EP2047273A1 - Verfahren und reagenzzusammenstellung zur sichtbarmachung von aminosäuren und peptiden - Google Patents

Verfahren und reagenzzusammenstellung zur sichtbarmachung von aminosäuren und peptiden

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Publication number
EP2047273A1
EP2047273A1 EP07765016A EP07765016A EP2047273A1 EP 2047273 A1 EP2047273 A1 EP 2047273A1 EP 07765016 A EP07765016 A EP 07765016A EP 07765016 A EP07765016 A EP 07765016A EP 2047273 A1 EP2047273 A1 EP 2047273A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reagent
amino acids
peptides
proteins
chloride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07765016A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Schulz
Heinz-Emil Hauck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP2047273A1 publication Critical patent/EP2047273A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6809—Determination of free amino acids involving fluorescent derivatizing reagents reacting non-specifically with all amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green

Definitions

  • the invention relates to a method and a reagent composition for staining and thus visualization of amino acids, peptides and similar compounds, in particular after separation by thin-layer chromatography.
  • the staining is carried out using at least one reagent for the detection of amino acids, peptides in combination with at least one ionic liquid.
  • the analysis of proteins plays an important role in the investigation of cell structures or cell metabolism or cell functions.
  • the analysis of proteins or peptides includes e.g. the structural analysis, determination of molecular weight, determination of a distribution pattern (peptide mapping) or the identification of certain peptides or proteins.
  • a separation must first be carried out before the analysis of the proteins or peptides.
  • Known methods for this are, for example, liquid chromatography, ion exchange chromatography, capillary electrophoresis or gel electrophoresis. Subsequently, the analysis is carried out e.g. by staining or by mass spectrometry.
  • Thin-layer chromatography is also suitable for the separation of proteins, peptides or amino acids.
  • a major advantage of thin layer chromatography is that it is inexpensive and easy to carry out.
  • the separation can be one-dimensional or multi-dimensional, so that the resolution of the separation can be adapted to the separation problem.
  • various staining methods are available for the evaluation of a thin-layer chromatographic separation (TLC separation). The best known are the staining with ninhydrin (2,2-dihydroxyindan-1, 3-dione), with fluorescamine or isatin-5
  • Fluorescamin offers a higher sensitivity compared to ninhydrin.
  • both ninhydrin and fluorescamine give no additional information about the stained compound since all compounds are stained in the same color.
  • Isatin-5-sulfonic acid selectively stains amino acids, but is not suitable for compounds consisting of several amino acids, since the sensitivity decreases very much with increasing number of amino acids in the molecule to be studied.
  • Object of the present invention is therefore to provide a method or a
  • Reagent for selective visualization in particular for the staining of amino acids, peptides and proteins to provide that can be used in particular after a DC separation.
  • a reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins in particular ninhydrin or one of its derivatives, most preferably ninhydrin, in combination with at least one ionic liquid, selectively stains amino acids and compounds consisting of several amino acids. It gives colorations in a wide range of colors between yellow, green, blue to red to pink.
  • the sensitivity of the staining corresponds at least to a conventional staining of amino acids with, for example, ninhydrin.
  • the subject of the present invention is therefore at least one containing at least one reagent for the detection of amino acids, Peptides or proteins, in particular ninhydrin or one of its derivatives, and an ionic liquid.
  • the reagent composition consists only of the reagent for the detection of
  • Amino acids, peptides or proteins in particular ninhydrin or one of its derivatives, and an ionic liquid.
  • the ninhydrin is dissolved in the ionic liquid, so that the ionic liquid additionally acts as a solvent.
  • the reagent composition contains at least a) a reagent at least containing at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins in at least one solvent and b) a reagent at least containing at least one ionic liquid.
  • the reagent composition contains at least a) a reagent containing at least 0.01-10% by mass, preferably 0.1-1% by mass ninhydrin in at least one solvent b) a reagent at least containing at least one ionic liquid, preferably in at least one solvent.
  • Ionic liquids or liquid salts are ionic species consisting of an organic cation (K + ) and a generally inorganic anion (A " ), which contain no neutral molecules and usually have melting points of less than 373 K.
  • Liquids are, for example, R. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407, MJ Earle, K.R. Seddon “Ionic liquids. Green Solvent for the Future ", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasserscheid, W. Keim” Ionic Liquids - Novel Solutions for Transition Metal Catalysis ", Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945;
  • the anion A is selected from the group comprising halides, in particular chloride and bromide, tetrafluoroborate, sulfonates, in particular trifluoromethylsulfonate.
  • the cation K + of the ionic liquid of the ionic liquid there are no limitations per se.
  • they are organic cations, with particular preference being given to ammonium, phosphonium, thiouronium,
  • R may be H at the same time, straight-chain or branched alkyl having 1 -20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2 20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms, which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, wherein one or more R partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl , or partially substituted by -OR ', -CN, -C (O) OH, -C (O) NR' 2) -SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 can be, and wherein one or two non-adjacent and non- ⁇ -carbon atom
  • Phosphonium cations can be described, for example, by the formula (2) [PR 2 4 ] + (2), wherein
  • R 2 each independently
  • NR ' 2 straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or a plurality of non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms, which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, wherein one or more R 2 partially or completely with
  • Halogens in particular -F and / or -Cl, or in some cases with -OR ', -CN, -C (O) OH, -C (O) NR' 2 , -SO 2 NR ' 2 , -SO 2 OH, - SO 2 X, -NO 2 , and wherein one or two non-adjacent and non- ⁇ -carbon atoms of R 2 , by atoms and / or atomic groups selected from the group -O-, -S-, -S ( O) -, -SO 2 -, -N + R ' 2 -, -C (O) NR'-, -
  • cations of the formulas (1) and (2) in which all four or three substituents R and R 2 are completely substituted by halogens are excluded, for example the tris (trifluoromethyl) methylammonium cation, the tetra (trifluoromethyl) ammonium cation or the tetra (nonafluorobutyl) ammonium cation.
  • Suitable thiouronium cations can be represented by the formula (3)
  • R 3 to R 7 each independently represents hydrogen, straight-chain or branched alkyl having 1 to 20 C -Atomen, straight or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl with 3 -7 C atoms which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, wherein one or more of the substituents R 3 to R 7 partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or partially with -OH, -OR ', -CN, -C (O) OH, -C (O) NR' 2 , -SO 2 NR ' 2) -SO 2 OH,
  • R 8 to R 13 are each independently of one another hydrogen, -CN, NR ' 2> straight-chain or branched Alkyl of 1 to 20 carbon atoms, straight-chain or branched alkenyl of 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl of 2-20 C atoms and one or more non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C atoms, which may be substituted by alkyl groups having 1-6 C atoms, where one or more of the substituents R 8 to R 13 is partially or completely halogenated, in particular -F and / or or -Cl, or partially with -OR ', -CN, -C (O) OH, -C (O) NR' 2 , -SO 2 NR '
  • R 1 'to R 4 ' are each independently
  • Hydrogen, -CN straight-chain or branched alkyl having 1-20 C atoms, straight-chain or branched alkenyl having 2-20 C atoms and one or more non-conjugated double bonds, straight-chain or branched alkynyl having 2-20 C atoms and one or a plurality of non-conjugated triple bonds, saturated, partially or fully unsaturated cycloalkyl having 3-7 C-
  • Ring system where one or more substituents R 1 'to R 4 ' partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or -OR ', -CN, -C (O) OH, -
  • Atomic moieties selected from -OR ', - NR' 2 , -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR' 2 , -SO 2 OH, -SO are also particularly suitable as substituent R 2 2 X or -NO 2 .
  • C 1 - to C 2 o- especially d- to Cu-alkyl groups, and saturated or unsaturated, ie also aromatic, C 3 - to C 7 -cycloalkyl groups which may be substituted by Cr to C 6 alkyl groups, in particular phenyl ,
  • the substituents R and R 2 in the compounds of formula (1) or (2) may be the same or different. Preferably, the substituents R and R 2 are different.
  • the substituents R and R 2 are particularly preferably methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl or tetradecyl.
  • examples of such guanidinium cations are: where the substituents R 8 to R 10 and R 13 may have a previously given or particularly preferred meaning.
  • the carbocycles or heterocycles of the abovementioned guanidinium cations can still be replaced by Cr to C ⁇ -alkyl, C r to Ce-alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 - AIkOXy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 NR ' 2> SO 2 X' or SO 3 H be substituted, where X and R 'have the meaning given above, substituted or unsubstituted phenyl or unsubstituted or substituted heterocycle substituted be.
  • the carbocycles or heterocycles of the cations given above can still by D- to C ⁇ -alkyl, C 1 - to C ⁇ -alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C r C 6 alkoxy , SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 NR ' 2 , SO 2 X or SO 3 H or substituted or unsubstituted phenyl or unsubstituted or substituted heterocycle, where X and R' are as defined above.
  • the substituents R 3 to R 13 are each, independently of one another, preferably a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 10 C atoms.
  • the substituents R 3 and R 4 , R 6 and R 7 , R 8 and R 9 , R 10 and R 11 and R 12 and R 13 in compounds of the formulas (3) to (4) may be identical or different.
  • R 3 to R 13 are each independently methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert. Butyl, sec-butyl, phenyl or cyclohexyl, most preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl.
  • Suitable substituents R 1 to R 4 of compounds of the formula (5) according to the invention are preferably hydrogen in addition to hydrogen: C 1 - to C 2 o, in particular C 1 - to C 2 -alkyl groups, and saturated or unsaturated, ie also aromatic, C 3 - to C 7 -cycloalkyl groups which may be substituted by C 1 - to C 6 -alkyl groups, in particular phenyl.
  • the substituents R 1 and R 4 are each, independently of one another, particularly preferably methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, pentyl, hexyl, octyl, decyl, cyclohexyl, phenyl or benzyl. They are very particularly preferably methyl, ethyl, n-butyl or hexyl. In pyrrolidinium, piperidinium or indolinium compounds, the two substituents R 1 ' and R 4 are preferably different.
  • R 2 or R 3 is, in each case independently of one another, in particular hydrogen, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, cyclohexyl, phenyl or benzyl.
  • R 2 ' is particularly preferably hydrogen, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl or sec-butyl. Most preferably, R 2 and R 3 are hydrogen.
  • the C 1 -C 2 -alkyl group is, for example, methyl, ethyl, isopropyl, propyl, butyl, sec-butyl or tert-butyl, and also pentyl, 1-, 2- or 3-methylbutyl, 1, 1, 1, 2 or 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl or dodecyl.
  • a straight-chain or branched alkenyl having 2 to 20 C atoms, wherein several double bonds may also be present, is, for example, allyl, 2- or 3-butenyl, isobutenyl, sec-butenyl, furthermore 4-pentenyl, isopentenyl, hexenyl, Heptenyl, octenyl, -C 9 Hi 7 , -Ci 0 H 19 to -C 2 oH 39 ; preferably allyl, 2- or 3-butenyl, isobutenyl, sec-butenyl, furthermore preferred is 4-pentenyl, iso-pentenyl or hexenyl.
  • a straight-chain or branched alkynyl having 2 to 20 C atoms, wherein a plurality of triple bonds may also be present, is, for example, ethynyl, 1- or 2-propynyl, 2- or 3-butynyl, furthermore 4-pentynyl, 3-pentynyl, hexynyl, Heptynyl, octynyl, -CgH 15 , -Ci 0 H 17 to -C 2 oH37 > preferably ethynyl, 1- or 2-propynyl, 2- or 3-butynyl, 4-pentynyl, 3-pentynyl or hexynyl.
  • Aryl-C 1 -C 6 -alkyl is, for example, benzyl, phenylethyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl or phenylhexyl, where both the phenyl ring and the alkylene chain, as described above, partially or completely with halogens, in particular -F and / or -Cl, or partly with -OR ', - NR' 2 , -CN, -C (O) OH, -C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR' 2 , -C (O) X, -SO 2 OH, - SO 2 X, -NO 2 may be substituted.
  • Unsubstituted saturated or partially or fully unsaturated cycloalkyl groups having 3-7 C atoms are therefore cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, phenyl, cycloheptenyl, which may be substituted by C 1 - to C 6 -alkyl groups, wherein in turn the cycloalkyl group or the cycloalkyl group substituted by C 1 -C 6 -alkyl groups also having halogen atoms such as F, Cl, Br or I, in particular F or Cl or with -OR ', -CN, -C (O) OH, - C (O) NR ' 2 , -SO 2 NR' 2 , -SO 2 OH, -SO 2 X, -NO 2 may be substituted.
  • halogen atoms such as F
  • examples are so modified
  • R ' C 3 - to C 7 -cycloalkyl, for example cyclopropyl, cyclobutyl,
  • R ' is substituted phenyl, by C 1 to C 6 alkyl, C 1 to C 6 alkenyl, NO 2 , CN, NR' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 -alkoxy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 X ', SO 2 NR " 2 or SO 3 H substituted phenyl, where X' is F, Cl or Br and R" is a non, partially or perfluorinated C 1 to C 6 -Alkyl or C 3 - to C 7 -cycloalkyl as defined for R ', for example, o-, m- or p-methylphenyl, o-, m- or p-ethylphenyl, o-, m- or p-propylphenyl, o-, m- or p-isopropylphenyl, o-, m- or p-tert-butyl
  • R 1 to R 4 as heteroaryl is a saturated or unsaturated mono- or bicyclic heterocyclic radical having 5 to 13 ring members understood, wherein 1, 2 or 3 N and / or 1 or 2 S or O atoms may be present and the heterocyclic radical mono- or polysubstituted by C 1 - to C 6 -alkyl, C 1 - to C 6 -alkenyl, NO 2 , CN, NR ' 2 , F, Cl, Br, I, C 1 -C 6 -
  • Alkoxy, SCF 3 , SO 2 CF 3 , COOH, SO 2 X ', SO 2 NR' 2 or SO 3 H may be substituted, wherein X 1 and R 'have the meaning given above.
  • the heterocyclic radical is preferably substituted or unsubstituted 2- or 3-furyl, 2- or 3-thienyl, 1-, 2- or 3-pyrrolyl, 1-, 2-, A- or 5-imidazolyl, 3-, A- or 5-pyrazolyl, 2-, 4- or 5-oxazolyl, 3-, 4- or 5-isoxazolyl, 2-, 4- or 5-thiazolyl, 3-, 4- or 5-isothiazolyl, 2-, 3- or 4-pyridyl, 2-, 4-, 5- or 6-pyrimidinyl, furthermore preferably 1, 2,3-triazole-1, -4- or -5-yl, 1, 2,4-triazole-1 , -4- or -5-yl, 1- or 5-tetrazolyl, 1, 2,3-oxadiazol-4 or -5-yl 1, 2,4-oxadiazol-3 or -5-yl, 1, 3,4-Thiadiazol-2- or -5-yl, 1, 2,4-thiadiazol-3 or -5-yl, 1, 2,
  • Benzopyrazolyl 2-, A-, 5-, 6- or 7-benzoxazolyl, 3-, A-, 5-, 6- or 7- benzisoxazolyl, 2-, A-, 5-, 6- or 7-benzthiazolyl, 2-, A-, 5-, 6- or 7- benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- or 7-benz-2,1,3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, A-, 5 -, 6-, 7- or 8-quinolinyl, 1-, 3-, A-, 5-, 6-, 7- or 8-isoquinolinyl, 1-, 2-, 3-, 4- or 9-carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- or 9-acridinyl, 3-, A-, 5-, 6-, 7- or 8-cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- or 8-quinazolinyl or 1-, 2- or 3-pyrrolidinyl.
  • Heteroaryl-CiC ⁇ - alkyl is now in analogy to aryl-C r C 6 alkyl, for example, pyridinyl-methyl, pyridinyl-ethyl, pyridinyl-propyl, pyridinyl-butyl, pyridinyl-pentyl, pyridinyl-hexyl understood, wherein further heterocycles described in this way can be linked to the alkylene chain.
  • the cations of the ionic liquid according to the invention are ammonium, imidazolium, pyridinium, pyrrolidinium, piperidinium, phosphonium, morpholinium or piperidinium cations.
  • Particularly preferred ionic liquids are 1-pentyl-3-methylimidazolium chloride, 1-hexyl-3-methylimidazolium chloride, 1-heptyl-3-methylimidazolium chloride, 1-octyl-3-methylimidazolium chloride, 1-nonyl-3 - methylimidazolium chloride, 1-decyl-3-methylimidazolium chloride, trihexyltetradecylphosphonium chloride, ethyldimethylpentylammonium bromide, ethyldimethylpropylammonium chloride, 1-methyl-1-octylpyrrolidinium chloride, n-butylpyridinium chloride, n-octylpyridinium chloride, 4-methyl-4-pentylmorpholinium bromide or 1 methyl-1-pentylpiperidiniumbromid.
  • Very particularly preferred ionic liquids are 1-pentyl-3-methylimidazolium chloride, i-hexyl-3-methylimidazolium chloride, 1-heptyl-3-methylimidazolium chloride, i-octyl-3-methylimidazolium chloride, 1-nonyl 3-methylimidazolium chloride, 1-decyl-3-methylimidazolium chloride, ethyldimethylpentylammonium bromide and 1-methyl-1-octylpyrrolidinium chloride.
  • the reagent composition additionally contains at least one TLC plate.
  • the present invention further provides a method for analyzing a sample with amino acids, peptides and / or proteins by a) chromatographic separation of the sample on a thin-layer chromatographic plate (TLC plate) b) staining the separated sample on the TLC plate with a
  • Reagent composition at least containing at least one
  • Reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins and at least one ionic liquid Reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins and at least one ionic liquid.
  • Another object of the present invention relates to a method for analyzing a sample with amino acids, peptides and / or proteins by a ' ) chromatographic separation of the sample on a thin-layer chromatographic plate (TLC plate), wherein the flow medium contains at least one ionic liquid, and b ' ) Staining the separated sample on the TLC plate with a reagent composition at least containing at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins.
  • TLC plate thin-layer chromatographic plate
  • TLC plate thin-layer chromatographic plate
  • a plate with a nonpolar phase or a cellulose phase is used as the TLC plate in step a) or a ' ).
  • step b) by first treating the TLC plate in a step b1) with a reagent which contains at least one ionic liquid and then in a step b2) with a reagent comprising at least at least one reagent for detecting amino acids, Peptides or proteins, preferably ninhydrin or one of its derivatives contains. It is also possible to carry out the visualization in step b) by first carrying out a treatment with at least one reagent for detecting amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin (b2), and then with the ionic liquid (b1).
  • the visualization in step b) by the DC plate is first treated in step b1) with a reagent containing at least one ionic liquid and then in a step b2) with a reagent containing at least ninhydrin or one of his Contains derivatives.
  • step b) after the treatment of the TLC plate with the reagent composition at least containing at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin, and at least one ionic liquid or after step b ' ) for 0.5 to Heated to a temperature between 50 and 200 0 C for 10 minutes.
  • a reagent composition is used which contains a reagent which contains at least 0.01-10% by mass, preferably 0.1-1% by mass of ninhydrin in at least one solvent, and a reagent which contains at least 0.1-10% of at least one ionic reagent Contains liquid in at least one solvent.
  • the present invention further provides a method for visualization, in particular for staining of amino acids, peptides and / or proteins, characterized in that the amino acids, peptides and / or proteins are treated with a reagent combination comprising at least one ionic liquid and at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin or one of its derivatives.
  • the amino acids, peptides and / or proteins are first treated with a reagent containing at least one ionic liquid and then with a reagent containing at least ninhydrin.
  • a sample of amino acids, peptides and / or proteins according to the invention is a sample which is believed to contain at least one amino acid and / or one peptide.
  • the sample may be of natural or synthetic origin, e.g. a cell extract, a body fluid, a protein digest or the reaction mixture of a peptide synthesis. In general, it is a liquid sample, wherein the analytes typically in an organic solvent or
  • the sample can contain any other solid, emulsified or dissolved constituents, but should interfere with neither the DC separation nor the subsequent staining of the analytes (amino acids and / or peptides).
  • Solid samples are usually first taken in one of the above solvents so that they can be applied to the TLC plate. For concentrated samples it may be necessary to dilute them first.
  • the skilled worker in the field of thin-layer chromatography is known how large the sample amount and sample concentration depending on the DC plate used and the respective separation problem may be or must be in order to obtain the most ideal evaluable bands.
  • amino acids, peptides and / or proteins are all natural or synthetic amino acids, compounds containing two or more natural or synthetic amino acids and amino-containing compounds which can be stained, for example, with a conventional ninhydrin stain.
  • Compounds containing two or more natural or synthetic amino acids are preferably oligoamino acids or peptides, in particular peptides having a chain length of up to 150 amino acids, preferably having a chain length between 2 and 100, particularly preferably between 2 and 25 amino acids.
  • amino group-containing compounds that can be stained with a conventional ninhydrin staining are amino acids, amines or amino sugars.
  • the amino acids may be synthetic or natural amino acids.
  • they are natural amino acids such as Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, GIn, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Type, Tyr or VaI.
  • a TLC plate is any medium on which thin-layer chromatographic separation can be carried out.
  • a TLC plate consists of a carrier, e.g. in the form of a glass plate, a metal plate or foil or a plastic film coated or coated with a sorbent phase.
  • the sorbents used are typically the basic sorbents known for chromatographic purposes. These are e.g. Silica gel, alumina, cellulose, diatomaceous earth or other organic or inorganic polymers or organic / inorganic hybrid polymers.
  • the basic sorbents may be derivatized with functional groups that alter their separation properties. Examples of these are RP phases in which e.g.
  • Silica gel is derivatized with ligands having C8 or C18 chains (reversed phase material). Other examples are CN or diol modified phases.
  • An overview of common sorbent phases for the DC can be found in Klaus K. Unger, Packings and Stationary Phases in Chromatography Techniques, M. Decker, New York 1990. According to the polarity of their surface, the sorbent phases can be polar, medium and polar Divide apolar phases. It has been found that the reagent composition according to the invention is particularly suitable for staining amino acids and / or peptides on nonpolar phases, such as kieselguhr or reversed phase materials. Cellulose phases can also be dyed with excellent color quality and intensity.
  • a reagent composition according to the invention contains at least at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin, and at least one ionic liquid.
  • the reagent composition can take the form of a
  • Reagent typically a liquid reagent, or contain several different reagents or components.
  • the at least one reagent for detecting amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin, and at least one ionic liquid may be present together in one reagent or in two different reagents or components of the reagent composition.
  • the reagent composition consists of at least one typically liquid reagent containing at least at least one reagent for detecting amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin, and at least one ionic liquid.
  • the reagent composition consists at least of a) a reagent which contains at least ninhydrin or one of its derivatives b) a reagent which contains at least one ionic liquid. Both reagents are typically liquid.
  • the solvent one or more organic solvents or mixtures of one or more organic solvents with water or water may be used. It is also possible that the ionic liquid itself serves as a solvent and, for example, according to the embodiment described above, acts as a solvent for the reagent for detecting amino acids, peptides and / or proteins.
  • the ionic liquid itself serves as a solvent and, for example, according to the embodiment described above, acts as a solvent for the reagent for detecting amino acids, peptides and / or proteins.
  • water or a mixture of water + alcohol may be useful.
  • the solvent used is preferably acetone or propanol.
  • the ninhydrin but not ionic Liquid contains is preferably an organic solvent such as propanol or acetone as a solvent.
  • the solvent used is preferably acetone, propanol, water and water / alcohol mixtures.
  • the reagents may also optionally contain other substances, e.g. one or more additional ionic liquids, solvents, stabilizers, buffers, other dyes, etc.
  • Ninhydrin is present in the reagents according to the invention typically in concentrations between 0.01 and 10, preferably in concentrations between 0.1 and 1% by mass.
  • the ionic liquid can be present in concentrations between 0.1 and 100% by mass. If the ionic liquid also acts as a solvent, or if the reagent composition comprises separate reagents of, for example, ninhydrin and ionic liquid, the proportion of the ionic liquid is typically between 80 and 100%. It goes without saying that in the case of the embodiment in which, for example, ninhydrin and the ionic liquid are present together, the proportion of the ionic liquid can not be 100%, but must be correspondingly reduced by the proportion of ninhydrin.
  • the ionic liquid is typically present in concentrations between 0.1 and 15, preferably in concentrations between 0.1 and 10, particularly preferably in concentrations between 1 and 5 mass%. If a reagent contains two or more different ionic liquids, the above concentration values for the total amount of ionic liquid apply.
  • constituents of the reagent combination according to the invention are, for example, one or more further reagents which contain at least at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin, and / or one or more ionic liquids (eg reagents containing these constituents in other concentrations or reagents containing other ionic liquid), one or more TLC plates, alternative staining reagents (eg reagents for fluorescamine staining) or color charts or color samples for evaluating the staining results.
  • one or more further reagents which contain at least at least one reagent for the detection of amino acids, peptides or proteins, preferably ninhydrin, and / or one or more ionic liquids (eg reagents containing these constituents in other concentrations or reagents containing other ionic liquid), one or more TLC plates, alternative staining reagents (eg reagents for fluorescamine
  • reagent combinations according to the invention are:
  • a reagent combination consisting of a reagent containing at least between 0.01 and 10% ninhydrin and between 0.1 and 10% of one or more ionic liquids in a solvent.
  • a reagent combination comprising a) a reagent which contains at least between 0.01 and 10% ninhydrin in a
  • Solvent contains b) a reagent which contains at least between 0.1 and 10% of one or more ionic liquids in a solvent
  • a reagent combination according to variant 2 which additionally contains a further reagent which contains at least one or more ionic liquids in a solvent, the nature of
  • Concentration and / or composition of the ionic liquids of this additional reagent differs from that of the other reagent containing at least one or more ionic liquids in a solvent.
  • Staining reagents eg reagents for fluorescamine staining
  • color tables or color samples for evaluating the staining results.
  • Preferred reagent combinations contain two or more reagents, wherein ninhydrin on the one hand and one or more ionic
  • liquids are present separately in different reagents.
  • the sample is first applied to a TLC plate and separated by thin-layer chromatography.
  • the performance of a thin layer chromatographic separation is known to those skilled in the art, e.g. from 0b1 s12v1 P Thin Layer Chromatography, Practical Implementation and Error Prevention by Elke Hahn-Deinstrop, Wiley-VCH (1998).
  • the separation can be one-dimensional or multi-dimensional.
  • the staining is carried out with a reagent composition containing at least
  • Ninhydrin and at least one ionic liquid for visualizing the amino acids, peptides and / or proteins contained in the sample.
  • the TLC plate is preferably first slightly, preferably completely, dried, so that the flow agent used in the TLC separation is completely or partially removed.
  • Staining can, however, also be carried out on DC-moistened
  • the order of the reagent combination of the invention i. usually wetting the TLC plate with the reagents of the
  • Reagent composition typically by dipping the TLC plate in the appropriate liquid reagents or preferably by spraying the reagents on the TLC plate.
  • the TLC plate is wetted with a reagent containing at least ninhydrin and one or more ionic liquids in a solvent.
  • This reagent may already have been put together a long time before use or may have been mixed together preferably for a maximum of 24 hours before use.
  • the TLC plate is first wetted with a reagent containing at least one ionic liquid in at least one solvent. Subsequently, preferably after complete or partial drying of the TLC plate, the plate is wetted with a reagent containing at least ninhydrin.
  • the TLC plate is preferably heated to temperatures above 35 ° C., preferably above 50 ° C., after the reagents of the reagent combination according to the invention have been applied. In a particularly preferred embodiment is heated to temperatures between 50 and 200 0 C. The duration of the temperature treatment is usually between 0.5 and 10 minutes.
  • the resulting coloration can be evaluated visually or with appropriate optical devices.
  • the reagent combination according to the invention can also be used for staining amino acids, peptides and / or proteins in other media, for example in the liquid phase or on other carriers, such as Paper, gels or membranes.
  • the reagent combination can be used for a rapid test in which it is initially only generally determined whether amino acids, peptides and / or proteins are present in a sample. For this purpose, no chromatographic or other separation must be performed. It is sufficient to bring the sample - preferably on a support, for example a TLC plate - into contact with the reagent combination.
  • the implementation is carried out according to step b) of the method described above. Based on the color development, it can then be determined whether and, if appropriate, which amino acids, peptides and / or proteins are present in the sample.
  • the particular advantage of the reagent composition according to the invention or of the method according to the invention is that a different coloration is produced with different amino acids, peptides and / or proteins. While in the conventional ninhydrin staining, in which no ionic liquids are added, all amino acids and / or peptides except proline show a blue to violet color, the color varies in the dyeing according to the invention over the entire color spectrum. In addition, by choosing the ionic liquid used or mixing two or more ionic liquids, the resulting color spectrum can be changed.
  • the visualization can already be carried out at amounts of 10 to 50 ng of amino acid or peptide.
  • ninhydrin in addition to ninhydrin, corresponding derivatives of ninhydrin or complexes of ninhydrin, e.g. those in combination with e.g. Cu, Cd, Sn, are used.
  • the present invention may include, consist essentially of, or consist of the stated necessary or optional ingredients or limitations.
  • Substances Ala ⁇ i ⁇ , arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine,
  • Leucine Leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, (from left to right)
  • Aluminum foil (manufacturer Merck KGaA, Germany)
  • Aluminum foil (manufacturer Merck KGaA, Germany)
  • Sample application The samples are applied to the TLC plate with a capillary or with an automatic DC applicator (e.g., Linomat V, Camag, Muttenz, Switzerland). At a typical sample concentration of 1-2 mg / ml, 1-1 ⁇ l is applied.
  • an automatic DC applicator e.g., Linomat V, Camag, Muttenz, Switzerland.
  • the development takes place in a DC chamber.
  • the plate is briefly dried after application and then placed in a mobile phase filled DC chamber (without chamber saturation) and developed.
  • the development distance is 5 cm and the development time for 5 cm is about 1 h.
  • Drying The plate is dried for at least 30 minutes under compressed air in order to remove the flow agent as completely as possible.
  • Staining is carried out by spraying with a DC
  • a fully automatic sprayer e.g. the device ChromaJet DS 20 from DESAGA SARSTEDT Group (Germany).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Reagenzzusammenstellung zur Anfärbung und damit Sichtbarmachung von Aminosäuren, Peptiden und ähnlichen Verbindungen, insbesondere nach Auftrennung mittels Dünnschichtchromatographie. Die Anfärbung erfolgt unter Verwendung von NINHYDRIN zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen in Kombination mit mindestens einer ionischen Flüssigkeit.

Description

Verfahren und Reagenzzusammenstellung zur Sichtbarmachung von
Aminosäuren und Peptiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Reagenzzusammenstellung zur Anfärbung und damit Sichtbarmachung von Aminosäuren, Peptiden und ähnlichen Verbindungen insbesondere nach Auftrennung mittels Dünnschichtchromatographie. Die Anfärbung erfolgt unter Verwendung von mindestens einem Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden in Kombination mit mindestens einer ionischen Flüssigkeit.
Die Analytik von Proteinen spielt eine wichtige Rolle bei der Untersuchung von Zellstrukturen oder Zellstoffwechseln bzw. Zellfunktionen. Die Analytik von Proteinen oder Peptiden umfasst dabei z.B. die Strukturanalyse, Bestimmung des Molekulargewichts, Bestimmung eines Verteilungsmusters (Peptide Mapping) oder auch die Identifikation bestimmter Peptide oder Proteine.
In der Regel muss vor der Analyse der Proteine oder Peptide zunächst eine Auftrennung durchgeführt werden. Bekannte Methoden hierzu sind beispielsweise die Flüssigkeitschromatographie, die lonenaustausch- chromatographie, die Kapillarelektrophorese oder die Gelelektrophorese. Anschließend erfolgt die Analyse z.B. mittels Anfärben oder mittels Massenspektrometrie.
Auch die Dünnschichtchromatographie ist zur Auftrennung von Proteinen, Peptiden oder Aminosäuren geeignet. Ein großer Vorteil der Dünnschichtchromatographie besteht darin, dass sie kostengünstig und einfach in der Durchführung ist. Weiterhin kann die Auftrennung ein- oder mehrdimensional erfolgen, so dass die Auflösung der Trennung an das Trennproblem angepasst werden kann. Für Aminogruppen-haltige Verbindungen wie Proteine, Peptide oder Aminosäuren stehen zur Auswertung einer dünnschichtchromatographischen Trennung (DC-Trennung) verschiedene Färbemethoden zur Verfügung. Die bekanntesten sind die Anfärbung mit Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindan-1 ,3-dion), mit Fluorescamin oder lsatin-5-
Sulfonsäure. Fluorescamin bietet im Vergleich zu Ninhydrin eine höhere Empfindlichkeit. Sowohl Ninhydrin als auch Fluorescamin geben jedoch keine zusätzliche Information über die angefärbte Verbindung, da alle Verbindungen in der gleichen Farbe angefärbt werden. lsatin-5-Sulfonsäure färbt Aminosäuren selektiv an, ist aber für Verbindungen, die aus mehreren Aminosäuren bestehen nicht geeignet, da die Empfindlichkeit sehr stark mit zunehmender Anzahl der Aminosäuren im zu untersuchenden Molekül abnimmt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren bzw. ein
Reagenz zur selektiven Sichtbarmachung, insbesondere zur Anfärbung von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen zur Verfügung zu stellen, das insbesondere auch nach einer DC-Trennung eingesetzt werden kann.
Es wurde gefunden, dass ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Ninhydrin oder eines seiner Derivate, ganz besonders bevorzugt Ninhydrin, in Kombination mit mindestens einer ionischen Flüssigkeit Aminosäuren und Verbindungen, die aus mehreren Aminosäuren bestehen, selektiv anfärbt. Man erhält Färbungen in einem breiten Farbspektrum zwischen gelb, grün, blau bis hin zu rot bis rosa. Die Empfindlichkeit der Anfärbung entspricht dabei zumindest der einer herkömmlichen Anfärbung von Aminosäuren mit beispielsweise Ninhydrin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Ninhydrin oder eines seiner Derivate, und eine ionische Flüssigkeit.
In der einfachsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Reagenzzusammenstellung nur aus dem Reagenz zum Nachweis von
Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Ninhydrin oder eines seiner Derivate, und einer ionischen Flüssigkeit. In diesem liegt beispielsweise das Ninhydrin in der ionischen Flüssigkeit gelöst vor, so dass die ionische Flüssigkeit zusätzlich als Lösungsmittel fungiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenzzusammenstellung zumindest a) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen in mindestens einem Lösungsmittel und b) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenzzusammenstellung zumindest a) ein Reagenz zumindest enthaltend 0.01-10 Massen-%, vorzugsweise 0.1-1 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel b) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit, vorzugsweise in mindestens einem Lösungsmittel.
Ionische Flüssigkeiten oder flüssige Salze sind ionische Spezies, die aus einem organischen Kation (K+) und einem in der Regel anorganischen Anion (A") bestehen. Sie enthalten keine neutralen Moleküle und weisen meistens Schmelzpunkte kleiner 373 K auf.
Das Gebiet der ionischen Flüssigkeiten wird zurzeit intensiv erforscht, da die Anwendungsmöglichkeiten vielfältig sind. Übersichtsartikel zu ionischen - A -
Flüssigkeiten sind beispielsweise R. Sheldon „Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001 , 2399-2407; MJ. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391- 1398; P. Wasserscheid, W. Keim „Ionische Flüssigkeiten - neue Lösungen für die Übergangsmetallkatalyse", Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945;
T. Welton „Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis", Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083 oder R. Hagiwara, Ya. Ito „Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions", J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227).
Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren zur Sichtbarmachung sind die Ionischen Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K+A". Vorzugsweise ist das Anion A" ausgewählt aus der Gruppe umfassend Halogenide, insbesondere Chlorid und Bromid, Tetrafluoroborat, Sulfonate, insbesondere Trifluormethylsulfonat.
In Bezug auf die Wahl des Kations K+ der Ionischen Flüssigkeit der ionischen Flüssigkeit gibt es per se keine Einschränkungen. Vorzugsweise handelt es sich aber um organische Kationen, wobei es sich insbesondere bevorzugt um Ammonium-, Phosphonium, Thiouronium-,
Guanidiniumkationen oder um heterocyclische Kationen handelt.
Ammoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (1 )
[NR4J+ (1 ), beschrieben werden, wobei
R jeweils unabhängig voneinander
H, wobei nicht alle Substituenten R gleichzeitig H sein dürfen, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 -20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, - C(O)OH, -C(O)NR'2) -SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, - SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis Cβ-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen sein kann.
Phosphoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (2) [PR2 4]+ (2), beschrieben werden, wobei
R2 jeweils unabhängig voneinander
H, NR'2 geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R2 teilweise oder vollständig mit
Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, - C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R2, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -
SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen.
Ausgeschlossen sind jedoch Kationen der Formeln (1 ) und (2), in denen alle vier oder drei Substituenten R und R2 vollständig mit Halogenen substituiert sind, beispielsweise das Tris(trifluormethyl)methylammonium- kation, das Tetra(trifluormethyl)ammoniumkation oder das Tetra(nonafluor- butyl)ammoniumkation.
Geeignete Thiouroniumkationen können durch die Formel (3),
[(R3R4N)-C(=SR5)(NR6R7)]+ (3), beschrieben werden, wobei R3 bis R7 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R3 bis R7 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2) -SO2OH, - SO2X, -NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome von R3 bis R7 durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, - S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen. Guanidiniumkationen können durch die Formel (4)
[C(NR8R9)(NR10R11)(NR12R13)]+ (4), beschrieben werden, wobei R8 bis R13 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, -CN, NR'2> geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C- Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R8 bis R13 teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2l -SO2OH, -SO2X, - NO2, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome von R8 bis R13 durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, ■ SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis C6-Alkyl, C3- bis C7-
Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
Darüber hinaus können Kationen der allgemeinen Formel (5)
[HetN]+ (5) eingesetzt werden, wobei
HetN+ ein heterocyclisches Kation, ausgewählt aus der Gruppe Imidazohum 1 H-Pyrazolιum 3H-Pyrazolιum 4H-Pyrazolιum 1-Pyrazolιnιum -Pyrazolιnιum 3-Pyrazolιnιum 2,3-Dιhydro-lmιdazolιnιum 4,5-Dιhydro-lmιdazolιnιum ,5-Dlhydro-lmιdazolιnιum Pyrrolidinium 1 i2i4.Tπaz0|lum 1 ,2,4-Tπazohum
Pyπdinium Pyπdazinium Pynmidinium
lndolium Chinolinium Isochinolinium Chinoxalinium
oder
bedeutet, wobei die Substituenten
R1' bis R4' jeweils unabhängig voneinander
Wasserstoff, -CN, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1-20 C-Atomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen, geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2-20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3-7 C-
Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1-6 C-Atomen substituiert sein kann, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Heteroaryl,
Heteroaryl-CrC6-alkyl oder Aryl-Ci-C6-alkyl bedeutet, wobei die Substituenten R1 , R2 , R3 und/oder R4 zusammen auch ein
Ringsystem bilden können, wobei ein oder mehrere Substituenten R1' bis R4' teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder -OR', -CN, -C(O)OH, -
C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2, substituiert sein können, wobei jedoch nicht gleichzeitig R1 und R4 vollständig mit
Halogenen substituiert sein dürfen, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht am Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome der Substituenten R1' bis R4', durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR1-, -SO2NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes Cr bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X =Halogen.
Als Substituent R2 eignen sich insbesondere auch Atomgruppierungen ausgewählt aus -OR',-NR'2, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -SO2OH, - SO2X oder -NO2.
Unter vollständig ungesättigten Substituenten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung auch aromatische Substituenten verstanden.
Als Substituenten R und R2 bis R13 der Verbindungen der Formeln (1 ) bis (4) kommen erfindungsgemäß dabei neben Wasserstoff bevorzugt in
Frage: d- bis C2o-, insbesondere d- bis Cu-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C3- bis C7-Cycloalkylgruppen, die mit Cr bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.
Die Substituenten R und R2 in den Verbindungen der Formel (1 ) oder (2) können dabei gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind die Substituenten R und R2 verschieden.
Die Substituenten R und R2 sind insbesondere bevorzugt Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl oder Tetradecyl.
Bis zu vier Substituenten des Guanidinium-Kations [C(NR8R9)(NR10R11)(NR12R13)]+ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Guanidinium-Kationen: wobei die Substituenten R8 bis R10 und R13 eine zuvor angegebene oder besonders bevorzugte Bedeutung haben können. Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Guanidinium-Kationen noch durch Cr bis Cβ-Alkyl, Cr bis Ce-Alkenyl, NO2, CN, NR'2, F, Cl, Br, I, C1-C6-AIkOXy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2> SO2X' oder SO3H substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben, substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein.
Bis zu vier Substituenten des Thiouroniumkations [(R3R4N)- C(=SR5)(NR6R7)]+ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Kationen im Folgenden angegeben, wobei Y = S bedeutet: wobei die Substituenten R3, R5 und R6 eine zuvor angegebene oder besonders bevorzugte Bedeutung haben können. Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Kationen noch durch d- bis Cβ-Alkyl, C1- bis Cβ-Alkenyl, NO2, CN, NR'2, F, Cl, Br, I, CrC6-Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2NR'2, SO2X oder SO3H oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.
Die Substituenten R3 bis R13 sind jeweils unabhängig voneinander bevorzugt eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 C- Atomen. Die Substituenten R3 und R4, R6 und R7, R8 und R9, R10 und R11 und R12 und R13 in Verbindungen der Formeln (3) bis (4) können dabei gleich oder verschieden sein. Besonders bevorzugt sind R3 bis R13 jeweils unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.- Butyl, sek.-Butyl, Phenyl oder Cyclohexyl, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder n-Butyl.
Als Substituenten R1 bis R4 von Verbindungen der Formel (5) kommen erfindungsgemäß dabei neben Wasserstoff bevorzugt in Frage: d- bis C2o, insbesondere C1- bis Ci2-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C3- bis C7-Cycloalkylgruppen, die mit d- bis C6- Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.
Die Substituenten R1 und R4 sind jeweils unabhängig voneinander insbesondere bevorzugt Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl. Sie sind ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Butyl oder Hexyl. In Pyrrolidinium-, Piperidinium- oder Indolinium-Verbindungen sind die beiden Substituenten R1' und R4 bevorzugt unterschiedlich.
Der Substituent R2 oder R3 ist jeweils unabhängig voneinander insbesondere Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.- Butyl, tert.-Butyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl. Besonders bevorzugt ist R2' Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl oder sek.-Butyl. Ganz besonders bevorzugt sind R2 und R3 Wasserstoff. Die CrCi2-Alkylgruppe ist beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3- Methylbutyl, 1 ,1-, 1 ,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl oder Dodecyl. Gegebenenfalls Difluormethyl, Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Heptafluorpropyl oder Nonafluorbutyl.
Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Doppelbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise AIIyI, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner 4-Pentenyl, iso- Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, -C9Hi7, -Ci0H19 bis -C2oH39; vorzugsweise AIIyI, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner bevorzugt ist 4-Pentenyl, iso-Pentenyl oder Hexenyl.
Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Dreifachbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, ferner 4- Pentinyl, 3-Pentinyl, Hexinyl, Heptinyl, Octinyl, -CgH15, -Ci0H17 bis -C2oH37> vorzugsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, 4-Pentinyl, 3- Pentinyl oder Hexinyl.
Aryl-Ci-C6-alkyl bedeutet beispielsweise Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl, Phenylbutyl, Phenylpentyl oder Phenylhexyl, wobei sowohl der Phenylring als auch die Alkylenkette, wie zuvor beschrieben teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', - NR'2, -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, -SO2NR'2, -C(O)X, -SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein können.
Unsubstituierte gesättigte oder teilweise oder vollständig ungesättigte Cycloalkylgruppen mit 3-7 C-Atomen sind daher Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Phenyl, Cycloheptenyl, welche mit C1- bis C6-Alkylgruppen substituiert sein können, wobei wiederum die Cycloalkylgruppe oder die mit C1- bis C6-Al kylgruppen substituierte Cycloalkylgruppe auch mit Halogenatomen wie F, Cl, Br oder I, insbesondere F oder Cl oder mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'2, - SO2NR'2, -SO2OH, -SO2X, -NO2 substituiert sein kann.
In den Substituenten R, R2 bis R13 oder R1 bis R4 können auch ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständig zum Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -N+R'2-, -C(O)NR'-, -SO2NR'-, oder - P(O)R'- ersetzt werden, mit R' = nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl, C3- bis C7-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl. Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für derart modifizierte
Substituenten R, R2 bis R13 und R1' bis R4':
-OCH3, -OCH(CHa)2, -CH2OCH3, -CH2-CH2-O-CH3, -C2H4OCH(CHs)2, - C2H4SC2H5, -C2H4SCH(CHs)2, -S(O)CH3, -SO2CH3, -SO2C6H5, -SO2C3H7, -
SO2CH(CHs) 2, -SO2CH2CF3, -CH2SO2CH3, -0-C4H8-O-C4H9, -CF3, -C2F5, -
C3F7, -C4F9, -C(CFa)3, -CF2SO2CF3, -C2F4N(C2F5)C2F5, -CHF2, -CH2CF3, -
C2F2H3, -C3FH6, -CH2C3F7, -C(CFH2)3, -CH2C(O)OH, -CH2C6H5 oder
P(O)(C2Hs)2.
In R' ist C3- bis C7-Cycloalkyl beispielweise Cyclopropyl, Cyclobutyl,
Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.
In R' bedeutet substituiertes Phenyl, durch d- bis C6-Alkyl, C1- bis C6- Alkenyl, NO2, CN, NR'2, F, Cl, Br, I, C1-C6-AIkOXy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR"2 oder SO3H substituiertes Phenyl, wobei X' F, Cl oder Br und R" ein nicht, teilweise oder perfluoriertes C1- bis C6-Alkyl oder C3- bis C7-Cycloalkyl wie für R' definiert bedeutet, beispielsweise, o-, m- oder p- Methylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, o-, m- oder p-Propylphenyl, o-, m- oder p-lsopropylphenyl, o-, m- oder p-tert.-Butylphenyl, o-, m- oder p-
Nitrophenyl, o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder p-Ethoxyphenyl, o-, m-, p-(Trifluormethyl)phenyl, o-, m-, p-(Trifluormethoxy)phenyl, o-, m-, p- (Trifluormethylsulfonyl)phenyl, o-, m- oder p-Fluorphenyl, o-, m- oder p- Chloφhenyl, o-, m- oder p-Bromphenyl, o-, m- oder p-lodphenyl, weiter bevorzugt 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethylphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5- , 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dihydroxyphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5- Difluorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dichlorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dibromphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5- Dimethoxyphenyl, 5-Fluor-2-methylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl oder 2,4,5-Trimethylphenyl. In R1 bis R4 wird als Heteroaryl ein gesättigter oder ungesättigter mono- oder bicyclischer heterocyclischer Rest mit 5 bis 13 Ringgliedern verstanden, wobei 1 , 2 oder 3 N- und/oder 1 oder 2 S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder mehrfach durch C1- bis C6-AIkVl, C1- bis C6-Alkenyl, NO2, CN, NR'2,F, Cl, Br, I, C1-C6-
Alkoxy, SCF3, SO2CF3, COOH, SO2X', SO2NR'2 oder SO3H substituiert sein kann, wobei X1 und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.
Der heterocyclische Rest ist vorzugsweise substituiertes oder unsubstituiertes 2- oder 3-Furyl, 2- oder 3-Thienyl, 1-, 2- oder 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, A- oder 5-lmidazolyl, 3-, A- oder 5-Pyrazolyl, 2-, 4- oder 5-Oxazolyl, 3-, 4- oder 5-lsoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Thiazolyl, 3-, 4- oder 5-lsothiazolyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, 2-, 4-, 5- oder 6-Pyrimidinyl, weiterhin bevorzugt 1 ,2,3- Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1 ,2,4-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1- oder 5- Tetrazolyl, 1 ,2,3-Oxadiazol-4- oder -5-yl 1 ,2,4-Oxadiazol-3- oder -5-yl, 1 ,3,4-Thiadiazol-2- oder -5-yl, 1 ,2,4-Thiadiazol-3- oder -5-yl, 1 ,2,3- Thiadiazol-4- oder -5-yl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-2H-Thiopyranyl, 2-, 3- oder A- 4H-Thiopyranyl, 3- oder 4-Pyridazinyl, Pyrazinyl, 2-, 3-, A-, 5-, 6- oder 7- Benzofuryl, 2-, 3-, A-, 5-, 6- oder 7-Benzothienyl, 1-, 2-, 3-, A-, 5-, 6- oder 7- 1 H-lndolyl, 1-, 2-, A- oder 5-Benzimidazolyl, 1-, 3-, A-, 5-, 6- oder 7-
Benzopyrazolyl, 2-, A-, 5-, 6- oder 7-Benzoxazolyl, 3-, A-, 5-, 6- oder 7- Benzisoxazolyl, 2-, A-, 5-, 6- oder 7-Benzthiazolyl, 2-, A-, 5-, 6- oder 7- Benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- oder 7-Benz-2,1 ,3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, A-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinolinyl, 1-, 3-, A-, 5-, 6-, 7- oder 8-lsochinolinyl, 1-, 2-, 3-, 4- oder 9-Carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 9-Acridinyl, 3-, A-, 5-, 6-, 7- oder 8-Cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinazolinyl oder 1-, 2- oder 3- Pyrrolidinyl.
Unter Heteroaryl-C-i-Cδ-alkyl wird nun in Analogie zu Aryl-CrC6-alkyl beispielsweise Pyridinyl-methyl, Pyridinyl-ethyl, Pyridinyl-propyl, Pyridinyl- butyl, Pyridinyl-pentyl, Pyridinyl-hexyl verstanden, wobei weiterhin die zuvor beschriebenen Heterocyclen in dieser Weise mit der Alkylenkette verknüpft werden können.
HetN+ ist bevorzugt
wobei die Substituenten R1 bis R4 jeweils unabhängig voneinander eine zuvor beschriebene Bedeutung haben.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Kationen der erfindungsgemäßen ionischen Flüssigkeit um Ammonium-, Imidazolium-, Pyridinium-, Pyrrolidinium-, Piperidinium-, Phosphonium-, Morpholinium- oder Piperidinium-Kationen.
Besonders bevorzugte Ionische Flüssigkeiten sind 1-Pentyl-3-methyl- imidazoliumchlorid, 1 -Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1 -Heptyl-3- methyl-imidazoliumchlorid, 1-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Nonyl-3- methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, Trihexyl- tetradecyl-phosphoniumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid, Ethyldimethylpropylammoniumchlorid, 1-Methyl-1-octylpyrrolidiniumchlorid, n-Butylpyridiniumchlorid, n-Octylpyridiniumchlorid, 4-Methyl-4- pentylmorpholiniumbromid oder 1-Methyl-1-pentylpiperidiniumbromid. Ganz besonders bevorzugte Ionische Flüssigkeiten sind 1-Pentyl-3-methyl- imidazoliumchlorid, i-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Heptyl-3- methyl-imidazoliumchlorid, i-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Nonyl-3- methyl-imidazoliumchlorid, 1 -Decyl-3-methyl imidazoliumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid und 1-Methyl-1- octylpyrrolidiniumchlorid.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenzzusammenstellung zusätzlich zumindest eine DC-Platte.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch a) chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte) b) Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer
Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein
Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch a') chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält, und b') Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin oder eines seiner Derivate, und mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als DC-Platte in Schritt a) oder a') eine Platte mit einer unpolaren Phase oder einer Cellulose-Phase eingesetzt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die
Sichtbarmachung in Schritt b), indem die DC-Platte in einem Schritt b1 ) zunächst mit einem Reagenz behandelt wird, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend in einem Schritt b2) mit einem Reagenz, das zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin oder eines seiner Derivate, enthält. Es ist auch möglich die Sichtbarmachung in Schritt b) durchzuführen, indem zunächst eine Behandlung mit mindestens einem Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin (b2), und dann mit der ionischen Flüssigkeit (b1 ) erfolgt. Vorzugsweise jedoch erfolgt die Sichtbarmachung in Schritt b), indem die DC-Platte in einem Schritt b1 ) zunächst mit einem Reagenz behandelt wird, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend in einem Schritt b2) mit einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält, behandelt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) nach der Behandlung der DC-Platte mit der Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und mindestens eine ionische Flüssigkeit oder nach Schritt b') für 0.5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur zwischen 50 und 2000C erhitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Reagenzzusammenstellung verwendet, die ein Reagenz enthält, das zumindest 0.01-10 Massen-%, vorzugsweise 0.1-1 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel enthält, und ein Reagenz, das zumindest 0.1 bis 10% mindestens einer ionischen Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Verfahren zur Sichtbarmachung, insbesondere zur Anfärbung von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine mit einer Reagenzkombination behandelt werden, die zumindest eine ionische Flüssigkeit und mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin oder eines seiner Derivate, enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine zunächst mit einem Reagenz behandelt, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und dann mit einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin enthält.
Weitere Kombinationen bzw. bevorzugte Ausführungsformen sind in den Patentansprüchen offenbart.
Eine Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen ist erfindungsgemäß eine Probe, von der angenommen wird, dass sie zumindest eine Aminosäure und/oder ein Peptid enthält. Die Probe kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein, z.B. ein Zellextrakt, eine Körperflüssigkeit, ein Proteinverdau oder das Reaktionsgemisch einer Peptidsynthese. In der Regel handelt es sich um eine flüssige Probe, wobei die Analyten typischerweise in einem organischen Lösungsmittel oder
Wasser oder Gemischen organischer Lösungsmittel oder Mischungen von organischen Lösungsmitteln und Wasser vorliegen. Die Probe kann beliebige weitere feste, emulgierte oder gelöste Bestandteile enthalten, die aber weder die DC-Auftrennung noch die spätere Anfärbung der Analyten (Aminosäuren und/oder Peptide) stören sollten. Feste Proben werden in der Regel zunächst in einem der oben genannten Lösungsmittel aufgenommen, damit sie auf die DC-Platte aufgetragen werden können. Bei konzentrierten Proben kann es notwendig sein, diese zunächst zu verdünnen. Dem Fachmann im Bereich der Dünnschichtchromatographie ist bekannt, wie groß die Probenmenge und Probenkonzentration in Abhängigkeit von der eingesetzten DC-Platte und dem jeweiligen Trennproblem sein darf bzw. sein muss, um möglichst ideal auswertbare Banden zu erhalten.
Aminosäuren, Peptide und/oder Proteinen sind erfindungsgemäß alle natürlichen oder synthetischen Aminosäuren, Verbindungen, die zwei oder mehrere natürliche oder synthetische Aminosäuren enthalten sowie Aminogruppen-haltige Verbindungen, die beispielsweise mit einer herkömmlichen Ninhydrin-Färbung angefärbt werden können. Verbindungen, die zwei oder mehrere natürliche oder synthetische Aminosäuren enthalten, sind bevorzugt Oligoaminosäuren oder Peptide, insbesondere Peptide mit einer Kettenlänge bis zu 150 Aminosäuren, bevorzugt mit einer Kettenlänge zwischen 2 und 100, besonders bevorzugt zwischen 2 und 25 Aminosäuren. Beispiele für Aminogruppen-haltige Verbindungen, die mit einer herkömmlichen Ninhydrin-Färbung angefärbt werden können, sind Aminosäuren, Amine oder Aminozucker. Bei den Aminosäuren kann es sich um synthetische oder natürliche Aminosäuren handeln. Vorzugsweise handelt es sich um natürliche Aminosäuren wie AIa, Arg, Asn, Asp, Cys, GIn, GIu, GIy, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Typ, Tyr oder VaI.
Möchte man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Proteine oder Peptide mit einer Kettenlänge von mehr als 150 Aminosäuren analysieren, so können diese in einer weiteren Ausführungsform zunächst in Peptide mit einer Kettenlänge von unter 150 Aminosäuren gespalten werden - z.B. durch einen tryptischen Verdau.
Eine DC-Platte ist erfindungsgemäß jedes Medium, auf dem eine dünnschichtchromatographische Auftrennung durchgeführt werden kann. In der Regel besteht eine DC-Platte aus einem Träger z.B. in Form einer Glasplatte, einer Metallplatte oder -folie oder einer Kunststofffolie, die mit einer Sorbens-Phase belegt oder beschichtet ist. Als Sorbentien werden typischerweise die für chromatographische Zwecke bekannten Basis- Sorbentien verwendet. Dies sind z.B. Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose, Kieselgur oder andere organische oder anorganische Polymere oder organisch/anorganische Hybridpolymere. Weiterhin können die Basis- Sorbentien mit funktionellen Gruppen derivatisiert sein, die ihre Trenneigenschaften verändern. Beispiele hierfür sind RP-Phasen, bei denen z.B. Kieselgel mit Liganden derivatisiert ist, die C8 oder C18 Ketten aufweisen (Reversed Phase Material). Andere Bespiele sind CN oder Diol- modifizierte Phasen. Einen Überblick über gängige Sorbens-Phasen für die DC findet man in Klaus K. Unger, Packings and Stationary Phases in Chromatographie Techniques, M. Decker, New York 1990. Entsprechend der Polarität ihrer Oberfläche kann man die Sorbens-Phasen in polare, mittelpolare und unpolare Phasen aufteilen. Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung besonders geeignet ist zur Anfärbung von Aminosäuren und/oder Peptiden auf unpolaren Phasen, wie Kieselgur oder Reversed Phase Materialien. Auch Cellulose-Phasen lassen sich mit hervorragender Farb-Qualität und Intensität anfärben.
Eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung enthält zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und mindestens eine ionische Flüssigkeit. Die Reagenzzusammenstellung kann in Form eines
Reagenzes, typischerweise eines flüssigen Reagenzes, vorliegen, oder mehrere unterschiedliche Reagenzien bzw. Komponenten enthalten. Dabei können das mindestens eine Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und zumindest eine ionische Flüssigkeit zusammen in einem Reagenz vorliegen oder in zwei unterschiedlichen Reagenzien bzw. Komponenten der Reagenzzusammenstellung.
In einer Ausführungsform besteht die Reagenzzusammenstellung zumindest aus einem typischerweise flüssigen Reagenz, das zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Reagenzzusammenstellung zumindest aus a) einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält b) einem Reagenz, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält. Beide Reagenzien sind typischerweise flüssig.
Als Lösungsmittel können ein oder mehrere organische Lösungsmittel oder Mischungen von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder Wasser eingesetzt werden. Es ist auch möglich, dass die ionische Flüssigkeit selbst als Lösungsmittel dient und beispielsweise gemäß der oben beschriebenen Ausführungsform als Lösungsmittel für das Reagenz zum Nachweisen von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen fungiert. Es können mehrere LM sein, bevorzugt wird nur ein LM verwendet. Für in organischen LM schwer lösliche ILs kann Wasser oder eine Mischung aus Wasser + Alkohol sinnvoll sein.
Bei einem Reagenz, das beispielsweise Ninhydrin und zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält, dient als Lösungsmittel bevorzugt Aceton oder Propanol. Bei einem Reagenz, das Ninhydrin aber keine ionische Flüssigkeit enthält, dient bevorzugt ein organisches Lösungsmittel wie Propanol oder Aceton als Lösungsmittel. Bei einem Reagenz, das mindestens eine ionische Flüssigkeit aber kein Ninhydrin enthält, dient als Lösungsmittel bevorzugt Aceton, Propanol, Wasser und Wasser/Alkohol- Mischungen.
Die Reagenzien können zudem optional weitere Stoffe enthalten, z.B. eine oder mehrere zusätzliche ionische Flüssigkeiten, Lösungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, weitere Farbstoffe etc.
Ninhydrin liegt in den erfindungsgemäßen Reagenzien typischerweise in Konzentrationen zwischen 0.01 und 10, bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0.1 und 1 Massen-% vor.
Die ionische Flüssigkeit kann, je nach Art der Reagenzienzusammenstellung, in Konzentrationen zwischen 0.1 und 100 Massen-% vorliegen. Dient die ionische Flüssigkeit zugleich als Lösungsmittel, bzw. umfasst die Reagenzienzusammenstellung getrennte Reagenzien von beispielsweise Ninhydrin und ionischer Flüssigkeit, so liegt der Anteil der ionischen Flüssigkeit typischerweise zwischen 80 und 100%. Es versteht sich von selbst, dass im Falle der Ausführungsform, bei der beispielsweise Ninhydrin und die ionische Flüssigkeit zusammen vorliegen, der Anteil der ionischen Flüssigkeit nicht 100% betragen kann, sondern entsprechend um den Anteil an Ninhydrin verringert werden muss. Wird zusätzlich ein anderes Lösungsmittel verwendet, liegt die ionische Flüssigkeit typischerweise in Konzentrationen zwischen 0.1 und 15, bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0.1 und 10, besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 1 und 5 Massen-% vor. Enthält ein Reagenz zwei oder mehrere verschiedene ionische Flüssigkeiten, dann gelten die obigen Konzentrationsangaben für die Gesamtmenge an ionischer Flüssigkeit. Weitere optionale Bestandteile der erfindungsgemäßen Reagenzkombination sind beispielsweise ein oder mehrere weitere Reagenzien, die zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und/oder eine oder mehrere ionische Flüssigkeit enthalten (z.B. Reagenzien, die diese Bestandteile in anderen Konzentrationen enthalten oder Reagenzien, die andere ionische Flüssigkeit enthalten), eine oder mehrere DC-Platten, alternative Färbereagenzien (z.B. Reagenzien zur Fluorescamin-Färbung) oder Farbtabellen bzw. Farbmuster zur Auswertung der Färbeergebnisse.
Beispiele für erfindungsgemäße Reagenzkombinationen sind:
1. Eine Reagenzkombination bestehend aus einem Reagenz, das zumindest zwischen 0.01 und 10% Ninhydrin und zwischen 0.1 und 10% einer oder mehrerer ionischer Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält.
2. Eine Reagenzkombination enthaltend a) ein Reagenz das zumindest zwischen 0.01 und 10% Ninhydrin in einem
Lösungsmittel enthält b) ein Reagenz, das zumindest zwischen 0.1 und 10% einer oder mehrerer ionischer Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält
3. Eine Reagenzkombination entsprechend Variante 2, die zusätzlich ein weiteres Reagenz enthält, das zumindest eine oder mehrere ionische Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält, wobei sich die Art,
Konzentration und/oder Zusammensetzung der ionischen Flüssigkeiten dieses zusätzlichen Reagenzes von der des anderen Reagenzes, das zumindest eine oder mehrere ionische Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält, unterscheidet.
4. Eine Reagenzkombination entsprechend Variante 1 , 2 oder 3, zusätzlich enthaltend eine oder mehrere DC-Platten und/oder alternative Färbereagenzien (z.B. Reagenzien zur Fluorescamin-Färbung) und/oder Farbtabellen bzw. Farbmuster zur Auswertung der Färbeergebnisse.
Bevorzugte Reagenzkombinationen enthalten zwei oder mehrere Reagenzien, wobei Ninhydrin einerseits und ein oder mehrere ionische
Flüssigkeiten andererseits getrennt in unterschiedlichen Reagenzien vorliegen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen wird die Probe zunächst auf eine DC-Platte aufgetragen und dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Durchführung einer dünnschichtchromatographischen Trennung ist dem Fachmann bekannt, z.B. aus 0b1 s12v1 P Dünnschichtchromatographie, Praktische Durchführung und Fehlervermeidung von Elke Hahn-Deinstrop, Wiley-VCH (1998). Die Auftrennung kann eindimensional oder mehrdimensional durchgeführt werden.
Nach erfolgter dünnschichtchromatographischer Auftrennung erfolgt die Anfärbung mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend
Ninhydrin und mindestens eine ionische Flüssigkeit zur Sichtbarmachung der in der Probe enthaltenen Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine.
Dazu wird die DC-Platte bevorzugt zunächst leicht, vorzugsweise vollständig, getrocknet, damit das Fließmittel, das bei der DC-T rennung verwendet wurde, ganz oder teilweise entfernt wird. Die erfindungsgemäße
Anfärbung kann jedoch auch auf noch vom Fließmittel angefeuchteten DC-
Platten durchgeführt werden.
Der Auftrag der erfindungsgemäßen Reagenzkombination, d.h. in der Regel das Benetzen der DC-Platte mit den Reagenzien der
Reagenzzusammenstellung, erfolgt typischerweise durch Eintauchen der DC-Platte in die entsprechenden flüssigen Reagenzien oder bevorzugt durch Aufsprühen der Reagenzien auf die DC-Platte.
In einer Ausführungsform wird die DC-Platte mit einem Reagenz benetzt, das zumindest Ninhydrin und eine oder mehrere ionische Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält. Dieses Reagenz kann bereits längere Zeit vor seiner Verwendung zusammengestellt worden sein oder bevorzugt maximal 24 Stunden vor seiner Verwendung zusammengemischt worden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DC-Platte zunächst mit einem Reagenz benetzt, das zumindest eine ionische Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält. Anschließend, bevorzugt nach ganz oder teilweisem Trocknen der DC-Platte, wird die Platte mit einem Reagenz benetzt, das zumindest Ninhydrin enthält.
Je nach Art der anzufärbenden Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine kann die Farbreaktion spontan oder nach mehrstündiger Inkubationszeit auftreten oder, wie in den häufigsten Fällen, erst nach Erhitzen. Aus diesem Grund wird die DC-Platte bevorzugt nach dem Auftrag der Reagenzien der erfindungsgemäßen Reagenzkombination auf Temperaturen über 35°C, bevorzugt über 50°C erhitzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird auf Temperaturen zwischen 50 und 2000C erhitzt. Die Dauer der Temperaturbehandlung beträgt in der Regel zwischen 0,5 und 10 Minuten.
Die entstehende Färbung kann visuell oder mit entsprechenden optischen Geräten ausgewertet werden.
Die erfindungsgemäße Reagenzkombination kann auch zum Anfärben von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen in anderen Medien verwendet werden, beispielsweise in flüssiger Phase oder auf anderen Trägern, wie Papier, Gelen oder Membranen. Genauso kann die Reagenzkombination für einen Schnelltest eingesetzt werden, in dem zunächst nur generell festgestellt wird, ob Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine in einer Probe vorhanden sind. Dazu muss keine chromatographische oder andere Trennung durchgeführt werden. Es ist ausreichend, die Probe - bevorzugt auf einem Träger, z.B. einer DC-Platte - mit der Reagenzkombination in Kontakt zu bringen. Die Durchführung erfolgt dabei entsprechend Schritt b) des oben beschriebenen Verfahrens. Anhand der Farbentwicklung lässt sich dann feststellen ob und gegebenenfalls welche Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine in der Probe vorhanden sind.
Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Reagenzzusammenstellung beziehungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass bei verschiedenen Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen eine unterschiedliche Färbung entsteht. Während bei der herkömmlichen Ninhydrin-Färbung, bei der keine ionischen Flüssigkeiten zugesetzt werden, alle Aminosäuren und/oder Peptide außer Prolin eine blau bis violette Färbung zeigen, variiert die Farbe bei der erfindungsgemäßen Färbung über das gesamte Farbspektrum. Hinzu kommt, dass durch die Wahl der eingesetzten ionischen Flüssigkeit bzw. Mischung zweier oder mehrerer ionischer Flüssigkeiten das entstehende Farbspektrum verändert werden kann. So kann man, falls nötig, anhand weniger Versuche mit verschiedenen ionischen Flüssigkeiten herausfinden, welche ionische Flüssigkeit oder welche Mischung für das vorliegende Analyseproblem besonders vorteilhaft ist und somit die Zielanalyte besonders gut und unterscheidbar von anderen in der Probe vorhandenen Aminosäuren und/oder Peptiden anfärbt.
Sowohl Aminosäuren wie auch Peptide zeigen je nach ihrer chemischen Struktur bzw. ihrer Zusammensetzung nach Behandlung mit der erfindungsgemäßen Reagenzkombination verschiedene Färbungen. Dadurch wird sowohl die Identifikation bestimmter Aminosäuren in einer Probe erheblich erleichtert, aber auch die Identifikation von Peptiden, z.B. für das Peptide Mapping nach einem tryptischen Verdau.
In den angefügten Tabellen 1 und 2 werden beispielhaft für erfindungsgemäße Reagenzkombinationen mit unterschiedlichen ionischen Flüssigkeiten die bei der Färbung einiger Aminosäuren entstehenden Farbmuster aufgelistet.
Tabelle 1
Tabelle 2
Üblicherweise kann die Sichtbarmachung bereits bei Mengen von 10 bis 50 ng an Aminosäure bzw. Peptid erfolgen.
Neben Ninhydrin können selbstverständlich auch entsprechende Derivate von Ninhydrin oder Komplexe des Ninhydrins, z.B. jene in Kombination mit z.B. Cu, Cd, Sn, eingesetzt werden.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen. Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Die vorliegende Erfindung kann die genannten notwendigen oder optionalen Bestandteile bzw. Einschränkungen umfassen, daraus im wesentlichen bestehen oder daraus bestehen.
Beispiele
1. Selektive Anfärbung von Aminosäuren
Anfärbung mit IL und Ninhydrin
Substanzen: Alaπiπ, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin,
Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, (von links nach rechts)
Mobile Phase: 2-Butanol/ Pyridin/ Essigsäure(100%)/ Wasser (30/20/6/24)
Stationäre Phase: ProteoChrom® HPTLC Cellulose
Aluminiumfolie (Hersteller Merck KGaA, Deutschland)
Anfärbung: Sprühen mit 3,5%iger lonic Liquid Lösung, trocknen, Sprühen mit 0,5% iger Ninhydrinlösung und auf
110° C erhitzen lonic Liquid: 1-Pentyl-3-methyl-imidazolim Chloride (Farben siehe Tabelle 1)
2. Selektive Anfärbung von Peptiden aus dem tryptischen Verdau von Proteinen
Anfarbung mit IL und Ninhydπn
Substanzen: Tryptischer Verdau von Phosphitin, Myoglobin, Cytochrome C, ß-Caseιn, BSA (von links nach rechts)
Mobile Phase: 2-Butanol/ Pyπdin/ Essιgsäure(100%)/ Wasser (30/20/6/24)
Stationäre Phase- ProteoChrom® HPTLC Cellulose
Aluminiumfohe (Hersteller Merck KGaA, Deutschland)
Anfarbung Sprühen mit 3,5%ιger lonic Liquid Losung, trocknen, Sprühen mit 0,5% iger Ninhydπnlόsung und auf
110" C erhitzen lonic Liquid: 1-Pentyl-3-methyl-ιmιdazolιm Chloride
Farben: Braun, rot, rotbraun, blau, violett
Verfahrensbeschreibung:
Probenauftragung: Die Proben werden mit einer Kapillare oder mit einem automatischen DC Auftragegerät (z.B. Linomat V, Camag, Muttenz, Schweiz) auf die DC-Platte aufgetragen. Bei einer typischen Probekonzentration von 1-2 mg/ml werden 1-1 Oμl aufgetragen.
Entwicklung: Die Entwicklung erfolgt in einer DC-Kammer. Die Platte wird nach der Auftragung kurz getrocknet und dann in eine mit Fließmittel (Mobile Phase) befüllte DC- Kammer (ohne Kammersättigung) gestellt und entwickelt. Die Entwicklungsstrecke ist 5 cm und die Entwicklungszeit für 5 cm liegt bei ca. 1 h.
Trocknung: Die Platte wird für mindestens 30 min unter Druckluft getrocknet, um das Fließmittel möglichst vollständig zu entfernen.
Anfärbung: Die Anfärbung erfolgt durch Besprühen mit einem DC-
Sprühgerät. Dazu wird eine 3,5%ige IL Lösung und eine 0,5%ige Ninhydrin Lösung vorbereitet. Die Platte wird erst mit der IL Lösung besprüht . Dann erfolgt eine Zwischentrocknung von 5 min. Dann wird die Platte mit Ninhydrin Lösung besprüht und gleich danach für zwei Minuten auf 1100C erhitzt. Die Platte wird kurz abgekühlt und dokumentiert.
Alternativ kann auch ein vollautomatisches Sprühgerät, z.B. das Gerät ChromaJet DS 20 von DESAGA SARSTEDT-Gruppe (Deutschland), eingesetzt werden.

Claims

Ansprüche
1. Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit.
2. Reagenzzusammenstellung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass das Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält.
3. Reagenzzusammenstellung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung zumindest a) ein Reagenz zumindest enthaltend Ninhydrin oder eines seiner Derivate in mindestens einem Lösungsmittel und b) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
4. Reagenzzusammenstellung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung zumindest a) ein Reagenz zumindest enthaltend 0.01-10 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel b) ein Reagenz zumindest enthaltend 0.1 bis 10 Massen-% mindestens einer ionischen Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält.
5. Reagenzzusammenstellung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung ein Reagenz enthält, das als ionische Flüssigkeit 1-Pentyl-3-methyl- imidazoliumchlorid, i-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchloπd, i-Heptyl-3- methyl-imidazoliumchlorid, 1 -Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1 -Nonyl-3- methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, Trihexyl- tetradecyl-phosphoniumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid, Ethyldimethylpropylammoniumchlorid, 1 -Methyl-1 -octylpyrrolidiniumchlorid, n-Butylpyridiniumchlorid, n-Octylpyridiniumchlorid, 4-Methyl-4- pentylmorpholiniumbromid oder 1 -Methyl-1 -pentylpiperidiniumbromid enthält.
6. Reagenzzusammenstellung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung zusätzlich zumindest eine DC-Platte enthält.
7. Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch a) chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte) b) Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer
Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit.
8. Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch a') chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält, und b') Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer
Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen.
9. Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren,
Peptiden oder Proteinen Ninhydrin oder eines seiner Derivate ist.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als DC-Platte in Schritt a) oder a') eine Platte mit einer unpolaren Phase oder einer Cellulose-Phase eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Anfärbung in Schritt b) erfolgt, indem die DC- Platte in einem Schritt b1 ) zunächst mit einem Reagenz behandelt wird, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend in einem Schritt b2) mit einem Reagenz, das zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen enthält.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) nach der Behandlung der DC-Platte mit der Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und eine ionische Flüssigkeit für 0.5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur zwischen 50 und 2000C erhitzt wird.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reagenzzusammenstellung verwendet wird, die ein Reagenz enthält, das zumindest 0.01-10 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel enthält, und ein Reagenz, das zumindest 0.1 bis 10 Massen-% mindestens einer ionischen Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält.
15. Verfahren zur Sichtbarmachung von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine mit einer Reagenzkombination behandelt werden, die zumindest eine ionische Flüssigkeit und mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine zunächst mit einem Reagenz behandelt werden, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend mit einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit ausgewählt ist aus 1-Pentyl- 3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-
Heptyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1- Nonyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, Trihexyl-tetradecyl-phosphoniumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid, Ethyldimethylpropylammoniumchlorid, 1-Methyl-i-octylpyrrolidiniumchlorid, n-Butylpyridiniumchlorid, n-
Octylpyridiniumchlorid, 4-Methyl-4-pentylmorpholiniumbromid oder 1- Methyl-1-pentylpiperidiniumbromid.
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