EP2255203A2 - Method and marker for diagnosis of tubular kidney damage and illnesses - Google Patents

Method and marker for diagnosis of tubular kidney damage and illnesses

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Publication number
EP2255203A2
EP2255203A2 EP09722298A EP09722298A EP2255203A2 EP 2255203 A2 EP2255203 A2 EP 2255203A2 EP 09722298 A EP09722298 A EP 09722298A EP 09722298 A EP09722298 A EP 09722298A EP 2255203 A2 EP2255203 A2 EP 2255203A2
Authority
EP
European Patent Office
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markers
polypeptide
sample
marker
absence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09722298A
Other languages
German (de)
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Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
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Publication of EP2255203A2 publication Critical patent/EP2255203A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis of tubular damage and diseases of the kidney, e.g. Debre-de-Toni-Fanconi syndrome, Dent's disease, cystinosis, or acquired forms by the action of drugs, e.g. Cytostatics.
  • tubular kidney diseases represent a growing problem in the aftercare of chemotherapeutic cancer patients.
  • tubular kidney damage and disease is reversible in early stages with mild severity, whereas severe damage persists. Therefore, the early detection of tubular damage to the kidney is very important, so that patients can be given early if appropriate, a corresponding therapy.
  • renal tubular damage is generally based on the determination of glucosuria and low molecular weight proteinuria, serum analysis and clinical examination.
  • Hereditary diseases such as cystinosis and Dent's disease can be genetically diagnosed. Although many different proteins in the urine of patients with tubular damage are detectable, these are rarely or rarely used for diagnosis.
  • J Physiol Renal Physiol 2007, 293, F456-F467 describe the use of 2-dimensional gel electrophoresis followed by mass fingerprinting to identify biomarkers for the diagnosis of renal tubular damage.
  • the focus here is on proteins / peptides with a molecular weight> 10 kDa.
  • the procedure used is associated with a high expenditure of time, which prevents the use in the clinical routine.
  • the object is achieved by a method for the diagnosis of tubular kidney diseases comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in a urine sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers shown in Table 1 by values for the molecular masses and the migration time are characterized.
  • the evaluation of the measured polypeptides can be based on the presence or absence or amplitude of the markers taking into account the following limits:
  • Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives. A specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, i. no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients.
  • Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false positives. Negative. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
  • markers according to the invention it is possible to achieve a specificity for tubular kidney damage of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
  • markers according to the invention it is possible to achieve a sensitivity for tubular kidney damage of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. be the polypeptides given in the examples (see example point 3).
  • the characterization of the polypeptides shown in Tables 1 to 4 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a procedure described in detail, for example, by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the variation the molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ⁇ 0.1%, preferably in the range of ⁇ 0.05%, more preferably ⁇ 0.03%, even more preferably ⁇ 0, 01% or 0.005%.
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be.
  • polypeptide markers molecular mass and migration time
  • polypeptides of the invention are used to diagnose tubular kidney disease.
  • Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury.
  • the presence or absence of certain polypeptide markers is also used differential diagnosis.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold value is preferably exceeded if the measured value of the sample for a particular molecule is exceeded. is at least twice as high as that of a blank (eg only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of tubular kidney disease.
  • polypeptide markers which are typically present in individuals with tubular kidney disease, but are less common or non-existent in individuals without tubular kidney disease.
  • amplitude markers can also be used for diagnosis.
  • Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • the tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • amplitude markers via an alternative standardization procedure: in this case, all peptide signals of a sample are scaled with a common normalization factor. For this purpose, a linear regression is formed between the peptide amplitudes of the individual samples and the reference values of all known polypeptides. The increase in the regression line just corresponds to the relative concentration and is used as a normalization factor for this sample. The decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group.
  • the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it can be assumed that the presence of a tubular kidney disease, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to be assumed by a tubular kidney disease.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
  • the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - are included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined may be any individual who may be suffering from tubular renal disease.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tears, tissue, sperm, vaginal fluid, or a stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the subject eg, the urine sample
  • the treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the processes may, for example, be centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic Methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation.
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by means of a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • TOF time-of-flight
  • electrospray ionization the molecules present in solution i.a. under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets which become smaller by evaporation of the solvent.
  • high voltage e.g. 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a sample of the measured nen polypeptide marker produced. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for diagnosis. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, ie show their hydrophilic groups on the inside, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can advantageously be used for diagnosis.
  • Preferred is the use of at least 3, 5, 6, 8, or 10 markers.
  • 20 to 50 markers are used.
  • the at least 1, 3, 5, 6, 8 or 10 markers are selected from the markers 2, 4, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 23 , 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 43, 49, 55, 57, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 68, 69, 70, 73, 77, 80, 82, 86 , 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 108, 111, 114, 115, 116, 121, 126, 131, 132, 134, 138, 139 , 141, 144, 145, 146, 150, 151, 152, 154, 156, 157, 159, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171.
  • the at least 1, 3, 5, 8 or 10 markers are selected from the markers 2, 17, 19, 32, 43, 60, 63, 65, 68, 80, 82, 86, 88, 91, 96, 97, 98, 99, 111, 115, 138, 139, 159, 171.
  • markers selected from the group of markers 17, 19, 32, 60, 63, 68, 72, 82, 86, 91, 97, 99, 111, 138, 139, 171.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) and from patients with kidney disease.
  • proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE).
  • the UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml of ultrafiltrate were obtained.
  • CE-MS measurements were carried out using a capillary electrophoresis system from Beckman Coulter (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and an Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D). carried out.
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the sheath flow at the MS, here with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was performed by a CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies , Waldbronn, DE). To inject the sample, 1 to max. 6 psi pressure applied, the duration of the injection was 99 seconds.
  • CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 32 min at 0.5 psi.
  • the total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas” was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV "REV”, "ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.

Abstract

Method for diagnosis of tubular kidney damages and illnesses comprising the step of determining a presence or non-presence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers that are characterized in Table 1 by values for molecular weight and migration time.

Description

Verfahren und Marker zur Diagnose von tubulären Nierenschäden und -erkrankunqen Methods and markers for the diagnosis of tubular kidney damage and disease
Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von tubulären Schädigungen und Erkrankungen der Niere, wie z.B. das Debre-de-Toni-Fanconi-Syndrom, der Dent- Krankheit, der Zystinose oder erworbener Formen durch die Einwirkung von Medikamenten, wie z.B. Zytostatika.The present invention relates to the diagnosis of tubular damage and diseases of the kidney, e.g. Debre-de-Toni-Fanconi syndrome, Dent's disease, cystinosis, or acquired forms by the action of drugs, e.g. Cytostatics.
Die Anzahl an Patienten mit tubulären Nierenerkrankungen ist in den letzten Jahren durch den Einsatz von teilw. bekannten oder weniger bekannten nephrotoxischen Zytostatika in der Chemotherapie stark angestiegen. Daher stellen tubuläre Nierenerkrankungen bspw. ein wachsendes Problem in die Nachsorge von chemotherapier- ten Krebspatienten dar.The number of patients with tubular kidney disease has risen sharply in recent years through the use of partially known or less well-known nephrotoxic cytostatics in chemotherapy. Therefore, tubular kidney diseases, for example, represent a growing problem in the aftercare of chemotherapeutic cancer patients.
Tubuläre Nierenschäden und -erkrankungen sind in frühen Phasen mit leichter Ausprägung reversibel, wogegen schwere Schädigungen persistieren. Daher ist die Früherkennung tubulärer Schäden der Niere sehr wichtig, so dass die Patienten gegebenenfalls frühzeitig einer entsprechenden Therapie zugeführt werden können.Tubular kidney damage and disease is reversible in early stages with mild severity, whereas severe damage persists. Therefore, the early detection of tubular damage to the kidney is very important, so that patients can be given early if appropriate, a corresponding therapy.
Die Diagnose tubulärer Nierenschäden basiert im Allgemeinen auf der Bestimmung von Glukosurie und niedrig molekularer Proteinurie, Serumanalysen und klinischer Untersuchung. Erbkrankheiten, wie Zystinose und Dent-Krankheit können genetisch diagnostiziert werden. Obwohl viele verschiedene Proteine im Urin von Patienten mit Tubulusschäden detektierbar sind, werden diese nicht oder nur selten zur Diagnose genutzt.The diagnosis of renal tubular damage is generally based on the determination of glucosuria and low molecular weight proteinuria, serum analysis and clinical examination. Hereditary diseases, such as cystinosis and Dent's disease can be genetically diagnosed. Although many different proteins in the urine of patients with tubular damage are detectable, these are rarely or rarely used for diagnosis.
Verschieden Versuche sind unternommen worden, um Proteine im Urin zur Diagnose tubulärer Nierenschäden- und erkrankungen zu charakterisieren.Various attempts have been made to characterize proteins in urine for the diagnosis of tubular renal disease and disease.
Vilasi, A., Cutillas, P. R., Mäher, A.D., Zirah, S. F. et a\., Combined proteomic and metabonomic studies in three genetic forms of the renal Fanconi Syndrome. Am. J Physiol Renal Physiol 2007, 293, F456-F467 beschreiben den Einsatz von 2- dimensionaler Gelelektrophorese gefolgt von Mass-fingerprinting zur Identifizierung von Biomarkern zur Diagnose eines tubulären Nierenschadens. Methodisch liegt der Fokus hier jedoch auf Proteinen/Peptiden mit einem Molekulargewicht > 10 kDa. Das angewendete Verfahren ist mit einem hohen Zeitaufwand verbunden, der den Einsatz in der klinischen Routine verhindert. Zusätzlich kann aufgrund einer fehlenden Validierung der Moleküle in einer geblindeten Studie, wie sie als Standardvorgehen in der klinischen Proteomforschung vorgeschlagen wurden (Mischak, H., Apweiler, R., Banks, R. E., Conaway, M. et ai, Clinical Proteomics: a need to define the field and to begin to set adequate Standards. PROTEOMICS - Clinical Applications 2007, 1, 148-156.) die Spezifität der identifizierten Proteine nicht als gesichert angesehen werden. Daher ist weiterhin Bedarf an einer schnellen und einfachen Methode zur Diagnose, tubulären Nierenerkrankungen.Vilasi, A., Cutillas, PR, Mower, AD, Zirah, SF et al., Combined proteomic and metabonomic studies on three renal forms of the renal Fanconi syndrome. At the. J Physiol Renal Physiol 2007, 293, F456-F467 describe the use of 2-dimensional gel electrophoresis followed by mass fingerprinting to identify biomarkers for the diagnosis of renal tubular damage. However, the focus here is on proteins / peptides with a molecular weight> 10 kDa. The procedure used is associated with a high expenditure of time, which prevents the use in the clinical routine. Additionally, due to a lack of validation of the molecules in a blinded study as proposed as standard in proteomic clinical research (Mischak, H., Apweiler, R., Banks, RE, Conaway, M. et al., Clinical Proteomics: a need PROTEOMICS - Clinical Applications 2007, 1, 148-156) does not consider the specificity of the identified proteins to be certain. Therefore, there is still a need for a quick and easy method of diagnosis, renal tubular diseases.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel für die Diagnose von tubulären Nierenerkrankungen bereit zu stellen.It is therefore the object of the present invention to provide methods and means for the diagnosis of tubular kidney diseases.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnostik von tubulären Nierenerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens eines Polypeptidmarkers in einer Urinprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.The object is achieved by a method for the diagnosis of tubular kidney diseases comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in a urine sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers shown in Table 1 by values for the molecular masses and the migration time are characterized.
Die Auswertung der gemessenen Polypeptide kann anhand der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker unter Berücksichtigung der folgenden Grenzwerte erfolgen :The evaluation of the measured polypeptides can be based on the presence or absence or amplitude of the markers taking into account the following limits:
Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch- Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt.Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives. A specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, i. no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients.
Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch- Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false positives. Negative. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
Durch die erfindungsgemäßen Marker ist es möglich, für tubuläre Nierenschäden eine Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.By the markers according to the invention it is possible to achieve a specificity for tubular kidney damage of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
Durch die erfindungsgemäßen Marker ist es möglich, für tubuläre Nierenschäden eine Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.By the markers according to the invention it is possible to achieve a sensitivity for tubular kidney damage of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.The migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined. In this example, a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 μm and an outer diameter (OD) of 360 μm is operated at an applied voltage of 30 kV. The eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).It is known that the CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. be the polypeptides given in the examples (see example point 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen 1 bis 4 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,1%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,05%, mehr bevorzugt ± 0,03%, noch mehr bevorzugt ± 0,01% oder 0,005%.The characterization of the polypeptides shown in Tables 1 to 4 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a procedure described in detail, for example, by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156). The variation the molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ± 0.1%, preferably in the range of ± 0.05%, more preferably ± 0.03%, even more preferably ± 0, 01% or 0.005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alky- lierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein.The polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be.
Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.Based on the parameters that determine the polypeptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um tubuläre Nierenerkrankungen zu diagnostizieren.The polypeptides of the invention are used to diagnose tubular kidney disease.
Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird die An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auch Differentialdiagnostik genutzt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury. In the present case, the presence or absence of certain polypeptide markers is also used differential diagnosis. The presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.A polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent. The threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Moleku- larmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).In the context of the present invention, the threshold value is preferably exceeded if the measured value of the sample for a particular molecule is exceeded. is at least twice as high as that of a blank (eg only buffer or solvent).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für die tubuläre Nierenerkrankung ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit tubulärer Nierenerkrankung vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne tubuläre Nierenerkrankung seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit tubulärer Nierenerkrankung vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne tubuläre Nierenerkrankung nicht oder nur seltener vorhanden sind.The polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of tubular kidney disease. Thus, there are polypeptide markers which are typically present in individuals with tubular kidney disease, but are less common or non-existent in individuals without tubular kidney disease. Furthermore, there are polypeptide markers that are present in patients with tubular kidney disease, but are not or only rarely present in patients without tubular kidney disease.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In den Tabellen sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsver- fahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben.Additionally or alternatively to the frequency markers (determination of presence or absence), amplitude markers can also be used for diagnosis. Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups. The tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Referenzwerten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt. Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer tubulären Nierenerkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer tubulären Nierenerkrankung auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden.In addition, it is possible to define further amplitude markers via an alternative standardization procedure: in this case, all peptide signals of a sample are scaled with a common normalization factor. For this purpose, a linear regression is formed between the peptide amplitudes of the individual samples and the reference values of all known polypeptides. The increase in the regression line just corresponds to the relative concentration and is used as a normalization factor for this sample. The decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it can be assumed that the presence of a tubular kidney disease, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to be assumed by a tubular kidney disease. The distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.Alternatively, the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Amplitu- denmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.A frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - are included in the calculation.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an tubulären Nierenerkrankungen leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.The individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined, may be any individual who may be suffering from tubular renal disease. Preferably, the subject is a mammal, most preferably a human.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden. Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pankreassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.In a preferred embodiment of the invention not only three polypeptide markers but a larger combination of markers are used. By comparing a plurality of polypeptide markers, the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the individual. The sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body. The sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual. For example, it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tears, tissue, sperm, vaginal fluid, or a stool sample. Preferably, it is a liquid sample.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine U- rinprobe.In a preferred embodiment, the sample is a urine sample.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.Urine samples may be known as known in the art. Preferably, in the context of the present invention, a mid-jet urine sample is used. The urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.The presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifu- gation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D- PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der PoIy- peptidmarker auswählen können.If necessary or desirable, the sample of the subject, eg, the urine sample, may be pretreated and, for example, purified or separated, prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) by any suitable means. The treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration. The processes may, for example, be centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic Methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation. Specific examples thereof are gel electrophoresis, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), capillary electrophoresis, metal affinity chromatography, immobilized metal affinity chromatography (IMAC), lectin affinity chromatography, liquid chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), normal and reverse phase HPLC, cation exchange chromatography, and selective binding Surfaces. All of these methods are well known to those skilled in the art and the person skilled in the art will be able to select the method depending on the sample used and the method for determining the presence or absence of the polypeptide marker (s).
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.In one embodiment of the invention, the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die mas- senspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (>100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.Preferably, a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample. The mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by means of a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ± 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer. For example, electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix. To analyze the For example, quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.In electrospray ionization (ESI), the molecules present in solution i.a. under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets which become smaller by evaporation of the solvent. Finally, so-called Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.In the analysis of the ions by TOF, a certain acceleration voltage is applied, which gives the ions an equal kinetic energy. Then, the time required for the respective ions to travel a drift path through the flight tube is measured very accurately. Since with the same kinetic energy, the speed of the ions depends on your mass, this can thus be determined. TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhan- ced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectro- metry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25:2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemesse- nen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt.A particularly preferred method is CE-MS, in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181). The CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a sample of the measured nen polypeptide marker produced. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for diagnosis. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.For CE-MS, the use of volatile solvents is preferred, and it is best to work under essentially salt-free conditions. Examples of suitable solvents include acetonitrile, methanol and the like. The solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded. The advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden. In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.In capillary electrophoresis, quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 μm are normally used. The used lengths are 30-100 cm. In addition, the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass. The capillaries may be both untreated, ie show their hydrophilic groups on the inside, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution. In addition to the voltage, a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process. In a preferred method of measuring polypeptide markers, the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere PoIy- peptidmarker zur Diagnostik verwendet werden.In the method according to the invention, several polypeptide markers can advantageously be used for diagnosis.
Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 3, 5, 6, 8, oder 10 Markern.Preferred is the use of at least 3, 5, 6, 8, or 10 markers.
In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.In one embodiment, 20 to 50 markers are used.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mindestens 1, 3, 5, 6, 8 oder 10 Marker ausgewählt aus den Markern 2, 4, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 43, 49, 55, 57, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 68,69, 70, 73, 77, 80, 82, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 108, 111, 114, 115, 116, 121, 126, 131, 132, 134, 138, 139, 141, 144, 145, 146, 150, 151, 152, 154, 156, 157, 159, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171.In a preferred embodiment, the at least 1, 3, 5, 6, 8 or 10 markers are selected from the markers 2, 4, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 23 , 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 43, 49, 55, 57, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 68, 69, 70, 73, 77, 80, 82, 86 , 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 102, 103, 108, 111, 114, 115, 116, 121, 126, 131, 132, 134, 138, 139 , 141, 144, 145, 146, 150, 151, 152, 154, 156, 157, 159, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform werden die mindestens 1, 3, 5, 8 oder 10 Marker ausgewählt aus den Markern 2, 17, 19, 32, 43, 60, 63, 65, 68, 80, 82, 86, 88, 91, 96, 97, 98, 99, 111, 115, 138, 139, 159, 171.In a more preferred embodiment, the at least 1, 3, 5, 8 or 10 markers are selected from the markers 2, 17, 19, 32, 43, 60, 63, 65, 68, 80, 82, 86, 88, 91, 96, 97, 98, 99, 111, 115, 138, 139, 159, 171.
Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 1, 3, 5, 6, 8 oder 10 Marker ausgewählt aus der Gruppe der Marker 17, 19, 32, 60, 63, 68, 72, 82, 86, 91, 97, 99, 111, 138, 139, 171.Most preferred is the use of at least 1, 3, 5, 6, 8 or 10 markers selected from the group of markers 17, 19, 32, 60, 63, 68, 72, 82, 86, 91, 97, 99, 111, 138, 139, 171.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65 :2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden. Beispiel:To determine the likelihood of disease using multiple markers, statistical techniques known to those skilled in the art may be used. For example, the Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) using a computer program such as S-Plus or the support vector machines described in the same publication. Example:
1. Probenvorbereitunq :1. Sample preparation:
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an Nierenerkrankungen leiden, abgenommen.Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) and from patients with kidney disease.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μm Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultra- filtrat erhalten wurden.For the subsequent CE-MS measurement, proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration. For this purpose, 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS). These 1.4 ml sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE). The UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml of ultrafiltrate were obtained.
Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (A- mersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und mit 2,5 ml 0,01% NH4OH eluiert und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.The resulting 1.1 ml of filtrate was then applied to a PD 10 column (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden) and eluted with 2.5 ml of 0.01% NH 4 OH and lyophillized. For CE-MS measurement, the polypeptides were then resuspended with 20 μl of water (HPLC grade, Merck).
2. CE-MS Messung :2. CE-MS measurement:
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beck- man Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.The CE-MS measurements were carried out using a capillary electrophoresis system from Beckman Coulter (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and an Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D). carried out.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath- Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI- MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert. Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.The CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 μm and a length of 90 cm. The mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the sheath flow at the MS, here with a flow rate of 2 μl / min The coupling of CE and MS was performed by a CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies , Waldbronn, DE). To inject the sample, 1 to max. 6 psi pressure applied, the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume. To concentrate the sample in the capillary, a "stacking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) before injecting the sample, and then injecting a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.The following CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 32 min at 0.5 psi. The total duration of a separation run was thus 80 minutes.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.In order to obtain the best possible signal intensity on the side of the MS, the "Nebulizer gas" was set to the lowest possible value. The voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V. The remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
3. Standards für die CE-Messunα3. Standards for the CE measurement
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind: Protein/Polypeptid MigrationszeitTo control and calibrate the CE measurement, the following proteins or polypeptides were used, which are characterized under the selected conditions by the CE migration times listed below: Protein / polypeptide migration time
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19,3 minAprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE, cat.No .: A1153) 19.3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 19,55minRibonuclease, Sigma, Taufkirchen, DE; Kat.Nr .; R4875 19.55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 19,28 minLysozyme, Sigma, Taufkirchen, DE; Kat.Nr .; L7651 19.28 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQIIS 20,95 min"REV", sequence: REVQSKIGYGRQIIS 20.95 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,49 min"ELM", sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22,62 min"KINCON", sequence: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22.62 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32,2 min"GIVLY" sequence: GIVLYELMTGELPYSHIN 32.2 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.The proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / μl in water. "REV", "ELM", "KINCON" and "GIVLY" represent synthetic peptides.
Die Molekularmassen der Peptide sowie die in der MS sichtbaren m/z Verhältnisse der einzelnen Ladungszustände sind in der folgenden Tabelle angegeben : The molecular masses of the peptides and the m / z ratios of the individual charge states that are visible in the MS are given in the following table:
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertig gestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird. It is known in principle to those skilled in the art that small variations in the migration times can occur in the case of capillary electrophoretic separations. Under the conditions described, however, the migration order does not change. It is readily possible for a person skilled in the art with knowledge of the indicated masses and CE times to assign their own measurements to the polypeptide markers according to the invention. For this he can, for example, proceed as follows: first, he selects one of the polypeptides found in his measurement (peptide 1) and attempts to find one or more matching masses within a time window of the indicated CE time (for example ± 5 min). If he only finds a matching mass within this interval, the assignment is completed. If he finds several suitable masses, one must still make a decision about the assignment. For this purpose, a further peptide (peptide 2) is selected from the measurement and attempts to identify a suitable polypeptide marker, again taking into account a corresponding time window.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im Wesentlichen linearer Zusammenhang besteht.If, in turn, several markers can be found with a corresponding mass, the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Co-migrierende Peptide co-migrieren aber auch unter solchen Bedingungen.Depending on the complexity of the assignment problem, it is obvious to a person skilled in the art to optionally use further proteins from his sample for the assignment, for example ten proteins. Typically, migration times are either lengthened or shortened by certain absolute values, or upsets or knocks occur throughout the course. Co-migrating peptides also co-migrate under such conditions.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich.In addition, the person skilled in the art can use the methods described by Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), pages 2111-2125. If he uses a simple diagram (eg with MS Excel) his Plotting measurement in the form of m / z versus migration time, the line patterns described are also visible. By counting the lines, a simple assignment of the individual polypeptides is now possible.
Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen. Other procedures for assignment are possible. In principle, one skilled in the art could also use the above peptides as an internal standard to assign its CE measurements.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Diagnostik von tubulären Nierenerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens eines Polypeptidmarkers in einer Urinprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.A method for the diagnosis of tubular kidney disease, comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in a urine sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers characterized in Table 1 by values for molecular masses and migration time are.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker anhand folgender in Tabelle 2 aufgeführter Referenzwerte erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that an evaluation of the determined presence or absence or amplitude of the markers is based on the following listed in Table 2 reference values.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei mindestens drei, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.3. The method according to at least one of claims 1 to 2, wherein at least three, at least five, at least six, at least eight, at least ten, at least 20 or at least 50 polypeptide markers are used, as defined in claim 1.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe eines Individuums eine Mittelstrahlurinprobe.The method of any one of claims 1 to 3, wherein the sample of an individual is a midbeam urine sample.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein capillary electrophoresis, HPLC, gas phase ion spectrometry and / or mass spectrometry is used to determine the presence or absence or amplitude of the polypeptide marker.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein before a measurement of the molecular mass of the polypeptide marker, a capillary electrophoresis is performed.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird. A method according to any one of claims 1 to 6, wherein mass spectrometry is used to detect the presence or absence of the polypeptide marker (s).
8. Verwendung von mindestens drei Polypeptidmarker ausgewählt aus den Markern gemäß Tabelle 1, die durch die Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert ist, zur Diagnostik von tubulären Nierenerkrankungen.8. Use of at least three polypeptide markers selected from the markers according to Table 1, which is characterized by the values for the molecular masses and the migration time, for the diagnosis of tubular kidney diseases.
9. Verfahren zur Diagnose von tubulären Nierenerkrankungen umfassend die Schritte9. A method of diagnosing tubular kidney disease comprising the steps
a) der Auftrennung einer Probe in mindestens drei, bevorzugt 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens fünf Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmar- kers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.a) the separation of a sample into at least three, preferably 10 subsamples, b) analysis of at least five subsamples for determining an absence or amplitude of at least one Polypeptidmar- kers in the sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers of Table 1 characterized by molecular masses and migration time (CE time).
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei mindestens 10 Teilproben gemessen werden.10. The method of claim 9, wherein at least 10 subsamples are measured.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.11. The method according to at least one of claims 1 to 10, characterized in that the CE time is based on a 90 cm long glass capillary having an inner diameter (ID) of 50 microns at an applied voltage of 25 kV, being used as the eluent 20% Acetonitrile, 0.25% formic acid in water is used.
12. Markerkombination, umfassend mindestens 10 Marker ausgewählt aus den Markern der Tabelle 1, die durch Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.12. A marker combination comprising at least 10 markers selected from the markers of Table 1 characterized by molecular masses and migration time (CE time).
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 bis 11, wobei die Sensitivität mindestens 60% und der Spezifität mindestens 40% beträgt. 13. The method according to at least one of claims 1 to 7 or 9 to 11, wherein the sensitivity is at least 60% and the specificity at least 40%.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 bis 11 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Masse der Marker < 5 kDa ist. 14. The method according to at least one of claims 1 to 7 or 9 to 11 or 13, characterized in that the mass of the marker <5 kDa.
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