EP2126068A2 - Enzymes (3r)-hydroxyacyl-acp deshydratases impliquees dans la biosynthese des acides mycoliques et leur utilisation pour le criblage d'antibiotiques - Google Patents

Enzymes (3r)-hydroxyacyl-acp deshydratases impliquees dans la biosynthese des acides mycoliques et leur utilisation pour le criblage d'antibiotiques

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EP2126068A2
EP2126068A2 EP08775548A EP08775548A EP2126068A2 EP 2126068 A2 EP2126068 A2 EP 2126068A2 EP 08775548 A EP08775548 A EP 08775548A EP 08775548 A EP08775548 A EP 08775548A EP 2126068 A2 EP2126068 A2 EP 2126068A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
rvo636
seq
rvo635
proteins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08775548A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Annaïk QUEMARD
Mamadou Daffe
Emmanuelle Sacco
Thomas Alwyn Jones
Adrian Suarez Covarrubias
Kristina BÄCKBRO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2126068A2 publication Critical patent/EP2126068A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to new enzymes involved in the biosynthesis of mycolic acids and their use for the screening of antibiotics, drugs that can be used to treat infections in humans or animals, due to Corynebacterineae and more particularly infections due to pathogenic mycobacteria ⁇ Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M. avium, M. fortuitum, M. kansasii ...) as well as infections caused by other genera such as Nocardia, Rhodococcus, Gordona ...
  • tuberculosis the agent of which is M. tuberculosis
  • tuberculosis the agent of which is M. tuberculosis
  • the design of new anti-tuberculosis drugs has become a priority again.
  • the identification of pharmacological targets is therefore necessary for the development of new drugs.
  • Mycobacterial mycobacterial acids also called eumycolates, are very long chain (C 60 -C 90 ) fatty acids, ⁇ -alkylated and ⁇ -hydroxylated, present in the form of esters in the wall of bacteria of a line phylogenetic particular actinomycetes, the suborder Corynebacterineae, also called "mycolotas", including, among others, the bacterial genera: Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia, Gordona and Tsukamurella.
  • Mycolic acids are thus specific for the envelope of mycobacteria and related bacteria (Brennan & Nikaido, 1995); mycobacterial mycolic acids are distinguished from mycolic acids of related genera that have shorter chain lengths (Barry et al, 1998). These compounds are important for the architecture and permeability of the mycobacterial envelope for which they represent a hydrophobic diffusion barrier (Brennan & Nikaido, 1995). In addition, they have a vital role in the survival of mycobacteria, and they are involved in the virulence and persistence of the tubercle bacillus in the infected host (Dubnau et al., 2000; Glickman et al., 2000).
  • Mycolotas include major pathogens, including mycobacteria Mycobacterium tuberculosis, agent of tuberculosis and Mycobacterium leprae, agent of leprosy.
  • the genus Mycobacterium comprises several species classified into 3 groups according to their risk of infection for humans. In the group of strict pathogens, several species are found including the leprosy bacillus M. leprae and M. tuberculosis belonging to the subgroup called "M. tuberculosis complex". This subgroup consists of the 4 classic members: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, and 3 recently defined members M. Canetti, M. pinnipedii and M.
  • the second group corresponds to opportunistic pathogens for humans (such as M. avium, M. fortuitum, M. kansasii ”) that have been isolated in certain animals and in the environment. These mycobacteria are responsible for pathologies in humans (mycobacteriosis) especially in subjects with a weakened immune system (for example, people with AIDS).
  • the third group corresponds to non-pathogenic saprophytic mycobacteria (M. smegmatis, M. phlei, M. gastri ...) present in the environment.
  • anti-tuberculosis drugs are those that interfere with mycobacterial envelope biosynthesis, such as isoniazid, ethionamide and ethambutol (WEBB et al., Molecular Biology and Virulence 1: 287 - 307 (eds Ratledge, C. & DaIe, J.) (Blackwell Science Ltd, Oxford), 1999).
  • Isoniazid a specifically anti-tuberculosis antibiotic, is primarily targeted at an enzyme of mycolic acid metabolism; it inhibits the activity of the protein InhA, which is part of the enzyme complex or FAS-II system, the function of which is to produce, by successive elongation cycles, long-chain fatty acids (acyl-ACP up to C 32 in vitro, or up to C 60 in vivo), mycolic acid precursors, using malonyl-ACP as the elongation unit.
  • InhA a 2- fra "s-enoyl-ACP reductase catalyzes the 4th stage of an elongation cycle which includes four steps ( Figure 1).
  • the FAS-II system is present in plants, bacteria (eg Rhodococcus, Nocardia and Mycobacterium), parasites (eg Plasmodium) and in mitochondria. Specifically, the initiation of the elongation system of the mycobacterial FAS-II system is performed by a ⁇ -ketoacyl-ACP synthase III, (mtFabH or KasIII), probably making the link between the two FAS-I and FAS-FAS systems. II catalyzing the condensation of acyl-CoA derived from FAS-I with the elongation unit, malonyl-ACP (Choi et al, 2000) ( Figure 1).
  • the FAS-II system involves the following proteins: / - ketoacyl-ACP reductase MabA (2 cme step) Penoyl-ACP reductase InhA (4th stage), the / î-ketoacyl-ACP synthase? Kasa, kasb (l st step) (Banerjee et al, 1998; Kremer et al, 2001; Kremer et al, 2002; Marrakchi et al, 2000; Quémard et al, 1995; Schaeffer et al, 2001b) ( Figure 1).
  • the target of isoniazid is the enzyme InhA; Isoniazid is a pro-drug that forms with InHA coenzyme, NADH, an inhibitor adduct.
  • InhA the enzyme
  • Isoniazid is a pro-drug that forms with InHA coenzyme, NADH, an inhibitor adduct.
  • MabA was chosen as a target and the screening of molecules inhibiting MabA (International Application WO 03/08291 1) was proposed.
  • the (3/2) -hydroxyacyl-ACP dehydratase enzyme involved in the third stage of the cycle and catalyzing the conversion of (3/2) -hydroxyacyl-ACP to 2- ⁇ -enoyl-ACP, has not yet been identified.
  • the set of enzymes or hydroxyacyl dehydratase domains are difficult to identify because of the lack of similarity between the sequences. This was the case, for example, with the dehydratase domain of FAS-I of M.
  • the inventors have now determined the enzymes involved in the third step of the fatty acid elongation cycle of the mycobacterial FAS-II system and their interest as a target for the screening of drugs and especially antibiotics active on microorganisms (bacteria, parasites, for example) containing a FAS-II system, in which the third step of the elongation cycle is catalyzed by a dehydratase containing a hydratase unit 2 (FIG. 11), or a catalytic unit derived from the hydratase unit 2 and constituted by less by the basic motif D- x (4) -H, wherein x (4) represents four amino acids, the latter being any amino acid, or a similar basic motif.
  • similar basic unit is understood to mean the basic unit Dx (4) -H, in which the aspartic acid (D) is substituted by an amino acid selected from the group consisting of asparagine (N), glutamic acid (E) and glutamine (Q), and / or histidine (H) is substituted with a basic amino acid such as arginine (R) and lysine (L).
  • Molecules having an inhibitory power on the expression or the activity of the G ⁇ -hydroxyacyl-ACP dehydratases of the mycobacterial FAS-II system may also potentially inhibit other essential metabolisms involving proteins of the hydase 2 type, in a given microorganism. .
  • the inventors have found that the enzymes responsible for the third step (dehydration) in the FAS-II system of M. tuberculosis H37rv correspond to proteins comprising protein subunits including RvO635 (SEQ ID NO: 4), RvO636 (SEQ ID NO: 2) or RvO637 (SEQ ID NO: 6) of M. tuberculosis H37Rv.
  • the different enzymes containing RvO636 are PCR dependent and have specificity for long chain substrates.
  • the subject of the present invention is therefore a purified and isolated enzyme, involved in the FAS-II system, preferably the FAS-II mycobacterial system, and having the following characteristics: a) it is constituted by a dimer or a multimer selected from the group constituted by
  • X is ACP and n ⁇ O, preferably n> 4, or CoA and n ⁇ O, preferably n> 8.
  • the protein lacking a hydratase 2 motif is, for example, a protein that binds a long acyl chain.
  • multimer means at least three proteins.
  • the protein such as as defined in (i) is selected from the group consisting of the protein RvO636 (SEQ ID NO: 2) comprising a Y-AGVSGDLNPI-HWDDEIA Y-hydrate unit 2 (SEQ ID NO: 16) and a protein which has at least 51% d identity or at least 72% similarity, preferably at least 85% identity or at least 90% similarity to the RvO636 protein of sequence SEQ ID NO: 2 of M. tuberculosis H37rv.
  • the protein as defined in (ii) which does not comprise a hydratase 2 unit is selected from the group consisting of: the protein RvO635 (SEQ ID NO: 4) or a protein which has at least 53% identity or at least 67% similarity, preferably at least 69% identity or at least 82% similarity with the RvO635 protein of sequence SEQ ID NO: 4 of M. tuberculosis H37RV and - the RvO637 protein (SEQ ID NO: 6) or a protein that has at least 44% identity or at least 61% similarity, preferably at least 59% identity or at least 76% identity. similarity with the RvO637 protein of sequence SEQ ID NO: 6 of M. tuberculosis H37Rv.
  • the dimer or multimer is selected from the group consisting of: a homomultimer of RvO636 (SEQ ID NO: 2) or a protein that has at least 51% identity or at least 72% similarity, preferably at least 85% identity or at least 90% similarity, on the whole of its sequence with the M. tuberculosis RvO636 protein,. a heterodimer or a heteromultimer consisting of (i) the protein RvO636 (SEQ ID NO: 2) or a protein that has at least 51% identity or at least 72% similarity, preferably at least 85% of identity or at least 90% similarity with the RvO636 protein of sequence SEQ ID NO: 2 of M.
  • tuberculosis H37Rv and (ii) the RvO635 protein (SEQ ID NO: 4) or a protein which has at least 53% identity or at least 67% similarity, preferably at least 69% identity or at least 82% similarity to the protein RvO635 of sequence SEQ ID NO: 4 of M. tuberculosis H37RV and.
  • a heterodimer or a heteromultimer consisting of (i) the protein RvO636 (SEQ ID NO: 2) or a protein that has at least 51% identity or at least 72% similarity, preferably at least 85% of identity or at least 90% similarity with the RvO636 protein of sequence SEQ ID NO: 2 of M tuberculosis H37Rv and (ii) the protein RvO637 (SEQ ID NO: 6) or a protein which has at least 44% d identity or at least 61% similarity, preferably at least at least 59% identity or at least 76% similarity to the RvO637 protein of sequence SEQ ID NO: 6 of M. tuberculosis H37Rv.
  • the enzymes in accordance with the invention thus participate in the third dehydration step of the FAS-II system elongation cycle, and in particular the mycobacterial FAS-II system as (3J) -hydroxyacyl dehydratase (FIG. 1).
  • RvO635 70-100% identity and 86-100% similarity in M. tuberculosis and M. avium, M. smegmatis, M. bovis and M. leprae; 53% identity and
  • RvO636 85-100% identity and 90-100% similarity in M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium and M. smegmatis; 51-63% identity and 72-78% similarity in Nocardia and Rhodococcus.
  • RvO637 68-100% identity and 83-100% similarity in M. tuberculosis, M. avium, M. smegmatis, M. bovis and M. leprae.
  • Corynebacterinae namely Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus sp. RHA1 and Nocardia farcinica were analyzed.
  • x% identity between a polypeptide P of length at least equal to that of the reference sequence and a reference sequence it is understood that when the two sequences are aligned, x% of the amino acids of P are identical to the corresponding amino acid of said reference sequence.
  • x% similarity between a polypeptide P of length at least equal to that of the reference sequence and a reference sequence it is understood that when the two polypeptides are aligned, x% of the amino acids of P are identical to the acid. corresponding amine of said reference sequence or are replaced by an amino acid of the same group.
  • the polypeptide P is less than the length of the reference sequence, the alignment is along the entire length of the P polypeptide.
  • Figures 7-9 show the results obtained.
  • amino acid of the same group is meant an amino acid having substantially identical chemical properties. In particular, this term is understood to mean amino acids having substantially the same charge and / or the same size, and / or the same hydrophilicity or hydrophobicity and / or the same aromaticity.
  • Such groups of amino acids include; (i) glycine, alanine
  • substitutions can be envisaged, in which an amino acid is replaced by another comparable but non-natural amino acid (hydroxyproline, norleucine, ornithine, citrulline, cyclohexylalanine, dextrorotatory amino acids, .).
  • the identity percentages and the defined percentages of similarity can be obtained using the BLAST program (or blast2seq, default parameters) (Tatustore et al., FEMS Microbiol., Lett., 1999, 174, 247-250) or PSI.
  • BLAST Altschul et al., 1997) with a comparison window corresponding to the total length of the sequences SEQ ID NO: 2, 4 and 6, when the P polypeptide compared is of length at least equal to that of the sequences SEQ ID NO: 2, 4 and 6.
  • the comparison window corresponds to the total length of the polypeptide P.
  • said enzymes are selected from the group consisting of: homomultimer of RvO636, heterodimer or heteromultimer Rv0635-Rv0636 and heterodimer or heteromultimer Rv0636-Rv0637.
  • enzymes comprising RvO636 associated heterodimer or heteromultimer with RvO635 or Rv0637 possess in vitro enoyl-CoA hydratase activity.
  • these two heterodimers effectively catalyze the hydration of 2-frara-enoyl-CoA in C 2 -C 2 O whereas no activity is detected in the presence of substrates with short chain (C 4 -C 8 ).
  • the specificity of an enzyme according to the invention for a given size of the acyl chain of the substrates may be a function of the origin (plant, parasite, bacterium, mitochondria) of said enzyme.
  • the (3i) -hydroxyacyl and / or 2-trans-enoyl substrate of said enzymes is preferably a substrate having an acyl chain of length equal to or greater than C 8 , preferably C 2 -C 20 , derived from PCA ( Figures 3 and 4).
  • RvO636 can associate with a partner lacking a catalytic motif hydratase 2.
  • the partner protein RvO635 or RvO637 is likely present to stabilize the long chain acyl substrate.
  • Rv0636 with RvO635 induces a different specificity, but also a much higher specific activity in comparison with that obtained with the heterodimer Rv0636-Rv0637 (Figure 3).
  • This latter enzyme exhibits an increasing activity following the increase in the chain length of the 2-en-1-enoyl-CoA (C 1 -C 20 ) substrates, with an apparent optimum activity for the C 20 substrate (FIG. 3).
  • the specificity profiles of Rv0635-Rv0636 and RvO636-RvO637 are comparable to those obtained for some proteins of the mycobacterial FAS-II system and show that they belong to the FAS-II system.
  • the fact that heterodimers exhibit a much higher activity in the presence of ACP derivative than CoA derivative confirms this membership (FIG. 4). This would explain the low specific activity of these enzymes in the presence of CoA derivatives.
  • Rv0636-Rv0637 would intervene in later cycles.
  • the inventors produced and purified the various dimers or multimers in recombinant form and determined their catalytic activity.
  • the subject of the present invention is also the polynucleotides encoding the various proteins as defined above, in particular the proteins RvO635, RvO636 and RvO637; in particular the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 codes for the RvO636 protein; the polynucleotide of SEQ ID NO: 3 codes for the RvO635 protein and the polynucleotide SEQ ID NO: 5 codes for the RvO637 protein; the polynucleotide comprising the sequence which codes for a RvO636 protein and the sequence which codes for a RvO635 protein and / or a RvO637 protein.
  • the subject of the present invention is also a polynucleotide represented by the sequence SEQ ID NO: 7 of the attached sequence listing; it comprises the ORFs encoding the RvO635, RvO636 and RvO637 proteins located between positions 731930 and 733525 of the M. tuberculosis H37Rv genome.
  • the chromosomal origins of the ORFs in said polynucleotide are as follows: RvO635: 731930-732406 (positions 201-677 of SEQ ID NO: 7); RvO636: 732393-732821 (positions 664-1092 of SEQ ID NO: 7); RvO637: 732825-733325 (positions 1096-1596 of SEQ ID NO: 7) (Fig. 12).
  • the present invention also relates to an expression vector, comprising a polynucleotide as defined above and in particular a polynucleotide encoding a RvO636 protein according to the invention alone or in combination with a polynucleotide encoding the RvO635 protein and / or the RvO637 protein, as well as a host cell, prokaryotic or eukaryotic, transformed by said expression vector.
  • the vector used is any vector of the state of the art.
  • Said vector may also comprise regulatory sequences for the expression of the protein encoded by the polynucleotide (promoter, termination site, etc.).
  • the introduction of the polynucleotide or expression vector into the modified host cell may be carried out by any known method such as, for example, transfection, infection, fusion, electroporation, microinjection or biolistics.
  • the present invention also relates to a process for producing an enzyme according to the invention, characterized in that it comprises culturing a host cell according to the invention in a suitable medium and purifying said enzyme from said culture.
  • said purification is by affinity chromatography, for example IMAC and / or exclusion chromatography.
  • affinity chromatography for example IMAC and / or exclusion chromatography.
  • IMAC Ni-Sepharose FF column and the HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade column.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting the biosynthesis of compounds of the envelope of mycolatas, characterized in that it comprises the inhibition of the expression or the activity of at least one of the enzymes as defined above, selected from the group consisting of the RvO636 protein, the RvO635 protein, the RvO637 protein and / or the protein complexes as defined above (dimers and multimers comprising the RvO636 protein).
  • inhibitors may be antibodies directed against these proteins, antisense RNAs or interfering RNAs targeting the genes encoding these proteins, molecules that bind to the active site or in the substrate binding site of these proteins, or, in particular, compounds having a phenylbenzopyrone structure such as flavonoids (Brown et al., 2007).
  • said method comprises: a) incubation of a suitable substrate selected from the group consisting of (3 ⁇ ) -hydroxyacyl-ACPs,?-Rara-2-enoyl-ACPs the RQs) -hydroxyacyl-CoA and tra "5-2-enoyl-CoA with an enzyme according to the invention, in the presence or in the absence of the molecule to be tested, and b) the comparison of the activity of the enzyme according to the invention in the presence and in the absence of the test molecule.
  • a suitable substrate selected from the group consisting of (3 ⁇ ) -hydroxyacyl-ACPs,?-Rara-2-enoyl-ACPs the RQs) -hydroxyacyl-CoA and tra "5-2-enoyl-CoA
  • the present invention also relates to a method for screening inhibitory ligands of an enzyme according to any one of claims 1 to 7 or a protein selected from the group consisting of the proteins RvO635, Rv0636 and RvO637, characterized in that it comprises a step of identifying inhibition of the expression or activity of said enzyme or said protein.
  • the inhibition of the hydratase / dehydratase activity can be carried out by any method known to those skilled in the art and in particular by measuring a variation in absorbance related to the disappearance of the substrate or the appearance of a product, at an appropriate wavelength or by a tandem reaction (secondary enzyme or antibody that will detect the residual amount of substrate or the amount of product formed).
  • the detection of the inhibitory power of the said molecule to be tested is carried out by:
  • tests for ligand binding to the proteins can also be carried out by spectrofluorimetry, thanks to the presence of Trp residues, especially in the substrate binding site.
  • the fluorescence emission intensity variation at the maximum emission makes it possible to detect the binding of a ligand and to deduce therefrom the dissociation constant (Kd).
  • Kd dissociation constant
  • mycobacterial FAS-II (3i?) -Hydroxyacyl-ACP dehydratase is an excellent potential target for the design of new anti-mycobacterial drugs. , including acting on the growth and / or viability of pathogenic mycobacteria (Mycobacterium tuberculosis, M. afccanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M. avium, M. fortuitum , M. kansasii Among or new drugs affecting the growth and / or viability of genera related to mycobacteria belonging to Corynebacterineae (for example, Nocardia, Rhodococcus, Gordona ).
  • the subject of the present invention is also the use of an enzyme as defined above, for the screening of active antibiotics on microorganisms containing a FAS-II system, in which the dehydration step is catalyzed by a dehydratase containing a hydration unit 2 [YF] -x (1, 2) - [LIVG] - [STGC] -GDXNP- [LIV] -HX (S) - [AS] (SEQ ID NO: 15), (wherein x (n) represents n amino acids, the latter being any amino acid and the acids amines in brackets represent alternatives) or a catalytic unit, derived from the unit hydrate 2 and consisting at least of the basic unit Dx (4) -H, wherein x (4) represents 4 amino acids, the latter being any which amino acid, or by a pattern similar to the basic pattern.
  • the hydratase unit 2 is the unit Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO: 16).
  • said microorganisms are Corynebacterinae, preferably bacteria of the genera Rhodococcus, Nocardia and Mycobacterium, preferably Mycobacterium.
  • the present invention also relates to a method for screening ligands of a protein (preferably RvO635, RvO636 and RvO637, in monomeric form and more preferably RvO636) or an enzyme according to the invention, characterized in that she understands :
  • the present invention also relates to a method for screening ligands of a protein (preferably RvO635, RvO636 and RvO637, and more preferably RvO636) or an enzyme according to the invention, characterized in that it comprises the following steps :
  • FIG. 1 shows the fatty acid cycle by the FAS-II system in mycobacteria.
  • the names of enzymes catalyzing similar steps in E. coli are mentioned in parentheses.
  • AcpM Mycobacterial ACP involved in the FAS-II system.
  • FIG. 2 illustrates the SDS-PAGE analyzes of the nickel column chromatography and exclusion column fractions during the purification of the products of the hadA-hadB (Rv0635-Rv0636) and hadB-hadC genes.
  • FIG. 3 represents the specificity profiles of the heterodimeric enzymes Rv0635-Rv0636 and Rv0636-Rv0637 for 2-fra / s-enoyl-CoA of different chain lengths.
  • the data are initial velocity averages with standard deviations. The larger standard deviations observed for long chain substrates are due to solubility problems.
  • the tests were carried out in the presence of fixed concentrations of substrate and enzyme in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.0.
  • the activities detected for the two heterodimers in the presence of short chain substrates (C 4 , C 8 ) are not significantly different from the activities detected in the control experiments in the absence of enzyme.
  • the concentration of each enzyme has been adapted to obtain optimal conditions for measuring the initial velocity.
  • FIG. 4 shows the comparison of the specific activity of the heterodimers RvO635-RvO636 and Rv0636-Rv0637 in the presence of 2-frmw-octenoyl-ACP and 2-rays-octenoyl-CoA.
  • the data are initial velocity averages with standard deviations.
  • the tests were carried out in the presence of 2 ⁇ M of substrate and, with fixed concentrations of enzymes Rv0635-Rv0636 (80 nM) (A) or RvO636-RvO637 (543 nM) (B), and monitored by spectrophotometry at 263 nm.
  • the responses obtained for the heterodimers Rv0635-Rv0636 and Rv0636-Rv0637 in the presence of 2-f ⁇ my-octenoyl-CoA is not significantly different from the response obtained for the control experiments (in the absence of an enzyme).
  • FIG. 5 illustrates the chromosomal organization of all the RvO635, RvO636 and RvO637 genes or orthologous genes in different Corynebacterinae.
  • Gene products thrT, t-RNA-Thr; metT, t-RNA-Met; rmpG2, probable ribosomal protein 50S L33; trpT, t-RNA-Trp; secEl, probable preprotein translocase; nusG, probable anti-termination protein of transcription; rplK, rplA, probable 50S ribosomal proteins L1 and L1: mmaA4, mycolic acid (MA) methyltransferase.
  • MA mycolic acid
  • ro01984 plus ro01983 and the nfa51180 fusion gene are orthologs of hadA and hadB in Rhodococcus sp. and Nocardia farcinica respectively.
  • the patterns are based on sequenced genomes of Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium, and Mtb and M. leaprae strains. It should be noted that downstream variations of the rplA gene exist in other mycobacterial genomes that have been sequenced.
  • FIG. 6 illustrates the role model of the heterodimers RvO635-RvO636 (HadAB) and Rv0636-Rv0637 (HadBC) in the mycolic acid biosynthetic pathway.
  • This model proposes that the enzyme Rv0635-Rv0636 (HadAB) is implicated, like the enzyme KasA, in the early stages of fatty acid elongation catalyzed by the FAS-II system, leading to the formation of the size-dependent meromycolic chains.
  • intermediate C 22 -C 42
  • mycolic acids found in Rhodococcus and Nocardia.
  • FIG. 10 illustrates the polypeptide sequences corresponding to the nucleotide sequences cloned in the recombinant E. coli strains.
  • FIG. 11 illustrates the alignment of the amino acid sequences of the proteins RvO635 (access number: P96926), RvO636 (access number: P96927) and RvO637 (accession number: P96928), produced at the Using the Clustal W.
  • RvO636 program exhibited 13% sequence identity with RvO635 and 15% with RvO637.
  • RvO636 and RvO637 have 45% identity with each other.
  • the black and gray shadows respectively indicate strictly conserved residues and the like.
  • Moisture unit 2 [YF] -X (I) - [LIVG] - [STGC] -G-D-X-N-P- [UV] -H-X (S) - [AS]) of RvO636 is indicated by stars.
  • FIG. 12 represents the coding sequences of the RvO635-Rv0636-Rv0637 operon in M. tuberculosis. The start and end of each ORF is indicated by an arrow or a line, respectively. The RvO635 and RvO636 genes are overlapping.
  • FIG. 13 represents the coupling tests of the heterodimer
  • Rv0635-Rv0636 (HadAB) in the presence of MabA and InhA. It illustrates the MALDI-TOF MS analyzes of the reaction medium containing 3-ketododecanoyl-CoA, NADPH, NADH, MabA plus InhA (A) or more than 280 nM of the heterodimer Rv0635-Rv0636 (B) or the heterodimer Rv0635-Rv0636 and InhA (C).
  • the peaks at 966, 988, 1010, 1032 and 1054 m / z respectively represent [M + H] + , [M + Na] + , [M-H + 2Na] + ions.
  • FIG. 14 represents the coupling tests of the heterodimer Rv0636-Rv0637 (HadBC) in the presence of MabA and InhA. It illustrates the MALDI-TOF MS analyzes of the reaction medium containing 3-ketododecanoyl-CoA, NADPH, NADH, MabA, plus InhA and the heterodimer Rv0636-Rv0637 (HadBC) (1.65 ⁇ M), after 3h (A) and 24h (B). ) of reaction. For the meaning of the peaks, see the legend of Figure 13 above.
  • Genome sequence analyzes were performed using the Sanger Institute and TubercuList Internet servers for Mycobacterium tuberculosis H37Rv (CoIe et al, 1998), and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website. the other genomes
  • the PRATT version 2.1 program of the PROSITE database (Jonassen et al, 1995) was used with the default parameters to define the two distinct specific motifs of the FabZ or FabA annotated proteins, based on two independent lists of 36 protein sequences.
  • FabZ type, and 24 FabA-like sequences [including FabZ1 protein from Enterococcus faecalis whose sequence is more related to FabZ proteins but having FabA (dehydratase / isomerase) activity (Wang & Cronan, 2004)].
  • the gene coding for the RvO636 protein was amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) in two steps, starting from the total DNA of the strain M. tuberculosis H37Rv. In a first PCR reaction, the primer pair 5'-GAT TTT
  • the nucleotides 731 930 to 733 325 of the genome of the M. tuberculosis strain H37Rv containing the three genes RvO635, RvO636 and RvO637, were amplified by PCR from the cosmid MTCY20H10 ( http://genolist.pasteur.fr/Tuberculist).
  • N-terminal tag of 6 histidines was simultaneously introduced into the PCR reaction using the 5'-ATG GCT pair of CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG CTG CGT GAG TTC AGC TCG G-3 '(sense primer) (SEQ ID NO: 13) and 5'-CAG TTG CTA ATT CGG TC-3 'ACG (antisense primer) (SEQ ID NO: 14), and PfuUltra polymerase (Stratagene).
  • the bacteria were cultured in LB medium (Luria Browth Base,
  • the expression of the target gene RvO636 was induced with 0.02% arabinose for 3-4 hours. After centrifugation of the bacterial cultures, the cell pellet was resuspended in lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0), and lysed using freeze-freezing cycles. thawing. Most of the RvO636 protein is in insoluble form.
  • the cell-free extract was plated on a pre-equilibrated Ni Sepharose FF column (1 ml, GE Healthcare). After washing with 20 column volumes of buffer
  • the protein was eluted with 5 column volumes of 250 mM imidazole in the same buffer.
  • Fractions containing the protein are pooled, and then their buffer is changed by PD-10 column chromatography (GE Healthcare).
  • the enzyme is further purified on a HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade column (GE Healthcare) equilibrated with 50 mM HEPES buffer, 15OmM NaCl, pH 7.5.
  • the purified protein solution is analyzed by staining with Coomassie blue on SDS-PAGE (FIG. 2). This protein is 95% pure. However, it is relatively unstable in solution. Glycerol is added at a final concentration of 50% (v / v) and the protein is stored at -2O 0 C.
  • the expression of the genes Rv0635-Rv0636 and Rv0636-Rv0637 was induced with 0.2 mM IPTG for 3-4 hours.
  • the cell pellet was resuspended in lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 30 mM NaCl, 10 mM imidazole, 10% (v / v) glycerol pH 8.0) with 1 mg / ml lysozyme, 0.01 mg / ml RNAse A, 0.02 mg / ml DNAse I, and 1 mM PMSF, and lysed using the One Shot CeIl disruptor (Constant Systems Ltd.).
  • the soluble fraction was deposited on a Ni Sepharose FF column
  • RvO636 Heterodimers During the chromatography steps described above, a coelution of the RvO635 proteins (fused with the N-terminal poly-histidine tag) and RvO636, and a coelution of the Rv0636 proteins (fused with the RvO636 protein) were demonstrated. N-terminal poly-histidine tag) and RvO637 ( Figure 2). These coelutions result from the interaction of Rv0635 with RvO636 on the one hand, and of RvO636 with RvO637 on the other hand.
  • Dynamic Light Scattering measurements were performed with a DynaPro-801 TC (Protein Solutions, Inc.), at a protein concentration of 12 mg / ml in 50 mM NaHePES, 150 mM NaCl, pH 7, 5, at temperatures of 8 to 20 ° C. The data were analyzed with Dynamics.
  • the sample showed a monomodal size distribution.
  • the 2-trans-enoy ⁇ -CoA was synthesized and purified according to the protocol described in Quémard et al, 1995.
  • the synthesis of 3-c / s-decenoyl-CoA was carried out as follows.
  • 3-m-decenoyl-CoA was prepared and purified from 3-cy-decenoic acid and CoA, using the same mixed anhydride method as for 2- fr- ⁇ -enoyl-CoA (Goldman & Vagelos, 1961). 3-czs-decenoyl-CoA was purified by reverse phase HPLC using a Nucleosil column 8 systems 8 x 250 nm
  • the 3-cis-decenoic acid was synthesized by the oxidation of 3-cis-decen-1-ol with pyridinium dichromate in dry dichloromethane and dimethylformamide, according to the described protocol of Besra (Besra et al., 1993). It was purified by silica gel chromatography using 80/20 (v / v) CHCl 3 / CH 3 OH as eluent, and characterized by 1 H-NMR spectroscopy.
  • the 3-c / s-decol -ol was obtained by semi-hydrogenation (1 atm) of a solution of 3-decyn-1-ol (158 mg) in dry diethyl ether over Lindlar's catalyst (40 mg) with vigorous stirring. That the hydrogen gas (1, 6 mmol) is absorbed. Then it was purified by adsorption chromatography on silica gel with silver nitrate using increasing concentrations of methanol in dichloromethane as eluent. 2-FrsO-octenoyl-ACP was synthesized from holo-ACP of is. coli (Sigma®) and 2-chloro-octenoic acid as previously described (Cronan & Klages, 1981).
  • Moistases / dehydratases (/?) - specific are more active in vitro in the sense of hydration than dehydration when isolated from their complex. Thus, their in vitro activity is often studied in the presence of alkyl derivatives rather than (3 ⁇ ) -hydroxyacyl.
  • the reaction followed is the conversion of a 2- (R) -enoyl-CoA (or ACP) to (3 R) -hydroxyacyl-CoA (or ACP) corresponding to the hydration reaction or the transformation of a (3i) ?) - hydroxyacyl-CoA at 2-toms-enoyl-CoA corresponding to the dehydration reaction.
  • the transformations corresponding to the hydration reaction and the dehydration reaction are respectively associated with a decrease and an increase in absorbance at 263 nm, related to the carbonyl conjugated double bond.
  • a concentration variation of 100 ⁇ M corresponds to a variation of OD 263 of 0.67.
  • the first hydration tests were carried out in the presence of 25 ⁇ M crotonoyl-CoA or 2-trans-octenoyl-CoA and the following ranges of enzyme concentrations: 0.8 to 280 nM of the heterodimer RvO635-RvO636, 0.8 to 543 nM of the heterodimer Rv0636-Rv0637
  • the dehydratase activity it was studied in the presence of 25 or 75 ⁇ M of substrate hydroxybutyryl-CoA and at the same concentration as enzyme for the hydase activity tests, namely 0.8 to 280 nM of the heterodimer Rv0635-Rv0636, 0.8 to 543 nM of the heterodimer Rv0636-Rv0637
  • the tests were carried out in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 in the presence of 3-hydroxybutyryl-CoA (25 or 75 ⁇ M) or 2-trans-octenoyl-CoA (25 ⁇ M) or crotonoyl-CoA ( 25 ⁇ M) and enzyme (Rv0635-Rv0636: 80 nM; Rv0636-Rv0637: 543 nM;).
  • enzyme Rv0635-Rv0636: 80 nM; Rv0636-Rv0637: 543 nM;
  • the activity of the various enzymes was tested on long chain derivatives, Ci 2 -C 2O IRA ".y-2-enoyl-CoAs.
  • the tests were carried out in the presence of a low concentration of substrates (2.5 ⁇ M) for the heterodimer Rv0635-Rv0636 in order to minimize the solubility problems related to these amphiphilic molecules.
  • the heterodimer Rv0636-Rv0637 the experiments were carried out in the presence of a higher concentration of substrate (25 ⁇ M) because at 2.5 ⁇ M, no activity could be detected.
  • the study of the specificity of Rv0635-Rv0636 was also carried out at 25 ⁇ M (FIG. 3).
  • the heterodimer-RvO635 RvO636 has a specificity profile significantly shifted to longer chains (CI -CI 2 O) and has an apparent specificity centered on the 2-trans-hexa decenoyl CoA (IO C) ( Figure 3A) . Indeed, no activity was detected in the presence of substrates with short chain (C 4 -Cg). At 25 ⁇ M of 2-frms-enoyl-CoA, the heterodimer Rv0635-Rv0636 has a similarity profile comparable to that obtained in the presence of 2.5 ⁇ M of substrate, except for the smaller difference between the activities. in the presence of substrates Ci 2 and C 2 o ( Figure 3D).
  • the dehydration step can be catalyzed by either (3 H) -hydroxyacyl-ACP dehydratase or (3 H) -hydroxyacyl-ACP FabA-type dehydratase / isomerase which transforms, in vivo, the 2- / 5-enoyles formed by the dehydration step into 3-en-3-enoyles.
  • the isomerase activity can be studied in vitro by studying the reverse reaction, that is to say the transformation of a 3-c / s-alkyl compound into 2-raysyl.
  • the ability of the proteins to catalyze the isomerization reaction was investigated in the presence of 3-cjs-decenoyl-CoA (10 ⁇ M) and enzyme Rv0635-Rv0636 (80 nM) or Rv0636-Rv0637 (543 nM).
  • the control experiments were carried out in presence of 2- (5-decenoyl-CoA (10 ⁇ M) and the same enzyme concentrations.
  • the reactions were followed at 263 rpm where the increase in absorbance results from the conversion of 3-c / s-decenoyl-CoA to 2-fr ⁇ ms-decenoyl-CoA.
  • Rv0635-Rv0636 enzyme 80 nM
  • Rv0636- RvO637 31 1 nM alone or RvO636 (311 nM) were compared in the presence of 2- / raw-octenoyl-ACP (2 .mu.M) or 2- / ram i -octenoyl-CoA (2 ⁇ M).
  • the heterodimer Rv0635-Rv0636 exhibited a specific activity in the presence of 2-r'-octenoyl-ACP of 0.28 ⁇ mol / min / mg whereas no significant activity was detected in the presence of the CoA derivative in these conditions (Figure 4A).
  • the specific activity detected in the presence of 2- ( ⁇ -octenoyl-ACP (2 ⁇ M) was 0.047 ⁇ mol / min / mg of protein whereas in the presence of 2- ⁇ - ⁇ -octenoyl-CoA (2 ⁇ M), its activity was not significant compared to the response of the control experiment (without enzyme) (Figure 4B).
  • no activity of the homodimer RvO636 could be detected in the presence of octenoyl-ACP. Reaction in tandem with MabA and InhA
  • the MabA reaction (73 nM) was carried out in the presence of NADPH (64 ⁇ M) and 3-ketododecanoyl-CoA (C ) 2 , 53 ⁇ M), and after completion of the reaction (monitored at 340 nm) one of the heterodimers (ie 280 nM of Rv0635-Rv0636, or 1.65 ⁇ M of Rv0636-Rv0637) plus InhA (1.4 ⁇ M) were added in the presence of NADH (259 ⁇ M). Control experiments in the absence of the heterodimer or InhA were performed.
  • the reaction media were analyzed in MALDI-TOF mass spectrometry (MALDI-TOF MS).
  • the reaction media were first diluted 10 times in water.
  • the samples (1 .mu.l) were placed on the target plates, mixed with 1 .mu.l of matrix [10 mg / ml of 2,5-dihydroxybenzoic acid in water: acetonitrile, 8: 2 (v / v) and allowed to crystallize. at room temperature.
  • the coupling reaction analyzes were carried out in reflectron mode on a 4700 Analyzer mass spectrometer (Applied Biosystems) equipped with a Nd: YAG laser (355 nm wavelength, pulses ⁇ 500-ps and 200 Hz). repetition rate). 2500 shots were accumulated in positive or negative ion mode and the mass spectrometry data was acquired using the default device calibration.
  • the MALDI-TOF mass spectrometry analysis of the reaction media demonstrates that the dodecanoyl-CoA, a product saturated with InhA, is formed very rapidly (in 3 min) in the presence of Rv0635-Rv0636 (FIG. 13C). This biosynthesis did not take place in the absence of the heterodimer (FIG. 13A). In the absence of InhA, a small proportion of dodecenoyl-CoA intermediate, a product of the hydration reaction catalyzed by Rv0635-Rv0636, appeared.
  • the RvO636 protein has the following properties:
  • the sequence coding for the Rv636 protein is located near the mmaAl-4 gene cluster involved in the biosynthesis of oxygenated mycolic acids in M. tuberculosis.
  • this protein has a conserved characteristic catalytic sequence, termed the hydratase unit 2 ( Figure 12) which includes the motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO: 16).
  • this protein belongs to the sub-family of hydratases 2.
  • the unit hydase 2 was first described in enoyl-CoA hydratases and was also found in the (3/2) -hydroxyacyl dehydratase domain of FAS-systems. I. This hydase 2 motif has recently been observed in the (3J) -hydroxyacyl-ACP dehydratase system FAS-
  • RvO635 and RvO637 proteins have the following properties: (i) they are ubiquitous among mycobacteria and only RvO635 is found in related genera (Corynebacte ⁇ nae); (ii) they are absent in Corynebacterium; (iii) their structure prediction corresponds to a SHD-like folding; (iv) but they do not have a catalytic motif; (v) they have the property of associating, independently to RvO636, forming heterodimers or multimers.
  • RvO635, RvO636 and RvO637 have the following properties:
  • Flavonoid inhibitors as novel antimycobacterial agents targeting RvO636, a putative dehydratase enzyme involved in Mycobacterium tuberculosis fatty acid synthase II. Microbiology 153, 3314-22.
  • Htd2p / YhrO67p is a yeast 3-hydroxyacyl-ACP dehydratase essential for mitochondrial function and morphology. Mol Microbiol 53, 1407-1421.

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Abstract

Enzymes (3R)-hydroxyacyl-ACP déshydratases impliquées dans la biosynthèse des acides mycoliques et leur utilisation pour le criblage d'antibiotiques, médicaments susceptibles d'être utilisés pour traiter des infections chez l'homme ou chez l'animal, dues à des Corynebacterineae et plus particulièrement des infections dues à des mycobactéries pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M. avium, M. fortuitum, M. kansasii...) ainsi que des infections provoquées par d'autres genres tels que Nocardia, Rhodococcus, Gordona...

Description

ENZYMES (3R)-HYDROXYACYL-ACP DESHYDRATASES IMPLIQUEES
DANS LA BIOSYNTHESE DES ACIDES MYCOLIQUES ET LEUR
UTILISATION POUR LE CRIBLAGE D'ANTIBIOTIQUES
La présente invention est relative à de nouvelles enzymes impliquées dans la biosynthèse des acides mycoliques et à leur utilisation pour le criblage d'antibiotiques, médicaments susceptibles d'être utilisés pour traiter des infections chez l'homme ou chez l'animal, dues à des Corynebacterineae et plus particulièrement des infections dues à des mycobactéries pathogènes {Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M. avium, M. fortuitum, M. kansasii...) ainsi que des infections provoquées par d'autres genres tels que Nocardia, Rhodococcus, Gordona...
Depuis une quinzaine d'années, on observe une recrudescence de la tuberculose (dont l'agent est M. tuberculosis), notamment dans les pays industrialisés, due à la fois à la multiplication des cas de co-infection tuberculose/VIH et à l'apparition de souches de bacille tuberculeux multirésistantes aux antibiotiques. Ainsi, la conception de nouveaux médicaments antituberculeux est redevenue une priorité. L'identification de cibles pharmacologiques est donc nécessaire pour le développement de nouveaux médicaments.
Les acides mycoliques mycobactériens, également appelés eumyco- lates, sont des acides gras à très longue chaîne (C60-C90), α-alkylés et β-hydroxylés, présents sous forme d'esters dans la paroi de bactéries d'une lignée phylogénétique particulière des actinomycètes, le sous-ordre des Corynebacterineae, également dénommés « mycolotas », comprenant, entre autres, les genres bactériens : Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia, Gordona et Tsukamurella. Les acides mycoliques sont ainsi spécifiques de l'enveloppe des mycobactéries et des bactéries apparentées (Brennan & Nikaido, 1995) ; les acides mycoliques mycobactériens se distinguent des acides mycoliques des genres apparentés qui ont des longueurs de chaîne plus courtes (Barry et al, 1998). Ces composés sont importants pour l'architecture et la perméabilité de l'enveloppe mycobactérienne pour laquelle ils représentent une barrière hydrophobe de diffusion (Brennan & Nikaido, 1995). De plus, ils ont un rôle essentiel dans la survie des mycobactéries, et ils sont impliqués dans la virulence et la persistance du bacille tuberculeux chez l'hôte infecté (Dubnau et al., 2000 ; Glickman et al., 2000).
Parmi les mycolotas, on trouve des pathogènes majeurs, notamment les mycobactéries Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose et Mycobacte- rium leprae, agent de la lèpre. Plus précisément, le genre Mycobacterium comprend plusieurs espèces classées en 3 groupes en fonction de leur risque d'infection pour l'homme. Dans le groupe des pathogènes stricts, plusieurs espèces sont retrouvées dont le bacille de la lèpre M. leprae ainsi que M. tuberculosis qui appartient au sous-groupe appelé "complexe M. tuberculosis" . Ce sous-groupe est constitué des 4 membres classiques : M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, et des 3 membres définis récemment M. Canetti, M. pinnipedii et M. caprae (Aranaz et al, 2003; Cousins et al, 2003; van Soolingen et al, 1997). Le deuxième groupe correspond aux pathogènes opportunistes pour l'homme (comme M. avium, M. fortuitum, M. kansasii...) qui ont été isolés chez certains animaux et dans l'environnement. Ces mycobactéries sont responsables de pathologies chez l'homme (mycobactérioses) notamment chez des sujets présentant un système immunitaire affaibli (par exemple, les personnes atteintes de SIDA). Enfin, le troisième groupe correspond aux mycobactéries non pathogènes saprophytes (M. smegmatis, M. phlei, M. gastri...) présentes dans l'environnement.
Parmi les médicaments anti -tuberculeux, se trouvent ceux qui inter- fèrent avec la biosynthèse de l'enveloppe des mycobactéries, tels que l'isoniazide, l'éthionamide et l'éthambutol (WEBB et al., Molecular Biology and Virulence 1 : 287- 307 (eds. Ratledge, C. & DaIe, J.) (Blackwell Science Ltd, Oxford), 1999). L'isoniazide, antibiotique spécifiquement antituberculeux a principalement pour cible une enzyme du métabolisme des acides mycoliques ; il inhibe l'activité de la protéine InhA, qui fait partie du complexe enzymatique ou système FAS-II, dont la fonction est de produire par cycles d'élongation successifs, des acides gras à longue chaîne (acyl- ACP jusqu'à C32 in vitro, voire jusqu'à C60 in vivo), précurseurs des acides mycoliques, en utilisant le malonyl-ACP comme unité d'élongation. InhA, une 2- fra«s-enoyl-ACP réductase, catalyse la 4eme étape d'un cycle d'élongation qui comprend quatre étapes (figure 1). Le système FAS-II est présent chez les plantes, les bactéries (par exemple Rhodococcus, Nocardia et Mycobacterium), les parasites (par exemple Plasmodium) et dans les mitochondries. Plus précisément, l'initiation du système d'élongation du système FAS-II mycobactérien est réalisée par une /?-cétoacyl-ACP synthase III, (mtFabH ou KasIII), faisant probablement le lien entre les deux systèmes FAS-I et FAS-II en catalysant la condensation des acyl-CoA dérivés de FAS-I avec l'unité d'élongation, le malonyl-ACP (Choi et al, 2000) (figure 1). Le système FAS-II, quant à lui, fait intervenir les protéines suivantes : la /?-cétoacyl-ACP réductase MabA (2cme étape), Penoyl-ACP réductase InhA (4eme étape), les /î-cétoacyl-ACP synthases KasA, KasB (lère étape) (Banerjee et al , 1998; Kremer et al, 2001 ; Kremer et al, 2002; Marrakchi et al, 2000; Quémard et al, 1995; Schaeffer et al , 2001b) (figure 1). La cible de l'isoniazide est l'enzyme InhA ; l'isoniazide est une pro-drogue qui forme avec le coenzyme de InhA, le NADH, un adduit inhibiteur. Dans un premier temps, MabA a été choisie comme cible et le criblage de molécules inhibant MabA (Demande Internationale WO 03/08291 1) a été proposé.
Toutefois, il existe un réel besoin de trouver des inhibiteurs d'autres enzymes de ce cycle, pour élargir la panoplie de médicaments disponibles, compte tenu de la fréquence d'apparition des résistances aux antibiotiques. D'autre part, multiplier les cibles augmente les chances de concevoir des molécules pharmaco- logiquement actives qui pourront effectivement être utilisées en clinique.
Parmi les enzymes du système FAS-II mycobactérien, l'enzyme (3/?)-hydroxyacyl-ACP déshydratase, intervenant dans la troisième étape du cycle et catalysant la transformation des (3/?)-hydroxyacyl-ACP en 2-?ramι-enoyl-ACP, n'a pas encore été identifiée. L'ensemble des enzymes ou domaines hydroxyacyl déshydra- tases sont difficiles à identifier à cause du manque de similarité entre les séquences. Ce fut par exemple le cas du domaine déshydratase de FAS-I de M. bovis BCG et de la (3Λ)-hydroxyacyl-ACP déshydratase du système FAS-II mitochondrial de Saccharo- myces cerevisiae (Fernandes & Kolattukudy, 1996; Kastaniotis et al, 2004). Une activité (3/?)-hydroxyacyl-ACP déshydratase a été observée chez des bactéries, (y compris Streptococcus, Staphylococcus, E. coli et Haemophilus influenzae), et correspond aux enzymes FabZ (déshydratase) et FabA (déshydratase-isomérase) (Brevet US 6,951,7298).
La recherche de protéines portant le motif consensus FabA/FabZ ('F- x(l,2)-G-H-[FI]-P-x(5)-P-G-V-x(3)-E-[AGS]-[LM]-A-Q') (SEQ ID NO: 17) dans le genre Mycobacterium à l'aide du logiciel ScanProsite (www.expasy.ch/tools/scanProsite) n'a pas permis d'identifier de protéines candidates (3i?)-hydroxyacyl déshydratases chez les mycobactéries. Ces résultats ont permis de conclure qu'aucune protéine de type FabZ ou FabA n'était présente chez les espèces mycobactériennes disponibles à travers le logiciel ScanProsite. Ceci suggérait que les protéines déshydratases/hydratases (iî)-spécifîques des mycobactéries devaient posséder un motif catalytique différent du motif commun FabA/FabZ.
Les Inventeurs ont maintenant déterminé les enzymes intervenant dans la troisième étape du cycle d'élongation des acides gras du système FAS-II myco- bactérien et leur intérêt comme cible pour le criblage de médicaments et notamment d'antibiotiques actifs sur les microorganismes (bactéries, parasites, par exemple) contenant un système FAS-II, dans lequel la troisième étape du cycle d'élongation est catalysée par une déshydratase contenant un motif hydratase 2 (figure 1 1), ou un motif catalytique dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D- x(4)-H, dans lequel x(4) représente quatre acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé, ou par un motif de base similaire.
On entend par « motif de base similaire », le motif de base D-x(4)-H, dans lequel l'acide aspartique (D) est substitué par un acide aminé choisi parmi le groupe constitué par l'asparagine (N), l'acide glutamique (E) et la glutamine (Q), et/ou l'histidine (H) est substituée par un acide aminé basique tel que Parginine (R) et la lysine (L).
Des molécules possédant un pouvoir inhibiteur sur l'expression ou l'activité des (Gφ-hydroxyacyl-ACP déshydratases du système FAS-II mycobactérien pourront également potentiellement inhiber d'autres métabolismes essentiels faisant intervenir des protéines de type hydratases 2, dans un microorganisme donné.
Les Inventeurs ont trouvé que les enzymes responsables de la troisième étape (déshydratation) dans le système FAS-II de M. tuberculosis H37rv correspondent à des protéines comprenant des sous-unités protéiques incluant RvO635 (SEQ ID NO :4), RvO636 (SEQ ID NO :2) ou RvO637 (SEQ ID NO :6) de M. tuber- culosis H37Rv. Les différentes enzymes contenant RvO636 sont dépendantes de l'ACP et présentent une spécificité pour des substrats à longues chaînes. La présente invention a en conséquence pour objet une enzyme purifiée et isolée, impliquée dans le système FAS-II, de préférence le système FAS-II mycobactérien, et possédant les caractéristiques suivantes : a) elle est constituée par un dimère ou un multimère sélectionné dans le groupe constitué par
(i) les homomultimères comprenant au moins trois protéines identiques comprenant un motif hydratase 2 [YF]-X( I ^)-[LIVG]-[STGC]-G-D-X-N-P-[LIV]-H-X(S)-[AS] (SEQ ID NO: 15), (dans lequel x(n) représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé, ou un motif similaire au motif de base, (ii) les hétérodimères et les hétéromultimères constitués d'au moins deux protéines différentes telles que définies en (i), ou d'une ou plusieurs protéines telles que définies en (i) et d'une ou plusieurs protéines ne portant pas de motif hydratase 2, mais dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog, de préférence d'une protéine telle que définies en (i) et d'une protéine ne portant pas de motif hydratase 2, mais dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog ; et b) elle catalyse la déshydratation d'un substrat (3/?)-hydroxyacyl en 2-/rα«^-enoyl et/ou l'hydratation d'un substrat 2-trans-enoy\ en (3i?)-hydroxyacyl, conformément au schéma suivant :
X dans lequel X représente ACP et n≥O, de préférence n>4, ou CoA et n≥O, de préférence n>8.
La protéine ne portant pas de motif hydratase 2 (i.e. sans site catalytique) est, par exemple, une protéine fixant une longue chaîne acyle. Le terme « multimère » signifie au moins trois protéines. Les méthodes permettant d'identifier une protéine dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog sont bien connues. A titre d'exemple, des protéines dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog, ont été décrites par Leesong et al, 1996 et Hisano et al, 2003. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine telle que définie en (i) est sélectionnée dans le groupe constitué par la protéine RvO636 (SEQ ID NO:2) comprenant un motif hydratase 2 Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I- H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16) et une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine RvO636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculosis H37rv.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine telle que définie en (ii) qui ne comporte pas de motif hydratase 2, est sélectionnée dans le groupe constitué par : - la protéine RvO635 (SEQ ID NO :4) ou une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine RvO635 de séquence SEQ ID NO :4 de M. tuberculosis H37RV et - la protéine RvO637 (SEQ ID NO :6) ou une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine RvO637 de séquence SEQ ID NO :6 de M. tuberculosis H37Rv.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le dimère ou multimère est sélectionné dans le groupe constitué par : . un homomultimère de RvO636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, sur la totalité de sa séquence avec la protéine RvO636 de M. tuberculosis, . un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine RvO636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine RvO636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine RvO635 (SEQ ID NO :4) ou d'une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine RvO635 de séquence SEQ ID NO :4 de M. tuberculosis H37RV et . un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine RvO636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine RvO636 de séquence SEQ ID NO :2 de M tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine RvO637 (SEQ ID NO :6) ou d'une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine RvO637 de séquence SEQ ID NO :6 de M. tuberculosis H37Rv .
Les enzymes conformes à l'invention interviennent ainsi dans la troisième étape de déshydratation du cycle d'élongation du système FAS-II, et notamment le système FAS-II mycobactérien en tant que (3J?)-hydroxyacyl déshydratase (figure 1 ).
Les recherches BLAST ont permis de montrer que ces trois protéines sont très conservées parmi les mycobactéries (figures 7-9) :
- RvO635 : 70-100 % d'identité et 86-100 % de similarité chez M tuberculosis et M. avium, M. smegmatis, M. bovis et M. leprae ; 53 % d'identité et
67 % de similarité chez Nocardia et Rhodococcus.
- RvO636 : 85-100 % d'identité et 90-100 % de similarité chez M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium et M smegmatis ; 51-63 % d'identité et 72-78 % de similarité chez Nocardia et Rhodococcus. - RvO637 : 68-100 % d'identité et 83-100 % de similarité chez M tuberculosis, M. avium, M. smegmatis, M. bovis et M leprae.
En outre, la séquence d'autres Corynebacterinae, à savoir Coryne- bacterium glutamicum, Rhodococcus sp. RHAl et Nocardia farcinica a été analysée.
Alors que Corynebacterium produit des acides mycoliques courts (C32-C36), Rhodo- coccus et Nocardia possèdent des acides mycoliques de taille intermédiaire (C34-C48 et
C44-C6O respectivement), présentant une chaîne méromycolique de longueur moyenne
(C22-C30 et C32-C42) c'est-à-dire plus courte que celle observée dans le genre Myco- bacterium. Comme cela a été déjà observé pour d'autres enzymes impliquées dans le système FAS-II, des polypeptides similaires à RvO635, RvO636 et RvO637 n'ont pas pu être détectés chez Corynebacterium. Ceci est en concordance avec le fait que sa voie de biosynthèse des acides mycoliques n'inclut pas d'étape d'élongation des acides gras. Chez Rhodococcus et Nocardia, des protéines orthologues à RvO635 et RvO636 sont présentes (voir résultats ci-dessus), comme observé pour les protéines InhA, MabA et KasA. Par contre, aucun orthologue de la protéine RvO637 n'est présent, tout comme pour KasB. Il y a lieu de noter que les gènes équivalents à RvO635 et RvO636 sont fusionnés en un long gène unique chez Nocardia (figure 5). Les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 ainsi que les protéines ayant les pourcentages d'identité ou de similarité précisés ci-dessus peuvent avantageusement servir de cible pour le criblage d'antibiotiques utiles comme médicaments anti-infectieux.
Par x% d'identité entre un polypeptide P de longueur au moins égale à celle de la séquence de référence et une séquence de référence, on entend que lorsque les deux séquences sont alignées, x% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de ladite séquence de référence.
Par x% de similarité entre un polypeptide P de longueur au moins égale à celle de la séquence de référence et une séquence de référence, on entend que lorsque les deux polypeptides sont alignés, x% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de ladite séquence de référence ou sont remplacés par un acide aminé du même groupe. Lorsque le polypeptide P est de longueur inférieure à celle de la séquence de référence, l'alignement se fait sur la longueur totale du polypeptide P. Les figures 7-9 montrent les résultats obtenus. Par acide aminé de même groupe, on entend un acide aminé possédant des propriétés chimiques sensiblement identiques. En particulier, on entend par ce terme des acides aminés ayant sensiblement la même charge et/ou la même taille, et/ou la même hydrophilie ou hydrophobie et/ou la même aromaticité.
De tels groupes d'acides aminés incluent notamment ; (i) glycine, alanine
(ii) isoleucine, leucine, valine
(iii) tryptophane, tyrosine, phénylalanine (iv) acide aspartique, acide glutamique (v) arginine, lysine, histidine (vi) serine, thréonine
D'autres substitutions peuvent être envisagées, dans lesquelles on remplace un acide aminé par un autre acide aminé comparable mais non naturel (hydroxyproline, norleucine, ornithine, citrulline, cyclohexylalanine, acides aminés dextrogyres, ....).
Les pourcentages d'identité et les pourcentages de similarité définis peuvent être obtenus en utilisant le programme BLAST (ou blast2seq, default para- meters) (Tatustore et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999, 174, 247-250) ou PSI-BLAST (Altschul et al., 1997) avec une fenêtre de comparaison correspondant à la longueur totale des séquences SEQ ID NO:2, 4 et 6, lorsque le polypeptide P comparé est de longueur au moins égale à celle des séquences SEQ ID NO:2, 4 et 6. Lorsque le polypeptide P à comparer est de longueur inférieure à celles des séquences SEQ ID NO: 2, 4 et 6, la fenêtre de comparaison correspond à la longueur totale du polypeptide P.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites enzymes sont sélectionnées dans le groupe constitué par : l'homomultimère de RvO636, l'hétérodimère ou l'hétéromultimère Rv0635-Rv0636 et l'hétérodimère ou l'hétéromultimère Rv0636-Rv0637. De manière surprenante, les enzymes comprenant RvO636 associée en hétérodimère ou en hétéromultimère avec RvO635 ou Rv0637 possèdent une activité d'enoyl-CoA hydratase in vitro. En particulier, ces deux hétérodimères catalysent efficacement l'hydratation de 2-frara-enoyl-CoA en Ci2-C2O alors qu'aucune activité n'est détectée en présence de substrats à courte chaîne (C4-C8). Ils présentent donc une spécificité pour des substrats de taille supérieure ou égale à 12 atomes de carbone, propriété comparable aux protéines du système FAS-II mycobacté- rien InhA, KasA et KasB et au système FAS-II lui-même (figure 3).
Bien entendu, la spécificité d'une enzyme selon l'invention pour une taille donnée de la chaîne acyle des substrats peut être fonction de l'origine (plante, parasite, bactérie, mitochondrie) de ladite enzyme.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le substrat (3i?)-hydroxyacyl et/ou 2-trans-enoy\ desdites enzymes est de préférence un substrat ayant une chaîne acyle de longueur égale ou supérieure à C8, de préférence en Ci2-C20, dérivé d'ACP (figures 3 et 4).
RvO636 peut s'associer avec un partenaire ne comportant pas de motif catalytique hydratase 2. Ainsi, la protéine partenaire (RvO635 ou RvO637) est vraisemblablement présente pour stabiliser la longue chaîne acyle du substrat.
L'association de Rv0636 avec RvO635 (pour former un hétérodimère ou un hétéromultimère) induit une spécificité différente, mais aussi une activité spécifique bien supérieure en comparaison de celle obtenue avec Phétérodimère Rv0636-Rv0637 (figure 3). Cette dernière enzyme présente une activité croissante suivant l'augmentation de la longueur de chaîne des substrats 2-/ra«s-enoyl-CoA (Ci2- C20), avec une activité optimale apparente pour le substrat C20 (figure 3). Les profils de spécificité de Rv0635-Rv0636 et RvO636-RvO637 sont comparables à ceux obtenus pour certaines protéines du système FAS-II mycobactérien et montrent qu'ils appartiennent au système FAS-II. Le fait que les hétérodimères présentent une activité beaucoup plus élevée en présence de dérivé d'ACP que de dérivé de CoA confirme cette appartenance (figure 4). Cela expliquerait la faible activité spécifique de ces enzymes en présence de dérivés de CoA.
De plus, le fait que la spécificité de substrats de Rv0636-Rv0637 soit déplacée vers les longues chaînes montre qu'il pourrait être impliqué, comme KasB, dans les dernières étapes de l'élongation de la chaîne méromycolique, et prendre le relais de Rv0635-Rv0636 (figure 6). Cette hypothèse est renforcée par le fait, notam- ment qu'aucun orthologue de RvO637 n'est retrouvé dans les espèces séquencées de
Nocardia et Rhodococcus. Ce schéma est retrouvé aussi pour KasB. Elle expliquerait la faible activité spécifique générale de Rv0636-Rv0637 (par rapport à RvO635- RvO636) qui devrait alors métaboliser des substrats à très longue chaîne (jusqu'à Cβo environ) (figure 6).
De manière surprenante, les résultats obtenus montrent que les deux hétérodimères ou multimères RvO635-RvO636 et RvO636-RvO637 interviennent dans l'étape de déshydratation du système FAS-II mycobactérien, et plus précisément que Rv0635-Rv0636 serait impliqué dans les premiers cycles d'élongation alors que
Rv0636-Rv0637 interviendrait dans les cycles plus tardifs. Les Inventeurs ont produit et purifié les différents dimères ou multi- mères sous forme recombinante et ont déterminé leur activité catalytique.
Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent que ces différents dimères correspondent effectivement à la (3i?,)-hydroxyacyl-ACP déshydratase inter- venant dans la troisième étape de déshydratation du système FAS-II mycobactérien et qu'il s'agit d'enzymes clés dans l'assemblage de l'enveloppe des mycolates. Des expériences de prédiction d'essentialité chez Mycobacterium tuberculosis suggèrent que les gènes RvO635 et RvO636 seraient essentiels pour la viabilité de cette espèce (Sassetti et al., 2003). Auparavant des enzymes appartenant à la famille des hydratases 2 sous forme d'hétéromultimères (par exemple d'hétérodimères), composées d'unités avec un repliement en simple « hot dog » correspondant à une sous-unité catalytique et à une sous-unité sans site catalytique, n'ont jamais été décrites.
En effet, dans l'art antérieur, seule une structure de type "asymétrique" a été décrite pour le domaine hydratase en double hot dog des protéines MFE-2 eucaryotes et a été prédite (par modélisation) pour l'enzyme hydratase/déshydratase Rv3389c de M tuberculosis, mais dans ces deux cas la structure est composée d'un seul polypeptide possédant deux domaines structuraux, l'un catalytique, l'autre non-catalytique, liés de façon covalente. La structure originale des enzymes selon l'invention peut favoriser la découverte de ligands spécifiques potentiellement inhibiteurs de ces enzymes.
La présente invention a également pour objet les polynucléotides codant pour les différentes protéines telles que définies ci-dessus, notamment les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 ; en particulier le polynucléotide de SEQ ID NO : 1 code pour la protéine RvO636 ; le polynucléotide de SEQ ID NO :3 code pour la protéine RvO635 et le polynucléotide SEQ ID NO :5 code pour la protéine RvO637 ; le polynucléotide comprenant la séquence qui code pour une protéine RvO636 et la séquence qui code pour une protéine RvO635 et/ou une protéine RvO637.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide représenté à la séquence SEQ ID NO :7 de la liste de séquences jointe en annexe ; il comprend les ORFs codant pour les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 situées entre les positions 731930 et 733525 du génome de M. tuberculosis H37Rv. Les coordon- nées chromosomiques des ORFs dans ledit polynucléotide sont les suivantes : RvO635 : 731930-732406 (positions 201-677 de la SEQ ID NO:7) ; RvO636 : 732393- 732821 (positions 664-1092 de la SEQ ID NO:7) ; RvO637 : 732825-733325 (positions 1096-1596 de la SEQ ID NO:7) (figure 12). La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus et notamment un polynucléotide codant pour une protéine RvO636 conforme à l'invention seul ou associé à un polynucléotide codant pour la protéine RvO635 et/ou la protéine RvO637, ainsi qu'une cellule-hôte, procaryote ou eucaryote, transformée par ledit vecteur d'expression.
Le vecteur utilisé est n'importe quel vecteur de l'état de la technique. Ledit vecteur peut également comprendre des séquences de régulation pour l'expression de la protéine codée par le polynucléotide (promoteur, site de terminaison, etc.). L'introduction du polynucléotide ou du vecteur d'expression dans la cellule hôte modifiée peut être effectuée par n'importe quelle méthode connue telle que, par exemple, transfection, infection, fusion, électroporation, microinjection ou biolistique.
La présente invention a également pour objet un procédé de produc- tion d'une enzyme conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte conforme à l'invention dans un milieu convenable et la purification de ladite enzyme à partir de ladite culture.
De manière avantageuse, ladite purification se fait par chromato- graphie d'affinité, par exemple IMAC et/ou chromatographie d'exclusion. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer la colonne IMAC Ni-sépharose FF et la colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade.
La présente invention a également pour objet un procédé pour inhiber la biosynthèse de composés de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'au moins l'une des enzymes telles que définies ci-dessus, sélectionnées dans le groupe constitué par la protéine RvO636, la protéine RvO635, la protéine RvO637 et/ou les complexes protéiques tels que définis ci-dessus (dimères et multimères comprenant la protéine RvO636). Par exemple, de tels inhibiteurs peuvent être des anticorps dirigés contre ces protéines, des ARN antisens ou des ARN interférents ciblant les gènes codant ces protéines, des molécules se fixant dans le site actif ou dans le site de fixation des substrats de ces protéines, ou, en particulier, des composés possédant une structure phénylbenzopyrone tels que les flavonoïdes (Brown et al., 2007).
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend : a) l'incubation d'un substrat convenable sélectionné dans le groupe constitué par les (3/?)-hydroxyacyl-ACP, les ?rara-2-enoyl-ACP, les QR)- hydroxyacyl-CoA et les tra«5-2-enoyl-CoA avec une enzyme conforme à l'invention, en présence ou en l'absence de la molécule à tester, et b) la comparaison de l'activité de l'enzyme selon l'invention en présence et en l'absence de la molécule à tester.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de ligands inhibiteurs d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, Rv0636 et RvO637, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'identification de l'inhibition de l'expression ou de l'activité de ladite enzyme ou de ladite protéine. L'inhibition de l'activité hydratase/déshydratase peut être effectuée par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier et notamment par mesure d'une variation d'absorbance liée à la disparition du substrat ou à l'apparition d'un produit, à une longueur d'onde appropriée ou par une réaction en tandem (enzyme secondaire ou anticorps qui détectera la quantité résiduelle de substrat ou la quantité de produit formé).
Par exemple, la détection du pouvoir inhibiteur de la dite molécule à tester est réalisée par :
Bl) mesure de la variation d'absorbance liée à la disparition du substrat ou à l'apparition du produit formé à 263 nm B2) détermination de l'activité enzymatique témoin, en l'absence de ladite molécule à tester B3) détermination de l'activité enzymatique en présence de ladite molécule à tester et
B4) comparaison des mesures obtenues en B2) et en B3). Ainsi, les tests d'inhibition des protéines constituées par au moins l'une des protéines RvO635, RvO636 et RvO637 ou des enzymes telles que définies ci- dessus, par des inhibiteurs potentiels, peuvent être suivies de façon aisée et rapide, par spectrophotométrie, en suivant l'hydratation de la double liaison trans en position 2 des substrats fr-α«s-2-enoyl ou la déshydratation des substrats (3i?)-hydroxyacyl, à 263 nm. Les constantes d'inhibition (Ki) et le mécanisme d'inhibition (inhibition compé- titive, non compétitive, incompétitive, irréversible, slow binding...) pour chaque molécule peuvent en être déduits. De plus, des tests de fixation de ligands sur les protéines peuvent être réalisés également par spectrofluorimétrie, grâce à la présence de résidus Trp, notamment dans le site de fixation du substrat. Après excitation à 303 nm, la variation d'intensité d'émission de fluorescence au maximum d'émission permet de détecter la fixation d'un ligand et d'en déduire la constante de dissociation (Kd). La simplicité de ces méthodes de mesure, et les volumes relativement faibles qu'elles requièrent, devraient permettre une miniaturisation des tests d'inhibition ou de fixation de ligand, pour le criblage automatique à haut débit de chimiothèques, grâce à un automate doté d'un spectrophotomètre ou d'un spectrofluorimètre. Du fait de son caractère prédit comme essentiel pour la viabilité, et de la spécificité de sa fonction, la (3i?)-hydroxyacyl-ACP déshydratase du système FAS-II mycobactérien constitue une excellente cible potentielle pour la conception de nouveaux médicaments anti-mycobactériens, notamment agissant sur la croissance et/ou sur la viabilité de mycobactéries pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, M. afήcanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M. avium, M. fortuitum, M. kansasii...) ou de nouveaux médicaments agissant sur la croissance et/ou la viabilité de genres apparentés aux mycobactéries appartenant aux Corynebacteri- neae (par exemple, Nocardia, Rhodococcus, Gordona...).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une enzyme telle que définie ci-dessus, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les microorganismes contenant un système FAS-II, dans lequel l'étape de déshydratation est catalysée par une déshydratase contenant un motif hydratase 2 [YF]-x(l,2)-[LIVG]- [STGC]-G-D-X-N-P-[LIV]-H-X(S)-[AS] (SEQ ID NO: 15), (dans lequel x(n) représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique, dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé, ou par un motif similaire au motif de base.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux de cette utilisation, le motif hydratase 2 est le motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO: 16). Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de cette utilisation, lesdits microorganismes sont des Corynebacterinae, de préférence des bactéries des genres Rhodococcus, Nocardia et Mycobacterium, de préférence Mycobacterium.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de ligands d'une protéine (de préférence RvO635, RvO636 et RvO637, sous forme monomérique et plus préférentiellement RvO636) ou d'une enzyme conformes à l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en présence de la protéine ou de l'enzyme telle que définie ci-dessus, dans un milieu réactionnel comprenant le ligand potentiel à tester,
- la mesure après excitation à 303 nm de la variation d'intensité de fluorescence au maximum d'émission,
- et sur la base de cette mesure, la détection de la fixation dudit ligand sur l'une ou plusieurs des protéines constituant l'enzyme telle que définie ci- dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de ligands d'une protéine (de préférence RvO635, RvO636 et RvO637, et plus préférentiellement RvO636) ou d'une enzyme conformes à l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- la mise en présence d'une protéine ou d'une enzyme selon l'invention avec le ligand à tester et - l'analyse du complexe formé en phase soluble entre ladite enzyme et ledit ligand, notamment par RMN et/ou par fluorescence.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente le cycle des acides gras par le système FAS-II dans les mycobactéries. n > 8. Le nom des enzymes catalysant des étapes similaires dans E. coli est mentionné entre parenthèses. AcpM : ACP mycobactérien impliqué dans le système FAS-II.
- la figure 2 illustre les analyses SDS-PAGE des fractions de chromatographie sur colonne de nickel et sur colonne d'exclusion lors de la purification des produits des gènes hadA-hadB (Rv0635-Rv0636) et hadB-hadC
(Rv0636-Rv0637) obtenus à partir de deux souches àΕ. coli recombinantes. Pistes : a : protéines solubles totales ; b : pool des fractions après colonne Ni-sepharose ; c, d : fractions après colonne Superdex S75 ; Mr : marqueurs de taille. Taille des protéines monomériques : H-HadA (H-RvO635), 18,3 kDa ; HadB (RvO636), 14,8 kDa ; H- HadB (H-RvO636), 15,9 kDa ; HadC (RvO637), 18,9 kDa.
- la figure 3 représente les profils de spécificité des enzymes hétérodimèriques Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 pour les 2-fra/?.s-enoyl-CoA de différentes longueurs de chaîne. Les données sont des moyennes de vitesses initiales avec des déviations standard. Les déviations standard plus importantes observées pour les substrats à longue chaîne sont dues à des problèmes de solubilité. Les tests ont été réalisés en présence de concentrations fixes en substrat et en enzyme dans du tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7,0. Les activités détectées pour les deux hétérodimères en présence de substrats à courte chaîne (C4, C8) ne sont pas significativement différentes des activités détectées dans les expériences contrôles en absence d'enzyme. La concentration de chaque enzyme a été adaptée afin d'obtenir des conditions optimales de mesure de la vitesse initiale. Spécificité de Phétérodimère Rv0635-Rv0636 en présence de 2,5 μM (A) ou 25 μM (B) de 2-/rara-enoyl-CoA. Spécificité de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 en présence de 25 μM (C) de 2-trans- enoyl-CoA. - la figure 4 représente la comparaison de l'activité spécifique des hétérodimères RvO635-RvO636 et Rv0636-Rv0637 en présence de 2-frmw-octenoyl- ACP et de 2-rra«.s-octenoyl-CoA. Les données sont des moyennes de vitesses initiales avec des déviations standard. Les tests ont été réalisés en présence de 2 μM de substrat et, de concentrations fixes en enzymes Rv0635-Rv0636 (80 nM) (A) ou RvO636- RvO637 (543 nM) (B), et suivis par spectrophotométrie à 263 nm. Les réponses obtenues pour les hétérodimères Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 en présence du 2-fπmy-octenoyl-CoA n'est pas significativement différente de la réponse obtenue pour les expériences contrôles (en absence d'enzyme).
- la figure 5 illustre l'organisation chromosomique de l'ensemble des gènes RvO635, RvO636 et RvO637 ou des gènes orthologues chez différentes Coryne- bacterinae. Les produits des gènes : thrT, t-RNA-Thr ; metT, t-RNA-Met ; rmpG2, probable protéine ribosomale 50S L33 ; trpT, t-RNA-Trp ; secEl, probable préprotéine translocase ; nusG, probable protéine d'anti-terminaison de la transcription ; rplK, rplA, probables protéines ribosomales 50S Ll 1 et Ll : mmaA4, acide mycolique (MA) méthyltransférase. ro01984 plus ro01983 et le gène de fusion nfa51180 sont des orthologues de hadA et hadB chez Rhodococcus sp. et Nocardia farcinica respectivement. Les schémas sont basés sur les génomes séquences de Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium et des souches du complexe Mtb et de M. leaprae. Il est à noter que des variations en aval du gène rplA existent dans d'autres génomes de mycobactéries qui ont été séquences.
- la figure 6 illustre le modèle des rôles des hétérodimères RvO635- RvO636 (HadAB) et Rv0636-Rv0637 (HadBC) dans la voie de biosynthèse des acides mycoliques. Ce modèle propose que l'enzyme Rv0635-Rv0636 (HadAB) est impliquée, tout comme l'enzyme KasA, dans les étapes précoces d'élongation des acides gras catalysées par le système FAS-II, conduisant à la formation des chaînes méromycoliques de taille intermédiaire (C22-C42) et par conséquent à la formation des acides mycoliques de longueur de chaîne moyenne trouvés chez Rhodococcus et Nocardia. Dans le genre Mycobacterium, l'enzyme Rv0636-Rv0637 (HadBC) interviendrait ensuite, tout comme l'enzyme KasB, dans les étapes tardives d'élongation des chaînes méromycoliques de taille intermédiaire en molécules de taille entière (Cs2-C64) catalysées par le système FAS-II, menant à la synthèse des acides eumycoliques (C74-C90). Seules certaines des protéines du système FAS-II sont mentionnées sur cette figure. - les figures 7, 8 et 9 représentent les pourcentages d'identité et les pourcentages de similarité des protéines RvO635, RvO636 et RvO637 avec les protéines orthologues rencontrées dans les mycobactéries, chez Rhodococcus et Nocardia, dont le génome a été séquence (mise à jour : 31/10/06). Dans le cas où le génome n'a pas encore été annoté, est mentionné le nom du contig renfermant le gène en question ainsi que l'emplacement du gène sur le contig (en paires de bases). Le nombre total d'acides aminés (aa) sur lequel a été fait l'alignement de séquence (logiciel BLASTP - protéine/protéine) est mentionné, ainsi que le score obtenu « E value ». Ces figures (7, 8 et 9) illustrent l'ubiquité des protéines RvO635, RvO636 et RvO637 chez les mycobactéries.
- la figure 10 illustre les séquences polypeptidiques correspondant aux séquences nucléotidiques clonées dans les souches de E. coli recombinantes.
- la figure 11 illustre l'alignement des séquences d'acides aminés des protéines RvO635 (numéro d'accès : P96926), RvO636 (numéro d'accès : P96927) et RvO637 (numéro d'accès : P96928), réalisé à l'aide du programme Clustal W. RvO636 présente 13% d'identité de séquence avec RvO635 et 15% avec RvO637. RvO636 et RvO637 présentent 45% d'identité entre elles. Les ombres noires et grises indiquent respectivement les résidus strictement conservés et similaires. Le motif hydratase 2 ([YF]-X(I ^)-[LIVG]-[STGC]-G-D-X-N-P-[UV]-H-X(S)-[AS]) de RvO636 est indiqué par des étoiles.
- la figure 12 représente les séquences codantes de l'opéron RvO635- Rv0636-Rv0637 chez M. tuberculosis. Le début (start) et la fin (end) de chaque ORF est indiquée par une flèche ou un trait, respectivement. Les gènes RvO635 et RvO636 sont chevauchants. - la figure 13 représente les tests de couplage de l'hétérodimère
Rv0635-Rv0636 (HadAB) en présence de MabA et InhA. Elle illustre les analyses MALDI-TOF MS du milieu réactionnel contenant 3-cétododécanoyl-CoA, NADPH, NADH, MabA plus InhA (A) ou plus 280 nM de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 (B) ou plus l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 et InhA (C). Pour (A) et (B), les pics à 966, 988, 1010, 1032 et 1054 m/z représentent respectivement les ions [M+H]+, [M+Na]+, [M-H+2Na]+, [M-2H+3Na]+ et [M-3H+4Na]+ du 3-hydroxydodécanoyl-CoA (produit de MabA). Pour (B), les pics mineurs à 948, 970, 992, 1014 et 1036 m/z représentent l'ion [M+H]+ et les produits d'addition mono- à tétra-sodium de l'espèce insaturée, dodécénoyl-CoA. Pour (C), les pics à 950, 972, 994, 1016 et 1038 représentent l'ion [M+H]+ et les produits d'addition mono- à tétra-sodium de l'espèce saturée, dodécanoyl-CoA. Les graphiques ajoutés en (A) et (C) illustrent la cinétique des réactions respectives à 340 nm (oxydation du coenzyme de InhA, le NADH). Les trois spectres correspondent au temps de 3 min de réaction.
- la figure 14 représente les tests de couplage de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 (HadBC) en présence de MabA et InhA. Elle illustre les analyses MALDI-TOF MS du milieu réactionnel contenant 3-cétododécanoyl-CoA, NADPH, NADH, MabA, plus InhA et l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 (HadBC) (1.65 μM), après 3h (A) et 24h (B) de réaction. Pour la signification des pics, voir la légende de la figure 13 ci-dessus. Les expériences témoins (sans hétérodimère ou sans InhA) sont similaires à celles obtenues en présence de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 (HadAB), bien que les pics ioniques ont différentes intensités. EXEMPLE 1 : Analyses bioinformatiques et modélisation moléculaire l.A. Analyses de séquences
Les analyses de séquences du génome ont été réalisées à l'aide des serveurs Internet de l'Institut Sanger et TubercuList pour Mycobacterium tuberculosis H37Rv (CoIe et al, 1998), et du site Internet "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) pour les autres génomes
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi). Les alignements de séquences ont été effectués en utilisant les logiciels BLAST ou PSI-BLAST, ClustalW version 1.8 ou MultAlin avec les paramètres par défaut (Altschul et al, 1997; Corpet, 1998; Thompson ét al, 1994). l.B. Définition du motif commun spécifique FabA/FabZ
Le programme PRATT version 2.1 de la base de données PROSITE (Jonassen et al, 1995) a été utilisé avec les paramètres par défaut pour définir les deux motifs spécifiques distincts des protéines annotées FabZ ou FabA, basés sur deux listes indépendantes de 36 séquences protéiques de type FabZ, et 24 séquences de type FabA [y compris la protéine FabZl d'Enterococcus faecalis dont la séquence est davantage apparentée aux protéines FabZ mais possédant une activité FabA (déshydratase/isomérase) (Wang & Cronan, 2004)]. Chaque motif a ensuite été utilisé comme sonde contre les banques de données proposées (Swiss-Prot, EMBL et TrEMBL) par le logiciel ScanProsite (paramètres par défaut) afin d'évaluer la spécificité du motif pour les deux familles de protéines (Gattiker et al, 2002). Un motif consensus commun spécifique des FabA/FabZ a ensuite été déterminé manuellement à partir des deux motifs préalablement définis. Ce motif consensus commun a été utilisé comme sonde contre l'ensemble des banques de données de protéines ou contre les banques des protéines prédites pour différentes espèces du genre Mycobacterium disponibles par ce logiciel. Une expérience témoin a été réalisée en utilisant la même stratégie que celle décrite ci-dessus, mais avec les protéines de la famille FabG. Cette analyse contre les protéines prédites du genre Mycobacterium a permis de piocher les protéines annotées comme FabG des espèces mycobactériennes et elle a montré que des protéines mycobactériennes pouvaient être détectées par cette stratégie. EXEMPLE 2 : Amplification PCR et clonage des gènes codant pour RvO635, RvO636 et RvO637 2.1 Amplification par PCR
RvO636
Le gène codant pour la protéine RvO636 a été amplifié par PCR {Polymerase Chain Réaction) en deux étapes, à partir de l'ADN total de la souche M. tuberculosis H37Rv. Dans une première réaction PCR, le couple d'amorces 5'-GAT TTT
CTG ATG GCG CTG CGT GAG TTC-3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 8) et 5'-CGG TCT TGA GCG CCA TAA ACT A-3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 9) a été utilisé. Dans une seconde réaction PCR, une étiquette N-terminale de 6 histidines a été introduite en utilisant l'amorce sens 5'-ATG GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG CTG CGT GAG TTC AGC TCG G-3' (SEQ ID NO : 10). Les réactions PCR ont été effectuées avec la polymerase PfuUltra (Stratagène). Rv0635-Rv0636
Afin de co-exprimer les protéines RvO635 et RvO636, les nucléotides 731 930 à 733 325 du génome de la souche de M. tuberculosis H37Rv, contenant les trois gènes RvO635, RvO636 et RvO637, ont été amplifiés par PCR à partir du cosmide MTCY20H10 (http://genolist.pasteur.fr/Tuberculist). Une étiquette N-terminale de 6 histidines a été introduite simultanément dans la réaction PCR en utilisant le couple d'amorces 5'-ATG GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG TTG AGC GCA GAC ATC G-3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 11) et 5'-CAG TTG CTA ATT ACG CGG TC-3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 12), et la polymérase PfuUltra (Stratagene). Rv0636-Rv0637
Afin de co-exprimer les protéines RvO636 et RvO6367, un fragment ADN contenant les deux gènes RvO636 et RvO637 a été amplifié à partir du cosmide MTCY20H10 (http://genolist.pasteur.fr/Tuberculist). Une étiquette N-terminale de 6 histidines a été introduite simultanément dans la réaction PCR en utilisant le couple d'amorces 5'-ATG GCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT GCG CTG CGT GAG TTC AGC TCG G-3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 13) et 5'-CAG TTG CTA ATT ACG CGG TC-3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 14), et la polymérase PfuUltra (Stratagene).
2.2 Ligαtion de l'ΛDN Après l'addition d'une extrémité 3' protrusive poly(A) par incubation avec la Taq polymérase (New England Biolabs), la ligation des gènes amplifiés avec le vecteur pCR T7 TOPO ou pEXP5-CT/T0P0 (Invitrogen) a été réalisée dans les conditions précisées par le fabricant.
2.3 Clonage Le clonage a été réalisé dans E. coli TOPl O (Invitrogen), et l'exactitude des gènes isolés a été contrôlée par analyse de la séquence ADN.
EXEMPLE 3 : Expression et purification des protéines RvO635, RvO636 et
RvO637
L'expression des gènes a été effectuée avec E. co//BL21-AI (Invitrogen) transformée par RvO636 et avec E. coliBLH Star (DE3) (Invitrogen) transformée par Rv0636-Rv0637 ou par Rv0635-Rv0636-Rv0637, les gènes étant intégrés dans les constructions décrites ci-dessus :
E. coli BL21 Star (OE3)/pEXP5-CT/TOPO::H-Rv0635-Rv0636-Rv0637 ;
E. co// BL21 Star (OE3)/pEX?5-CT/TOPO::H-Rv0636-Rv0637 et E. coli BL21 -AI/pCR T7 TOPO: :H-RvO636.
Les bactéries ont été cultivées dans le milieu LB (Luria Browth Base,
DIFCO-BRL) supplémenté avec 50 μg/ml d'ampicilline, à 37°C. RvO636
A une Dθ6oo=0,7-0,9, l'expression du gène cible RvO636 a été induite avec 0,02% d'arabinose pendant 3-4 heures. Après centrifugation des cultures bactériennes, le culot cellulaire a été re-suspendu dans un tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0), et lysé en utilisant des cycles de congélation-décongélation. La majeure partie de la protéine RvO636 est sous forme insoluble.
Après centrifugation à 19 000 t/min (43 00Ox g) pendant 20 minutes, l'extrait exempt de cellules a été déposé sur une colonne Ni Sepharose FF (1 ml, GE Healthcare) pré-équilibrée. Après lavage avec 20 volumes de colonne de tampon
(20 mM imidazole, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0), la protéine a été éluée avec 5 volumes de colonne de 250 mM imidazole dans le même tampon.
Les fractions contenant la protéine sont regroupées, puis leur tampon est changé par chromatographie sur colonne PD-10 (GE Healthcare). L'enzyme est purifiée plus avant sur une colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare) équilibrée avec le tampon 50 mM HEPES, 15OmM NaCl, pH 7,5. La solution de protéine purifiée est analysée par coloration au bleu de Coomassie sur SDS- PAGE (figure 2). Cette protéine est pure à 95 %. Elle est cependant relativement peu stable en solution. Du glycérol est ajouté à une concentration finale de 50% (v/v) et la protéine est conservée à -2O0C.
Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637
A une Dθ6oo=0,5-0,7, l'expression des gènes Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 a été induite avec 0,2 mM d'IPTG pendant 3-4 heures. Après centrifugation des cultures bactériennes, le culot cellulaire a été re-suspendu dans un tampon de lyse (5O mM NaH2PO4, 30O mM NaCl, 1O mM imidazole, 10%(v/v) glycérol pH 8,0) avec 1 mg/ml lysozyme, 0,01 mg/ml RNAse A, 0,02 mg/ml DNAse I, et 1 mM PMSF, et lysé en utilisant le One Shot CeIl disruptor (Constant Systems Ltd.).
La fraction soluble a été déposée sur une colonne Ni Sepharose FF
(1 ml, GE Healthcare) pré-équilibrée. Après lavage avec 20 volumes de colonne de tampon (2O mM imidazole, 5O mM NaH2PO4 ou HEPES, 30O mM NaCl, 10%(v/v) glycérol, pH 8.0), la protéine a été éluée avec 5 volumes de colonne du même tampon comprenant 250 mM imidazole. Les fractions contenant l'enzyme sont regroupées, puis leur tampon est changé par chromatographie sur colonne PD-IO (GE Healthcare). L'enzyme est purifiée plus avant sur colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 pre grade (GE Healthcare) équilibrée avec 5O mM HEPES, 15O mM NaCl, pH 7,5. Du glycérol est ajouté aux fractions (jusqu'à 50 % v/v) et la solution de protéine est stockée à -200C.
La solution de protéine purifiée est évaluée par coloration au bleu de Coomassie sur SDS-PAGE (figure 2), puis par spectrométrie de masse. EXEMPLE 4 : Analyse de Ia structure des protéines RvO635, Rv0636 et RvO637
Hétérodimères RvO636 Lors des étapes de chromatographie décrites ci-dessus il a été mis en évidence une coélution des protéines RvO635 (fusionnée avec l'étiquette poly-histidine en N-terminale) et RvO636, et une coélution des protéines Rv0636 (fusionnée avec l'étiquette poly-histidine en N-terminale) et RvO637 (figure 2). Ces coélutions résultent de l'interaction de Rv0635 avec RvO636 d'une part, et de RvO636 avec RvO637 d'autre part. L'étape de chromatographie d'exclusion, réalisée à 4°C, a suggéré que ces hétérocomplexes Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 étaient tétramériques (figure 2). La structure quaternaire de Rv0635-Rv0636 a été examinée plus avant par Dynamic Light Scattering.
Les mesures de la dispersion lumineuse dynamique {Dynamic Light Scattering) ont été effectuées avec un DynaPro-801 TC (Protein Solutions, Inc), à une concentration en protéine de 12 mg/ml dans 50 mM NaHEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, à des températures de 8 à 20 0C. Les données ont été analysées avec Dynamics.
L'échantillon a montré une distribution de taille monomodale.
Ces mesures ont confirmé que cette enzyme (33,1 kDa) forme un tétramère à basse température (8°C). Cependant, à plus haute température (20°C), elle se comporte comme un hétérodimère. Les résultats sont montrés au Tableau 1 ci- dessous. Tableau 1 : Mesures de la dispersion lumineuse dynamique du complexe RvO635- RvO636 à deux températures différentes.
Rayon Température Polydispersion Poids Moléculaire hydrodynamique
(0C) (nm) estimé
(nm)
8 3.4 ± 0.1 Ô/7 57
20 2.9 ± 0.1 0.7 37
EXEMPLE 5 : Mise en évidence de l'activité eatalytique des enzymes in vitro Synthèse des dérivés d'acides gras
Le 2-trans-enoy\-CoA. a été synthétisé et purifié suivant le protocole décrit dans Quémard et al, 1995. La synthèse du 3-c/s-decenoyl-CoA a été réalisée comme suit.
Le 3-m-decenoyl-CoA a été préparé et purifié à partir de l'acide 3- cw-décénoique et du CoA, suivant la même méthode d'anhydride mixte que pour les 2- fr-αra-enoyl-CoA (Goldman & Vagelos, 1961). Le 3-czs-decenoyl-CoA a été purifié par HPLC en phase inverse en utilisant une colonne Nucléosil Ci8 8 x 250 nm
(Bischoff Chromatography). La colonne a été préalablement équilibrée par un mélange méthanol/eau contenant 20 mM de NaH2PO4, et Pélution a été réalisée par un gradient de 10 à 60% de méthanol dans l'eau à 1 ,5 ml/min. La détection a été effectuée par mesure de Pabsorbance à 260 nm.
L'acide 3-c/^-décénoïque a été synthétisé par l'oxydation du 3-cis- decen-1-ol avec du dichromate de pyridinium dans du dichlorométhane et du diméthyl- formamide sec, suivant le protocole décrit de Besra (Besra et al., 1993). Il a été purifié par chromatographie en gel de silice en utilisant comme éluant un mélange CHCI3/CH3OH 80/20 (v/v), et caractérisé par spectroscopie RMN-1H. Le 3-c/s-decen- l -ol a été obtenu par semi hydrogénation eatalytique (1 atm) d'une solution de 3- decyn-1 -ol (158 mg) dans du diéthyl éther sec sur le catalyseur de Lindlar (40 mg) avec une agitation vive jusqu'à ce que le gaz hydrogène (1 ,6 mmol) soit absorbé. Puis il a été purifié par chromatographie d'adsorption sur gel de silice avec du nitrate d'argent en utilisant des concentrations croissantes de méthanol dans du dichlorométhane comme éluant. Le 2-frγw.s-octenoyl-ACP a été synthétisé à partir de l'holo-ACP d'is. coli (Sigma®) et de l'acide 2-fra«.j-octénoïque comme préalablement décrit (Cronan & Klages, 1981).
Calibration des solutions de réactifs Les concentrations des solutions de substrats 2-/ra«,s-enoyl-CoA, 3- czs-decenoyl-CoA, et du 2-/rara-octenoyl-ACP ont été déterminées par spectrophoto- métrie à 260 nm avec les coefficients d'extinction molaire suivants : pour les 2-trans- enoyl-CoA, ε26o = 22600 M-1Cm"1), pour le 3-cw-decenoyl-CoA, ε26o = 16800 M-1Cm"1, ou à 280 nm pour le 2-rrarcs-octenoyl-ACP (ε2go = 1800 M-1Cm"1). Puis une calibration plus précise de la concentration en 2-/rara-octenoyl-ACP a été effectuée en présence de l'enzyme InhA de M. tuberculosis purifiée (25 nM) et de NADH (à concentration saturante : 100 μM). La réaction a été suivie par spectrophotométrie à 340 nm, longueur d'onde où l'on suit l'oxydation du NADH, et la concentration totale de substrat transformé a été déduite. Principe du test enzymatique
Les hydratases/déshydratases (/?)-spécifîques sont plus actives in vitro dans le sens de l'hydratation que de la déshydratation lorsqu'elles sont isolées de leur complexe. Ainsi, leur activité in vitro est souvent étudiée en présence de dérivés enoyle plutôt que (3Λ)-hydroxyacyle.
3-hydroxyacyl-CoA 2-frα/ιs-enoyl-CoA
La réaction suivie est la transformation d'un 2-/ram'-enoyl-CoA (ou ACP) en (3i?)-hydroxyacyl-CoA (ou ACP) correspondant à la réaction d'hydratation ou la transformation d'un (3i?)-hydroxyacyl-CoA en 2-toms-enoyl-CoA correspondant à la réaction de déshydratation.
Conditions standards
Ces réactions sont suivies par spectrophotométrie à 263 nm à l'aide d'un spectrophotomètre Uvikon 923, thermostaté (Kontron Instruments). Elles sont réalisées dans une cuve en quartz (trajet optique de 1 cm) dans un volume total de 700 μl, à 25°C. Le mélange réactionnel contient du tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7,0, des concentrations variables en substrats. Après équilibration de la ligne de base sur le mélange réactionnel en absence de l'enzyme, les réactions sont déclenchées par l'ajout d'enzyme puis suivies pendant 1,5 à 5 min. La vitesse réactionnelle correspond à la vitesse initiale mesurée en traçant la tangente de la courbe DO = f(temps) au temps zéro.
Les transformations correspondant à la réaction d'hydratation et à la réaction de déshydratation sont associées respectivement a une diminution et à une augmentation de l'absorbance à 263 nm, liée à la double liaison conjuguée au carbo- nyle. A une variation de concentration de 100 μM correspond une variation de DO263 de 0,67.
Détermination de l'activité spécifique hydratase/déshydratase des enzymes Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637
Pour réaliser les différents tests enzymatiques, plusieurs concentrations en enzyme ont été testées ce qui a permis de définir pour chaque enzyme la concentration la plus adéquate pour les mesures.
Afin de déterminer si les enzymes sont actives, les premiers tests d'hydratation ont été réalisés en présence de 25 μM de crotonoyl-CoA ou de 2-trans- octenoyl-CoA et des gammes de concentrations en enzyme suivantes : 0,8 à 280 nM de l'hétérodimère RvO635-RvO636, 0,8 à 543 nM de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 Quant à l'activité déshydratase, elle a été étudiée en présence de 25 ou 75 μM de substrat hydroxybutyryl-CoA et à la même concentration en enzyme que pour les tests d'activité hydratase, à savoir 0,8 à 280 nM de l'hétérodimère Rv0635-Rv0636, 0,8 à 543 nM de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637
Détermination de la spécificité de substrats des enzymes La spécificité de substrats a été étudiée en présence de 2-trans-&noy\-
CoA de différentes longueurs de chaîne (C4-Q0). Les vitesses initiales ont été mesurées et comparées à une très faible concentration en substrat pour réduire au maximum les problèmes de solubilité rencontrés avec ces composés amphiphiles. Les réactions ont été réalisées en présence de 2,5 ou 25 μM de substrat ; les concentrations respec- tives des enzymes Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 étaient les suivantes : 80 nM et 543 nM. Activité sur des substrats en C4-Cs
L'activité des hétérodimères Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637 purifiés a été testée en présence d'un 2-fr-αn.s-enoyl-CoA puisque les déshydratases/hydratases (/^-spécifiques fonctionnent préférentiellement dans le sens de l'hydratation in vitro lorsqu'elles sont isolées de leur complexe.
Les tests ont été réalisés dans du tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7,0 en présence de 3-hydroxybutyryl-CoA (25 ou 75 μM) ou de 2-trans- octenoyl-CoA (25 μM) ou de crotonoyl-CoA (25 μM) et d'enzyme (Rv0635-Rv0636 : 80 nM; Rv0636-Rv0637 : 543 nM;). Plusieurs concentrations en enzyme ont été testées. Dans le cas où aucune activité n'a été détectée, la concentration maximale testée est indiquée. Après addition de l'enzyme, les réactions ont été suivies par spectrophotométrie à 263 nm pendant 1,5 min.
Les résultats ont montré que ces enzymes ne sont pas actives dans ces conditions sur des substrats en C4 ou en C8, puisque aucune baisse d'absorbance n'a été observée.
Activité sur des substrats en Cn-C2O
L'activité des différentes enzymes a été testée sur des dérivés à longue chaîne, des Ci2-C2O ïra«.y-2-enoyl-CoAs. Les tests ont été réalisés en présence d'une faible concentration en substrats (2,5 μM) pour l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 afin de réduire au maximum les problèmes de solubilité liés à ces molécules amphi- philes. Pour l'hétérodimère Rv0636-Rv0637, les expériences ont été réalisées en présence d'une plus forte concentration en substrat (25 μM) car à 2,5 μM, aucune activité n'a pu être détectée. Pour pouvoir comparer, l'étude de la spécificité de Rv0635-Rv0636 a été également effectuée à 25 μM (figure 3). L'hétérodimère RvO635-RvO636 présente un profil de spécificité nettement déplacé vers les longues chaînes (CI2-CIÔ) et il présente une spécificité apparente centrée sur le 2-trans-hexa- decenoyl-CoA (CIÔ) (figure 3A). En effet, aucune activité n'a été détectée en présence de substrats à courte chaîne (C4-Cg). A 25 μM de 2-frτms-enoyl-CoA, l'hétérodimère Rv0635-Rv0636 présente un profil de spécificité comparable à celui obtenu en présence de 2,5 μM de substrat, si ce n'est l'écart plus faible entre les activités en présence des substrats Ci2 et C2o (figure 3D). Cette diminution d'écart pourrait être due à un problème de solubilité induisant la formation de micelles du substrat à longue chaîne C2o à 25 μM. Pour rhétérodimère Rv0636-Rv0637, des profils de spécificité similaires ont été observés (figures 3B, 3C). Ces enzymes, inactives dans ces conditions en présence de substrats à courte chaîne (C4-C8), montrent une spécificité pour des substrats à moyenne et longue chaîne (C12-C2o). Mais contrairement à RvO635- RvO636, leur activité augmente graduellement avec la longueur de chaîne, jusqu'à C20. Ces résultats mettent en évidence des différences importantes au niveau de la spécificité de substrats des enzymes conformes à l'invention. La préférence apparente de rhétérodimère Rv0635-Rv0636 pour l'hexadecenoyl-CoA (Ci6) rappelle celle de la protéine InhA du système FAS-II mycobactérien (Quémard et al., 1995) (figure 3F). Il est intéressant de noter que l'association de RvO636 avec RvO635 en hétérodimère s'accompagne d'une augmentation très importante de l'activité spécifique (grossièrement d'un facteur 100) par rapport à l'association de RvO636 avec RvO637.
Ces résultats confirment que les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 sont impliquées dans le système d'élongation FAS-II mycobactérien puisque les enzymes qu'elles forment présentent une spécificité de substrats à moyenne et longue chaîne (Ci2-C2o), comme le système FAS-II et certaines de ses protéines déjà caractérisées.
Détermination de l'activité isomérase des enzymes Comme dans certains systèmes FAS-II décrits, l'étape de déshydratation peut être catalysée soit par une (3/?)-hydroxyacyl-ACP déshydratase, soit par une (3i?)-hydroxyacyl-ACP déshydratase/isomérase de type FabA qui transforme, in vivo, les 2-/rα«5-enoyles, formés par l'étape de déshydratation, en 3-cw-enoyles. L'activité isomérase peut être étudiée in vitro en étudiant la réaction inverse, c'est-à- dire la transformation d'un composé 3-c/s-enoyle en 2-rra«s-enoyle.
CH3-
3-c/s-decenoyl-CoA
La capacité des protéines à catalyser la réaction d'isomérisation a été étudiée en présence de 3-cjs-decenoyl-CoA (10 μM) et d'enzyme Rv0635-Rv0636 (80 nM) ou Rv0636-Rv0637(543 nM). Les expériences témoins ont été réalisées en présence de 2-/ra«5-decenoyl-CoA (10 μM) et des mêmes concentrations d'enzyme. Les réactions ont été suivies à 263 tira où l'augmentation de l'absorbance résulte de la transformation du 3-c/s-decenoyl-CoA en 2-frγms-decenoyl-CoA.
Aucune variation de l'absorbance n'a été observée en présence de 3- m-decenoyl-CoA alors que pour les expériences contrôles, les enzymes RvO635- RvO636 et Rv0636-Rv0637 présentaient une activité spécifique respective de 0,20 μmol/min/mg de protéine et 0,02 μmol/min/mg de protéine. Dans les conditions testées, les enzymes étudiées ne présentent pas d'activité isomérase. Etude de la dépendance vis-à-vis de l'ACP La particularité des systèmes FAS-II est de posséder une activité dépendante de l'ACP. FAS-II est le seul système de biosynthèse d'acides gras qui soit dépendant de l'ACP chez les mycobactéries.
Lesactivités des enzymes Rv0635-Rv0636 (80 nM) Rv0636- RvO637(31 1 nM) ou RvO636 seule (311 nM) ont été comparées en présence de 2- /raw-octenoyl-ACP (2 μM) ou de 2-/rami-octenoyl-CoA (2 μM).
L'hétérodimère Rv0635-Rv0636 a présenté une activité spécifique en présence de 2-rra«s-octenoyl-ACP de 0,28 μmol/min/mg tandis qu'aucune activité significative n'a été détectée en présence du dérivé de CoA dans ces conditions (figure 4A). Quant à l'hétérodimère Rv0636-Rv0637, l'activité spécifique détectée en présence de 2-?ra«.y-octenoyl-ACP (2 μM) était de 0,047 μmol/min/mg de protéine alors qu'en présence de 2-fr-αra-octenoyl-CoA (2 μM), son activité n'était pas significative par rapport à la réponse de l'expérience contrôle (sans enzyme) (figure 4B). De façon intéressante, aucune activité de l'homodimère RvO636 n'a pu être détectée en présence d'octenoyl-ACP. Réaction en tandem avec MabA et InhA
Les inventeurs ont testé la capacité des deux hétérodimères à fonctionner en réaction couplée en présence de MabA et InhA, les deux réductases de FAS-II qui catalysent les réactions en amont et en aval de l'étape de deshydratation dans le cycle (figure 1). Premièrement, la réaction de MabA (73 nM) a été réalisée en présence de NADPH (64 μM) et de 3-cétododécanoyl-CoA (C)2, 53 μM), et, après achèvement de la réaction (suivie à 340 nm), l'un des hétérodimères (soit 280 nM de Rv0635-Rv0636, soit 1,65 μM de Rv0636-Rv0637) plus InhA (1,4 μM) ont été ajoutés en présence de NADH (259 μM). Des expériences contrôles en absence de l'hétérodimère ou de InhA ont été réalisées.
Les milieux réactionnels ont été analysés en spectroraétrie de masse MALDI-TOF (MALDI-TOF MS). Les milieux réactionnels ont tout d'abord été dilués 10 fois dans de l'eau. Les échantillons (1 μl) ont été déposés sur les plaques cibles, mélangés avec 1 μl de matrice [10 mg/ml d'acide 2,5-dihydroxybenzoïque dans de reau:acétonitrile, 8:2 (v/v) et laissés cristalliser à température ambiante. Les analyses des réactions de couplage ont été réalisées en mode réflectron, sur un spectromètre de masse 4700 Analyser (Applied Biosystems) équipé d'un laser Nd:YAG (longueur d'onde de 355 nm, pulsations <500-ps et 200 Hz de taux de répétition). 2500 tirs ont été accumulés en mode ionique positif ou négatif et les données de spectrométrie de masse ont été acquises en utilisant la calibration de l'appareil par défaut.
L'analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF des milieux réactionnels démontre que le dodecanoyl-CoA, produit saturé de InhA, est formé très rapidement (en 3 min) en présence de Rv0635-Rv0636 (figure 13C). Cette biosynthèse n'a pas eu lieu en absence de l'hétérodimère (figure 13A). En absence d'InhA, une faible proportion d'intermédiaire dodécénoyl-CoA, un produit de la réaction d'hydratation catalysée par Rv0635-Rv0636, est apparue. Ce type de profil rappelle ce qui a été décrit pour d'autres hydroxyacyl-ACP deshydratases : en absence d'énoyl reductase, l'équilibre réactionnel est en faveur de la réaction d'hydratation. En comparaison, la réaction complète en présence de l'hétérodimère Rv0636-Rv0637 s'est déroulée très lentement : le produit d'InhA n'a commencé à apparaître qu'après 30 min, et la réaction s'est achevée entre 3 et 24h d'incubation (figure 14). Cette faible activité est corrélée avec l'activité spécifique relativement faible de Rv0636-Rv0637 en présence de dérivés de CoA à chaîne moyenne (voir ci-dessus).
L'ensemble de ces résultats suggère fortement que les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 sont impliquées dans le système d'élongation FAS-II. Les deux hétérodimères, Rv0635-Rv0636 et Rv0636-Rv0637, ne sont actifs qu'en présence de dérivés d'ACP à la faible concentration en substrat utilisé. Ces données rappellent ce qui a été observé pour les enzymes des systèmes FAS-II décrits, notamment pour les enzymes mycobactériennes InhA, KasA et KasB ainsi que pour les (3i?)-hydroxyacyl-ACP deshydratases d'autres organismes qui, bien que montrant une préférence pour les dérivés d'ACP, restent actives en présence de dérivés de CoA. De plus, les deux hétérodimères présentent une activité (3R)-hydroxyacyl deshydratase en présence des deux réductases du complexe FAS-II.
Résumé des propriétés de la protéine RvO636 La protéine RvO636 présente les propriétés suivantes :
(i) l'ubiquité de la protéine parmi les espèces mycobactériennes ainsi que la présence chez des genres apparentés, dans la mesure où les acides mycoliques sont des composés caractéristiques des Corynebacterineae ; (ii) l'absence de la protéine chez Corynebacterium ; (iii) la présence au voisinage de l'ORF sur le chromosome de gènes décrits comme intervenant dans le métabolisme des acides mycoliques et (iv) la présence d'un motif catalytique.
Plus précisément, la séquence codant pour la protéine Rv636 est localisée près du groupe de gènes mmaAl-4 impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques oxygénés chez M. tuberculosis. De plus, cette protéine présente une séquence catalytique caractéristique conservée, appelée motif hydratase 2 (figure 12) qui inclut le motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO: 16). Ainsi cette protéine appartient à la sous-famille des hydratases 2. Le motif hydratase 2 a tout d'abord été décrit dans les enoyl-CoA hydratases et a également été trouvé dans le domaine (3/?)-hydroxyacyl deshydratase des systèmes FAS-I. Ce motif hydratase 2 a récemment été observé dans la (3J?)-hydroxyacyl-ACP deshydratase du système FAS-
II dans les mitochondries de levure. Enfin le gène RvO635 chevauche le gène RvO636 et le gène RvO637 est décalé de 4 pb par rapport au gène RvO636. Ces trois gènes forment probablement un opéron ; les protéines codées par cet ensemble de gènes présentent une prédiction de structure SHD, c'est-à-dire de repliement de type « simple hot dog ».
Résumé des propriétés des protéines RvO635 et RvO637 Les protéines RvO635 et RvO637 présentent les propriétés suivantes : (i) elles sont ubiquitaires parmi les mycobactéries et seule RvO635 est retrouvée chez des genres apparentés {Corynebacteήnae) ; (ii) elles sont absentes chez Corynebacterium ; (iii) leur prédiction de structure correspond à un repliement de type SHD ; (iv) mais elles ne comportent pas de motif catalytique ; (v) elles ont la propriété de s'associer, de façon indépendante à RvO636, formant des hétérodimères ou des multimères.
Résumé concernant des enzymes comportant les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 De manière surprenante, les enzymes comportant les protéines
RvO635, RvO636 et RvO637 présentent les propriétés suivantes :
(i) elles forment des structures quaternaires correspondant à des dimères ou des multimères de RvO636 seule, de l'association RvO635-RvO636 et de l'association Rv0636-Rv0637 ; (ii) les structures quaternaires comportant une sous- unité catalytique et une sous-unité non catalytique (RvO635-RvO636 et RvO636- RvO637) corrèlent avec leur spécificité pour des substrats à longue chaîne (> Cj2), la sous-unité non catalytique pouvant jouer le rôle d'accepteur de longue chaîne acyle ; (iii) ces enzymes semblent présenter une spécificité marquée pour des dérivés d'ACP par rapport à des dérivés de CoA ; (iv) leur spécificité de longueur de chaîne et pour le groupement transporteur de la chaîne acyle du substrat correspond aux propriétés décrites pour le système FAS-II mycobactérien et pour les enzymes qui le composent ; (v) la préférence de Rv0636-Rv0637 pour des substrats à plus longue chaîne par rapport à Rv0635-Rv0636 et l'absence de protéine orthologue à RvO637 dans les genres apparentés à Mycobacterium comportant des acides mycoliques courts suggère que Rv0635-Rv0636 serait impliqué dans les cycles précoces d'élongation catalysés par FAS-II, alors que Rv0636-Rv0637 serait impliqué dans les cycles tardifs d'élongation.
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Claims

REVENDICATIONS
1 °) Enzyme purifiée et isolée, impliquée dans le système FAS-II et possédant les caractéristiques suivantes : a) elle est constituée par un dimère ou un multimère sélectionné dans le groupe constitué par
(i) les homomultimères comprenant au moins trois protéines identiques comprenant un motif hydratase 2 [YF]-x(l,2)-[LIVG]-[STGC]-G-D-x-N-P- [LIV]-H-x(5)-[AS] (SEQ ID NO: 15), (dans lequel x(n) représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé, ou un motif similaire au motif de base,
(ii) les hétérodimères et les hétéromultimères constitués : - d'au moins deux protéines différentes telles que définies en (i), ou
- d'une ou plusieurs protéines telle que définie en (i) et d'une ou plusieurs protéines ne comprenant pas de motif hydratase 2, mais dont la structure tridimensionnelle présente un repliement de type hot dog ; et b) elle catalyse la déshydratation d'un substrat (3R)-hydroxyacyl en 2-trans-enoy\ et/ou l'hydratation d'un substrat 2-trans-enoy\ en (37?)-hydroxyacyl, conformément au schéma suivant :
dans lequel X représente ACP et n>0, de préférence n>4 ou CoA n>0.
2°) Enzyme purifiée et isolée selon la revendication 1, caractérisée en ce que lorsque X représente CoA, alors n>8.
3°) Enzyme purifiée et isolée selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la protéine telle que définie en (i) est sélectionnée dans le groupe constitué par la protéine RvO636 (SEQ ID NO :2) comprenant un motif hydratase 2 Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO:16) et une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine RvO636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculosis H37Rv.
4°) Enzyme isolée et purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la protéine telle que définie en (ii) qui ne comporte pas de motif hydratase 2, est sélectionnée dans le groupe constitué par :
- la protéine RvO635 (SEQ ID NO :4) ou une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine RvO635 de séquence SEQ ID NO :4 de M. tuberculosis H37Rv et
- la protéine RvO637 (SEQ ID NO :6) ou une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine RvO637 de séquence SEQ ID NO :6 de M. tuberculosis H37Rv.
5°) Enzyme purifiée et isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le dimère ou multimère est sélectionné dans le groupe constitué par : . un homomultimère de RvO636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité, sur la totalité de sa séquence avec la protéine RvO636 de M. tuberculosis,
. un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine RvO636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine RvO636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculosis H37Rv et (ii) de la protéine RvO635 (SEQ ID NO :4) ou d'une protéine qui possède au moins 53 % d'identité ou au moins 67 % de similarité, de préférence au moins 69 % d'identité ou au moins 82 % de similarité avec la protéine RvO635 de séquence SEQ ID NO :4 de M. tuberculosis H37RV et
. un hétérodimère ou un hétéromultimère constitué (i) de la protéine RvO636 (SEQ ID NO :2) ou d'une protéine qui possède au moins 51 % d'identité ou au moins 72 % de similarité, de préférence au moins 85 % d'identité ou au moins 90 % de similarité avec la protéine RvO636 de séquence SEQ ID NO :2 de M. tuberculosis H37Rv et (if) de la protéine RvO637 (SEQ ID NO :6) ou d'une protéine qui possède au moins 44 % d'identité ou au moins 61 % de similarité, de préférence au moins au moins 59 % d'identité ou au moins 76 % de similarité avec la protéine RvO637 de séquence SEQ ID NO :6 de M tuberculosis H37Rv .
6°) Enzyme purifiée et isolée selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : l'homodimère ou l'hétérodimère ou l' hétéromultimère Rv0635-Rv0636 et l'hétérodimère ou l' hétéromultimère Rv0636-Rv0637.
7°) Enzyme purifiée et isolée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le substrat (3R) -hydroxyacyl et/ou 2-trans-enoyl de l'enzyme est de préférence un substrat ayant une chaîne acyle de longueur égale ou supérieure à C8, de préférence en Ci2-C2O1 dérivé d'ACP.
8°) Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il code pour une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et RvO637. 9°) Polynucléotide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par le polynucléotide de SEQ ID NO :1, qui code pour la protéine RvO636 ; le polynucléotide de SEQ ID NO :3, qui code pour la protéine RvO635, le polynucléotide SEQ ID NO :5 qui code pour la protéine RvO637 et le polynucléotide comprenant la séquence qui code pour une protéine RvO636 et la séquence qui code pour une protéine RvO635 et/ou une protéine RvO637.
10°) Polynucléotide, caractérisé en ce qu'il comprend les cadres de lecture codant pour les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 et en ce qu'il est représenté par la séquence SEQ ID NO :7 de la liste de séquences jointe en annexe.
1 1°) Vecteur d'expression, comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 12°) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour une protéine RvO636 et au moins un poly- nucléotide codant pour la protéine RvO635 et/ou la protéine RvO637.
13°) Vecteur selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce qu'il inclut en outre les séquences de régulation pour l'expression de la protéine.
14°) Cellule-hôte, procaryote ou eucaryote, transformée par le vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 13, ou par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 15°) Procédé de production d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines Rv0635, RvO636 et RvO637, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte selon la revendication 14 dans un milieu convenable et la purification de l'enzyme ou de la protéine à partir de ladite culture. 16°) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite purification se fait par chromatographie d'affinité, par exemple IMAC et/ou chromato- graphie par exclusion.
17°) Procédé pour inhiber la biosynthèse de composés de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'au moins l'une des enzymes selon l'une quelconque des revendications 1 à
7, ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par la protéine RvO636, la protéine RvO635 et la protéine Rv0637 .
18°) Procédé pour inhiber la biosynthèse de composés de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'incubation d'un substrat convenable sélectionné dans le groupe constitué par les (3i?)-hydroxyacyl-ACP, les trans-2-cnoy\-ACΫ, les (3i?)-hydrox- yacyl-CoA et les /raws-2-enoyl-CoA avec une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, en présence ou en l'absence de la molécule à tester, et b) la comparaison de l'activité de l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 en présence et en l'absence de la molécule à tester. 19°) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la molécule à tester inhibe la biosynthèse de composés de l'enveloppe de mycobactéries pathogènes et d'autres bactéries pathogènes parmi les Corynebacterinae.
20°) Utilisation d'une enzyme selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et RvO637, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les microorganismes contenant un système FAS-II, dans lequel l'étape de déshydratation est catalysée par une déshydratase contenant un motif hydratase 2 [YF]-x(l ,2)- [LIVG]-[STGC]-G-D-X-N-P-[LIV]-H-X(S)-[AS] (SEQ ID NO: 15), (dans lequel x(n) représente n acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé et les acides aminés entre crochets représentent des alternatives) ou un motif catalytique, dérivé du motif hydratase 2 et constitué au moins par le motif de base D-x(4)-H, dans lequel x(4) représente 4 acides aminés, ces derniers étant n'importe quel acide aminé ou un motif similaire au motif de base. 21°) Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que le motif hydratase 2 est le motif Y-A-G-V-S-G-D-L-N-P-I-H-W-D-D-E-I-A (SEQ ID NO: 16).
22°) Utilisation selon la revendication 20 ou la revendication 21 , caractérisé en ce que lesdits microorganismes sont des Corynebacterinae. 23°) Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que lesdits Corynebacterinae sont sélectionnés dans le groupe constitué par les mycobactéries pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M. leprae, M. ulcerans, M. microti, M. bovis, M. abscissus, M. avium, M. fortuitum, M. kansasii ...), Nocardia, Rhodococcus et Gordona. 24°) Méthode de criblage de ligands d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et RvO637, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- la mise en présence d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et Rv0637, dans un milieu réactionnel comprenant le ligand potentiel à tester, - la mesure après excitation à 303 nm de la variation d'intensité de fluorescence au maximum d'émission,
- et sur la base de cette mesure, la détection de la fixation dudit ligand sur l'une ou plusieurs des protéines constituant l'enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
25°) Méthode de criblage selon la revendication 24, caractérisée en ce que l'enzyme est la protéine Rv0636 ou une enzyme la contenant.
26°) Méthode de criblage de ligands d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et Rv0637, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- la mise en présence d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et RvO637 , avec le ligand à tester, et - l'analyse du complexe formé en phase soluble entre ladite enzyme et ledit ligand, notamment par RMN et/ou par fluorescence.
27°) Méthode de criblage de ligands inhibiteurs d'une enzyme selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par les protéines RvO635, RvO636 et RvO637, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'identification de l'inhibition de l'expression ou de l'activité de ladite enzyme ou de ladite protéine.
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