine modifizierte Form des calcium- sensitiven Photoproteins Aequorin, das nach Rekonstitution mit dem Co-Faktor Coelenterazin bei Erhöhungen der freien Calcium-Konzentration im inneren mitochondrialen Kompartiment Licht emittiert (Rizzuto R, Simpson AW, Brini M, Pozzan T.; Nature 1992, 355, 325-327). Zusätzlich exprimiert die Zelle stabil den endogenen humanen PAR-I -Rezeptor sowie den endogenen purinergen Rezeptor P2Y2. Die resultierende PAR-I -Testzelle reagiert auf Stimulation des endogenen PAR-I oder P2Y2-Rezeptors mit einer intrazellulären Freisetzung von Calcium-Ionen, die durch die resultierende Aequorin-Lumineszens mit einem geeigneten Luminometer quantifiziert werden kann (Milligan G, Marshall F, Rees S, Trends in Pharmacological Sciences 1996, 77, 235-237).
Für die Prüfung der Substanz-Spezifität wird deren Wirkung nach Aktivierung des endogenen PAR-I -Rezeptors mit der Wirkung nach Aktivierung des endogenen purinergen P2Y2-Rezeptors verglichen, der den gleichen intrazellulären Signalweg nutzt.
Testablauf: Die Zellen werden zwei Tage (48 Std.) vor dem Test in Kulturmedium (DMEM F 12, ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamine, 20 mM HEPES, 1.4 mM Pyruvat, 0.1 mg/ml Gentamycin, 0.15% Na-Bicarbonat; BioWhittaker Cat.# BE04-687Q; B-4800 Verviers, Belgien) in 384-Loch- Mikrotiterplatten ausplattiert und in einem Zellinkubator (96% Luftfeuchtigkeit, 5% v/v CO2, 37°C) gehalten. Am Testtag wird das Kulturmedium durch eine Tyrodelösung (in mM: 140 Natriumchlorid, 5 Kaliumchlorid, 1 Magnesiumchlorid, 2 Calciumchlorid, 20 Glucose, 20 HEPES), das zusätzlich den Co-Faktor Coelenterazin (25 μM) und Glutathion (4 mM) enthält, ausgetauscht und die Mikrotiterplatte anschließend für weitere 3-4 Stunden inkubiert. Dann werden die Testsubstanzen auf die Mikrotiterplatte pipettiert und 5 Minuten nach Übertragung der Testsubstanzen in die Wells der Mikrotiterplatte wird die Platte in das Luminometer transferiert, eine PAR-I -Agonist-Konzentration, die EC5O entspricht, zugeschossen und sofort das resultierende Lichtsignal im Luminometer gemessen. Zur Unterscheidung einer Antagonist- Substanzwirkung von einer toxischen Wirkung wird unmittelbar anschließend der endogene purinerge Rezeptor mit Agonist aktiviert (ATP, 10 μM Endkonzentration) und das resultierende Lichtsignal gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle A gezeigt:
Tabelle A:
l.b) PAR-I Rezeptor Bindungsassay
Thrombozytenmembranen werden mit 12 nM [3H]haTRAP und Testsubstanz in verschiedenen Konzentrationen in einem Puffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM EGTA, 0.1% BSA) bei Raumtemperatur für 80 min inkubiert. Danach wird der Ansatz auf eine Filterplatte übertragen und zweimal mit Puffer gewaschen. Nach Zugabe von Scintillationsflüssigkeit wird die Radioaktivität auf dem Filter in einem beta-Counter vermessen.
l.c) Thrombozytenaggregation in Plasma
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt,
Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natrium Citrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140g für 20 min zentrifugiert.
Für die Aggregationsmessungen werden Aliquots des plättchenreichen Plasmas mit aufsteigenden Konzentrationen an Prüfsubstanz 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Aggregation durch Zugabe eines Thrombin-Rezeptor Agonisten (TRAP6, SFLLRN) in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G.V.R., Cross MJ. , The
Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168, 178-195) bei 37°C bestimmt. Die SFLLRN-
Konzentration, die zur maximalen Aggregation führt, wird gegebenenfalls jeweils für jeden Spender individuell ermittelt.
Zur Berechnung der inhibitorischen Wirkung wird die maximale Zunahme der Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach Zugabe des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit von Prüfsubstanz ermittelt und die Inhibition berechnet. Aus den Inhibitionskurven wird die Konzentration berechnet, die die Aggregation zu 50% hemmt.
l.d) Thrombozytenaggregation in Puffer
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumeitrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumeitrat, 20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid) zugegeben und 10 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet wird mit Wasch- Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Die Thrombozyten werden in Inkubations-Puffer resuspendiert und auf 200000 Z/μl eingestellt. Vor Versuchsbeginn wird Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, Endkonzentration je 2mM (Stammlösung 2M, 1 :1000 Verdünnung) zugegeben. Besonderheit: bei ADP-induzierter Aggregation wird nur Calciumchlorid zugegeben. Folgende Agonisten können eingesetzt werden: TRAP6-Trifluoracetat- Salz, Kollagen, Humanes α-Thrombin und U-46619. Die Konzentration des Agonisten wird zu jedem Spender ausgetestet.
Testdurchführung: Es werden 96er-Loch Mikrotiterplatten verwendet. Die Prüfsubstanz wird in DMSO verdünnt und 2 μl je Loch vorgelegt. 178 μl Thrombozyten-Suspension werden zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. 20 μl Agonist werden zugegeben und die
Messung im Spectramax, OD 405 nm, sofort gestartet. Die Kinetik wird in 11 Messungen von je 1 Minute bestimmt. Zwischen den Messungen wird 55 Sekunden geschüttelt.
l.e) Thrombozytenaggregation in fibrinogendepletiertem Plasma
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumeitrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen.
Herstellung von fibrinogendepletiertem Plasma: Zur Gewinnung von plättchenarmem Plasma wird das Citrat- Vollblut bei 140g für 20 min abzentrifugiert. Das plättchenarme Plasma wird im Verhältnis 1 :25 mit Reptilase (Roche Diagnostic, Deutschland) versetzt und vorsichtig invertiert. Es folgen 10 min Inkubation bei 37°C im Wasserbad mit direkt folgender Inkubation auf Eis für 10 min. Das Plasma-Reptilase Gemisch wird bei 1300g für 15 min zentrifugiert und der Überstand (fibrinogendepletiertes Plasma) wird gewonnen.
Thrombozyten-Isolierung: Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat- Vollblut bei 140g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumeitrat, 20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid) zugegeben und 10 Minuten bei 1300g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet wird mit Wasch- Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1300g zentrifugiert. Die Thrombozyten werden in Inkubations-Puffer resuspendiert und auf 400000 Z/μl eingestellt und Calciumchloridlösung mit einer Endkonzentration von 5 mM (l/200Verdünnung) zugegeben.
Für die Aggregationsmessungen werden Aliquots (98 μl fibrinogendepletiertes Plasma und 80 μl Thrombozytensuspension) mit aufsteigenden Konzentrationen an Prüfsubstanz 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die Aggregation durch Zugabe von humanem alpha Thrombin in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G.V.R., Cross M.J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168, 178-195) bei 37°C bestimmt. Die alpha Thrombin Konzentration, die gerade eben zur maximalen Aggregation führt, wird jeweils für jeden Spender individuell ermittelt.
Zur Berechnung der inhibitorischen Wirkung wird die Zunahme der maximalen Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach Zugabe des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit von Prüfsubstanz ermittelt und die Inhibition berechnet. Aus den Inhibitionskurven wird die Konzentration berechnet, die die Aggregation zu 50% hemmt.
l.f) Stimulation gewaschener Thrombozyten und Analyse in der Durchflusszytometrie
Isolierung gewaschener Thrombozyten: Humanes Vollblut wird mittels Venenpunktion von freiwilligen Spendern gewonnen und in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) überfuhrt, die als Antikoagulans Natriumeitrat enthalten (1 Teil Natriumeitrat 3.8% + 9 Teile Vollblut). Die Monovetten werden bei 900 Umdrehungen pro Minute und 4°C über einen Zeitraum von 20 Minuten zentrifugiert (Heraeus Instruments, Deutschland; Megafuge 1.0RS). Das plättchenreiche Plasma wird vorsichtig abgenommen und in ein 50 ml-Falconröhrchen überführt. Nun wird das Plasma mit ACD-Puffer (44 mM Natriumeitrat, 20.9 mM Zitronensäure, 74.1 mM Glucose) versetzt. Das Volumen des ACD-Puffers entspricht einem Viertel des Plasmavolumens. Durch zehnminütige Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen und 4°C werden die Thrombozyten sedimentiert. Danach wird der Überstand vorsichtig abdekantiert und verworfen. Die präzipitierten Thrombozyten werden zunächst vorsichtig mit einem Milliliter Waschpuffer (113 mM Natriumchlorid, 4 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 24 mM Natriumdihydrogenphosphat, 4 mM Kaliumchlorid, 0.2 mM Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-NN,N'N'-tetraessigsäure, 0.1% Glucose) resuspendiert und dann mit Waschpuffer auf ein Volumen aufgefüllt, das dem der Plasmamenge entspricht. Der Waschvorgang wird ein zweites Mal durchgeführt. Nachdem die Thrombozyten durch eine erneute zehnminütige Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen und 4°C präzipitiert worden sind, werden sie vorsichtig in einem Milliliter Inkubationspuffer (134 mM Natriumchlorid, 12 mM Natriumhydrogencarbonat, 2.9 mM Kaliumchlorid, 0.34 mM Natriumdihydrogencarbonat, 5 mM HEPES, 5 mM Glucose, 2 mM Calciumchlorid und 2 mM Magnesiumchlorid) resuspendiert und mit Inkubationspuffer auf eine Konzentration von 300.000 Thrombozyten pro μl eingestellt.
Färbung und Stimulierung der humanen Thrombozyten mit humanem α-Thrombin in Gegenwart oder Abwesenheit eines PAR-I -Antagonisten: Die Thrombozytensuspension wird mit der zu prüfenden Substanz bzw. des entsprechenden Lösungsmittels für 10 Minuten bei 37°C vorinkubiert (Eppendorf, Deutschland; Thermomixer Comfort). Durch Zugabe des Agonisten (0.5 μM bzw. 1 μM α-Thrombin; Kordia, Niederlande, 3281 NIH Units/mg; oder 30μg/ml Thrombin reeeptor activating peptide (TRAP6); Bachern, Schweiz) bei 37° und unter Schütteln von 500 Umdrehungen pro Minute wird die Thrombozytenaktivierung ausgelöst. Zu den Zeitpunkten 0, 1, 2.5, 5, 10 und 15 Minuten wird jeweils ein Aliquot von 50μl entnommen und in einen Milliliter einfach-konzentrierte CellFix™-Lösung (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) überführt. Zur Fixierung der Zellen werden sie 30 Minuten bei 4°C in der Dunkelheit inkubiert. Durch eine zehnminütige Zentrifugation bei 600 g und 4°C werden die Thrombozyten präzipitiert. Der Überstand wird verworfen und die Thrombozyten werden in 400 μl CellWash™ (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) resuspendiert. Ein Aliquot von 100 μl wird in ein
neues FACS-Röhrchen überfuhrt, lμl des thrombozyten-identifizierenden Antikörpers und 1 μl des aktivierungszustands-detektierenden Antikörpers werden mit CellWash™ auf ein Volumen von 100 μl aufgefüllt. Diese Antikörperlösung wird dann zur Thrombozytensuspension gegeben und 20 Minuten bei 4°C in der Dunkelheit inkubiert. Im Anschluss an die Färbung wird das Ansatz- volumen durch Zugabe von weiteren 400 μl CellWash™ erhöht.
Zur Identifizierung der Thrombozyten wird ein fluorescein-isothiocyanat-konjugierter Antikörper eingesetzt, der gegen das humane Glykoprotein IIb (CD41) gerichtet ist (Immunotech Coulter, Frankreich; Cat. No. 0649). Mit Hilfe des phycoerythrin-konjugierten Antikörpers, der gegen das humane Glykoprotein P-Selektin (Immunotech Coulter, Frankreich; Cat. No. 1759) gerichtet ist, lässt sich der Aktivierungszustand der Thrombozyten bestimmen. P-Selektin (CD62P) ist in den α- Granula ruhender Thrombozyten lokalisiert. Es wird jedoch nach in-vitro- bzw. in-vivo- Stimulierung zur äußeren Plasmamembran translokalisiert.
Durchflusszytometrie und Auswertung der Daten: Die Proben werden im Gerät FACSCalibur™ Flow Cytometry System der Firma Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA, vermessen und mit Hilfe der Software CellQuest, Version 3.3 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) ausgewertet und graphisch dargestellt. Das Maß der Thrombozytenaktivierung wird durch den Prozentsatz der CD62P-positiven Thrombozyten (CD41 -positive Ereignisse) bestimmt. Es werden von jeder Probe 10.000 CD41 -positive Ereignisse gezählt.
Die inhibitorische Wirkung der zu prüfenden Substanzen wird anhand der Reduktion der Thrombozytenaktivierung berechnet, die sich auf die Aktivierung durch den Agonisten bezieht.
l.g) Thrombozytenaggregationsmessung mit der Parallelplattenflußkammer
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumeitrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat- Vollblut bei 140g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumeitrat, 20.9 raM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid) zugegeben und 10 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet wird mit Wasch- Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Für die Perfusionsstudie wird eine Mischung von 40% Erythrozyten und 60% gewaschene Thrombozyten (200.000/μl) hergestellt und in HEPES-Tyrode Puffer suspendiert. Die Messung der Thrombozytenaggregation unter Flußbedingungen wird mittels der Parallelplattenflußkammer durchgeführt (B. Nieswandt et al.,
EMBO J. 2001, 20, 2120-2130: C. Weeterings, Arterioscler Thromb. Vase. Biol. 2006, 26, 670- 675; JJ Sixma, Thromb. Res. 1998, 92, 43-46). Glasobjektträger werden mit 100 μl humaner α- Thrombinlösung (gelöst in Tris-Puffer) über Nacht bei 4°C benetzt (α-Thrombin in verschiedenen Konzentrationen, z.B. 10 bis 50 μg/ml) und abschließend mittels 2% BSA abgeblockt.
Rekonstituiertes But wird über die Thrombin-benetzten Glasobjektträger über 5 Minuten mit konstanter Flußrate geleitet (z.B. Scherrate 300/Sekunde) und mittels Mikroskop-Videosystem beobachtet und aufgezeichnet. Die inhibitorische Wirkung der zu prüfenden Substanzen wird morphometrisch anhand der Reduktion der Plättchenaggregatsbildung ermittelt. Alternativ kann die Inhibierung der Plättchenaktivierung durch Durchflußzytometrie, z.B. über p-Selektin- Expression (CD62p), bestimmt werden (siehe Methode 1.f).
2.) Ex vivo Assav
2.a) Thrombozytenaggregation (Primaten, Meerschweinchen)
Meerschweinchen oder Primaten werden in wachem oder narkotisiertem Zustand oral, intravenös oder intraperitoneal mit Prüfsubstanzen in geeigneter Formulierung behandelt. Als Kontrolle werden andere Meerschweinchen oder Primaten in identischer Weise mit dem entsprechenden Vehikel behandelt. Nach je nach Applikationsart unterschiedlich langer Zeit wird aus den tief narkotisierten Tieren Blut durch Punktion des Herzens oder der Aorta gewonnen. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumeitrat 3.8% (1 Teil Citratlösung + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140g für 20 min zentrifugiert.
Die Aggregation wird durch Zugabe eines Thrombin-Rezeptor Agonisten (TRAP6, SFLLRN, 50 μg/ml; Konzentration wird in jedem Experiment je nach Tierart ermittelt) in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G.V.R., Cross M.J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168, 178-195) bei 37°C bestimmt.
Zur Aggregationsmessung wird die maximale Zunahme der Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach Zugabe des Agonisten ermittelt. Die inhibitorische Wirkung der verabreichten Prüfsubstanzen in den behandelten Tieren wird durch die Reduktion der Aggregation, bezogen auf den Mittelwert der Kontrolltiere, berechnet.
2.b) Thrombozytenaggregation und -aktivierungsmessung in der Parallelplatten- flusskammer (Primaten)
Primaten werden in wachem oder narkotisiertem Zustand oral, intravenös oder intraperitoneal mit
Prüfsubstanzen in geeigneter Formulierung behandelt. Als Kontrolle werden andere Tiere in iden- tischer Weise mit dem entsprechenden Vehikel behandelt. Nach je nach Applikationsart unterschiedlich langer Zeit wird aus den Tieren Blut durch Venenpunktion gewonnen. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumeitrat 3.8%
(1 Teil Citratlösung + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Alternativ kann nicht- antikoaguliertes Blut mit Neutralmonovetten (Sarstedt) entnommen werden. In beiden Fällen wird das Blut zur Verhinderung der Fibringerinnselbildung mit Pefabloc FG (Pentapharm,
Endkonzentration 3 mM) versetzt.
Citratvollblut wird vor der Messung durch Zugabe von CaCl2-Lö"sung (Endkonzentration Ca^ 5 mM) rekalzifiert. Nicht-antikoaguliertes Blut wird unmittelbar zur Messung in die Parallelplattenflusskammer eingeleitet. Die Messung der Thrombozytenaktivierung wird in der Kollagen-beschichteten Parallelplattenflußkammer morphometrisch oder durchflusszytometrisch wie in Methode 1.h) beschrieben durchgeführt.
3.) In vivo Assays
3.a) Thrombosemodelle
Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können in Thrombosemodellen in geeigneten Tierspezies, in denen die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation über den PAR-I -Rezeptor vermittelt wird, untersucht werden. Als Tierspezies eignen sich Meerschweinchen und insbesondere Primaten
(vergleiche: Lindahl, A.K., Scarborough, R.M., Naughton, M.A., Harker, L.A., Hanson, S.R.,
Thromb Haemost 1993, 69, 1 196; Cook JJ, Sitko GR, Bednar B, Condra C, Meilott MJ, Feng D-M,
Nutt RF, Shager JA, Gould RJ, Connolly TM, Circulation 1995, 91, 2961-2971; Kogushi M, Kobayashi H, Matsuoka T, Suzuki S, Kawahara T, Kajiwara A, Hishinuma I, Circulation 2003,
108 Suppl. 17, IV-280; Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman
M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304, 855-861).
Alternativ können Meerschweinchen verwendet werden, die mit Inhibitoren von PAR-3 und/oder
PAR-4 vorbehandelt werden (Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244-1254), oder transgene PAR-3- und/oder PAR-4-Knockdown-Meersch weinchen.
3.b) Gerinnungsstörung und Organdysfunktion bei Disseminierter Intravasaler Gerinnung (DIC)
Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können in Modellen für DIC und/oder Sepsis in geeigneten Tierspezies untersucht werden. Als Tierspezies eignen sich Meerschweinchen und insbesondere Primaten, bei Untersuchung der endothelvermittelten Effekte auch Mäuse und Ratten (vergleiche: Kogushi M, Kobayashi H, Matsuoka T, Suzuki S, Kawahara T, Kajiwara A, Hishinuma I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280; Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304, 855-861; Kaneider NC et al., Nat Immunol, 2007, 8, 1303-12; Camerer E et al., Blood, 2006, 707, 3912-21; Riewald M et al., J Biol Chem, 2005, 280, 19808-14.). Alternativ können Meerschweinchen verwendet werden, die mit Inhibitoren von PAR-3 und/oder PAR-4 vorbehandelt werden (Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244-1254), oder transgene PAR-3- und/oder PAR-4-Knockdown-Meerschweinchen.
3.b.l) Thrombin-Antithrombin-Komplexe
Thrombin-Antithrombin-Komplexe (nachfolgend als „TAT" bezeichnet) sind ein Maß für das durch Gerinnungsaktivierung endogen gebildete Thrombin. TAT werden mittels eines ELISA- Assays bestimmt (Enzygnost TAT micro, Dade-Behring). Aus Citratblut wird durch Zentrifugation Plasma gewonnen. Zu 50 μl Plasma wird 50 μl TAT-Probenpuffer gegeben, kurz geschüttelt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden abgesaugt, und das Well 3-malig mit Waschpuffer gewaschen (300 μl/Well). Die Platte wird zwischen den Waschgängen abgeklopft. Es wird Konjugatlösung (100 μl) hinzugegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden abgesaugt, und das Well 3-malig mit Waschpuffer gewaschen (300 μl/Well). Anschließend wird chromogenes Susbtrat hinzugegeben (100 μl/Well), 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, Stopplösung hinzugegeben (100 μl/ Well), und die Farbbildung bei 492 nm gemessen (Saphire Plate reader).
3.b.2) Parameter für Organdysfunktion
Es werden verschiedene Parameter bestimmt, aufgrund derer Rückschlüsse auf die Funktionseinschränkung verschiedener innerer Organe durch die LPS-Gabe gezogen werden können, und der therapeutische Effekt von Prüfsubstanzen abgeschätzt werden kann. Citratblut oder ggf. Lithium-Heparin-Blut wird zentrifugiert, und die Parameter aus dem Plasma bestimmt. Folgende Parameter werden typischerweise erhoben: Kreatinin, Harnstoff, Aspartat- Aminotransferase (AST), Alanin-Aminotransferase (ALT), Gesamt-Bilirubin,
Laktatdehydrogenase (LDH), Gesamt-Protein, Gesamt-Albumin und Fibrinogen. Die Werte geben Aufschluss auf die Funktion der Niere, der Leber, des Kreislaufes und der Gefäße.
3.b.3) Parameter für Entzündung
Das Ausmaß der durch Endotoxin ausgelösten Entzündungsreaktion lässt sich aus dem Anstieg von Entzündungsmediatoren im Plasma nachweisen, z.B. Interleukine (1, 6, 8 und 10), Tumornekrosefaktor alpha oder Monocyte Chemoattractant Protein- 1. Hierzu können ELISAs oder das Luminex-System verwendet werden.
3.c) Antitumor Wirksamkeit
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Modellen für Krebs getestet werden, z.B. im humanen Brustkrebs-Modell in immundefϊzienten Mäusen (vergleiche: S. Even-Ram et. al., Natur e Medicine, 1988, 4, 909-914).
3.d) Antiangiogenetische Wirksamkeit
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in in vitro und in vivo Modellen für Angiogenese getestet werden (vergleiche: Caunt et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2003, 10, 2097- 2102; Haralabopoulos et al., Am J Physiol, 1997, C239-C245; Tsopanoglou et al., JBC, 1999, 274, 23969-23976; Zania et al., JPET, 2006, 318, 246-254).
3.e) Blutdruck- und Herzfrequenz-modulierende Wirkung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in in vivo Modellen hinsichtlich Ihrer Wirkung auf den arteriellen Blutdruck und die Herzfrequenz untersucht werden. Hierzu werden Ratten (z.B. Wistar) mit implantierbaren Radiotelemetrieeinheiten instrumentiert, und es wird ein elektronisches Datenaquisitions- und Speicherungs-System (Data Sciences, MN, USA), bestehend aus einem chronisch implantierbaren Transducer/Transmitter-Einheit in Verbindung mit einem Flüssigkeits-gefüllten Katheter, verwendet. Der Transmitter wird in die Peritonealhöhle implantiert und der Sensor-Katheter in der deszendierenden Aorta positioniert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können appliziert werden (z.B. oral oder intravenös). Vor Behandlung wird der mittlere arterielle Blutdruck und die Herzfrequenz der unbehandelten und behandelten Tiere gemessen und sichergestellt, dass diese im Bereich von ca. 131-142 mmHg und 279-321 Schläge/Minute liegen. PAR-I -aktivierendes Peptid (SFLLRN; z.B. Dosen zwischen 0.1 und 5 mg/kg) wird intravenös verabreicht. Der Blutdruck und die Herzfrequenz werden in verschiedenen Zeitintervallen und Zeiträumen mit und ohne PAR-I -aktivierendem Peptid sowie mit und ohne
einer der erfindungsgemäßen Verbindungen gemessen (vergleiche: Cicala C et al., The FASEB Journal, 2001, 75, 1433-5; Stasch JP et al., British Journal of Pharmacology 2002, 135, 344-355).
4.) Bestimmung der Löslichkeit
Herstellung der Ausgangslösung (Urlösung):
Mindestens 1.5 mg der Testsubstanz werden in ein Wide Mouth 10 mm Screw V-Vial (Fa. Glastechnik Gräfenroda GmbH, Art.-Nr. 8004-WM-H/V15μ) mit passender Schraubkappe und Septum genau eingewogen, mit DMSO zu einer Konzentration von 50 mg/ml versetzt und 30 Minuten mittels eines Vortexers geschüttelt.
Herstellung der Kalibrierlösungen:
Die notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er Deep Well Plate (DWP) mittels eines Liquid-Handling-Roboters. Als Lösemittel wird ein Gemisch aus Acetonitril/Wasser 8:2 verwendet.
Herstellung der Ausgangslösung für Kalibrierlösungen (Stammlösung): 10 μl der Urlösung werden mit 833 μl des Lösemittelgemisch versetzt (Konzentration = 600 μg/ml) und homogenisiert. Es werden von jeder Testsubstanz 1 :100 Verdünnungen in separaten DWP's hergestellt und wiederum homogenisiert.
Kalibrierlösung 5 (600 ng/ml): 30 μl der Stammlösung werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 4 (60 ng/ml): 30 μl der Kalibrierlösung 5 werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 3 (12 ng/ml): 100 μl der Kalibrierlösung 4 werden mit 400 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 2 (1.2 ng/ml): 30 μl der Kalibrierlösung 3 werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 1 (0.6 ng/ml): 150 μl der Kalibrierlösung 2 werden mit 150 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Herstellung der Probenlösungen:
Die notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er DWP mittels eines Liquid-Handling- Roboters. 10.1 μl der Stammlösung werden mit 1000 μl PBS-Puffer pH 6.5 versetzt. (PBS-Puffer pH 6.5: 61.86 g Natriumchlorid, 39.54 g Natriumdihydrogenphosphat und 83.35 g 1 N Natronlauge werden in einen 1 Liter-Messkolben eingewogen, mit Wasser aufgefüllt und ca. 1 Stunde gerührt. Von dieser Lösung werden 500 ml in einen 5 Liter-Messkolben gegeben und mit Wasser aufgefüllt. Es wird mit 1 N Natronlauge auf pH 6.5 einstellen.)
Durchführung:
Die notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er DWP mittels eines Liquid-Handling- Roboters. Die so hergestellten Proben lösungen werden 24 Stunden bei 1400 rpm mittels eines temperierbaren Schüttlers bei 200C geschüttelt. Von diesen Lösungen werden jeweils 180 μl abgenommen und in Beckman Polyallomer Centrifuge Tubes überführt. Diese Lösungen werden 1 Stunde mit ca. 223.000 x g zentrifügiert. Von jeder Probenlösung werden 100 μl des Überstandes abgenommen und 1: 10 und 1 :1000 mit PBS-Puffer 6.5 verdünnt.
Analytik:
Die Proben werden mittels HPLC/MS-MS analysiert. Quantifiziert wird über eine Fünf-Punkt- Kalibrationskurve der Testverbindung. Die Löslichkeit wird in mg/1 ausgedrückt. Analysensequenz: 1) Blank (Lösemittelgemisch); 2) Kalibrierlösung 0.6 ng/ml; 3) Kalibrierlösung 1.2 ng/ml; 4) Kalibrierlösung 12 ng/ml; 5) Kalibrierlösung 60 ng/ml; 6) Kalibrierlösung 600 ng/ml; 7) Blank (Lösemittelgemisch); 8) Probenlösung 1 : 1000; 9) Probenlösung 1 : 10.
HPLC/MS-MSMethode:
HPLC: Agilent 1100, quat. Pumpe (G1311A), Autosampier CTC HTS PAL, Degaser (G1322A) und Säulenthermostat (G1316A); Säule: Oasis HLB 20 mm x 2.1 mm, 25 μ; Temperatur: 400C; Eluent A: Wasser + 0.5 ml Ameisensäure/l; Eluent B: Acetonitril + 0.5 ml Ameisensäure/l; Flussrate: 2.5 ml/min; Stoptime 1.5 min; Gradient: 0 min 95% A, 5% B; Rampe: 0-0.5 min 5% A, 95% B; 0.5-0.84 min 5% A, 95% B; Rampe: 0.84-0.85 min 95% A, 5% B; 0.85-1.5 min 95% A, 5% B.
MS/MS: WATERS Quattro Micro Tandem MS/MS; Z-Spray API-Interface; HPLC-MS- Eingangssplitter 1 :20; Messung im ESI-Mode.
C) Ausfuhrungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Substanzen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überfuhrt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der Verbindung des Beispiels 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke, 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus der Verbindung des Beispiels 1, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min. gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben).
Orale Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der Verbindung des Beispiels 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel (Xanthan gum) (Fa. FMC, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die Verbindung des Beispiels 1 wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6h gerührt.
Intravenös applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.
Herstellung:
Die Verbindung von Beispiel 1 wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.