EP2321646A1 - Method for characterizing, in particular for quantifying, molecular markers that are intracellularly absorbed from tissues by blood macrophages that are recirculated from the tissues into the circulatory system - Google Patents

Method for characterizing, in particular for quantifying, molecular markers that are intracellularly absorbed from tissues by blood macrophages that are recirculated from the tissues into the circulatory system

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Publication number
EP2321646A1
EP2321646A1 EP09781481A EP09781481A EP2321646A1 EP 2321646 A1 EP2321646 A1 EP 2321646A1 EP 09781481 A EP09781481 A EP 09781481A EP 09781481 A EP09781481 A EP 09781481A EP 2321646 A1 EP2321646 A1 EP 2321646A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
clone
polyclonal
blood
cells
beads
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09781481A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Wolfang Brozek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Synmed Research GmbH
SynMed Res GmbH
Original Assignee
Synmed Research GmbH
SynMed Res GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Synmed Research GmbH, SynMed Res GmbH filed Critical Synmed Research GmbH
Publication of EP2321646A1 publication Critical patent/EP2321646A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages

Definitions

  • the invention relates to a method for the characterization, in particular quantification of phagocytosed, intracellular molecular markers of blood mononuclear leukocytes, in particular blood macrophages according to the preamble of patent claim 1 and an analysis arrangement for carrying out the method according to the preamble of patent claim 13.
  • CD14 is a cell surface protein that is typically expressed by monocytes and macrophages.
  • the cell-surface protein CD16 allows cells to bind to the constant (Fc) region of IgG.
  • Antibodies it is present in two isoforms: as CD16a (FcyRIIIA) on the surface of NK cells, macrophages and so-called activated monocytes, and as CD16b (FcyRIIIB) on neutrophil granulocytes.
  • CD16a FcyRIIIA
  • CD16b FcyRIIIB
  • activate monocytes of the blood, which express both CD14 and CD16.
  • Previous opinion has simply considered CD14 / CD16 positive (CD14 + CD16 + ) cells of the blood as “activated monocytes” that have not (yet) migrated into the tissue, for example at the site of inflammation, infection, or tumor (Ziegler-Heitbrock, L., 2007.
  • the CD14 + CD16 + blood monocytes their role in infection and inflammation, J. Leukocyte Biol., 81, 584-592).
  • activated monocytes are macrophages recirculated from the tissue into the bloodstream and have tissue components in their intracellular phagosomes, e.g. Epithelial proteins derived, for example, from the site of inflammation or a tumor (Herwig, R., Horninger, W., Rehder, P. et al., 2005.
  • CD14 + CD16 + blood monocytes their role in infection and inflammation., J. Leukocyte Biol. 584-592
  • a total loss of CD14 Bazil and Strominger, 1991: Shedding as a mechanism of down modulation of CD14 on stimulated human monocytes, J. Immunol., 147, 1567-1574).
  • PSA prostate-specific antigen
  • imPSA Intracellular Macrophage PSA
  • the basis of the flow cytometric characterization of cells is the labeling of the target molecules to be detected (the "antigens") with fluorescent dye-labeled antibodies.
  • the cells are passed in suspension by hydrodynamic focusing on a bundled laser beam of suitable wavelength. This excites the fluorescent dye to emit energy in the form of photons registered by a detector.
  • a disadvantage of this method lies in the lack of quantification of the amount of bound antibodies and thus in a lack of information about the amount of detected antigen.
  • Another disadvantage is the considerable apparatus and financial expense that causes the operation of a flow cytometer.
  • the object of the invention is to provide an improved, simplified and cost-effective method and an analysis arrangement, with their help a characterization of mononuclear leukocytes of the blood, especially blood macrophages, including their phagocytosed molecular marker from tissue quantitatively, in particular by a representation as Mass unit per cell number is possible.
  • the object is achieved by a method for the characterization, in particular quantification, of molecular markers (intracellularly taken up from tissue) by blood macrophages recirculated from the tissue into the bloodstream, wherein the following steps are carried out:
  • An inventive principle consideration is molecular markers, z.
  • epithelial proteins in phagocytic mononuclear cells of the bloodstream, namely in blood macrophages detect, and it is possible by means of the inventive method in an advantageous manner to lead a direct and specific and quantitative detection.
  • Marker fragments as defined above for imPSA, macrophages taken in the tissue and at least partially phagocytosed molecules that are detected intracellularly in blood macrophages.
  • the selection and / or enrichment and / or separation of the blood macrophages is carried out by means of a positive selection using antibodies directed against the surface marker CD16.
  • a consideration of all CD16-expressing cells is thus carried out in order to ensure detection of all activated monocytes / macrophages.
  • a positive selection is carried out using antibodies directed against the surface marker CD14.
  • CD14 + selection offers the advantage according to the invention that the CD14 + population, which is large compared to the CD16 + population, has undifferentiated monocytes which have no CD16 surface markers and are not the subject of the method according to the invention for characterizing, in particular quantifying, tissue recirculated into the bloodstream, blood macrophages intracellularly taken up by tissue molecular marker (s) are already excluded in a first step.
  • NK cells NK Cells expressed surface proteins CD56 or CD57 or CD161 can be connected.
  • a negative selection for the exclusion of cells with the surface markers CD56 and / or CD57 and / or CD161 using antibodies which are directed against the surface markers CD56 and / or CD57 and / or CD161.
  • Such a negative selection can be carried out as a separate selection step or, according to another advantageous Embodiment also be made simultaneously with a positive selection of CD16 + cells, as exemplified below.
  • the invention provides that a positive or negative selection is carried out using, preferably reversibly, coupled magnetic "beads" to separate the respective selected cells in a very simple manner by means of a suitable magnet.
  • a quantitative determination of a mononuclear leukocyte populations in an Elisa plate preferably by measuring the lactate dehydrogenase activity by Elisa plate reader, more preferably in the same Elisa plate, in which a qualitative and quantitative Determination of molecular markers, in particular non-blood macrophage antigens, is provided.
  • a quantitative determination of the amount of non-blood macrophage tissue-derived molecular markers present is carried out by means of Elisa plate reader and / or chemiluminescence measuring device, according to the invention as molecular markers, especially tissue markers and / or serological markers abnormal DNA methylation, AFP ( ⁇ -1-fetoprotein), AHCY (S-adenosyl-homocysteine hydrolase), AMY2 (pancreatic amylase), CA 15-3 (synonyms: MUCl, EMA, CD227), CA 19-9, CA 50, CA 72-4 (synonym: TAG72), CA 125 (synonym: MUC16), calcitonin, calprotectin, CCSA-2 (colon cancer-specific antigen-2), CCSP-2
  • whole blood is first of all mixed with an anti-caking and / or coagulating agent, for example heparin or another suitable anti-coagulant, eg. As citrate solution, added.
  • an anti-caking and / or coagulating agent for example heparin or another suitable anti-coagulant, eg. As citrate solution, added.
  • Perforation or lysis of the macrophages or macrophage-containing leukocyte populations is also carried out according to the invention, for example by means of a saponin treatment or a treatment with Triton solution.
  • non-blood macrophage antigens optionally conjugated with biotin, HRP (horseraddish peroxidase), AP (alkaline phosphatase), or luminescent, antibodies, in particular the immunoglobulin class G (IgG) and Fab or F (ab) 2 fragments, and / or aptamers, in particular selected from: anti-mouse IgG (polyclonal), anti-rabbit IgG (polyclonal), anti-goat IgG (polyclonal), anti-rat IgG (polyclonal), anti -Selective IgG (polyclonal), anti-AFP (clone AFP-Ol), anti-AFP (clone AFP-II), anti-AFP (clone 4A3), anti-AFP (clone 5H7), anti-AFP (clone M803209) , anti-AFP (clone M0151611), anti-AFP (clone M803209) , anti
  • anti-cystatin B (clone B-02), anti-cystatin B (clone RJMW-2E7), anti-cystatin B (polyclonal), anti-DDH (clone TlOl), anti-DDH (polyclonal), anti-cystatin DKK-1 (clone 141135), anti-DKK-1 (polyclonal), anti-GP73 / GOLPH2 (clone YA-14), anti-GP73 / GOLPH2 (clone 5B10), anti-GP73 / GOLPH2 (polyclonal), anti- HE4 (clone C-12), anti-HE4 (polyclonal), anti-HER2 / neu (clone 10C7), anti-HER2 / neu (clone 191924), anti-HER2 / neu (clone N3 / D10), anti-HER2 / neu (polyclonal), anti-HSP-27 (clone G3.1), anti
  • a positive selection against CD14 + cells or negative selection this is followed by another separation step characterized by positive selection of the cells using an antibody directed against the cell surface protein CD16, which is either coupled to magnetic beads or is coated on an Elisa plate.
  • a further positive selection of the cells against CD14 + cells is followed by an antibody which is either coupled to magnetic beads or coated on an Elisa plate, or it follows a negative Selection against CD56 + or CD57 + or CD161 + NK cells using a magnetic antibody directed against the cell surface protein CD56 or CD57 or CD161.
  • positive selection against CD16 + cells and negative selection against CD56 + or CD57 + or CD161 + NK cells can be done simultaneously in one step.
  • further selection steps may alternatively be omitted.
  • the now separated and enriched mononuclear leukocytes are subsequently destroyed by treatment with a perforation solution and / or a cell lysis reagent.
  • a perforation solution and / or a cell lysis reagent can be previously, either immediately before the lysis of the cells or immediately after
  • the quantification of the molecular marker contained in the cells is possible.
  • the activity of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) in the lysate is determined in an Elisa plate for the purpose of determining the number of cells used, wherein the amount of mononuclear leucocytes present can be calculated by means of a standard.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • antibodies are specifically directed against the respective molecular marker (s) and / or against the respective molecular antibodies directed antibody (s), preferably in the same Elisa plate, in which the cell quantification was carried out by measuring the LDH activity, an enzymatic color reaction or a chemiluminescent signal is triggered in proportion to the amount of marker studied.
  • Elisa plate reader or chemiluminescence detector the respective molecular marker can be quantified by a standard.
  • the object according to the invention is further achieved by an analysis arrangement for carrying out the method according to the invention.
  • the method of analysis according to the invention comprises a device for adding an agent which inhibits the clumping and / or coagulation of whole blood (eg heparin, citrate solution, or another suitable anti-coagulant); a device for performing a preselection or selection and enrichment of all mononuclear leucocytes present in the blood sample by density gradient centrifugation;
  • an agent which inhibits the clumping and / or coagulation of whole blood eg heparin, citrate solution, or another suitable anti-coagulant
  • a device for performing a preselection or selection and enrichment of all mononuclear leucocytes present in the blood sample by density gradient centrifugation e.g heparin, citrate solution, or another suitable anti-coagulant
  • CD56 or CD57 or CD161 a device for perforating and / or lysing the mononuclear leukocyte populations; a device for the quantitative determination of mononuclear leukocyte populations in an Elisa plate (eg, measurement of lactate dehydrogenase activity by Elisa plate reader), in the same Elisa plate, in which the qualitative and quantitative determination of molecular weight Marker takes place;
  • a device for the qualitative and quantitative determination of intracellular molecular markers phagocytosed by blood macrophages eg using Elisa plate reader, chemiluminescence meter, et c.
  • intracellular molecular markers phagocytosed by blood macrophages eg using Elisa plate reader, chemiluminescence meter, et c.
  • a device for fixation and permeabilization of mononuclear leucocytes, prior to lysis thereof, preferably before or optionally after the selection and / or enrichment and / or separation of the blood macrophages or blood macrophage-containing leukocyte populations can be provided in order to advantageously produce a To perform intracellular binding of antibodies directed against intracellular phagocytosed molecular marker to be quantified before the cell lysis.
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • 2 mM EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be removed and stored at 2-8 ° C be kept.
  • the suspension is spiked with an adequate amount of magnetic "beads" carrying directly on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD14, for example 10 8 "beads" in 250 ⁇ l.
  • the suspension may be incubated with 10 ⁇ g of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell-surface antigen CD14 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, after which the suspension is centrifuged (350 ⁇ g, 8 minutes), the cells are resuspended after discarding the supernatant in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
  • the beads in a cell-release buffer may contain the modified biotin contains, be resuspended.
  • the suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant.
  • the supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and dissolved in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
  • a defined volume of the homogenized suspension (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate containing both a mouse antibody directed against the cell surface antigen CD16, for example 5 ⁇ g / ml of the clone 3G8, as well as with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8, and has been blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). Serial dilutions of the suspension can be made. An aliquot of the suspension should be kept at 2-8 ° C. The plate is sealed (for example with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature or overnight in the refrigerator at 2-8 ° C.
  • the plate is washed five times with PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. Subsequently, 50 ⁇ l of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) are pipetted into each well.
  • aliquots of the retained suspensions of all mononuclear leukocytes or of the "beads" with all cells carrying the antigen CD14 on their surface are pipetted into any number, for example two, wells and with the volume of 50 l of missing cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride).
  • a serial dilution of recombinant PSA for example, between 50 pg / ml and 2 ng / ml, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is then placed for 5 minutes at 2-8 ° C and then treated for 5 minutes in an ultrasonic bath (only the plate bottom immersed in the water, a just below the water surface mounted basket serves as a support).
  • HRP horseradish peroxidase
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell number (CD14 + CD16 + cells, or also CD14 + cells, or else mononuclear leukocytes).
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the suspension is spiked with an adequate amount of magnetic "beads" carrying directly on its surface an antibody directed against the cell-surface antigen CD16, for example 10 8 "beads" in 250 ⁇ l.
  • the suspension may be incubated with 10 ⁇ g of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, after which the suspension is centrifuged (350 xg, 8 minutes), the cells are resuspended after discarding the supernatant in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
  • the "beads" in a cell-release buffer may contain the modified biotin contains, be resuspended.
  • the suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant.
  • the supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
  • a defined volume of the homogenized suspension (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which has both a mouse antibody directed against the cell-surface antigen CD14, for example 5 ⁇ g / ml of the clone M ⁇ P9, as well as coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8, and blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). Serial dilutions of the suspension can be made. An aliquot of the suspension should be kept at 2-8 ° C. The plate is sealed (for example with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature or overnight in the refrigerator at 2-8 ° C.
  • the plate is washed five times with PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. Subsequently, 50 ⁇ l of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) are pipetted into each well.
  • aliquots of the retained suspensions of all mononuclear leucocytes or of the "beads" with all cells carrying the CD16 antigen on their surface are pipetted into any number, for example two, wells and with the volume of lysis solution missing to 50 ⁇ l containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride).
  • a serial dilution of recombinant PSA for example, between 50 pg / ml and 2 ng / ml, prepared, of which 50 ul of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is then placed for 5 minutes at 2-8 ° C and then treated for 5 minutes in an ultrasonic bath (only the plate bottom immersed in the water, a just below the water surface mounted basket serves as a support).
  • the presentation of the results is carried out, for example, as pg imPSA / cell number
  • CD14 + CD16 + cells or also CD16 + cells, or even mononuclear leukocytes.
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which additionally contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene buffered saline).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • 2 mM EDTA ethylene buffered saline
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution, which is 1%
  • Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved, and stored at 2-8 ° C.
  • the suspension is incubated with 10 ⁇ g of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD14 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning.
  • the cells are centrifuged (350 xg, 8 minutes) and, after discarding the supernatant, resuspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
  • PBS solution pH 7.4
  • the supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. An aliquot of the suspension is removed and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and stored at 2-8 ° C.
  • PBS solution pH 7.4
  • PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • the cell suspension is now “beads” in 100 uL, added with an adequate amount of magnetic "beads”, which bear on their surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16 antibody, for example, 4 x 10 7 and 20 minutes at 2-8 ° C shaken or swiveled. This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic beads by means of a suitable magnet, the supernatant being discarded.
  • the "beads" with the cells are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, before a defined volume of cell lysis Solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride).
  • the lysate is placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
  • All cell lysates are now sonicated for 5 minutes, a suitable magnet used to remove the beads from the appropriate lysates, and still centrifuged once (14000 xg, 10 minutes).
  • a defined volume of the supernatants (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution).
  • a serial dilution of recombinant PSA for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells.
  • a cell number standard a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the presentation of the results is carried out, for example, as pg imPSA / cell number
  • CD14 + CD16 + cells or even CD14 + cells, or even mononuclear leukocytes.
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which additionally contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene buffered saline).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • 2 mM EDTA ethylene buffered saline
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution, which is 1%
  • Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved, and stored at 2-8 ° C.
  • the suspension is incubated with 5 ⁇ g of a DSB-X biotin-conjugated antibody against the cell surface antigen CD16 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning.
  • the cells are centrifuged (350 ⁇ g, 8 minutes), and after discarding the supernatant at 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) but no Ca 2+ or Mg 0.1% BSA and 2 mM EDTA 2+ ions resuspended.
  • An adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 ⁇ l, are added.
  • a defined volume of the suspension is removed therefrom and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and at 2-8 ° C keep on.
  • Triton and ImM PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • the cell suspension is then treated with an adequate amount of magnetic "beads” carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD14 antibody, for example, 2 x 10 7 "beads” in 50 ul, and 20 minutes at 2-8 ° C shaken or swiveled. This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic beads by means of a suitable magnet, the supernatant being discarded.
  • an adequate amount of magnetic "beads” carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD14 antibody, for example, 2 x 10 7 "beads” in 50 ul, and 20 minutes at 2-8 ° C shaken or swiveled.
  • the "beads" with the cells are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, before a defined volume of cell lysis Solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) is added.
  • the lysate is placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
  • All cell lysates are now sonicated for 5 minutes, a suitable magnet used to remove the beads from the appropriate lysates, and centrifuged again (14,000 x g, 10 minutes).
  • a defined volume of the supernatants (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution).
  • a serial dilution of recombinant PSA for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells.
  • a cell number standard a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell number (CD14 + CD16 + cells, or also CD16 + cells, or else mononuclear leukocytes).
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution, which is 1% Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved, and stored at 2-8 ° C.
  • the suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 ⁇ l.
  • DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads. which carry streptavidin on their surface, for example 2 ⁇ 10 7 "beads" in 50 ⁇ l, followed.
  • the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes.
  • the "beads” coupled to antibodies or the “beads” labeled with streptavidin bind to cells which carry the CD16 antigen on their surface or to DSB-X biotin-conjugated antibody bound to cells with the surface antigen CD16 are.
  • All cell lysates are then sonicated for 5 minutes, a suitable magnet used to remove the beads from the appropriate lysates, and centrifuged again (14,000 xg, 10 minutes).
  • a defined volume of the supernatants (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution).
  • a serial dilution of recombinant PSA for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells.
  • a cell number standard a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, of which 50 ⁇ l of each concentration are pipetted into at least two free wells.
  • the plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C.
  • the suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 ⁇ l.
  • DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads. which carry streptavidin on their surface, for example 2 ⁇ 10 7 "beads" in 50 ⁇ l, followed.
  • the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. In doing so, they bind to antibodies coupled "beads" or streptavidin-labeled "beads” on cells carrying on their Oberflumble the antigen CD16 or on DSB-X biotin-conjugated antibody bound to cells with the surface antigen CD16.
  • a defined volume of the suspension is removed therefrom and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and at 2-8 ° C keep on.
  • Triton and ImM PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • the cell suspension is then mixed with an adequate amount of magnetic "beads" carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 antibody, for example, 2 x 10 7 "beads” in 50 ul.
  • an adequate amount of magnetic "beads” carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 antibody for example, 2 x 10 7 "beads” in 50 ul.
  • 5 ⁇ g of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads” carrying streptavidin on their surface, for example 2 ⁇ 10 7 "beads” in 50 ⁇ l, followed.
  • All cell lysates are then sonicated for 5 minutes and centrifuged again (14,000 x g, 10 minutes).
  • a defined volume of the supernatants (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution).
  • a serial dilution of recombinant PSA for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells.
  • a cell number standard a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else CD16 + cells, or else mononuclear leukocytes).
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which additionally contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene buffered saline).
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • 2 mM EDTA ethylene buffered saline
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions Aliquot can be removed, dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), and stored at 2-8 ° C.
  • the suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 ⁇ l.
  • DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 ⁇ 10 7 "beads" in 50 ⁇ l, followed.
  • the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes.
  • the "beads” coupled to antibodies or the “beads” labeled with streptavidin bind to cells which carry on their surface the antigen CD56 or CD57 or CD161 or to DSB-X biotin-conjugated antibody which binds to cells with the surface -Antigen CD56 or CD57 or CD161 are bound.
  • a defined volume of the suspension is removed therefrom and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and stored at 2-8 ° C keep on.
  • Triton and ImM PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • the cell suspension is then mixed with an adequate amount of magnetic "beads" carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD16 antibody, for example 2 x 10 7 "beads” in 50 ul.
  • an adequate amount of magnetic "beads” carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD16 antibody for example 2 x 10 7 "beads” in 50 ul.
  • 5 ⁇ g of a modified DSB-X biotin-conjugated antibody to the Cell surface antigen CD16 are incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads carrying streptavidin on their surface, for example 2 x 10 7 "beads" 50 ⁇ l, followed.
  • a serial dilution of recombinant PSA for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells.
  • a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • HRP horseradish peroxidase
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 “ or CD16 + CD57 “ or CD16 + CD161 " cells, or else CD56 " or CD57 “ or CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 xg, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C.
  • the suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 ⁇ l.
  • DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 ⁇ 10 7 "beads" in 50 ⁇ l, followed.
  • the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes.
  • the "beads” coupled to antibodies or the “beads” labeled with streptavidin bind to cells which carry on their surface the antigen CD56 or CD57 or CD161 or to DSB-X biotin-conjugated antibody which binds to cells with the surface -Antigen CD56 or CD57 or CD161 are bound.
  • a defined volume of the cell suspension (maximum 100 .mu.l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate, both with a directed against the cell surface antigen CD16 mouse antibody, for example 5 ug / ml of Clone 3G8, as well as with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8, coated and blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). Serial dilutions of the suspension can be made. A residual volume of the suspension should be retained, but not frozen for the time being. The plate is sealed (for example with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature or overnight in the refrigerator at 2-8 ° C.
  • the plate is washed five times with PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. Subsequently, 50 ⁇ l of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) are pipetted into each well. In addition, 25 .mu.l of the retained suspension from all cells which do not carry the antigen CD56 or CD57 or CD161 on their surface are pipetted into any number of wells, for example two, and with the same volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), added.
  • a serial dilution of recombinant PSA for example, between 50 pg / ml and 2 ng / ml, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is then placed for 5 minutes at 2-8 ° C and then treated for 5 minutes in an ultrasonic bath (only the plate bottom immersed in the water, a just below the water surface mounted basket serves as a support).
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 “ or CD16 + CD57 “ or CD16 + CD161 " cells, or else CD56 " or CD57 “ or CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).
  • the starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution.
  • centrifugation of the blood for example 1800 x g, 20 minutes, all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C.
  • PBS solution pH 7.4
  • BSA bovine serum
  • ImM PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • the suspension is spiked with 5 ⁇ g of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 and the same amount (5 ⁇ g) of a biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 ,
  • the suspension is incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads carrying streptavidin on its surface, for example 2 ⁇ 10 7 beads in 50 ⁇ l ,
  • the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes.
  • the labeled with streptavidin "beads” bind to biotin as well as with DSB-X biotin conjugated antibodies that are bound to cells with the surface antigen CD56 or CD57 or CD161 or with the surface antigen CD16. This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic "beads" using a suitable magnet, the supernatant being discarded.
  • the "beads” are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, the washing solution is discarded, the "beads” are subsequently in a cell release buffer containing modified biotin resuspended. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant.
  • the supernatant containing only CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells is removed, centrifuged (350xg, 8 minutes), the pellet is placed in a defined volume cell lysis solution containing 1% Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved and placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
  • PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • a serial dilution of recombinant PSA for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells.
  • a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted.
  • the plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • HRP horseradish peroxidase
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).
  • the starting point is 6 ml of whole blood, which in one is a polyester gel and a 0.1 M
  • the isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylene-diamine-tetra-acetate
  • the isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions and conjugated with 5 ⁇ g of a modified DSB-X biotin Antibody against the cell surface antigen CD16 and with the same amount (5 ug) of a biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 added.
  • the suspension is incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning.
  • the cells After a washing step with PBS solution (pH 7.4), the cells are suspended in 0.5 ml fixation reagent (for example 1% formalin solution), washed after 10 min with PBS solution (pH 7.4), then taken up in 100 ⁇ l permeabilization medium and incubated for approx For 20 minutes, incubate with an anti-PSA enzyme conjugated with the HRP (horseraddish peroxidase) or biotin-conjugated mouse antibody, for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8.
  • fixation reagent for example 1% formalin solution
  • HRP horseradish peroxidase
  • biotin-conjugated mouse antibody for example 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8.
  • the cells are washed with a PBS solution (pH 7.4) and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions; an aliquot can be taken, dissolved in a defined volume of zeolysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), and stored at 2-8 ° C. This is followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 ⁇ 10 7 "beads" in 50 ⁇ l.
  • PBS solution pH 7.4
  • BSA bovine serum
  • ImM PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • treatment of the cells with fixative reagent and permeabilization medium may be omitted at this point in the protocol, and after removal of an aliquot, take place in a defined manner Volume cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C, the cells immediately with an adequate amount of magnetic beads, the carry on their surface streptavidin, for example, 2 x 10 7 "beads" in 50 ul, incubated.
  • Triton and ImM PMSF phenyl methyl sulfonyl fluoride
  • the pellet is discarded after discarding the supernatant, even if an addition of the antibody directed against imPSA to permeabilization of the cells, in a defined volume cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) , dissolved and placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes. Otherwise, the pellet is discarded after discarding the supernatant in 0.5 ml
  • Fixing reagent for example 1% formalin solution
  • PBS solution pH 7.4
  • HRP horseradish peroxidase
  • biotin conjugated, mouse antibody for example, 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8, incubated.
  • HRP horseradish peroxidase
  • biotin conjugated, mouse antibody for example, 1 ⁇ g / ml of the clone ER-PR8, incubated.
  • the cells are washed with a PBS solution (pH 7.4) and dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride) for at least 5 minutes -8 ° C.
  • Triton and ImM PMSF phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride
  • All cell lysates are then sonicated for 5 minutes and centrifuged again (14,000 xg, 10 minutes).
  • a defined volume of the supernatants (maximum 100 ⁇ l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate coated with a polyclonal antibody directed against mouse immunoglobulin (using a HRP-conjugated antibody directed against PSA), e.g. 2 ⁇ g / ml, or coated with avidin or streptavidin (using a biotin-conjugated anti-PSA antibody) and blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution).
  • a polyclonal antibody directed against mouse immunoglobulin using a HRP-conjugated antibody directed against PSA
  • avidin or streptavidin using a biotin-conjugated anti-PSA antibody
  • FCS fetal calf serum
  • a dilution series of the HRP (horseraddish peroxidase) or biotin-conjugated mouse antibody clone ER-PR8 is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Of this, the amount of bound imPSA can be recalculated.
  • a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution for example starting from a 1/2500 dilution, is prepared as the cell number standard, of which 50 ⁇ l of each concentration are pipetted into at least two free wells. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
  • the incubation period with TMB-containing substrate solution is 15 minutes at room temperature, then 50 ⁇ l of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
  • a stop solution for example IM H 2 SO 4
  • results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).

Abstract

The invention relates to a method for characterizing, in particular for quantifying, molecular marker(s) that are intracellularly absorbed from tissues by blood macrophages that are recirculated from the tissues into the circulatory system, wherein the following steps are carried out: application of an agent to whole blood, said agent inhibiting coagulation and/or agglomeration of whole blood; selecting and/or enriching and/or separating blood macrophages or leukocyte populations that contain blood macrophages from whole blood; perforating and/or lysing the selected blood macrophages or leukocyte populations containing the blood macrophages, optionally after previous permeabilization thereof; qualitatively and quantitatively determining non blood macrophage markers, namely molecular markers arising from tissue, after previously perforating and/or lysing the blood macrophages or leukocyte populations containing the blood macrophages, and an apparatus for carrying out the method.

Description

"Verfahren zur Charakterisierung, insbesondere Quantifizierung, von durch, aus dem Gewebe in die Blutbahn rezirkulierten, Blutmakrophagen intrazellulär aus Gewebe aufgenommenen molekularen Markern sowie Analyseanordnung zur Durchführung des "Method for the characterization, in particular quantification, of blood markers intracellularly picked up from tissue by tissue markers recirculated from the tissue into the bloodstream and analysis device for carrying out the method
Verfahrens"procedure "
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung, insbesondere Quantifizierung von phagozytierten, intrazellulären molekularen Markern, von mononukleären Leukozyten des Blutes, insbesondere Blutmakrophagen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie eine Analyseanordnung zur Verfahrensdurchführung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 13.The invention relates to a method for the characterization, in particular quantification of phagocytosed, intracellular molecular markers of blood mononuclear leukocytes, in particular blood macrophages according to the preamble of patent claim 1 and an analysis arrangement for carrying out the method according to the preamble of patent claim 13.
In Vollblut sind Zellen, die an ihrer Oberfläche die Proteine sowohl CD14 als auch CD16 (FcyRIII) exprimieren, nachweisbar. CD14 ist ein Zell-Oberflächen-Protein, das typischerweise von Monozyten und Makrophagen exprimiert wird. Das Zell-Oberflächen- Protein CD16 ermöglicht Zellen die Bindung der konstanten (Fc) Region von IgG-In whole blood, cells expressing on their surface the proteins both CD14 and CD16 (FcyRIII) are detectable. CD14 is a cell surface protein that is typically expressed by monocytes and macrophages. The cell-surface protein CD16 allows cells to bind to the constant (Fc) region of IgG.
Antikörpern, es liegt in zwei Isoformen vor: als CD16a (FcyRIIIA) an der Oberfläche von NK-Zellen, Makrophagen und sogenannten aktivierten Monozyten, und als CD16b (FcyRIIIB) auf Neutrophilen Granulozyten.Antibodies, it is present in two isoforms: as CD16a (FcyRIIIA) on the surface of NK cells, macrophages and so-called activated monocytes, and as CD16b (FcyRIIIB) on neutrophil granulocytes.
Nach klassischer Lehrmeinung sind es ausschließlich Makrophagen im Gewebe, und sogenannte "aktivierte Monozyten" des Blutes, die jeweils sowohl CD14 als auch CD16 exprimieren. Die bisherige Lehrmeinung betrachtete CD14/CD16-positive (CD14+CD16+) Zellen des Blutes schlichtweg als "aktivierte Monozyten", die (noch) nicht in das Gewebe, beispielsweise an den Ort einer Entzündung, einer Infektion, oder eines Tumors, eingewandert sind (Ziegler-Heitbrock, L., 2007. The CD14+CD16+ blood monocytes : Their role in infection and inflammation. J. Leukocyte Biol . 81, 584- 592). Neuere Befunde weisen jedoch darauf hin, dass es sich bei aktivierten Monozyten um aus dem Gewebe in die Blutbahn rezirkulierte Makrophagen handelt, die in ihren intrazellulären Phagosomen Gewebe-Anteile, z. B. epitheliale Proteine, einschließen, die beispielsweise vom Ort einer Entzündung oder eines Tumors stammen (Herwig, R., Horninger, W., Rehder, P. et al., 2005. Ability of PSA-positive circulating macrophages to detect prostate Cancer. Prostate 62, 290-298; Leers, M. P. G., Nap, M., Herwig, R. et al., 2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target for the detec- tion of prostate Cancer: A three-colour/five-parameter flow cytometric study on periph- eral blood samples. Am. J. Clin. Pathol. 129, 649-656). Im Unterschied zur nativen CD14-positiven, CD16-negativen (CD14+CD16") Monozyten-Population haben diese Zellen die morphologischen Eigenschaften von ausdifferenzierten Makrophagen des Gewebes, und die von ihnen eingeschlossenen (phagozytierten) Moleküle werden in Monozyten nicht gefunden (Leers, M. P. G., Nap, M., Herwig, R. et al., 2008. Circulating PSA- containing macrophages as a possible target for the detection of prostate Cancer: A three-colour/five-parameter flow cytometric study on peripheral blood samples. Am. J. Clin. Pathol. 129, 649-656).According to classical doctrine, it is exclusively macrophages in the tissue, and so-called "activated monocytes" of the blood, which express both CD14 and CD16. Previous opinion has simply considered CD14 / CD16 positive (CD14 + CD16 + ) cells of the blood as "activated monocytes" that have not (yet) migrated into the tissue, for example at the site of inflammation, infection, or tumor (Ziegler-Heitbrock, L., 2007. The CD14 + CD16 + blood monocytes: their role in infection and inflammation, J. Leukocyte Biol., 81, 584-592). However, recent findings indicate that activated monocytes are macrophages recirculated from the tissue into the bloodstream and have tissue components in their intracellular phagosomes, e.g. Epithelial proteins derived, for example, from the site of inflammation or a tumor (Herwig, R., Horninger, W., Rehder, P. et al., 2005. Ability of PSA-positive circulating macrophages to detect prostate cancer. Prostate 62, 290-298; Leers, MPG, Nap, M., Herwig, R., et al., 2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target for the detection of prostate cancer: A three-color / five flow cytometric study on peripheral blood samples., J. Clin., Pathol., 129: 649-656). In contrast to the native CD14-positive, CD16-negative (CD14 + CD16 " ) monocyte population, these cells have the morphological properties of differentiated macrophages of the tissue, and the molecules they contain (phagocytosed) are not found in monocytes (Leers, MPG , Nap, M., Herwig, R., et al., 2008. Circulating PSA-containing macrophages as a possible target for the detection of prostate cancer: A three-color / five-parameter flow cytometric study on peripheral blood samples. J. Clin., Pathol., 129, 649-656).
Methodisch ist sowohl zur analytischen Erfassung als auch zur Isolierung und Anreicherung von CD14+CD16+ Zellen des Blutes somit eine Betrachtung der CD16+ Zellen als Unter-Population aller CD14+ Zellen, als auch eine Betrachtung der CD14+ Zellen als Teilmenge aller CD16+ Zellen denkbar.Methodologically, for the analytical detection as well as for the isolation and accumulation of CD14 + CD16 + cells of the blood, a consideration of the CD16 + cells as a sub-population of all CD14 + cells, as well as a consideration of the CD14 + cells as a subset of all CD16 + cells conceivable.
Des Weiteren ist bekannt, dass aktivierte Monozyten bzw. Blutmakrophagen eine teilweise schwache Expression von CD14 aufweisen (Ziegler-Heitbrock, L., 2007. The CD14+CD16+ blood monocytes: Their role in infection and inflammation. J. Leukocyte Biol. 81, 584-592) bzw. einen Total-Verlust von CD14 erleiden (Bazil and Strominger, 1991: Shedding as a mechanism of down-modulation of CD14 on stimulated human monocytes. J. Immunol. 147, 1567-1574).Furthermore, it is known that activated monocytes or blood macrophages have partially weak expression of CD14 (Ziegler-Heitbrock, L., 2007. The CD14 + CD16 + blood monocytes: their role in infection and inflammation., J. Leukocyte Biol. 584-592) or a total loss of CD14 (Bazil and Strominger, 1991: Shedding as a mechanism of down modulation of CD14 on stimulated human monocytes, J. Immunol., 147, 1567-1574).
Die durchflußzytometrische Detektion von Blutmakrophagen, die intrazellulär in ihren Phagosomen beispielsweise das Marker-Protein PSA (Prostata-spezifisches Antigen) enthalten, das dann als imPSA (intrazelluläres Makrophagen-PSA) bezeichnet wird, kann das Stadium von Erkrankungen der Prostata in überaus spezifischer und sensitiver Weise nachzeichnen, und ist darin der klassischen Bestimmung von PSA im Blutse- rum überlegen (Herwig, R., Mitteregger, D., Djavan, B. et al., 2008. Detecting prostate Cancer by intracellular macrophage prostate-specific antigen (PSA): A more specific and sensitive marker than conventional serum total PSA. Eur. J. Clin. Invest. 38, 430- 437).Flow cytometric detection of blood macrophages containing intracellularly in their phagosomes, for example, the marker protein PSA (prostate-specific antigen), which is referred to as imPSA (Intracellular Macrophage PSA), may make the state of prostate disease more highly specific and sensitive Tracing the classic determination of PSA in the blood Herwig, R., Mitteregger, D., Djavan, B. et al., 2008. Detecting prostate cancer by intracellular macrophage prostate-specific antigen (PSA): A more specific and sensitive marker than conventional serum total PSA. Eur J. Clin Invest 38, 430-437).
Grundlage der durchflußzytometrischen Charakterisierung von Zellen ist die Markierung der zu detektierenden Ziel-Moleküle (der "Antigene") mit fluoreszenzfarbstoffmarkier- ten Antikörpern. Zur Analyse werden die Zellen in Suspension durch hydrodynamische Fokussierung an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet. Dadurch wird der Fluoreszenzfarbstoff zur Abgabe von Energie in Form von Photonen angeregt, die durch einen Detektor registriert werden.The basis of the flow cytometric characterization of cells is the labeling of the target molecules to be detected (the "antigens") with fluorescent dye-labeled antibodies. For analysis, the cells are passed in suspension by hydrodynamic focusing on a bundled laser beam of suitable wavelength. This excites the fluorescent dye to emit energy in the form of photons registered by a detector.
Ein Nachteil dieser Methode liegt jedoch in der fehlenden Quantifizierbarkeit der Menge an gebundenen Antikörpern und somit in einer fehlenden Aussage über die Menge an detektiertem Antigen. Ein weiterer Nachteil ist der erhebliche apparative und finanzielle Aufwand, den der Betrieb eines Durchflußzytometers verursacht.A disadvantage of this method, however, lies in the lack of quantification of the amount of bound antibodies and thus in a lack of information about the amount of detected antigen. Another disadvantage is the considerable apparatus and financial expense that causes the operation of a flow cytometer.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein verbessertes, vereinfachtes und kostengünstiges Verfahren sowie eine Analyseanordnung anzugeben, mit deren Hilfe eine Charakterisierung von mononukleären Leukozyten des Blutes, insbesondere Blut- makrophagen, inkl. deren phagozytierter molekularer Marker aus Gewebe quantitativ, insbesondere durch eine Darstellung als Masseneinheit pro Zellzahl möglich ist.The object of the invention is to provide an improved, simplified and cost-effective method and an analysis arrangement, with their help a characterization of mononuclear leukocytes of the blood, especially blood macrophages, including their phagocytosed molecular marker from tissue quantitatively, in particular by a representation as Mass unit per cell number is possible.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 sowie durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 13 gelöst.This object is achieved by a method according to claim 1 and by a device according to claim 13.
Insbesondere wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Charakterisierung, insbesondere Quantifizierung, von durch, aus dem Gewebe in die Blutbahn rezirkulierten, Blut- makrophagen intrazellulär aus Gewebe aufgenommenen molekularen Marker(n), gelöst, wobei folgende Schritte durchgeführt werden:In particular, the object is achieved by a method for the characterization, in particular quantification, of molecular markers (intracellularly taken up from tissue) by blood macrophages recirculated from the tissue into the bloodstream, wherein the following steps are carried out:
Anwenden eines Mittels auf Vollblut, welches das Verklumpen und/oder Gerinnen von Vollblut hemmt; Durchführen einer Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung von Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen aus dem Vollblut;Applying an agent to whole blood which inhibits clumping and / or clotting of whole blood; Performing a selection and / or enrichment and / or separation of blood macrophages or blood macrophage containing leukocyte populations from the whole blood;
- Durchführung einer Permeabilisierung und/oder Perforation und/oder Lyse der selektierten Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen;- Carrying out a permeabilization and / or perforation and / or lysis of the selected blood macrophages or blood macrophage containing leukocyte populations;
Durchführung einer qualitativen und quantitativen Bestimmung von nicht- blutmakrophageneigenen Markern, nämlich aus Gewebe stammenden molekularen Markern, nach vorheriger Perforation und/oder Lyse der Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden LeukozytenpopulationenCarrying out a qualitative and quantitative determination of non-blood macrophage markers, namely tissue-derived molecular markers, after prior perforation and / or lysis of the blood macrophages or blood macrophage-containing leukocyte populations
Eine erfindungsgemäß prinzipielle Überlegung besteht darin, molekulare Marker, z. B. epitheliale Proteine, in phagozytierenden mononukleären Zellen der Blutbahn, nämlich in Blutmakrophagen, nachzuweisen, wobei es anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens in vorteilhafter Weise möglich ist, einen direkten und spezifischen sowie quantitativen Nachweis zu führen.An inventive principle consideration is molecular markers, z. As epithelial proteins, in phagocytic mononuclear cells of the bloodstream, namely in blood macrophages detect, and it is possible by means of the inventive method in an advantageous manner to lead a direct and specific and quantitative detection.
Um einen Nachweis der molekularen Marker in Blutmakrophagen zu ermöglichen, ist es somit erfindungsgemäß vorgesehen, zunächst eine Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung von Blutmakrophagen aus Vollblut vorzunehmen, wobei im Weiteren die Begriffe "aktivierter Monozyt" und "Makrophage" identisch mit "Blutmakrophage" zu verstehen sind. Ferner sei darauf hingewiesen, dass alle im Rahmen dieser Erfindung behandelten, respektive nachzuweisenden, Marker undIn order to make it possible to detect the molecular markers in blood macrophages, it is thus provided according to the invention first to carry out a selection and / or enrichment and / or separation of blood macrophages from whole blood, the terms "activated monocyte" and "macrophage" being identical to " Blood macrophages "are to be understood. It should also be noted that all the markers treated and / or detected in the context of this invention, and
Markerfragmente, entsprechend vorstehender Definition für imPSA, von Makrophagen im Gewebe aufgenommene und zumindest teilweise phagozytierte Moleküle sind, die intrazellulär in Blutmakrophagen nachgewiesen werden.Marker fragments, as defined above for imPSA, macrophages taken in the tissue and at least partially phagocytosed molecules that are detected intracellularly in blood macrophages.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung der Blutmakrophagen mittels einer Positiv- Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächenmarker CD16 gerichteten Antikörpern durchgeführt. Erfindungsgemäß wird somit eine Betrachtung aller CD16-exprimierenden Zellen vorgenommen, um eine Erfassung aller aktivierten Monozyten/Makrophagen zu gewährleisten.According to a preferred embodiment of the invention, the selection and / or enrichment and / or separation of the blood macrophages is carried out by means of a positive selection using antibodies directed against the surface marker CD16. According to the invention, a consideration of all CD16-expressing cells is thus carried out in order to ensure detection of all activated monocytes / macrophages.
Sofern gewünscht, ist erfindungsgemäß ferner vorgesehen, dass entweder, bevorzugt nach oder gemäß einer Alternative auch vor der Positiv-Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächenmarker CD16 gerichteten Antikörpern eine Positiv-Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächenmarker CD14 gerichteten Antikörpern durchgeführt wird. Die Vorschaltung einer Positiv-CD16+-Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächenmarker CD16 gerichteten Antikörpern vor einer Positiv-If desired, it is further provided according to the invention that either, preferably after or according to an alternative also before the positive selection using antibodies directed against the surface marker CD16, a positive selection is carried out using antibodies directed against the surface marker CD14. The preassignment of a positive CD16 + selection using antibodies directed against the surface marker CD16 to a positive
CD14+-Selektion bietet den erfindungsgemäßen Vorteil, dass die gegenüber der CD16+- Population große CD14+-Population undifferenzierter Monozyten, die keine CD16- Oberflächenmarker aufweisen und die nicht Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Charakterisierung, insbesondere Quantifizierung, von durch, aus dem Gewebe in die Blutbahn rezirkulierten, Blutmakrophagen intrazellulär aus Gewebe aufgenommenen molekularen Marker(n) sind, bereits in einem ersten Schritt ausgeschlossen werden.CD14 + selection offers the advantage according to the invention that the CD14 + population, which is large compared to the CD16 + population, has undifferentiated monocytes which have no CD16 surface markers and are not the subject of the method according to the invention for characterizing, in particular quantifying, tissue recirculated into the bloodstream, blood macrophages intracellularly taken up by tissue molecular marker (s) are already excluded in a first step.
Mit dieser Vorgehensweise wird in vorteilhafter Weise gewährleistet, dass nur CD14+CD16+-Zellen selektiert werden, wobei erwähnt sei, dass erfindungsgemäß auch eine einer Positiv-CD14+-Selektion nachgeschaltete Positiv-CD16+-Selektion möglich ist.With this procedure, it is advantageously ensured that only CD14 + CD16 + cells are selected, wherein it should be mentioned that according to the invention a positive CD16 + selection following a positive CD14 + selection is also possible.
Sollten andere Zellpopulationen mit dem Zell-Oberflächen-Protein CD16, insbesondere NK-Zellen, bei der nachfolgenden Analyse der in intrazellulären Phagosomen enthaltenen aus Gewebe stammenden molekularen Marker als störend empfunden werden, kann eine negative Selektion anhand der unter CD16+ mononukleären Zellen ausschließlich von NK-Zellen exprimierten Oberflächen-Proteine CD56 oder CD57 oder CD161 angeschlossen werden.Should other cell populations with the cell surface protein CD16, in particular NK cells, be found to be disturbing in the subsequent analysis of the tissue-derived molecular markers contained in intracellular phagosomes, a negative selection can be made on the basis of CD16 + mononuclear cells excluding NK Cells expressed surface proteins CD56 or CD57 or CD161 can be connected.
Aus diesem Grund kann erfindungsgemäß vorteilhafterweise eine Negativ-Selektion zum Ausschluss von Zellen mit den Oberflächenmarkern CD56 und/oder CD57 und/oder CD161 unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt werden, die gegen die Oberflächenmarker CD56 und/oder CD57 und/oder CD161 gerichtet sind. Eine solche Negativ-Selektion kann als separater Selektionsschritt oder, gemäß einer weiteren vorteil- haften Ausführungsform auch gleichzeitig mit einer Positiv-Selektion von CD16+-Zellen vorgenommen werden, wie nachstehend beispielhaft erläutert wird.For this reason, according to the invention, it is advantageously possible to carry out a negative selection for the exclusion of cells with the surface markers CD56 and / or CD57 and / or CD161 using antibodies which are directed against the surface markers CD56 and / or CD57 and / or CD161. Such a negative selection can be carried out as a separate selection step or, according to another advantageous Embodiment also be made simultaneously with a positive selection of CD16 + cells, as exemplified below.
Des Weiteren ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass eine Positiv- oder Negativ- Selektion unter Verwendung von, vorzugsweise reversibel, koppelbaren magnetischen "beads" durchgeführt wird, um die jeweils selektierten Zellen auf äußerst einfache Weise mittels eines geeigneten Magneten abzutrennen.Furthermore, the invention provides that a positive or negative selection is carried out using, preferably reversibly, coupled magnetic "beads" to separate the respective selected cells in a very simple manner by means of a suitable magnet.
Alternativ oder in vor- oder nachgeschalteten Selektionsschritten wird erfindungsge- maß vorgeschlagen, eine Positiv- oder Negativ-Selektion unter Verwendung von an eine ELISA-Platte gekoppelten Antikörpern durchzuführen, um in erfindungsgemäß vorteilhafter Weise einerseits den Probendurchsatz zu erhöhen, und andererseits unnötige Transfers der zu untersuchenden Flüssigkeit von einem Gefäß in ein anderes und damit einhergehenden Substanzverlust der zu untersuchenden Zellen zu vermeiden.Alternatively or in upstream or downstream selection steps, it is proposed according to the invention to carry out a positive or negative selection using antibodies coupled to an ELISA plate in order advantageously to increase the sample throughput in accordance with the invention and, on the other hand, to avoid unnecessary transfers examining fluid from one vessel to another and concomitant loss of substance to be examined cells.
Ferner ist gemäß einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform eine quantitative Bestimmung einer mononukleären Leukozyten-Populationen in einer Elisa-Platte, vorzugsweise durch Messung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität mittels Elisa-Plattenleser, besonders bevorzugt in derselben Elisa-Platte, in der eine qualitative und quantitative Bestimmung der molekularen Marker, insbesondere nicht- blutmakrophageneigener Antigene, durchgeführt wird, vorgesehen.Furthermore, according to a further preferred embodiment of the invention, a quantitative determination of a mononuclear leukocyte populations in an Elisa plate, preferably by measuring the lactate dehydrogenase activity by Elisa plate reader, more preferably in the same Elisa plate, in which a qualitative and quantitative Determination of molecular markers, in particular non-blood macrophage antigens, is provided.
Des Weiteren wird die Durchführung einer quantitativen Bestimmung der vorhandenen Menge an nicht-blutmakrophageneigenen aus Gewebe stammenden molekularen Mar- kern mittels Elisa-Plattenleser und/oder Chemolumineszenz-Meßgerät durchgeführt, wobei erfindungsgemäß als molekulare Marker, insbesondere Gewebe-Marker und/oder serologische Marker abnorme DNA-Methylierung, AFP (α-1-Fetoprotein), AHCY (S- Adenosyl-Homocystein-Hydrolase), AMY2 (Pankreas-Amylase), CA 15-3 (Synonyme: MUCl, EMA, CD227), CA 19-9, CA 50, CA 72-4 (Synonym: TAG72), CA 125 (Synonym: MUC16), Calcitonin, Calprotectin, CCSA-2 (colon cancer-specific antigen-2), CCSP-2Furthermore, a quantitative determination of the amount of non-blood macrophage tissue-derived molecular markers present is carried out by means of Elisa plate reader and / or chemiluminescence measuring device, according to the invention as molecular markers, especially tissue markers and / or serological markers abnormal DNA methylation, AFP (α-1-fetoprotein), AHCY (S-adenosyl-homocysteine hydrolase), AMY2 (pancreatic amylase), CA 15-3 (synonyms: MUCl, EMA, CD227), CA 19-9, CA 50, CA 72-4 (synonym: TAG72), CA 125 (synonym: MUC16), calcitonin, calprotectin, CCSA-2 (colon cancer-specific antigen-2), CCSP-2
(colon Cancer secreted protein-2), CEA (carcinoembryonic antigen), CYP24A1, Cytoke- ratin (CK) 8 und Fragmente davon, CK18 und Fragmente davon, CK19 und Fragmente davon, CRP (C-reaktives Protein), Cystatin B, DDH (Dihydrodiol-Dehydrogenase), DKK- 1 (Dikkopf-1), GP73 (Golgi Protein-73) (Synonym: GOLPH2), HE4 (human epididymis protein 4), HER2/neu, HSP (heat shock protein)-27, Mac-2 BP (Mac-2 binding protein), Mammaglobin A, Mammaglobin B, MIA (melanoma-inhibitory activity), MnSOD (Man- gan-Superoxiddismutase), PARK7 (Synonym: DJ-I), ProGRP (progastrin-releasing pep- tide), NSE (neuron-specific enolase), Pan-Cytokeratin, Pro-MMP (Pro-Matrix- Metalloproteinase)-7, PSA (Prostata-spezifisches Antigen), S100A8, S100A9, S-100beta, SCCAl (squamous cell Carcinoma antigen 1), SCCA2 (squamous cell Carcinoma antigen 2), Thyroglobulin, UHRFl (ubiquitin-like with/containing PHD and ring-finger domains 1), URG4 (Up-regulated gene 4), und YKL-40 (Synonym: CHI3-L1), auch in Kombinationen), verwendet werden.(Colon Cancer Secreted Protein-2), CEA (carcinoembryonic antigen), CYP24A1, cytokirin (CK) 8 and fragments thereof, CK18 and fragments thereof, CK19 and fragments thereof, CRP (C-reactive protein), cystatin B, DDH (Dihydrodiol dehydrogenase), DKK-1 (Dikkopf-1), GP73 (Golgi protein-73) (synonym: GOLPH2), HE4 (human epididymis protein 4), HER2 / neu, HSP (heat shock protein) -27, Mac-2BP (Mac-2 binding protein), mammaglobin A, mammaglobin B, MIA (melanoma-inhibitory activity), MnSOD (manganese superoxide dismutase ), PARK7 (synonym: DJ-I), ProGRP (progastrin-releasing peptide), NSE (neuron-specific enolase), pan-cytokeratin, pro-MMP (pro-matrix metalloproteinase) -7, PSA (prostate specific antigen), S100A8, S100A9, S-100beta, SCCA1 (squamous cell carcinoma antigen 1), SCCA2 (squamous cell carcinoma antigen 2), thyroglobulin, UHRF1 (ubiquitin-like with / containing PHD and ring-finger domains 1), URG4 (Up-regulated gene 4), and YKL-40 (synonym: CHI3-L1), also in combinations).
Erfindungsgemäß wird zum Zweck der Verfahrensdurchführung Vollblut zunächst mit einem Mittel gegen Verklumpen und/oder Gerinnen, beispielsweise Heparin oder einem anderen geeigneten Anti-Koagulans, z. B. Zitrat-Lösung, versetzt.According to the invention, for the purpose of carrying out the method, whole blood is first of all mixed with an anti-caking and / or coagulating agent, for example heparin or another suitable anti-coagulant, eg. As citrate solution, added.
Eine Perforation oder Lyse der Makrophagen bzw. Makrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen wird erfindungsgemäß ferner beispielsweise mittels einer Saponinbe- handlung oder einer Behandlung mit Triton-Lösung durchgeführt.Perforation or lysis of the macrophages or macrophage-containing leukocyte populations is also carried out according to the invention, for example by means of a saponin treatment or a treatment with Triton solution.
Des Weiteren werden erfindungsgemäß zur Bestimmung von nicht-blutmakrophagen- eigenen Antigenen, gegebenenfalls mit Biotin, HRP (horseraddish peroxidase), AP (Alkalische Phosphatase), oder Lumineszenzfarbstoffen konjugierte, Antikörper, insbesondere der Immunglobulin-Klasse G (IgG) und Fab- bzw. F(ab)2-Fragmente, und/oder Aptamere, insbesondere ausgewählt aus: anti-Maus IgG (polyklonal), anti-Kaninchen IgG (polyklonal), anti-Ziege IgG (polyklonal), anti-Ratte IgG (polyklonal), anti-Esel IgG (polyklonal), anti-AFP (Klon AFP-Ol), anti-AFP (Klon AFP-Il), anti-AFP (Klon 4A3), anti-AFP (Klon 5H7), anti-AFP (Klon M803209), anti-AFP (Klon M0151611), anti-AFP (Klon M0151608), anti-AFP (polyklonal), anti-AHCY (Klon 1E11-1A7), anti-AHCY (Klon 2F11- IDlO), anti-AHCY (Klon 4H2), anti-AHCY (Klon Ml), anti-AHCY (Klon M2), anti-AHCY (polyklonal), anti-AMY2 (Klon 6A9/1), anti-AMY2 (Klon 501), anti-AMY2 (Klon 503), anti-AMY2 (Klon 10-102.5), anti-AMY2 (polyklonal), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M2C5), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M9E7), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M4H2), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M8C9), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M10G4), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M10H6), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M3A106), anti-CA 15-3/MUC1 (Klon C595(NCRC48)), anti-CA 15- 3/MUC1 (Klon E29), anti-CA 15-3/MUC1 (polyklonal), anti-CA 19-9 (Klon 121SLE), anti- CA 19-9 (polyklonal), anti-CA 50 (Klon M991149), anti-CA 50 (Klon 93), anti-CA 50 (po- lyklonal), anti-CA 72-4/TAG72 (Klon SPM148), anti-CA 72-4/TAG72 (polyklonal), anti- CA 125/MUC16 (Klon 2Fl), anti-CA 125/MUC16 (Klon 10G12), anti-CA 125/MUC16 (Klon X75), anti-CA 125/MUC16 (Klon X325), anti-CA 125/MUC16 (polyklonal), anti- Calcitonin (Klon SP17), anti-Calcitonin (Klon 13B9), anti-Calcitonin (Klon 13f2), anti- Calcitonin (Klon 24B2), anti-Calcitonin (polyklonal), anti-Calprotectin (Klon 27E10), anti-Calprotectin (polyklonal), anti-CCSA-2 (polyklonal), anti-CCSP-2 (polyklonal), anti- CEA (Klon CoI-I), anti-CEA (Klon 1C7), anti-CEA (Klon IClO), anti-CEA (Klon ICH), anti-CEA (polyklonal), anti-CYP24Al (Klon IEl), anti-CYP24Al (Klon 1F8), anti- CYP24A1 (polyklonal), anti-CK8 (Klon 24), anti-CK8 (Klon LP3K), anti-CK8 (polyklonal), anti-CK18 (Klon DC-10), anti-CK18 (Klon DA-7), anti-CK18 (Klon LDK18), anti-CK18 (polyklonal), anti-CK19 (Klon A53-B/A2), anti-CK19 (Klon BA17), anti-CK19 (Klon 236- 11221), anti-CK19 (polyklonal), anti-CRP (Klon 232007), anti-CRP (Klon 232024), anti- CRP (Klon C2), anti-CRP (Klon C4), anti-CRP (Klon C5), anti-CRP (Klon C6), anti-CRP (Klon C7), anti-CRP (polyklonal), anti-Cystatin B (Klon 2Fl), anti-Cystatin B (KlonFurthermore, according to the invention for the determination of non-blood macrophage antigens, optionally conjugated with biotin, HRP (horseraddish peroxidase), AP (alkaline phosphatase), or luminescent, antibodies, in particular the immunoglobulin class G (IgG) and Fab or F (ab) 2 fragments, and / or aptamers, in particular selected from: anti-mouse IgG (polyclonal), anti-rabbit IgG (polyclonal), anti-goat IgG (polyclonal), anti-rat IgG (polyclonal), anti -Selective IgG (polyclonal), anti-AFP (clone AFP-Ol), anti-AFP (clone AFP-II), anti-AFP (clone 4A3), anti-AFP (clone 5H7), anti-AFP (clone M803209) , anti-AFP (clone M0151611), anti-AFP (clone M0151608), anti-AFP (polyclonal), anti-AHCY (clone 1E11-1A7), anti-AHCY (clone 2F11-ID10), anti-AHCY (clone 4H2 ), anti-AHCY (clone Ml), anti-AHCY (clone M2), anti-AHCY (polyclonal), anti-AMY2 (clone 6A9 / 1), anti-AMY2 (clone 501), anti-AMY2 (clone 503) , anti-AMY2 (clone 10-102.5), anti-AMY2 (polyclonal), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M2C5), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M9E7), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M4H2), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M8C9), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M10G4 ), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M10H6), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M3A106), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone C595 (NCRC48)), anti-CA 15-3 / MUC1 (clone E29), anti-CA 15-3 / MUC1 (polyclonal), anti-CA 19-9 (clone 121SLE), anti- CA 19-9 (polyclonal), anti-CA 50 (clone M991149), anti-CA 50 (clone 93), anti-CA 50 (polyclonal), anti-CA 72-4 / TAG72 (clone SPM148), anti -CA 72-4 / TAG72 (polyclonal), anti-CA 125 / MUC16 (clone 2Fl), anti-CA 125 / MUC16 (clone 10G12), anti-CA 125 / MUC16 (clone X75), anti-CA 125 / MUC16 (Clone X325), anti-CA 125 / MUC16 (polyclonal), anti-calcitonin (clone SP17), anti-calcitonin (clone 13B9), anti-calcitonin (clone 13f2), anti-calcitonin (clone 24B2), anti-calcitonin (polyclonal), anti-calprotectin (clone 27E10), anti-calprotectin (polyclonal), anti-CCSA-2 (polyclonal), anti-CCSP-2 (polyclonal), anti-CEA (clone CoI-I), anti-CEA (Clone 1C7), anti-CEA (clone IC10), anti-CEA (clone ICH), anti-CEA (polyclonal), anti-CYP24A1 (clone IE1), anti-CYP24A1 (clone 1F8), anti-CYP24A1 (polyclonal) , anti-CK8 (clone 24), anti-CK8 (clone LP3K), anti-CK8 (polyclonal), anti-CK18 (clone DC-10), anti-CK18 (clone DA-7), anti-CK18 (clone LDK18 ), anti-CK18 (polyclonal), anti-CK19 (clone A53-B / A2), anti-CK19 (clone BA17), anti-CK19 (clone 236-11221), anti-CK19 (polyclonal), anti-CRP (clone 232007), anti-CRP (clone 232024), anti-CRP (clone C2), anti-CRP (clone C4), anti-CRP (clone C5 ), anti-CRP (clone C6), anti-CRP (clone C7), anti-CRP (polyclonal), anti-cystatin B (clone 2Fl), anti-cystatin B (clone
8k275), anti-Cystatin B (Klon B-02), anti-Cystatin B (Klon RJMW-2E7), anti-Cystatin B (polyklonal), anti-DDH (Klon TlOl), anti-DDH (polyklonal), anti-DKK-1 (Klon 141135), anti-DKK-1 (polyklonal), anti-GP73/GOLPH2 (Klon YA-14), anti-GP73/GOLPH2 (Klon 5B10), anti-GP73/GOLPH2 (polyklonal), anti-HE4 (Klon C-12), anti-HE4 (polyklonal), anti-HER2/neu (Klon 10C7), anti-HER2/neu (Klon 191924), anti-HER2/neu (Klon N3/D10), anti-HER2/neu (polyklonal), anti-HSP-27 (Klon G3.1), anti-HSP-27 (Klon AF5E5), anti-HSP-27 (Klon F-4), anti-HSP-27 (Klon 2A5), anti-HSP-27 (polyklonal), an- ti-Mac-2 BP (Klon SP-2), anti-Mac-2 BP (polyklonal), anti-Mammaglobin A (Klon 1G8D6, synonym 2E7G9), anti-Mammaglobin A (Klon 304-1A5), anti-Mammaglobin A (polyk- lonal), anti-Mammaglobin B (Klon E-17), anti-Mammaglobin B (polyklonal), anti-MIA8k275), anti-cystatin B (clone B-02), anti-cystatin B (clone RJMW-2E7), anti-cystatin B (polyclonal), anti-DDH (clone TlOl), anti-DDH (polyclonal), anti-cystatin DKK-1 (clone 141135), anti-DKK-1 (polyclonal), anti-GP73 / GOLPH2 (clone YA-14), anti-GP73 / GOLPH2 (clone 5B10), anti-GP73 / GOLPH2 (polyclonal), anti- HE4 (clone C-12), anti-HE4 (polyclonal), anti-HER2 / neu (clone 10C7), anti-HER2 / neu (clone 191924), anti-HER2 / neu (clone N3 / D10), anti-HER2 / neu (polyclonal), anti-HSP-27 (clone G3.1), anti-HSP-27 (clone AF5E5), anti-HSP-27 (clone F-4), anti-HSP-27 (clone 2A5), anti-HSP-27 (polyclonal), anti-Mac-2 BP (clone SP-2), anti-Mac-2 BP (polyclonal), anti-mammaglobin A (clone 1G8D6, synonymous 2E7G9), anti-mammaglobin A (Clone 304-1A5), anti-mammaglobin A (polyclonal), anti-mammaglobin B (clone E-17), anti-mammaglobin B (polyclonal), anti-MIA
(Klon 3A6), anti-MIA (polyklonal), anti-MMP-7 (Klon 6A4), anti-MMP-7 (Klon 176-5F12), anti-MMP-7 (Klon 141-7B2), anti-MMP-7 (Klon 377313), anti-MMP-7 (polyklonal), anti- MnSOD (Klon IAE), anti-MnSOD (Klon 2Al), anti-MnSOD (Klon 4F10), anti-MnSOD (Klon 23G5), anti-MnSOD (Klon 37CT127.5.11.6), anti-MnSOD (polyklonal), anti- PARK7/DJ-1 (Klon IBIl), anti-PARK7/DJ-l (Klon 1D7), anti-PARK7/DJ-l (Klon 6A65), anti-PARK7/DJ-l (Klon 3055), anti-PARK7/DJ-l (Klon A-9), anti-PARK7/DJ-l (Klon D-4), anti-PARK7/DJ-l (Klon E2), anti-PARK7/DJ-l (polyklonal), anti-proGRP (Klon pGRP5), anti-proGRP (Klon E146), anti-proGRP (Klon E172), anti-GRP (Klon 76-E6), anti-proGRP (polyklonal), anti-GRP (polyklonal), anti-NSE (Klon ICl), anti-NSE (Klon 5A4), anti-NSE (Klon 5E2), anti-NSE (Klon 5G10), anti-NSE (polyklonal), anti-Pan-Cytokeratin (Klon 7H8C4), anti-Pan-Cytokeratin (Klon B311.1), anti-Pan-Cytokeratin (Klon CIl), anti-Pan- Cytokeratin (Klon D-12), anti-Pan-Cytokeratin (polyklonal), anti-PSA (Klon ER-PR8), anti-PSA (Klon 181823), anti-PSA (polyklonal), anti-S100A8 (Klon 1B3), anti-S100A8 (Klon 2C5/4), anti-S100A8 (Klon 2H2), anti-S100A8 (Klon 2Q396A), anti-S100A8 (Klon 6A614), anti-S100A8 (Klon 8L627), anti-S100A8 (Klon 8-5C2), anti-S100A8 (Klon CF- 145), anti-S100A8 (Klon MRP8 7C12/4), anti-S100A8 (Klon S13.67), anti-S100A8 (polyklonal), anti-S100A9 (Klon IClO), anti-S100A9 (Klon 2Q396B), anti-S100A9 (Klon 4G9), anti-S100A9 (Klon NO.19), anti-S100A9 (Klon NO.134), anti-S100A9 (Klon S32.2), anti-S100A9 (Klon S36.48), anti-S100A9 (polyklonal), anti-S-100beta (Klon(Clone 3A6), anti-MIA (polyclonal), anti-MMP-7 (clone 6A4), anti-MMP-7 (clone 176-5F12), anti-MMP-7 (clone 141-7B2), anti-MMP 7 (clone 377313), anti-MMP-7 (polyclonal), anti-MnSOD (clone IAE), anti-MnSOD (clone 2Al), anti-MnSOD (clone 4F10), anti-MnSOD (clone 23G5), anti-MnSOD (Clone 37CT127.5.11.6), anti-MnSOD (polyclonal), anti-PARK7 / DJ-1 (clone IBIII), anti-PARK7 / DJ-1 (clone 1D7), anti-PARK7 / DJ-1 (clone 6A65 ), anti-PARK7 / DJ-1 (clone 3055), anti-PARK7 / DJ-1 (clone A-9), anti-PARK7 / DJ-1 (clone D-4), anti-PARK7 / DJ-1 ( Clone E2), anti-PARK7 / DJ-1 (polyclonal), anti-proGRP (clone pGRP5), anti-proGRP (clone E146), anti-proGRP (clone E172), anti-GRP (clone 76-E6), anti -ProGRP (polyclonal), anti-GRP (polyclonal), anti-NSE (clone ICl), anti-NSE (clone 5A4), anti-NSE (Clone 5E2), anti-NSE (clone 5G10), anti-NSE (polyclonal), anti-pan cytokeratin (clone 7H8C4), anti-pan cytokeratin (clone B311.1), anti-pan cytokeratin (clone CIl ), anti-pan-cytokeratin (clone D-12), anti-pan-cytokeratin (polyclonal), anti-PSA (clone ER-PR8), anti-PSA (clone 181823), anti-PSA (polyclonal), anti- S100A8 (clone 1B3), anti-S100A8 (clone 2C5 / 4), anti-S100A8 (clone 2H2), anti-S100A8 (clone 2Q396A), anti-S100A8 (clone 6A614), anti-S100A8 (clone 8L627), anti-S100A8 S100A8 (clone 8-5C2), anti-S100A8 (clone CF-145), anti-S100A8 (clone MRP8 7C12 / 4), anti-S100A8 (clone S13.67), anti-S100A8 (polyclonal), anti-S100A9 ( Clone IC10), anti-S100A9 (clone 2Q396B), anti-S100A9 (clone 4G9), anti-S100A9 (clone NO.19), anti-S100A9 (clone NO.134), anti-S100A9 (clone S32.2), anti-S100A9 (clone S36.48), anti-S100A9 (polyclonal), anti-S-100beta (clone
SB6), anti-S-100beta (Klon SH-Bl), anti-S-100beta (Klon SH-B4), anti-S-100beta (polyklonal), anti-SCCAl (Klon 8H11), anti-SCCAl (polyklonal), anti-SCCA2 (Klon 10C12), anti-SCCA2 (polyklonal), anti-SCCAl/2 (Klon B-9), anti-SCCAl/2 (polyklonal), anti- Thyroglobulin (Klon 5E6), anti-Thyroglobulin (Klon 5F9), anti-Thyroglobulin (Klon 5G4), anti-Thyroglobulin (Klon 11A16), anti-Thyroglobulin (Klon PB2), anti-ThyroglobulinSB6), anti-S-100beta (clone SH-Bl), anti-S-100beta (clone SH-B4), anti-S-100beta (polyclonal), anti-SCCAl (clone 8H11), anti-SCCAl (polyclonal) , anti-SCCA2 (clone 10C12), anti-SCCA2 (polyclonal), anti-SCCAl / 2 (clone B-9), anti-SCCAl / 2 (polyclonal), anti-thyroglobulin (clone 5E6), anti-thyroglobulin (clone 5F9), anti-thyroglobulin (clone 5G4), anti-thyroglobulin (clone 11A16), anti-thyroglobulin (clone PB2), anti-thyroglobulin
(Klon PB3), anti-Thyroglobulin (polyklonal), anti-UHRFl (Klon lRClC-10), anti-UHRFl (Klon 3A11), anti-UHRFl (polyklonal), anti-URG4 (polyklonal), anti-YKL-40/CHI3-l_l (Klon 2011), anti-YKL-40/CHI3-Ll (Klon 321806), anti-YKL-40/CHI3-Ll (polyklonal) verwendet.(Clone PB3), anti-thyroglobulin (polyclonal), anti-UHRFl (clone 1RClC-10), anti-UHRF1 (clone 3A11), anti-UHRF1 (polyclonal), anti-URG4 (polyclonal), anti-YKL-40 / CHI3-l_l (clone 2011), anti-YKL-40 / CHI3-L1 (clone 321806), anti-YKL-40 / CHI3-Ll (polyclonal).
Zusammenfassend kann somit festgehalten werden, dass zunächst durch eine Dichtegradienten-Zentrifugation alle mononukleären Zellen gewonnen werden, wodurch CD16-positive Neutrophile Granulozyten ausgeschlossen werden. Daran wird eine Positiv-Selektion und Anreicherung entweder von Zellen mit dem Oberflächen- Protein CD14, oder von Zellen mit dem Oberflächen-Protein CD16 angeschlossen. Als Alternative kann stattdessen eine Negativ-Selektion von Zellen mit dem Oberflächen- Protein CD56 oder CD57 oder CD161 erfolgen.In summary, it can thus be stated that first of all a mononuclear cell is obtained by density gradient centrifugation, whereby CD16-positive neutrophil granulocytes are excluded. This is followed by positive selection and enrichment of either cells with the surface protein CD14, or cells with the surface protein CD16. Alternatively, negative selection of cells with the surface protein CD56 or CD57 or CD161 can instead take place.
Erfindungsgemäß erfolgen sowohl die Positiv-Selektion und Anreicherung von mononukleären Zellen mit den Oberflächen-Proteinen CD14 oder CD16, als auch dieAccording to the invention, both the positive selection and accumulation of mononuclear cells with the surface proteins CD14 or CD16, as well as the
Negativ-Selektion von mononukleären Zellen mit den Oberflächen-Proteinen CD56 oder CD57 oder CD161 mithilfe von an magnetische "beads" gekoppelte Antikörper, die gegen die Zell-Oberflächen-Proteine CD14 oder CD16 oder CD56 oder CD57 oder CD161 gerichtet sind. Im Falle einer Positiv-Selektion gegen CD14+ Zellen oder Negativ-Selektion schließt sich daran ein weiterer durch Positiv-Selektion der Zellen gekennzeichneter Trennungsschritt unter Verwendung eines gegen das Zell-Oberflächen-Protein CD16 gerichteten Antikörpers, der entweder an magnetische "beads" gekoppelt oder auf eine Elisa-Platte gecoated ist. Im Falle einer Positiv-Selektion gegen zunächst CD16+ Zellen folgt eine weitere Positiv-Selektion der Zellen gegen CD14+ Zellen mithilfe eines Antikörpers, der entweder an magnetische "beads" gekoppelt oder auf eine Elisa-Platte gecoated ist, oder es folgt eine Negativ-Selektion gegen CD56+ oder CD57+ oder CD161+ NK-Zellen unter Verwendung eines gegen das Zell-Oberflächen-Protein CD56 oder CD57 oder CD161 gerichteten magnetischen Antikörpers. Als Alternative können Positiv-Selektion gegen CD16+ Zellen und Negativ-Selektion gegen CD56+ oder CD57+ oder CD161+ NK-Zellen gleichzeitig in einem Verfahrensschritt vorgenommen werden. Im Falle einer Positiv-Selektion gegen CD16+ Zellen können alternativ dazu weitere Selektions-Schritte unterbleiben.Negative selection of mononuclear cells with the surface proteins CD56 or CD57 or CD161 by means of antibodies coupled to magnetic beads which are directed against the cell surface proteins CD14 or CD16 or CD56 or CD57 or CD161. In the case of a positive selection against CD14 + cells or negative selection, this is followed by another separation step characterized by positive selection of the cells using an antibody directed against the cell surface protein CD16, which is either coupled to magnetic beads or is coated on an Elisa plate. In the case of a positive selection against initially CD16 + cells, a further positive selection of the cells against CD14 + cells is followed by an antibody which is either coupled to magnetic beads or coated on an Elisa plate, or it follows a negative Selection against CD56 + or CD57 + or CD161 + NK cells using a magnetic antibody directed against the cell surface protein CD56 or CD57 or CD161. Alternatively, positive selection against CD16 + cells and negative selection against CD56 + or CD57 + or CD161 + NK cells can be done simultaneously in one step. In the case of a positive selection against CD16 + cells, further selection steps may alternatively be omitted.
Die nun abgetrennten und angereicherten mononukleären Leukozyten werden in weiterer Folge durch Behandlung mit einer Perforations-Lösung und/oder einem ZeII- Lysis-Reagens zerstört. Gemäß einer Verfahrensvariante kann zuvor, und zwar entweder unmittelbar vor der Lyse der Zellen oder unmittelbar nach derThe now separated and enriched mononuclear leukocytes are subsequently destroyed by treatment with a perforation solution and / or a cell lysis reagent. According to a variant of the method can be previously, either immediately before the lysis of the cells or immediately after
Dichtegradienten-Zentrifugation, der/die Antikörper gegen den/die zu detektierenden molekularen Marker unter Permeabilisierung der Zellen zugegeben werden. So ist in einem der der Zell-Lyse nachfolgenden Schritte die Quantifizierung der in den Zellen enthaltenen molekularen Marker möglich.Density gradient centrifugation to which antibodies against the molecular marker (s) to be detected are added to permeabilize the cells. Thus, in one of the cell lysis subsequent steps, the quantification of the molecular marker contained in the cells is possible.
Des weiteren wird in einer Elisa-Platte zum Zwecke der Ermittlung der eingesetzten Zellzahl die Aktivität des Enzyms Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Lysat bestimmt, wobei über einen Standard die Menge an vorhandenen mononukleären Leukozyten berechnet werden kann. Durch Zugabe eines Indikator-Substrats kann die durch die enzymatische Aktivität hervorgerufene Farbreaktion mittels Elisa-Reader ausgelesen und somit quantifiziert werden.Furthermore, the activity of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) in the lysate is determined in an Elisa plate for the purpose of determining the number of cells used, wherein the amount of mononuclear leucocytes present can be calculated by means of a standard. By adding an indicator substrate, the color reaction caused by the enzymatic activity can be read out by means of the Elisa reader and thus quantified.
Zuletzt wird mittels spezifisch gegen den jeweiligen molekularen Marker gerichteten(r) Antikörper(s) und/oder mittels gegen den/die jeweiligen molekularen Antikörper gerichteten(r) Antikörper(s), vorzugsweise in derselben Elisa-Platte, in der die Zeil- Quantifizierung durch Messung der LDH-Aktivität erfolgte, proportional zur Menge des untersuchten Markers eine enzymatische Farbreaktion oder ein Chemolumineszenz- Signal ausgelöst. Mittels Elisa-Plattenleser oder Chemolumineszenz-Detektor kann der jeweilige molekulare Marker über einen Standard quantifiziert werden. Die finaleFinally, antibodies are specifically directed against the respective molecular marker (s) and / or against the respective molecular antibodies directed antibody (s), preferably in the same Elisa plate, in which the cell quantification was carried out by measuring the LDH activity, an enzymatic color reaction or a chemiluminescent signal is triggered in proportion to the amount of marker studied. By Elisa plate reader or chemiluminescence detector, the respective molecular marker can be quantified by a standard. The final
Darstellung der Ergebnisse erfolgt als „Menge bzw. Masseneinheit an intrazellulärem molekularen Marker pro Zellzahl".The results are displayed as "quantity or mass unit of intracellular molecular marker per cell number".
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner durch eine Analyseanordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Patentanspruch 13 gelöst.The object according to the invention is further achieved by an analysis arrangement for carrying out the method according to the invention.
Die Analyseanordnung zur Verfahrensdurchführung umfaßt erfindungsgemäß eine Vorrichtung zum Zusetzen eines Mittels, das das Verklumpen und/oder Gerinnen von Vollblut hemmt (z. B. Heparin, Zitrat-Lösung, oder ein anderes geeignetes Anti-Koagulans); eine Vorrichtung zur Durchführung einer Vorselektion bzw. Selektion und Anreicherung von sämtlichen in der Blutprobe vorhandenen mononukleären Leukozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation;The method of analysis according to the invention comprises a device for adding an agent which inhibits the clumping and / or coagulation of whole blood (eg heparin, citrate solution, or another suitable anti-coagulant); a device for performing a preselection or selection and enrichment of all mononuclear leucocytes present in the blood sample by density gradient centrifugation;
- eine Vorrichtung zur Durchführung einer Selektion und Anreicherung von CD14+ Zellen unter Verwendung von, gegebenenfalls reversibel, an magnetische "beads" oder an eine Elisa-Platte gekoppelte Antikörpern gegen CD14;a device for carrying out selection and accumulation of CD14 + cells using, optionally reversibly, antibodies to CD14 coupled to magnetic beads or to an Elisa plate;
- eine Vorrichtung zur Durchführung einer Selektion und Anreicherung von CD16+ Zellen unter Verwendung von, gegebenenfalls reversibel an magnetische "beads" oder an eine Elisa-Platte gekoppelte Antikörpern gegen- An apparatus for performing a selection and accumulation of CD16 + cells using, optionally reversibly coupled to magnetic beads or to an Elisa plate antibodies against
CD16;CD16;
- optional eine Vorrichtung zum Ausschluß von NK-Zellen mit den ZeII- Oberflächen-Markern CD56 oder CD57 oder CD161 aus dem Kollektiv von mononukleären Leukozyten bzw. mononukleären CD16+ Zellen, unter Verwendung von an magnetische "beads" gekoppelte Antikörpern gegenoptionally, a device for the exclusion of NK cells with the cell surface markers CD56 or CD57 or CD161 from the pool of mononuclear leukocytes or mononuclear CD16 + cells, using antibodies coupled to magnetic beads
CD56 oder CD57 oder CD161; eine Vorrichtung zur Perforation und/oder Lyse der mononukleären Leukozyten-Populationen; eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der mononukleären Leukozyten-Populationen in einer Elisa-Platte (z. B. Messung der Laktat- Dehydrogenase-Aktivität mittels Elisa-Plattenleser), und zwar in derselben Elisa-Platte, in der die qualitative und quantitative Bestimmung der molekularen Marker stattfindet;CD56 or CD57 or CD161; a device for perforating and / or lysing the mononuclear leukocyte populations; a device for the quantitative determination of mononuclear leukocyte populations in an Elisa plate (eg, measurement of lactate dehydrogenase activity by Elisa plate reader), in the same Elisa plate, in which the qualitative and quantitative determination of molecular weight Marker takes place;
- eine Vorrichtung zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von durch Blutmakrophagen phagozytierten intrazellulären molekularen Markern (z. B. mithilfe von Elisa-Plattenleser, Chemolumineszenz-Meßgerät, et c.) nach vorhergehender Perforation oder Lyse der Blutzellen.a device for the qualitative and quantitative determination of intracellular molecular markers phagocytosed by blood macrophages (eg using Elisa plate reader, chemiluminescence meter, et c.) after previous perforation or lysis of the blood cells.
Ferner kann erfindungsgemäß eine Vorrichtung zur Fixierung und Permeabilisierung von mononukleären Leukozyten, vor der Lyse derselben, vorzugsweise vor oder gegebenenfalls nach der Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung der Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen vorgese- hen sein, um in vorteilhafter Weise eine intrazelluläre Bindung von gegen intrazellulär phagozytierte molekulare zu quantifizierende Marker gerichtete Antikörper bereits vor der Zell-Lyse durchzuführen.Furthermore, according to the invention, a device for fixation and permeabilization of mononuclear leucocytes, prior to lysis thereof, preferably before or optionally after the selection and / or enrichment and / or separation of the blood macrophages or blood macrophage-containing leukocyte populations, can be provided in order to advantageously produce a To perform intracellular binding of antibodies directed against intracellular phagocytosed molecular marker to be quantified before the cell lysis.
Die Erfindung wird nachstehend anhand mehrerer Ausführungsbeispiele näher erläutert:The invention will be explained in more detail below with reference to several embodiments:
1. Ausführunqsbeispiel :1st embodiment:
Positiv-Selektion der CD14+ Monozyten mithilfe magnetischer "beads"; Positiv-Selektion der CD14+CD16+ Population, Zellzahl-Bestimmung, und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Positive selection of CD14 + monocytes using magnetic beads; Positive selection of CD14 + CD16 + population, cell number determination, and quantification of the molecular marker, here in PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert. Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 xg, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel. The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen und bei 2-8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die direkt an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD14 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 108 "beads" in 250 μl, versetzt. Alternativ dazu kann die Suspension mit 10 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen- Antigen CD14 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, wonach die Suspension zentrifugiert wird (350 x g, 8 Minuten), die Zellen werden nach Verwerfen des Überstandes in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, resuspendiert. Eine adäquate Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 108 "beads" in 300 μl, wird zugesetzt.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be removed and stored at 2-8 ° C be kept. The suspension is spiked with an adequate amount of magnetic "beads" carrying directly on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD14, for example 10 8 "beads" in 250 μl. Alternatively, the suspension may be incubated with 10 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell-surface antigen CD14 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, after which the suspension is centrifuged (350 × g, 8 minutes), the cells are resuspended after discarding the supernatant in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. An adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 10 8 "beads" in 300 μl, are added.
Nachdem die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten lang bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt wird, werden die nun an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten abgetrennt, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA enthält, gewaschen. Bei Verwendung von magnetischen "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen- Antigen CD14 gerichteten Antikörper tragen, werden die "beads" in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert. Alternativ dazu können, bei Verwendung des mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD14 und der magnetischen "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, die "beads" in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert werden. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von "beads" und Überstand. Der Überstand wird entnommen, zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), und in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert.After shaking or swirling the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads for 20 minutes at 2-8 ° C, the cells now bound to the magnetic beads are separated using a suitable magnet, discarding the supernatant. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA. When using magnetic beads bearing on their surface an antibody directed against the cell-surface antigen CD14, the beads are dissolved in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4), the 0.1% BSA and 2 mM EDTA no Ca 2+ or Mg 2+ ions suspended. Alternatively, using the modified DSB-X biotin-conjugated antibody against the cell-surface antigen CD14 and the magnetic beads carrying streptavidin on its surface, the beads in a cell-release buffer may contain the modified biotin contains, be resuspended. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and dissolved in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
Ein definiertes Volumen der homogenisierten Suspension (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die sowohl mit einem gegen das ZeII- Oberflächen-Antigen CD16 gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 5 μg/ml des Klons 3G8, als auch mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER-PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Verdünnungsreihen der Suspension können hergestellt werden. Ein Aliquot der Suspension soll bei 2-8°C aufbehalten werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 2-8°C inkubiert.A defined volume of the homogenized suspension (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate containing both a mouse antibody directed against the cell surface antigen CD16, for example 5 μg / ml of the clone 3G8, as well as with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8, and has been blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). Serial dilutions of the suspension can be made. An aliquot of the suspension should be kept at 2-8 ° C. The plate is sealed (for example with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature or overnight in the refrigerator at 2-8 ° C.
Die Platte wird fünf Mal mit PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen. Anschließend wird in jedes well 50 μl Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, pipettiert. Außerdem werden Aliquots der aufbehaltenen Suspensionen aller mononukleären Leukozyten oder der "beads" mit allen Zellen, die an ihrer Oberfäche das Antigen CD14 tragen, in beliebig viele, beispielsweise je zwei, wells pipettiert und mit dem auf 50 μl fehlenden Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, versetzt. Des weiteren wird als Standard eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird nun 5 Minuten auf 2-8°C gestellt und anschließend 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt (nur der Platten-Boden taucht ins Wasserbad ein, ein knapp unterhalb der Wasseroberfläche angebrachter Korb dient als Auflage).The plate is washed five times with PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. Subsequently, 50 μl of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) are pipetted into each well. In addition, aliquots of the retained suspensions of all mononuclear leukocytes or of the "beads" with all cells carrying the antigen CD14 on their surface are pipetted into any number, for example two, wells and with the volume of 50 l of missing cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride). Furthermore, as a standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example, between 50 pg / ml and 2 ng / ml, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is then placed for 5 minutes at 2-8 ° C and then treated for 5 minutes in an ultrasonic bath (only the plate bottom immersed in the water, a just below the water surface mounted basket serves as a support).
Nach Versiegelung der Platte und Inkubation bei Raumtemperatur (eine Stunde) oder bei 2-8°C (über Nacht) wird als Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH- Positiv-Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500- Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa- Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After plate sealing and incubation at room temperature (one hour) or at 2-8 ° C (overnight), a standard dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution starting, for example, from 1 / 2500th Dilution prepared, of which 50 μl of each concentration are pipetted into at least two free wells. Subsequently, 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tightly sealed with aluminum foil and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and measured the light absorptions of all wells in a Elisa plate reader at 492 nm. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS, inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal goat anti-PSA detection antibody, for example at a concentration of 0.5 μg / ml in PBS.
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einerAll wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. It is directed against the detection antibody, conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) secondary antibody, such as mouse or rabbit, for example in a
Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.Concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4) added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD14+CD16+ Zellen, oder auch CD14+ Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten). 2. Ausführungsbeispiel :The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell number (CD14 + CD16 + cells, or also CD14 + cells, or else mononuclear leukocytes). 2nd embodiment:
Positiv-Selektion der CD16+ Monozyten mithilfe magnetischer "beads"; Positiv-Selektion der CD14+CD16+ Population, Zellzahl-Bestimmung, und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Positive selection of CD16 + monocytes using magnetic beads; Positive selection of CD14 + CD16 + population, cell number determination, and quantification of the molecular marker, here in PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen und bei 2-8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die direkt an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 108 "beads" in 250 μl, versetzt. Alternativ dazu kann die Suspension mit 10 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen- Antigen CD16 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, wonach die Suspension zentrifugiert wird (350 x g, 8 Minuten), die Zellen werden nach Verwerfen des Überstandes in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, resuspendiert. Eine adäquate Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 108 "beads" in 300 μl, wird zugesetzt.The isolated mononuclear leukocytes in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) but no Ca 2+ or Mg 0.1% BSA and 2 mM EDTA 2+ ions suspended, an aliquot can be removed and at 2-8 ° C be kept. The suspension is spiked with an adequate amount of magnetic "beads" carrying directly on its surface an antibody directed against the cell-surface antigen CD16, for example 10 8 "beads" in 250 μl. Alternatively, the suspension may be incubated with 10 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, after which the suspension is centrifuged (350 xg, 8 minutes), the cells are resuspended after discarding the supernatant in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. An adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 10 8 "beads" in 300 μl, are added.
Nachdem die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten lang bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt wird, werden die nun an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten abgetrennt, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA enthält, gewaschen. Bei Verwendung von magnetischen "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen- Antigen CD16 gerichteten Antikörper tragen, werden die "beads" in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert. Alternativ dazu können, bei Verwendung des mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 und der magnetischen "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, die "beads" in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert werden. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von "beads" und Überstand. Der Überstand wird entnommen, zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), und in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert.After shaking or swirling the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads for 20 minutes at 2-8 ° C, the cells now bound to the magnetic beads are separated using a suitable magnet, discarding the supernatant. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA. When using Magnetic "beads" carrying on their surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16 become the "beads" in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4), the 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2 + or Mg 2+ ions suspended. Alternatively, using the modified DSB-X biotin-conjugated antibody against the cell-surface antigen CD16 and the magnetic beads carrying streptavidin on its surface, the "beads" in a cell-release buffer may contain the modified biotin contains, be resuspended. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
Ein definiertes Volumen der homogenisierten Suspension (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die sowohl mit einem gegen das Zell- Oberflächen-Antigen CD14 gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 5 μg/ml des Klons MφP9, als auch mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER-PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Verdünnungsreihen der Suspension können hergestellt werden. Ein Aliquot der Suspension soll bei 2-8°C aufbehalten werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 2-8°C inkubiert.A defined volume of the homogenized suspension (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which has both a mouse antibody directed against the cell-surface antigen CD14, for example 5 μg / ml of the clone MφP9, as well as coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8, and blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). Serial dilutions of the suspension can be made. An aliquot of the suspension should be kept at 2-8 ° C. The plate is sealed (for example with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature or overnight in the refrigerator at 2-8 ° C.
Die Platte wird fünf Mal mit PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen. Anschließend wird in jedes well 50 μl Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, pipettiert. Außerdem werden Aliquots der aufbehaltenen Suspensionen aller mononukleären Leukozyten oder der "beads" mit allen Zellen, die an ihrer Oberfäche das Antigen CD16 tragen, in beliebig viele, beispielsweise je zwei, wells pipettiert und mit dem auf 50 μl fehlenden Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, versetzt. Des weiteren wird als Standard eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird nun 5 Minuten auf 2-8°C gestellt und anschließend 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt (nur der Platten-Boden taucht ins Wasserbad ein, ein knapp unterhalb der Wasseroberfläche angebrachter Korb dient als Auflage).The plate is washed five times with PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. Subsequently, 50 μl of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) are pipetted into each well. In addition, aliquots of the retained suspensions of all mononuclear leucocytes or of the "beads" with all cells carrying the CD16 antigen on their surface are pipetted into any number, for example two, wells and with the volume of lysis solution missing to 50 μl containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride). Furthermore, as a standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example, between 50 pg / ml and 2 ng / ml, prepared, of which 50 ul of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is then placed for 5 minutes at 2-8 ° C and then treated for 5 minutes in an ultrasonic bath (only the plate bottom immersed in the water, a just below the water surface mounted basket serves as a support).
Nach Versiegelung der Platte und Inkubation bei Raumtemperatur (eine Stunde) oder bei 2-8°C (über Nacht) wird als Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH- Positiv-Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500- Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa- Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After plate sealing and incubation at room temperature (one hour) or at 2-8 ° C (overnight), a standard dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution starting, for example, from 1 / 2500th Dilution prepared, of which 50 μl of each concentration are pipetted into at least two free wells. Subsequently, 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight sealed with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and measured the light absorptions of all wells in a Elisa plate reader at 492 nm. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS, inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal goat anti-PSA detection antibody, for example at a concentration of 0.5 μg / ml in PBS.
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einer Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.All wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. A secondary antibody, for example from mouse or rabbit, conjugated to the detection antibody and conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase), for example in a concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4), is added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Last, the light absorption of the wells in measured on a Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / ZellzahlThe presentation of the results is carried out, for example, as pg imPSA / cell number
(CD14+CD16+ Zellen, oder auch CD16+ Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).(CD14 + CD16 + cells, or also CD16 + cells, or even mononuclear leukocytes).
3. Ausführungsbeispiel :3rd embodiment
Positiv-Selektion sowohl zuerst der CD14+ Monozyten als auch anschließend der CD14+CD16+ Population mithilfe magnetischer "beads"; Zellzahl-Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Positive selection of both the CD14 + monocytes first and then the CD14 + CD16 + population using magnetic beads; Cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen-The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which additionally contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene buffered saline).
Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.Diamine-tetra-acetate), washed to remove the platelets.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1%The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution, which is 1%
Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit 10 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD14 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert.Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved, and stored at 2-8 ° C. The suspension is incubated with 10 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD14 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning.
Die Zellen werden zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten) und nach Verwerfen des Überstandes in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, resuspendiert. Eine adäquate Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 108 "beads" in 300 μl, wird zugesetzt.The cells are centrifuged (350 xg, 8 minutes) and, after discarding the supernatant, resuspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. An adequate amount of magnetic "Beads" carrying streptavidin on their surface, for example 10 8 "beads" in 300 μl, are added.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die mit Streptavidin markierten "beads" an mit DSB-X Biotin konjugiertem Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD14 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. The labeled with streptavidin "beads" bind to DSB-X biotin-conjugated antibody bound to cells with the surface antigen CD14.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, und anschließend in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von "beads" und Überstand. Der Überstand wird entnommen, zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), und in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert. Ein Aliquot der Suspension wird entnommen und zentrifugiert, das Pellet wird in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl- Fluorid) enthält, aufgelöst und bei 2-8°C aufbehalten.This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic "beads" using a suitable magnet, the supernatant being discarded. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, and then in a cell release buffer, the modified biotin contains, resuspended. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. An aliquot of the suspension is removed and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and stored at 2-8 ° C.
Die Zellsuspension wird nun mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 4 x 107 "beads" in 100 μl, versetzt und 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Es folgt die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" mit den Zellen werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, bevor ein definiertes Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, zugesetzt wird. Das Lysat wird mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt.The cell suspension is now "beads" in 100 uL, added with an adequate amount of magnetic "beads", which bear on their surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16 antibody, for example, 4 x 10 7 and 20 minutes at 2-8 ° C shaken or swiveled. This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic beads by means of a suitable magnet, the supernatant being discarded. The "beads" with the cells are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, before a defined volume of cell lysis Solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride). The lysate is placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt, zur Entfernung der "beads" aus den entsprechenden Lysaten ein geeigneter Magnet verwendet, und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der Überstände (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER- PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als PSA-Standard wird eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv- Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.All cell lysates are now sonicated for 5 minutes, a suitable magnet used to remove the beads from the appropriate lysates, and still centrifuged once (14000 xg, 10 minutes). A defined volume of the supernatants (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As a PSA standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Furthermore, as a cell number standard, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten beiThen 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight with aluminum foil and sealed for 30 minutes
Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt.Room temperature allowed to stand. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einerAll wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. It is directed against the detection antibody, conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) secondary antibody, such as mouse or rabbit, for example in a
Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde. Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.Concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4) added. The incubation time at room temperature is again one hour. After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / ZellzahlThe presentation of the results is carried out, for example, as pg imPSA / cell number
(CD14+CD16+ Zellen, oder auch CD14+ Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).(CD14 + CD16 + cells, or even CD14 + cells, or even mononuclear leukocytes).
4. Ausführungsbeispiel :4th embodiment
Positiv-Selektion sowohl zuerst der CD16+ Population als auch anschließend der CD14+CD16+ Population mithilfe magnetischer "beads"; Zellzahl-Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Positive selection of both the CD16 + population first and then the CD14 + CD16 + population using magnetic beads; Cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen-The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which additionally contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene buffered saline).
Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.Diamine-tetra-acetate), washed to remove the platelets.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1%The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution, which is 1%
Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert. Die Zellen werden zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten) und nach Verwerfen des Überstandes in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, resuspendiert. Eine adäquate Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, wird zugesetzt.Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved, and stored at 2-8 ° C. The suspension is incubated with 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody against the cell surface antigen CD16 at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning. The cells are centrifuged (350 × g, 8 minutes), and after discarding the supernatant at 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) but no Ca 2+ or Mg 0.1% BSA and 2 mM EDTA 2+ ions resuspended. An adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 μl, are added.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die mit Streptavidin markierten "beads" an mit DSB-X Biotin konjugiertem Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD16 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. The labeled with streptavidin "beads" bind to DSB-X biotin-conjugated antibody bound to cells with the surface antigen CD16.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mMThis is followed by the separation of the cells bound to the magnetic "beads" using a suitable magnet, the supernatant being discarded. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM
EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, und anschließend in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von "beads" und Überstand. Der Überstand wird entnommen, zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), und in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert. Ein definiertes Volumen der Suspension wird davon entnommen und zentrifugiert, das Pellet wird in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl- Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und bei 2-8°C aufbehalten.EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, washed, and then resuspended in a cell release buffer containing modified biotin. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. A defined volume of the suspension is removed therefrom and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and at 2-8 ° C keep on.
Die Zellsuspension wird nun mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD14 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt und 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Es folgt die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" mit den Zellen werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, bevor ein definiertes Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, zugesetzt wird. Das Lysat wird mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt.The cell suspension is then treated with an adequate amount of magnetic "beads" carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD14 antibody, for example, 2 x 10 7 "beads" in 50 ul, and 20 minutes at 2-8 ° C shaken or swiveled. This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic beads by means of a suitable magnet, the supernatant being discarded. The "beads" with the cells are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, before a defined volume of cell lysis Solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) is added. The lysate is placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt, zur Entfernung der "beads" aus den entsprechenden Lysaten ein geeigneter Magnet verwendet, und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der Überstände (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER- PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als PSA-Standard wird eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv- Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.All cell lysates are now sonicated for 5 minutes, a suitable magnet used to remove the beads from the appropriate lysates, and centrifuged again (14,000 x g, 10 minutes). A defined volume of the supernatants (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As a PSA standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Furthermore, as a cell number standard, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten beiThen 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight with aluminum foil and sealed for 30 minutes
Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt.Room temperature allowed to stand. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einer Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.All wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. A secondary antibody conjugated to the detection antibody conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) is used. Antibodies, for example from mouse or rabbit, for example, in a concentration of 2 ug / ml in PBS solution (pH 7.4) was added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD14+CD16+ Zellen, oder auch CD16+ Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell number (CD14 + CD16 + cells, or also CD16 + cells, or else mononuclear leukocytes).
5. Ausführunqsbeispiel :5. Exemplary embodiment:
Positiv-Selektion der CD16+ Population mithilfe magnetischer "beads"; Zellzahl- Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa- Platte.Positive selection of CD16 + population using magnetic beads; Cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt. Als Alternative können 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, woran sich die Zugabe einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution, which is 1% Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved, and stored at 2-8 ° C. The suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 μl. Alternatively, 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads. which carry streptavidin on their surface, for example 2 × 10 7 "beads" in 50 μl, followed.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die an Antikörper gekoppelten "beads" bzw. die mit Streptavidin markierten "beads" an Zellen, die an ihrer Oberfäche das Antigen CD16 tragen bzw. an mit DSB-X Biotin konjugiertem Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD16 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. In this case, the "beads" coupled to antibodies or the "beads" labeled with streptavidin bind to cells which carry the CD16 antigen on their surface or to DSB-X biotin-conjugated antibody bound to cells with the surface antigen CD16 are.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, und anschließend in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl- Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und bei 2-8°C aufbehalten.This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic "beads" using a suitable magnet, the supernatant being discarded. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, and then in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved and stored at 2-8 ° C.
Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt, zur Entfernung der "beads" aus den entsprechenden Lysaten ein geeigneter Magnet verwendet, und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der Überstände (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER- PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als PSA-Standard wird eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv- Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.All cell lysates are then sonicated for 5 minutes, a suitable magnet used to remove the beads from the appropriate lysates, and centrifuged again (14,000 xg, 10 minutes). A defined volume of the supernatants (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As a PSA standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Furthermore, as a cell number standard, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, of which 50 μl of each concentration are pipetted into at least two free wells. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt.Subsequently, 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight sealed with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einer Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.All wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. A secondary antibody, for example from mouse or rabbit, conjugated to the detection antibody and conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase), for example in a concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4), is added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD16+ Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard. The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell number (CD16 + cells, or else mononuclear leukocytes).
6. Ausführungsbeispiel :6th embodiment:
Positiv-Selektion der CD16+ Population, anschließend Negativ-Selektion der CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Population mithilfe magnetischer "beads"; Zellzahl-Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Positive selection of the CD16 + population, then negative selection of the CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " population using magnetic" beads ", cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in one Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt. Als Alternative können 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, woran sich die Zugabe einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C. The suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD16, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 μl. Alternatively, 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads. which carry streptavidin on their surface, for example 2 × 10 7 "beads" in 50 μl, followed.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die an Antikörper gekoppelten "beads" bzw. die mit Streptavidin markierten "beads" an Zellen, die an ihrer Oberfäche das Antigen CD16 tragen bzw. an mit DSB-X Biotin konjugiertem Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD16 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. In doing so, they bind to antibodies coupled "beads" or streptavidin-labeled "beads" on cells carrying on their Oberfläch the antigen CD16 or on DSB-X biotin-conjugated antibody bound to cells with the surface antigen CD16.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenenThis is followed by the separation of the bound to the magnetic "beads"
Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, und anschließend in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von "beads" und Überstand. Der Überstand wird entnommen, zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), und in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert. Ein definiertes Volumen der Suspension wird davon entnommen und zentrifugiert, das Pellet wird in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl- Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und bei 2-8°C aufbehalten.Cells using a suitable magnet, the supernatant is discarded. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, and then in a cell release buffer, the modified biotin contains, resuspended. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant is removed, centrifuged (350 xg, 8 minutes), and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. A defined volume of the suspension is removed therefrom and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and at 2-8 ° C keep on.
Die Zellsuspension wird nun mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt. Als Alternative können 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, woran sich die Zugabe einer adäquate Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The cell suspension is then mixed with an adequate amount of magnetic "beads" carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 antibody, for example, 2 x 10 7 "beads" in 50 ul. Alternatively, 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 × 10 7 "beads" in 50 μl, followed.
Es folgt nach 20minütigem Schütteln bzw. Schwenken bei 2-8°C die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand aufbehalten wird. Die "beads" mit den Zellen werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oderAfter shaking or panning at 2-8 ° C. for 20 minutes, separation of the cells bound to the magnetic "beads" is carried out using a suitable magnet, the supernatant being retained. The "beads" with the cells are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or
Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, die Waschlösung wird dem Überstand hinzugefügt und ebenso aufbehalten, die "beads" werden verworfen. Die Überstandslösung wird zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), dem Zeil-Pellet wird ein definiertes Volumen Zell- Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, zugesetzt. Das Lysat wird mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt.Mg 2+ ions, washed, the washing solution is added to the supernatant and also retained, the "beads" are discarded. The supernatant solution is centrifuged (350 × g, 8 minutes), the cell pellet is given a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) added. The lysate is placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der Überstände (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER- PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als PSA-Standard wird eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv- Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.All cell lysates are then sonicated for 5 minutes and centrifuged again (14,000 x g, 10 minutes). A defined volume of the supernatants (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which is coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8 and blocked was (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As a PSA standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Furthermore, as a cell number standard, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt.Subsequently, 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight sealed with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einer Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.All wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. It is directed against the detection antibody, conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) secondary antibody, such as mouse or rabbit, for example in a Concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4) added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Zellen, oder auch CD16+ Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else CD16 + cells, or else mononuclear leukocytes).
7. Ausführunqsbeispiel :7th embodiment:
Negativ-Selektion der CD56" bzw. CD57" bzw. CD161" Population, anschließend Positiv- Selektion der CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Population mithilfe magnetischer "beads"; Zellzahl-Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Negative selection of the CD56 " or CD57 " or CD161 " population, then positive selection of the CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " population by means of magnetic "beads"; Cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen-The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which additionally contains 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene buffered saline).
Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.Diamine-tetra-acetate), washed to remove the platelets.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt. Als Alternative können 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, woran sich die Zugabe einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions Aliquot can be removed, dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), and stored at 2-8 ° C. The suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 μl. Alternatively, 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 × 10 7 "beads" in 50 μl, followed.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die an Antikörper gekoppelten "beads" bzw. die mit Streptavidin markierten "beads" an Zellen, die an ihrer Oberfäche das Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 tragen bzw. an mit DSB-X Biotin konjugiertem Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. In this case, the "beads" coupled to antibodies or the "beads" labeled with streptavidin bind to cells which carry on their surface the antigen CD56 or CD57 or CD161 or to DSB-X biotin-conjugated antibody which binds to cells with the surface -Antigen CD56 or CD57 or CD161 are bound.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand aufbehalten wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, die Waschlösung wird dem Überstand hinzugefügt und ebenso aufbehalten, die "beads" werden verworfen. Die Überstandslösung wird zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), das Pellet wird in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert. Ein definiertes Volumen der Suspension wird davon entnommen und zentrifugiert, das Pellet wird in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und bei 2-8°C aufbehalten.This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic "beads" using a suitable magnet, the supernatant being retained. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, the wash solution is added to the supernatant and also retained, the "Beads" are discarded. The supernatant solution is centrifuged (350 xg, 8 minutes), the pellet is suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. A defined volume of the suspension is removed therefrom and centrifuged, the pellet is dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) and stored at 2-8 ° C keep on.
Die Zellsuspension wird nun mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt. Als Alternative können 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, woran sich die Zugabe einer adäquate Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The cell suspension is then mixed with an adequate amount of magnetic "beads" carrying on its surface a directed against the cell surface antigen CD16 antibody, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 ul. Alternatively, 5 μg of a modified DSB-X biotin-conjugated antibody to the Cell surface antigen CD16 are incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads carrying streptavidin on their surface, for example 2 x 10 7 "beads" 50 μl, followed.
Es folgt nach 20minütigem Schütteln bzw. Schwenken bei 2-8°C die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" mit den Zellen werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+- Ionen enthält, gewaschen, und anschließend in einem definierten Volumen Zell-Lysis- Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt.After shaking or panning at 2-8 ° C for 20 minutes, the separation of the cells bound to the magnetic "beads" by means of a suitable magnet, whereby the supernatant is discarded. The "beads" containing the cells are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, and then in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der ÜberständeAll cell lysates are then sonicated for 5 minutes and centrifuged again (14,000 x g, 10 minutes). A defined volume of the supernatants
(maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER- PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als PSA-Standard wird eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv- Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.(maximum 100 .mu.l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which has been coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 .mu.g / ml of the clone ER-PR8 and has been blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As a PSA standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Furthermore, as a cell number standard, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt. AIIe wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.Subsequently, 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight sealed with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard. All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einerAll wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. It is directed against the detection antibody, conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) secondary antibody, such as mouse or rabbit, for example in a
Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.Concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4) added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Zellen, oder auch CD56" bzw. CD57" bzw. CD161" Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else CD56 " or CD57 " or CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).
8. Ausführunqsbeispiel :8th embodiment:
Negativ-Selektion der CD56" bzw. CD57" bzw. CD161" Population mithilfe magnetischer "beads"; Positiv-Selektion der CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Negative selection of the CD56 " or CD57 " or CD161 " population by means of magnetic" beads "; positive selection of the CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 "
Population, Zellzahl-Bestimmung, und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte. Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.Population, cell number determination, and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate. The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 xg, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche einen gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 gerichteten Antikörper tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, versetzt. Als Alternative können 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert werden, woran sich die Zugabe einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C. The suspension is spiked with an adequate amount of magnetic beads carrying on its surface an antibody directed against the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161, for example 2 x 10 7 "beads" in 50 μl. Alternatively, 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 can be incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking, followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 × 10 7 "beads" in 50 μl, followed.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die an Antikörper gekoppelten "beads" bzw. die mit Streptavidin markierten "beads" an Zellen, die an ihrer Oberfäche das Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 tragen bzw. an mit DSB-X Biotin konjugiertem Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. In this case, the "beads" coupled to antibodies or the "beads" labeled with streptavidin bind to cells which carry on their surface the antigen CD56 or CD57 or CD161 or to DSB-X biotin-conjugated antibody which binds to cells with the surface -Antigen CD56 or CD57 or CD161 are bound.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenenThis is followed by the separation of the bound to the magnetic "beads"
Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand aufbehalten wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, die Waschlösung wird dem Überstand hinzugefügt und ebenso aufbehalten, die "beads" werden verworfen. Die Überstandslösung wird zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), das Pellet wird in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert.Cells using a suitable magnet, wherein the supernatant is retained. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, the wash solution is added to the supernatant and also retained, the "Beads" are discarded. The Supernatant solution is centrifuged (350 × g, 8 minutes), the pellet is suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions.
Ein definiertes Volumen der Zeil-Suspension (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96- well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die sowohl mit einem gegen das Zell-Oberflächen- Antigen CD16 gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 5 μg/ml des Klons 3G8, als auch mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER-PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Verdünnungsreihen der Suspension können hergestellt werden. Ein Restvolumen der Suspension soll aufbehalten, aber vorerst nicht eingefroren werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 2-8°C inkubiert.A defined volume of the cell suspension (maximum 100 .mu.l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate, both with a directed against the cell surface antigen CD16 mouse antibody, for example 5 ug / ml of Clone 3G8, as well as with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8, coated and blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). Serial dilutions of the suspension can be made. A residual volume of the suspension should be retained, but not frozen for the time being. The plate is sealed (for example with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature or overnight in the refrigerator at 2-8 ° C.
Die Platte wird fünf Mal mit PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen. Anschließend wird in jedes well 50 μl Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, pipettiert. Außerdem werden 25 μl der aufbehaltenen Suspension aus allen Zellen, die an ihrer Oberfäche nicht das Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 tragen, in beliebig viele, beispielsweise zwei, wells pipettiert und mit demselben Volumen Zell- Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, versetzt. Des weiteren wird als Standard eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird nun 5 Minuten auf 2-8°C gestellt und anschließend 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt (nur der Platten-Boden taucht ins Wasserbad ein, ein knapp unterhalb der Wasseroberfläche angebrachter Korb dient als Auflage).The plate is washed five times with PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions. Subsequently, 50 μl of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) are pipetted into each well. In addition, 25 .mu.l of the retained suspension from all cells which do not carry the antigen CD56 or CD57 or CD161 on their surface are pipetted into any number of wells, for example two, and with the same volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), added. Furthermore, as a standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example, between 50 pg / ml and 2 ng / ml, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is then placed for 5 minutes at 2-8 ° C and then treated for 5 minutes in an ultrasonic bath (only the plate bottom immersed in the water, a just below the water surface mounted basket serves as a support).
Nach Versiegelung der Platte und Inkubation bei Raumtemperatur (eine Stunde) oder bei 2-8°C (über Nacht) wird als Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH- Positiv-Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500- Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa- Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After plate sealing and incubation at room temperature (one hour) or at 2-8 ° C (overnight), a standard dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution starting, for example, from 1 / 2500th Dilution prepared, of which 50 μl of each concentration are pipetted into at least two free wells. Then add to each incubated well of the plate 50 .mu.l LDH substrate solution was added, the plate is light-tight sealed with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and measured the light absorptions of all wells in a Elisa plate reader at 492 nm. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einer Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.All wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. A secondary antibody, for example from mouse or rabbit, conjugated to the detection antibody and conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase), for example in a concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4), is added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Zellen, oder auch CD56" bzw. CD57" bzw. CD161" Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten). 9. Ausführungsbeispiel :The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else CD56 " or CD57 " or CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes). 9th embodiment:
Positiv-Selektion der CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Population mithilfe einmaliger Anwendung magnetischer "beads"; Zellzahl-Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte.Positive selection of the CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " population using single use of magnetic beads; cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate.
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 M Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.The starting point is 6 ml of whole blood taken in a tube containing a polyester gel and a 0.1 M sodium citrate solution. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert, ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2- 8°C aufbewahrt werden. Die Suspension wird mit 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD16 und mit der gleichen Menge (5 μg) eines mit Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell- Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 versetzt. Die Suspension wird bei 2- 8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert, woran sich die Zugabe einer adäquaten Menge magnetischer "beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 "beads" in 50 μl, anschließt.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, an aliquot can be taken, in a defined volume of cell Lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C. The suspension is spiked with 5 μg of a DSB-X biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD16 and the same amount (5 μg) of a biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 , The suspension is incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning, followed by the addition of an adequate amount of magnetic beads carrying streptavidin on its surface, for example 2 × 10 7 beads in 50 μl ,
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen "beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die mit Streptavidin markierten "beads" an mit Biotin als auch mit DSB-X Biotin konjugierte Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 bzw. mit dem Oberflächen-Antigen CD16 gebunden sind. Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen "beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die "beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, die Waschlösung wird verworfen, die "beads" werden anschließend in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von "beads" und Überstand. Der Überstand, der nur CD16+CD56" oder CD16+CD57" oder CD16+CD161" Zellen enthält, wird entnommen, zentrifugiert (350 x g, 8 Minuten), das Pellet wird in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or swirled at 2-8 ° C for 20 minutes. The labeled with streptavidin "beads" bind to biotin as well as with DSB-X biotin conjugated antibodies that are bound to cells with the surface antigen CD56 or CD57 or CD161 or with the surface antigen CD16. This is followed by the separation of the cells bound to the magnetic "beads" using a suitable magnet, the supernatant being discarded. The "beads" are washed several times with a PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions, the washing solution is discarded, the "beads" are subsequently in a cell release buffer containing modified biotin resuspended. The suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant containing only CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells is removed, centrifuged (350xg, 8 minutes), the pellet is placed in a defined volume cell lysis solution containing 1% Triton and ImM contains PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), dissolved and placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes.
Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der ÜberständeAll cell lysates are then sonicated for 5 minutes and centrifuged again (14,000 x g, 10 minutes). A defined volume of the supernatants
(maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem gegen PSA gerichteten Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER- PR8, gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als PSA-Standard wird eine Verdünnungsreihe von rekombinantem PSA, beispielsweise zwischen 50 pg/ml und 2 ng/ml, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv- Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.(maximum 100 .mu.l) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate which has been coated with a mouse antibody directed against PSA, for example 1 .mu.g / ml of the clone ER-PR8 and has been blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As a PSA standard, a serial dilution of recombinant PSA, for example between 50 pg / ml and 2 ng / ml, is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Furthermore, as a cell number standard, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, prepared, of which 50 .mu.l of each concentration in at least two free wells are pipetted. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt. Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Daraufhin werden die wells eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen, gegen PSA gerichteten, Detektions-Antikörper aus Ziege, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), inkubiert.Subsequently, 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight sealed with aluminum foil and allowed to stand for 30 minutes at room temperature. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard. All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. The wells are then incubated for one hour at room temperature with a polyclonal, anti-PSA detection antibody from goat, for example at a concentration of 0.5 ug / ml in PBS solution (pH 7.4).
Alle wells werden nun abermals fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Es wird ein gegen den Detektions-Antikörper gerichteter, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) konjugierter Sekundär- Antikörper, beispielsweise aus Maus oder Kaninchen, beispielsweise in einerAll wells are again washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20. It is directed against the detection antibody, conjugated with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) secondary antibody, such as mouse or rabbit, for example in a
Konzentration von 2 μg/ml in PBS-Lösung (pH 7.4), zugesetzt. Die Inkubationszeit bei Raumtemperatur beträgt wiederum eine Stunde.Concentration of 2 μg / ml in PBS solution (pH 7.4) added. The incubation time at room temperature is again one hour.
Nachdem alle wells neuerlich fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen wurden, werden pro well 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung zugesetzt. Die Inkubationszeit beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.After all wells have again been washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20, 100 μl of a substrate solution containing TMB (tetramethylbenzidine) are added per well. The incubation period is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).
10. Ausführunqsbeispiel:10th embodiment:
Isolierung der CD14+CD16+ oder CD16+ oder CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Population mithilfe magnetischer „beads", wie im 3., 4., 5., 6., 7., und 9. Ausführungsbeispiel beschrieben; entweder davor oder danach Zugabe eines Antikörpers gegen den molekularen Marker, hier imPSA, unter Permeabilisierung der Zellen; Zellzahl-Bestimmung und Quantifizierung des molekularen Markers, hier imPSA, in einer Elisa-Platte. Ausführung beschrieben für Isolierung der CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Population nach dem 9. Ausführungsbeispiel:Isolation of the CD14 + CD16 + or CD16 + or CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " population using magnetic" beads ", as in the 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, and 9th embodiment described; either before or after adding an antibody against the molecular marker, here in the PSA, to permeabilize the cells; Cell number determination and quantification of the molecular marker, here in the PSA, in an Elisa plate. Embodiment described for isolation of CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " population according to the 9th embodiment:
Ausgegangen wird von 6 ml Vollblut, das in einem ein Polyester-Gel und eine 0.1 MThe starting point is 6 ml of whole blood, which in one is a polyester gel and a 0.1 M
Natrium-Zitrat-Lösung enthaltenden Röhrchen abgenommen wird. Durch Zentrifugation des Blutes (beispielsweise 1800 x g, 20 Minuten) werden alle mononukleären Leukozyten zusammen mit den Thrombozyten oberhalb des Gels isoliert.Sodium citrate solution containing tubes is removed. By centrifugation of the blood (for example 1800 x g, 20 minutes), all mononuclear leukocytes are isolated together with the platelets above the gel.
Die isolierten Zellen werden zweimal mit PBS (phosphate buffered saline)-Lösung (pH 7.4), die zusätzlich 0.1% BSA (bovine serum albumin) und 2 mM EDTA (Ethylen- Diamin-tetra-Acetat) enthalten kann, gewaschen, um die Thrombozyten zu entfernen.The isolated cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline) solution (pH 7.4), which may additionally contain 0.1% BSA (bovine serum albumin) and 2 mM EDTA (ethylene-diamine-tetra-acetate), to the platelets to remove.
Die isolierten mononukleären Leukozyten werden in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert und mit 5 μg eines mit modifiziertem DSB-X Biotin konjugierten Antikörpers gegen das ZeII- Oberflächen-Antigen CD16 und mit der gleichen Menge (5 μg) eines mit Biotin konjugierten Antikörpers gegen das Zell-Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 versetzt. Die Suspension wird bei 2-8°C 10 Minuten unter Schütteln bzw. Schwenken inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBS-Lösung (pH 7.4) werden die Zellen in 0.5 ml Fixierungsreagens (beispielsweise l%ige Formalin-Lösung) suspendiert, nach 10 min mit PBS-Lösung (pH 7.4) gewaschen, danach in 100 μl Permeabilisierungsmedium aufgenommen und ca. 20 Minuten mit einem gegen PSA gerichteten, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) oder mit Biotin konjugierten, Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER-PR8, inkubiert. Danach werden die Zellen mit einer PBS-Lösung (pH 7.4) gewaschen und in 0.5 ml PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, suspendiert; ein Aliquot kann entnommen, in einem definierten Volumen ZeII- Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2-8°C aufbewahrt werden. Daran schließt sich die Zugabe einer adäquaten Menge magnetischer „beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 „beads" in 50 μl. Alternativ dazu kann die Behandlung der Zellen mit Fixierungsreagens und Permeabilisierungsmedium an dieser Stelle des Protokolls unterbleiben, wobei nach Entnahme eines Aliquots, das in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl- Fluorid) enthält, aufgelöst, und bei 2-8°C aufbewahrt wird, die Zellen sofort mit einer adäquaten Menge magnetischer „beads", die an ihrer Oberfläche Streptavidin tragen, beispielsweise 2 x 107 „beads" in 50 μl, inkubiert werden.The isolated mononuclear leukocytes are suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions and conjugated with 5 μg of a modified DSB-X biotin Antibody against the cell surface antigen CD16 and with the same amount (5 ug) of a biotin-conjugated antibody to the cell surface antigen CD56 or CD57 or CD161 added. The suspension is incubated at 2-8 ° C for 10 minutes with shaking or panning. After a washing step with PBS solution (pH 7.4), the cells are suspended in 0.5 ml fixation reagent (for example 1% formalin solution), washed after 10 min with PBS solution (pH 7.4), then taken up in 100 μl permeabilization medium and incubated for approx For 20 minutes, incubate with an anti-PSA enzyme conjugated with the HRP (horseraddish peroxidase) or biotin-conjugated mouse antibody, for example 1 μg / ml of the clone ER-PR8. Thereafter, the cells are washed with a PBS solution (pH 7.4) and suspended in 0.5 ml of PBS solution (pH 7.4) containing 0.1% BSA and 2 mM EDTA but no Ca 2+ or Mg 2+ ions; an aliquot can be taken, dissolved in a defined volume of zeolysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), and stored at 2-8 ° C. This is followed by the addition of an adequate amount of magnetic "beads" carrying streptavidin on their surface, for example 2 × 10 7 "beads" in 50 μl. Alternatively, treatment of the cells with fixative reagent and permeabilization medium may be omitted at this point in the protocol, and after removal of an aliquot, take place in a defined manner Volume cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) dissolved and stored at 2-8 ° C, the cells immediately with an adequate amount of magnetic beads, the carry on their surface streptavidin, for example, 2 x 10 7 "beads" in 50 ul, incubated.
Danach wird die Suspension aus mononukleären Leukozyten und magnetischen „beads" 20 Minuten bei 2-8°C geschüttelt bzw. geschwenkt. Dabei binden die mit Streptavidin markierten „beads" an mit Biotin als auch an mit DSB-X Biotin konjugierte Antikörper, die an Zellen mit dem Oberflächen-Antigen CD56 oder CD57 oder CD161 bzw. mit dem Oberflächen-Antigen CD16 gebunden sind.Thereafter, the suspension of mononuclear leucocytes and magnetic beads is shaken or pivoted for 20 minutes at 2-8 ° C. The streptavidin-labeled beads of biotin-conjugated to DSB-X biotin bind to the antibodies Cells are bound to the surface antigen CD56 or CD57 or CD161 or to the surface antigen CD16.
Daran schließt sich die Abtrennung der an die magnetischen „beads" gebundenen Zellen mithilfe eines geeigneten Magneten, wobei der Überstand verworfen wird. Die „beads" werden mehrmals mit einer PBS-Lösung (pH 7.4), die 0.1% BSA und 2 mM EDTA aber keine Ca2+ oder Mg2+-Ionen enthält, gewaschen, die Waschlösung wird verworfen, die „beads" werden anschließend in einem Zellfreisetzungs-Puffer, der modifiziertes Biotin enthält, resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt bzw. geschwenkt, gefolgt von der magnetischen Trennung von „beads" und Überstand. Der Überstand, der nur CD16+CD56" oder CD16+CD57" oder CD16+CD161" Zellen enthält, wird entnommen und zentrifugiert (350 x g, 8This is followed by separation of the cells bound to the magnetic beads by means of a suitable magnet, the supernatant being discarded The beads are washed several times with a PBS solution (pH 7.4), the 0.1% BSA and 2 mM EDTA does not contain any Ca 2+ or Mg 2+ ions, washed, the wash solution is discarded, the beads are then resuspended in a cell release buffer containing modified biotin, the suspension is shaken for 10 minutes at room temperature, followed by magnetic separation of beads and supernatant. The supernatant containing only CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells is removed and centrifuged (350 xg, 8
Minuten). Das Pellet wird nach Verwerfen des Überstandes, falls schon eine Zugabe des gegen imPSA gerichteten Antikörpers unter Permeabilisierung der Zellen erfolgte, in einem definierten Volumen Zell-Lysis-Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl- Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt. Andernfalls wird das Pellet nach Verwerfen des Überstandes in 0.5 mlMinutes). The pellet is discarded after discarding the supernatant, even if an addition of the antibody directed against imPSA to permeabilization of the cells, in a defined volume cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) , dissolved and placed at 2-8 ° C for at least 5 minutes. Otherwise, the pellet is discarded after discarding the supernatant in 0.5 ml
Fixierungsreagens (beispielsweise l%ige Formalin-Lösung) suspendiert, nach 10 min mit PBS-Lösung (pH 7.4) gewaschen, danach in 100 μl Permeabilisierungsmedium aufgenommen und ca. 20 Minuten mit einem gegen PSA gerichteten, mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) oder Biotin konjugierten, Maus-Antikörper, beispielsweise 1 μg/ml des Klons ER-PR8, inkubiert. Danach werden die Zellen mit einer PBS-Lösung (pH 7.4) gewaschen und in einem definierten Volumen Zell-Lysis- Lösung, die 1% Triton und ImM PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid) enthält, aufgelöst und mindestens 5 Minuten auf 2-8°C gestellt. Alle Zell-Lysate werden nun 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt und noch einmal zentrifugiert (14000 x g, 10 Minuten). Ein definiertes Volumen der Überstände (maximal 100 μl) wird pro well in eine 96-well Maxi-Sorp-Platte pipettiert, die mit einem polyklonalen gegen Maus-Immunglobulin gerichteten Antikörper (bei Verwendung eines mit HRP konjugierten gegen PSA gerichteten Antikörpers), beispielsweise in einer Konzentration von 2 μg/ml, oder mit Avidin bzw. Streptavidin (bei Verwendung eines mit Biotin konjugierten gegen PSA gerichteten Antikörpers) gecoatet ist und geblockt wurde (beispielsweise mit einer 5%igen FCS (fetal calf serum) -Lösung). Als Standard wird eine Verdünnungsreihe des mit dem Enzym HRP (horseraddish peroxidase) oder mit Biotin konjugierten Maus-Antikörper-Klons ER-PR8, hergestellt, wovon ein definiertes Volumen jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert wird. Davon kann auf die Menge an gebundenem imPSA rückgerechnet werden. Des weiteren wird als Zellzahl-Standard eine Verdünnungsreihe der geeichten LDH-Positiv-Kontrolle in Zell-Lysis-Lösung, beispielsweise beginnend ab einer 1/2500-Verdünnung, hergestellt, wovon 50 μl von jeder Konzentration in je mindestens zwei freie wells pipettiert werden. Die Platte wird versiegelt (beispielsweise mit Frischhalte-Folie oder Alufolie) und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.Fixing reagent (for example 1% formalin solution), washed after 10 min with PBS solution (pH 7.4), then taken up in 100 ul Permeabilisierungsmedium and about 20 minutes with a directed against PSA, with the enzyme HRP (horseraddish peroxidase) or biotin conjugated, mouse antibody, for example, 1 μg / ml of the clone ER-PR8, incubated. Thereafter, the cells are washed with a PBS solution (pH 7.4) and dissolved in a defined volume of cell lysis solution containing 1% Triton and ImM PMSF (phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride) for at least 5 minutes -8 ° C. All cell lysates are then sonicated for 5 minutes and centrifuged again (14,000 xg, 10 minutes). A defined volume of the supernatants (maximum 100 μl) is pipetted per well into a 96-well Maxi-Sorp plate coated with a polyclonal antibody directed against mouse immunoglobulin (using a HRP-conjugated antibody directed against PSA), e.g. 2 μg / ml, or coated with avidin or streptavidin (using a biotin-conjugated anti-PSA antibody) and blocked (for example with a 5% FCS (fetal calf serum) solution). As standard, a dilution series of the HRP (horseraddish peroxidase) or biotin-conjugated mouse antibody clone ER-PR8 is prepared, of which a defined volume of each concentration is pipetted into at least two free wells. Of this, the amount of bound imPSA can be recalculated. Furthermore, a dilution series of the calibrated LDH positive control in cell lysis solution, for example starting from a 1/2500 dilution, is prepared as the cell number standard, of which 50 μl of each concentration are pipetted into at least two free wells. The plate is sealed (for example, with cling film or aluminum foil) and incubated for one hour at room temperature.
Anschließend werden zu jedem inkubierten well der Platte 50 μl LDH-Substrat-Lösung zugegeben, die Platte wird lichtdicht mit Alufolie versiegelt und 30 Minuten beiThen 50 μl of LDH substrate solution are added to each incubated well of the plate, the plate is light-tight with aluminum foil and sealed for 30 minutes
Raumtemperatur stehengelassen. Danach werden alle inkubierten wells mit je 50 μl Stopp-Lösung (IM CH3COOH) versetzt, alle großen Luftblasen mit einer Nadel zerstochen, und die Licht-Absorptionen aller wells in einem Elisa-Plattenleser bei 492 nm gemessen. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Zellzahl proportional, welche sich anhand des Zellzahl-Standards bestimmen läßt.Room temperature allowed to stand. Thereafter, all incubated wells each with 50 .mu.l stop solution (IM CH 3 COOH) were added, all large air bubbles pierced with a needle, and the light absorptions of all wells in an Elisa plate reader at 492 nm measured. The intensity of the measured absorption is proportional to the number of cells, which can be determined by the cell number standard.
Alle wells werden nun fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen und bei Verwendung eines mit HRP konjugierten, gegen PSA gerichteten Antikörpers mit 100 μl einer TMB (Tetramethyl-Benzidin) enthaltenden Substrat-Lösung versetzt. Bei Verwendung eines mit Biotin konjugierten, gegen PSA gerichteten Antikörpers wird zuvor eine Stunde lang mit einem mit HRP konjugierten polyklonalen gegen Maus-Immunglobulin gerichteten Antikörper, beispielsweise in einer Konzentration von 0.5 μg/ml, inkubiert, danach werden alle wells fünf Mal mit PBS-Lösung, die 0.05% oder 0.1% Tween-20 enthält, gewaschen. Die Inkubationszeit mit TMB enthaltender Substrat-Lösung beträgt 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach werden in jedes well 50 μl einer Stopp-Lösung (beispielsweise IM H2SO4) pipettiert. Zuletzt wird die Licht-Absorption der wells in einem Elisa-Plattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen, die Absorption bei 570 nm wird subtrahiert. Die Intensität der gemessenen Absorption ist der Menge an imPSA proportional, welche sich anhand des Standards bestimmen läßt.All wells are now washed five times with PBS solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20 and treated with 100 μl of a TMB (tetramethylbenzidine) -containing substrate solution using an HRP conjugated anti-PSA antibody , If a biotin-conjugated antibody directed against PSA is first incubated for one hour with an HRP-conjugated polyclonal antibody directed against mouse immunoglobulin, for example at a concentration of 0.5 μg / ml, then all wells are washed five times with PBS reagent. Solution containing 0.05% or 0.1% Tween-20 washed. The incubation period with TMB-containing substrate solution is 15 minutes at room temperature, then 50 μl of a stop solution (for example IM H 2 SO 4 ) are pipetted into each well. Finally, the light absorption of the wells is measured in an Elisa plate reader at a wavelength of 450 nm, the absorption at 570 nm is subtracted. The intensity of the measured absorbance is proportional to the amount of imPSA which can be determined by the standard.
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt beispielsweise als pg imPSA / Zellzahl (CD16+CD56" bzw. CD16+CD57" bzw. CD16+CD161" Zellen, oder auch Mononukleäre Leukozyten).The results are displayed, for example, as pg imPSA / cell count (CD16 + CD56 " or CD16 + CD57 " or CD16 + CD161 " cells, or else mononuclear leukocytes).
An dieser Stelle sei erwähnt, dass alle oben genannten Ausführungsbeispiele, die beispielhaft die Quantifizierung von imPSA demonstrieren, explizit auch zur Charakterisierung aller anderen oben genannten, insbesondere der in Anspruch 9 genannten, molekularen Marker anzuwenden sind und die Quantifizierung dieser Marker analog zur Quantifizierung von imPSA erfolgt. Weiterhin sei darauf hingewiesen, dass zur Bestimmung der jeweiligen molekularen Marker oder den jeweiligen Epitopen derselben die diesen Markern und/oder Epitopen jeweils zugeordneten Antikörper verwendet werden.It should be mentioned at this point that all of the abovementioned exemplary embodiments, which exemplarily demonstrate the quantification of imPSA, are also to be used explicitly to characterize all the other abovementioned molecular markers mentioned above, in particular the quantification of these markers analogously to the quantification of imPSA he follows. It should also be pointed out that the antibodies assigned to these markers and / or epitopes are used to determine the respective molecular markers or the respective epitopes thereof.
An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, daß alle oben beschriebenen Teile für sich alleine gesehen und in jeder Kombination, insbesondere die in der Zeichnung dargestellten Details, als erfindungswesentlich beansprucht werden. Abänderungen hiervon sind dem Fachmann geläufig. At this point, it should be noted that all the above-described parts taken alone and in any combination, in particular the details shown in the drawing, are claimed as essential to the invention. Variations thereof are familiar to the person skilled in the art.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Charakterisierung, insbesondere Quantifizierung, von durch, aus dem Gewebe in die Blutbahn rezirkulierten, Blutmakrophagen intrazellulär aus1. A method for the characterization, in particular quantification, of intracellular blood macrophages recirculated from the tissue into the bloodstream
Gewebe aufgenommenen molekularen Marker(n), g e k e n n z e i c h n e t d u r c h folgende Schritte:Tissue Molecular Marker (s) Taken In The Following Steps:
Anwenden eines Mittels auf Vollblut, welches das Verklumpen und/oder Gerinnen von Vollblut hemmt;Applying an agent to whole blood which inhibits clumping and / or clotting of whole blood;
Durchführen einer Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung von Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen aus dem Vollblut;Performing a selection and / or enrichment and / or separation of blood macrophages or blood macrophage containing leukocyte populations from the whole blood;
Durchführung einer Perforation und/oder Lyse der selektierten Blut- makrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen, gegebenenfalls nach vorheriger optionaler Permeabilisierung der selektierten Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen;Perforation and / or lysis of the selected blood macrophages or blood macrophage-containing leukocyte populations, optionally after previous optional permeabilization of the selected blood macrophages or blood macrophage-containing leukocyte populations;
Durchführung einer qualitativen und quantitativen Bestimmung von phagozytierten, nicht-blutmakrophageneigenen Markern, nämlich aus Gewebe stammenden molekularen Markern, nach vorheriger Perforation und/oder Lyse der Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen.Carrying out a qualitative and quantitative determination of phagocytosed, non-blood macrophage-own markers, namely tissue-derived molecular markers, after prior perforation and / or lysis of the blood macrophages or blood macrophage containing leukocyte populations.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung der Blutmakrophagen mittels einer Positiv-Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächen- marker CD16 gerichteten Antikörpern durchgeführt wird.2. Method according to claim 1, wherein the selection and / or accumulation and / or separation of the blood macrophages is carried out by means of a positive selection using antibodies directed against the surface marker CD16.
3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s vorzugsweise nach oder gegebenenfalls vor der Positiv-Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächenmarker CD16 gerichteten Antikörpern eine Po- sitiv-Selektion unter Verwendung von gegen den Oberflächenmarker CD14 gerichteten Antikörpern durchgeführt wird.3. The method according to claim 2, characterized in that preferably after or optionally before the positive selection using antibodies directed against the surface marker CD16 antibodies a sitiv selection using antibodies directed against the surface marker CD14.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine Negativ-Selektion zum Ausschluss von Zellen mit den Oberflächenmarkern CD56 und/oder CD57 und/oder CD161 unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt wird, die gegen die Oberflächenmarker CD56 und/oder CD57 und/oder CD161 gerichtet sind.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a negative selection is carried out for the exclusion of cells with the surface markers CD56 and / or CD57 and / or CD161 using antibodies against the surface marker CD56 and / or CD57 and / or CD161.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine Positiv- oder Negativ-Selektion unter Verwendung von, vorzugsweise reversibel, koppelbaren magnetischen "beads" durchgeführt wird.5. Method according to one of the preceding claims, characterized in that a positive or negative selection is carried out using, preferably reversibly, coupled magnetic "beads".
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine Positiv- oder Negativ-Selektion unter Verwendung von an eine ELISA-Platte gekoppelten Antikörpern durchgeführt wird.6. Method according to one of the preceding claims 1 to 4, wherein a positive or negative selection is carried out using antibodies coupled to an ELISA plate.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine quantitative Bestimmung der mononukleären Leukozyten-Populationen in einer Elisa-Platte, vorzugsweise durch Messung der Laktat-Dehydrogenase- Aktivität mittels Elisa-Plattenleser, besonders bevorzugt in derselben Elisa-7. Method according to one of the preceding claims, characterized in that a quantitative determination of the mononuclear leukocyte populations in an Elisa plate, preferably by measuring the lactate dehydrogenase activity by Elisa plate reader, particularly preferably in the same Elisa-
Platte, in der eine qualitative und quantitative Bestimmung der molekularen Marker, insbesondere nicht-blutmakrophageneigener Antigene, durchgeführt wird.Plate in which a qualitative and quantitative determination of the molecular marker, in particular non-blood macrophage antigens, is performed.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Durchführung einer quantitativen Bestimmung der vorhandenen Menge an phagozytierten, nicht-blutmakrophageneigenen aus Gewebe stammenden mole- kularen Markern mittels Elisa-Plattenleser und/oder Chemolumineszenz- Meßgerät durchgeführt wird.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the implementation of a quantitative determination of the existing amount of phagocytosed, non-blood macrophage own tissue-derived mole- gular markers by means of Elisa plate reader and / or Chemolumineszenz- measuring device is performed.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s als molekulare Marker, insbesondere Gewebe-Marker und/oder serologische Marker abnorme DNA-Methylierung;9. Method according to one of the preceding claims, characterized in that as molecular markers, in particular tissue markers and / or serological markers, abnormal DNA methylation;
AFP (α-1-Fetoprotein); - AHCY (S-Adenosyl-Homocystein-Hydrolase);AFP (α-1 fetoprotein); AHCY (S-adenosyl homocysteine hydrolase);
AMY2 (Pankreas-Amylase);AMY2 (pancreatic amylase);
CA 15-3 (Synonyme: MUCl, EMA, CD227);CA 15-3 (Synonyms: MUCl, EMA, CD227);
CA 19-9;CA 19-9;
CA 50; - CA 72-4 (Synonym: TAG72);APPROX. 50; - CA 72-4 (synonym: TAG72);
CA 125 (Synonym: MUC16);CA 125 (synonym: MUC16);
Calcitonin;calcitonin;
Calprotectin;calprotectin;
CCSA-2 (colon cancer-specific antigen-2); - CCSP-2 (colon Cancer secreted protein-2);CCSA-2 (colon cancer-specific antigen-2); - CCSP-2 (colon cancer secreted protein-2);
CEA (carcinoembryonic antigen);CEA (carcinoembryonic antigen);
CYP24A1;CYP24A1;
Cytokeratin (CK) 8 und Fragmente davon;Cytokeratin (CK) 8 and fragments thereof;
CK18 und Fragmente davon; - CK19 und Fragmente davon;CK18 and fragments thereof; CK19 and fragments thereof;
CRP (C-reaktives Protein);CRP (C-reactive protein);
Cystatin B;Cystatin B;
DDH (Dihydrodiol-Dehydrogenase);DDH (dihydrodiol dehydrogenase);
DKK-I (Dikkopf-1); - GP73 (Golgi Protein-73) (Synonym: GOLPH2);DKK-I (Dikkopf-1); - GP73 (Golgi protein-73) (synonym: GOLPH2);
HE4 (human epididymis protein 4);HE4 (human epididymis protein 4);
HER2/neu;HER2 / neu;
HSP (heat shock protein)-27;HSP (heat shock protein) -27;
Mac-2 BP (Mac-2 binding protein); Mammaglobin A;Mac-2 BP (Mac-2 binding protein); Mammaglobin A;
Mammaglobin B;Mammaglobin B;
MIA (melanoma-inhibitory activity);MIA (melanoma-inhibitory activity);
MnSOD (Mangan-Superoxiddismutase); - PARK7 (Synonym: DJ-I);MnSOD (manganese superoxide dismutase); - PARK7 (synonym: DJ-I);
ProGRP (progastrin-releasing peptide);ProGRP (progastrin-releasing peptide);
NSE (neuron-specific enolase);NSE (neuron-specific enolase);
Pan-Cytokeratin;Pan-cytokeratin;
Pro-MMP (Pro-Matrix-Metalloproteinase)-7; - PSA (Prostata-spezifisches Antigen);Pro-MMP (Pro-Matrix Metalloproteinase) -7; - PSA (prostate-specific antigen);
S100A8;S100A8;
S100A9;S100A9;
S-100beta;S-100beta;
SCCAl (squamous cell Carcinoma antigen 1); - SCCA2 (squamous cell Carcinoma antigen 2);SCCA1 (squamous cell carcinoma antigen 1); SCCA2 (squamous cell carcinoma antigen 2);
Thyroglobulin;thyroglobulin;
UHRFl (ubiquitin-like with/containing PHD and ring-finger domains 1);UHRFl (ubiquitin-like with / containing PHD and ring-finger domains 1);
URG4 (Up-regulated gene 4); undURG4 (Up-regulated gene 4); and
YKL-40 (Synonym: CHI3-L1), auch in Kombination(en), verwendet werden.YKL-40 (synonym: CHI3-L1), also in combination (s).
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s als Mittel gegen Verklumpen und/oder Gerinnen Heparin oder ein anderes ge- eignetes Anti-Koagulans verwendet wird.10. Method according to one of the preceding claims, wherein a heparin or another suitable anti-coagulant is used as the anti-agglutination and / or clotting agent.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Perforation oder Lyse der Makrophagen bzw. diese enthaltender Leukozyten- Populationen mittels einer Saponinbehandlung oder einer Behandlung mit Triton-Lösung durchgeführt wird.11. Method according to one of the preceding claims, wherein the perforation or lysis of the macrophages or of the leukocyte populations containing them is carried out by means of a saponin treatment or a treatment with Triton solution.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s zur Bestimmung von nicht-blutmakrophageneigenen Antigenen, gegebenenfalls mit Biotin, HRP (horseraddish peroxidase), AP (Alkalische Phosphatase), oder Lumineszenzfarbstoffen konjugierte, Antikörper, insbesondere der Immunglobu- lin-Klasse G (IgG) und Fab- bzw. F(ab)2-Fragmente, und/oder Aptamere, insbe- sondere ausgewählt aus: anti-Maus IgG (polyklonal); anti-Kaninchen IgG (polyklonal); anti-Ziege IgG (polyklonal); anti-Ratte IgG (polyklonal); - anti-Esel IgG (polyklonal); anti-AFP (Klon AFP-Ol); anti-AFP (Klon AFP-I l); anti-AFP (Klon 4A3); anti-AFP (Klon 5H7); - anti-AFP (Klon M803209); anti-AFP (Klon M0151611); anti-AFP (Klon M0151608); anti-AFP (polyklonal); anti-AHCY (Klon 1E11-1A7); - anti-AHCY (Klon 2F11-1D10); anti-AHCY (Klon 4H2); anti-AHCY (Klon Ml); anti-AHCY (Klon M2); anti-AHCY (polyklonal); - anti-AMY2 (Klon 6A9/1); anti-AMY2 (Klon 501); anti-AMY2 (Klon 503); anti-AMY2 (Klon 10-102.5); anti-AMY2 (polyklonal); - anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M2C5); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M9E7); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M4H2); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M8C9); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M10G4); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M10H6); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon M3A106); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon C595(NCRC48)); anti-CA 15-3/MUC1 (Klon E29); - anti-CA 15-3/MUC1 (polyklonal); anti-CA 19-9 (Klon 121SLE); anti-CA 19-9 (polyklonal); anti-CA 50 (Klon M991149); anti-CA 50 (Klon 93); - anti-CA 50 (polyklonal); anti-CA 72-4/TAG72 (Klon SPM148); anti-CA 72-4/TAG72 (polyklonal); anti-CA 125/MUC16 (Klon 2Fl); anti-CA 125/MUC16 (Klon 10G12); - anti-CA 125/MUC16 (Klon X75); anti-CA 125/MUC16 (Klon X325); anti-CA 125/MUC16 (polyklonal); anti-Calcitonin (Klon SP17); anti-Calcitonin (Klon 13B9); - anti-Calcitonin (Klon 13f2); anti-Calcitonin (Klon 24B2); anti-Calcitonin (polyklonal); anti-Calprotectin (Klon 27E10); anti-Calprotectin (polyklonal); - anti-CCSA-2 (polyklonal); anti-CCSP-2 (polyklonal); anti-CEA (Klon CoI-I); anti-CEA (Klon 1C7); anti-CEA (Klon IClO); - anti-CEA (Klon ICH); anti-CEA (polyklonal); anti-CYP24Al (Klon IEl); anti-CYP24Al (Klon 1F8); anti-CYP24Al (polyklonal); anti-CK8 (Klon 24); anti-CK8 (Klon LP3K); anti-CK8 (polyklonal); anti-CK18 (Klon DC-IO); - anti-CK18 (Klon DA-7); anti-CK18 (Klon LDK18); anti-CK18 (polyklonal); anti-CK19 (Klon A53-B/A2); anti-CK19 (Klon BA17); - anti-CK19 (Klon 236-11221); anti-CK19 (polyklonal); anti-CRP (Klon 232007); anti-CRP (Klon 232024); anti-CRP (Klon C2); - anti-CRP (Klon C4); anti-CRP (Klon C5); anti-CRP (Klon C6); anti-CRP (Klon C7); anti-CRP (polyklonal); - anti-Cystatin B (Klon 2Fl); anti-Cystatin B (Klon 8k275); anti-Cystatin B (Klon B-02); anti-Cystatin B (Klon RJMW-2E7); anti-Cystatin B (polyklonal); - anti-DDH (Klon TlOl); anti-DDH (polyklonal); anti-DKK-1 (Klon 141135); anti-DKK-1 (polyklonal); anti-GP73/GOLPH2 (Klon YA-14); - anti-GP73/GOLPH2 (Klon 5B10); anti-GP73/GOLPH2 (polyklonal); anti-HE4 (Klon C-12); anti-HE4 (polyklonal); anti-HER2/neu (Klon 10C7); anti-HER2/neu (Klon 191924); anti-HER2/neu (Klon N3/D10); anti-HER2/neu (polyklonal); anti-HSP-27 (Klon G3.1); - anti-HSP-27 (Klon AF5E5); anti-HSP-27 (Klon F-4); anti-HSP-27 (Klon 2A5); anti-HSP-27 (polyklonal); anti-Mac-2 BP (Klon SP-2); - anti-Mac-2 BP (polyklonal); anti-Mammaglobin A (Klon 1G8D6, synonym 2E7G9); anti-Mammaglobin A (Klon 304-1A5); anti-Mammaglobin A (polyklonal); anti-Mammaglobin B (Klon E-17); - anti-Mammaglobin B (polyklonal); anti-MIA (Klon 3A6); anti-MIA (polyklonal); anti-MMP-7 (Klon 6A4); anti-MMP-7 (Klon 176-5F12); - anti-MMP-7 (Klon 141-7B2); anti-MMP-7 (Klon 377313); anti-MMP-7 (polyklonal); anti-MnSOD (Klon IAE); anti-MnSOD (Klon 2Al); - anti-MnSOD (Klon 4F10); anti-MnSOD (Klon 23G5); anti-MnSOD (Klon 37CT127.5.11.6); anti-MnSOD (polyklonal); anti-PARK7/DJ-l (Klon IBIl); - anti-PARK7/DJ-l (Klon 1D7); anti-PARK7/DJ-l (Klon 6A65); anti-PARK7/DJ-l (Klon 3055); anti-PARK7/DJ-l (Klon A-9); anti-PARK7/DJ-l (Klon D-4); anti-PARK7/DJ-l (Klon E2); anti-PARK7/DJ-l (polyklonal); anti-proGRP (Klon pGRP5); anti-proGRP (Klon E146); - anti-proGRP (Klon E172); anti-GRP (Klon 76-E6); anti-proGRP (polyklonal); anti-GRP (polyklonal); anti-NSE (Klon ICl); - anti-NSE (Klon 5A4); anti-NSE (Klon 5E2); anti-NSE (Klon 5G10); anti-NSE (polyklonal); anti-Pan-Cytokeratin (Klon 7H8C4); - anti-Pan-Cytokeratin (Klon B311.1); anti-Pan-Cytokeratin (Klon CIl); anti-Pan-Cytokeratin (Klon D-12); anti-Pan-Cytokeratin (polyklonal); anti-PSA (Klon ER-PR8); - anti-PSA (Klon 181823); anti-PSA (polyklonal); anti-S100A8 (Klon 1B3); anti-S100A8 (Klon 2C5/4); anti-S100A8 (Klon 2H2); - anti-S100A8 (Klon 2Q396A); anti-S100A8 (Klon 6A614); anti-S100A8 (Klon 8L627); anti-S100A8 (Klon 8-5C2); anti-S100A8 (Klon CF-145); - anti-S100A8 (Klon MRP8 7C12/4); anti-S100A8 (Klon S13.67); anti-S100A8 (polyklonal); anti-S100A9 (Klon IClO); anti-S100A9 (Klon 2Q396B); anti-S100A9 (Klon 4G9); anti-S100A9 (Klon NO.19); anti-S100A9 (Klon NO.134); anti-S100A9 (Klon S32.2); - anti-S100A9 (Klon S36.48); anti-S100A9 (polyklonal); anti-S-100beta (Klon SB6); anti-S-100beta (Klon SH-Bl); anti-S-100beta (Klon SH-B4); - anti-S-100beta (polyklonal); anti-SCCAl (Klon 8H 11); anti-SCCAl (polyklonal); anti-SCCA2 (Klon 10C12); anti-SCCA2 (polyklonal); - anti-SCCAl/2 (Klon B-9); anti-SCCAl/2 (polyklonal); anti-Thyroglobulin (Klon 5E6); anti-Thyroglobulin (Klon 5F9); anti-Thyroglobulin (Klon 5G4); - anti-Thyroglobulin (Klon 11A16); anti-Thyroglobulin (Klon PB2); anti-Thyroglobulin (Klon PB3); anti-Thyroglobulin (polyklonal); anti-UHRFl (Klon lRClC-10); - anti-UHRFl (Klon 3A11); anti-UHRFl (polyklonal); anti-URG4 (polyklonal); anti-YKL-40/CHI3-l_l (Klon 2011); anti-YKL-40/CHI3-l_l (Klon 321806); - anti-YKL-40/CHI3-Ll (polyklonal); verwendet werden.12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for the determination of non-blood macrophage antigens, antibodies conjugated with biotin, HRP (horseraddish peroxidase), AP (alkaline phosphatase), or luminescent dyes, in particular the immunoglobulin class G (IgG) and Fab- or F (ab) 2 -fragments, and / or aptamers, in particular selected from: anti-mouse IgG (polyclonal); anti-rabbit IgG (polyclonal); anti-goat IgG (polyclonal); anti-rat IgG (polyclonal); - anti-donkey IgG (polyclonal); anti-AFP (clone AFP-Ol); anti-AFP (clone AFP-I l); anti-AFP (clone 4A3); anti-AFP (clone 5H7); anti-AFP (clone M803209); anti-AFP (clone M0151611); anti-AFP (clone M0151608); anti-AFP (polyclonal); anti-AHCY (clone 1E11-1A7); anti-AHCY (clone 2F11-1D10); anti-AHCY (clone 4H2); anti-AHCY (clone Ml); anti-AHCY (clone M2); anti-AHCY (polyclonal); anti-AMY2 (clone 6A9 / 1); anti-AMY2 (clone 501); anti-AMY2 (clone 503); anti-AMY2 (clone 10-102.5); anti-AMY2 (polyclonal); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M2C5); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M9E7); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M4H2); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M8C9); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M10G4); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M10H6); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone M3A106); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone C595 (NCRC48)); anti-CA 15-3 / MUC1 (clone E29); anti-CA 15-3 / MUC1 (polyclonal); anti-CA 19-9 (clone 121SLE); anti-CA 19-9 (polyclonal); anti-CA 50 (clone M991149); anti-CA 50 (clone 93); anti-CA 50 (polyclonal); anti-CA 72-4 / TAG72 (clone SPM148); anti-CA 72-4 / TAG72 (polyclonal); anti-CA 125 / MUC16 (clone 2Fl); anti-CA 125 / MUC16 (clone 10G12); anti-CA 125 / MUC16 (clone X75); anti-CA 125 / MUC16 (clone X325); anti-CA 125 / MUC16 (polyclonal); anti-calcitonin (clone SP17); anti-calcitonin (clone 13B9); - anti-calcitonin (clone 13f2); anti-calcitonin (clone 24B2); anti-calcitonin (polyclonal); anti-calprotectin (clone 27E10); anti-calprotectin (polyclonal); anti-CCSA-2 (polyclonal); anti-CCSP-2 (polyclonal); anti-CEA (clone CoI-I); anti-CEA (clone 1C7); anti-CEA (clone IC10); - anti-CEA (clone ICH); anti-CEA (polyclonal); anti-CYP24Al (clone IEI); anti-CYP24Al (clone 1F8); anti-CYP24Al (polyclonal); anti-CK8 (clone 24); anti-CK8 (clone LP3K); anti-CK8 (polyclonal); anti-CK18 (clone DC-IO); - anti-CK18 (clone DA-7); anti-CK18 (clone LDK18); anti-CK18 (polyclonal); anti-CK19 (clone A53-B / A2); anti-CK19 (clone BA17); anti-CK19 (clone 236-11221); anti-CK19 (polyclonal); anti-CRP (clone 232007); anti-CRP (clone 232024); anti-CRP (clone C2); - anti-CRP (clone C4); anti-CRP (clone C5); anti-CRP (clone C6); anti-CRP (clone C7); anti-CRP (polyclonal); - anti-cystatin B (clone 2Fl); anti-cystatin B (clone 8k275); anti-cystatin B (clone B-02); anti-cystatin B (clone RJMW-2E7); anti-cystatin B (polyclonal); anti-DDH (clone T101); anti-DDH (polyclonal); anti-DKK-1 (clone 141135); anti-DKK-1 (polyclonal); anti-GP73 / GOLPH2 (clone YA-14); - anti-GP73 / GOLPH2 (clone 5B10); anti-GP73 / GOLPH2 (polyclonal); anti-HE4 (clone C-12); anti-HE4 (polyclonal); anti-HER2 / neu (clone 10C7); anti-HER2 / neu (clone 191924); anti-HER2 / neu (clone N3 / D10); anti-HER2 / neu (polyclonal); anti-HSP-27 (clone G3.1); anti-HSP-27 (clone AF5E5); anti-HSP-27 (clone F-4); anti-HSP-27 (clone 2A5); anti-HSP-27 (polyclonal); anti-Mac-2 BP (clone SP-2); - anti-Mac-2 BP (polyclonal); anti-mammaglobin A (clone 1G8D6, synonymous 2E7G9); anti-mammaglobin A (clone 304-1A5); anti-mammaglobin A (polyclonal); anti-mammaglobin B (clone E-17); anti-mammaglobin B (polyclonal); anti-MIA (clone 3A6); anti-MIA (polyclonal); anti-MMP-7 (clone 6A4); anti-MMP-7 (clone 176-5F12); anti-MMP-7 (clone 141-7B2); anti-MMP-7 (clone 377313); anti-MMP-7 (polyclonal); anti-MnSOD (clone IAE); anti-MnSOD (clone 2Al); anti-MnSOD (clone 4F10); anti-MnSOD (clone 23G5); anti-MnSOD (clone 37CT127.5.11.6); anti-MnSOD (polyclonal); anti-PARK7 / DJ-1 (clone IBIII); anti-PARK7 / DJ-1 (clone 1D7); anti-PARK7 / DJ-1 (clone 6A65); anti-PARK7 / DJ-1 (clone 3055); anti-PARK7 / DJ-1 (clone A-9); anti-PARK7 / DJ-1 (clone D-4); anti-PARK7 / DJ-1 (clone E2); anti-PARK7 / DJ-1 (polyclonal); anti-proGRP (clone pGRP5); anti-proGRP (clone E146); anti-proGRP (clone E172); anti-GRP (clone 76-E6); anti-proGRP (polyclonal); anti-GRP (polyclonal); anti-NSE (clone ICl); - anti-NSE (clone 5A4); anti-NSE (clone 5E2); anti-NSE (clone 5G10); anti-NSE (polyclonal); anti-pan cytokeratin (clone 7H8C4); anti-pan cytokeratin (clone B311.1); anti-pan cytokeratin (clone CIl); anti-pan cytokeratin (clone D-12); anti-pan cytokeratin (polyclonal); anti-PSA (clone ER-PR8); anti-PSA (clone 181823); anti-PSA (polyclonal); anti-S100A8 (clone 1B3); anti-S100A8 (clone 2C5 / 4); anti-S100A8 (clone 2H2); - anti-S100A8 (clone 2Q396A); anti-S100A8 (clone 6A614); anti-S100A8 (clone 8L627); anti-S100A8 (clone 8-5C2); anti-S100A8 (clone CF-145); anti-S100A8 (clone MRP8 7C12 / 4); anti-S100A8 (clone S13.67); anti-S100A8 (polyclonal); anti-S100A9 (clone IC10); anti-S100A9 (clone 2Q396B); anti-S100A9 (clone 4G9); anti-S100A9 (clone NO.19); anti-S100A9 (clone NO.134); anti-S100A9 (clone S32.2); anti-S100A9 (clone S36.48); anti-S100A9 (polyclonal); anti-S-100beta (clone SB6); anti-S-100beta (clone SH-Bl); anti-S-100beta (clone SH-B4); - anti-S-100beta (polyclonal); anti-SCCAl (clone 8H11); anti-SCCAl (polyclonal); anti-SCCA2 (clone 10C12); anti-SCCA2 (polyclonal); anti-SCCAI / 2 (clone B-9); anti-SCCAl / 2 (polyclonal); anti-thyroglobulin (clone 5E6); anti-thyroglobulin (clone 5F9); anti-thyroglobulin (clone 5G4); anti-thyroglobulin (clone 11A16); anti-thyroglobulin (clone PB2); anti-thyroglobulin (clone PB3); anti-thyroglobulin (polyclonal); anti-UHRF1 (clone ICRC-10); anti-UHRF1 (clone 3A11); anti-UHRFl (polyclonal); anti-URG4 (polyclonal); anti-YKL-40 / CHI3-I_ (clone 2011); anti-YKL-40 / CHI3-I_ (clone 321806); anti-YKL-40 / CHI3-L1 (polyclonal); be used.
13. Anordnung zur Isolierung und Charakterisierung von mononukleären Leukozyten des Blutes, insbesondere Blutmakrophagen, umfassend : eine Vorrichtung zum Zusetzen eines Mittels, das das Verklumpen und/oder Gerinnen von Vollblut hemmt; eine Vorrichtung zur Durchführung einer Vorselektion und Anreicherung von mononukleären Leukozyten, insbesondere Blutmakrophagen aus VoII- blut mittels Dichtegradienten-Zentrifugation; eine Vorrichtung zur Durchführung einer Selektion und Anreicherung von CD14+ Zellen durch, gegebenenfalls reversibel, an magnetische "beads" oder an eine Elisa-Platte gekoppelte Antikörper gegen CD14; eine Vorrichtung zur Durchführung einer Selektion und Anreicherung von CD16+ Zellen durch, gegebenenfalls reversibel, an magnetische "beads" oder an eine Elisa-Platte gekoppelte Antikörper gegen CD16; eine Vorrichtung zur Perforation bzw. Lyse der mononukleären Leukozyten-Populationen, insbesondere Blutmakrophagen, mittels einer Saponin- bzw. Triton-Lösung; - eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der mononukleären Leukozyten-Populationen, insbesondere Blutmakrophagen, unter Verwendung eines Tests zur Bestimmung der Aktivität der LDH (Laktat- Dehydrogenase) in einer Elisa-Platte, und zwar in derselben Elisa-Platte, in der die qualitative und quantitative Bestimmung der molekularen Marker durchgeführt wird; eine Vorrichtung zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von durch Blut-Makrophagen, phagozytierten intrazellulären molekularen Markern nach vorhergehender Perforation oder Lyse der mononukleären Leukozyten, insbesondere Makrophagen des Blutes mittels Elisa- Plattenleser und/oder einem Chemolumineszenz-Meßgerät.13. Arrangement for the isolation and characterization of blood mononuclear leukocytes, in particular blood macrophages, comprising: a device for adding a means which inhibits the clumping and / or coagulation of whole blood; a device for carrying out a preselection and enrichment of mononuclear leukocytes, in particular blood macrophages from void by means of density gradient centrifugation; a device for performing a selection and accumulation of CD14 + cells by, optionally reversibly, antibodies to CD14 coupled to magnetic beads or to an Elisa plate; a device for performing a selection and accumulation of CD16 + cells by, optionally reversibly, antibodies to CD16 coupled to magnetic beads or to an Elisa plate; a device for perforating or lysing the mononuclear leukocyte populations, in particular blood macrophages, by means of a saponin or Triton solution; a device for the quantitative determination of mononuclear leukocyte populations, in particular blood macrophages, using a test for the determination of the activity of LDH (lactate dehydrogenase) in an Elisa plate, in the same Elisa plate, in which the qualitative and quantitative Determination of molecular markers is carried out; a device for the qualitative and quantitative determination of blood macrophages, phagocytosed intracellular molecular markers after previous perforation or lysis of the mononuclear leukocytes, in particular macrophages of the blood by means of Elisa plate reader and / or a chemiluminescence measuring device.
14. Anordnung nach Anspruch 13, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h eine Vorrichtung zum Ausschluß von NK-Zellen (natürliche Killerzellen) mit den Zell-Oberflächen-Markern CD56 oder CD57 oder CD161 aus dem Kollektiv von mononukleären Leukozyten, insbesondere CD16+ Leukozyten, unter Verwendung von an magnetische "beads" gekoppelte Antikörper gegen CD56 oder CD57 oder CD161. 14. Arrangement according to claim 13, characterized by a device for the exclusion of NK cells (natural killer cells) with the cell surface markers CD56 or CD57 or CD161 from the collective of mononuclear leukocytes, in particular CD16 + leukocytes, using magnetic " beads "coupled antibodies against CD56 or CD57 or CD161.
15. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 13 oder 14, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h eine Vorrichtung zur Fixierung und Permeabilisierung von mononukleären Leukozyten, vor der Lyse derselben, vorzugsweise vor oder gegebenenfalls nach der Selektion und/oder Anreicherung und/oder Abtrennung der Blutmakrophagen bzw. Blutmakrophagen enthaltenden Leukozytenpopulationen zur intrazellulären Bindung von gegen intrazelluläre phagozytierte molekulare Marker gerichtete Antikörper vor der Zell-Lyse. 15. Arrangement according to one of the preceding claims 13 or 14, characterized by a device for fixation and permeabilization of mononuclear leukocytes, before the lysis thereof, preferably before or optionally after the selection and / or enrichment and / or separation of blood macrophages or blood macrophages containing leukocyte populations for intracellular binding of antibodies directed against intracellular phagocytosed molecular markers prior to cell lysis.
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