EP2321432A1 - Procede de detection d'anomalies chromosomiques - Google Patents

Procede de detection d'anomalies chromosomiques

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EP2321432A1
EP2321432A1 EP09740385A EP09740385A EP2321432A1 EP 2321432 A1 EP2321432 A1 EP 2321432A1 EP 09740385 A EP09740385 A EP 09740385A EP 09740385 A EP09740385 A EP 09740385A EP 2321432 A1 EP2321432 A1 EP 2321432A1
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EP
European Patent Office
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chromosomes
chromosome
fluorochrome
labeled
probes
Prior art date
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Withdrawn
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EP09740385A
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German (de)
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Inventor
Pierrick Serge Romana
Marc Le Lorc'h
Héra DER-SARKISSIAN
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite Paris Descartes
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite Paris Descartes
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Publication date
Application filed by Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP, Universite Paris Descartes filed Critical Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • Hybridization is carried out according to the standard conditions of in situ hybridization (Romana et al., 1994, supra); As an indication, the metaphase chromosomes suspended in a mixture of acetic acid / methanol (1 / 3-2 / 3) are spread on slides. After being dried in air, they are immersed for 5 minutes in 2XSSC saline solution, dehydrated in alcohol solutions of increasing concentration (60% to 100%) and air dried. The two batches of probe are then denatured for 10 minutes at 70 ° C. in 50% Formamide (FLUKA) / 2XSSC (Standard Sodium Citrate) at pH 7. The denatured probes are deposited on the slide at two different locations and covered by two lamellae.
  • FLUKA Formamide
  • 2XSSC Standard Sodium Citrate
  • Hybridization of probes Hybridization of so-called “Mega telomeric probes” probes (MTP) is carried out according to the same protocol as for the BACs, but requires two-depot slides to simultaneously treat the two groups of chromosomes.

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Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro pour détecter des anomalies chromosomiques chez un mammifère, comprenant l'hybridation in situ de n chromosomes d'une préparation de chromosomes métaphasiques avec des ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques, chaque ensemble s'hybridant, sur une longueur de 700 000 à 3 000 000 pb contiguës, de manière spécifique aux extrémités subtélomériques spécifiques desdits chromosomes, chaque ensemble étant marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochromes.

Description

PROCEDE DE DETECTION D'ANOMALIES CHROMOSOMIQUES
L'invention concerne la détection d'anomalies chromosomiques par hybridation de sondes d'acide nucléique spécifiques.
Arrière-plan technologique :
Les anomalies chromosomiques, qu'elles soient constitutionnelles ou acquises, sont à l'origine de nombreuses pathologies. Elles peuvent être équilibrées (c'est-à-dire ne s 'accompagnant pas de perte de matériel chromosomique) ou déséquilibrées, c'est-à-dire s 'accompagnant de pertes ou de gains de matériel chromosomique. On parle alors de déséquilibres génomiques. Avec les techniques dont on dispose aujourd'hui en routine (caryotype en bande et hybridation in situ fluorescente), on estime que les anomalies chromosomiques, sont responsables de 10 à 15% des retards mentaux et des malformations congénitales. Par ailleurs, elles sont très fréquemment retrouvées associées dans les cellules cancéreuses. Dans de très nombreux cas, elles en déterminent le pronostic, et elles permettent d'en comprendre la cause moléculaire et d'envisager des traitements ciblés. C'est pourquoi que ce soit en pathologie constitutionnelle ou dans les cancers, le diagnostic des anomalies chromosomiques est fondamental tant pour le traitement que pour la recherche. Les anomalies chromosomiques peuvent être visibles au microscope ou non. Lorsqu'elles le sont, leur détection est assurée par les techniques classiques du caryotype. Mises au point dans les années 60, elles permettent de visualiser les chromosomes avec une succession, le long de leur axe longitudinal, de bandes claires et plus sombres caractéristiques de chaque paire de chromosomes. L'examen de la morphologie globale des chromosomes et de l'ordonnancement des différentes bandes permet d'établir le caryotype. La plus petite des bandes observables est de 5 millions de paires de bases (5 mégabases ou Mb). Ceci est une première limite à cette technique. Une deuxième est que des échanges de régions télomériques, de même taille et dont la teinte (en générale noire) est identique, ne peuvent être détectés par les techniques classiques du caryotype. Ces anomalies non détectables par les techniques de bandes sont dites cryptiques.
Une approche pour détecter ces anomalies chromosomiques cryptiques met en œuvre des sondes fluorescentes spécifiques qui hybrident sur les chromosomes. Cette technique, appelée FISH pour « fluorescence in situ hybridization » (FISH), consiste à hybrider sur l'ADN cible un fragment d'ADN complémentaire dans lequel a été introduit un fluorochrome (opération dite de marquage). Un tel fragment d'ADN est appelé sonde. L'hybridation in situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, d'un locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible s'étant hybrides avec les sondes.
L'une des indications majeures de la FISH est la détection des anomalies cryptiques télomériques. Ces anomalies occasionnent à elles seules près de 5% des retards mentaux avec malformations. Par ailleurs, dans les cancers, il a été décrit des anomalies télomériques (équilibrés dans ces pathologies) dont la fréquence est importante. C'est ainsi que la t(12 ;21) des leucémies aiguës de l'enfant est invisible par les techniques classiques de cytogénétique alors qu'elle est l'anomalie génétique la plus fréquente dans cette pathologie (Romana et al, Gènes Chromosomes Cancer, 1994, 9(3):186-91). Les systèmes de détection des anomalies chromosomiques disponibles pour l'instant dans le commerce sont composés d'un ou deux sondes représentant les extrémités télomériques d'une ou de deux paires chromosomiques. Cela suppose, si l'on veut étudier l'ensemble des extrémités, d'hybrider ces sondes sur une ou plusieurs lames, en les déposant sur différentes parties de ces lames. Ce système suppose des préparations chromosomiques riches en métaphases pour que des mitoses soient présentes sur toutes les parties de la lame où seront déposées les différentes sondes. Ces prés requis ne peuvent être atteints pour les préparations de chromosomes venant de cultures d'amniocytes en cytogénétique constitutionnelle prénatale, ni dans les cancers. Pour ces deux situations, il restait nécessaire de développer un système permettant l'étude de l'ensemble des extrémités chromosomiques sur une ou deux mitoses.
C'est ce à quoi Brown et al (Nature Medicine, 7(4) :497-501) ont voulu répondre en développant le système M-TeI. Dans ce système, les sondes télomériques d'un chromosome sont marquées avec une combinaison spécifique de fluorochrome. Ainsi, ils purent fabriquer des sondes spécifiques de 12 chromosomes, détectables chacune après l'hybridation sur une seule métaphase. En utilisant deux lots de sondes, l'ensemble des 23 paires chromosomiques pouvait être exploré en étudiant deux mitoses. Ce test, utilisé ensuite dans l'étude Brown et al, 2002, Blood, 99(7) :2526-2531, présente néanmoins certains inconvénients. En particulier, les sondes utilisées produisent un signal faible, avec un rapport signal/bruit bien trop élevé.
Il existait toujours un besoin d'un test de détection des anomalies télomériques cryptiques, qui soit rapide, pratique, et fiable. Le test proposé par les inventeurs répond à ces exigences et est en outre utilisable non seulement pour le diagnostic des pathologies chromosomiques constitutionnelles prénatale et postnatale, mais aussi pour le diagnostic de celles associées aux cancers. Ce test est également particulièrement adapté à la détection d'anomalies chromosomiques équilibrées.
Résumé de l'invention
L'invention fournit un procédé in vitro pour détecter des anomalies chromosomiques chez un animal, de préférence un vertébré, de manière plus préférée un mammifère, comprenant :
- l'hybridation in situ de n chromosomes d'une préparation de chromosomes métaphasiques avec des ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques, chaque ensemble hybridant sur une longueur de 700 000 à 3 000 000 pb, de manière spécifique aux extrémités subtélomériques spécifiques desdits chromosomes, chaque ensemble étant marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochromes, n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes du dit animal, le nombre total de fluorochromes utilisés étant un entier inférieur à n,
- la détection de la fluorescence émise par les fluorochromes, par ce en quoi des anomalies chromosomiques sont détectées.
Légende de la Figure :
La Figure montre un protocole général de l'obtention de l'ADN des clones télomériques. Description détaillée de l'invention :
Définitions :
Une « extrémité subtélomérique spécifique» est la région spécifique d'un chromosome la plus proche de la séquence consensus télomérique d'un chromosome (commune à tous les chromosomes). Elle se situe en générale entre 100 à 300 kb des séquences consensus.
Un « télomère » ou « extrémité télomérique » est une région hautement répétitive, non codante, d'ADN à l'extrémité d'un chromosome. Chez l'homme, la séquence TTAGGG est spécifique des télomères et est répétée plusieurs centaines de fois. Cette séquence est commune à tous les chromosomes.
Par « hybridation spécifique » on désigne la capacité d'un ensemble d'une pluralité de nucléotides à s'hybrider à une séquence d'ADN donnée. En d'autres termes, un ensemble s'hybridant de manière spécifique à une extrémité subtélomérique d'un chromosome ne s'hybride pas à une autre extrémité subtélomérique. Par exemple, un ensemble s'hybridant de manière spécifique à l'extrémité subtélomérique du bras long du chromosome 1 ne s'hybridera pas à l'extrémité subtélomérique du bras court du chromosome 1, ni à aucune autre séquence de ce chromosome ou d'un autre chromosome.
Pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible", le chromosome suspecté d'être affecté par une anomalie.
Préparation des échantillons Les échantillons à tester sont des préparations de liquides ou tissus biologiques contenant des chromosomes métaphasiques d'un animal. De préférence il s'agit d'échantillons sanguins, de liquide amniotique dans le cas de diagnostic prénatal ou de mœlle osseuse pour les hémopathies malignes. De préférence l'animal est un mammifère, de préférence un humain, quel que soit son sexe ou son âge. Il peut s'agir d'un embryon, d'un fœtus, d'un nouveau-né, d'un enfant, d'un adolescent, ou d'un adulte.
Les échantillons sont préparés comme pour une analyse cytogénétique classique sur lame, qu'il s'agisse de prélèvements mis en culture ou analysés directement. Une procédure générale pour préparer des chromosomes métaphasiques consiste à mettre en culture, si possible, les cellules contenant les chromosomes à analyser et à les arrêter en mitose avec un inhibiteur du fuseau mitotique, par exemple avec de la colchicine. Les chromosomes sont ensuite fixés avec un mélange acide acétique/méthanol, puis étalés sur lame.
Sondes utilisées :
Le procédé de l'invention utilise des sondes d'acides nucléiques qui couvrent une longueur de 700 000 à 3 000 000 bases (pb) contiguës d'au moins une extrémité subtélomérique de chaque chromosome cible. De préférence, les sondes couvrent au moins 800 000 pb, de préférence encore au moins 1 Mb, de manière encore préférée 1 à 1,5 Mb, des extrémités subtélomériques spécifiques des chromosomes.
Les sondes sont constituées par un ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques (ci-après « un ensemble ») recouvrant tout ou parties de l'extrémité subtélomérique spécifique du bras long ou du bras court du chromosome cible. La pluralité d'acides nucléiques est composée d'acides nucléiques complémentaires de parties contiguës de l'extrémité subtélomérique dont l'ensemble est spécifique. Ces parties contiguës peuvent éventuellement être légèrement chevauchantes. L'extrémité subtélomérique à laquelle hybrident les sondes n'est pas celle d'un bras court d'un chromosome acrocentrique (i.e. les chromosomes 13,14,15,21 et 22 chez l'être humain). Comme illustré dans le tableau 2, les ensembles d'acides nucléiques hybrident à une distance variable du télomère, selon le chromosome visé. Par exemple, les ensembles d'acides nucléiques utilisés dans les exemples hybrident à une distance de 4110 pb de l'extrémité proximale du télomère 21q, ou 828 698 pb de l'extrémité proximale du télomère Ip. Cette distance est liée à l'impératif de spécificité de la sonde. En effet, certaines régions même subtélomériques d'un chromosome donné peuvent avoir des séquences d'ADN communes avec d'autres chromosomes. La taille de ces séquences partagées peut être variable selon les chromosomes. C'est ce qui explique la variabilité, selon les chromosomes, de la distance qui existe entre la séquence consensus télomérique et l'extrémité distale de la sonde subtélomérique spécifique.
Le nombre total de chromosomes présents dans les cellules normales d'un animal donné est fixe et connu. Ainsi, les cellules d'un être humain comprennent normalement 23 paires de chromosomes, dont une paire correspond aux chromosomes XX ou XY. Dans le procédé de l'invention, n chromosomes sont analysés de manière simultanée, n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes de l'animal. De préférence, au moins 12 chromosomes sont analysés simultanément.
Selon un mode préféré de l'invention, l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques est produit par amplification d'un ou plusieurs BAC dans lesquels est inséré un fragment de l'extrémité subtélomérique du chromosome cible. Différents sites Internet permettent de visualiser la position de ces BACs le long de chaque chromosome. Par exemple, sur le site de l'UCSC (http://genome.ucsc.edu/)
L'amplification peut être réalisée par tout moyen d'amplification d'ADN connu de l'homme du métier. A titre exemple, on peut citer une amplification par PCR ou une amplification du type Rolling-Circle Amplification (RCA).
Marquage des sondes :
Dans le procédé de l'invention, chaque ensemble est marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable des autres chromosomes par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochrome.
Les acides nucléiques composant l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques peuvent être marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule fluorescente, ou fluorochrome
(marquage direct).
L'incorporation de nucléotides conjugués avec un fluorochrome dans les sondes de l'invention peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par nick-translation ou PCR. De manière alternative, les acides nucléiques peuvent être marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule reconnue spécifiquement par un ligand, de préférence un anticorps conjugué à un fluorochrome (marquage indirect).
Plus particulièrement, le marquage indirect des sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécifiquement au dit haptène et qui est, soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre- ligand conjugué à un fluorochrome. À titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage indirect des sondes utiles dans la présente invention, on peut notamment citer :
-la digoxigenine, le dinitrophénol et le 2-acetylaminofluorène, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome ;
-la biotine, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps dirigés contre ces derniers et qui sont conjugués à un fluorochrome.
Les fluorochromes utilisés peuvent être indifféremment choisis parmi différents composés fluorescents utilisés pour le marquage de sondes nucléiques tels que la fluorescéine (fluorescéinate de sodium) et ses dérivés tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC); la rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthyl rhodamine isothiocyanate (TRITC); le diaminidophényl indo (DAPI); l'acridine; les colorants fluorescents à aminés réactives tels que l'ester succinimidylique de l'acide 6-((725 ami no-4-mhétylcoumnarin-3-acétyl)amino) hexanoque (A. NICA); les colorants fluorescents vendus sous les dénominations commerciales BODIPY telles que BODIPY'J, FR-Br, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR et les BODIPY 530/550 vendus par la société Bio-Rad Inc. (USA), les colorants Cascade Blue (Trilink BioTechlnologies USA), Cy2, Cy3. Cy3.5. CYS, Cy5.5, et Cy7 (Bio- Rad Inc., USA), DABCYL et EDANS (Eurogentec, BE); l'Eosine; l'Erythrosine; le 6-Farn et le Texas Red. La coumarine et son dérivé la diéthyl aminométhyl coumarine (DEAC) sont des fluorochromes également préférés.
Le procédé selon l'invention est un procédé en multi-fluorescence. En d'autres termes, le nombre de fluorochromes utilisés pour la détection des anomalies chromosomiques est inférieur au nombre n de chromosomes analysés. Les chromosomes sont donc marqués de manière combinatoire pour pouvoir les distinguer les uns des autres. Ce marquage des chromosomes est réalisé par chaque ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques. De préférence, les extrémités subtélomériques des bras courts et longs (p et q, respectivement) d'un même chromosome sont marquées avec le même fluorochrome ou la même combinaison de fluorochromes.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise au moins quatre fluorochromes (par exemple un marquage direct par les fluorochromes FITC, rhodamine, Coumarine, et un marquage indirect par la Biotine, cette dernière étant révélée par de la streptavidine marquée au Cy5), ce qui permet 15 combinaisons différentes de fluorochromes (24-l). Pour détecter des anomalies sur l'ensemble des chromosomes d'un animal ayant plus de 15 chromosomes, on peut alors utiliser deux lots de sondes (pour 12 chromosomes pour l'un et 11 chromosomes pour l'autre pour l'étude de chromosomes humains, pour un total de 41 sondes qui hybrident toutes les extrémités des bras longs et courts des chromosomes humains, sauf les bras courts des chromosomes acrocentriques). Ainsi peuvent être étudiées, à partir de l'analyse d'une mitose choisie sur deux zones différentes d'une lame sur laquelle ont été déposés les deux lots de sondes, toutes les extrémités télomériques. De préférence, les lots de sondes sont regroupées de manière à éviter d'analyser dans un même groupe des chromosomes se ressemblant du point de vue cytogénétique (par exemple, les chromosomes 21 et 22 humains sont de préférence analysés par 2 lots différents).
Le tableau 1 ci-dessous illustre de manière théorique les 15 combinaisons possibles pour 4 fluorochromes différents :
Tableau 1
Hybridation :
L'hybridation est réalisée selon les conditions classiques d'hybridation in situ (Romana et al. 1994, supra) ; À titre indicatif, les chromosomes métaphasiques en suspension dans un mélange acide acétique/méthanol (1/3-2/3) sont étalés sur des lames. Après avoir été séchées à l'air, elles sont plongées 5 minutes dans une solution saline 2XSSC, déshydratées dans des solutions d'alcool de concentration croissante (60% à 100%) et séchées à l'air. Les deux lots de sonde sont ensuite dénaturés pendant 10 minutes à 700C dans 50% Formamide (FLUKA) /2XSSC (Standard Sodium Citrate) à pH 7. Les sondes dénaturées sont déposées sur la lame à deux emplacements différents et recouvertes par deux lamelles scellées hermétiquement avec une colle type « rubber cernent ». L'ensemble est mis sur une plaque chauffante pendant 3 à 4 minutes. L'ensemble est ensuite mis à hybrider durant 18 heures à 37°C dans une chambre humide. Les lavages post-hybridation sont effectués à 72°C pendant 5 minutes dans du tampon IXSSC. Dans le cas d'utilisation de sondes marquées à la digoxigénine ou à la biotine notamment, la détection des sondes se fait par une utilisation d'anticorps couplés à des fluorochromes différents.
Dans le cas d'utilisation de sondes directement marquée avec des fluorochromes, on peut procéder tout de suite à la contre-coloration des chromosomes avec du DAPI (lμg/ml, Molecular Probes) et au montage des lames dans du p-phenyl-diamine. Des variations de ces modes opératoires sont présentées dans la partie expérimentale.
Visualisation :
La révélation se fait généralement après 18 heures d'incubation à 37°C.
Les lames sont observées à l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé d'une caméra CCD et de filtres appropriés. Les images sont analysées à l'aide d'un système informatique de traitement d'image.
Une anomalie chromosomique sera détectée en cas d'absence de signal au niveau d'une extrémité subtélomérique d'un chromosome cible, ou en cas de signal qui n'est pas localisé au niveau du chromosome correspondant à la sonde. Applications :
Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre pour la détection de deux chromosomes ou plus ou, de préférence, pour l'ensemble des chromosomes de la préparation de chromosomes. Le procédé de l'invention est utilisable non seulement pour le diagnostic des pathologies chromosomiques constitutionnelles, mais aussi pour le diagnostic des cancers. Ce test est également particulièrement adapté à la détection d'anomalies chromosomiques équilibrées. Il est notamment utile en diagnostic de routine, pour la vérification des anomalies chromosomiques suspectées par un examen chromosomique par les techniques de bandes. Par ailleurs, il peut être mis en œuvre pour le diagnostic des anomalies chromosomiques cryptiques en pathologie chromosomique constitutionnelle prénatale et prénatale et dans les cancers, notamment dans les hémopathies malignes (où elles sont souvent équilibrées).
La zone d'hybridation entre l'extrémité subtélomérique analysée et l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques qui lui est spécifique permet la détection d'un signal de forte intensité. Ceci a pour principal avantage d'augmenter le rapport signal/bruit.
En outre, le marquage fluorescent combinatoire est particulièrement avantageux si la quantité d'échantillons disponible pour le diagnostic est restreinte. En effet, comme indiqué ci-dessus, l'utilisation d'une combinaison de 4 fluorochromes permet une analyse sur deux mitoses.
Les exemples et figures illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction de 41 sondes télomériques
Les sondes sont préparées à partir de BACs (Bacterial Artifîcial Chromosome). Un BAC est un fragment d'ADN humain, de taille comprise généralement entre 150.000 et 200.000 paires de bases (150kb - 200kb), inséré dans un plasmide transfecté dans E. CoIi.
Différents sites Internet permettent de visualiser la position de ces BACs le long de chaque chromosome. En consultant le site UCSC (http://genome.ucsc.edu/), les inventeurs ont sélectionné 286 BACs situés au niveau des régions subtélomériques spécifiques des bras longs et courts de tous les chromosomes, à l'exception de celles des bras courts des 5 chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 21 et 22) qui sont composés de séquences répétées communes à ces 5 chromosomes. Pour les 41 extrémités (23 paires chromosomiques moins 5), les BACs ont été choisis en contiguïté sur une distance d'au moins 800 000 paires de bases (800 kb) de façon à obtenir une sonde générant un signal puissant.
Tableau 2 : caractéristiques des sondes utilisées (dist du télo=distance du télomère)
K)
σ \
OO
^o
K)
O
K)
1.1. Culture des BACs
Les BACs sont commandés au Centre National de Séquençage à Evry (Génoscope), qui les fournit sous forme de colonies dans des boîtes de Pétri.
Chaque BAC est mis en culture selon le protocole suivant : 500μl de milieu de culture TB contenant du chloramphénicol (25μg/ml) est déposé dans chacun des puits de la plaque 96 puits. Puis une colonie de chaque clone bactérien est mise en culture par puits. Les plaques sont incubées pendant 24 heures à 37°C sous agitation. Les cultures sont arrêtées en ajoutant 500μl de milieu TB/30% de glycérol. Ceci formera la plaque Glycérol Stock, à partir de laquelle 3 répliques seront générées : la plaque M (Mère), la plaque S (Sauvegarde) et la plaque T (Travail) chacune contenant 150μl de culture. La plaque T sert à l'obtention de l'ADN. Les plaques sont stockées à -800C dans des congélateurs différents.
1.2. Amplification de l'ADN par RCA (Rolling Circle Amplification) : C'est l'étape de la production d'ADN a) Principe
L'amplification de l'ADN par RCA est basée sur la réplication à température constante de courts segments d'ADN circulaires simple brin. La réaction consiste en l'extension d'amorces hexamériques aléatoirement liées à la matrice d'ADN permettant d'obtenir des copies d'ADN simple brin linéaire, pouvant à leur tour servir de matrice pour l'hybridation d'autres amorces. Ceci permet d'éviter les étapes classiques d'extraction type phénol-chloroforme.
b) Protocole : Kit GE Healthcare Europe: ref 25-6400-80
Cette étape utilise le protocole fourni avec le kit de RCA. Elle s'effectue en plaque 96 ce qui permet la production simultanée d'ADN (10μg) à partir de 4μl de culture de 96 clones différents.
On obtient une concentration finale d'ADN de lOOng/μl (lOμg dans lOOμl d'eau). La vérification de l'amplification se fait sur gel d'agarose.
1.3. Marquage
C'est l'étape qui va permettre l'incorporation de molécules fluorescentes à l'ADN.
Chaque produit de RCA est marqué par le principe de la nick-translation.
On obtient en 2h30 une solution à 20 ng/μl d'ADN marqués par un fluorochrome. Les marquages sont vérifiés comme suit :
4ml de la réaction de marquage sont déposés sur gel d'agarose à 1% afin de visualiser sous UV, l'ADN dans lequel se sont intégrés les fluorochromes. Ceci permet d'apprécier la qualité du marquage.
1.4. Précipitation des sondes
Cette étape permet la fabrication de la sonde prête à l'emploi.
200ng de chacune des sondes sont précipités en présence de 5OX (soit lOμg) d'ADN Cotl (ADN riche en séquences répétées qui bloqueront les séquences répétées existantes dans la sonde), avec 0,15M de NaCl 3M et 3 volumes d'éthanol 100%. Le culot est ensuite repris dans 6μl de tampon d'hybridation (50% formamide, 2X SSC, 0,1% SDS, 4OmM NaH2PO4/NaHPO4). La concentration d'utilisation de la sonde est donc d'environ 30ng/μl.
1.5. Vérification de la localisation des sondes par FISH
Avant de constituer un contig de sonde, chaque sonde (BACs) a été vérifiée par FISH sur métaphase. Tous les BACs générant un signal sur plusieurs chromosomes, ou non en place sur le chromosome attendu, ont été remplacés.
1.6. Formation du " pool "
Ceci permet de simplifier considérablement le processus en ne manipulant que 41 ADN pools en place des 286 clones le constituant.
La plaque "pool" est formée à partir de la plaque de travail. Pour chaque extrémité chromosomique, 20μl de TB/glycérol, de chaque clone bactérien correspondant à un BAC constituant le contig, sont prélevés puis mélangés dans un seul puit d'une plaque 96. Ainsi est constituée une plaque contenant 41 mélanges de clones bactériens à partir desquels sont fabriquées très rapidement, selon les procédés décrits précédemment (culture, RCA, marquage, et vérification par FISH), des sondes spécifiques de chacune des 41 extrémités chromosomiques.
À partir de la plaque T (20μl de chaque BAC)
I 1P I !q I 2P I 2q I 3p I 3q I 4P I 4q I 5P I 5q I 6p I 6q I
Plaque 41 extrémités = plaque "pool"
Exemple 2 : Fabrication du système MTP (« Mega telomeric probes »)
La stratégie adoptée a conduit à la fabrication de 41 sondes qui sont marquées grâce à une combinaison de 5 fluorochromes : FITC, rhodamine, DEAC, biotine (révélée par la streptavidine-Cy5) et digoxygénine (révélée en Cy5.5). Les extrémités d'un même chromosome sont marquées par la même combinaison de couleurs.
2.1 Marquage des deux groupes
Chaque groupe a été construit de façon à éviter de rassembler des chromosomes se ressemblant du point de vue cytogénétique (le 21 et le 22, dans deux groupes différents, par exemple).
Toutes les extrémités qui contiennent le même fluorochrome sont marquées ensemble par nick-translation et selon les Tableaux 3A et 3B ci-dessous. Pour le groupe I, 1960ng d'ADN ont été marqués en FITC, 2120ng en rhodamine, 1050ng en coumarine, 1983ng en Biotine, et 1860ng en digoxygénine dans des volumes respectifs de 83, 98, 50, 88 et 84μl. Pour le groupe II, 1810ng ont été marqués en FITC, 1860ng en Rhodamine, 1607ng en Biotine, et 1944ng en digoxygénine. Cette différence de quantité d'ADN marqué vise à renforcer le signal de certaines extrémités plus faibles. Tableaux 3A et 3B : Tableaux de marquage des deux groupes avec table combinatoire A- B-
2.2. Précipitation des groupes
Pour une hybridation et par groupe, l'ensemble des sondes marquées est précipité simultanément et repris dans 6μl de tampon d'hybridation.
2.3. Hybridation des sondes L'hybridation des sondes dites « Mega telomeric probes » (MTP) se réalise selon le même protocole que pour les BACs, mais nécessite des lames à deux dépôts pour traiter simultanément les deux groupes de chromosomes.
2.4. Révélation des lames et analyse
Les lames sont lavées dans un bain de IXSSC à 72°C pendant 5min, puis révélées par deux couches d'anticorps pour révéler les sondes marquées à la biotine et la digoxygénine. La première couche d'anticorps (50 μl de bicarbonate de soude IX + 2μl d'anti streptavidine Cy5
(lmg/ml) pour la biotine + 0,5μl d'anti-digoxygénine souris et la deuxième couche (50 μl de bicarbonate de soude 1X+ lμl d'anti souris Cy5.5 (lmg/ml)) permet la révélation de la digoxygénine.
Les lames sont montées avec lOμl d'une solution de DAPI/Vectashield® (Vector
Laboratories) puis recouvertes d'une lamelle 24x60.
Les lames sont observées à l'aide d'un microscope à épi fluorescence équipé d'une caméra et de filtres appropriés et les métaphases analysées à l'aide d'un système d'analyse. Exemple 3 : Mise en évidence d'une translocation équilibrée subtélomérique t(5 ;ll)(q35 ;P15)
Pour tester la résolution des sondes, les inventeurs ont réalisé une hybridation de celles-ci chez un patient ayant une leucémie aiguë myéloïde associée à une anomalie télomérique cryptique, la t(5;l I)(q35;pl5) invisible donc en cytogénétique classique.
Cette translocation recombine les gènes NUP98 codant pour une nucléoporine de 98 kDa situé à 3Mb du télomère du bras court du chromosome 11 et le gène NSDl codant pour le nuclear receptor SET domain protéine situé à 4 Mb du télomère du bras long du chromosome 5. La résolution du caryotype en bandes est de 5 à 10 Mb (souvent 10Mb pour les chromosomes des cellules leucémiques). Le système MTP de l'invention a permis de détecter aisément cette anomalie.
Pour confirmer qu'il s'agit bien d'une translocation remaniant l'extrémité distale du bras long d'un chromosomes 5 et celle du bras court d'un chromosome 11, les inventeurs ont hybride les sondes spécifiques des bras court et long du chromosome 11 (respectivement marquées par de la coumarine (en bleu) et de la biotine révélée par de la streptavidine Cy5 (jaune) et celle des bras courts (marqués par du FITC, vert) et longs (marqués par de la Rhodamine, rouge) du chromosome 5. Les inventeurs ont ainsi pu visualiser une translocation t(5;l l)(qter;pter).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro pour détecter des anomalies chromosomiques chez un animal, comprenant : - l'hybridation in situ de n chromosomes d'une préparation de chromosomes métaphasiques avec des ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques, chaque ensemble hybridant, sur une longueur de 700 000 à 3 000 000 pb contiguës, de manière spécifique aux extrémités subtélomériques spécifiques desdits chromosomes, chaque ensemble étant marqué de manière détectable par un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de fluorochromes, n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes dudit animal, le nombre total de fluorochromes utilisés étant un entier inférieur à n,
- la détection de la fluorescence émise par les fluorochromes, par ce en quoi des anomalies chromosomiques sont détectées.
2. Procédé selon la revendication 1, le procédé étant mis en oeuvre pour la détection d'au moins douze chromosomes.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, le procédé étant mis en oeuvre pour l'ensemble des chromosomes de la préparation de chromosomes métaphasiques.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques est produit par amplification d'un ou plusieurs BAC dans lesquels sont insérés un ou plusieurs fragments de l'extrémité subtélomérique dudit chromosome.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'amplification est une amplification du type Rolling-Circle Amplification (RCA).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les acides nucléiques d'au moins un ensemble sont marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule reconnue spécifiquement par un ligand marqué avec un fluorochrome.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les acides nucléiques d'au moins un ensemble sont marqués avec des nucléotides conjugués avec un fluorochrome.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel, pour chaque chromosome, les extrémités subtélomériques du bras court et du bras long sont marquées avec le même fluorochrome ou avec la même combinaison de fluorochromes.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'animal est l'humain.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour le diagnostic d'une pathologie chromosomique constitutionnelle.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour le diagnostic d'un cancer.
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