AMINOACYL-PRODRUGS ALS ARZNEIMITTELWIRKSTOFF FÜR
THROMBOEMBOLISCHE
ERKRANKUNGEN
Die vorliegende Anmeldung betrifft Prodrug-Derivate von 5-Chlor-N-({(5<S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3- oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l ,3-oxazolidin-5-yl}methyl)thiophen-2-carboxamid, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von thromboembolischen Erkrankungen.
Prodrugs sind Derivate eines Wirkstoffs, die in vivo eine ein- oder mehrstufige Biotransformation enzymatischer und/oder chemischer Art durchlaufen, bevor der eigentliche Wirkstoff freigesetzt wird. Ein Prodrug-Rest wird in der Regel genutzt, um das Eigenschaftsprofil des zu Grunde liegen- den Wirkstoffs zu verbessern [P. Ettmayer et al., J. Med. Chem. 47, 2393 (2004)]. Um ein optimales Wirkprofil zu erreichen, muss dabei das Design des Prodrug-Restes ebenso wie der angestrebte Freisetzungsmechanismus sehr genau auf den individuellen Wirkstoff, die Indikation, den Wirkort und die Applikationsroute abgestimmt werden. Eine große Zahl von Arzneimitteln wird als Prodrugs verabreicht, die gegenüber dem zu Grunde liegenden Wirkstoff eine verbesserte Bioverfügbarkeit aufweisen, beispielsweise erzielt durch eine Verbesserung des physikochemischen Profils, speziell der Löslichkeit, der aktiven oder passiven Absorptionseigenschaften oder der gewebsspezifischen Verteilung. Aus der umfangreichen Literatur über Prodrugs sei beispielhaft genannt: H. Bundgaard (Ed.), Design of Prodrugs: Bioreversible derivatives for various functional groups and chemical entities, Elsevier Science Publishers B.V., 1985.
5-Chlor-N-({(5S)-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-2-oxo-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)- thiophen-2-carbonsäureamid [Verbindung (A)] ist ein oral wirksamer, direkter Inhibitor der Serin- Protease Faktor Xa, welche eine essentielle Funktion bei der Regulation der Blutgerinnung ausübt. Ein Oxazolidinon befinde! sich gegenwärtig in vertiefter klinischer Prüfung als möglicher neuer Arzneimittelwirkstoff für die Prävention und Therapie thromboembolischer Erkrankungen [S. Roehrig et al., J. Med. Chem. 48, 5900 (2005)].
(A)
Verbindung (A) weist jedoch nur eine begrenzte Löslichkeit in Wasser und physiologischen Medien auf, was beispielsweise eine intravenöse Applikation des Wirkstoffs erschwert. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Identifizierung von Derivaten oder Prodrugs von Verbindung (A), die eine verbesserte Löslichkeit in den genannten Medien besitzen und gleichzeitig nach Applikation eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs (A) im Körper des Patienten erlauben.
In WO 2005/028473 werden Acyloxymethylcarbamat-Prodrugs von Oxazolidinonen beschrieben, die einer Erhöhung der oralen Bioverfügbarkeit dienen. In WO 01/00622 werden Acyl-Prodrugs von Carbamat-Inhibitoren der Inosin-5'-monophosphat-Dehydrogenase offenbart. Eine weitere Art von Amid-Prodrugs für Oxazolidinone, die über einen mehrstufigen Aktivierungsmechanismus den zu Grunde liegenden Wirkstoff freisetzen, ist in WO 03/006440 beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
in welcher
n für die Zahl 1 oder 2 steht,
X für ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder NH steht,
R1 für die Seitengruppe einer natürlichen α-Aminosäure oder ihrer Homologe oder Isomere steht,
R für Wasserstoff oder Methyl steht,
R für Wasserstoff steht,
oder
R1 und R3 sind über eine (CH2)3- oder (CH2)4-Gruppe verknüpft und bilden zusammen mit dem Stickstoff- bzw. Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen 5- bzw. 6-Ring,
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan- sulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluor- essigsaure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Die Seitengruppe einer α-Aminosäure in der Bedeutung von R1 umfasst sowohl die Seitengruppen der natürlich vorkommenden α-Aminosäuren als auch die Seitengruppen von Homologen und Iso- meren dieser α-Aminosäuren. Die α-Aminosäure kann hierbei sowohl in der L- als auch in der D- Konfiguration oder auch als Gemisch der L- und D-Form vorliegen. Als Seitengruppen seien beispielhaft genannt: Wasserstoff (Glycin), Methyl (Alanin), Propan-2-yl (Valin), Propan-1-yl (Nor- valin), 2-Methylpropan-l-yl (Leucin), 1-Methylpropan-l-yl (Isoleucin), Butan-1-yl (Norleucin), Phenyl (2-Phenylglycin), Benzyl (Phenylalanin), p-Hydroxybenzyl (Tyrosin), Indol-3-ylmethyl (Tryptophan), Imidazol-4-ylmethyl (Histidin), Hydroxymethyl (Serin), 2-Hydroxyethyl (Homo- serin), 1 -Hydroxyethyl (Threonin), Mercaptomethyl (Cystein), Methylthiomethyl (S-Methyl- cystein), 2-Mercaptoethyl (Homocystein), 2-Methylthioethyl (Methionin), Carbamoylmethyl (Asparagin), 2-Carbamoylethyl (Glutamin), Carboxymethyl (Asparaginsäure), 2-Carboxyethyl (Glutaminsäure), 4-Aminobutan-l-yl (Lysin), 4-Amino-3-hydroxybutan-l-yl (Hydroxylysin), 3- Aminopropan-1-yl (Ornithin), 3-Guanidinopropan-l-yl (Arginin), 3-Ureidopropan-l-yl (Citrullin). Bevorzugte α-Aminosäure-Seitengruppen in der Bedeutung von R2 sind Wasserstoff (Glycin), Methyl (Alanin), Propan-2-yl (Valin), Propan-1-yl (Norvalin), Imidazol-4-ylmethyl (Histidin), Hydroxymethyl (Serin), 1 -Hydroxyethyl (Threonin), Carbamoylmethyl (Asparagin), 2-Carbamoyl- ethyl (Glutamin), 4-Aminobutan-l-yl (Lysin), 3-Aminopropan-l-yl (Ornithin), 3-Guanidino- propan-1-yl (Arginin). Bevorzugt ist die L-Konfiguration.
Wenn Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert sind, können die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach substituiert sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt, dass für alle Reste, die mehrfach auftreten, deren Bedeutung unabhängig voneinander ist. Eine Substitution mit einem oder zwei gleichen oder verschiedenen Substituenten ist bevor- zugt. Ganz besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem Substituenten.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
n für die Zahl 1 oder 2 steht,
X für ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder NH steht,
R1 für Wasserstoff, Methyl, Propan-2-yl, Propan-1-yl, 2-Methylpropan-l-yl, Imidazol-4-yl- methyl, Hydroxymethyl, 1 -Hydroxyethyl, Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, Carbamoylmethyl, 2-Carbamoylethyl, 4-Aminobutan-l-yl, 3-Aminopropan-l-yl, 3-Guanidinopropan- 1 -yl, Benzyl oder 4-Hydroxybenzyl steht,
R2 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R3 für Wasserstoff steht,
oder
R1 und R3 sind über eine (CH2)3- oder (CH2)4-Gruppe verknüpft und bilden zusammen mit dem Stickstoff- bzw. Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind einen 5- bzw. 6-Ring,
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
n für die Zahl 1 oder 2 steht,
X für NH steht,
R1 für Wasserstoff, Methyl, Propan-2-yl, 2-Methylpropan-l-yl, Imidazol-4-ylmethyl, Hydroxymethyl, 1 -Hydroxyethyl, Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, Carbamoylmethyl, 2- Carbamoylethyl, 4-Aminobutan-l-yl, Benzyl oder 4-Hydroxybenzyl steht,
R2 für Wasserstoff steht,
R3 für Wasserstoff steht,
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher n für die Zahl 2 steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher X für NH steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Wasserstoff, Methyl, Propan- 2-yl, 2-Methylpropan-l-yl, Imidazol-4-ylmethyl, Hydroxymethyl, 1 -Hydroxyethyl, Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, Carbamoylmethyl, 2-Carbamoylethyl, 4-Aminobutan-l-yl, 3-Guanidinopropan-l- yl, Benzyl oder 4-Hydroxybenzyl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Wasserstoff, Methyl, Propan- 2-yl, 2-Methylpropan-l-yl, Imidazol-4-ylmethyl, Hydroxymethyl, 1 -Hydroxyethyl, Carboxymethyl, 2-Carboxyethyl, Carbamoylmethyl, 2-Carbamoylethyl, 4-Aminobutan-l-yl, Benzyl oder 4- Hydroxybenzyl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für Wasserstoff steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R für Wasserstoff steht.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass man entweder
[A] die Verbindung der Formel
zunächst in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer Base mit einer Verbindung der Formel
in welcher n die oben angegebene Bedeutung hat,
und
für eine Abgangsgruppe wie beispielsweise Chlor, Brom oder Iod steht,
in eine Verbindung der Formel
in welcher n und Q die oben angegebene Bedeutung haben,
überführt, diese dann nach Verfahren
[Al] in einem inerten Lösungsmittel mit dem Caesiumsalz einer α-Aminocarbonsäure oder einer α-Aminothiocarbonsäure der Formel
in welcher R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben,
PG für eine Amino-Schutzgruppe wie beispielsweise terΛ-Butoxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) steht
und
für O oder S steht,
zu einer Verbindung der Formel
in welcher n, R1, R2, R3 und PG die oben angegebene Bedeutung haben, und
X für O oder S steht,
umsetzt und nachfolgend die Schutzgruppe PG nach üblichen Methoden unter Erhalt einer Verbindung der Formel
in welcher n, R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben, und
X für O oder S steht,
entfernt
oder
[A2] in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer Base mit einer α- Aminothiocarbonsäure der Formel
in welcher R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben,
PG für eine Amino-Schutzgruppe wie beispielsweise tert.-Butoxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) steht,
zu einer Verbindung der Formel
in welcher n, R1, R2, R3 und PG die oben angegebene Bedeutung haben, umsetzt und nachfolgend die Schutzgruppe PG nach üblichen Methoden unter Erhalt einer Verbindung der Formel
in welcher n, R | 1 , D R2 . u.∞ndΛ T Rj 3 die oben angegebene Bedeutung haben, entfernt
oder
[B] Verbindung (A) in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart einer Base mit einer Verbindung der Formel
in welcher n die oben angegebene Bedeutung hat,
zu einer Verbindung der Formel
in welcher n die oben angegebene Bedeutung hat,
umsetzt, anschließend die Schutzgruppen nach üblichen Methoden unter Erhalt einer Verbindung der Formel
(IX),
in welcher n die oben angegebene Bedeutung hat, entfernt und dann in Gegenwart einer Base mit einer Verbindung der Formel
in welcher R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben,
AG für Hydroxy oder Halogen, bevorzugt Chlor oder Brom, steht oder zusammen mit der Carbonylgruppe einen Aktivester, bevorzugt einen N-Hydoxysuccinimidester, oder ein gemischtes Anhydrid, bevorzugt einen Kohlensäurealkylester, besonders bevorzugt einen Kohlensäureethylester, bildet, und
PG für eine Amino-Schutzgruppe wie beispielsweise ter/.-Butoxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) steht,
unter Erhalt einer Verbindung der Formel
in welcher n, R , R , R und PG die oben angegebene Bedeutung haben, umsetzt,
und anschließend die Schutzgruppe PG nach üblichen Methoden unter Erhalt einer Verbindung der Formel
in welcher n, R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben, entfernt
und die jeweils resultierenden Verbindungen der Formel (I-A) bzw. (I-B) gegebenenfalls mit den entsprechenden (i) Lösungsmitteln und/oder (ii) Säuren in ihre Solvate, Salze und/oder Solvate der Salze überführt.
Die Verbindungen der Formel (I-A), (I-B) und (DC) können auch in Form ihrer Salze vorliegen. Diese Salze können gegebenenfalls mit den entsprechenden (i) Lösungsmitteln und/oder (ii) Basen in die freie Base überführt werden.
In dem Rest R1 gegebenenfalls vorhandene funktionelle Gruppen können bei den zuvor beschriebenen Reaktionssequenzen, falls zweckmäßig oder erforderlich, auch in temporär geschützter Form vorliegen. Die Einführung und Entfernung solcher Schutzgruppen wie auch der
Schutzgruppe PG erfolgt hierbei nach üblichen, aus der Peptidchemie bekannten Methoden [siehe z.B. T.W. Greene und P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York,
1999; M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984].
Solche in R1 gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen können hierbei gleichzeitig mit der Abspaltung von PG oder in einem separaten Reaktionsschritt vor oder nach der Abspaltung von PG entfernt werden.
Als Amino-Schutzgruppe PG wird bei den obigen Verfahren bevorzugt tert.-Butoxycarbonyl (Boc) oder Benzyloxycarbonyl (Z) verwendet. Die Abspaltung dieser Schutzgruppen sowie die
Abspaltung der Schutzgruppen in dem Verfahrensschritt (VIII) — > (X) wird nach üblichen
Methoden, vorzugsweise durch Reaktion mit einer starken Säure wie Chlorwasserstoff, Brom-
wasserstoff oder Trifluoressigsäure in einem inerten Lösungsmittel wie Dioxan, Dichlormethan oder Essigsäure durchgeführt.
Als inerte Lösungsmittel werden in den Verfahrensschritten (A) + (H) -» (HI) und (A) + (VII) → (VTU) vorzugsweise Tetrahydrofuran, NN-Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid verwendet; besonders bevorzugt ist NN-Dimethylformamid. Als Base ist bei diesen Reaktionen insbesondere Νatriumhydrid geeignet. Die genannten Umsetzungen werden im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 00C bis +400C bei Normaldruck durchgeführt.
Als inerte Lösungsmittel werden in den Verfahrensschritten (HI) + (VI) -> (V-A) und (DC) + (X) — > (XI) vorzugsweise Tetrahydrofuran, NN-Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid verwendet; besonders bevorzugt ist NN-Dimethylformamid. Als Base ist bei diesen Reaktionen insbesondere Ethyldiisopropylamin geeignet. Die genannten Umsetzungen werden im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 00C bis +400C bei Normaldruck durchgeführt.
Der Verfahrensschritt (HI) + (IV) — > (V) erfolgt bevorzugt in NN-Dimethylformamid als Lösungsmittel. Im Allgemeinen wird die Reaktion in einem Temperaturbereich von 00C bis +500C, bevor- zugt bei +200C bis +500C, bei Normaldruck durchgeführt. Die Umsetzung kann auch vorteilhaft unter Ultraschall-Behandlung ausgeführt werden.
Die Verbindungen der Formeln (II), (IV), (VI), (VII) und (X) sind kommerziell erhältlich, literaturbekannt oder können nach literaturüblichen Verfahren hergestellt werden. Die Herstellung der Verbindung (A) ist in den Beispielen beschrieben.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht werden:
Schema
2 Tπfluoressigsaure
Die erfindungsgemaßen Verbindungen und ihre Salze stellen nützliche Prodrugs der Wirkstoff- Verbindung (A) dar Sie weisen einerseits eine gute Stabilität zum Beispiel bei pH 4 auf und zeigen andererseits eine effiziente Konversion zur Wirkstoff-Verbindung (A) in vivo Darüber hinaus besitzen die erfindungsgemaßen Verbindungen eine gute Loshchkeit in Wasser und anderen physiologisch vertraglichen Medien, was sie für die therapeutische Anwendung insbesondere bei intravenöser Applikation geeignet macht
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemaßen Verbin- düngen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von thromboembo- hschen Erkrankungen und/oder thromboembohschen Komplikationen
Zu den „thromboembohschen Erkrankungen" im Sinne der vorliegenden Erfindung zahlen insbesondere Erkrankungen wie Herzinfarkt mit ST-Segment-Erhohung (STEMI) und ohne ST- Segment-Erhohung (non-STEMI), stabile Angina Pectoris, instabile Angina Pectoπs, Reokklusio- nen und Restenosen nach Koronaπnterventionen wie Angioplastie oder aortokoronarem Bypass, peπphere arterielle Verschlusskrankheiten, Lungenembolien, tiefe venöse Thrombosen und Nierenvenenthrombosen, transitoπsche ischämische Attacken sowie thrombotischer und thrombo- embohscher Hirnschlag
Die Substanzen eignen sich daher auch zur Prävention und Behandlung von kardiogenen Thrombo- embohen, wie beispielsweise Hirn-Ischamien, Schlaganfall und systemischen Thromboembohen und Ischämien, bei Patienten mit akuten, intermittierenden oder persistierenden Herzarrhythmien,
wie beispielsweise Vorhofflimmern, und solchen, die sich einer Kardioversion unterziehen, ferner bei Patienten mit Herzklappen-Erkrankungen oder mit künstlichen Herzklappen. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der disseminierten intravasalen Gerinnung (DIC) geeignet.
Thromboembolische Komplikationen treten ferner auf bei mikroangiopathischen hämolytischen Anämien, extrakorporalen Blutkreisläufen, wie Hämodialyse, sowie Herzklappenprothesen.
Außerdem kommen die erfindungsgemäßen Verbindungen auch für die Prophylaxe und/oder Behandlung von atherosklerotischen Gefäßerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen wie rheumatische Erkrankungen des Bewegungsapparats in Betracht, darüber hinaus ebenso für die Prophylaxe und/oder Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung. Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Inhibition des Tumorwachstums und der Metastasenbildung, bei Mikroangiopathien, altersbedingter Makula-Degeneration, diabetischer Retinopathie, diabetischer Nephropathie und anderen mikrovaskulären Erkrankungen sowie zur Prävention und Behandlung thromboembolischer Komplikationen, wie beispielsweise venöser Thromboembolien, bei Tumorpatienten, insbesondere solchen, die sich größeren chirurgischen Eingriffen oder einer Chemo- oder Radiotherapie unterziehen, eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfmdungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwen- düng der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:
• Lipidsenker, insbesondere HMG-CoA-(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A)-Reduktase- Inhibitoren;
• Koronartherapeutika/Vasodilatatoren, insbesondere ACE-(Angiotensin-Converting-Enzyme)- Inhibitoren; AII-(Angiotensin II)-Rezeptor-Antagonisten; ß-Adrenozeptor-Antagonisten; alpha- 1 -Adrenozeptor- Antagonisten; Diuretika; Calciumkanal-Blocker; Substanzen, die eine Erhöhung von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP) bewirken, wie beispielsweise Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase;
• Plasminogen-Aktivatoren (Thrombolytika/Fibrinolytika) und die Thrombolyse/Fibrinolyse steigernde Verbindungen wie Inhibitoren des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors (P AI-Inhibitoren) oder Inhibitoren des Thrombin-aktivierten Fibrinolyse-Inhibitors (TAFI-Inhibitoren);
• antikoagulatorisch wirksame Substanzen (Antikoagulantien);
• plättchenaggregationshemmende Substanzen (Plättchenaggregationshemmer, Thrombozytenaggregationshemmer);
• Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten (Glycoprotein-IIb/IIIa-Antagonisten);
• sowie Antiarrhythmika.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfln- dungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal oder nasal. Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende, die erfindungsgemäßen Verbindungen schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht-überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. inhalative Arzneiformen wie Pulverinhalatoren oder Nebulizer, oder nasal applizierbare Arzneiformen wie Tropfen, Lösungen oder Sprays.
Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige PoIy- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecyl- sulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 20 mg/kg und ganz besonders bevorzugt 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
abs. absolut
Boc rer/.-Butoxycarbonyl
DMF NN-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute) h Stunde(n)
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie min Minute(n)
MS Massenspektrometrie
NMR Kernresonanzspektrometrie
PaVC Palladium auf Aktivkohle quant. quantitativ (bei Ausbeute)
RT Raumtemperatur
R, Retentionszeit (bei HPLC)
UV Ultraviolett-Spektrometrie v/v Volumen-zu- Volumen-Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
LC-MS- und HPLC-Methoden:
Methode 1 : Instrument: HP 1 100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil 100 RP-18, 60 mm x 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure (70%-ig) / 1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B → 0.5 min 2% B → 4.5 min 90% B → 6.5 min 90% B → 6.7 min 2% B → 7.5 min 2% B; Fluss: 0.75 ml/min; Säulentemperatur: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 2: Instrument: HP 1 100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil 100 RP-18, 60 mm x 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure (70%-ig) / 1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B → 0.5 min 2% B → 4.5 min 90% B → 9 min 0% B → 9.2 min 2% B → 10 min 2% B; Fluss: 0.75 ml/min; Säulentemperarur: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Gemini 3μ 30 mm x 3.00 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A — » 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 4: Instrument: Micromass GCT, GC6890; Säule: Restek RTX-35MS, 30 m x 250 μm x 0.25 μm; konstanter Fluss mit Helium: 0.88 ml/min; Ofen: 600C; Inlet: 2500C; Gradient: 600C (0.30 min halten), 50°C/min → 1200C, 16°C/min → 2500C, 30°C/min → 3000C (1.7 min halten).
Methode 5: Säule: GROM-SIL 120 ODS-4 HE, 10 μM, 250 mm x 30 mm; Fluss: 50 ml/min; Laufmittel und Gradientenprogramm: Acetonitril/0.1% wässrige Ameisensäure 10:90 (0-3 min), Acetonitril/0.1% wässrige Ameisensäure 10:90 -» 95:5 (3-27 min), Acetonitril/0.1% wässrige Ameisensäure 95:5 (27-34 min), Acetonitril/0.1% wässrige Ameisensäure 10:90 (34-38 min); Temperatur: 22°C; UV-Detektion: 254 nm.
Methode 6: Instrument: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1 100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Gemini 3μ 30 mm x 3.00 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A — > 2.5 min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Temperatur: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 7 (LC-MS): Gerätetyp MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Gerätetyp HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3μ 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A → 3.0 min 10% A → 4.0 min 10%A → 4.01 min 100%A (Fluss: 2.5 ml) → 5.00 min 100%A; Ofen: 500C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 8 ("LC-MSV Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2.5 μ MAX-RP 100A Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 0.1 min 90%A → 3.0 min 5%A → 4.0 min 5%A → 4.01 min 90%A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 9 (analytische HPLC): Gerät: HP1090 Serie II; Säule: Waters XTerra C18-5, 3.9 mm x 150 mm WAT 186000478; Eluent A: 10 ml 70%-ige Perchlorsäure in 2.5 Liter Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0.0 min 20% B → 1 min 20% B → 4 min 90% B → 6 min 90% B → 8 min 20% B. Temperatur: 400C; Fluss: 1 ml/min.
Methode 10: (analytische HPLC): Instrument: HP 1090 Serie ü; Säule: Merck Chromolith Speed ROD RP-18e, 50 mm x 4.6 mm; Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4.6mm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure (70%-ig) / 1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 20% B → 0.5 min 20% B → 3 min 90% B → 3.5 min 90% B → 3.51 min 20% B → 4 min 20% B; Fluss: 5 ml/min; Säulentemperatur: 400C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 1 1 (präparative HPLC): Gerät: Gilson mit UV-Detektor, Säule: Kromasil Cl 8, 5 μm/ 250 mm x 20 mm (Fluss: 25 ml/min); Eluent A: Wasser (0.01% Trifluoressigsäure); Eluent B: Acetonitril (0.01% Trifluoressigsäure); Gradient: 0 min 5-20% B, 10 min-15 min 5-20% B, 45 min 90% B, 50 min 90% B; UV-Detektion: 210 nm; Fluss: 25 ml/min.
Methode 12 (präparative HPLC): Gerät: Gilson mit UV-Detektor, Säule: YMC ODS AQ Cl 8, 10 μm/ 250 mm x 30 mm (Fluss: 50 ml/min); Eluent A: Wasser (0.01% Trifluoressigsäure), Eluent B: Acetonitril (0.01 % Trifluoressigsäure); Gradient: 0 min 5-20% B, 10 min-15 min 5-20% B, 45 min 90% B, 50 min 90% B; UV-Detektion: 210 nm; Fluss: 50 ml/min.
Methode 13 (LC-MS): Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9μ, 50 mm x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 0.1 min 90%A → 1.5 min 10%A → 2.2 min 10%A; Ofen: 500C; Fluss: 0.33 ml/min; UV- Detektion: 210 nm.
NMR-Spektrometrie:
NMR-Messungen wurden bei einer Protonenfrequenz von 400.13 MHz oder 500.13 MHz durchgeführt. Die Proben wurden üblicherweise in DMSO-dö gelöst; Temperatur: 302 K.
Ausgangsverbindungen :
Als Ausgangsmaterial wurde 5-Chlor-N-({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]- l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)thiophen-2-carboxamid [Verbindung (A)] verwendet.
Beispiel IA
5-Chlorthiophen-2-carbonsäurechlorid
Eine Suspension von 51.2 g (0.315 mmol) 5-Chlorthiophen-2 -carbonsäure in 307 ml Dichlormethan wurde mit 137 ml (1.57 mol) Oxalsäuredichlorid versetzt. Nach Zugabe von 2 Tropfen DMF wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden das Lösemittel und überschüßiges Oxalylchlorid am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde im Vakuum destilliert. Das Produkt siedete bei 74-78°C und einem Druck von 4-5 mbar. Es wurden 50.5 g (87% d. Th.) eines Öls erhalten, das beim Lagern im Kühlschrank fest wurde.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ/ppm): 7.79 (d, IH), 7.03 (d, IH).
QCIMS (Methode 4): Rt = 5.18 min.
MS (EI+, m/z): 180/182/184 (2 35C1/37C1) M+.
Beispiel 2A
5-Chlorthiophen-2-carbonsäure-((S)-2,3-dihydroxy-propyl)-amid
(entnommen aus: CR. Thomas, Bayer HealthCare AG, DE-I 03001 U-Al (2004).)
461 g (4.35 mol) Natriumhydrogencarbonat und 350 g (3.85 mol) (2S)-3-Amino-propan-l ,2-diol- Hydrochlorid wurden bei 13-15°C in 2.1 1 Wasser vorgelegt und mit 950 ml 2- Methyltetrahydrofuran versetzt. Zu dieser Mischung wurden unter Kühlung bei 15-18°C 535 g (2.95 mol) S-Chlorthiophen^-carbonylchlorid (Verbindung aus Beispiel IA) in 180 ml Toluol über einen Zeitraum von zwei Stunden zugetropft. Zur Aufarbeitung wurden die Phasen getrennt und die organische Phase wurde in mehreren Schritten mit insgesamt 1.5 1 Toluol versetzt. Das ausgefallene Produkt wurde abgesaugt, mit Essigsäureethylester gewaschen und getrocknet. Man erhielt 593.8 g (92% d. Th.) Produkt.
Beispiel 3A
5-Chlorthiophen-2-carbonsäure-((S)-3-brom-2-hydroxy-propyl)-amid
(entnommen aus: CR. Thomas, Bayer HealthCare AG, DE-10300111-Al (2004).)
Zu einer Suspension von 100 g (0.423 mol) der Verbindung aus Beispiel 2A in 250 ml Eisessig wurden bei 21-26°C über einen Zeitraum von 30 Minuten 301.7 ml einer 33%igen Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure zugegeben. Anschließend wurden 40 ml Essigsäureanhydrid zugegeben und der Reaktionsansatz wurde drei Stunden bei 60-650C gerührt. Bei 20-250C wurden dann über einen Zeitraum von 30 Minuten 960 ml Methanol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 Stunden unter Rückfluss und dann über Nacht bei 20-250C gerührt. Zur Aufarbeitung wurden die Lösungsmittel im Vakuum bei ca. 95 mbar abdestilliert. Die zurückbleibende Suspension wurde mit 50 ml n-Butanol und 350 ml Wasser versetzt. Das ausgefallene Produkt wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 89.8 g (71 % d. Th.) Produkt.
Beispiel 4A
5-Chlor-N-[(2S)-oxiran-2-ylmethyl]thiophen-2-carbonsäureamid
Eine Lösung von 50 g (0.167 mol) der Verbindung aus Beispiel 3 A in 500 ml wasserfreiem THF wurde mit 155 g (1.12 mol) gepulvertem Kaliumcarbonat versetzt und bei Raumtemperatur 3 Tage gerührt. Anschließend wurden die anorganischen Salze über eine Schicht von Kieselgur abgesaugt, zweimal mit je 100 ml THF gewaschen und das Filtrat am Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur eingeengt. Es wurden 36 g (81% d. Th.) Produkt erhalten.
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6, δ/ppm): 8.81 (t, IH), 7.68 (d, IH), 7.19 (d, IH), 3.55-3.48 (m, IH), 3.29-3.22 (m, IH), 3.10-3.06 (m, IH), 2.75-2.72 (m, IH), 2.57-2.54 (m, IH).
HPLC (Methode 1): R, = 3.52 min.
MS (DCI, NH3, m/z): (35C1/37C1) 218/220 (M+H)+, 235/237 (M+NIL,)+.
Beispiel 5A
N,N-Dibenzyl-2-fluor-4-jodanilin
24.37 g (0.103 mol) 2-Fluor-4-jodanilin, 31.8 ml (0.267 mol) Benzylbromid, 23.98 g (0.226 mol) Νatriumcarbonat und 1.9 g (5.14 mmol) Tetra-n-butylarnrnoniumjodid wurden in einem Gemisch aus 100 ml Wasser und 200 ml Dichlormethan sechs Tage zum Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Phasen voneinander getrennt Die organische Phase wurde mit
Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der erhaltene Rückstand wurde mittels Saugfϊltration über Kieselgel mit Cyclohexan als Laufmittel gereinigt. Es wurden 35 g (82% d. Th.) der Titel Verbindung erhalten.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): 7.48 (IH, dd), 7.32-7.21 (m, 1 IH), 6.69 (dd, IH), 4.33 (s, 4H).
HPLC (Methode 1): R, = 5.87 min.
MS (DCI, NH3, m/z): 418 (M+H)+.
Beispiel 6A
4-[4-(Dibenzylamino)-3-fluoφhenyl]moφholin-3-on
1.5 g (3.59 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A wurden in 20 ml wasserfreiem Dioxan gelöst und nacheinander mit 0.45 g (4.49 mmol) Morpholinon, 137 mg (0.719 mmol) Kupfer(I)-jodid, 1.53 g (7.19 mmol) Kaliumphosphat und 153 μl (1.44 mmol) N,N'-Dimethylethylendiamin versetzt. Die Rückflussapparatur wurde durch wiederholtes Anlegen eines leichten Vakuums und Begasen mit Argon inertisiert. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Nach dieser Zeit ließ man auf Raumtemperatur abkühlen. Es wurde mit Wasser versetzt und mit Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wurde nacheinander mit Wasser und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Es wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, anschließend filtriert und das Filtrat im Vakuum vom Lösemittel befreit. Der Rückstand wurde mittels Saugfiltration über Kieselgel mit Cyclohexan/Ethylacetat 1 : 1 als Laufmittel gereinigt. Es wurden 1.38 g (98% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ/ppm): 7.32-7.28 (m, 9H), 7.26-7.20 (m, 2H), 7.00-6.92 (m, 2H), 4.33 (s, 4H), 4.15 (s, 2H), 3.91 (dd, 2H), 3.55 (dd, 2H).
HPLC (Methode 1): R, = 4.78 min.
MS (DCI, NH3, m/z): 391 (M+H)+.
Beispiel 7A
4-(4-Amino-3-fiuorphenyl)morpholin-3-on
Methode 1 :
700 mg (1.79 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A wurden in 70 ml Ethanol gelöst und mit 95 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt. Es wurde bei Raumtemperatur und einem Wasserstoffdruck von 1 bar eine Stunde lang hydriert. Dann wurde vom Katalysator über wenig Kieselgur abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt. Es wurden 378 mg (95% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): 7.04 (dd, IH), 6.87 (dd, IH), 6.73 (dd, IH), 5.17 (s, breit, 2H), 4.12 (s, 2H), 3.91 (dd, 2H), 3.62 (dd, 2H).
HPLC (Methode 1): R, = 0.93 min.
MS (DCI, NH3, m/z): 21 1 (M+H)+, 228 (M+NH,)*.
Methode 2:
Eine Suspension von 29.6 g (125 mmol) 2-Fluor-4-iodanilin, 15.8 g (156 mmol, 1.25 eq.) Morpholin-3-on [J.-M. Lehn, F. Montavon, HeIv. Chim. Acta 1976, 59, 1566-1583], 9.5 g (50 mmol, 0.4 eq.) Kupfer(I)iodid, 53.1 g (250 mmol, 2 eq.) Kaliumphosphat und 8.0 ml (75 mmol, 0.6 eq.) NN'-Dimethylethylendiamin in 300 ml Dioxan wurde unter Argon über Nacht unter Rückfluss gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde nach Abkühlen auf RT über eine Kieselgur- Schicht filtriert und der Rückstand mit Dioxan gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel 60, Dichlormethan/M ethanol 100:1 → 100:3). Es wurden 24 g (74% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.87 min;
MS (ESIpos): m/z = 21 1 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 7.05 (dd, IH), 6.87 (dd, IH), 6.74 (dd, IH), 5.14 (s, 2H), 4.1 1 (s, 2H), 3.92 (dd, 2H), 3.63 (dd, 2H).
Beispiel 8A
5-Chlor-N-[(2R)-3-{[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]amino}-2-hydroxypropyl]thiophen-2- carbonsäureamid
Eine Lösung von 376 mg (1.79 mmol) des Produktes aus Beispiel 7A und 429 mg (1.97 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A in 10 ml Acetonitril wurde mit 600 mg (2.69 mmol) Magnesiumperchlorat versetzt und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde mit Wasser versetzt und mit Ethylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wurde nacheinander mit Wasser und gesättigter Νatriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 5) gereinigt. Es wurden 503 mg (64% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
1H-NMR (400 MHz, DMSOd6, δ/ppm): 8.61 (t, IH), 7.68 (d, IH), 7.18 (d, IH), 7.11 (dd, IH), 6.97 (dd, IH), 6.73 (dd, IH), 5.33 (t, IH), 5.14 (d, IH), 4.13 (s, 2H), 3.92 (dd, 2H), 3.87-3.79 (m, IH), 3.63 (dd, 2H), 3.39-3.22 (m, 2H, teilweise überlagert vom Wassersignal), 3.21-3.15 (m, IH), 3.08-3.02 (m, IH).
HPLC (Methode 1): R, = 3.75 min.
MS (DCI, NH3, m/z): 428/430 (35C1/37C1) (M+H)+, 445/447 (M+N1L,)+.
Beispiel 9A
5-Chlor-N-({(5S)-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-2-oxo-l ,3-oxazolidin-5-yl}methyl)- thiophen-2 -carbonsäureamid
Methode 1 :
Eine Lösung von 478 mg (1.12 mmol) des Produktes aus Beispiel 8A und 363 mg (2.24 mmol) Carbonyldiimidazol in 10 ml Butyronitril wurde mit 2.7 mg (0.022 mmol) 4- Dimethylaminopyridin versetzt und auf 700C erwärmt. Nach drei Tagen wurde das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC (Methode 5) aus dem Rückstand isoliert. Es wurden 344 mg (68% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ/ppm): 8.98 (t, IH), 7.70 (d, IH), 7.52 (dd, IH), 7.48 (dd, IH), 7.31 (dd, IH), 7.21 (d, IH), 4.91-4.84 (m, IH), 4.21 (s, 2H), 4.12 (t, IH), 3.98 (dd, 2H), 3.80 (dd, IH), 3.76 (dd, 2H), 3.68-3.57 (m, 2H).
HPLC (Methode 1): R, = 3.82 min.
MS (DCI, NH3, m/z): 41MW (35Cy37Cl) (M+NH4)+.
Methode 2:
Eine Lösung von 11.2 g (36 mmol) der Verbindung aus Beispiel 62A in 224 ml Pyridin wurde bei 00C mit 7.9 g (43 mmol, 1.2 eq.) der Verbindung aus Beispiel IA versetzt. Nach 30 min wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt und der Rückstand in Wasser und Dichlormethan aufgenommen. Nach Phasentrennung wurde die wässrige Phase zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Wasser und mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan verrührt, filtriert und im Vakuum getrocknet, wobei 7.4 g (45% d. Th.) der Titelverbindung erhalten wurden. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand mittels Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel 60, Dichlormethan/Methanol 100: 1 → 100:2), wobei weitere 1.9 g (12% d. Th.) der Titelverbindung erhalten wurden.
HPLC (Methode 2): R, = 3.74 min;
MS (ESIpos): m/z = 454 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ = 8.94 (t, IH), 7.69 (d, IH), 7.52 (dd, IH), 7.48 (dd, IH), 7.31 (dd, IH), 7.20 (d, IH), 4.92-4.84 (m, IH), 4.21 (s, 2H), 4.12 (t, IH), 3.97 (t, 2H), 3.81 (dd, IH), 3.76 (t, 2H), 3.67-3.56 (m, 2H);
Schmelzpunkte: 177°C , ΔH 84 Jg"1 und 1830C, ΔH 7 Jg"1.
Beispiel IQA
5-Chlor-N-(4-chlorbutanoyl)-N-({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5 -yl } methyl)thiophen-2-carboxamid
400 mg (0.88 mmol) 5-Chlor-N-({(5S)-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-2-oxo-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)-thiophen-2-carbonsäureamid [Verbindung (A)] wurden unter Argon in 40 ml absolutem DMF gelöst. Man setzte 1.677 g (1.76mmol) Νatriumhydrid (98%ig) zu und ließ 20 min bei RT rühren. Dann wurden 461 mg (11.9 mmol) Chlorbutanoylchlorid zugesetzt, wobei die Reaktionstemperatur auf RT gehalten wurde. Man rührte 16 h bei RT, setzte dann etwas Wasser zu und goss den Ansatz anschließend auf gesättigte wässrige Ammoniumchloridlösung/ Essigsäureethylester 1 : 1. Die Phasen wurden getrennt und die Essigsäureethylesterphase zunächst mit Νatriumhydrogencarbonatlösung, dann mit gesättigter Νatriumchloridlösung ausgeschüttelt und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Methode 1 1) gereinigt. Die dabei erhaltene nach Enolisierung entstandene bis- acylierte Verbindung wurde in 5 ml einer gesättigten Lösung aus Chlorwasserstoff in Dichlormethan über Nacht gerührt. Dann wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 20 mg (4% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
HPLC (Methode 10): R1 = 1.8 min;
LC-MS (Methode 7): R, = 1.2 min; m/z = 558 (M+H)+.
Beispiel IIA
5-Chlor-N-(4-chlorpentanoyl)-N-({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)thiophen-2-carboxamid
100 mg (0.22 mmol) 5-Chlor-N-({(5S)-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-2-oxo-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)-thiophen-2-carbonsäureamid [Verbindung (A)] wurden unter Argon in 10 ml absolutem DMF gelöst. Man setzte 11 mg (0.44 mmol) Νatriumhydrid (98%ig) zu und ließ 20 min bei RT rühren. Dann wurden 461 mg (2.98 mmol) Chlorpentanoylchlorid zugesetzt, wobei die Reaktionstemperatur auf RT gehalten wurde. Man rührte 16 h bei RT und goss den Ansatz dann auf gesättigte wässrige Ammoniumchloridlösung/Essigsäureethylester 1 :1. Die Phasen wurden getrennt und die Essigsäureethylesterphase zunächst mit Νatriumhydrogencarbonatlösung, dann mit gesättigter Νatriumchloridlösung ausgeschüttelt und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Methode 11) gereinigt. Die dabei erhaltene nach Enolisierung entstandene bis-acylierte Verbindung wurde in 2 ml einer gesättigten Lösung aus Chlorwasserstoff in Dichlormethan über Nacht gerührt. Dann wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 20 mg (17% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
HPLC (Methode 10): R1 = 1.9 min;
LC-MS (Methode 6): R, = 2.4 min; m/z = 572 (M+H)+.
Beispiel 12A
N-(4-Aminobutanoyl)-5-chlor-N-({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl } methyl)thiophen-2-carboxamid-Hydrochlorid
x HCl
Stufe a):
0.5 g (1.1 mmol) der Verbindung (A) wurden unter Argonatmosphäre in 27 ml DMF gelöst, mit 79 mg (3.31 mmol) Natriumhydrid versetzt und die Mischung 30 min bei RT gerührt. Dann gab man 4.14 g (1 1 mmol) der frisch hergestellten Verbindung aus Beispiel 14A, gelöst in 3 ml DMF, hinzu. Man rührte weitere 15 min bei RT und versetzte den Ansatz dann mit 1 ml Methanol. Der Ansatz wurde auf ein 1 : 1 Gemisch aus 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Essigsäureethylester gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt und noch zweimal mit 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Danach wurde eingeengt und der Rückstand 20 h lang bei RT mit 5 ml einer gesättigten Lösung von Chlorwasserstoff in Dichlormethan verrührt, wobei der initial entstandene Enolester gespalten wurde. Anschließend wurde eingeengt und der verbleibende Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/ Essigsäureethylester als Eluent gereinigt, wobei das Mischungsverhältnis von 1 : 1 über 1 :2 bis zu 1 :3 gesteigert wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt, und man erhielt 124 mg (8% d. Th.) des zweifach geschützten Intermediats als Schaum.
HPLC (Methode 10): R, = 2.3 min;
LC-MS (Methode 8): R, = 2.33 min; m/z = 793 (M+H)+.
Stufe b):
118 mg (0.149 mmol) der oben erhaltenen Zwischenstufe wurden in 6 ml wasserfreier Trifluor- essigsaure über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde danach im Hochvakuum eingeengt, wobei die Temperatur bei etwa 200C gehalten wurde. Der Rückstand wurde in 50 ml wässriger Salzsäure, die auf pH 3 eingestellt wurde, aufgenommen und die Lösung mit 75 ml Dichlormethan versetzt. Man schüttelte durch, trennte anschließend die wässrige Phase ab und engte diese im Hochvakuum ein. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Methode 1 1) gereinigt. Die entsprechenden
Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und anschließend aus IN Salzsäure lyophilisiert. Ausbeute: 59 mg (69% d. Th.)
HPLC (Methode 10): R, = 0.98 min;
LC-MS (Methode 8): Rt = 0.98 min; m/z = 539 (M+H)+.
Beispiel 13A
N-(5-Aminopentanoyl)-5-chlor-N-({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl } methyOthiophen^-carboxamid-Hydrochlorid
x HCl
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 12A aus Verbindung (A) und der Verbindung aus Beispiel 19A hergestellt werden.
Beispiel 14A
Benzyl-(4-chlor-4-oxobutyl)(4-methoxybenzyl)carbamat
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 19A ausgehend von 4-Amino-buttersäure.
Beispiel 15A
(25)-2-[(?er/.-Butoxycarbonyl)amino]-3-methylbutanthio-S-säure
Die Titelverbindung wurde aus Boc-Valin analog literaturbekannter Vorschrift [R. Michelot et al., Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 2201) hergestellt.
Beispiel 16A
[(tert-Butoxycarbonyl)amino]ethanthio S-säure
Die Titelverbindung wurde aus Boc-Glycin analog literaturbekannter Vorschrift [R. Michelot et al., Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 2201) hergestellt.
Beispiel 17A
(2S)-2,6-Bis[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexanthio S-säure
Die Titelverbindung wurde aus Bis-Boc-Lysin analog literaturbekannter Vorschrift [R. Michelot et al., Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 2201) hergestellt.
Beispiel 18A
(2S)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]propanthio S-säure
Die Titelverbindung wurde aus Boc-Alanin analog literaturbekannter Vorschrift [R. Michelot et al., Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 2201) hergestellt.
Beispie» 19A
Benzyl-(5-chlor-5-oxopentyl)(4-methoxybenzyl)carbamat
10 g (85.4 mmol) 5-Amino-valeriansäure, 17.4 g (128 mmol) p-Anisaldehyd und 10.3 g (85.4 mmol) Magnesiumsulfat wurden in 330 ml Ethanol aufgenommen und 1 h unter Rückfluss erhitzt. Man filtrierte ab, wusch mit Ethanol nach und versetzte anschließend die Lösung portionsweise innerhalb von 15 min mit 1.94 g (51.2 mmol) Natriumborhydrid. Man setzte zunächst 10 ml Wasser zu und dann 128 ml einer 2M Natronlauge. Nach 5 min wurde mit 300 ml Wasser verdünnt und anschließend dreimal mit je 200 ml Essigsäureethylester ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde mit 4M Salzsäure auf pH 2 eingestellt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Acetonitril/Wasser/Essigsäure 5:1 :0.1 als Eluent gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt und mit Essigsäureethylester und Diethylether verrührt. Der Rückstand wurde dann abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.1 g (45% d. Th.) der p-Methoxybenzyl-geschützten Aminosäure.
Diese wurde in 1.6 1 Dioxan/Wasser 1 :1 aufgenommen, mit Natronlauge auf pH 10 eingestellt und anschließend tropfenweise mit 12.97 g (76 mmol) Benzyl-chlorcarbonat versetzt. Nach 15 min Rühren bei RT wurde Dioxan im Vakuum entfernt und die verbleibende Lösung mit 2M Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Man extrahierte mit Essigsäureethylester und wusch die organische Phase anschließend zweimal mit Wasser. Die organische Phase wurde dann eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Anschließend erfolgte eine Reinigung durch Flash-Chromatographie an Kieselgel mit Acetonitril als Eluent. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt und der
Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.6 g (38% d. Th.) der geschützten Aminosäure.
LC-MS (Methode 6): R, = 2.47 min; m/z = 372 (M+H)+.
5.6 g (15 mmol) 5-{[(Benzyloxy)carbonyl](4-methoxybenzyl)amino}valeriansäure wurden in 60 ml Dichlormethan gelöst und mit 2.2 ml Thionylchlorid versetzt. Man erhitzte die Mischung 30 min lang unter Rückfluss. Danach wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand erneut mit Dichlormethan versetzt und abermals eingeengt. Zurück blieb ein viskoses Öl, das im Hochvakuum getrocknet wurde. Man erhielt 5.7 g (98% d. Th.) der Zielverbindung, welche ohne weitere Aufreinigung und Charakterisierung weiter umgesetzt wurde.
Ausführungsbeispiele:
Allgemeine Vorschrift 1 zur Herstellung von Caesium-Salzen von Carbonsäuren oder geeignet geschützten Aminosäure-Derivaten:
1 mmol der entsprechenden Carbonsäure wird in einer Mischung aus 10 ml Dioxan und 10 ml Wasser gelöst und mit 0.5 mmol Caesiumcarbonat versetzt. Anschließend wird lyophilisiert.
Allgemeine Vorschrift 2 zur Herstellung von urethan-geschϋtzten N-Carboxy-anhydriden von geeignet geschützten Aminosäure-Derivaten:
Urethangeschützte N-Carboxyanhydride von Aminsosäure-Derivaten sind entweder kommerziell erhältlich oder können nach Literaturvorschriften hergestellt werden: M. Johnston et al. J.Org.Chem. 1985, 50, 2200; W.D. Füller et al. J.Am.Chem.Soc. 1990, 112, 7414; S. Mobasheri et al. J.Org.Chem. 1992, 57, 2755.
Allgemeine Vorschrift 3 zur Herstellung von N-Hvdroxysuccinimid Estern von geeignet geschützten Aminosäure-Derivaten:
N-Hydroxysuccinimid Ester von Aminsosäure-Derivaten sind entweder kommerziell erhältlich oder können nach Standardmethoden der Peptidchemie hergestellt werden.
Beispiel 1
2-[[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl } methyl)amino] -4-oxobutyl-glycinat-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu den Beispielen 2 und 25 aus der Verbindung aus Beispiel 10A und Boc-Glycin hergestellt werden.
Beispiel 2
2-[[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l ,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino]-5-oxopentyl-glycinat-Hydrochlorid
Die Titelverbindung wurde durch Auflösen von 5 mg der Verbindung aus Beispiel 25 in auf pH 3 eingestellter, wässriger Salzsäure und anschließende Lyophilisation hergestellt. Ausbeute: 4.4 mg (99% d. Th.)
HPLC (Methode 10): R, = 1.3 min;
LC-MS (Methode 8): R, = 1.08 min; m/z = 61 1 (M+H)+.
Beispiel 3
2-[[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l ,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino]-5-oxopentyl-L-valinat-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu den Beispielen 2 und 25 aus der Verbindung aus Beispiel 1 IA und Boc-Valin hergestellt werden.
Beispiel 4
S-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)(2S)-2-amino-3-methylbutanthioat-Hydrochlorid
Die Titelverbindung wurde durch Auflösen von 7.4 mg der Verbindung aus Beispiel 26 in auf pH 3 eingestellter, wässriger Salzsäure und anschließende Lyophilisation hergestellt. Ausbeute: 6.4 mg (quant.)
HPLC (Methode 10): R, = 1.6 min;
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.52 min; m/z = 669 (M+H)+.
Beispiel 5
S-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl) aminoethanthioat-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu den Beispielen 4 und 26 aus den Verbindungen der Beispiele 1 IA und 16A hergestellt werden.
Beispiel 6
S-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl) (2S)-2,6-diaminohexanthioat-Dihydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu den Beispielen 4 und 26 aus den Verbindungen der Beispiele I IA und 17A hergestellt werden.
Beispiel 7
S-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)(2S)-2-aminopropanthioat-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu den Beispielen 4 und 26 aus den Verbindungen der Beispiele 1 IA und 18A hergestellt werden.
Beispiel 8
S-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl } methyl)amino} -4-oxobutyl) (2S)-2-amino-3-methylbutanthioat-Hydrochlorid
Die Titelverbindυng kann in Analogie zu den Beispielen 4 und 26 aus den Verbindungen der Beispiele 1OA und 15A hergestellt werden.
Beispiel 9
5-Chlor-N-[4-(glycylamino)butanoyl]-N-({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]- l ^-oxazolidin-S-ylJmethyOthiophen^-carboxamid-Hydrochlorid
x HCl
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 12A mit Boc-Glycin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b)
beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 10
5 -Chlor-N- [4-(glycylamino)pentanoyl] -N-( { (5 S)-2-oxo-3 - [2-fluor-4-(3 -oxomorpholin-4- yl)phenyl] -1 ,3 -oxazolidin-5 -yl } methyl)thiophen-2-carboxamide-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Glycin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 11
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-prolinamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Prolin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 12
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l ,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-histidinamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Bis-Boc-Histidin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst
entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 13
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-valinamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Valin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 14
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-lysinamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Bis-Boc-Lysin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 15
5-Chlor-N-({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l ,3-oxazolidin-5-yl}methyl)- N-[5-(L-threonylamino)pentanoyl]thiophen-2-carboxamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Threonin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 16
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l ,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-tyrosinamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Tyrosin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 17
N'-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-aspartamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Asparagin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 18
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl } methyl)amino} -5-oxopentyl)-L-phenylalaninamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Phenylalanin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 19
Nl-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-glutamamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Glutamin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 20
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l ,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-alpha-glutamin-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Glutaminsäure-tert.-butylester hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem
zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 21
5-Chlor-N-({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3-oxazolidin-5-yl}methyl)- N-[5-(L-serylamino)pentanoyl]thiophen-2-carboxamid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Serin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 22
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl } methyl)amino} -5-oxopentyl)-L-leucinarnid-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus der Verbindung aus Beispiel 13A mit Boc-Leucin hergestellt werden. Die Entschützung kann alternativ auch wie in Beispiel 25, Stufe b) beschrieben mit Trifluoressigsäure durchgeführt werden und aus dem zunächst entstandenen Trifluoracetat durch Umsalzung mit wässriger Salzsäure die Titelverbindung generiert werden.
Beispiel 23
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5 -yl } methyl)amino } -5 -oxobutyl)-L-histidinamid-Hydrochlorid
Stufe a):
59 mg (0.103 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A wurden in 15 ml DMF vorgelegt. Dann setzte man 51 mg (0.144 mmol) N,l-Bis(tert-butoxycarbonyl)-L-histidin, 19 mg (0.123 mmol) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol und 24 mg (0.123 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-
carbodiimid Hydrochlorid sowie 12 mg Ethyldiisopropylamin zu und rührte über Nacht bei RT. Der Ansatz wurde dann auf ein 1 : 1 Gemisch aus gesättigter Ammoniumchloridlösung und Essigsäureethylester gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Danach wurde eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 66 mg (55% d. Th.) eines Schaums der mono-Boc- geschützten Zwischenverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 1.2 min
LC-MS (Methode 13): R, = 0.93 min; m/z = 776 (M+H)+
Stufe b):
66 mg (0.085 mmol) der mono-Boc-geschützten Zwischenstufe wurden in 3 ml einer gesättigen Lösung aus Chlorwasserstoff in Dichlormethan gelöst und 30 min bei RT gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde abgesaugt und mit der Mutterlauge ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde eingeengt und durch präparative HPLC (Methode 11) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und der Rückstand aus IN Salzsäure lyophilisiert. Man erhielt 3 mg (4% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 1.07 min;
LC-MS (Methode 8): R, = 1 min; m/z = 676 (M+H)+.
Beispiel 24
N-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)-L-alpha-asparagin-Hydrochlorid
Die Titelverbindung kann in Analogie zu Beispiel 23 aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen hergestellt werden.
Beispiel 25
2-[[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(55)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)anύno]-5-oxopentyl-glycinat-Trifluoractetat
Stufe a):
48 mg (0.084 mmol) der Verbindung aus Beispiel I IA wurden mit 77 mg (0.252 mmol) des Caesiumsalzes von Boc-Glycin (hergestellt aus Boc-Glycin nach der Allgemeinen Vorschrift 1) in 10 ml DMF gelöst. Nach 3 h Rühren bei 600C setzte man nochmals die gleiche Menge an Caesiumsalz zu und rührte über Nacht bei 600C. Der Ansatz wurde dann auf ein 1 : 1 Gemisch aus gesättigter wässriger Ammoniumchloridlösung und Essigsäureethylester gegossen. Die organische
Phase wurde abgetrennt und mit 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Danach wurde eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei als Eluent zunächst Dichlormethan/ Essigsäureethylester 3: 1 und später Dichlormethan/ Essigsäureethylester/Methanol 15:5:1 verwendet wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand dann im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10 mg (16% d. Th.) der Boc-geschützten Zwischenverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 1.9 min;
LC-MS (Methode 8): R, = 1.98 min; m/z = 71 1 (M+H)+.
Stufe b):
9 mg (0.013 mmol) der geschützten Verbindung wurden in 1.5 ml Dichlormethan gelöst, mit 1.5 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt und dann 15 min bei RT gerührt. Dann wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Dioxan/Wasser lyophilisiert. Man erhielt 8 mg (85% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R1 = 1.3 min;
LC-MS (Methode 13): R1 = 0.83 min; m/z = 61 1 (M+H)+.
Beispiel 26
S-(5-{[(5-Chlor-2-thienyl)carbonyl]({(5S)-2-oxo-3-[2-fluor-4-(3-oxomoφholin-4-yl)phenyl]-l,3- oxazolidin-5-yl}methyl)amino}-5-oxopentyl)(2S)-2-amino-3-methylbutanthioat-Trifluoractetat
Stufe a):
47 mg (0.082 mmol) der Verbindung aus Beispiel I IA wurden mit 90 mg (0.25 mmol) des Caesiumsalzes von (2S)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-3-methylbutanthio-S-säure (hergestellt aus Beispiel 15A nach der Allgemeinen Vorschrift 1) in 2 ml DMF gelöst. Nach 3 h Rühren bei 600C setzte man nochmals die gleiche Menge an Caesiumsalz zu und rührte über Nacht bei 600C. Der Ansatz wurde dann auf ein 1 :1 Gemisch aus gesättigter wässriger Ammoniumchloridlösung und Essigsäureethylester gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit 10%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Danach wurde eingeengt und der Rückstand durch Flashchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei als Eluent zunächst Dichlormethan/ Essigsäureethylester 3: 1 und später Dichlormethan/Essigsäureethylester/Methanol 15:5:1 verwendet wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel abgedampft. Dieser Reinigungsprozess wurde ein zweites Mal wiederholt. Anschließend wurde der verbleibende Rückstand nochmals durch präparative HPLC gereinigt (Methode 11). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel abgedampft. Man erhielt 7 mg (1 1% d. Th.) der Boc-geschützten Zwischenverbindung.
HPLC (Methode 10): R, = 2.3 min;
LC-MS (Methode 13): Rt = 1.43 min; m/z = 769 (M+H)+.
Stufe b):
7 mg (0.009 mmol) der geschützten Verbindung wurden in 1 ml Dichlormethan gelöst, mit 1 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt und dann 15 min bei RT gerührt. Dann wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Man erhielt 6.8 mg (95% d. Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 10): R1 = 1.6 min;
LC-MS (Methode 8): R, = 1.24 min; m/z = 669 (M+H)+.
B. Bestimmung von Löslichkeit, Stabilität und Freisetzungsverhalten
a) Bestimmung der Löslichkeit:
Die Prüfsubstanz wird in Wasser oder verdünnter Salzsäure (pH 4) suspendiert. Diese Suspension wird 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Ultra-Zentrifugation bei 224000g für 30 min wird der Überstand mit DMSO verdünnt und per HPLC analysiert. Quantifiziert wird über eine Zwei- Punkt-Kalibrationskurve der Testverbindung in DMSO.
HPLC Methode:
Agilent 1 100 mit DAD (Gl 315A), quat. Pumpe (Gl 31 IA), Autosampier CTC HTS PAL, Degaser (Gl 322A) und Säulenthermostat (Gl 316A); Säule: Zorbax Extend-C18 3.5 μ; Temperatur: 400C; Eluent A: Wasser + 5 ml Perchlorsäure/Liter, Eluent B: Acetonitril; Flussrate: 0.7 ml/min; Gradient: 0-0.5 min 98% A, 2% B; Rampe 0.5-4.5 min 10% A, 90% B; 4.5-6 min 10% A, 90% B; Rampe 6.5-6.7 min 98% A, 2% B; 6.7-7.5 min 98% A, 2% B.
b) Stabilität in Puffer bei verschiedenen pH-Werten:
0.25 mg der Testsubstanz werden in einem 2 ml-HPLC-Vial eingewogen und mit 0.5 ml Acetonitril versetzt. Zum Lösen der Substanz wird das Probengefäß für ca. 10 Sekunden ins Ultraschallbad gegeben. Anschließend werden 0.5 ml der jeweiligen Pufferlösung zugefügt und die Probe erneut im Ultraschallbad behandelt.
Eingesetzte Pufferlösungen:
pH 4.0: 1 Liter Millipore- Wasser wird mit 1 N Salzsäure auf pH 4.0 eingestellt;
pH 7.4: 90 g Natriumchlorid, 13.61 g Kaliumdihydrogenphosphat und 83.35 g 1 M Natronlauge werden auf 1 Liter mit Millipore- Wasser aufgefüllt und dann 1 : 10 verdünnt.
Über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37°C werden stündlich jeweils 10 μl der Probenlösung per HPLC auf ihren Gehalt an unveränderter Testsubstanz analysiert. Quantifiziert wird über die Flächenprozente der entsprechenden Peaks.
HPLC-Methode:
Agilent 1 100 mit DAD (G1314A), binärer Pumpe (G1312A), Autosampier (G1329A), Säulenofen (Gl 316A), Thermostat (G 1330A); Säule: Kromasil 100 Cl 8, 125 mm x 4 mm, 5 μm; Säulentemperatur: 300C; Eluent A: Wasser + 5 ml Perchlorsäure/Liter, Eluent B: Acetonitril.
Gradient:
0-1.0 min 98% A, 2% B → 1.0-13.0 min 50% A, 50% B → 13.0-17.0 min 10% A, 90% B → 17.0- 18.0 min 10% A, 90% B → 18.0-19.5 98% A, 2% B → 19.5-23.0 min 98% A, 2% B; Flussrate: 2.0 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
c) In Wlro-Stabilität in Ratten- und Humanplasma (HPLC-Detektion):
0,5 mg Substanz werden in ImI Dimethylsulfoxid/Wasser 1 : 1 gelöst. 500 μl dieser Probenlösung werden mit 500 μl 37°C warmem Rattenplasma versetzt und geschüttelt. Es wird sofort eine erste Probe (10 μl) für die HPLC-Analyse gezogen. Im Zeitraum bis zu 2 h nach Inkubationsbeginn werden nach 2, 5, 10, 30, 60 und 90 min weitere Aliquote entnommen und der Gehalt der jeweiligen Prüfsubstanz und der daraus freigesetzten Wirkstoff-Verbindung (A) bestimmt.
HPLC-Methode:
Agilent 1100 mit DAD (G1314A), binärer Pumpe (G1312A), Autosampier (G1329A), Säulenofen (G1316A), Thermostat (G1330A); Säule: Kromasil 100 C18, 250 mm x 4.6 mm, 5 μm; Säulentemperatur: 300C; Eluent A: Wasser + 5 ml Perchlorsäure/Liter, Eluent B: Acetonitril.
Gradient:
0-3.0 min 69% A, 31% B → 3.0-18.0 min 69% A, 31% B -» 18.0-20.0 min 10% A, 90% B → 20.0-21.0 90% A, 10% B → 21.0-22.5.0 min 98% A, 2% B → 22.5-25.0 min 98% A, 2% B; Flussrate: 2.0 ml/min; UV-Detektion: 248 nm.
d) In v/fro-Stabilität in Ratten- und Humanplasma (LC/MS-MS-Detektion):
Ein definiertes Plasmavolumen (z.B. 2.0 ml) wird in einem geschlossenen Reagenzglas im Wasserbad auf 37°C erwärmt. Nach Erreichen der Soll-Temperatur wird eine definierte Menge der Prüfsubstanz als Lösung zugegeben (Volumen des Lösungsmittels max. 2% des Plasmavolumens). Das Plasma wird geschüttelt und eine erste Probe (50-100 μl) sofort entnommen. Im Zeitraum bis 2 h nach Inkubationsbeginn werden anschließend 4-6 weitere Aliquote entnommen.
Die Plasmaproben werden zur Proteinfällung mit Acetonitril versetzt. Nach Zentrifugation werden Prüfsubstanz und gegebenenfalls bekannte Spaltprodukte der Prüfsubstanz im Überstand mit einer geeigneten LC/MS-MS-Methode quantitativ bestimmt.
Stabilitätsbestimmungen in heparinisiertem Ratten- oder Humanblut werden wie für Plasma beschrieben durchgeführt.
e) i.v.-Pharmakokinetik in Wistar-Ratten:
Am Tag vor der Substanzgabe wird den Versuchstieren (männliche Wistar-Ratten, Körpergewicht 200-250 g) unter Isofluran®-Narkose ein Katheter für die Blutgewinnung in die Vena Jugularis implantiert.
Am Versuchstag wird eine definierte Dosis der Prüfsubstanz als Lösung mit einer Hamilton®- Glasspritze in die Schwanzvene appliziert (Bolusgabe, Applikationsdauer <10 s). Innerhalb von 24 h nach Substanzgabe werden sequentiell Blutproben (8-12 Zeitpunkte) über den Katheter entnommen. Zur Plasmagewinnung werden die Proben in heparinisierten Röhrchen zentrifugiert. Pro Zeitpunkt wird ein definiertes Plasmavolumen zur Proteinfällung mit Acetonitril versetzt. Nach Zentrifugation werden Prüfsubstanz und gegebenenfalls bekannte Spaltprodukte der Prüfsubstanz im Überstand mit einer geeigneten LC/MS-MS-Methode quantitativ bestimmt.
Die Berechnung pharmakokinetischer Kenngrößen der Prüfsubstanz bzw. der daraus freigesetzten Wirkstoff-Verbindung (A) wie AUC, Cm3x, T1/2 (Halbwertszeit) und CL (Clearance) erfolgt aus den gemessenen Plasmakonzentrationen.
f) Hepatozytenassay zur Bestimmung der metabolischen Stabilität:
Die metabolische Stabilität der Testverbindungen gegenüber Hepatozyten wird bestimmt, indem die Verbindungen bei niedrigen Konzentrationen (bevorzugt unter 1 μM) und bei niedrigen Zellzahlen (bevorzugt bei 1 * 106 Zellen/ml) inkubiert werden, um möglichst lineare kinetische Bedingungen im Versuch sicherzustellen. Sieben Proben aus der Inkubationslösung werden in einem festgelegten Zeitraster für die LC-MS-Analytik entnommen, um die Halbwertszeit (d.h. den Abbau) der Verbindung zu bestimmen. Aus dieser Halbwertszeit werden unterschiedliche "Clearance"-Parameter (CL) und "Fmax"- Werte berechnet (s.u.).
Die CL- und Fmax-Werte stellen ein Maß für den Phase 1- und Phase 2-Metabolismus der Verbindung in den Hepatozyten dar. Um den Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Enzyme in den Inkubationsansätzen möglichst klein zu halten, wird dessen Konzentration im Allgemeinen auf 1% (Acetonitril) bzw. 0.1% (DMSO) begrenzt.
Für alle Spezies und Rassen wird mit einer Hepatozyten-Zellzahl in der Leber von 1.1 * 108 Zellen/g Leber gerechnet. CL-Parameter, deren Berechnung auf Halbwertszeiten beruhen, die über die Inkubationszeit hinausgehen (üblicherweise 90 Minuten), können nur als grobe Richtwerte an- gesehen werden.
Die berechneten Parameter und deren Bedeutung sind:
Fmaχ well-stirred [%] maximal mögliche Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation
Berechnung: (l-CLblood well-stirred/QH) * 100
CLbI0Od well-stirred [L/(h*kg)J berechnete Blut-Clearance (well stirred-Modell)
Berechnung: (QH * CL',nmnsic) / (QH + CL'intπnsκ:)
CL'in,rinsic [ml/(min*kg)] maximale Fähigkeit der Leber (der Hepatozyten), eine Verbindung zu metabolisieren (unter der Annahme, dass der Leberblutfluss nicht geschwindigkeitslimitierend ist)
Berechnung: CL'mtπnsic, apparent * speziesspezifische Hepatozytenzahl [1.1 * 108/g Leber] * speziesspezifisches Lebergewicht [g/kg]
CL'intrinsic, apparent [ml/(min*mg)] normiert die Eliminationskonstante, indem diese durch die eingesetzte Hepatozyten-Zellzahl x (x * 106/ml) dividiert wird
Berechnung: kei [l/min] / (Zellzahl [x * 106] / Inkubationsvolumen [ml])
(QH = speziesspezifischer Leberblutfluss).
g) Bestimmung der antithrombotischen Wirkung in einem arteriovenösen Shunt-Modell in Ratten:
Nüchterne männliche Ratten (Stamm: HSD CPB:WU) werden durch intraperitoneale Gabe einer Rompun/Ketavet-Lösung narkotisiert (12 mg/kg / 50 mg/kg). Die Thrombusbildung wird in einem arteriovenösen Shunt in Anlehnung an die von P.C. Wong et al. beschriebene Methode [Thrombosis Research 82 (2), 117-126 (1996)] ausgelöst. Dazu werden die linke Vena jugularis und die rechte Arteria carotis freipräpariert. In die Arterie wird ein 8 cm langer Polyethylen- katheter (PE60, Fa. Becton-Dickinson), gefolgt von einem 6 cm langen Tygonschlauch (R-3606, ID 3.2 mm, Fa. Kronlab), der zur Erzeugung einer thrombogenen Oberfläche einen aufgerauhten und zu einer Doppelschlinge gelegten Nylonfaden (60 x 0.26 mm, Fa. Berkley Trilene) enthält, eingebunden. In die Vena jugularis wird ein 2 cm langer Polyethylenkatheter (PE60, Fa. Becton- Dickinson) eingebunden und über einen 6 cm langen Polyethylenkatheter (PEl 60, Fa. Becton- Dickinson) mit dem Tygonschlauch verbunden. Die Schläuche werden mit physiologischer Kochsalzlösung vor Öffnung des Shuntes gefüllt. Der extrakorporale Kreislauf wird 15 min lang auf-
rechterhalten. Dann wird der Shunt entfernt und der Nylonfaden mit dem Thrombus sofort gewogen. Das Leergewicht des Nylonfadens ist vor Versuchsbeginn ermittelt worden. Die Prüfsubstanz (als Lösung in physiologischer Kochsalzlösung, die mit 0.1 N Salzsäure auf pH 4 eingestellt ist) wird vor Anlegung des extrakorporalen Kreislaufs als Bolus-Injektion verabreicht.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
i.v.-Lösung;
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%, die jeweils auf einen pH-Wert von 3-5 eingestellt sind) gelöst. Die Lösung wird gegebenenfalls steril filtriert und/oder in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.