EP2338054A1 - Kidney cell carcinoma - Google Patents

Kidney cell carcinoma

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Publication number
EP2338054A1
EP2338054A1 EP09783135A EP09783135A EP2338054A1 EP 2338054 A1 EP2338054 A1 EP 2338054A1 EP 09783135 A EP09783135 A EP 09783135A EP 09783135 A EP09783135 A EP 09783135A EP 2338054 A1 EP2338054 A1 EP 2338054A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
markers
polypeptide
absence
amplitude
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09783135A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP09783135A priority Critical patent/EP2338054A1/en
Publication of EP2338054A1 publication Critical patent/EP2338054A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for the diagnosis of renal cell carcinomas.
  • RCC renal cell carcinomas
  • New active ingredients based on tyrosine kinase inhibitors promise to improve the therapy, but an earlier diagnosis is an essential prerequisite for a promising therapy.
  • a typical manifestation of urogenital disease is hematuria. This occurs in various kidney and bladder disorders without providing a clear diagnostic tool for distinguishing, for example, ANCA-associated vasculitis, IgA nephropathy, bladder cancer and kidney cancer.
  • JP 2002022746 relates to a tumor marker which is suitable for the diagnosis of various carcinomas such as brain tumors, ovarian carcinomas, renal carcinomas and the like. It is therefore not a specific marker for RCC.
  • the object can be achieved by a method for the diagnosis of a renal cell carcinoma comprising the step of determining a presence or absence or amplitude of at least three Polypeptidmar- nucleus in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers in Table 1 by values are characterized for the molecular masses and the migration time.
  • the method is suitable for the differential diagnosis between a renal cell carcinoma and other diseases selected from chronic kidney diseases such.
  • RCC Renal Cell Carcinoma
  • Control Normal Control
  • BCa Bladder Carcinoma
  • CKD chronic kidney disease
  • auc Area under the curve
  • At least five, at least six, at least eight, at least ten, at least 20 or at least 50 polypeptide markers, or all markers are used, as defined in Table 1.
  • markers whose molecular weight is 840 daltons or more.
  • markers whose molecular weight is ⁇ 10,000 daltons, more preferably ⁇ 5,000 daltons and even more preferably ⁇ 4,000 daltons.
  • Important is due to the variety of urine existing polypeptides that the markers are determined with sufficient accuracy.
  • the urine sample is a midbeam urine sample.
  • the measurement of the amplitudes and / or presence or absence can be done by a variety of methods. Suitable methods include capillary electrophoresis, HPLC, gas phase ion spectrometry and / or mass spectrometry.
  • capillary electrophoresis is performed prior to measuring the molecular mass of the polypeptide markers.
  • Mass spectrometry is particularly useful for measuring the amplitude or the presence or absence of the polypeptide marker (s).
  • the method preferably has a sensitivity of at least 60% and a specificity of at least 60%.
  • the sensitivity is at least 70% or at least 80% and the specificity is at least 70% or at least 80%.
  • the sample is first separated into at least three, preferably at least 10, partial samples. Subsequently, an analysis of at least three, preferably at least 10 sub-samples to determine a presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in the sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers of Table 1, by the molecular mass and migration time (CE time ) are characterized.
  • CE times given in the tables are based on a 90 cm long glass capillary with an internal diameter (ID) of 50 ⁇ m with a voltage applied of 25 kV, with 20% acetonitrile, 0.25% formic acid as eluent used in water. Details are included in the experimental section.
  • Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives.
  • a specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, ie no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients.
  • Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives.
  • a sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
  • the markers according to the invention make it possible, for each of the indicated diseases for which a diagnosis is desired, to have a specificity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a sensitivity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%, for each of the indicated diseases for which a diagnosis is desired.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary.
  • the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for any CE system used under the conditions indicated.
  • the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. the polypeptides given in the examples (see Example 3).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be. Based on the parameters that determine the polypeptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
  • the polypeptides of the invention are used to diagnose renal cell carcinomas.
  • Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury.
  • the presence or absence of certain polypeptide markers is also used differential diagnosis.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of renal cell carcinoma.
  • polypeptide markers which are typically present in individuals with renal cell carcinoma, but are less common or non-existent in individuals without renal cell carcinoma.
  • polypeptide markers that are present in patients with renal cell carcinoma but are not or only rarely present in patients without renal cell carcinoma.
  • amplitude markers can also be used for diagnosis.
  • Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the level of the signal (the amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • the tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • All groups used consist of at least 20 individual patients or control samples to obtain a reliable mean amplitude.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitudes of the respective polypeptide markers in the patient sample are compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it can be assumed that the presence of renal cell carcinoma, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to assume a renal cell carcinoma.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
  • the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - is included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined can be any individual who may be suffering from renal cell carcinoma.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • not only three polypeptide markers but a larger combination of markers are used to facilitate differential diagnostics.
  • the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the individual.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tear fluid, tissue sample, sperm, vaginal fluid, or stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample can be removed, for example, by means of a catheter or else by means of a urination apparatus as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for the measurement of polypeptide markers. Those skilled in such methods are known.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods, such as, for example, mass spectrometry, or indirect methods, such as, for example, by means of ligands.
  • the sample of the individual e.g. the urine sample
  • pretreated prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) by any suitable means e.g. be cleaned or separated.
  • the treatment may e.g. a purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation.
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are mostly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • TOF time-of-flight
  • electrospray ionization (ESI) the molecules present in solution are sprayed, inter alia, under the influence of high voltage (eg 1-8 kV), forming charged droplets, which become smaller due to evaporation of the solvent.
  • high voltage eg 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of UAS. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents include acetonitrile, methanol, and the like.
  • the solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow when creating a current, cations become
  • Electrophoresis is in the favorable ratio of surface to volume, which allows a good removal of the Joule heat arising during the flow of current. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can advantageously be used for diagnostics.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was collected from healthy donors (peer group), patients with chronic kidney disease or bladder cancer ("disease control") and patients with renal cell carcinoma.
  • proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE).
  • the UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml ultrafiltrate was obtained.
  • CE-MS measurements were performed using a Beckman Coulter capillary electrophoresis system (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water.
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "staking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) prior to sample injection and a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection.
  • the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • the following CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, then 0.1 psi for 2 min, 0.2 psi for 2 min 0.3 psi for 2 min, 0.4 psi for 2 min, 0.5 psi for 17 min, and a total run time of 65 min.
  • the "Nebulizer gas” was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV "REV”, "ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
  • Non-RCC disorders included patients with prostate cancer, nephrovaskulitis and lupus nephritis.
  • the data found were used to identify the markers.
  • a subgroup was used to determine a test kit.
  • FIG. NK normal control
  • BCC bladder cell carcinoma
  • CKD chronic kidney disease 0
  • Figure 2 shows the ROC curves for the training set and the test set.

Abstract

The method for diagnosing a kidney cell carcinoma comprises the step of determining a presence or non-presence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers that are characterized in Table 1 by values for molecular weight and migration time.

Description

Nierenzellkarzinom Renal cell carcinoma
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Diagnose von Nierenzellkarzinomen.The present invention relates to a method and a device for the diagnosis of renal cell carcinomas.
Pro Jahr werden weltweit ca. 210.000 neue Fälle von Nierenkrebs diagnostiziert mit etwa 100.000 Todesfällen pro Jahr. 90% aller Nierentumore sind Nierenzell- karzinome (renal cell Carcinoma = RCC), die sich im Nierenparenchym bilden. Es gibt bisher keine diagnostischen Marker für RCC. Aufgrund der wenig spezifischen oder ganz ausbleibenden Symptome erfolgt die Diagnostik häufig erst im fortgeschrittenen Stadium. Etwa 30% der Patienten weisen bei der Erstdiagnose bereits Metastasen auf. Nach einer deutschen Studie wird bei 61% der Patienten RCC nur zufällig diagnostiziert.Every year, approximately 210,000 new cases of kidney cancer are diagnosed worldwide, with approximately 100,000 deaths per year. 90% of all renal tumors are renal cell carcinomas (RCC), which form in the renal parenchyma. There are no diagnostic markers for RCC. Due to the lack of specific or completely absent symptoms, the diagnosis is often made at an advanced stage. About 30% of patients already have metastases at the time of initial diagnosis. According to a German study, 61% of RCC patients are only diagnosed by chance.
Es besteht daher ein Bedarf nach einer frühen Diagnose, insbesondere, weil me- tastasierende RCC auf übliche Chemotherapie oder Strahlentherapie schlecht anspricht. Die Patienten haben eine mittlere Überlebenszeit von 10 bis 13 Monaten und eine Fünfjahresüberlebensrate von weniger als 10%.There is therefore a need for early diagnosis, in particular because metastatic RCC is poorly responsive to standard chemotherapy or radiation therapy. Patients have a median survival of 10 to 13 months and a five-year survival rate of less than 10%.
Neue Wirkstoffe auf Basis von Thyrosin Kinase Inhibitoren versprechen im Bereich der Therapie eine Verbesserung, trotzdem ist eine frühere Diagnose wesentliche Voraussetzung für eine erfolgversprechende Therapie.New active ingredients based on tyrosine kinase inhibitors promise to improve the therapy, but an earlier diagnosis is an essential prerequisite for a promising therapy.
Eine typische Erscheinung bei Urogenitalerkrankungen ist Hämaturie. Diese tritt bei verschiedenen Nieren- und Blasenerkrankungen auf, ohne ein eindeutiges diagnostisches Mittel zur Unterscheidung von beispielsweise ANCA assoziierter Vaskulitis, IgA Nephropathie, Blasenkrebs und Nierenkrebs zu ermöglichen.A typical manifestation of urogenital disease is hematuria. This occurs in various kidney and bladder disorders without providing a clear diagnostic tool for distinguishing, for example, ANCA-associated vasculitis, IgA nephropathy, bladder cancer and kidney cancer.
B. Perroud et al. : Molecular Cancer 2006, 5: 64 beschreiben Nierenkrebsmarker abgeleitet aus acht Proben von lediglich vier Patienten, sodass die Aussagen statistisch nicht gesichert sind.Perroud et al. : Molecular Cancer 2006, 5: 64 describe renal cancer markers derived from eight samples from just four patients, so the claims are not statistically substantiated.
Medline PMID 15312509, Wu, D. -L. et al. beschreiben vier potenzielle Biomarker.Medline PMID 15312509, Wu, D.-L. et al. describe four potential biomarkers.
In Technology in Cancer Research and Treatment 7 (2008) 155-160 beschreiben die gleichen Autoren ebenfalls diese vier Marker. Als Genauigkeit der Messung wird angegeben : 4020 ± 5, 4637 ± 8, 5070 ± 8 und 5500 ± 11. Mit der Angabe 4020 ±5 werden im Urin mindestens 185 Peptide erfasst, mit den anderen Angaben 280, 289 beziehungsweise 100 Peptide, sodass keine Zuordnung zwischen der Erkrankung und den Massenangaben möglich ist.In Technology in Cancer Research and Treatment 7 (2008) 155-160, the same authors also describe these four markers. The accuracy of the measurement is given as: 4020 ± 5, 4637 ± 8, 5070 ± 8, and 5500 ± 11. Specifying 4020 ± 5, at least 185 peptides are detected in the urine, and 280, 289, and 100 peptides, respectively, so that no Association between the disease and the mass information is possible.
Die Angaben erlauben daher keine eindeutige Identifizierung, die Qualität der Marker ist fragwürdig.The data therefore do not allow a clear identification, the quality of the markers is questionable.
T. Kind et al. in Analytical Biochemistry 363 (2007) 185-195 beschreiben Meta- boliten zur Identifikation von Nierenkrebs. Es handelt sich dabei nicht um Peptide.T. Kind et al. in Analytical Biochemistry 363 (2007) 185-195 describe metabolites for the identification of kidney cancer. These are not peptides.
B. Delahunt et al. 38 (2007) in Human Pathology 1372-1377 beschreiben die Collagenexpression in Nierenkarzinomen. Beschrieben wird nur die Expression im Gewebe, nicht im Urin und es werden auch keine diagnostischen Anwendungen beschrieben. JP 2002022746 betrifft einen Tumormarker, der zur Diagnose verschiedener Karzinome wie Hirntumore, Ovarialkarzinome, Nierenkarzinome usw. geeignet ist. Es handelt sich also nicht um einen spezifischen Marker für RCC.Delahunt et al. 38 (2007) in Human Pathology 1372-1377 describe collagen expression in renal carcinomas. Only the expression in the tissue is described, not in the urine and no diagnostic applications are described. JP 2002022746 relates to a tumor marker which is suitable for the diagnosis of various carcinomas such as brain tumors, ovarian carcinomas, renal carcinomas and the like. It is therefore not a specific marker for RCC.
Es besteht also weiterhin ein Bedarf nach diagnostischen Methoden zur Erkennung von Nierenzellkarzinomen und zur Unterscheidung zwischen Nierenzellkar- zinomen und anderen Erkrankungen.Thus, there is still a need for diagnostic methods for the detection of renal cell carcinomas and to distinguish between renal cell carcinomas and other diseases.
Überraschenderweise kann die Aufgabe gelöst werden durch ein Verfahren zur Diagnostik eines Nierenzellkarzinoms umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmar- kern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.Surprisingly, the object can be achieved by a method for the diagnosis of a renal cell carcinoma comprising the step of determining a presence or absence or amplitude of at least three Polypeptidmar- nucleus in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers in Table 1 by values are characterized for the molecular masses and the migration time.
Tabelle 1 :Table 1 :
Insbesondere eignet sich das Verfahren zur Differentialdiagnostik zwischen einem Nierenzellkarzinom und anderen Erkrankungen ausgewählt aus chronischen Nierenerkrankungen wie z.B. ANCA assoziierter Vaskulitis, IgA Nephropathie, Nierensteinen, und Blasenkrebs.In particular, the method is suitable for the differential diagnosis between a renal cell carcinoma and other diseases selected from chronic kidney diseases such. ANCA associated vasculitis, IgA nephropathy, kidney stones, and bladder cancer.
Zur Auswertung der gemessenen An- oder Abwesenheiten oder Amplituden der Marker kann auf folgende Referenzwerte zurückgegriffen werden :To evaluate the measured presence or absence or amplitude of the markers, the following reference values can be used:
RCC: Renal Cell Carcinom, Control : Normalkontrolle, BCa : Bladder Carcinom, CKD: chronic kidney disease; auc. Area under the CurveRCC: Renal Cell Carcinoma, Control: Normal Control, BCa: Bladder Carcinoma, CKD: chronic kidney disease; auc. Area under the curve
Es wird bevorzugt, dass mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker, oder alle Marker verwendet werden, wie sie in Tabelle 1 definiert sind.It is preferred that at least five, at least six, at least eight, at least ten, at least 20 or at least 50 polypeptide markers, or all markers are used, as defined in Table 1.
Bevorzugt werden Marker verwendet, deren Molekulargewicht 840 Dalton oder mehr beträgt. Als Obergrenze sind bevorzugt Marker geeignet, deren Molekulargewicht < 10000 Dalton, mehr bevorzugt < 5000 Dalton und noch mehr bevorzugt < 4000 Dalton liegt. Wichtig ist aufgrund der Vielzahl der im Urin vorhandenen Polypeptide, dass die Marker hinreichend genau bestimmt werden.Preference is given to using markers whose molecular weight is 840 daltons or more. As an upper limit, preferred are markers whose molecular weight is <10,000 daltons, more preferably <5,000 daltons and even more preferably <4,000 daltons. Important is due to the variety of urine existing polypeptides that the markers are determined with sufficient accuracy.
Bevorzugt handelt es sich bei der Urinprobe um eine Mittelstrahlurinprobe.Preferably, the urine sample is a midbeam urine sample.
Die Messung der Amplituden und/oder An- oder Abwesenheit kann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen. Geeignete Verfahren sind unter anderem Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Mas- senspektrometrie.The measurement of the amplitudes and / or presence or absence can be done by a variety of methods. Suitable methods include capillary electrophoresis, HPLC, gas phase ion spectrometry and / or mass spectrometry.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt. Massenspektrometrie ist zur Messung der Amplitude oder der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker besonders geeignet.In a preferred embodiment, capillary electrophoresis is performed prior to measuring the molecular mass of the polypeptide markers. Mass spectrometry is particularly useful for measuring the amplitude or the presence or absence of the polypeptide marker (s).
Erfindungsgemäß weist das Verfahren bevorzugt eine Sensitivität von mindestens 60% und eine Spezifität von mindestens 60% auf. Bevorzugt liegt die Sensitivität bei mindestens 70% oder mindestens 80% und die Spezifität bei mindestens 70% oder mindestens 80%.According to the invention, the method preferably has a sensitivity of at least 60% and a specificity of at least 60%. Preferably, the sensitivity is at least 70% or at least 80% and the specificity is at least 70% or at least 80%.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt zunächst eine Auftrennung der Probe in mindestens drei, bevorzugt mindestens 10 Teilproben. Anschließend erfolgt eine Analyse von mindestens drei, bevorzugt mindestens 10 Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.In one embodiment of the invention, the sample is first separated into at least three, preferably at least 10, partial samples. Subsequently, an analysis of at least three, preferably at least 10 sub-samples to determine a presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in the sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers of Table 1, by the molecular mass and migration time (CE time ) are characterized.
Die in den Tabellen angegebenen CE-Zeit sind bezogen auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer ange- legten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% A- meisensäure in Wasser verwendet wird. Einzelheiten sind im experimentellen Teil enthalten.The CE times given in the tables are based on a 90 cm long glass capillary with an internal diameter (ID) of 50 μm with a voltage applied of 25 kV, with 20% acetonitrile, 0.25% formic acid as eluent used in water. Details are included in the experimental section.
Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch-Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt. Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch-Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt. Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für jede der angegebenen Erkrankungen, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives. A specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, ie no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients. Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people. The markers according to the invention make it possible, for each of the indicated diseases for which a diagnosis is desired, to have a specificity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
Durch die erfindungsgemäßen Marker ist es möglich, für jede der angegebenen Erkrankungen, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.The markers according to the invention make it possible to achieve a sensitivity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%, for each of the indicated diseases for which a diagnosis is desired.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophore- sis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.The migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined. In this example, a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 μm and an outer diameter (OD) of 360 μm is operated at an applied voltage of 30 kV. The eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Rei- henfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Bei- spielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).It is known that the CE migration time can vary. However, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for any CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. the polypeptides given in the examples (see Example 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,01% oder 0,005%.The characterization of the polypeptides shown in the tables was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a method which was described e.g. in detail by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156). The variation of molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ± 0.01% or 0.005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein. Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.The polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be. Based on the parameters that determine the polypeptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um Nierenzellkarzi- nome zu diagnostizieren.The polypeptides of the invention are used to diagnose renal cell carcinomas.
Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird die An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auch Differentialdiagnostik genutzt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury. In the present case, the presence or absence of certain polypeptide markers is also used differential diagnosis. The presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.A polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent. The threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).In the context of the present invention, the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwe- senheit indikativ für ein Nierenzellkarzinom ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit Nierenzellkarzinom vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne Nierenzellkarzinom seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit Nierenzellkarzinom vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne Nierenzellkarzinom nicht oder nur seltener vorhanden sind.The polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of renal cell carcinoma. Thus, there are polypeptide markers which are typically present in individuals with renal cell carcinoma, but are less common or non-existent in individuals without renal cell carcinoma. Furthermore, there are polypeptide markers that are present in patients with renal cell carcinoma, but are not or only rarely present in patients without renal cell carcinoma.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Ampli- tude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In den Tabellen sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsverfahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben.Additionally or alternatively to the frequency markers (determination of presence or absence), amplitude markers can also be used for diagnosis. Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the level of the signal (the amplitude) in the presence of the signal in both groups. The tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert, wie z.B. in Theodorescu et al, Electrophoresis, 26: 2797-808 (2005), ausgeführt. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Referenzwerten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt.In addition, it is possible to define additional amplitude markers via an alternative normalization method: in this case, all peptide signals of a sample are scaled with a common normalization factor, such as e.g. in Theodorescu et al, Electrophoresis, 26: 2797-808 (2005). For this purpose, a linear regression is formed between the peptide amplitudes of the individual samples and the reference values of all known polypeptides. The increase in the regression line just corresponds to the relative concentration and is used as a normalization factor for this sample.
Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patientenoder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitu- de der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen eines Nierenzellkarzinom auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einem Nierenzellkarzinom auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden.All groups used consist of at least 20 individual patients or control samples to obtain a reliable mean amplitude. The decision to make a diagnosis depends on how high the amplitudes of the respective polypeptide markers in the patient sample are compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it can be assumed that the presence of renal cell carcinoma, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to assume a renal cell carcinoma. The distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden. Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Amplitudenmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.Alternatively, the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group. A frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - is included in the calculation.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an Nierenzellkarzinomen leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.The individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined, can be any individual who may be suffering from renal cell carcinoma. Preferably, the subject is a mammal, most preferably a human.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet, um Differentialdiagnostik zu ermöglichen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch ein- zelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.In a preferred embodiment of the invention, not only three polypeptide markers but a larger combination of markers are used to facilitate differential diagnostics. By comparing a plurality of polypeptide markers, the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the individual.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pank- reassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.The sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body. The sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual. For example, it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tear fluid, tissue sample, sperm, vaginal fluid, or stool sample. Preferably, it is a liquid sample.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.In a preferred embodiment, the sample is a urine sample.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von PoIy- peptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines PoIy- peptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.Urine samples may be known as known in the art. Preferably, in the context of the present invention, a mid-jet urine sample is used. The urine sample can be removed, for example, by means of a catheter or else by means of a urination apparatus as described in WO 01/74275. The presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for the measurement of polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods, such as, for example, mass spectrometry, or indirect methods, such as, for example, by means of ligands.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der PoIy- peptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Tren- nung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Um- kehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.If necessary or desirable, the sample of the individual, e.g. the urine sample, pretreated prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) by any suitable means, and e.g. be cleaned or separated. The treatment may e.g. a purification, separation, dilution or concentration. The methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation. Specific examples include gel electrophoresis, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), capillary electrophoresis, metal affinity chromatography, immobilized metal affinity chromatography (IMAC), lectin affinity chromatography, liquid chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), normal and reverse phase HPLC, cation exchange chromatography, and selective Bonding to surfaces. All of these methods are well known to those skilled in the art and one skilled in the art will be able to select the method depending on the sample used and the method for determining the presence or absence of the polypeptide marker (s). In one embodiment of the invention, the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (>100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrome- tern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät ge- koppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of- flight (TOF) Analysatoren verwendet werden. Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.Preferably, a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample. The mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ± 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer. For example, electrospray ionization (ESI) interfaces are mostly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix. For example, quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used to analyze the resulting ions. In electrospray ionization (ESI), the molecules present in solution are sprayed, inter alia, under the influence of high voltage (eg 1-8 kV), forming charged droplets, which become smaller due to evaporation of the solvent. Finally, so-called Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.In the analysis of the ions by TOF, a certain acceleration voltage is applied, which gives the ions an equal kinetic energy. Then, the time required for the respective ions to travel a drift path through the flight tube is measured very accurately. Since with the same kinetic energy, the speed of the ions depends on your mass, this can thus be determined. TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypep- tid-markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillare- lektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von UAS zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt.A particularly preferred method is CE-MS, in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181). The CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of UAS. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingun- gen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.For CE-MS, the use of volatile solvents is preferred, and it is best to work under essentially salt-free conditions. Examples of suitable solvents include acetonitrile, methanol, and the like. The solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zurCapillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow when creating a current, cations become
Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in derCathode accelerates and anions delay. The advantage of capillaries in the
Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.Electrophoresis is in the favorable ratio of surface to volume, which allows a good removal of the Joule heat arising during the flow of current. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwen- deten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.In capillary electrophoresis, quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 μm are normally used. The used lengths are 30-100 cm. In addition, the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass. The capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution. In addition to the voltage, a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.In a preferred method of measuring polypeptide markers, the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere Polypeptidmarker zur Diagnostik verwendet werden.In the method according to the invention, several polypeptide markers can advantageously be used for diagnostics.
Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.Preferred is the use of at least 5, 6, 8, or 10 markers. In one embodiment, 20 to 50 markers are used.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) beschriebene Ra ndom-Forests- Verfahren unter Verwen- düng eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die Linearkombination von individuellen Signalen dar, wie z.B. in Rossing et al., J Am Soc Nephral. (2008) 19(7) : 1283-90, beschrieben Beispiel:To determine the likelihood of disease using multiple markers, methods known to those skilled in the art may be used. For example, the Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) described R ndom-Forests method using a computer program such. S-Plus or the support vector machines described in the same publication. Another possibility is the linear combination of individual signals, e.g. in Rossing et al., J. Am Soc Nephral. (2008) 19 (7): 1283-90, described Example:
1. Probenvorbereitunq :1. Sample preparation:
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe), Patienten, die an einer chronischen Nierenerkrankung oder an einem Blasenkarzinom („Krank- heitskontrolle") sowie Patienten, die an Nierenzellkarzinom leiden, abgenommen.Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was collected from healthy donors (peer group), patients with chronic kidney disease or bladder cancer ("disease control") and patients with renal cell carcinoma.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μl Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultrafiltrat erhalten wurden. Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und gegen 2,5 ml 0,01% NH4OH entsalzt und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert. 2. CE-MS Messung :For the subsequent CE-MS measurement, proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration. For this purpose, 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS). These 1.4 ml sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE). The UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml ultrafiltrate was obtained. The resulting 1.1 ml of filtrate was then applied to a PD 10 column (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden) and desalted against 2.5 ml of 0.01% NH 4 OH and lyophilized. For CE-MS measurement, the polypeptides were then resuspended with 20 μl of water (HPLC grade, Merck). 2. CE-MS measurement:
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt. Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.CE-MS measurements were performed using a Beckman Coulter capillary electrophoresis system (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D). The CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 μm and a length of 90 cm. The mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the "sheath flow" on the MS, here with a flow rate of 2 μl / min The coupling of CE and MS was performed by a CE-ESI-MS sprayer kit (Agilent Technologies , Waldbronn, DE).
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolu- mens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Sta- cking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert. Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 17 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 65 Minuten.To inject the sample, 1 to max. 6 psi pressure applied, the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume. To concentrate the sample in the capillary, a "staking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) prior to sample injection and a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection. After applying the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions The following CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, then 0.1 psi for 2 min, 0.2 psi for 2 min 0.3 psi for 2 min, 0.4 psi for 2 min, 0.5 psi for 17 min, and a total run time of 65 min.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.In order to obtain the best possible signal intensity on the side of the MS, the "Nebulizer gas" was set to the lowest possible value. The voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V. The remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
3. Standards für die CE-Messunq3. Standards for the CE measurement
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind :To control and calibrate the CE measurement, the following proteins or polypeptides were used, which are characterized under the selected conditions by the CE migration times listed below:
Protein/Polypeptid Migrationszeit Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19,3 minProtein / polypeptide migration time Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE, cat.No .: A1153) 19.3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 19,55minRibonuclease, Sigma, Taufkirchen, DE; Kat.Nr .; R4875 19.55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 19,28 minLysozyme, Sigma, Taufkirchen, DE; Kat.Nr .; L7651 19.28 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYG RQIIS 20,95 min"REV", sequence: REVQSKIGYG RQIIS 20.95 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,49 min"ELM", sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22,62 min"KINCON", sequence: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22.62 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32,2 min"GIVLY" sequence: GIVLYELMTGELPYSHIN 32.2 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.The proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / μl in water. "REV", "ELM", "KINCON" and "GIVLY" represent synthetic peptides.
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorge- hen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertiggestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird.It is known in principle to those skilled in the art that small variations in the migration times can occur in the case of capillary electrophoretic separations. Under the conditions described, however, the migration order does not change. It is readily possible for a person skilled in the art with knowledge of the indicated masses and CE times to assign their own measurements to the polypeptide markers according to the invention. For this he may, for example, proceed as follows: first, he selects one of the polypeptides found in his measurement (peptide 1) and attempts to find one or more matching masses within a time window of the indicated CE time (for example ± 5 min). If he only finds a matching mass within this interval, the assignment is completed. If he finds several suitable masses, one must still make a decision about the assignment. For this purpose, a further peptide (peptide 2) is selected from the measurement and attempts to identify a suitable polypeptide marker, again taking into account a corresponding time window.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im wesentlichen linearer Zusammenhang besteht.If, in turn, several markers can be found with a corresponding mass, the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Comigrierende Peptide comigrieren aber auch unter solchen Bedingungen.Depending on the complexity of the assignment problem, it is obvious to a person skilled in the art to optionally use further proteins from his sample for the assignment, for example ten proteins. Typically, migration times are either lengthened or shortened by certain absolute values, or upsets or knocks occur throughout the course. Comigrating peptides also comigrate under such conditions.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich. Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen. Prüfung der MarkerIn addition, the person skilled in the art can use the methods described by Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), pages 2111-2125. If he plots his measurement in the form of m / z versus migration time using a simple diagram (eg with MS Excel), the line patterns described become visible as well. By counting the lines, a simple assignment of the individual polypeptides is now possible. Other procedures for assignment are possible. In principle, one skilled in the art could also use the above peptides as an internal standard to assign its CE measurements. Testing the markers
Zur Prüfung der Marker wurden Urinproben von Patienten mit RCC analysiert. Als weitere Daten wurden Urinproben zugrundegelegt, die von 289 Patienten mit Nicht-RCC Erkrankungen und 310 gesunden Kontrollen erhalten wurden. 5 Die Nicht-RCC Erkrankungen umfassten unter anderem Patienten mit Prostatakrebs, Nephrovaskulitis und Lupus nephritis.To examine the markers, urine samples from patients with RCC were analyzed. Further data were based on urine samples obtained from 289 patients with non-RCC disorders and 310 healthy controls. 5 Non-RCC disorders included patients with prostate cancer, nephrovaskulitis and lupus nephritis.
Die Proben wurden in zwei Kliniken in Virginia, USA und in Großbritannien gesammelt. Kontrollen kamen ebenfalls aus diesen beiden Kliniken sowie aus Hamburg, Hannover und Aachen. 0 Die Proben wurden der oben beschriebenen Analyse unterzogen.The samples were collected at two clinics in Virginia, USA and the UK. Controls also came from these two clinics as well as from Hamburg, Hanover and Aachen. 0 The samples were subjected to the analysis described above.
Die gefundenen Daten wurden zum einen zur Identifikation der Marker verwendet. Eine Untergruppe wurde zur Bestimmung eines Testsets verwendet.The data found were used to identify the markers. A subgroup was used to determine a test kit.
Auf diese Weise konnten 517 Biomarker identifiziert werden. In einem Testset von 34 RCC Fällen und 29 Kontrollen ergab sich eine Sensitivität von 82,4% 5 und eine Spezifität von 84,2%.In this way 517 biomarkers could be identified. In a test set of 34 RCC cases and 29 controls, the sensitivity was 82.4% 5 and the specificity was 84.2%.
Eine grafische Darstellung der Daten ist in Figur 1 gezeigt. NK = Normalkontrolle BCC = bladder cell Carcinoma CKD = chronische Nierenerkrankung 0 Figur 2 zeigt die ROC Kurven für das Trainingset und das Testset.A graphical representation of the data is shown in FIG. NK = normal control BCC = bladder cell carcinoma CKD = chronic kidney disease 0 Figure 2 shows the ROC curves for the training set and the test set.
Die Marker wurden teilweise sequenziert. Die hier erhaltenen Sequenzinformationen sind in Tabelle 3 angegeben.The markers were partially sequenced. The sequence information obtained here are given in Table 3.
Tabelle 3:Table 3:

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Diagnostik eines Nierenzellkarzinoms umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die PoIy- peptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durchA method for diagnosing a renal cell carcinoma comprising the step of determining an absence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers shown in Table 1
Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.Values for the molecular masses and the migration time are characterized.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Diagnostik eine Differentialdiagnostik zwischen einem Nierenzellkarzinom und einer oder mehrerer Erkrankungen ausgewählt aus chronischen Nierenerkrankungen und Blasenkrebs ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the diagnosis is a differential diagnosis between a renal cell carcinoma and one or more diseases selected from chronic kidney disease and bladder cancer.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker anhand der Referenzwerte der Tabelle 2 erfolgt. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that an evaluation of the determined presence or absence or amplitude of the marker is based on the reference values of Table 2.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.4. The method according to at least one of claims 1 to 3, wherein at least five, at least six, at least eight, at least ten, at least 20 or at least 50 polypeptide markers are used, as defined in claim 1.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Marker 1 , 2, 13, 19, 20, 22, 23, 25, 30, 34, 41 , 44, 45,5. The method according to at least one of claims 1 to 4, character- ized in that the markers 1, 2, 13, 19, 20, 22, 23, 25, 30, 34, 41, 44, 45,
46, 53, 58, 61 , 62, 65, 71 , 73, 74, 78, 85, 86, 87, 96, 98, 99, 101 , 103, 105, 108, 110, 113, 115, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 133, 135, 136, 139, 140, 144, 145, 147, 150, 151 , 163, 168, 174, 175, 176, 182, 184, 187, 188, 199, 201 , 202, 204, 217, 219, 221 , 223, 233, 235, 237, 239, 241 , 247, 251 , 255, 256, 259, 261 , 266, 267, 268, 273, 274, 275, 277, 280, 281 , 283, 286, 291 , 293, 297, 300,46, 53, 58, 61, 62, 65, 71, 73, 74, 78, 85, 86, 87, 96, 98, 99, 101, 103, 105, 108, 110, 113, 115, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 133, 135, 136, 139, 140, 144, 145, 147, 150, 151, 163, 168, 174, 175, 176, 182, 184, 187, 188, 199, 201, 202, 204, 217, 219, 221, 223, 233, 235, 237, 239, 241, 247, 251, 255, 256, 259, 261, 266, 267, 268, 273, 274, 275, 277, 280, 281, 283, 286, 291, 293, 297, 300,
302, 304, 306, 313, 314, 316, 317, 318, 319, 324, 326, 328, 330, 333, 335, 340, 342, 344, 349, 352, 353, 354, 356, 360, 367, 369, 372, 373, 374, 377, 385, 387, 392, 395, 396, 405, 409, 414, 415, 417, 419, 421 , 422, 430, 431 , 433, 447, 448, 457, 462, 467, 490, 491 , 493, 494 verwendet werden.302, 304, 306, 313, 314, 316, 317, 318, 319, 324, 326, 328, 330, 333, 335, 340, 342, 344, 349, 352, 353, 354, 356, 360, 367, 369, 372, 373, 374, 377, 385, 387, 392, 395, 396, 405, 409, 414, 415, 417, 419, 421, 422, 430, 431, 433, 447, 448, 457, 462, 467, 490, 491, 493, 494 are used.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass alle Marker verwendet werden.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that all markers are used.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Urinprobe eine Mittelstrahlurinprobe ist. The method of any one of claims 1 to 6, wherein the urine sample is a midbeam urine sample.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird.8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein capillary electrophoresis, HPLC, gas phase ion spectrometry and / or mass spectrometry is used to determine the presence or absence or amplitude of the polypeptide marker.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein before a measurement of the molecular mass of the polypeptide marker, a capillary electrophoresis is performed.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptid marker und/oder zur Identifizierung der Polypeptidmarker verwendet wird.A method according to any one of claims 1 to 9, wherein mass spectrometry is used to detect the presence or absence of the polypeptide marker (s) and / or to identify the polypeptide markers.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Sensitivität mindestens 60% und die Spezifität mindestens 60% beträgt.11. The method according to at least one of claims 1 to 10, wherein the sensitivity is at least 60% and the specificity at least 60%.
12. Verfahren zur Diagnose eines Nierenzellkarzinoms umfassend die Schritte a) der Auftrennung einer Probe in mindestens drei, bevorzugt mindestens 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens drei, bevorzugt mindestens 10 Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind, die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.12. A method for the diagnosis of a renal cell carcinoma comprising the steps of a) the separation of a sample in at least three, preferably at least 10 subsamples, b) analysis of at least three, preferably at least 10 subsamples for determining a presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in the A sample wherein the polypeptide marker is selected from the markers of Table 1 characterized by molecular masses and migration time (CE time), the CE time, based on a 90 cm long glass capillary having an inner diameter (ID) of 50 μm at an applied voltage of 25 kV, using as eluant 20% acetonitrile, 0.25% formic acid in water.
13. Vorrichtung zur quantitativen Auswertung der in einer Urinprobe gefundenen Polypeptidmarker, wobei die Vorrichtung eine Datenbank umfasst, die Datensätze enthält, die Referen zweiten von Polypeptiden entsprechen und Angaben über die An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptide in Proben von gesunden oder kranken Probanden umfasst, wobei die Datenbank mindestens Angaben hinsichtlich der Identität der Marker und der An- und Abwesenheit oder Amplitude für drei Polypeptidmarker aus Tabelle 1 enthält. 13. An apparatus for quantitatively evaluating polypeptide markers found in a urine sample, the apparatus comprising a database containing data sets corresponding to second reference polypeptides and including information on the presence or absence or amplitude of the polypeptides in samples from healthy or diseased subjects wherein the database contains at least information regarding the identity of the markers and the presence and absence or amplitude for three polypeptide markers from Table 1.
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