EP2297194A1 - Verfahren zur erzeugung von hypoallergenen glykoproteinen in mutierten oder transgenen pflanzen oder pflanzenzellen sowie mutierte oder transgene pflanzen und pflanzenzellen zur erzeugung hypoallergener glykoproteine - Google Patents

Verfahren zur erzeugung von hypoallergenen glykoproteinen in mutierten oder transgenen pflanzen oder pflanzenzellen sowie mutierte oder transgene pflanzen und pflanzenzellen zur erzeugung hypoallergener glykoproteine

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EP2297194A1
EP2297194A1 EP09741822A EP09741822A EP2297194A1 EP 2297194 A1 EP2297194 A1 EP 2297194A1 EP 09741822 A EP09741822 A EP 09741822A EP 09741822 A EP09741822 A EP 09741822A EP 2297194 A1 EP2297194 A1 EP 2297194A1
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plants
plant
plant cells
hypoallergenic
mutated
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Antje Von Schaewen
Heidi Kaulfürst-Soboll
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Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
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    • C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)

Definitions

  • hypoallergenic glycoproteins in mutated or transgenic plants or plant cells and mutated or transgenic plants and plant cells for the production of hypoallergenic glycoproteins
  • the present invention relates to a method for producing hypoallergenic glycoproteins in mutated or transgenic plants, parts of these plants or plant cells produced therefrom and the corresponding mutated or transgenic plants, plant parts and plant cells.
  • N-glycosylation in the secretory system is an essential process.
  • Glycoproteins are first assembled in the endoplasmic reticulum (ER), whereby membrane-bound glycans (dolichol pyrophosphate oligosaccharides) are cotranslationally transferred to specific asparagine residues in the growing polypeptide chain.
  • ER endoplasmic reticulum
  • membrane-bound glycans dolichol pyrophosphate oligosaccharides
  • sugar moieties located on the surface of the folded polypeptide chain in Golgi cisterns undergo further trimming and modification reactions.
  • glycoproteins The direct application of conventionally isolated glycoproteins is often problematic because individual residues of the glycan components, when administered as a therapeutic agent, can cause undesirable side effects.
  • the glycan component can not be dispensed with, as it mainly contributes to the physicochemical properties (such as folding, stability and solubility) of the glycoproteins.
  • Yeasts have proven to be largely unsuitable for the production of glycoproteins in medicine and research because they can only perform glycosylations to the so-called "high" mannose type. "Insects and higher plants exhibit” complex "but non-animal glycoprotein modifications. so that isolated glycoproteins from these organisms are immunogenic in mammals (Faye & Chrispeels, 1988; Strasser et al., 2008). Animal organisms with glycosylation defects are usually not viable, since the terminal glycan residues (for example membrane-bound glycoproteins) have a biological signal function and are indispensable, above all, for cell-cell recognition during embryonic development. While mammalian cell lines (CHO) exist with defined glycosylation defects, their cultivation is labor intensive and costly.
  • glycosylation mutants have already been described for mammals at the cell culture level. These mutants are either involved in the biosynthesis of mature oligosaccharide chains on the dolichol pyrophosphate or in the glycan processing or show deviations in their terminal sugar residues. Some of these cell lines show a conditional lethal phenotype or show defects in intracellular protein transport.
  • Defective HEMPAS (hereditary erythroblastic multinuclearity with a positive acidified serum lysis test) is based either on a deficiency of ⁇ -mannosidase II in the Golgi apparatus or in lysosomes and / or low levels of the enzyme iV-acetyl-glucosa - minyltransferase II (GnTII) and have a strong limiting effect on the viability of the mutant organisms (Fukuda, 1990).
  • hGC was produced in a carrot cell suspension (Shaaltiel et al., 2007).
  • the recombinant protein was transported to the vacuoles using a C-terminal, vacuolated targeting signal (CTTP), carrying plant-specific immunogenic glycans Control of vacuoles had to be used extra sequences that are not allowed for clinical phase III studies.
  • CTP C-terminal, vacuolated targeting signal
  • hGC preparations obtained from this seed had reduced levels of immunogenic xylose and fucose residues, galactose and glucose modifications were detected. While this did not affect the functionality of the enzyme preparation, it did diminish uptake into fibroblasts of Gaucher patients (Reggi et al., 2005), for which mannose-terminated glycans would be more suitable, as in the present invention (see, anti-PHA-L (cf. Phytohemagglutinin L) to ConA binding in Figure 6).
  • RNAi throttling in Nicotiana benthamiana decimated both core fucosyltransferases and xylosyltransferase had hypoallergenic properties (Jin et al., 2008).
  • Glycoproteins from these plants should also have hardly any mannose-terminated glycoproteins, analogous to the wild-type (FIG. 6), which should reduce the clearance of humoral administered hGC in Gaucher patients.
  • the object of the present invention is therefore to provide a suitable process or suitable plants or plant materials for producing hypoallergenic glycoproteins, in particular for the therapy of lysosomal storage diseases.
  • the present inventors have surprisingly found that plants in which the activity of Golgi ⁇ -mannosidase II (GMII, EC 3.2.1.114) is suppressed, a significant reduction in the immunological recognition of complex glycosylated proteins in transgenic plants and thus a general reduction of CCD allergens ("cross-reactive carbohydrate determinants" of the structure Man 3 XylFucGlcNac 2 or Man 3 XylGlcNac 2 ), ie, generate highly hypoallergenic glycoproteins, although this was largely the case for parallel studied GiV77 RNAi lines but unlike the GiV77 RNAi lines M4M / RNAi lines did not cause any loss of vitality in the plants, in this case tomatoes ( Figure 4).
  • the present invention thus relates to a method of producing hypoallergenic glycoproteins comprising culturing a mutant or transgenic plant, portions of these plants or plant cells produced therefrom, and isolating a desired hypo-allergenic glycoprotein from the cultured material, characterized that the activity of the enzyme Golgi ⁇ -mannosidase II in the mutated or transgenic plant, parts of these plants or plant cells produced therefrom is eliminated or reduced.
  • Parts of such plants may e.g. also include seeds and propagating material.
  • parts of such plants as well as plant cells in this application are also referred to as plant material or plant materials.
  • Golgi ⁇ -mannosidase II (GMII, EC 3.2.1.114) is an enzyme that is localized in the Golgi of multicellular eukaryotes, and the hydrolysis of branched mannose residues on the ⁇ 1, 6-arm (ie of mannoses in both ⁇ 1, 3 - As ⁇ 1,6 linkage) can catalyze.
  • the mannose-terminated glycans remain on the ⁇ 1, 6 arm and are not cleaved off, which is important to the present invention.
  • Effective gene silencing approaches such as cosuppression, antisense or RNAi restriction (Waterhouse et al., 1999) may be considered as methods for eliminating or reducing the activity of Golgi ⁇ -mannosidase II, but so-called “knock out "mutants in which the gene (s) which are (s) for Golgi ⁇ -mannosidase II coded / coded, deliberately eliminated or rendered inoperable, or otherwise modified plants which do not possess intact Golgi ⁇ -mannosidase II are used.
  • the plants or plant parts or plant cells used in the process according to the invention can be transformed beforehand with the gene which codes for the desired glycoprotein.
  • Methods for introducing such genes into plants are known to the person skilled in the art and are part of the general state of the art (eg either by T-DNA transfer by agrobacteria or by direct gene transfer into protoplasts by means of electroporation or PEG, as well as by more recent biolistic methods Bombardment of plant cells in whole tissues with DNA-clad metal spheres ("gene gun", for example from BIORAD)).
  • the generated hypoallergenic glycoprotein is preferably a therapeutic protein such as e.g. Glucocerebrosidase (glucosylceramidase; D-glucosyl-iV-acylsphingosine-glucohydrolase, EC 3.2.1.45), in particular human glucocerebrosidase (hCG), a glycoprotein for the treatment of Gaucher disease, whose uptake into liver cells of patients is based on terminal mannose residues (Barton et al., 1990).
  • the hypoallergenic glycoprotein may be another secreted glycoprotein therapeutic, such as e.g.
  • an antibody an interleukin, an interferon, a lipase, etc., in particular a lysosomal storage disorder therapeutic.
  • a lysosomal storage disorder therapeutic for example ⁇ -mannosidases (GMII itself or lysosomal ⁇ -mannosidase) for the treatment of diseases with HEMPAS syndrome (Fukuda, 1990) or GnTII for the treatment of CDGSII ("carbohydrate deficient glycoprotein syndrome type II "; Tan et al., 1996).
  • Suitable plants in the process according to the invention are, in particular, the genetic model plant Arabidopsis thaliana or solanaceae such as tomato plants (Lycopersicon spec), tobacco plants ⁇ Nicotiana spec.) Or potato plants ⁇ solarium spec). Furthermore are Other agronomically important plants such as rice and corn suitable. In addition, the water lens Lemna spec. (Cox et al., 2006) and also lower plants. For the moss Physcomitrella patens it could be shown that "targeted knockout" strategies are possible due to homologous recombination (reviewed in: Decker & Reski, 2007).
  • the activity of core fucosyltransferases is eliminated or reduced Enzymes which catalyze the transfer of core ⁇ , 3-fucose residues to glycoprotein glycans, i.
  • the present invention relates to mutated or transgenic plants, parts of these plants or plant cells produced therefrom, which are characterized in that the activity of the enzyme Golgi ⁇ -mannosidase II in the mutated or transgenic plant, the parts of these plants or plant cells produced therefrom eliminated or is reduced and these produce a hypoallergenic heterologous glycoprotein.
  • the activity of the enzyme "core" fucosyltransferase is also eliminated or reduced.
  • transgenic plants or plant materials, the glycoproteins produced, the methods for eliminating or reducing the activity of ⁇ -mannosidase II or "core" fucosyltransferase are preferably as described for the method according to the invention.
  • the present inventors have also found, in experiments with tomatoes, that plants with reduced Golgi ⁇ -mannosidase II activity do not cause any adverse effects on the environment. hen show fully mature red fruits without abnormalities. In contrast, in plants in which the activity of GntI was reduced instead of the activity of ⁇ -mannosidase II, distinct phenotypes were found during fruit ripening. Particularly noticeable were maturity-inhibited spots and necrotic stems (see Fig. 4), which caused premature dropping of fruit. Together with an increased susceptibility to pathogens of GNTI-RNAi plants, these factors should make it difficult to purify and isolate heterologous glycoproteins.
  • transgenic plants or plant materials according to the invention are therefore suitable in particular for the generation of hypoallergenic heterologous glycoproteins as well as hypoallergenic plants which are suitable as foods for allergy sufferers, for the CCD epitopes ("cross-reactive carbohydrate determinants")
  • the invention thus also relates to hypoallergenic plants or plant materials as such.
  • the suitability can be increased by eliminating, inhibiting or reducing the activity of "core" fucosyltransferase in addition to the activity of Golgi ⁇ -mannosidase II.
  • glycoproteins which are obtainable by means of the processes according to the invention or from the plants or plant materials according to the invention are also part of the present invention.
  • FIG. 1 Sequence of plant-typical IV glycan modifications which are subject to secretory glycoproteins when they pass through the ER and the Golgi apparatus. Glycans accumulating in defects in ⁇ -mannosidase II are shown as the path with dashed arrows.
  • Fig. 2 Scheme of the RNAi constructs used.
  • s sense
  • antisense antisense
  • Fig. 3 central intron tested (result, see Fig. 3)
  • cloning of the dsRNAi construct was carried out analogously to Chen et al. (2003), with subsequent insertion into the plant expression cassette as described by von Schaewen et al. (1990).
  • Abbr . 35S, promoter of cauliflower mosaic virus (constitutive); B33, promoter for solanaceous (tuber / fruit specific); OCS pA, polyadenylation signal of octopine synthase (from Agrobacterium T-DNA).
  • FIG. 3 Immunoblot detection of the CCD pattern (with PHA-L antiserum) in tomato extracts of the AUNII-KNAi primary transformants (TO) with wild type (Wt) and GNTI-KN Ai lines for comparison (top) , The Ponceau S reversibly-stained membrane (bottom) shows that comparable amounts of protein were transferred.
  • M Marker Proteins (Pre-stained Protein Ladder, Fermentas). This shows for the present invention that the CCD throttling in M4M / RNAi lines is comparable to that in GNTY RNAi lines (with different running behaviors of the remaining CCD-reactive glycoproteins).
  • Fig. 4 Comparison of hypoallergenic tomato fruits. While GiV77 RNAi lines show a maturity phenotype (patchy, immature sites and necrotic stems), MANII RNAi lines produce fully ripe fruits. This demonstrates for the present invention that CCD throttling in M4iV // RNAi lines does not phenotypically affect fruit development.
  • FIG. 5 CCD pattern in leaf extracts of selected Arabidopsis N-glycosylation mutants and tomato RNAi lines on immunodetection with PHA-L antiserum which predominantly recognizes xylose residues (Lauriere et al., 1989) and Stripping of the blot - with HRP antiserum (stronger core-fucose recognition)
  • HRP antiserum stronger core-fucose recognition
  • Fig. 6 Tomato fruit extracts of wild type and RNAi lines without / with PNGase F treatment.
  • the glycoproteins of the M4JV7 / RNAi lines carry "core" fucose residues (PNGase F can not cleave) and untrimmed mannose residues on the ⁇ l, 6-mannose arm, resulting in stronger ConA binding compared to the wild type.
  • This demonstrates for the present invention that glycoproteins from hglI (/ " ⁇ " //) mutants or MANII-RNAi lines are suitable for preferential uptake into cells of patients with lysosomal storage diseases (such as Gaucher, etc.).
  • Fig. 7 Immunoblot analysis of tomato fruit extracts with patient sera.
  • the chemiluminescent detection of allergy type I-relevant immunoglobulins (IgE) shows reduced reactivity of the two CCD allergy sufferers with proteins from M4M / RNAi lines that are comparable to GiV77 RNAi lines.
  • the colorimetric overdevelopment of non-allergic (NA) blots with PHA-L antiserum (rabbit IgG) gives a similar pattern (control). Including, for comparison of protein levels, 43 kDa region of Ponceau S-stained blots.
  • Abbr . NA, non-allergic; TB-02 and AK-06, CCD allergy sufferers. This shows for the present invention that CCD throttling via M4N // RNAi is immunologically relevant for CCD allergy sufferers.
  • FIG. 8 Detectability of the hGC signal as a function of the iV glycan decoration in apoplast eluates from leaves of tobacco RNAi lines. Two colons represent stable integration of the respective constructs into the plant genome. X, offspring resulting from intersections of the corresponding lines. MD and Xan (Xanthi) denote tobacco varieties (Nicotiana tabacum). His-hGC, recombinant human glucocerebrosidase with N-terminal His tag without iV glycans (after overexpression in E.
  • the arrows mark the position of the plant-produced hGC glycoproteins on the blot which only are clearly detectable in the hypoallergenic M4iV7 / RNAi line No. 1.
  • the lack of binding of PHA-L antiserum indicates that hGC in M4M7 RNAi lines carries hypoallergenic N-glycans.
  • the M4M / dsDNAi constructs were designed based on a tomato EST clone (TA33056_4081 from the TIGR database) specifically for tomato.
  • An approximately 400 bp fragment of Golgi ⁇ -mannosidase II was isolated by RT-PCR from leaf RNA of Lycopersicon esculentum of the Moneymaker "Microtome” variety was added to the vector pUC-RNAi (Chen et al., 2003) flanking the first intron of the potato GA20 oxidase via Sall / BamHI or XhoI / BglII via compatible overhangs
  • two different M4M / dsDNAi constructs were prepared: a "sense" intron antisense construct with the primers:
  • the dsRNAi regions were excised with PstI and inserted into an expression cassette (between the constitutive CaMV 35S promoter and the OCS polyadenylation signal) of the Sdal-opened binary vector pBinAR (HygR, Becker, 1990).
  • Competent GV2260 Agrobacterium cells (strain C58C1 with virulence plasmid pGV2260, Deblaere et al., 1985) were directly transformed with the binary plasmid constructs (Höfgen and Willmitzer, 1988) and for cocultivation of tomato cotyledons on a feeder layer of tobacco BY2- Cells were used as described in Ling et al., 1998. Regeneration of M4M / RNAi transformants was under selection pressure (10 mg / l hygromycin B).
  • Protein Extraction First, the seeds were removed from fresh tomato fruits and the remaining fruit either whole or pulp and shell separated in liquid nitrogen ground to a fine powder and stored until further use aliquots at -80 ° C.
  • the minced material was mixed with ice-cold buffer (either 100 mM HEPES pH 7.5 or 50 mM HEPES pH 7.5 with 250 mM NaCl) and other additives (2 mM Na 2 S 2 O 5 , 1 mM Pefabloc SC, SERVA , Proteinase inhibitor cocktail, SIGMA, 1: 5000) and then centrifuged for 10 min at 4 ° C. The supernatants were used after determination of the protein content (Bradford, 1976) for immunoblots.
  • Protein extracts were separated under reducing conditions in 11-15% polyacrylamide gels by SDS-PAGE (Laemmli, 1970) and on nitrocellulose membranes (0.45 ⁇ m PROTRAN, Schleicher & Schull) in a wet cell (Mini-Protean 3 system , Bio-Rad) for 2 hours at 350 mA.
  • the proteins were stained and fixed with Ponceau S (0.3% in 3% TCA, SERVA), and according to the documentation (flatbed scanner) with TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% ( v / v) Tween 20, pH 7.4).
  • the blot membranes were then blocked with 2% milk powder in TBST either overnight at 4 ° C or at RT for at least 1 hour.
  • the blots were incubated in dilute antisera (1: 5000 in TBST, 2% milk powder) with shaking for 2 hours at RT. This was followed by 3 washes with TBST and a further incubation with HRP-conjugated "goat-anti-rabbit" IgG (Bio-Rad, 1: 10,000 in TBST, 2% milk powder) for 1 hour, followed by washing 3 times, followed by development and subsequent stripping blot membranes were prepared according to the manufacturer's instructions for the ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare).
  • vacuolar invertase vINV
  • human glucocerebrosidase hGC
  • antisera obtained after immunization of rabbits with N-terminal truncated versions and His tag were first cloned (first cloning corresponding cDNA fragments into pETIb followed by IPTG -induced overexpression in E. coli BL21 cells (Novagen) and subsequent affinity purification on Ni-NTA (Qiagen). All further steps were carried out as described above.
  • the antisera were used 10 times more concentrated, incubated with HRP-conjugated "goat-anti-rabbit" IgG (Bio-Rad, 1: 3,000 in TBST, 2% milk powder) for 1 hour at RT and as described by Schaewen et al. (1993).
  • IgE immunoblots For immunoblot detection of IgE antibodies from human sera, the blocked blot membranes were incubated with diluted patient sera (1:10 in TBST, 2% milk powder) with shaking for 3 hours at RT, 3 times with TBST and subsequently incubated with affinity-purified antibody peroxidase-labeled goat anti-human IgE ( ⁇ ) (Kirkegaard & Perry Laboratories, MD, USA) (1: 10,000 in TBST) for 1 hour and washed as above The subsequent chemiluminescent development was also performed with the ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions.
  • Recombinant human beta-glucosidase stored in tobacco seed is stable, and is taken up by human fibroblasts. Plant Mol. Biol. 57: 101-113.
  • Strasser R Schoberer J, Jin C, Glössl J, Mach L, Steinkellner H (2006). Molecular cloning and characterization of Arabidopsis thaliana Golgi alpha-mannosidase II, a key enzyme in the formation of complex JV glycans in plants. Plant J. 45: 789-803.
  • Strasser R Stadimann J, Shahs M, Stiegler G, Quendler H, Mach L, Gössl J, Weterings K, Pabst M, Steinkellner H (2008). Generation of glyco-engineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies with a homogeneous human-like N-glycan structure. Plant Biotechnol. J. 6: 392-402.
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von hypoallergenen Glykoproteinen in mutierten oder transgenen Pflanzen, Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen sowie die entsprechenden mutierten oder transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen, bei welchen die Aktivität des Enzyms Golgi a-Mannosidase II beseitigt oder verringert ist und welche hypoallergene heterologe Glykoproteine produzieren.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Erzeugung von hypoallergenen Glykoproteinen in mutierten oder transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen sowie mutierte oder transgεne Pflanzen und Pflanzenzellen zur Erzeugung hypoallergener Glykoproteine
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von hypoallergenen Glykoproteinen in mutierten oder transgenen Pflanzen, Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen sowie die entsprechenden mutierten oder transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen.
In allen Eurkaryoten ist N-Glykosylierung im Sekretorischen System ein essentieller Prozess. Glykoproteine werden zunächst im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zusammengesetzt, wobei membrangebundene Glykane (Dolicholpyrophosphat-Oligosaccharide) cotranslational auf spezielle Asparagin-Reste in der wachsenden Polypeptidkette transferiert werden. In höheren Organismen unterliegen Zuckereinheiten, die an der Oberfläche der gefalteten Polypeptidkette liegen, in Golgi-Zisternen weiteren Trimm- und Modifikationsreaktionen. Durch verschiedene Glykosidasen und Glykosyltransferasen im ER und Golgi-Apparat (die Ausstattung kann Spezies-abhängig unterschiedlich sein), werden zunächst typische Glc3Man9GlcNAc2-Grund- einheiten (,,core"-Glykane) des „high"-Mannose-Typs (Anglizismen werden in der vorliegenden Anmeldung in Anführungsstriche gesetzt) gebildet und anschließend bei Passage durch die verschiedenen Golgi-Zisternen in sogenannte „komplexe" Glykane umgewandelt. Letztere zeichnen sich durch eine geringere Zahl an Mannose-Einheiten und den Besitz weiterer Zuckerreste, wie Fucose und/oder Xylose sowie Galaktose in Pflanzen bzw. Sialinsäure (jV-Acetylneuraminsäure, NeuNAc) in Säugern, aus.
In Höheren Pflanzen umfasst die Bildung komplexer iV-Glykane im Sekretorischen System insgesamt acht Schritte (Fig. 1), wobei die Verknüpfung mit „core" αl,3-Fucose- und ßl,2-Xylose- Resten für pflanzliche Glykoproteine charakteristisch ist. Da diese Modifikationen zwar auch in einigen Invertebraten vorkommen, in Säugern aber nur αl,6-verknüpfte „core"-Fucose-Reste existieren, wirken pflanzliche Glykoproteine auf Letztere immunogen. Dies zeigt eindrucksvoll, dass nicht nur die Zuckerreste als solche, sondern auch die Art ihrer Verknüpfung über Bindung oder Nicht-Bindung von Antikörpern entscheidet. Glykoproteine sind für Medizin und Forschung von großer Bedeutung. Eine Isolierung von Glykoproteinen im Großmaßstab ist jedoch aufwendig und teuer. Die direkte Anwendung konventionell isolierter Glykoproteine ist oft problematisch, da einzelne Reste der Glykan- Komponenten bei Verabreichung als Therapeutikum ungewünschte Nebenwirkungen auslösen können. In den meisten Fällen kann auf die Glykan-Komponente nicht verzichtet werden, da sie vor allem zu den physikochemischen Eigenschaften (wie Faltung, Stabilität und Löslichkeit) der Glykoproteine beiträgt.
Hefen haben sich zur Gewinnung von Glykoproteinen für Medizin und Forschung größtenteils als ungeeignet erwiesen, da sie nur Glykosylierungen zum sogenannten „high"-Mannose-Typ durchführen können. Insekten und Höhere Pflanzen zeigen zwar „komplexe", aber von Tieren abweichende Glykoprotein-Modifikationen, so dass aus diesen Organismen isolierte Glykoproteine in Säugern immunogen wirken (Faye & Chrispeels, 1988; Strasser et al., 2008). Tierische Organismen mit Glykosylierungsdefekten sind meist nicht lebensfähig, da die termi- nalen Glykan-Reste (beispielsweise membranständiger Glykoproteine) biologische Signalfunktion besitzen und vor allem für die Zell-Zell-Erkennung während der Embryonalentwicklung unentbehrlich sind. Es existieren zwar Säugerzell-Linien (CHO, „Chinese Hamster Ovary cells") mit definierten Glykosylierungsdefekten, jedoch ist deren Kultivierung arbeitsintensiv und kostspielig.
Im Einzelnen wurden für Säuger auf Zellkulturebene bereits unterschiedliche Glykosylierungs- mutanten beschrieben. Diese Mutanten sind entweder in der Biosynthese reifer Oligosaccharid- ketten am Dolicholpyrophosphat oder in der Glykan-Prozessierung betroffen bzw. zeigen Abweichungen in ihren terminalen Zuckerresten. Einige dieser Zeil-Linien weisen einen konditi- onal-letalen Phänotyp auf oder zeigen Defekte im intrazellulären Proteintransport.
Die Folgen dieser Defekte für den intakten Organismus sind schwer abschätzbar. Es wurde beobachtet, dass eine Veränderung im Muster komplexer Glykane auf Zelloberflächen von Säugern mit Tumor- und Metastasenbildung einhergeht (Li et al., 2008 und darin zitierte Arbeiten). Glykosylierungsmutanten kommen in Säugern daher sehr selten vor. Unter der Abkürzung HEMPAS („Hereditary Erythroblastic Multinuclearity with a Positive Acidified Serum lysis test") zusammengefasste Defekte beruhen entweder auf einem Defizit von α-Mannosidase II im Golgi-Apparat bzw. in Lysosomen und/oder niedrigen Gehalten des Enzyms iV-Acetyl-Glucosa- minyltransferase II (GnTII) und wirken sich stark einschränkend auf die Lebensfähigkeit der mutierten Organismen aus (Fukuda, 1990). In „knock out"-Mäusen, in denen Golgi α-Mannosi- dase II (GMII) zerstört ist, wird ein alternativer Syntheseweg beschriften, so dass sie lebensfähig aber anämisch sind (Chui et al., 1997; Moremen, 2002). Patienten mit Mutationen in GnTII leiden an CDGSII („carbohydrate deficient glycoprotein Syndrome type II") mit schweren, multip- len Entwicklungsdefekten (Tan et al., 1996). „knock out"-Mäuse, in denen das Gen für N-Ace- tyl-Glucosaminyltransferase I (GnTI) zerstört wurde, sterben bereits im Embryonalstadium an multiplen Entwicklungsdefekten (Ioffe & Stanley, 1994; Metzler et al., 1994).
Aufgrund der Ergebnisse mit Säugern bzw. Säugerzellen (aufwendig und anfällig für Kontami- nation mit humanen Pathogenen) wurden in den letzten Jahren vermehrt Versuche unternommen, heterologe Glykoproteine in Pflanzen oder Pflanzenzellen zu erzeugen, die so modifiziert sind, dass sie Glykoproteine mit verminderten immunogenen Eigenschaften synthetisieren.
So wurden in früheren Arbeiten Arabidopsis-Mutanten isoliert (von Schaewen et al., 1993), die im zweiten Schritt der Glykan-Modifkation im Golgi- Apparat defekt sind, so dass Glykoproteine mit einheitlicher Man5GlcNAc2-Modifikation akkumulieren. Trotz fehlender Aktivität der N- Acetyl-Glukosaminyltransferase I (NAG oder GnTI) unterschieden sich diese Arabidopsis cgll- Mutanten unter standardisierten Anzucht-Bedingungen (d.h. in Klimakammern oder im Gewächshaus) nicht merklich vom Wiltyp. GW77-codierende cDNA-Sequenzen aus Arabidopsis, Kartoffel und Tabak wurden erfolgreich zur „antisense"-Drosselung komplexer Glykoprotein- Glykane in Solanaceen eingesetzt (Wenderoth & von Schaewen, 2000). Dies war ein erster Hinweis darauf, dass auch agronomisch wichtige Kulturpflanzen fehlende GnTI-Aktivität prinzipiell tolerieren und zur Produktion modifizierter Glykoproteine eingesetzt werden könnten.
Auf dieser Basis wurde dann versucht, ein Modellsystem für die Herstellung hypoallergener
Glykoproteine in Pflanzen zu entwickeln. Hierzu diente exemplarisch bislang eine stabile Tabak- Linie (T. Turpen, US-Patent 6,841,659), in der humane Glucocerebrosidase (hCG; EC 3.2.1.45) im Apoplasten akkumuliert. Zusätzliche GNTY-RNAi-Drosselung in diesem System führte allerdings dazu, dass hCG nicht mehr nachgewiesen werden konnte (Fig. 8).
In einem anderen Ansatz wurde hGC in einer Karottenzellsuspension produziert (Shaaltiel et al., 2007). Das rekombinante Protein wurde hier mithilfe eines C-terminal angehängten, vakuolären „targeting" Signals (CTTP) zu den Vakuolen transportiert und trägt daher pflanzentypische, immunogene Glykane. Das bei diesem Ansatz benutzte System hat zudem den Nachteil, dass zur Ansteuerung von Vakuolen Extrasequenzen verwendet werden mussten, die für klinische Phase III-Studien nicht erlaubt sind.
Gezielte Überproduktion von hGC in Tabaksamen resultierte in einer Verminderung der Vitalität des rekombinanten Saatguts. Aus diesem Saatgut erhaltene hGC-Präparationen wiesen zwar reduzierte Gehalte an immunogenen Xylose- und Fucose-Resten auf, dafür wurden aber Galaktose- und Glucose-Modifikationen nachgewiesen. Das beeinträchtigte zwar nicht die Funktionalität der Enzympräparation, minderte jedoch die Aufnahme in Fibroblasten von Gaucher-Patienten (Reggi et al., 2005), wofür Mannose-terminierte Glykane wie bei der vorliegenden Erfindung besser geeignet wären (vgl. anti-PHA-L (Phytohämagglutinin L) zu ConA-Bindung in Fig. 6).
Des Weiteren wurden mittels RNAi-Drosselung in Nicotiana benthamiana sowohl „core"-Fuco- syltransferasen sowie gleichzeitig Xylosyltransferase dezimiert (Strasser et al., 2008). Ein in diesen Pflanzen erzeugter monoklonaler Antikörper hatte hypoallergene Eigenschaften (Jin et al., 2008). Glykoproteine aus diesen Pflanzen sollten, analog zum Wildtyp (Fig. 6), ebenfalls kaum Mannose-terminierte Glykoproteine aufweisen, was die Wirksamkeit („clearance") humoral verabreichter hGC in Gaucher-Patienten herabsetzen dürfte.
Für Medizin und Forschung besteht also nach wie vor ein Bedarf für Expressionssysteme bzw. Verfahren, um rekombinante und insbesondere hypoallergene Glykoproteine kostengünstig herstellen zu können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein geeignetes Verfahren bzw. geeignete Pflanzen oder Pflanzenmaterialien zur Erzeugung hypoallergener Glykoproteine, insbesondere für die Therapie lysosomaler Speicherkrankheiten, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie mutierte oder transgene Pflanzen bzw. Pflanzenmaterialien nach Anspruch 8 sowie die Verwendung nach Anspruch 11.
Die gegenwärtigen Erfinder haben überraschend festgestellt, dass Pflanzen, in denen die Aktivität der Golgi α-Mannosidase II (GMII, EC 3.2.1.114) unterdrückt ist, eine signifikante Reduktion der immunologischen Erkennung komplex glykosylierter Proteine in transgenen Pflanzen und damit auch eine generelle Reduktion von CCD-Allergenen („cross-reactive carbohydrate deter- minants" der Struktur Man3XylFucGlcNac2 oder Man3XylGlcNac2) aufweisen, d.h. in hohem Maße hypoallergene Glykoproteine erzeugen. Dies war weitestgehend zwar auch bei parallel untersuchten GiV77-RNAi-Linien der Fall, aber im Gegensatz zu den GiV77-RNAi-Linien führten M4M/-RNAi-Linien zu keinerlei Vitalitätseinbußen bei den Pflanzen, in diesem Fall bei Tomaten (Fig. 4).
Dieses Ergebnis war völlig unerwartet, da bisher beschriebene „knock out"-Mutanten von Golgi α-Mannosidase II in Arabidopsis thaliana iV-Glykane produzierten, die auf der Basis von mas- senspektrometrischen Glykan-Analysen eine normale Immunogenität erwarten lassen, da sie sowohl „core" Fucose- wie auch Xylose-Reste tragen (Strasser et al., 2006). Der bisherige Stand der Technik ließ es also als höchst unwahrscheinlich erscheinen, dass Pflanzen mit fehlender oder verringerter Aktivität von Golgi α-Mannosidase II geeignet sein könnten, hypoallergene Glykoproteine zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erzeugung von hypoallergenen Glykoproteinen, welches das Züchten einer mutierten oder transgenen Pflanze, von Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellter Pflanzenzellen und das Isolieren eines gewünschten hypo- allergenen Glykoproteins aus dem gezüchteten Material umfasst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aktivität des Enzyms Golgi α-Mannosidase II in der mutierten oder transgenen Pflanze, Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen beseitigt oder verringert ist.
Teile von solchen Pflanzen können z.B. auch Samen und Vermehrungsmaterial umfassen. Zur Vereinfachung werden Teile von solchen Pflanzen sowie Pflanzenzellen in dieser Anmeldung zusammengefasst auch als Pflanzenmaterial oder Pflanzenmaterialien bezeichnet.
Golgi α-Mannosidase II (GMII, EC 3.2.1.114) ist ein Enzym, das im Golgi -Apparat vielzelliger Eukaryoten lokalisiert ist und die Hydrolyse von verzweigten Mannose-Resten auf dem αl,6- Arm (d.h. von Mannosen in sowohl αl,3- wie α 1,6- Verknüpfung) katalysieren kann. Bei Ausschaltung der Golgi α-Mannosidase II bleiben die Mannose-terminierten Glykane auf dem αl,6- Arm erhalten und werden nicht abgespalten, was für die vorliegende Erfindung von Bedeutung ist.
Als Methoden zur Beseitigung oder Verringerung der Aktivität von Golgi α-Mannosidase II kommen effektive „gene silencing"-Ansätze, beispielsweise Cosuppression, Antisense- oder RNAi-Drosselung (Waterhouse et al. 1999), in Betracht. Es können aber ebenfalls sogenannte „knock out"-Mutanten, bei denen das/die Gen(e), welche(s) für Golgi α-Mannosidase II codiert/codieren, gezielt eliminiert oder funktionsunfähig gemacht wurde(n), oder in anderer Weise veränderte Pflanzen, die keine intakte Golgi α-Mannosidase II besitzen, eingesetzt werden.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Pflanzen bzw. Pflanzenteile oder Pflanzenzellen können dabei vorher mit dem Gen, welches das gewünschte Glykoprotein codiert, transformiert werden. Verfahren, um solche Gene in Pflanzen einzuführen, sind dem Fachmann bekannt und gehören zum allgemeinen Stand der Technik (z.B. entweder durch T-DNA-Transfer mittels Agrobakterien oder durch direkten Gentransfer in Protoplasten mittels Elektroporation bzw. PEG, sowie auch durch neuere biolistische Methoden nach Beschuss von Pflanzenzellen in ganzen Geweben mit DNA-umhüllten Metallkügelchen („gene gun", z.B. der Fa. BIORAD)).
Das erzeugte hypoallergene Glykoprotein ist vorzugsweise ein therapeutisches Protein wie z.B. Glucocerebrosidase (Glucosylceramidase; D-Glucosyl-iV-Acylsphingosin-Glucohydrolase, EC 3.2.1.45), insbesondere humane Glucocerebrosidase (hCG), ein Glykoprotein zur Behandlung der Gaucher-Krankheit, dessen Aufnahme in Leberzellen der Patienten auf terminalen Mannose- Resten beruht (Barton et al., 1990). Ebenso kann das hypoallergene Glykoprotein ein anderes sekretiertes Glykoprotein-Therapeutikum wie z.B. ein Antikörper, ein Interleukin, ein Interferon, eine Lipase etc., insbesondere ein Therapeutikum für eine lysosomale Speichererkrankung sein. Denkbar wäre auch eine Produktion von sekretierten Versionen membranverankerter Enzyme, beispielsweise von α-Mannosidasen (GMII selbst bzw. lysosomaler α-Mannosidase) zur Behandlung von Krankheiten mit HEMPAS-Syndrom (Fukuda, 1990) oder von GnTII zur Behandlung von CDGSII („carbohydrate deficient glycoprotein Syndrome type II"; Tan et al., 1996).
Besonders bevorzugt werden solche Pflanzen oder Pflanzenmaterialien eingesetzt, bei welchen das heterologe Glykoprotein im Apoplasten/der Zellwand oder in Vakuolen akkumuliert. Dadurch wird die Reinigung aus Blättern vereinfacht, da so angereicherte Glykoprotein-Präpara- tionen weniger Verunreinigungen enthalten (siehe z.B. US-Patent Nr. 6,841,659 B2 von Thomas H. Turpen et al.).
Als Pflanzen in dem erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere die genetische Modellplfanze Arabidopsis thaliana oder Solanaceen wie z.B. Tomatenpflanzen (Lycopersicon spec), Tabakpflanzen {Nicotiana spec.) oder Kartoffelpflanzen {Solarium spec). Weiterhin sind auch andere agronomisch wichtige Pflanzen wie z.B. Reis und Mais geeignet. Daneben bieten sich als Expressionssysteme die Wasserlinse Lemna spec. (Cox et al. 2006) und auch niedere Pflanzen an. Für das Moos Physcomitrella patens konnte gezeigt werden, dass „targeted knock- out"-Strategien aufgrund von homologer Rekombination möglich sind (Übersicht in: Decker & Reski, 2007).
Bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich die Aktivität von „core"-Fucosyltransferasen beseitigt oder verringert. Enzyme, die den Transfer von „core" αl,3-Fucose-Resten auf Glykoprotein-Glykane katalysieren, d.h. „core" αl,3-Fuco- syltransferasen, sind ebenfalls im Golgi- Apparat lokalisiert (Sturm et al., 1987) und benötigen mindestens ein terminales GlcNac, d.h. können frühestens im Anschluss an GnTI arbeiten (Johnson & Chrispeels, 1987). Nachdem durch Kreuzung in Arabidopsis zusätzlich zur Aktivität der GMII (Strasser et al., 2006) auch die Aktivität von zwei „core"-Fucosyltransferase-Isoformen (FucTa und FucTb; Strasser et al., 2004) ausgeschaltet wurde, konnten bei der vorliegenden Erfindung hypoallergene Glykoproteine analog zu cgll (mit GnTI-Defekt) erzielt werden (Fig. 5). Dies sollte ebenfalls einen günstigen Effekt auf die Wirkung von in Pflanzen rekombinant hergestellten Antikörpern haben (ADCC, vgl. Cox et al., 2006; Decker & Reski, 2007; Strasser et al., 2008).
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung mutierte oder transgene Pflanzen, Teile dieser Pflanzen oder daraus hergestellte Pflanzenzellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Aktivität des Enzyms Golgi α-Mannosidase II in der mutierten oder transgenen Pflanze, den Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen beseitigt oder verringert ist und diese ein hypoallergenes heterologes Glykoprotein produzieren.
Bei besonders bevorzugten transgenen Pflanzen oder Pflanzenmaterialien ist ebenfalls die Aktivität des Enzyms „core"-Fucosyltransferase beseitigt oder verringert.
Die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenmaterialien, die produzierten Glykoproteine, die Metho- den zur Beseitigung oder Verringerung der Aktivität von α-Mannosidase II oder „core"-Fucosyl- transferase sind vorzugsweise so wie für das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben wurde.
Die gegenwärtigen Erfinder haben darüber hinaus bei Versuchen mit Tomaten festgestellt, dass Pflanzen mit verringerter Golgi α-Mannosidase II- Aktivität keine Beeinträchtigungen im Ausse- hen zeigen und voll ausgereifte rote Früchte ohne Auffälligkeiten bilden. Dagegen wurden bei entsprechenden Pflanzen, in denen anstelle der Aktivität von α-Mannosidase II die Aktivität von GntI verringert wurde, während der Fruchtreife deutliche Phänotypen festgestellt. Besonders auffällig waren hierbei Reife-inhibierte Flecken und nekrotische Stielansätze (vergl. Fig. 4), was vorzeitigen Fruchtfall auslöste. Zusammen mit einer erhöhten Pathogenanfälligkeit der GNTI- RNAi-Pflanzen sollten diese Faktoren eine Reinigung und Isolation von heterologen Glyko- proteinen erschweren.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenmaterialien eignen sich daher insbe- sondere sowohl zur Erzeugung hypoallergener heterologer Glykoproteine als auch als hypoaller- gene Pflanzen, die als Nahrungsmittel für Allergiker geeignet sind, für die CCD-Epitope („cross- reactive carbohydrate determinants") ein Problem darstellen. Die Erfindung betrifft damit auch hypoallergene Pflanzen bzw. Pflanzenmaterialien als solche.
Die Eignung kann noch dadurch erhöht werden, dass neben der Aktivität von Golgi α-Mannosidase II zusätzlich die Aktivität von „core"-Fucosyltransferase beseitigt, gehemmt oder verringert wird.
Schließlich sind auch die Glykoproteine, die mittels der erfϊndungsgemäßen Verfahren oder aus den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. Pflanzenmaterialien erhältlich sind, Teil der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen mit Bezug auf die beigefügten Figuren näher erläutert. Die Ausführungsbeispiele sollen den Umfang der Erfindung aber nicht beschränken.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 : Reihenfolge Pflanzen-typischer iV-Glykan-Modifikationen, denen sekretorische Glyko- proteine bei Passage durch das ER und den Golgi-Apparat unterliegen. Glykane, die bei Defekten in α-Mannosidase II akkumulieren, sind als Weg mit gestrichelten Pfeilen dargestellt.
Fig. 2: Schema der verwendeten RNAi-Konstrukte. Für den M4M/-RNAi-Ansatz wurden unterschiedliche Orientierungen der cDNA-Fragmente in sense (s) und antisense (as) relativ zum zentralen Intron getestet (Ergebnis, vgl. Fig. 3), dabei erfolgte die Klonierung des dsRNAi- Konstrukts analog zu Chen et al. (2003), mit anschließender Insertion in die Pflanzen- Expressionskassette wie bei von Schaewen et al. (1990). Abk.: 35S, Promotor aus Blumenkohl- Mosaikvirus (konstitutiv); B33, Promotor für Solanaceen (Knolle/Frucht-spezifisch); OCS pA, Polyadenylierungssignal der Octopin-Synthase (aus Agrobakterien T-DNA).
Fig. 3: Immunoblot-Detektion des CCD-Musters (mit PHA-L- Antiserum) in Tomatenfrucht- Extrakten der AUNII-KNAi Primär-Transformanten (TO) mit Wildtyp (Wt) und GNTI-KN Ai- Linien zum Vergleich (oben). Die Ponceau S reversibel-gefärbte Membran (unten) zeigt, dass vergleichbare Proteinmengen transferiert wurden. M, Markerproteine (Pre-stained Protein Ladder, Fermentas). Dies zeigt für die vorliegende Erfindung, dass die CCD-Drosselung in M4M/-RNAi-Linien mit der in GNTY-RNAi-Linien vergleichbar ist (bei unterschiedlichem LaufVerhalten der verbleibenden, CCD-reaktiven Glykoproteine).
Fig. 4: Vergleich von hypoallergenen Tomatenfrüchten. Während GiV77-RNAi-Linien einen Reifephänotyp zeigen (fleckige, unreife Stellen und nekrotische Stielansätze), bilden MANII- RNAi-Linien Vollreife Früchte aus. Dies zeigt für die vorliegende Erfindung, dass die CCD- Drosselung in M4iV//-RNAi-Linien die Fruchtentwicklung phänotypisch nicht beeinträchtigt.
Fig. 5: CCD-Muster in Blatt-Extrakten von ausgewählten Arabidopsis N-Glykosylierungs- mutanten und Tomaten RNAi-Linien bei Immunodetektion mit PHA-L- Antiserum, welches überwiegend Xylose-Reste erkennt (Lauriere et al., 1989) und - nach Strippen des Blots - mit HRP -Antiserum (stärkere ,,core"-Fucose-Erkennung). Der Vergleich der beiden linken Blots zeigt für die Arabidopsis-Mutanten, dass hgll (manll) mit xylT vergleichbar ist und deutet an, dass Restreaktivität der Tomaten M4M/-RNAi-Extrakte auf „core"-Fucosen beruhen muss.
Rechts, nach Kreuzung von hgll (manll) und fucTafucTb ergibt sich eine weitere Reduktion der CCD-Erkennung in Arabidopsis mtf«///Mc7tf6-Tripelmutanten (ohne ,,core"-Fucose-Reste). Wie die Blot-Entwicklung mit HRP -Antiserum (unten) zeigt, impliziert dies für die vorliegende Erfindung, dass zusätzliche Drosselung von „core"-Fucosyltransferase- Aktivität die CCD- Reaktivität der M4M/-RNAi-Linien noch weiter reduzieren sollte.
Fig. 6: Tomatenfrucht-Extrakte von Wildtyp und RNAi-Linien ohne/mit PNGase F-Behandlung. Die Glykoproteine der M4JV7/-RNAi-Linien (Beispiel: vakuoläre Invertase, anti-vINV) tragen „core"-Fucose-Reste (PNGase F kann nicht spalten) und ungetrimmte Mannose-Reste auf dem αl,6-Mannose-Arm, was in stärkerer ConA-Bindung im Vergleich zum Wildtyp resultiert. Dies zeigt für die vorliegende Erfindung, dass Glykoproteine aus hgll (/«α«//)-Mutanten oder MANII- RNAi-Linien für eine bevorzugte Aufnahme in Zellen von Patienten mit lysosomalen Speicherkrankheiten (wie Gaucher, etc.) geeignet sind.
Fig. 7: Immunoblot- Analyse von Tomatenfrucht-Extrakten mit Patientenseren. Der chemi- lumineszente Nachweis Allergie-Typ I-relevanter Immunglobuline (IgE) zeigt reduzierte Reaktivität der beiden CCD-Allergiker mit Proteinen aus M4M/-RNAi-Linien, die vergleichbar mit GiV77-RNAi-Linien sind. Die colorimetrische Überentwicklung des Nicht-Allergiker (NA)- Blots mit PHA-L- Antiserum (Kaninchen IgG) ergibt ein vergleichbares Muster (Kontrolle). Darunter, zum Vergleich der Proteinmengen, 43 kDa-Region der Ponceau S-gefärbten Blots. Abk.: NA, Nicht- Allergiker; TB-02 und AK-06, CCD- Allergiker. Dies zeigt für die vorliegende Erfindung, dass CCD-Drosselung via M4N//-RNAi für CCD-Allergiker immunologisch relevant ist.
Fig. 8: Nachweisbarkeit des hGC-Signals in Abhängigkeit von der iV-Glykan-Dekoration in Apoplasten-Eluaten aus Blättern von Tabak RNAi-Linien. Zwei Doppelpunkte stehen für stabile Integration der jeweiligen Konstrukte in das Pflanzengenom. X, Nachkommen, die aus Kreuzungen der entsprechenden Linien resultieren. MD und Xan (Xanthi) bezeichnen Tabak-Sorten {Nicotiana tabacum). His-hGC, rekombinante humane Glucocerebrosidase mit N-terminalem His-„tag" ohne iV-Glykane (nach Überexpression in E. coli und anschließender Affinitätsreinigung). Die Pfeile markieren die Position der in Pflanzen produzierten hGC-Glykoproteine auf dem Blot, die nur in der hypoallergenen M4iV7/-RNAi-Linie Nr. 1 deutlich nachweisbar sind. Für die vorliegende Erfindung zeigt die fehlende Bindung von PHA-L- Antiserum, dass hGC in M4M7-RNAi-Linien hypoallergene N-Glykane trägt.
Beispiele
Beispiel 1. Erzeugung von Tomatenfrüchten mit verringerter Aktivität von Golgi α-Mannosidase II (M4Λ7/-RNAi-Linien)
Herstellung von RNAi-Linien: Die M4M/-dsRNAi-Konstrukte wurden auf Grundlage eines Tomaten-EST-Klons (TA33056_4081 aus der Datenbank TIGR) speziell für Tomate konzipiert. Ein ca. 400 bp-Fragment der Golgi α-Mannosidase II wurde mittels RT-PCR aus Blatt-RNA von Lycopersicon esculentum der Sorte Moneymaker „Microtom" gewonnen. Dieses Fragment wurde in den Vektor pUC-RNAi (Chen et al., 2003) zweimal flankierend zum ersten Intron der Kartoffel GA20-Oxidase über Sall/BamHI, bzw. XhoI/BglII via kompatible Überhänge inseriert. So wurden zwei verschiedene M4M/-dsRNAi-Konstrukte hergestellt. Ein „sense"-Intron- „antisense"-Konstrukt mit den Primern:
„Sense" 5'-CACCGTCGACAGTCCAAGCACATCCTAGATA-S' (Sali unterstrichen) (SEQ ID NO:1)
„ Antisense" 5 ' -NNNGGATCC AAATTCTGGTTTAAAGCC A-3 ' (BamHI unterstrichen) (SEQ ID NO:2)
Sowie ein „antisense"-Intron-„sense"-Konstrukt mit den Primern:
„Sense" 5'-CACCGGATCCAAGCACATCCTAGATATGTTG-S' (BamHI unterstrichen) (SEQ ID NO:3)
„Antisense" 5'-NNNGTCGACCAAATTCTGGTTTAAAGCCA-S' (Sali unterstrichen) (SEQ ID NO:4)
Anschließend wurden die dsRNAi-Bereiche mit PstI ausgeschnitten und in eine Expressionskas- sette (zwischen den konstitutiven CaMV 35S-Promotor und das OCS-Polyadenylierungssignal) des mit Sdal geöffneten binären Vektors pBinAR(HygR; Becker, 1990) inseriert.
Mit den binären Plasmid-Konstrukten wurden kompetente GV2260 Agrobakterienzellen (Stamm C58C1 mit Virulenzplasmid pGV2260, Deblaere et al., 1985) direkt transformiert (Höfgen und Willmitzer, 1988) und zur Cokultivierung von Tomaten-Kotyledonen auf einem „feeder layer" aus Tabak BY2-Zellen verwendet, wie bei Ling et al. (1998) beschrieben. Die Regeneration von M4M/-RNAi-Transformanten erfolgte unter Selektionsdruck (10 mg/1 Hygromycin B).
Die erhaltenen Tomatenfrüchte zeigten keinerlei Flecken oder Vitalitätseinbußen und erwiesen sich bei in vitro- Analysen für einige Allergiepatienten (CCD- Allergiker, siehe Fig. 7) als weitgehend hypoallergen. Beispiel 2. Isolation von (Glyko-) Proteinen aus Tomatenfrüchten
Protein-Extraktion: Zunächst wurden die Samen aus frischen Tomatenfrüchten entfernt und die verbleibende Frucht entweder komplett oder in Fruchtfleisch und Schale getrennt in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemörsert und bis zur weiteren Verwendung aliquotiert bei -80°C gelagert. Zur Extraktion wurde das gemörserte Material mit eiskaltem Puffer (entweder 100 mM HEPES pH 7,5 oder 50 mM HEPES pH 7,5 mit 250 mM NaCl) und weiteren Zusätzen (2 mM Na2S2O5 , 1 mM Pefabloc SC, SERVA, Proteinase-Inhibitor-Cocktail, SIGMA, 1 :5000) extrahiert und anschließend 10 min bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden nach Bestim- mung des Proteingehalts (Bradford, 1976) für Immunoblots verwendet.
Beispiel 3: Untersuchung des isolierten Glykoproteins mit verschiedenen Antiseren - Immuno- blot-Analysen
Protein-Extrakte wurden unter reduzierenden Bedingungen in 11-15%igen Polyacrylamid-Gelen mittels SDS-PAGE aufgetrennt (Laemmli, 1970) und auf Nitrozellulosemembranen (0,45 μm PROTRAN, Schleicher&Schüll) in einer Nass-Zelle (Mini-Protean 3-System, Bio-Rad) für 2 Stunden bei 350 mA transferiert. Auf der Membran wurden die Proteine mit Ponceau S (0,3% in 3% TCA, SERVA) gefärbt und fixiert, und nach der Dokumentation (Flachbett-Scanner) mit TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0, 1 % (v/v) Tween 20, pH 7,4) wieder entfärbt. Die Blot- Membranen wurden anschließend mit 2% Milchpulver in TBST entweder über Nacht bei 4°C oder mindestens für 1 Stunde bei RT blockiert.
Für chemilumineszente Entwicklungen wurden die Blots in verdünnten Antiseren (1:5.000 in TBST, 2% Milchpulver) unter Schütteln für 2 Stunden bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte 3maliges Waschen mit TBST und eine weitere Inkubation mit HRP -konjugiertem „goat-anti- rabbit" IgG (Bio-Rad, 1:10.000 in TBST, 2% Milchpulver) für 1 Stunde, und abschließendem 3maligen Waschen. Entwicklung und anschließendes Strippen der Blot-Membranen erfolgte nach Herstellerangaben für das ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare).
Zur Markierung von pflanzlichen Protein-Glykanen (CCD) wurde routinemäßig ein Kaninchen- Antiserum verwendet, das gegen PHA-L hergestellt wurde (Lauriere et al., 1989) und neben „core"-Fucose-Resten überwiegend Xylose-Reste erkennt (1 :10.000 in TBST, 2% Milchpulver für 2 Stunden). Alternativ wurde ein käufliches Kaninchen-Antiserum gegen HRP (Sigma) ver- wendet (1:20.000 in 40 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20, 2% Milchpulver für 2 Stunden), bei dem die „core"-Fucose-Erkennung bedingt durch Besonderheiten des HRP- Glykoproteins (Wuhrer et al., 2004; 2005) in Pflanzenextrakten erhöht ist.
Zur Markierung von vakuolärer Invertase (vINV) und humaner Glucocerebrosidase (hGC) wurden Antiseren verwendet, die nach Immunisierung von Kaninchen mit N-terminal verkürzten Versionen und His-„tag" erhalten wurden (zunächst Klonieren entsprechender cDNA-Fragmente in pETlόb, gefolgt von IPTG-induzierter Überexpression in E. coli BL21 -Zellen (Novagen) und anschließender Affinitätsreinigung an Ni-NTA (Qiagen)). Alle weiteren Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Für colorimetrische Entwicklungen wurden die Antiseren lOfach konzentrierter eingesetzt, mit HRP-konjugiertem „goat-anti-rabbit" IgG (Bio-Rad, 1 :3.000 in TBST, 2% Milchpulver) 1 Stunde bei RT inkubiert und wie bei von Schaewen et al. (1993) beschrieben detektiert.
IgE-Immunoblots: Für den Immunoblot-Nachweis von IgE- Antikörpern aus humanen Seren wurden die blockierten Blot-Membranen mit verdünnten Patienten-Seren (1 : 10 in TBST, 2% Milchpulver) unter Schütteln für 3 Stunden bei RT inkubiert, 3mal mit TBST gewaschen und anschließend mit „affϊnity-purified antibody peroxidase-labeled goat-anti-human" IgE(ε) (Kirke- gaard & Perry Laboratories, MD, US A) (1 :10.000 in TBST) für 1 Stunde inkubiert und wie oben gewaschen. Die anschließende chemilumineszente Entwicklung erfolgte ebenfalls mit dem ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare) nach Herstellerangaben.
Die PNGase F-Behandlung der Tomatenfrucht-Extrakte folgte den Herstellerangaben (Roche). Die ConA-Affinoblot-Entwicklung wurde analog zu Faye & Chrispeels (1985) mit lOfach geringeren Konzentrationen an Concanavalin A (ConA, Sigma) und HRP (Fluka) für die ECL- Entwicklung durchgeführt. Zitierte Literatur
Barton NW, Furbish FS, Murray GJ, Garfield M, Brady RO (1990). Therapeutic response to intravenous infiisions of glucocerebrosidase in a patient with Gaucher disease. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 1913-1916.
Becker D (1990). Binary vectors, which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes. Nucl. Acids Res. 18: 203. Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
Chen S, Hofius D, Sonnewald U, Börnke F (2003). Temporal and spatial control of gene silencing in transgenic plants by inducible expression of double-stranded RNA. Plant J. 36: 731- 740.
Chui D, Oh-Eda M, Liao YF, Panneerselvam K, LaI A, Marek KW, Freeze HH, Moremen KW, Fukuda MN, Marth JD (1997). Alpha-mannosidase-II deficiency results in dyserythro- poiesis and unveils an alternate pathway in Oligosaccharide biosynthesis. Cell 90: 157-167.
Cox KM, Sterling JD, Regan JT, Gasdaska JR, Frantz KK, Peele CG, Black A, Passmore D, Moldovan-Loomis C, Srinivasan M, Cuison S, Cardarelli PM, Dickey LF (2006). Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat. Biotechnol. 24: 1591-1597.
Deblaere R, Bytebier B, De Greve H, Debroeck F, Schell J, van Montagu M, Leemans J (1985). Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors of Agrobacterium-mediated gene transfer to plants. Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788. Decker EL, Reski R (2007). Moss bioreactors producing improved biopharmaceuticals. Curr. Opin. Biotechnol. 18: 393-398. Review.
Faye L, Chrispeels MJ (1985). Characterization of ΛMinked Oligosaccharides by affinobloting with concanavalin A-peroxidase and treatment of the blots with glycosidases. Anal. Biochem. 149: 218-224.
Faye L, Chrispeels MJ (1988). Common antigenic determinants in the glycoproteins of plants, molluscs, and insects. Glycoconj. J. 5: 245-256. Fukuda MN (1990). HEMPAS disease: genetic defect of glycosylation. Glycobiology 1 : 9-15. Review.
Höfgen R, Willmitzer L (1988). Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucl. Acids Res. 16: 9877.
Ioffe E, Stanley P (1994). Mice lacking N-acetylglucosaminyltransferase I activity die at mid- gestation, revealing an essential role for complex or hybrid N-linked carbohydrates. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 : 728-732. Jin C, Altmann F, Strasser R, Mach L, Schahs M, Kunert R, Rademacher T, Glössl J, Steinkellner H (2008). A plant-derived human monoclonal antibody induces an anti- carbohydrate immune response in rabbits. Glycobiology 18: 235-241.
Johnson KD, Chrispeels MJ (1987). Substrate specificities of N-acetylglucosaminyl-, fucosyl-, and xylosyltransferases that modify glycoproteins in the Golgi apparatus of bean cotyledons. Plant Physiol. 84: 1301-1308.
Laemmli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lauriere M, Lauriere C, Chrispeels MJ, Johnson KD, Sturm A (1989). Characterization of a xylose-specific antiserum that reacts with the complex asparagine-linked glycans of extracellular and vacuolar glycoproteins. Plant Physiol. 90: 1182-1188.
Li D, Li Y, Wu X, Li Q, Yu J, Gen J, Zhang XL (2008). Knockdown oϊMgatS inhibits breast Cancer cell growth with activation of CD4+ T cells and macrophages. J. Immunol. 180: 3158- 3165.
Ling H-Q, Kriseleit D, Ganal MW (1998). Effect of ticarcillin/potassium clavulanate on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum MiIL)- Plant Cell Rep. 17: 843-847. Metzler M, Gertz A, Sarkar M, Schachter H, Schrader JW, Marth JD (1994). Complex asparagine-linked Oligosaccharides are required for morphogenic events during post- implantation development. EMBO J. 13: 2056-2065.
Moremen KW (2002). Golgi alpha-mannosidase II deficiency in vertebrate Systems: implications for asparagine-linked Oligosaccharide processing in mammals. Biochim. Biophys. Acta 1573: 225-235.
Reggi S, Marchetti S, Patti T, De Amicis F, Cariati R, Bembi B, Fogher C (2005).
Recombinant human acid beta-glucosidase stored in tobacco seed is stable, active and taken up by human fibroblasts. Plant Mol. Biol. 57: 101-113.
Shaaltiel Y, Bartfeld D, Hashmueli S, Baum G, Brill-Almon E, Galili G, Dym O, Boldin- Adamsky SA, Silman I, Sussman JL, Futerman AH, Aviezer D (2007). Production of gluco- cerebrosidase with terminal mannose glycans for enzyme replacement therapy of Gaucher's disease using a plant cell System. Plant Biotechnol. J. 5: 579-590.
Strasser R, Altmann F, Mach L, Glössl J, Steinkellner H (2004). Generation of Arabidopsis thaliana plants with complex N-glycans lacking betal,2-linked xylose and core alphal,3-linked fucose. FEBS Lett. 561 : 132-136.
Strasser R, Schoberer J, Jin C, Glössl J, Mach L, Steinkellner H (2006). Molecular cloning and characterization of Arabidopsis thaliana Golgi alpha-mannosidase II, a key enzyme in the formation of complex JV-glycans in plants. Plant J. 45: 789-803. Strasser R, Stadimann J, Schahs M, Stiegler G, Quendler H, Mach L, GIössl J, Weterings K, Pabst M, Steinkellner H (2008). Generation of glyco-engineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies with a homogeneous human-like N-glycan structure. Plant Biotechnol. J. 6: 392-402.
Sturm A, Johnson KD, Szumilo T, Elbein AD, Chrispeels MJ (1987). Subcellular localization of glycosidases and glycosyltransferases involved in the processing of N-linked Oligosaccharides. Plant Physiol. 85: 741-745. Tan J, Dünn J, Jaeken J, Schachter H (1996). Mutations in the MGAT2 gene Controlling complex N-glycan synthesis cause carbohydrate-deficient glycoprotein Syndrome type II, an autosomal recessive disease with defective brain development. Am. J. Hum. Genet. 59: 810-807. von Schaewen A, Stitt M, Schmidt R, Sonnewald U, Willmitzer L (1990). Expression of a yeast-derived invertase in the cell wall of tobacco and Arabidopsis plants leads to accumulation of carbohydrate and inhibition of photosynthesis and strongly influences growth and phenotype of transgenic tobacco plants. EMBO J. 9: 3033-3044. von Schaewen A, Sturm A, O'Neill J, Chrispeels MJ (1993). Isolation of a mutant Arabidopsis plant that lacks N-acetyl glucosaminyl transferase I and is unable to synthesize Golgi-modified complex N-linked glycans. Plant Physiol. 102: 1109-1118.
Waterhouse PM, Smith NA, Wang MB (1999). Virus resistance and gene silencing: killing the messenger. Trends Plant Sei. 4: 452-457.
Wenderoth I, von Schaewen A (2000). Isolation and characterization of plant N-acetyl glucosaminyltransferase I (Gntϊ) cDNA sequences. Functional analyses in the Arabidopsis cgi mutant and in antisense plants. Plant Physiol. 123: 1097-1108. Wuhrer M, Hokke CH, Deelder AM (2004). Glycopeptide analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry reveals novel features of horseradish peroxidase glycosylation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18: 1741-1748.
Wuhrer M, Balog CI, Koeleman CA, Deelder AM, Hokke CH (2005). New features of site- speeifie horseradish peroxidase (HRP) glycosylation uncovered by nano-LC-MS with repeated ion-isolation/fragmentation cycles. Biochim. Biophys. Acta 1723: 229-239.

Claims

-19-Ansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung von hypoallergenen Glykoproteinen, umfassend das Züchten einer mutierten oder transgenen Pflanze, von Teilen dieser Pflanzen oder daraus herge- stellter Pflanzenzellen und das Isolieren eines gewünschten hypoallergenen Glykopro- teins aus dem gezüchteten Material, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Enzyms Golgi α-Mannosidase II in der mutierten oder transgenen Pflanze, den Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen beseitigt oder verringert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Enzyms
Golgi α-Mannosidase II durch Mutation oder „gene silencing", wie z.B. Cosuppression, Antisense- oder RNAi-Drosselung, beseitigt oder verringert wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mutierte oder transgene Pflanze, Teile dieser Pflanzen oder daraus hergestellte Pflanzenzellen zusätzlich mit einem Gen, welches das gewünschte hypoallergene Glykoprotein codiert, transformiert wurde/wurden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das hypo- allergene Glykoprotein Glucocerebrosidase oder ein anderes sekretiertes Glykoprotein-
Therapeutikum ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das hypoallergene Glykoprotein im pflanzlichen Apoplasten/der Zellwand oder in Vakuolen akkumuliert und daraus isoliert werden kann.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mutierte oder transgene Pflanze, Teile dieser Pflanzen oder daraus hergestellte Pflanzenzellen abgeleitet sind von Solanaceen wie z.B. Tomatenpflanzen, Kartoffelpflanzen oder Tabakpflanzen oder weiteren agronomisch wichtigen Pflanzen wie z.B. Reis oder Mais, oder auch Arabidopsis.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Aktivität des Enzyms „core"-Fucosyltransferase in der mutierten oder transgenen -20-
Pflanze, den Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen beseitigt oder verringert ist.
8. Mutierte oder transgene Pflanze, Teile dieser Pflanzen oder daraus hergestellte Pflanzen- zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität des Enzyms Golgi α-Mannosidase II in der mutierten oder transgenen Pflanze, den Teilen dieser Pflanzen oder den daraus hergestellten Pflanzenzellen beseitigt oder verringert ist und diese ein hypoallergenes heterolo- ges Glykoprotein produzieren.
9. Mutierte oder transgene Pflanze, Teile dieser Pflanzen oder daraus hergestellte Pflanzenzellen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Aktivität des Enzyms „core"-Fucosyltransferase in der mutierten oder transgenen Pflanze, den Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen beseitigt oder verringert ist.
10. Mutierte oder transgene Pflanze, Teile dieser Pflanzen oder daraus hergestellte Pflanzenzellen nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass diese hypoaller- gen ist/sind.
11. Verwendung einer mutierten oder transgenen Pflanze, von Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Erzeugung hypoallergener Glykoproteine und/oder hypoallergener Pflanzen.
12. Hypoallergene Glykoproteine, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, erhältlich aus einer mutierten oder transgenen Pflanze, Teilen dieser Pflanzen oder daraus hergestellten Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder erhältlich durch eine Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mannose-terminierten Glykane auf dem α 1,6- Arm nicht abgespalten sind.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1104479B1 (de) 1998-08-11 2006-10-18 Biosource Technologies, Inc. Verfahren zur gewinnung von proteinen aus der interstitiellen flüssigkeit von pflanzen
CN101365783B (zh) * 2005-11-15 2013-07-17 格利科菲公司 具有降低的o-糖基化的糖蛋白的产生

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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