EP2153229A1 - Use of auto-antibodies against cd28 as a prognostic marker in malignant melanoma - Google Patents
Use of auto-antibodies against cd28 as a prognostic marker in malignant melanomaInfo
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- EP2153229A1 EP2153229A1 EP08773255A EP08773255A EP2153229A1 EP 2153229 A1 EP2153229 A1 EP 2153229A1 EP 08773255 A EP08773255 A EP 08773255A EP 08773255 A EP08773255 A EP 08773255A EP 2153229 A1 EP2153229 A1 EP 2153229A1
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- malignant melanoma
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N2333/70521—CD28, CD152
Definitions
- the present invention relates to a method for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma, in which a sample from a patient is examined for the presence of anti-CD28 autoantibodies by bringing the sample into contact with CD28, wherein a binding of the autoantibodies to CD28 indicates a significantly worse survival prognosis of the patient with malignant melanoma.
- the invention further relates to the use of CD28 as a detection reagent for anti-CD28 autoantibodies for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma and
- HAMBURG TEL. : (040) 899 654-0 FAX: (040) 899 654-88 BE S ELERSTRASSE 4 D-22607 HAMBURG a kit designed for this purpose comprising CD28 and labeled anti-immunoglobulin antibodies.
- Malignant melanoma is an extremely aggressive tumor that starts from the melanocytes in the skin or other organs and prematurely metastasizes.
- the standard therapy of malignant melanoma is the earliest possible excision of the primary tumor.
- LDH lactate dehydrogenase
- the present invention satisfies this need and provides for the first time a method is available, with which semi-quantitatively determine the survival prognosis in patients with malignant melanoma 'leaves.
- the present invention relates to a method for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma, in which a sample from a patient is examined for the presence of anti-CD28 autoantibodies by bringing the sample into contact with CD28, wherein a binding of the autoantibodies to CD28 on a - in comparison to patients without anti-CD28 autoantibodies - significantly worse survival prognosis of the patient with malignant melanoma indicates.
- the present invention is based on the surprising discovery that the presence of autoantibodies to CD28 in patient samples, preferably in plasma, and more preferably in the serum of patients with malignant melanoma, is a statistically significant marker for the prognosis of overall patient survival.
- autoantibodies are increasingly found in high-risk melanoma patients who are adjuvantly treated with interferon alpha (IFN ⁇ ) and also worsen overall survival in these patients. Therefore, the diagnosis of autoantibodies to CD28 represents a new parameter for differentiated therapy decisions and for the prognosis in patients with malignant melanoma. That is, according to the invention anti-CD28 autoantibodies are used as prognostic markers for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
- IFN ⁇ interferon alpha
- PFS progression-free survival
- OS overall survival
- the invention encompasses the semiquantitative detection of human autoantibodies to CD28 in patient samples, preferably in blood samples or in plasma, and more preferably in the serum of patients with malignant melanoma, using an ELISA described further herein.
- stage III melanoma patients detection of autoantibodies to CD28 is associated with significantly decreased overall survival.
- autoantibodies ANA, anti-thyroid antibodies
- ANA anti-thyroid antibodies
- the invention makes it possible for the first time to identify melanoma patients with a poorer survival prognosis and to deduce therapeutic consequences therefrom.
- patients who have autoantibodies to CD28 in serum should not receive treatment with IFN ⁇ , because it can induce even higher serum titers of autoantibodies to CD28.
- patients who develop autoantibodies to CD28 under IFNa therapy off the ⁇ immunotherapy be broken.
- the use of, for example, interleukin-2 (IL2) or chemotherapy could also be considered.
- CD28 a CD28 molecule of full length according to SEQ ID NO: 1 or an extracellular fragment thereof according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 is designated as CD28, which can be recognized by anti-CD28 autoantibodies.
- the extracellular fragment of CD28 comprises the full-length CD28 amino acids except the intracellular part and the transmembrane region.
- the sequence according to SEQ ID NO: 6 describes the sequence of the human extracellular fragment, and SEQ ID NO: 2 a shorter by a total of five amino acids fragment.
- CD28 proteins or fragments thereof from other species are also included within the scope of this invention, e.g. from mouse, rat, rabbit, guinea pig, dog, cat, horse or cow (so-called species variants).
- fragments (parts) of these sequences are included, ie partial sequences of these explicitly mentioned fragments, which as well as the longer CD28 fragments for the detection of anti -CD28 autoantibodies are suitable.
- derivatives of these fragments and partial sequences that differ from them by substitution of single, preferably fewer, amino acids.
- Self-proclaimed comprehensible such sequence variants selected which are still suitable for 'detection of anti-CD28 autoantibodies.
- those shorter parts of the extracellular CD28 fragment or sequence variants thereof are selected which still allow a sufficient, preferably high specificity and / or selectivity in the detection of anti-CD28 autoantibodies.
- the full length CD28 molecule or extracellular fragments thereof may be part of a fusion protein.
- the fusion protein further comprises glutathione S-transferase or a histidine tag, which is particularly helpful for the purification of the recombinant protein.
- CD28 can be purified from cells or prepared recombinantly.
- the fusion protein may comprise an Ig (immunoglobulin) moiety, but it is preferred that it is not included in the fusion protein so as to avoid difficulties with possible cross-reactivity of autoantibodies found in the patent serum to the Ig moiety.
- CD28 can be cleaved from CD28-Ig fusion molecules, e.g. with trypsin.
- the sample of a patient is preferably a blood sample or a serum sample.
- the method according to the invention is generally carried out in vitro.
- CD28 is bound to a carrier.
- a carrier may be, for example, an ELISA plate, a magnetic bead or a blot foil, eg a nitrocellulose foil.
- carriers are also referred to as carriers which express CD28 naturally or recombinantly on their surface.
- CD28 can be sent directly to the wearer or, for example, antibodies, in particular antibodies to a CD28-associated tag such as glutathione-S-transferase, to a carrier. These antibodies are not human antibodies to prevent cross-reactions with secondary antibodies.
- the binding of anti-CD28 autoantibodies to CD28 is assayed by contacting the support with labeled anti-immunoglobulin antibodies to antibodies of the species to which the patient belongs, and detecting the labeled antibodies.
- the patient may be human.
- human CD28 is preferably used and the anti-immunoglobulin antibodies are anti-human immunoglobulin antibodies.
- the anti-immunoglobulin antibodies are specific for antibodies of the IgG isotype, but they may also be reactive against IgG and IGM and / or IgE.
- the anti-immunoglobulin antibodies are with an enzyme, for example, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye, e.g. Fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE).
- enzyme for example, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye, e.g. Fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE).
- FITC Fluorescein isothiocyanate
- PE phycoerythrin
- the examination can be carried out in a blot, for example a dot blot or a Western blot, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), an RIA (radioimmunoassay), a fluorescence activated cell sorting (FACS) examination or also in a liquid phase detection system.
- a blot for example a dot blot or a Western blot, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), an RIA (radioimmunoassay), a fluorescence activated cell sorting (FACS) examination or also in a liquid phase detection system.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- RIA radioimmunoassay
- FACS fluorescence activated cell sorting
- kits for carrying out the method according to the invention comprises CD28 and labeled anti-immunoglobulin antibodies.
- the CD28 preferably comprises a full length CD28 molecule according to SEQ ID NO: 1 or an extracellular fragment thereof according to SEQ ID NO: 2.
- these are human CD28 and labeled anti-human immunoglobulin antibodies, in particular anti-human IgG Antibodies.
- the kit of the invention further comprises labeled anti-IgE antibodies and is therefore useful for diagnostic assays for determining survival prognosis in patients with malignant melanoma, based both on the determination of total IgE concentration and on the detection of CD28 autoantibodies, as high IgE levels may be an indication that there is less likelihood of melanoma development.
- the kit may further comprise unlabeled anti-IgE antibodies so that the assay for total IgE can be performed as a sandwich ELISA.
- the unlabeled antibodies may be polyclonal anti-IgE antibodies, the labeled anti-IgE antibodies may be polyclonal or monoclonal.
- the labeled and unlabeled anti-IgE antibodies can both be monoclonal antibodies, but must be directed against a different epitope.
- the labeled antibodies contained in the kit can be labeled with an enzyme, eg alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye, eg FITC or PE.
- the invention also relates to the use of anti-CD28 autoantibodies as a prognostic marker for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma and thus the use of a kit described herein for the determination of anti-CD28 autoantibodies as a prognostic marker for the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
- Anti-CD28 autoantibodies are detectable by various methods, such as e.g. by blotting techniques (Example 1).
- the recombinant CD28-Ig fusion protein (R & D Systems Inc. Minneapolis, USA) was incubated in PBS buffer (2.7M NaCl, 54mM KCl, 87mM Na 2 HPO 4 , 30mM KHPO 4 , pH 7.4) dissolved at a concentration of 1 mg / ml and 100 .mu.l of this solution were digested with 50 .mu.l trypsin (10 mg / ml) at 37 0 C for 15 minutes.
- PBS buffer 2.7M NaCl, 54mM KCl, 87mM Na 2 HPO 4 , 30mM KHPO 4 , pH 7.4
- aprotinin 10 mg / ml
- 2.5 ⁇ l TLCK N ⁇ -p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone, 20 mg / ml
- the solution can be stored at -20 0 C until further use.
- the gel electrophoretic separation of proteins is carried out according to the method of Lughtenberg et al. (Lughtenberg, B. (1975), FEBS Lett. 58, 254).
- the cleavage products were separated by SDS-Gel electrophoresis (10% gel) with a 4% stacking gel (110V, 150 minutes) under non-reducing conditions.
- the fission products were transferred at a current of 50 mA for 3 hours to PVDF (polyvinylidene fluoride) membranes (Segin-Blot, Biorad, Germany).
- PVDF polyvinylidene fluoride
- mouse monoclonal antihuman CD28 antibody (R & D Systems, Minneapolis, USA), 1: 5,000 diluted in PBS, biotinylated polyclonal mouse anti-human CD28 antibody (R & D Systems, Minneapolis, USA), diluted 1: 5,000 in PBS, monoclonal mouse anti-human Fc antibody (Dianova, Hamburg, Germany), diluted 1: 10,000 in PBS, and polyclonal rabbit anti-human IgG antibody (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), diluted 1: 3,500 in PBS.
- a cleavage product of the CD28-Ig fusion protein is clearly recognized only by the anti-CD28 antibodies, but not by antibodies to IgG or Fc.
- the PVDF membranes cut into strips were incubated in 1:10 diluted human serum for 1 hour on a swivel table at room temperature.
- Specific antisera to human Fc (Dianova, Hamburg) and human CD28 were used as controls
- RNA was prepared from human whole blood with the help of the QIAamp RNA Blood Mini-Kit from Qiagen (Hilden, catalog number: 52304).
- RNA 5 ⁇ g of the prepared RNA were transcribed into blood cDNA with the superscript kit (Invitrogen, Düsseldorf) with random hexamer-primexn (catalog number: 53034).
- cDNA region coding for the extracellular region (IgG-like domain, without transmembrane region and signal peptide) of this protein was amplified by means of a polymerase chain reaction (PCR).
- PCR polymerase chain reaction
- the amplified cDNA encodes the amino acid sequence: PSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNY- SQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKVYPPPYLDNEKSNGTI- IHVKGKHLCPSPLF (SEQ ID NO: 2)
- the PCR amplificate just like the vector pGEX-4T-1, was first mixed with Smal (New England Biolabs, Frankfurt aM, catalog number: # RO141S) and then with EcoRI (New England Biolabs, catalog number # R0101S) in the reaction buffer NEB4 at 20 ° C and 37 "C were incubated for two hours each, followed by purification of the cut DNA using the Agarose Gel DNA Extraction Kit from Roche (Basel, catalog number: 1696505) . The linearized vector was subsequently dephosphorylated, to which the eluted DNA was added After incubation at 37 ° C.
- competent bacteria (XLI Blue, HB 101) were transformed with one fifth of the ligation mixture. To this was added 50 ⁇ l of competent bacteria thawed on ice Pipette one-fifth of a ligation mixture or 0.5 ⁇ g of a DNA preparation and incubate on ice for 30 min.
- the bacteria mixtures were heated to 37 0 C for 5 min. Thereafter, 950 .mu.l SOC medium were added and uniformly streaked between 50 .mu.l and 1 ml of the batch on LB agar plates with 150 ug / ml ampicillin with a pipette and incubated overnight at 37 0 C.
- Competent BL21-RILsuppl Bacteria (a protease-deficient E. coli strain) were transformed with the cDNA construct and streaked after half an hour of pre-incubation in SOC medium at 37 ° C on LB agar plates containing 150 ⁇ g / ml ampicillin. After 14 hours of incubation, a 30 ml LB medium was incubated with ampicillin with a colony.
- This preculture was incubated overnight at 37 0 C in a shaker. This was then transferred into 500 ml of LB medium with ampicillin and incubated at 600 nm with continuous shaking at 37 ° C. to an optical density of 0.6-0.8 (about 1.5 hours).
- Glutathione-Sepharose 4B (Amer- sham Biosciences, catalog number: 27-4574-01) was added to a bed volume of 1 ml in a gravity-driven poly- propylene column and equilibrated in a five-fold volume of PBS.
- the bacterial lysate was then charged and the flow re-added to the column. The second flow was discarded and the column washed with five to ten times the bed volume of PBS. Elution was carried out in 10 mM reduced glutathione, 50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% glycerol. The eluted protein was then aliquoted and stored at - 80 0 C kept.
- TFB 1 Adjust 15% glycerol 10 mM CaCl 2 30 mM potassium acetate to pH 5.8 with acetic acid
- XLlblue bacteria were streaked on an LB plate and incubated overnight at 37 ° C. In the morning, some colonies were inoculated with 2 ml of Y-broth and incubated for 2 hours at 37 0 C in a shaker. Subsequently, these precultures were poured into 500 ml Y-broth and incubated to an OD at 600 nm of 0.3-0.35. Then, the culture was spread on two tubes 50 ml polypropylene, placed briefly on ice, and at 4 0 C and pelletized 2000g.
- the supernatant was decanted, the pellet resuspended in 15 ml each in TFB 1 (15% glycerol, 10 mM CaCl 2 , 30 mM potassium acetate, adjusted to pH 5.8 with acetic acid, 100 mM RbCl, 50 mM MnCla) and 60-90 Minutes on ice.
- GST monoclonal mouse anti-glutathione S-transferase
- the blank contained the antigen but no control serum, the negative control contained the control serum but no antigen and the blank contained neither control serum nor antigen.
- Each patient serum was measured in duplicate against antigen and - to exclude nonspecific reactions - against PBS + 0.1% / Tween 20. Subsequently, the microtiter plate was incubated for 1 h at room temperature and then washed three times. In the next step, the secondary antibody was added. 100 ⁇ l of an anti-rabbit IgG antibody (Fc-specific, Sigma, Kunststoff) and 100 ⁇ l of an anti-human IgG antibody (Fc-specific; Sigma, Kunststoff) were used in each of the wells containing the control serum (B 1-4). used. Both antibodies were prediluted 1: 5000 and labeled with alkaline phosphatase. The incubation time was 60 min at room temperature.
- the quotient was calculated for all sera tested. The limit was calculated with the sera of healthy volunteers. It was found that 95% of the calculated quotients of healthy subjects were below 9, so that values> 10 were were considered positive, ie they contained autoantibodies to CD28.
- Example 4 Investigated patient collective consisting of 116 melanoma patients in clinical stage III A-C.
- Example 5 Serum autoantibodies of patients with malignant melanoma stage IUI AC.
- Figure 2 shows the number of patients with and without autoantibodies to CD28, anti-nuclear antibodies (ANAs) and anti-thyroglobulin antibodies prior to the initiation of stage III IFN ⁇ therapy. In the advanced stages HIB and IHC, more patients with autoantibodies were found.
- PFS was median at 39.7 months (95% confidence interval (CI): 21.91, 57.49 months) in patients with CD28 autoantibodies (CD28 +) and median survival was not achieved in patients without autoantibodies to CD28 (CD28-).
- Example 6 Comparison of progression-free survival and overall survival in patients with various autoantibodies.
- Figure 4 shows progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of the various patient groups using Kaplan-Meier curves.
- the graphs show that survival is worse when anti-CD28 autoantibodies are present (p ⁇ 0.05).
- the presence of other autoantibodies that positively affect overall survival can not offset this adverse effect on the prognosis of melanoma patients.
- Figure 7 shows the titers of autoantibodies in the serum of melanoma patients before and after IFN ⁇ therapy.
- the two figures show that both the number of patients with autoantibodies and the serum titres are significantly increased by IFN ⁇ therapy.
- the titers of autoantibodies to CD28 and thyroid tissue are significantly increased by IFN ⁇ therapy.
- Example 8 Comparison of progression-free survival and overall survival in patients with and without autoantibodies to CD28 after performing IFN ⁇ therapy.
- Demographics of the investigated patient population consisting of sera from 116 stage III melanoma patients (AJCC 2002).
- Kaplan-Meier curves for progression-free survival (A) and overall survival (B) of patients with and without anti-CD28 autoantibodies (n 116).
- Kaplan-Meier curves for progression-free (A) and overall survival (B) in patients with stage III malignant melanoma (n 116).
- the different patient groups are: CD28 / auto-ac, CD28 + / auto-ac, CD28- / auto-ac + and CD28 + / auto-ac +.
- anti-CD28 autoantibodies are significantly enhanced by interferon therapy, i. More patients produce these autoantibodies. This also applies to ANAs and anti-thyroglobulin autoantibodies.
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Abstract
The invention relates to a method for determining the survival prognosis of patients with malignant melanoma, according to which a sample from a patient is analysed for the presence of anti-CD28 auto-antibodies by bringing said sample into contact with CD28. If auto-antibodies bond to the CD28, this indicates a significantly worse survival prognosis of the patient with malignant melanoma. The invention also relates to the use of CD28 as a detection reagent for anti-CD28 auto-antibodies for the diagnosis of said diseases and to a kit that is designed for this purpose, comprising CD28 and marked anti-immunglobulin antibodies.
Description
PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS PATENT OFFICERS EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
EUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYSEUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYS
THOMAS-WIMMER-RING 9 DIPL.-ING. ARNULF HUBER D-80539 MÜNCHEN DR. ALLARD von KAMEKETHOMAS-WIMMER-RING 9 DIPL.-ING. ARNULF HUBER D-80539 MUNICH DR. ALLARD von KAMEKE
DIPL.-BIOL. INGEBORG VOELKERGRADUATE BIOL. INGEBORG VOELKER
DR. PETER FRANCKDR. PETER FRANCK
DR. GEORG BOTHDR. GEORG BOTH
DR. ULRICH-MARIA GROSSDR. ULRICH-MARIA GROSS
DR. HELMUT van HEESCHDR. HELMUT van HEESCH
Universitätsklinikum Hamburg- DR. JOHAN NES AHMEUniversity Hospital Hamburg- DR. JOHAN NES AHME
Eppendorf DR. HEINZ-PETER MUTHEppendorf DR. HEINZ-PETER MUTH
DR. BERND JANSSENDR. BERND JANSSEN
Martinistr. 52 DR. ALBRECHT von MENGESMartinistr. 52 DR. ALBRECHT by MENGES
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20246 Hamburg DR. PETER WIEGELEBEN20246 Hamburg DR. PETER WIEGELEBEN
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RECHTSANWÄLTELAWYERS
DR. FRANK DETTMANNDR. FRANK DETTMANN
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M ÜNCHENMUNICH
EUROPEAN PATENT ATTORNEYS EUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYS DIPL.-ING. LARS MANKE DR. OLGA BEZZUBOVA DR. SOLVEIG MOREEUROPEAN PATENT ATTORNEYS EUROPEAN TRADEMARK ATTORNEYS DIPL.-ING. LARS MANKE DR. OLGA BEZZUBOVA DR. SOLVEIG MORE
P 77526 16.05.2008P 77526 16.05.2008
Verwendung von Autoantikörpern gegen CD28 als prognostischerUse of autoantibodies to CD28 as prognostic
Marker beim malignen MelanomMarker in malignant melanoma
1. Gegenstand der Erfindung1. Subject of the invention
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom, bei dem man eine Probe von einem Patienten auf das Vorhandensein von anti-CD28 Autoantikörpern untersucht, indem man die Probe mit CD28 in Kontakt bringt, wobei eine Bindung der Autoantikörper an CD28 auf eine signifikant schlechtere Überlebensprognose des Patienten mit malignem Melanom hinweist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von CD28 als Nachweisreagenz für anti-CD28 Autoantikörper zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom undThe present invention relates to a method for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma, in which a sample from a patient is examined for the presence of anti-CD28 autoantibodies by bringing the sample into contact with CD28, wherein a binding of the autoantibodies to CD28 indicates a significantly worse survival prognosis of the patient with malignant melanoma. The invention further relates to the use of CD28 as a detection reagent for anti-CD28 autoantibodies for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma and
M ÜNCHEN : TEL. : (089) 290 91 7-0 F AX : (089) 290 917-88 PO STMÄSTER@UEX.DE WWW.UEX.DE HAM BURG: TEL. : (040) 899 654-0 FAX : (040) 899 654-88 BE S ELERSTRASSE 4 D-22607 HAMBURG
ein zu diesem Zweck gedachtes Kit, das CD28 und markierte an- ti-Immunglobulin-Antikörper umfaßt .MUNICH: TEL. : (089) 290 91 7-0 F AX: (089) 290 917-88 PO STMÄSTER@UEX.DE WWW.UEX.DE HAM BURG: TEL. : (040) 899 654-0 FAX: (040) 899 654-88 BE S ELERSTRASSE 4 D-22607 HAMBURG a kit designed for this purpose comprising CD28 and labeled anti-immunoglobulin antibodies.
2. Stand der Technik2. State of the art
Das maligne Melanom ist ein äußerst aggressiver Tumor, der von den Melanozyten in der Haut oder anderen Organen ausgeht und frühzeitig metastasiert . Die Standardtherapie des malignen Melanoms besteht in der möglichst frühzeitigen Exzision des Primärtumors. In den fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung gibt es einige unspezifische Parameter, die die Prognose des Krankheitsverlaufs sowie der Überlebensrate beeinflussen. Dazu gehört die Erhöhung der Laktatdehydrogenase (LDH) im Serum sowie eine schlechter Allgemeinzustand. Spezifische Prognoseparameter, die zum Beispiel mit bestimmten Funktionen des Immun- systems assoziiert sind, wurden bisher nicht beschrieben (Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ et al. Final Version of the American Joint Committee on Cancer Staging System for cutane- ous melanoma. J Clin Oncol 2001; 19: 3635-48.). Als Tumormarker hat sich in den letzten Jahren der Nachweis des SlOO Proteins im Serum etabliert. Wie bei anderen Tumormarkern auch ist SlOO allerdings nur als Verlaufsparameter bei Patienten mit weit fortgeschrittenen Melanomen geeignet und gibt lediglich Hinweise auf ein Tumorrezidiv. Die Prognose des einzelnen Patienten ist nicht mit der Höhe der S100-Spiegel im Serum korreliert (Harpio R, Einarsson R. SlOO proteins as Cancer biomarkers with focus on SlOOB in malignant melanoma. Clin Biochem 2004; 37: 512-8) .
Um bei Patienten mit malignem Melanom eine Prognose bezüglich des Gesamtüberlebens stellen zu können, besteht ein Bedarf, ein entsprechendes Diagnoseverfahren bereit zu stellen. Da das Melanom im fortgeschrittenen Stadium eine lebensbedrohliche Erkrankung ist, die sehr häufig zum Tod des Patienten führt, ist die Prognose von wesentlicher Bedeutung, um das weitere Therapieschema entsprechend darauf abzustellen und Therapiemaßnahmen zu ergreifen, die geeignet sind, die Überlebensprognose zu verbessern. Praktische Konsequenzen aus der Prognose können zum Beispiel eine intensivierte klinische Überwachung und Diagnostik bei Patienten mit CD28-positivem Autoantikörper-Status (CD28+ Ak-Status), möglicherweise das Absetzen der IFNα-Therapie oder sogar eine immunsuppressive Therapie sein.Malignant melanoma is an extremely aggressive tumor that starts from the melanocytes in the skin or other organs and prematurely metastasizes. The standard therapy of malignant melanoma is the earliest possible excision of the primary tumor. In the advanced stages of the disease, there are some nonspecific parameters that influence the prognosis of disease progression and survival. These include the increase in lactate dehydrogenase (LDH) in the serum and a poor general condition. Specific prognosis parameters associated, for example, with certain functions of the immune system have not previously been described (Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ et al., Final Version of the American Joint Committee on the Cancer Staging System for cutaneous ous melanoma Clin Oncol 2001; 19: 3635-48.). As a tumor marker, the detection of the SlOO protein in serum has become established in recent years. As with other tumor markers, however, SlOO is only suitable as a course parameter in patients with advanced melanoma and is merely indicative of tumor recurrence. The prognosis of the individual patient is not correlated with the level of S100 levels in the serum (Harpio R, Einarsson R. SlOO proteins as cancer biomarkers with focus on SlOOB in malignant melanoma, Clin Biochem 2004; 37: 512-8). In order to be able to predict overall survival in patients with malignant melanoma, there is a need to provide a corresponding diagnostic procedure. Since advanced melanoma is a life-threatening disease that very often leads to the death of the patient, the prognosis is essential in order to remedy the further therapy regimen and to take therapeutic measures that are likely to improve the survival prognosis. Practical consequences of the prognosis may be, for example, intensified clinical monitoring and diagnostics in patients with CD28-positive autoantibody status (CD28 + Ab status), possibly cessation of IFNα therapy, or even immunosuppressive therapy.
Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt erstmals ein Verfahren zur Verfügung, mit dem sich die Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom semiquantitativ bestimmen' lässt.The present invention satisfies this need and provides for the first time a method is available, with which semi-quantitatively determine the survival prognosis in patients with malignant melanoma 'leaves.
3. Detaillierte Beschreibung der Erfindung3. Detailed description of the invention
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom, bei dem man eine Probe von einem Patienten auf das Vorhandensein von anti-CD28 Autoantikörpern untersucht, indem man die Probe mit CD28 in Kontakt bringt, wobei eine Bindung der Autoantikörper an CD28 auf eine - im Vergleich zu Patienten ohne anti-CD28 Autoantikörper - signifikant schlechtere Überlebensprognose des Patienten mit malignem Melanom hinweist.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen CD28 in Patientenproben, vorzugsweise im Plasma und besonders bevorzugt im Serum von Patienten mit malignem Melanom, ein statistisch signifikanter Marker für die Prognose hinsichtlich des Gesamtüberlebens der Patienten ist. Diese Autoantikörper treten vermehrt bei Hochrisiko-Melanompatienten auf, die adjuvant mit Interferon-alpha (IFNα) behandelt werden und verschlechtern bei diesen Patienten auch das Gesamtüberleben. Daher stellt die Diagnostik von Autoantikörpern gegen CD28 einen neuen Parameter für differenzierte Therapieentscheidungen und für die Prognose bei Patienten mit malignem Melanom dar. Das heißt, dass man erfindungsgemäß anti-CD28 Autoantikörper als prognostischen Marker zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom verwendet.The present invention relates to a method for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma, in which a sample from a patient is examined for the presence of anti-CD28 autoantibodies by bringing the sample into contact with CD28, wherein a binding of the autoantibodies to CD28 on a - in comparison to patients without anti-CD28 autoantibodies - significantly worse survival prognosis of the patient with malignant melanoma indicates. The present invention is based on the surprising discovery that the presence of autoantibodies to CD28 in patient samples, preferably in plasma, and more preferably in the serum of patients with malignant melanoma, is a statistically significant marker for the prognosis of overall patient survival. These autoantibodies are increasingly found in high-risk melanoma patients who are adjuvantly treated with interferon alpha (IFNα) and also worsen overall survival in these patients. Therefore, the diagnosis of autoantibodies to CD28 represents a new parameter for differentiated therapy decisions and for the prognosis in patients with malignant melanoma. That is, according to the invention anti-CD28 autoantibodies are used as prognostic markers for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
Unter „Überlebensprognose" wird vorliegend sowohl das progressionsfreie Überleben (PFS) als auch das Gesamtüberleben (OS) der Patienten verstanden.."Survival prognosis" is understood herein to mean both progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of the patients.
Die Erkenntnis, dass das Vorhandensein von anti-CD28 Autoantikörpern ein statistisch signifikanter, prognostischer Marker bei Patienten mit malignem Melanom ist, ist umso überraschender, als das Auftreten von verschiedenen Autoantikörpern oder von Autoimmunerkrankungen unter der adjuvanten Immuntherapie mit IFNα - die sich inzwischen in Stadien mit großen Primärme- lanomen oder regionärer Metastasierung als Standardtherapie etabliert hat (Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ et al., a.a.O.; Kirkwood JM, Strawderman MH, Ernstoff MS et al . Interferon alfa-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous mela- noma: the Eastern Cooperative Oncology Group .Trial EST 1684. J
Clin Oncol 1996; 14: 7-17) - die Prognose von Melanompatienten mit hohem Metastasierungsrisiko statistisch signifikant verbessert (Gogas H, Ioannovich J, Dafni U et al. Prognostic sig- nificance of autoimmunity during treatment of melanoma with interferon. N Engl J Med 2006; 354: 709-18) . Im Fall des malignen Melanoms hingegen verringert sich das progressionsfreie Überleben (PFS) signifikant, und das Gesamtüberleben (OS) der Patienten verringert sich hochsignifikant.The finding that the presence of anti-CD28 autoantibodies is a statistically significant prognostic marker in patients with malignant melanoma is even more surprising than the occurrence of various autoantibodies or autoimmune diseases under adjuvant immunotherapy with IFNα - which is now in stages has established major primary melanomas or regional metastases as a standard therapy (Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ et al., supra; Kirkwood JM, Strawderman MH, Ernstoff MS et al., Interferon alfa-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous mela - noma: the Eastern Cooperative Oncology Group. Trial EST 1684. J Clin Oncol 1996; 14: 7-17) - the prognosis of melanoma patients with a high risk of metastasis was statistically significantly improved (Gogas H, Ioannovich J, Dafni U et al., Prognostic nificance of autoimmunity during the treatment of melanoma with interferon.) N Engl J Med 2006; 709-18). In the case of malignant melanoma, on the other hand, progression-free survival (PFS) is significantly reduced, and overall survival (OS) of patients is significantly reduced.
Die Erfindung umfasst den semiquantitativen Nachweis von humanen Autoantikörpern gegen CD28 in Patientenproben, vorzugsweise in Blutproben oder im Plasma und besonders bevorzugt im Serum von Patienten mit malignem Melanom, mit Hilfe eines ELI- SAs, der hierin näher beschrieben ist.The invention encompasses the semiquantitative detection of human autoantibodies to CD28 in patient samples, preferably in blood samples or in plasma, and more preferably in the serum of patients with malignant melanoma, using an ELISA described further herein.
Bei Melanompatienten im Stadium III ist der Nachweis von Autoantikörpern gegen CD28 mit einem signifikant verschlechterten Gesamtüberleben verbunden. Das gleichzeitige Vorhandensein von anderen Autoantikörpern (ANA, anti-Schilddrüsen-Ak) , die möglicherweise die Prognose verbessern, kann diesen prognostisch ungünstigen Effekt nur unwesentlich ausgleichen.In stage III melanoma patients, detection of autoantibodies to CD28 is associated with significantly decreased overall survival. The concomitant presence of other autoantibodies (ANA, anti-thyroid antibodies), which may improve the prognosis, can only marginally offset this prognostically unfavorable effect.
Die Erfindung ermöglicht es erstmals, Melanompatienten mit einer schlechteren Überlebensprognose zu identifizieren und daraus therapeutische Konsequenzen abzuleiten. Zum einen sollten Patienten, die Autoantikörper gegen CD28 im Serum haben, keine Therapie mit IFNα erhalten, weil dadurch noch höhere Serumti- ter der Autoantikörper gegen CD28 induziert werden können. Zum anderen sollte bei Patienten, die unter einer IFNα-Therapie Autoantikörper gegen CD28 entwickeln, die ■ Immuntherapie abge-
brochen werden. Alternativ käme auch der Einsatz von z.B. In- terleukin-2 (IL2) oder Chemotherapie in Betracht.The invention makes it possible for the first time to identify melanoma patients with a poorer survival prognosis and to deduce therapeutic consequences therefrom. On the one hand, patients who have autoantibodies to CD28 in serum should not receive treatment with IFNα, because it can induce even higher serum titers of autoantibodies to CD28. On the other hand should be in patients who develop autoantibodies to CD28 under IFNa therapy, off the ■ immunotherapy be broken. Alternatively, the use of, for example, interleukin-2 (IL2) or chemotherapy could also be considered.
Im Rahmen dieser Erfindung wird als CD28 ein CD28-Molekül ganzer Länge gemäß SEQ ID NO:1 oder ein extrazelluläres Fragment davon gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 bezeichnet, das von anti-CD28 Autoantikörpern erkannt werden kann. Das extrazelluläre Fragment von CD28 umfasst die in CD28 ganzer Länge vorkommenden Aminosäuren mit Ausnahme des intrazellulären Teils und der transmembranen Region. Die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 beschreibt die Sequenz des humanen extrazellulären Fragments, und SEQ ID NO: 2 ein um insgesamt fünf Aminosäuren kürzeres Fragment .In the context of this invention, a CD28 molecule of full length according to SEQ ID NO: 1 or an extracellular fragment thereof according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 is designated as CD28, which can be recognized by anti-CD28 autoantibodies. The extracellular fragment of CD28 comprises the full-length CD28 amino acids except the intracellular part and the transmembrane region. The sequence according to SEQ ID NO: 6 describes the sequence of the human extracellular fragment, and SEQ ID NO: 2 a shorter by a total of five amino acids fragment.
Die Sequenz von humanem CD28 ganzer Länge ist in SEQ ID NO: 1 angegeben. Neben humanen CD28-Molekülen oder Fragmenten davon sind jedoch auch CD28-Proteine oder Fragmente davon aus anderen Spezies im Rahmen dieser Erfindung umfasst, wie z.B. aus Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Hund, Katze, Pferd oder Rind (sogen. Speziesvarianten).The full length human CD28 sequence is given in SEQ ID NO: 1. However, in addition to human CD28 molecules or fragments thereof, CD28 proteins or fragments thereof from other species are also included within the scope of this invention, e.g. from mouse, rat, rabbit, guinea pig, dog, cat, horse or cow (so-called species variants).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind neben den extrazellulären Fragmenten gemäß SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 2 auch Fragmente (Teile) dieser Sequenzen eingeschlossen, d.h. Teilsequenzen dieser explizit genannten Fragmente, die ebenso wie die längeren CD28-Fragmente zum Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern geeignet sind. Erfindungsgemäß ebenfalls eingeschlossen sind Derivate dieser Fragmente und Teilsequenzen, die sich von diesen durch Austausch einzelner, vorzugsweise weniger Aminosäuren unterscheiden. Dabei werden selbstver-
ständlich solche Sequenzvarianten gewählt, die nach wie vor zum' Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern geeignet sind. Vorzugsweise werden solche kürzeren Teile des extrazellulären CD28-Fragments oder Sequenzvarianten derselben gewählt, die noch eine ausreichende, vorzugsweise hohe Spezifität und/oder Selektivität beim Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern ermöglichen.In the context of the present invention, in addition to the extracellular fragments according to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 2 also fragments (parts) of these sequences are included, ie partial sequences of these explicitly mentioned fragments, which as well as the longer CD28 fragments for the detection of anti -CD28 autoantibodies are suitable. Also included within the scope of the invention are derivatives of these fragments and partial sequences that differ from them by substitution of single, preferably fewer, amino acids. Self-proclaimed comprehensible such sequence variants selected which are still suitable for 'detection of anti-CD28 autoantibodies. Preferably, those shorter parts of the extracellular CD28 fragment or sequence variants thereof are selected which still allow a sufficient, preferably high specificity and / or selectivity in the detection of anti-CD28 autoantibodies.
Das CD28-Molekül ganzer Länge oder extrazelluläre Fragmente davon können Teil eines Fusionsproteins sein. Bevorzugt umfaßt das Fusionsprotein ferner Glutathion-S-Transferase oder ein Histidin-Tag, wobei dies besonders zur Aufreinigung des rekom- binanten Proteins hilfreich ist. Grundsätzlich kann CD28 aus Zellen aufgereinigt oder rekombinant hergestellt sein. Das Fusionsprotein kann einen Ig (Immunglobulin) -Teil umfassen, es ist jedoch bevorzugt, daß dieser nicht in dem Fusionsprotein enthalten ist, so daß Schwierigkeiten mit möglicher Kreuzreaktivität von im Patentientenserum vorkommenden Autoantikörpern gegen den Ig-Teil vermieden werden. CD28 kann jedoch aus CD28- Ig-Fusionsmolekülen abgespalten werden, z.B. mit Trypsin.The full length CD28 molecule or extracellular fragments thereof may be part of a fusion protein. Preferably, the fusion protein further comprises glutathione S-transferase or a histidine tag, which is particularly helpful for the purification of the recombinant protein. In principle, CD28 can be purified from cells or prepared recombinantly. The fusion protein may comprise an Ig (immunoglobulin) moiety, but it is preferred that it is not included in the fusion protein so as to avoid difficulties with possible cross-reactivity of autoantibodies found in the patent serum to the Ig moiety. However, CD28 can be cleaved from CD28-Ig fusion molecules, e.g. with trypsin.
Die Probe eines Patienten ist bevorzugt eine Blutprobe oder eine Serumprobe. Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Allgemeinen in vitro durchgeführt.The sample of a patient is preferably a blood sample or a serum sample. The method according to the invention is generally carried out in vitro.
Bevorzugt ist CD28 an einen Träger gebunden. Ein solcher fester Träger kann z.B. eine ELISA-Platte, ein magnetisches Kü- gelchen oder eine Blotfolie, z.B. eine Nitrozellulosefolie, sein. Als Träger werden im Rahmen der Erfindung auch Zellen bezeichnet, die CD28 natürlicherweise oder rekombinant an ihrer Oberfläche exprimieren. CD28 kann direkt an den Träger ge-
bunden, oder, z.B. über Antikörper, insbesondere Antikörper gegen einen mit CD28 verbundenen Tag, wie Glutathion-S- Transferase, an einen Träger gekoppelt werden. Diese Antikörper sind keine humanen Antikörper, um Kreuzreaktionen mit sekundären Antikörpern zu verhindern.Preferably, CD28 is bound to a carrier. Such a solid support may be, for example, an ELISA plate, a magnetic bead or a blot foil, eg a nitrocellulose foil. In the context of the invention, carriers are also referred to as carriers which express CD28 naturally or recombinantly on their surface. CD28 can be sent directly to the wearer or, for example, antibodies, in particular antibodies to a CD28-associated tag such as glutathione-S-transferase, to a carrier. These antibodies are not human antibodies to prevent cross-reactions with secondary antibodies.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bindung von anti-CD28 Autoantikörpern an CD28 untersucht, indem man den Träger mit markierten anti-Immunglobulin- Antikörpern gegen Antikörper der Spezies, der der Patient angehört, kontaktiert, und man die markierten Antikörper nachweist. Beispielsweise kann der Patient ein Mensch sein. In diesem Fall wird bevorzugt humanes CD28 verwendet, und die an- ti-Immunglobulin-Antikörper sind anti-humane Immunglobulin- Antikörper .In a preferred embodiment of the invention, the binding of anti-CD28 autoantibodies to CD28 is assayed by contacting the support with labeled anti-immunoglobulin antibodies to antibodies of the species to which the patient belongs, and detecting the labeled antibodies. For example, the patient may be human. In this case, human CD28 is preferably used and the anti-immunoglobulin antibodies are anti-human immunoglobulin antibodies.
Bevorzugt sind die anti-Immunglobulin-Antikörper spezifisch für Antikörper des IgG-Isotyps, sie können jedoch auch gegen IgG und IGM und/oder IgE reaktiv sein.Preferably, the anti-immunoglobulin antibodies are specific for antibodies of the IgG isotype, but they may also be reactive against IgG and IGM and / or IgE.
Bevorzugt sind die anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym, beispielsweise Alkalischer Phosphatase oder Meerrettich- Peroxidase, Biotin, einem radioaktiven Isotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. Fluoresceinisothiozyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) markiert.Preferably, the anti-immunoglobulin antibodies are with an enzyme, for example, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye, e.g. Fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE).
Die Untersuchung kann in einem Blot, z.B. einem Dotblot oder einem Westernblot, einem ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) , einem RIA (Radioimmunoassay) , einer FACS (Fluorescence activated cell sorting) -Untersuchung oder auch in einem Flüs- sigphasendetektionssystem durchgeführt werden. Sind die Träger
Zellen, so findet die nachfolgende Untersuchung der Bindung bevorzugt im FACS oder fluoreszenzmikroskopisch statt.The examination can be carried out in a blot, for example a dot blot or a Western blot, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), an RIA (radioimmunoassay), a fluorescence activated cell sorting (FACS) examination or also in a liquid phase detection system. Are the carriers Cells, the subsequent investigation of the binding preferably takes place in FACS or fluorescence microscopy.
Ebenfalls wird ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt. Bevorzugt umfasst dieses Kit CD28 und markierte anti-Immunglobulin-Antikörper .Also provided is a kit for carrying out the method according to the invention. Preferably, this kit comprises CD28 and labeled anti-immunoglobulin antibodies.
Das CD28 umfasst bevorzugt ein CD28-Molekül ganzer Länge gemäß SEQ ID NO :1 oder ein extrazelluläres Fragment davon gemäß SEQ ID NO: 2. Bevorzugt handelt es sich um humanes CD28 und markierte anti-humane Immunglobulin-Antikörper, insbesondere anti-humane IgG-Antikörper .The CD28 preferably comprises a full length CD28 molecule according to SEQ ID NO: 1 or an extracellular fragment thereof according to SEQ ID NO: 2. Preferably, these are human CD28 and labeled anti-human immunoglobulin antibodies, in particular anti-human IgG Antibodies.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Kit ferner markierte anti-IgE-Antikörper und ist damit dazu geeignet, diagnostische Tests zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom sowohl auf Basis der Feststellung der Konzentration an Gesamt-IgE als auch auf Basis des Nachweises von CD28 Autoantikörpern durchzuführen, da hohe IgE-Spiegel ein Indiz dafür sein können, dass eine geringere Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung eines Melanoms besteht. Das Kit kann weiterhin unmarkierte anti-IgE- Antikörper umfassen, so dass der Test auf Gesamt-IgE als Sand- wich-ELISA durchgeführt werden kann. Die unmarkierten Antikörper können polyklonale anti-IgE-Antikörper sein, die markierten anti-IgE-Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Alternativ können die markierten und die unmarkierten anti-IgE Antikörper beide jeweils monoklonale Antikörper sein, die jedoch gegen ein unterschiedliches Epitop gerichtet sein müssen.
Die in dem Kit enthaltenen markierten Antikörper können mit einem Enzym, z.B. alkalischer Phosphatase oder Meerrettich- Peroxidase, Biotin, einem radioaktiven Isotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. FITC oder PE, markiert sein.In a preferred embodiment, the kit of the invention further comprises labeled anti-IgE antibodies and is therefore useful for diagnostic assays for determining survival prognosis in patients with malignant melanoma, based both on the determination of total IgE concentration and on the detection of CD28 autoantibodies, as high IgE levels may be an indication that there is less likelihood of melanoma development. The kit may further comprise unlabeled anti-IgE antibodies so that the assay for total IgE can be performed as a sandwich ELISA. The unlabeled antibodies may be polyclonal anti-IgE antibodies, the labeled anti-IgE antibodies may be polyclonal or monoclonal. Alternatively, the labeled and unlabeled anti-IgE antibodies can both be monoclonal antibodies, but must be directed against a different epitope. The labeled antibodies contained in the kit can be labeled with an enzyme, eg alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye, eg FITC or PE.
Schließlich betrifft die Erfindung noch die Verwendung von an- ti-CD28 Autoantikörpern als prognostischer Marker zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom und somit die Verwendung eines hierin beschriebenen Kits zur Bestimmung von anti-CD28 Autoantikörpern als prognostischer Marker für die Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom.Finally, the invention also relates to the use of anti-CD28 autoantibodies as a prognostic marker for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma and thus the use of a kit described herein for the determination of anti-CD28 autoantibodies as a prognostic marker for the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert.The present invention will be further explained by way of examples.
BEISPIELEEXAMPLES
Anti-CD28 Autoantikörper sind durch verschiedene Methoden nachweisbar, wie z.B. durch Blot-Techniken (Beispiel 1).Anti-CD28 autoantibodies are detectable by various methods, such as e.g. by blotting techniques (Example 1).
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden Seren von Melanom- patienten mit hohem Metastasierungsrisiko, d.h. in den Stadien II und III (AJCC 2002), mit einem ELISA zum Nachweis von Autoantikörpern gegen CD28 untersucht (Beispiel 3) . Dabei wurde ein Fusionsprotein von CD28 mit Glutathion-S-Transferase verwendet (Beispiel 2).
Beispiel 1 ;In a preferred embodiment, sera from melanoma patients with a high metastatic risk, ie at stages II and III (AJCC 2002), were tested with an ELISA for the detection of autoantibodies to CD28 (example 3). In this case, a fusion protein of CD28 with glutathione-S-transferase was used (Example 2). Example 1 ;
Enzymatisσhe Spaltung des rekombinaten CD28-Ig Pusionsprotein mit Trypsin und Nachweis von Autoantikörpern gegen CD28 im Im- munoblotEnzymatic cleavage of the recombinant CD28-Ig fusion protein with trypsin and detection of autoantibodies to CD28 in the immunoblot
Das rekombinante CD28-Ig Fusionsprotein (R & D Systems Inc. Minneapolis, USA) wurde in PBS-Puffer (2,7 M NaCl, 54 mM KCl, 87 mM Na2HPO4, 30 mM KHPO4, pH7,4) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und 100 μl dieser Lösung wurden mit 50 μl Trypsin (10 mg/ml) bei 370C für 15 Minuten verdaut. Am Ende der Inkubationszeit wurden 1,5 μl Aprotinin (10 mg/ml) und 2,5 μl TLCK (Nα-p-Tosyl-L-lysin-chlormethylketon, 20 mg/ml) hinzugefügt, um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu hemmen. Die Lösung kann bis zum weiteren Gebrauch bei -200C gelagert werden.The recombinant CD28-Ig fusion protein (R & D Systems Inc. Minneapolis, USA) was incubated in PBS buffer (2.7M NaCl, 54mM KCl, 87mM Na 2 HPO 4 , 30mM KHPO 4 , pH 7.4) dissolved at a concentration of 1 mg / ml and 100 .mu.l of this solution were digested with 50 .mu.l trypsin (10 mg / ml) at 37 0 C for 15 minutes. At the end of the incubation period, 1.5 μl aprotinin (10 mg / ml) and 2.5 μl TLCK (Nα-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone, 20 mg / ml) were added to inhibit the enzymatic activity of trypsin , The solution can be stored at -20 0 C until further use.
Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen (SDS-PAGE) wird nach der Methode von Lughtenberg et al . (Lughtenberg, B. (1975), FEBS Lett. 58, 254) durchgeführt. Die Spaltprodukte wurden durch SDS-GeI Elektrophorese (10%iges Gel) mit einem 4% Sammelgel (110 V, 150 Minuten) unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Anschließend wurden die Spaltprodukte bei einer Stromstärke von 50 mA 3 Stunden lang auf PVDF (Po- lyvinylidenfluorid) -Membranen (Segin-Blot, Biorad, Germany) transferriert . Anschließend wurden die Membranen mit 5% Magermilchpulver für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und mit PBS dreimal gewaschen.The gel electrophoretic separation of proteins (SDS-PAGE) is carried out according to the method of Lughtenberg et al. (Lughtenberg, B. (1975), FEBS Lett. 58, 254). The cleavage products were separated by SDS-Gel electrophoresis (10% gel) with a 4% stacking gel (110V, 150 minutes) under non-reducing conditions. Subsequently, the fission products were transferred at a current of 50 mA for 3 hours to PVDF (polyvinylidene fluoride) membranes (Segin-Blot, Biorad, Germany). Subsequently, the membranes were blocked with 5% skimmed milk powder for 60 minutes at room temperature and washed with PBS three times.
Die Sensitivität und Spezifität des Immunblots wurde mit den folgenden Antikörpern kontrolliert: monoklonaler Maus antihuman CD28 Antikörper (R&D Systems, Minneapolis, USA), 1:5.000
in PBS verdünnt, biotinylierter polyklonaler Maus anti-human CD28 Antikörper (R&D Systems, Minneapolis, USA), 1:5.000 in PBS verdünnt, monoklonaler Maus anti-human Fc Antikörper (Dianova, Hamburg, Germany) , 1:10.000 in PBS verdünnt, und polyklonaler Kaninchen anti-human IgG Antikörper (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), 1: 3.500 in PBS verdünnt.The sensitivity and specificity of the immunoblot was monitored with the following antibodies: mouse monoclonal antihuman CD28 antibody (R & D Systems, Minneapolis, USA), 1: 5,000 diluted in PBS, biotinylated polyclonal mouse anti-human CD28 antibody (R & D Systems, Minneapolis, USA), diluted 1: 5,000 in PBS, monoclonal mouse anti-human Fc antibody (Dianova, Hamburg, Germany), diluted 1: 10,000 in PBS, and polyclonal rabbit anti-human IgG antibody (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), diluted 1: 3,500 in PBS.
Ein Spaltprodukt des CD28-Ig Fusionsproteins wird eindeutig nur von den Anti-CD28 Antikörpern erkannt, nicht aber von Antikörpern gegen IgG oder Fc.A cleavage product of the CD28-Ig fusion protein is clearly recognized only by the anti-CD28 antibodies, but not by antibodies to IgG or Fc.
Zum Nachweis der Autoantikörper gegen CD28 im Serum wurden die in Streifen geschnittenen PVDF-Membranen in 1:10 verdünntem humanem Serum für 1 Stunde auf einem Schwenktisch bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrollen dienten spezifische Antise- ren gegen humanes Fc (Dianova, Hamburg) und humanes CD28For detection of autoantibodies to CD28 in serum, the PVDF membranes cut into strips were incubated in 1:10 diluted human serum for 1 hour on a swivel table at room temperature. Specific antisera to human Fc (Dianova, Hamburg) and human CD28 were used as controls
(R&D, Wiesbaden) . Anschließend wurden die Blots wieder dreimal gewaschen und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem sekundären, AP-konjugierten Antikörper gegen humanes IgG(R & D, Wiesbaden). The blots were then washed again three times and then at room temperature for 1 hour with a secondary, AP-conjugated antibody to human IgG
(Fa. Serva, Heidelberg) inkubiert. Die Bindung wurd durch eine enzymatische Farbreaktion (BCIP/NBT, 5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate/ p-nitroblue tetrazolium Chloride) sichtbar gemacht .(Serva, Heidelberg). The binding was visualized by an enzymatic color reaction (BCIP / NBT, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / p-nitroblue tetrazolium chloride).
Mit Hilfe des Immunoblots können im Serum spezifische IgG- Antikörper gegen CD28 nachgewiesen werden.
Beispiel 2 :Using the immunoblot, specific IgG antibodies to CD28 can be detected in the serum. Example 2:
Herstellung eines CD28-GST-FusionsproteinsPreparation of a CD28-GST fusion protein
RNA-Präparation aus humanem VollblutRNA preparation from human whole blood
Zunächst wurde aus humanem Vollblut mit Hilfe des QIAamp RNA Blood Mini-Kit der der Firma Qiagen (Hilden, Katalognummer: 52304) RNA präpariert.First, RNA was prepared from human whole blood with the help of the QIAamp RNA Blood Mini-Kit from Qiagen (Hilden, catalog number: 52304).
RT-PCR zur Herstellung von cDNART-PCR for the production of cDNA
5 μg der präparierten RNA wurden mit dem superscript-Kit (In- vitrogen, Karlsruhe) mit random hexamer-Primexn (Katalognummer: 53034) in Blut-cDNA umgeschrieben.5 μg of the prepared RNA were transcribed into blood cDNA with the superscript kit (Invitrogen, Karlsruhe) with random hexamer-primexn (catalog number: 53034).
Klonierung der CD28 cDNACloning of the CD28 cDNA
Anschließend wurde der für den extrazellulären Bereich (IgG- artige Domäne, ohne Transmembranregion und Signalpeptid) dieses Proteins kodierende cDNA-Bereich mit Hilfe einer Polyme- rasekettenreaktion (PCR) amplifiziert . Als Referenz diente die online bei NCBI abfragbare Sequenz NM_006139 (SEQ ID NO: 3) .Subsequently, the cDNA region coding for the extracellular region (IgG-like domain, without transmembrane region and signal peptide) of this protein was amplified by means of a polymerase chain reaction (PCR). The reference NM_006139 (SEQ ID NO: 3), which can be queried online at NCBI, served as a reference.
Die amplifizierte cDNA kodiert für die Aminosäuresequenz: PSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNY- SQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTI- IHVKGKHLCPSPLF (SEQ ID NO: 2)The amplified cDNA encodes the amino acid sequence: PSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNY- SQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKVYPPPYLDNEKSNGTI- IHVKGKHLCPSPLF (SEQ ID NO: 2)
Als Primer dienten:As primers served:
Sense 5 ' -AAAGÄÄTTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAAC-3 'Sense 5 '-AAAGÄÄTTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAAC-3'
(SEQ ID NO: 4) Antisense 5 ' -AAACCCGGGAÄATAGGGGACTTGGACAAAG-3 '(SEQ ID NO: 4) Antisense 5 '-AAACCCGGGAAATAGGGGACTTGGACAAAG-3'
(SEQ ID NO: 5)
Die Integration der cDNA in die multiple-cloning-site des Vektors pGEX-4T-l (Amersham Biosciences, Freiburg, Katalognummer: 27-4580-01) erfolgte über Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI und Sinai, die bereits in die zur Amplifikation eingesetzten Primer 5' integriert waren (in der Primersequenz unterstrichen) . Dazu wurde das PCR-Amplifikat ebenso wie der Vektor pGEX-4T-l zunächst mit Smal (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Katalognummer: #RO141S) und anschließend mit EcoRI (New England Biolabs, Katalognummer #R010lS) im Reaktionspuffer NEB4 bei 20 °C bzw. 37 "C für jeweils zwei Stunden inkubiert. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung der geschnittenen DNA über das Agarose Gel DNA Extraction-Kit der Firma Roche (Basel, Katalognummer: 1696505) . Der linearisierte Vektor wurde anschließend dephosphoryliert, wozu die eluierte DNA bei 37 °C mit 10 U alkalischer Phosphatase (Roche, Katalognummer: 713023) nach Zugabe des entsprechenden Puffers inkubiert wurde. Die Restriktionsansätze wurden anschließend in einem einprozentigen Agarose-Gel bei 100 V aufgetrennt. Nach Ethidi- um-Bromid-Färbung konnte eine Bande von ca. 400 bp auf einem UV-Transilluminator visualisiert und ausgeschnitten werden. Die geschnittene cDNA wurde dann mit Hilfe des Roche Agarose- gel-Elution kits in 50 μl H2O eluiert. Anschließend wurde ein Ligationsansatz mit T4-Ligase (Invitrogen, Katalognummer: Elll-01), 100 ng Vektor und 200 ng cDNA-Fragment angesetzt und bei 120C mehrere Stunden inkubiert. Hieraus ergibt sich ein Konstrukt, bei dem die Glutathion S-Transferase 5'-wärts des im Leserahmen befindlichen CD28-Bereichs liegt.(SEQ ID NO: 5) The integration of the cDNA into the multiple cloning site of the vector pGEX-4T-1 (Amersham Biosciences, Freiburg, catalog number: 27-4580-01) was carried out via cleavage sites for the restriction enzymes EcoRI and Sinai, which are already inserted into the primers used for the amplification 5 'were integrated (underlined in the primer sequence). For this purpose, the PCR amplificate, just like the vector pGEX-4T-1, was first mixed with Smal (New England Biolabs, Frankfurt aM, catalog number: # RO141S) and then with EcoRI (New England Biolabs, catalog number # R0101S) in the reaction buffer NEB4 at 20 ° C and 37 "C were incubated for two hours each, followed by purification of the cut DNA using the Agarose Gel DNA Extraction Kit from Roche (Basel, catalog number: 1696505) .The linearized vector was subsequently dephosphorylated, to which the eluted DNA was added After incubation at 37 ° C. with 10 U alkaline phosphatase (Roche, catalog number: 713023), the restriction batches were subsequently separated in a 1% agarose gel at 100 V. After ethidium bromide staining, a band of 400 bp were visualized and excised on a UV transilluminator, and the cut cDNA was then transformed into 50 μl H 2 using the Roche agarose gel elution kit O. Subsequently, a ligation mixture with T4 ligase (Invitrogen, catalog number: Elll-01), 100 ng of vector and 200 ng cDNA fragment was prepared and incubated at 12 0 C for several hours. This results in a construct in which the glutathione S-transferase is 5'-wards of the in-frame CD28 region.
Anschließend wurden kompetente Bakterien (XLl Blue, HB 101) mit einem Fünftel des Ligationsansatzes transformiert. Dazu wurde zu 50 μl auf Eis aufgetauter kompetenter Bakterien ein
Fünftel eines Ligationsansatzes oder 0,5 μg einer DNS- Präparation hinzupipettiert und 30 min auf Eis inkubiert.Subsequently, competent bacteria (XLI Blue, HB 101) were transformed with one fifth of the ligation mixture. To this was added 50 μl of competent bacteria thawed on ice Pipette one-fifth of a ligation mixture or 0.5 μg of a DNA preparation and incubate on ice for 30 min.
Anschließend wurden die Bakterienansätze 5 min auf 370C erwärmt. Danach wurden 950 μl SOC Medium zugegeben und zwischen 50 μl und 1 ml des Ansatzes auf LB-Agar-Platten mit 150- μg/ml Ampicillin mit einer Pipette gleichmäßig ausgestrichen und über Nacht bei 370C inkubiert.Subsequently, the bacteria mixtures were heated to 37 0 C for 5 min. Thereafter, 950 .mu.l SOC medium were added and uniformly streaked between 50 .mu.l and 1 ml of the batch on LB agar plates with 150 ug / ml ampicillin with a pipette and incubated overnight at 37 0 C.
Minipräparation von Plasmid-DNA aus BakterienMinipreparation of plasmid DNA from bacteria
Einzelne Kolonien transformierter Bakterien wurden in 2,5 ml Medium mit entsprechendem Antibiotikumszusatz angeimpft und über Nacht inkubiert. Die Bakterien wurden dann bei 2400 g pelletiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet in 200 μl STET (8% Sukrose, 5% Triton X-100, 50 inM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA) mit 1 μg/ml Lysozym auf dem Schüttler resuspendiert. Anschließend wurde der Ansatz für 2 Minuten auf 95°C erhitzt und dann 10 min bei 16000g zentrifugiert . Das Sediment wurde nun mit einem Zahnstocher entfernt und verworfen. Dem Überstand wurden 10 μl 5%iger CTAB-Lösung (Cetyl-Trimethyl- Ammoniumbromid) zugegeben, kurz geschüttelt und das Präzipitat bei 16000 g pelletiert. Der Überstand ' wurde abgesaugt und das Pellet in 300 μl 1,2 M NaCl auf dem Schüttler gelöst. Dann wurden 750 μl Ethanol 100% zugegeben, der Ansatz kräftig geschüttelt und bei 10 min bei 16000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, das Pellet nun in 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, 5 min bei 16000 g zentrifugiert und der Überstand erneut verworfen. Das DNA-Pellet wurde nun getrocknet und in 30 μl H2O aufgenommen.
Die Richtigkeit der Sequenz des eingefügten Bereichs erfolgte durch anschließende Sequenzierung.Individual colonies of transformed bacteria were inoculated in 2.5 ml of medium with appropriate antibiotic addition and incubated overnight. The bacteria were then pelleted at 2400 g, the supernatant aspirated and the pellet in 200 μl STET (8% sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA) with 1 μg / ml lysozyme resuspended on the shaker. The batch was then heated to 95 ° C. for 2 minutes and then centrifuged at 16,000 g for 10 minutes. The sediment was now removed with a toothpick and discarded. To the supernatant, 10 μl of 5% CTAB solution (cetyl trimethyl ammonium bromide) was added, shaken briefly and the precipitate pelleted at 16,000 g. The supernatant 'was aspirated and the pellet was dissolved in 300 ul 1.2 M NaCl on the shaker. Then 750 .mu.l of 100% ethanol were added, the batch was shaken vigorously and centrifuged at 16,000 g for 10 min. The supernatant was aspirated, the pellet washed now in 1 ml of 70% ethanol, centrifuged for 5 min at 16000 g and the supernatant discarded again. The DNA pellet was then dried and taken up in 30 μl H 2 O. The correctness of the sequence of the inserted region was carried out by subsequent sequencing.
Präparation des rekombinanten CD28-GST-FusionsproteinsPreparation of the recombinant CD28-GST fusion protein
Kompetente BL21-RILsuppl . Bakterien (ein proteasedefizienter E. coli-Stamm) wurden mit dem cDNA-Konstrukt transformiert und nach halbstündiger Vorinkubation in SOC-Medium bei 37° C auf LB-Agar-Platten mit 150 μg/ml Ampicillin ausgestrichen. Nach 14stündiger Inkubation wurde eine 30 ml LB-Medium mit Ampicillin mit einer Kolonie beimpft.Competent BL21-RILsuppl. Bacteria (a protease-deficient E. coli strain) were transformed with the cDNA construct and streaked after half an hour of pre-incubation in SOC medium at 37 ° C on LB agar plates containing 150 μg / ml ampicillin. After 14 hours of incubation, a 30 ml LB medium was incubated with ampicillin with a colony.
Diese Vorkultur wurde über Nacht bei 370C im Schüttler inkubiert. Diese wurde dann in 500 ml LB-Medium mit Ampicillin überführt und bis zu einer optischen Dichte von 0,6-0,8 bei 600 nm unter ständigem Schütteln bei 370C inkubiert (ca. 1,5 Stunden) .This preculture was incubated overnight at 37 0 C in a shaker. This was then transferred into 500 ml of LB medium with ampicillin and incubated at 600 nm with continuous shaking at 37 ° C. to an optical density of 0.6-0.8 (about 1.5 hours).
Sobald diese Dichte erreicht war, wurde die Proteinexpression mit 1 mM IPTG (Isopropyl bD-thiogalactopyranosid, Biomol, Hamburg, Katalognummer: 05684-1) induziert. Nach ca. 4 Stunden wurden die Bakterien bei 4000g und 40C für 10 Minuten pelletiert, der Kulturüberstand verworfen und das Pellet in 5-10 ml eiskaltem PBS resuspendiert. Diese Suspension wurde nun fünfmal einer Ultraschallbehandlung von je 10 Sekunden Dauer unterzogen (Branson Sonifier 250, Stufe 6) und anschließend 20 Minuten bei 30000 g zentrifugiert . Nun erfolgte die Affinitätsreinigung über den GST-Tag. Glutathion-Sepharose 4B (Amer- sham Biosciences, Katalognummer: 27-4574-01) wurde bis zu einem Bettvolumen von 1 ml in eine gravitationsgetriebene PoIy-
propylensäule geladen und in einem fünffachem Volumen PBS äquilibriert .Once this density was reached, protein expression was induced with 1 mM IPTG (isopropyl bD-thiogalactopyranoside, Biomol, Hamburg, catalog number: 05684-1). After about 4 hours, the bacteria were pelleted at 4000g and 4 0 C for 10 minutes, the culture supernatant was discarded and the pellet resuspended in 5-10 ml ice-cold PBS. This suspension was then subjected to ultrasound treatment of 10 seconds duration (Branson Sonifier 250, step 6) five times and then centrifuged for 20 minutes at 30,000 g. Now the affinity purification was done via the GST-tag. Glutathione-Sepharose 4B (Amer- sham Biosciences, catalog number: 27-4574-01) was added to a bed volume of 1 ml in a gravity-driven poly- propylene column and equilibrated in a five-fold volume of PBS.
Anschließend wurde das Bakterienlysat aufgeladen und der Durchfluss erneut auf die Säule gegeben. Der zweite Durchfluss wurde verworfen und die Säule mit dem fünf- bis zehnfachen des Bettvolumens PBS gewaschen. Eluiert wurde in 10 mM reduziertem Glutathion, 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10% Glycerol. Das eluierte Protein wurde anschließend aliquotiert und bei - 800C aufbewahrt.The bacterial lysate was then charged and the flow re-added to the column. The second flow was discarded and the column washed with five to ten times the bed volume of PBS. Elution was carried out in 10 mM reduced glutathione, 50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10% glycerol. The eluted protein was then aliquoted and stored at - 80 0 C kept.
Benötigte MaterialienRequired materials
PBS 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 7, 4 mM Na2HPO4 1,5 mM KH2PO4 PBS 137mM NaCl 2.7mM KCl 7, 4mM Na 2 HPO 4 1.5mM KH 2 PO 4
STET 8% Sucrose 0,1% Triton X 50 mM EDTA 50 mM Tris pHSTET 8% sucrose 0.1% Triton X 50mM EDTA 50mM Tris pH
TAEx50 2 M Tris Base 5,71% Eisessig 50 mM EDTATAEx50 2M Tris Base 5.71% glacial acetic acid 50mM EDTA
TE 20 mM Tris pH 7,5 1 mM EDTATE 20 mM Tris pH 7.5 1 mM EDTA
Auftragpuffer x 5 40% Sucrose (für Nukleinsäuren) 0,25% BromphenolblauApplication buffer x 5 40% sucrose (for nucleic acids) 0.25% bromophenol blue
0,25% Xylene X in TE
SOC Medium 2% bacto-trypton0.25% of xylenes X in TE SOC medium 2% bacto-tryptone
0,5% Bacto Hefe Extrakt0.5% Bacto yeast extract
10 mM NaCl10 mM NaCl
2,5 UiM KCl2.5 μM KCl
5 N NaOH auf pH 7,05N NaOH to pH 7.0
Autoklavieren und anschließend auf 600C abkühlen.Autoclave and then cool to 60 0 C.
10 mM MgCl2 10 mM Glukose10mM MgCl 2 10mM glucose
Dyt Medium 1, 6% Bacto-tryptoneDyt Medium 1, 6% Bacto-tryptone
1% Bacto Hefe Extrakt1% Bacto yeast extract
100 mM NaCl LB Medium 1% Bacto-tryptone100 mM NaCl LB medium 1% Bacto-tryptone
0,5% Bacto Hefe Extrakt0.5% Bacto yeast extract
200 mM NaCl mit NaOH auf pH 7,5 einstellenAdjust 200 mM NaCl to pH 7.5 with NaOH
Y-broth LB MediumY-broth LB medium
4 mM MgSO4 4 mM MgSO4
5 mM KCl5mM KCl
TFB 1 15% Glycerin 10 mM CaCl2 30 mM Kaliumacetat mit Essigsäure auf pH 5,8 einstellenTFB 1 Adjust 15% glycerol 10 mM CaCl 2 30 mM potassium acetate to pH 5.8 with acetic acid
100 mM RbCl100mM RbCl
50 mM MnCl2 50 mM MnCl 2
TFB 2 15% Glycerin 10 mM MOPS 75 mM CaCl2 10 mM RbCl
LB Medium 1% Bacto-tryptoneTFB 2 15% glycerol 10 mM MOPS 75 mM CaCl 2 10 mM RbCl LB medium 1% Bacto tryptone
0,5% Bacto Hefe Extrakt 200 mM NaCl mit NaOH auf pH 7,5 einstellenAdjust 0.5% Bacto Yeast Extract 200 mM NaCl to pH 7.5 with NaOH
Herstellung kompetenter BakterienProduction of competent bacteria
XLlblue Bakterien wurden auf einer LB-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37° C inkubiert. Morgens wurden einige Kolonien mit je 2 ml Y-broth angeimpft und 2 Stunden bei 370C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurden diese Vorkulturen in 500 ml Y-broth gegossen und bis zu einer OD bei 600 nm von 0,3-0,35 inkubiert. Dann wurde die Kultur auf zwei 50 ml Polypropylen- röhrchen verteilt, kurz auf Eis gestellt und bei 40C und 2000g pelletiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Pellet in je 15 ml in TFB 1 (15% Glycerin, 10 mM CaCl2, 30 mM Kaliumacetat, mit Essigsäure auf pH 5,8 eingestellt, 100 mM RbCl, 50 mM MnCIa) resuspendiert und 60-90 Minuten auf Eis gestellt.XLlblue bacteria were streaked on an LB plate and incubated overnight at 37 ° C. In the morning, some colonies were inoculated with 2 ml of Y-broth and incubated for 2 hours at 37 0 C in a shaker. Subsequently, these precultures were poured into 500 ml Y-broth and incubated to an OD at 600 nm of 0.3-0.35. Then, the culture was spread on two tubes 50 ml polypropylene, placed briefly on ice, and at 4 0 C and pelletized 2000g. The supernatant was decanted, the pellet resuspended in 15 ml each in TFB 1 (15% glycerol, 10 mM CaCl 2 , 30 mM potassium acetate, adjusted to pH 5.8 with acetic acid, 100 mM RbCl, 50 mM MnCla) and 60-90 Minutes on ice.
Anschließend wurde erneut mit 2000g pelletiert, der Überstand dekantiert und das Pellet in je 2 ml TFB 2 (15% Glycerin, 10 mM MOPS, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl) resuspendiert. Die Bakterien wurden dann in 200 μl Aliquots aufgeteilt und sofort in Flüssigstickstoff schockgefroren und anschließend bei -80°C gelagert .
Beispiel 3 : ELISA zum Nachweis spezifischer Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des humanen CD28It was then pelleted again with 2000 g, the supernatant decanted and the pellet resuspended in 2 ml of TFB 2 (15% glycerol, 10 mM MOPS, 75 mM CaCl 2 , 10 mM RbCl). The bacteria were then split into 200 μl aliquots and flash frozen immediately in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C. Example 3: ELISA for detection of specific antibodies against the extracellular domain of the human CD28
Die Kavitäten von Mikrotiterplatten (Maxisorp, Nunc) wurden mit lOOμl monoklonalem Maus anti-Gluthation-S-Transferase (GST) Antikörper (spezifisch für GST aus Schistosoma japoni- cuiii, 1:2000 in PBS vorverdünnt) beschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 1 h bei Raumtemperatur wurden die Kavitäten dreimal mit PBS + 0,1% Tween 20 gewaschen.The wells of microtiter plates (Maxisorp, Nunc) were coated with 100 μl monoclonal mouse anti-glutathione S-transferase (GST) antibody (specific for GST from Schistosoma japonicaii, prediluted 1: 2000 in PBS). After an incubation period of 1 h at room temperature, the wells were washed three times with PBS + 0.1% Tween 20.
Dann wurde mit 250μl PBS mit 1% Magermilchpulver und 0,1 % Tween 20 für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde erneut dreimal mit PBS + 0,1% Tween 20 gewaschen. Während in die Vertiefungen der Spalten 1 und 2 jeweils lOOμl 1:2 vorverdünntes CD28-GST Antigen (PBS + 0,1% Tween 20) pipettiert wurden, kamen in die Vertiefungen der dritten und vierten Spalte nur je . lOOμl PBS + 0,1 % Tween 20. Entsprechend wurden die übrigen Spalten der Mikrotiterplatte vorbereitet.Then it was blocked with 250 μl of PBS with 1% skimmed milk powder and 0.1% Tween 20 for 1 h at room temperature. It was then washed again three times with PBS + 0.1% Tween 20. While in the wells of columns 1 and 2 each lOOμl 1: 2 prediluted CD28-GST antigen (PBS + 0.1% Tween 20) were pipetted, the wells of the third and fourth column came only ever. 100 μl PBS + 0.1% Tween 20. The remaining columns of the microtiter plate were prepared accordingly.
Nach 1 h bei Raumtemperatur folgten erneut drei Waschschr-itte . Anschließend wurden die Patientenseren sowie das positive Kontrollserum, ein polyklonaler Kaninchen anti-human CD28 Antikörper (Santa Cruz, Heidelberg), Konzentration lμg/ml, 1:200 in PBS + 0,1 % Tween 20 vorverdünnt.After 1 h at room temperature, another three washes followed. Subsequently, the patient sera and the positive control serum, a polyclonal rabbit anti-human CD28 antibody (Santa Cruz, Heidelberg), concentration 1 μg / ml, 1: 200 in PBS + 0.1% Tween 20 were prediluted.
Der Leerwert enthielt das Antigen, aber kein Kontrollserum, die Negativkontrolle enthielt das Kontrollserum, aber kein Antigen und der Blank enthielt weder Kontrollserum noch Antigen. Jedes Patientenserum wurde in Doppelbestimmungen gegen Antigen und - zum Ausschluss unspezifischer Reaktionen - gegen PBS + 0,1 % /Tween 20 gemessen.
Anschließend wurde die Mikrotiterplatte für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend dreimal gewaschen. Im nächsten Schritt wurde der Sekundärantikörper hinzugegeben. In die Vertiefungen mit dem Kontrollserum (B 1-4) wurden je lOOμl eines anti Kaninchen IgG Antikörpers (Fc-spezifisch; Sigma, München) und für die Patientenseren je lOOμl eines anti-human IgG Antikörpers (Fc-spezifisch; Sigma, München) verwendet. Beide Antikörper wurden 1:5000 vorverdünnt und sind mit alkalischer Phosphatase markiert. Die Inkubationszeit betrug bei Raumtemperatur 60 min.The blank contained the antigen but no control serum, the negative control contained the control serum but no antigen and the blank contained neither control serum nor antigen. Each patient serum was measured in duplicate against antigen and - to exclude nonspecific reactions - against PBS + 0.1% / Tween 20. Subsequently, the microtiter plate was incubated for 1 h at room temperature and then washed three times. In the next step, the secondary antibody was added. 100 μl of an anti-rabbit IgG antibody (Fc-specific, Sigma, Munich) and 100 μl of an anti-human IgG antibody (Fc-specific; Sigma, Munich) were used in each of the wells containing the control serum (B 1-4). used. Both antibodies were prediluted 1: 5000 and labeled with alkaline phosphatase. The incubation time was 60 min at room temperature.
Danach wurde fünfmal gründlich gewaschen und in jede Vertiefung wurden lOOμl der p-Nitrophenyl Substratlösung gegeben (pNPP Substrat Tabletten Set, Sigma, München) und sechzig Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Farbentwicklung wurde nach 30 und nach 60 Minuten bei 405nm gemessen.Thereafter, it was washed thoroughly five times, and 100 μl of the p-nitrophenyl substrate solution (pNPP Substrate Tablets Set, Sigma, Munich) was added to each well and incubated at room temperature in the dark for sixty minutes. Color development was measured at 305 and 60 minutes at 405nm.
Das Ergebnis für jedes Serum wurde nach der folgenden Formel berechnet :The result for each serum was calculated according to the following formula:
ODserum [60 min] - ODLW Anti-CD28 =OD serum [60 min] - OD LW Anti-CD28 =
OD 1LWOD 1 LW
Der Quotient wurde für alle getesteten Seren errechnet. Der Grenzwert wurde mit den Seren der gesunden Probanden errechnet. Es zeigte sich, daß 95 % aller errechneten Quotienten der gesunden Probanden unter 9 lagen, so daß Werte, die >10 waren
als positiv gewertet wurden, d.h. sie enthielten Autoantikörper gegen CD28.The quotient was calculated for all sera tested. The limit was calculated with the sera of healthy volunteers. It was found that 95% of the calculated quotients of healthy subjects were below 9, so that values> 10 were were considered positive, ie they contained autoantibodies to CD28.
Zusätzlich wurden Seren, die sicher keine Autoantikörper gegen CD28 enthielten und solche, die sicher CD28 Autoantikörper enthielten in einer Verdünnungsreihe getestet. Es zeigte sich, dass Seren, die CD28 Autoantikörpex enthalten, auch noch bei einer Verdünnung von 1 : 700 eine eindeutig höhere OD zeigten als die negativen Seren.In addition, sera that did not contain autoantibodies to CD28 and those that contained CD28 autoantibodies were serially tested in a dilution series. It was found that sera containing CD28 Autoantikörpex, even at a dilution of 1: 700 showed a clearly higher OD than the negative sera.
Kreuzreagierende Antikörper in den Patientenseren gegen GST konnten ausgeschlossen werden. Dazu wurden 32 Seren getestet und in keinem Serum fanden sich Antikörper gegen das in diesem ELISA verwendete GST.Cross-reacting antibodies in the patient sera against GST could be excluded. Thirty-two sera were tested and no serum was found to have antibodies to the GST used in this ELISA.
Beispiel 4 : Untersuchtes Patientenkollektiv bestehend aus 116 Melanompatienten im klinischen Stadium III A-C.Example 4: Investigated patient collective consisting of 116 melanoma patients in clinical stage III A-C.
Seren von 116 Patienten mit metastasierendem malignem Melanom im Stadium III wurden untersucht. Die demographischen Daten des untersuchten Kollektivs sind in Abbildung 1 (= Tabelle 1) zusammengefasst .Sera from 116 patients with stage III metastatic malignant melanoma were studied. The demographic data of the investigated collective are summarized in Figure 1 (= Table 1).
Das Kollektiv war weitgehend homogen zusammengesetzt, d.h. jeweils ca. ein Drittel der Patienten waren im Stadium 1IIA, II- IB und IIIC, so dass die Überlebenswahrscheinlichkeiten der Patienten als normalverteilt angenommen werden konnten.
Beispiel 5 : Autoantikörper im Serum von Patienten mit malignem Melanom im Stadium IUI A-C.The collective was largely homogeneous, ie approximately one third of the patients were in the stage 1IIA, II-IB and IIIC, so that the survival probabilities of the patients could be assumed to be normally distributed. Example 5: Serum autoantibodies of patients with malignant melanoma stage IUI AC.
In Abbildung 2 (=Tabelle 2) ist die Zahl der Patienten mit und ohne Autoantikörper gegen CD28, Anti-Nukleäre Antikörper (ANAs) und anti-Thyreoglobuln-Antikörper vor Beginn einer IF- Nα-Therapie im Stadium III aufgeführt. In den fortgeschrittenen Stadien HIB und IHC wurden mehr Patienten mit Autoantikörpern gefunden.Figure 2 (= Table 2) shows the number of patients with and without autoantibodies to CD28, anti-nuclear antibodies (ANAs) and anti-thyroglobulin antibodies prior to the initiation of stage III IFNα therapy. In the advanced stages HIB and IHC, more patients with autoantibodies were found.
Beispiel 5 : Vergleich des Progressionsfreies Überlebens und des Gesamtüberlebens zwischen Patienten mit und ohne Autoanti- körper gegen CD28Example 5: Comparison of progression-free survival and overall survival between patients with and without autoantibodies to CD28
In Abbildung 3 ist das progressionsfreie Überleben (PFS) und das Gesamtüberleben (OS) der Patienten ohne CD28- Autoantikörper (n=82) und mit CD28-Autoantikörpern (n=34) dargestellt. Es sind die Überlebenszeiten seit der Erstdiagnose des klinischen Stadiums III, d.h. dem Auftreten von regionären Metastasen.Figure 3 shows progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) in patients without CD28 autoantibodies (n = 82) and CD28 autoantibodies (n = 34). It is the survival times since the initial diagnosis of clinical stage III, i. the occurrence of regional metastases.
Das PFS betrug bei Patienten mit CD28 Autoantikörpern (CD28+) im Median 39,7 Monate (95% Konfidenzintervall (CI): 21.91; 57.49 Monate) und bei den Patienten ohne Autoantikörper gegen CD28 (CD28-) wurde das mediane Überleben nicht erreicht. Das Signifikanzniveau zwischen den beiden Gruppen betrug p=0.0657, d.h. es war knapp signifikant.PFS was median at 39.7 months (95% confidence interval (CI): 21.91, 57.49 months) in patients with CD28 autoantibodies (CD28 +) and median survival was not achieved in patients without autoantibodies to CD28 (CD28-). The significance level between the two groups was p = 0.0657, i. it was almost significant.
Das OS betrug bei Patienten mit CD28 Autoantikörpern (CD28+) im Median 51.3 Monate (95% CI: 0.00; 111.04 Monate). Bei Pati-
enten ohne CD28 Autoantikörper im Serum (CD28-) wurde das mediane Überleben nicht erreicht. Das Gesamtüberleben war für Patienten mit Autoantikörpern gegen CD28 hochsignifikant schlechter (p=0.0074).The OS was median at 51.3 months (95% CI: 0.00, 111.04 months) in patients with CD28 autoantibodies (CD28 +). For patients Without CD28 autoantibodies in serum (CD28-), median survival was not achieved. Overall survival was highly significantly worse for patients with autoantibodies to CD28 (p = 0.0074).
Beispiel 6 : Vergleich des progressionsfreien Überlebens und des Gesamtüberlebens bei Patienten mit verschiedenen Autoantikörpern .Example 6: Comparison of progression-free survival and overall survival in patients with various autoantibodies.
Im Folgenden würden Patienten verglichen, die entweder keine Autoantikörper im Serum hatten oder nur Autoantikörper gegen CD28 oder nur ANAs bzw. anti-Schilddrüsen Antikörper. Eine weitere Gruppe bildeten die Patienten, die Autoantikörper gegen alle getesteten Antigene hatten.In the following, patients who had either no autoantibodies in serum or only autoantibodies to CD28 or only ANAs or anti-thyroid antibodies were compared. Another group was the patients who had autoantibodies to all antigens tested.
In Abbildung 4 sind das progressionsfreie Überleben (PFS) und das Gesamtüberleben (OS) der verschiedenen Patientengruppen mit Kaplan-Meier-Kurven dargestellt. Die Grafiken zeigen, dass das Überleben dann schlechter ist, wenn anti-CD28 Autoantikörper vorhanden sind(p < 0.05). Die Anwesenheit der anderen Autoantikörper, die das Gesamtüberleben positiv beeinflussen, kann diesen nachteiligen Effekt auf die Prognose der Melanom- patienten nicht ausgleichen.Figure 4 shows progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of the various patient groups using Kaplan-Meier curves. The graphs show that survival is worse when anti-CD28 autoantibodies are present (p <0.05). The presence of other autoantibodies that positively affect overall survival can not offset this adverse effect on the prognosis of melanoma patients.
Das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen CD28 ist auch nach Durchführung einer Varianzanalyse mit anderen relevanten Parametern wie Alter, Geschlecht und Tumorstadium die einzig signifikante Einflußgröße für das Gesamtüberleben der untersuchten Patienten (Abbildung 5 = Tabelle 3) .
Beispiel 7 : Vergleich des Auftretens von Autoantikörpern vor und nach IFNα Therapie.The presence of autoantibodies to CD28 is the only significant predictor of overall survival for the patients studied, even after analysis of variance with other relevant parameters such as age, sex, and tumor stage (Figure 5 = Table 3). Example 7: Comparison of the occurrence of autoantibodies before and after IFNα therapy.
In Abbildung 6 (=Tabelle 4) ist die Zahl der Patienten mit und ohne Autoantikörper gegen CD28, ANAs und anti-Thyreoglobulin- Antikörper vor und nach einer IFNα-Therapie im Stadium III aufgeführt. Abbildung 7 zeigt die Titer der Autoantikörper im Serum der Melanompatienten vor und nach einer IFNα-Therapie.Figure 6 (= Table 4) shows the number of patients with and without autoantibodies to CD28, ANAs and anti-thyroglobulin antibodies before and after stage III IFNα therapy. Figure 7 shows the titers of autoantibodies in the serum of melanoma patients before and after IFNα therapy.
Die beiden Abbildungen zeigen, dass sowohl die Zahl der Patienten mit Autoantikörpern als auch die Serumtiter durch die IFNα-Therapie deutlich gesteigert werden. Insbesondere die Titer der Autoantikörper gegen CD28 und gegen Schilddrüsengewebe werden signifikant durch die IFNα-Therapie gesteigert.The two figures show that both the number of patients with autoantibodies and the serum titres are significantly increased by IFNα therapy. In particular, the titers of autoantibodies to CD28 and thyroid tissue are significantly increased by IFNα therapy.
Beispiel 8 : Vergleich des progressionsfreien Überlebens und des Gesamtüberlebens bei Patienten mit und ohne Autoantikörper gegen CD28 nach Durchführung einer IFNα-Therapie.Example 8: Comparison of progression-free survival and overall survival in patients with and without autoantibodies to CD28 after performing IFNα therapy.
Sowohl das progressionsfreie Überleben als auch das Gesamtüberleben war bei Melanompatienten, die Autoantikörper gegen CD28 produzieren, nach Beginn einer IFNα-Therapie deutlich verschlechtert (Abbildung 8) . Bereits 18 Monate nach Beginn der Therapie mit IFNα verschlechterten sich sowohl das progressionsfreie Überleben als auch das Gesamtüberleben der Patienten, die Autoantikörper gegen CD28 entwickelten.
Abbildungen :Both progression-free survival and overall survival were significantly worsened in melanoma patients producing autoantibodies to CD28 after initiation of IFNα therapy (Figure 8). As early as 18 months after the initiation of IFNα therapy, both progression-free survival and overall survival of patients developing autoantibodies to CD28 worsened. Illustrations:
Abb. 1:Fig. 1:
Demographie des untersuchten Patientenkollektivs, das aus Seren von 116 Melanompatienten im Stadium III (AJCC 2002) bestand.Demographics of the investigated patient population consisting of sera from 116 stage III melanoma patients (AJCC 2002).
Abb. 2:Fig. 2:
Autoantikörper bei Patienten im Stadium III A-C vor Beginn einer IFNα Therapie.Autoantibodies in patients with stage III A-C prior to initiation of IFNα therapy.
Abb. 3:Fig. 3:
Kaplan-Meier-Kurven für das progressionsfreie Überleben (A) und das Gesamtüberleben (B) der Patienten mit und ohne anti- CD28 Autoantikörper (n=116) .Kaplan-Meier curves for progression-free survival (A) and overall survival (B) of patients with and without anti-CD28 autoantibodies (n = 116).
Abb. 4:Fig. 4:
Kaplan-Meier-Kurven für das Progressionsfreie- (A) und das Gesamtüberleben (B) der Patienten mit malignem Melanom im Stadium III (n=116) . Die verschiedene Patientengruppen sind: CD28- /Auto-Ak-, CD28+/Auto-Ak-, CD28-/Auto-Ak+ und CD28+/Auto-Ak+.Kaplan-Meier curves for progression-free (A) and overall survival (B) in patients with stage III malignant melanoma (n = 116). The different patient groups are: CD28 / auto-ac, CD28 + / auto-ac, CD28- / auto-ac + and CD28 + / auto-ac +.
Abb. 5:Fig. 5:
Univariate Cox Regressions Analyse des progressionsfreien und des Gesamtüberlebens. CI, Konfidenz Intervall, NE nicht evalu- ierbar, and NR nicht erreicht. P-Werte wurden mit dem Wald- Test berechnet.Univariate Cox regression analysis of progression-free and overall survival. CI, confidence interval, NE not evaluable, and NR not reached. P values were calculated using the Wald test.
Abb. 6:Fig. 6:
Autoantikörper im Serum von Patienten vor und nach IFNα Therapie im Stadium III.
Abb . 7 :Autoantibodies in the serum of patients before and after IFNα therapy in stage III. Fig. 7:
Die Produktion von anti-CD28 Autoantikörpern wird durch eine Interferon-Therapie signifikant gesteigert, d.h. mehr Patienten produzieren diese Autoantikörper. Das gilt auch für ANAs und anti-Thyreoglobulin-Autoantikörper .The production of anti-CD28 autoantibodies is significantly enhanced by interferon therapy, i. More patients produce these autoantibodies. This also applies to ANAs and anti-thyroglobulin autoantibodies.
Abb. 8:Fig. 8:
Progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben der Patienten ohne CD28-Autoantikörper und mit CD28-Autoantikörpern nach Behandlung mit Interferon-alpha. Zeit seit Beginn der IFNa- Therapie im Stadium III.
Progression-free survival and overall survival of patients without CD28 autoantibodies and with CD28 autoantibodies after treatment with interferon-alpha. Time since the start of IFNa therapy in stage III.
Claims
1. Verwendung von CD28 als Nachweisreagenz für anti-CD28 Autoantikörper zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom.1. The use of CD28 as a detection reagent for anti-CD28 autoantibodies for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
2. Verfahren zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe eines Patienten auf das Vorhandensein von anti- CD28 Autoantikörpern untersucht, indem man die Probe mit CD28 in Kontakt bringt, wobei eine Bindung der Autoantikörper an CD28 auf eine signifikant schlechtere Überlebensprognose des Patienten mit malignem Melanom hinweist.2. A method for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma, characterized in that one examines a sample of a patient for the presence of anti-CD28 autoantibodies by bringing the sample into contact with CD28, wherein a binding of the autoantibodies to CD28 on indicates a significantly worse survival prognosis of the patient with malignant melanoma.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß CD28 ein CD28-Molekül ganzer Länge gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein extrazelluläres Fragment davon gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO : 6 oder ein zum Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern geeigner Teil dieses Fragments ist.3. The method according to claim 2, characterized in that CD28 a full length CD28 molecule according to SEQ ID NO: 1 or an extracellular fragment thereof according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 or one for the detection of anti-CD28 autoantibodies is a suitable part of this fragment.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet/ daß das CD28-Molekül ganzer Länge oder das extrazelluläre Fragment davon Teil eines Fusionsproteins sind.4. The method according to claim 3, characterized in / that the CD28 molecule entire length or the extracellular fragment thereof are part of a fusion protein.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein ferner Glutathion-S-Transferase umfaßt.5. The method according to claim 4, characterized in that the fusion protein further comprises glutathione-S-transferase.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Blutprobe, Plasmaprobe oder Serumprobe ist. ' 6. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the sample is a blood sample, plasma sample or serum sample. '
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis β, dadurch gekennzeichnet, daß CD28 an einen Träger gebunden ist.7. The method according to any one of claims 2 to β, characterized in that CD28 is bound to a carrier.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung von anti-CD28 Autoantikörpern an CD28 untersucht, indem man den Träger mit markierten anti- Immunglobulin-Antikörpern gegen Antikörper der Spezies, der der Patient angehört, kontaktiert und die markierten Antikörper nachweist.8. The method according to claim 7, characterized in that one examines the binding of anti-CD28 autoantibodies to CD28 by contacting the carrier with labeled anti-immunoglobulin antibodies to antibodies of the species to which the patient belongs, and detects the labeled antibodies ,
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Patient ein Mensch ist und die anti-Immunglobulin-Antikörper anti-humane Immunglobulin-Antikörper sind.9. The method according to claim 8, characterized in that the patient is a human and the anti-immunoglobulin antibodies are anti-human immunoglobulin antibodies.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym, Biotin, einem radioaktiven Isotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.10. The method according to any one of claims 8 and 9, characterized in that the anti-immunoglobulin antibodies are labeled with an enzyme, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in einem Blot, einem ELISA, einem RIA, einer FACS-Üntersuchung oder in einem Flüssigphasen-Detektionssystem durchführt .11. The method according to any one of claims 8 to 10, characterized in that one carries out the investigation in a blot, an ELISA, an RIA, a FACS examination or in a liquid phase detection system.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine hohe Konzentration von Autoantikörpern gegen CD28 auf ein besonderes Risiko, eine besonders schwere Erkrankung oder eine besondere Schwere der Erkrankung hinweist. 12. The method according to any one of claims 2 to 11, characterized in that a high concentration of autoantibodies to CD28 indicates a particular risk, a particularly serious disease or a particular severity of the disease.
13. Kit zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom, dadurch gekennzeichnet, daß es CD28 und markierte anti-Immunglobulin Antikörper umfaßt.13. Kit for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma, characterized in that it comprises CD28 and labeled anti-immunoglobulin antibodies.
14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß CD28 ein CD28-Molekül ganzer Länge gemäß SEQ ID NO: 1 oder ein extrazelluläres Fragment davon gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 oder ein zum Nachweis von anti-CD28 Autoantikörpern geeigner Teil dieses Fragments ist.14. Kit according to claim 13, characterized in that CD28 a full length CD28 molecule according to SEQ ID NO: 1 or an extracellular fragment thereof according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 or one for the detection of anti-CD28 autoantibodies is a suitable part of this fragment.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das CD28-Molekül ganzer Länge oder das Fragment davon Teil eines Fusionsproteins sind.15. Kit according to claim 14, characterized in that the CD28 molecule of full length or the fragment thereof are part of a fusion protein.
16. Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein ferner Glutathion-S-Transferase umfaßt.16. Kit according to claim 15, characterized in that the fusion protein further comprises glutathione-S-transferase.
17. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner markierte anti-IgE Antikörper umfaßt.17. Kit according to any one of claims 13 to 16, characterized in that it further comprises labeled anti-IgE antibodies.
18. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die markierten Antikörper mit einem Enzym, Biotin, einem radioaktiven Isotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.18. Kit according to any one of claims 13 to 17, characterized in that the labeled antibodies are labeled with an enzyme, biotin, a radioactive isotope or a fluorescent dye.
19. Verwendung eines Kits nach den Ansprüchen 13 bis 18 zur Bestimmung von anti-CD28 Autoantikörpern als prognostischer Marker für die Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom. 19. Use of a kit according to claims 13 to 18 for the determination of anti-CD28 autoantibodies as a prognostic marker for the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
20. Verwendung von anti-CD28 Autoantikörpern als prognostischer Marker zur Bestimmung der Überlebensprognose bei Patienten mit malignem Melanom. 20. Use of anti-CD28 autoantibodies as a prognostic marker for determining the survival prognosis in patients with malignant melanoma.
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