EP2033715A1 - Verfahren zum Suspendieren oder Resuspendieren von Partikeln in einer Lösung sowie daran angepasste Vorrichtung - Google Patents

Verfahren zum Suspendieren oder Resuspendieren von Partikeln in einer Lösung sowie daran angepasste Vorrichtung Download PDF

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EP2033715A1
EP2033715A1 EP07015986A EP07015986A EP2033715A1 EP 2033715 A1 EP2033715 A1 EP 2033715A1 EP 07015986 A EP07015986 A EP 07015986A EP 07015986 A EP07015986 A EP 07015986A EP 2033715 A1 EP2033715 A1 EP 2033715A1
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EP
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mixing
magnetic field
mixing rod
particles
rod
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EP2033715B1 (de
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Daniel Zwirner
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Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/286—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the inner circumference of a recipient, e.g. magnetic drain bolt
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/284—Magnetic plugs and dipsticks with associated cleaning means, e.g. retractable non-magnetic sleeve

Definitions

  • the invention relates to a method for suspending particles, in particular magnetically attractable particles and beads such as ferromagnetic and / or paramagnetic particles, in a liquid mixture used for example for diagnostic or analytical purposes.
  • Magnetically attractable particles can be separated by suitable magnetic fields from the mixture in which they are suspended. This applies in particular to automated methods, since in this way a large number of samples can be analyzed within a short time without expensive centrifugation steps. This allows a large sample throughput and makes it possible to considerably reduce the effort involved in extensive and in particular parallel investigations.
  • Important fields of application are the purification of biological or medical samples, generally the separation and isolation of biological target molecules in particular, medical diagnostics as well as pharmaceutical screening methods for the identification of potential active pharmaceutical ingredients.
  • Methods for separating magnetically attractable particles are, for example, in DE 44 21 058 . DE 103 31 254 . DE 10 2005 004 664 . WO 94/18565 . WO 99/42832 . WO 02/40173 . WO 2005/044460 . US Pat. No. 5,942,124 and US 6,448,092 disclosed.
  • the basic principle of the methods described therein is based on the fact that a separating device, for example a magnetic bar, is immersed in a usually liquid mixture and, due to the action of the magnetic field, the magnetically attractable particles contained in the mixture are concentrated on the surface of the separating device. The separation device is then guided out of the solution with the adhering particles.
  • the magnetic particles come into contact with a plurality of solutions, e.g. in binding or washing processes, yield losses of the target molecules which bind to the magnetic particles or inadequate purification results frequently occur when the particles are not sufficiently suspended in the solutions or mixtures but settle at the bottom.
  • the particles used in such processes per se have a high tendency for sedimentation. Therefore, it is attempted in the processes described to hold the magnetic particles in suspension at least temporarily by mechanical mixing movements or to resuspend the sedimented particles.
  • a problem that has been found in the practical application of the processes of the prior art is that the particles having the target molecules, in particular the biological target molecules, or the impurities in generating a magnetic field and direct or indirect collection of the magnetic particles no longer adhere to the magnet as particles on the magnet, but rather as lumps or flakes.
  • the particles having the target molecules, in particular the biological target molecules, or the impurities in generating a magnetic field and direct or indirect collection of the magnetic particles no longer adhere to the magnet as particles on the magnet, but rather as lumps or flakes.
  • after release of the particles from the magnet for example for washing the particles or eluting the components bound thereto, they are difficult to suspend and sediment very quickly. This can also lead to poor purification results.
  • magnetically attractable particles are understood as meaning particles and beads which can be attracted by a magnetic field. Examples thereof are particles and beads which have ferro-, ferri-, paramagnetic and / or superparamagnetic materials as well as magnetizable materials.
  • the magnetic or magnetizable particles usually have at least partially a surface of a non-magnetic or magnetizable material, which ultimately causes the binding of the biological target molecules or impurities.
  • the size of such particles can range from about 500 nm to about 25 ⁇ m.
  • the mixing vessel may in particular be any vessel typically used in the field of analysis and diagnostics.
  • it may be a single separate and independent reaction vessel for chemical, biological and / or medical applications or such a reaction vessel, which forms a unit together with one or more further usually similar reaction vessels, for example in the form of a so-called multiwell plate.
  • the reaction vessels can be combined in a stackable plate.
  • Such plates are commonly used in the field of biotechnology for the manual or automated performance of purification of biological samples or isolations of special components, such as nucleic acids or proteins, or for downstream processes such as assays, PCR o. ⁇ .
  • each reaction or mixing vessel may have a mixture with magnetically attractable particles contained therein.
  • the mixtures may contain other substances, e.g. dissolved or suspended.
  • the magnetic particles are added as a powder or suspension to an untreated or pretreated sample.
  • the particles then usually sink first to the ground.
  • the magnetically attractable particles at the time of application of the method according to the invention are therefore predominantly at the bottom of the mixing vessel, d. H. the particles are sedimented. In this case, the particles are resuspended in the mixture again.
  • the powdery particles are in the mixing vessel before a sample or mixture is added. In this case, the method serves to suspend the magnetically attractable particles accumulated at the bottom of the mixing vessel.
  • the mixing rod used for suspending or resuspending has at least one magnetic field generating device.
  • the purpose of this device is to selectively generate an effective magnetic field, in particular in the region of the front end of the mixing rod, ie an effective magnetic field can be switched on and off there.
  • turning on the magnetic field at a location is meant that an effective magnetic field is generated at that location (for example, by switching on an electromagnet located there) or that a magnetic field is transported to that location (for example, by moving a permanent magnet). Under the latter conditions, the magnetic field is considered to be turned on only when the total magnetic field strength is in place, that is, when the magnetic field is still on its way to the location, it is not yet considered turned on.
  • switch-off is understood to mean that no effective magnetic field is generated in the region of the front end (more) or a previously generated magnetic field is removed.
  • a magnetic field is "effective” for the purposes of the present invention, if it moves the particles in the mixture and in particular can be attracted to the mixing rod.
  • Switchching on” and “switching off” therefore refers to the selective generation of a magnetic field, in particular in the region of the front end of the mixing rod.
  • the magnetic field can be generated not only in the region of the front end of the mixing rod, but also extend over the length of the rod. However, it should preferably be avoided that the opposite of the front end of the mixing rod pole of the magnet is also immersed in the mixture. It goes without saying that the strength of the required magnetic field has to be selected as a function of the viscosity of the solution and of the size, weight and magnetic material of the particles.
  • the particles located at the bottom of the mixing vessel are first drawn from the bottom in the direction of the front end of the mixing rod.
  • the mixing rod is preferably brought together with the magnetic field generating device with its front end to the bottom of the mixing vessel. It is not only not necessary, but also for reasons of construction and process assurance not desired that the front end of the mixing rod touches the ground.
  • a magnetic field is generated in the region of the front end of the magnetic field generating means, with which the particles are attracted to the mixing rod.
  • the mixing rod can also be moved together with the magnetic field generating device, which already generates a magnetic field, to the bottom of the mixing vessel or an already magnetic field generating Magnetic field generating means can be moved in the direction of the front end of the mixing rod, which is already positioned in the vicinity of the bottom of the mixing vessel.
  • the magnetic field generating device is then preferably pulled out of the mixture together with the mixing rod at least partially away from the ground.
  • the strength of the generated magnetic field and the acceleration and the speed with which the magnetic field is moved out of the mixture should preferably be tuned so that the sedimented magnetic particles move from the ground into the mixture but not necessarily adhere to the mixing rod.
  • this is achieved in that the magnetic field is always in motion and residence times are minimized, especially in the vicinity of the soil.
  • a permanent magnet this can be achieved by first moving the magnet towards the ground (be it together with the mixing rod or towards the front end of the mixing rod already located there). If the magnet is sufficiently close to the ground to be able to attract the particles via the magnetic field, the magnet reverses and the magnet is now moved away from the ground together with the mixing rod.
  • the residence time of the magnet in the vicinity of the bottom should be just chosen so that the particles, although to move on this, but at least not as completely collect on the mixing rod.
  • the adhesion of a part of the particles to the mixing rod can not normally be completely avoided even with careful coordination of the conditions, but the proportion should be kept as small as possible.
  • the minimum distance of the mixing rod to the bottom is preferably 0.1 to 2 mm, more preferably 0.3 to 1 mm, and most preferably 0.5 to 0.6 mm.
  • the minimum distance of the magnet to the inner tip of the mixing rod prior to the movement reversal of the magnet is preferably> 0 to 10 mm, more preferably 0.3 to 8 mm and most preferably 0.5 to 5 mm.
  • the above-specified distance ranges from the lowest (distal) end of the magnet to the lowest (distal) inner end of the mixing rod preferably include both the case that both have parallel contours at their lower end and that both have different contours at their lower end ,
  • electromagnets When electromagnets are used, they can already be switched on a considerable distance from the ground. Under these circumstances, the first one runs Process step of raising the particles preferably analogous to when using the permanent magnet. If the electromagnet is only activated when it is close to the ground, then the movement of the magnetic field should take place together with the mixing rod away from the ground directly after generation of the magnetic field and acceleration of the particles in the direction of the mixing rod.
  • the residence time of the magnet turned on with a field strength in the range of 0.5 to 1.5 T at the location where the distance of the integrated-magnet mixing rod to the ground is minimum (preferably 0.1 to 2 mm, more preferably 0) , 3 to 1 mm, and most preferably 0.5 to 0.6 mm) 0.02 to 5 s, more preferably 0.04 to 3 s, even more preferably 0.1 to 0.5 s, and most preferably 0, 2 s.
  • the travel of the magnet should first have an acceleration of the stationary magnet to a travel speed (preferably a 1 * t 1 ) in the direction of the vessel bottom, the magnet either together with the mixing rod or on the already closer to the vessel bottom located mixing rod can be accelerated.
  • the magnet may then further have a directed in the direction of the vessel bottom constant travel speed a 1 * t 1 , wherein the magnet in turn can move simultaneously with the mixing rod or on this. Subsequently, the magnet is accelerated to a speed of 0 with a negative acceleration (preferably a 2 * t 2 ). This negative acceleration can also follow directly after the positive acceleration.
  • the mixing bar may accordingly experience the same negative acceleration or have been previously accelerated to a speed of zero.
  • the magnet together with the mixing rod should preferably be at a speed 0 at the position at which the distance between magnet and mixing rod to the bottom of the vessel is always minimal.
  • a 1 is the acceleration of the magnet or of the mixing rod
  • t 1 the time required to reach the travel speed of the magnet or the mixing rod in the direction of the vessel bottom
  • t 3 the time during which a constant travel speed in the direction of the If the bottom of the vessel is present
  • the travel of the mixing rod can be parallel to that of the magnet or different from this run.
  • the function underlying the travel of the mixing rod should correspond to that of the magnet, whereby the individual parameters for the magnet and the mixing rod can have different values. If the travel distances for magnet and mixing rod are different, it should at least be ensured that when the magnet has reached its position at a minimum distance from the bottom of the vessel at zero speed, the mixing rod is also at a minimum distance from the bottom of the vessel and the speed is zero.
  • the durations t 1 and t 2 of the accelerations are preferably in the range from 0.02 to 5 s, more preferably from 0.04 to 3 s and even more preferably from 0.1 to 0.5 s.
  • the travel should be analogous to that for the permanent magnet.
  • the path should correspond to the above-described travel of the permanent magnet in the direction of the vessel opening.
  • the particles are released, ie the direction of movement of the particles is no longer influenced by the magnetic field. This is preferably done by switching off the magnetic field or removing the magnetic field generating device from the mixing rod. Simultaneously with the release of the particles or shortly thereafter, the mixing rod is in a Mixed movement, with which he distributes the particles as homogeneously as possible in the solution.
  • the mixing movement is typically a repeated up and down movement of the mixing rod, ie a vertical movement of the mixing rod. In general, a rotating movement or a combination of vertical and rotating movement of the mixing rod is conceivable.
  • the number of mixing operations is not fixed and is usually determined by the user according to what degree of homogeneous distribution of the particles in the mixture is desired.
  • the particles are therefore preferably sufficiently suspended or resuspended if the degree of suspension or resuspension meets the requirements of the user or the best possible suspension or resuspension of the particles in the present system. In most cases, the particles will then be sufficiently suspended if the proportion of resuspended particles after lifting and suspending is still relatively small.
  • the sedimented particles can be effectively removed from the soil with the aid of the method according to the invention and suspended or resuspended in the solution. It is therefore preferably not a separation process in the true sense, in which the particles are held as quantitatively as possible on the magnet or on a surrounding sleeve and removed from the mixing vessel, but the particles should only be brought back into suspension, in particular order to achieve the best possible binding, washing action, elution or the like.
  • the magnetic field is preferably used only for lifting the sedimented particles, while the distribution of the particles in the solution takes place by the mixing movement of the mixing rod with the magnetic field switched off.
  • the inventive method has the advantage that the mere distribution of the already raised from the ground particles can be done by comparatively gentle mixing movements. A stirring up of the sedimented particles only with strong mixing movements, as it would be necessary without the use of a magnetic field, is not necessary. In the method according to the invention, therefore, the solution does not have to be moved very strongly, whereby the risk of cross-contamination of adjacent mixing vessels in automated parallel processing is considerably reduced.
  • the mixing rod for lifting the sedimented particles need not be completely led to the ground in the process according to the invention, but only be brought close to the ground. As a result, impacts of the mixing rod are avoided on the bottom of the mixing vessel.
  • the mixing rod When fluidizing the sedimented particles exclusively by a mixing movement of the mixing rod and without the use of a magnetic field, the mixing rod must be brought directly to the ground, otherwise there is a risk that a large part of the particles is not stirred up.
  • a purely mechanical mixing can cause the particles are not suspended or resuspended, but rather are pressed to the ground.
  • such a purely mechanical Resuspend istmaschinesclar requires a high design effort to exclude or minimize collisions of soil and mixing vessel and related damage to the soil and leakage of the mixture.
  • This embodiment can be suitably combined with individual aspects and features of the embodiments described above and below, in particular with regard to the structure of the mixing rod, the type of magnetic field generation and the timing of the mixing movement and the magnetic field generation.
  • Figures 1A and 1B show a first and a second embodiment of a mixing rod.
  • FIG. 2 shows a third embodiment of a mixing rod.
  • FIGS. 3A to 3E show individual sequences of the sequence of an embodiment of the method according to the invention.
  • FIGS. 4A to 4E show individual sequences of the sequence of another embodiment of the inventive method
  • FIG. 5 shows a lift diagram of a mixing rod with a movable permanent magnet according to another embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 1A shows a first embodiment of a mixing rod 101.
  • the mixing rod may for example have an elongated cylindrical shape.
  • the mixing rod 101 has an example cylindrical or rotationally symmetrical outer sleeve 102 made of a typically non-magnetic material.
  • the material of the sleeve 102 should preferably be chosen so that it does not or only slightly attenuates magnetic fields.
  • the sleeve 102 may consist of an inert plastic, which is for example largely dimensionally stable. To achieve the dimensional stability, the material thickness of the sleeve 102 can be selected accordingly.
  • the sleeve 102 may be structured on its outer side. At its front end 103, the sleeve 102 is typically closed. This end simultaneously forms the front end 103 of the mixing rod 101.
  • a permanent magnet 104 is movable within the sleeve 102, in particular in the longitudinal direction of the sleeve 102, respectively.
  • the permanent magnet 104 can be moved in the sleeve 102 by a rod 105 in the longitudinal direction, i. in particular out of the region of the front end 103 and again brought into the region of the front end 103 into it. This is done for example by means of a corresponding actuator, which is not shown here.
  • the mixing rod 101 is also movable, for example, in the longitudinal direction. In this case, mixing rod 101 and permanent magnet 104 can be moved independently of each other.
  • the movable permanent magnet 104 forms the magnetic field generating means in this embodiment.
  • the mixing rod 101 may, as in Figure 1A shown inserted into a mixing vessel 110.
  • the mixing vessel 110 may be made of a dimensionally stable, soft material, which may be partially flexible.
  • a plastic can be used for the mixing vessel.
  • the material of the mixing vessel 110 or softer be as the material of the sleeve 102.
  • a plurality of mixing vessels 110 may be grouped next to each other to a plate, not shown here.
  • Figure 1A shows a mixing vessel 110 with a tapered, for example, approximately conical bottom 111.
  • the front end 103 of the mixing rod 101 may be adapted to the shape of the mixing vessel 110 and may also taper pointed, for example approximately conical.
  • Other shapes for the bottom 111 of the mixing vessel and the front end 103 of the mixing rod are also possible, for example approximately concave-shaped, conical, flat or round.
  • free-form surfaces are also conceivable as forms for the bottom 111 of the mixing vessel and the front end 103 of the mixing rod, although these are less preferred for reasons of construction, production and the course of the process.
  • the permanent magnet 104 has a vertical extension which is dimensioned so that its upper end (its north pole N in the exemplary embodiment shown) is always above the liquid level even when the mixing rod 103 is fully immersed.
  • the permanent magnet 104 generates according to the in Figure 1A In the embodiment shown, a magnetic field that runs essentially in the longitudinal direction of the mixing rod 110. This is in Figure 1A indicated by the arrangement of the poles (north and south). It is also possible for the magnetic field to have a different orientation, for example a lateral alignment with respect to the longitudinal extent of the mixing rod 101.
  • the permanent magnet 104 is in Figure 1A shown comparatively short in the longitudinal direction of the mixing rod 101. It is also possible for the permanent magnet 104 to have a different extension in the longitudinal direction, for example significantly longer.
  • the permanent magnet 104 may be formed by two or more permanent magnets.
  • the spatial position of the magnetic field generated by the permanent magnet 104 with respect to the front end 103 of the mixing rod 101 can be changed by moving the permanent magnet 104. If the permanent magnet 104 is pushed to the front end 103 of the mixing rod 101, the magnetic field generated by the permanent magnet 104 acts there. An "effective" magnetic field is therefore "turned on” in the front region of the mixing rod 101. If, however, the permanent magnet 104 sufficiently far away from the front end 103 of the mixing rod 101, the effect of the magnetic field generated by the permanent magnet 104 at the front end 103 is so far weakened that there is no to Lifting of magnetically attractable particles effective magnetic field is more present. The magnetic field is therefore "turned off” at the front end 103 of the mixing rod 101.
  • FIG. 1B Another embodiment for turning on and off the magnetic field shows FIG. 1B , This comprises one in comparison to the permanent magnet 104 Figure 1A in the longitudinal direction comparatively long permanent magnet 106, which is surrounded by a shielding 107 of, for example, ferromagnetic material.
  • Both the permanent magnet 106 and the shielding sleeve 107 may be arranged to be movable in the longitudinal direction of the mixing rod 101 and be moved independently of one another by corresponding actuating devices, not shown here.
  • the shielding sleeve 107 can be withdrawn from the front end 103 in order to expose the south pole of the permanent magnet 106 shown here.
  • the field lines can penetrate through the sleeve 102 and extend outside the mixing rod 101.
  • the shielding sleeve 107 is pushed back over the permanent magnet 106 and thereby shields the magnetic field generated by the permanent magnet to the outside.
  • the permanent magnet 106 may be withdrawn from the front end 103.
  • the permanent magnet 106 together with the shielding sleeve 107 in this embodiment forms the magnetic field generating means.
  • FIG. 2 shows an embodiment in which the magnetic field is generated by an electromagnet 120.
  • the electromagnet 120 has a core 121 with, for example, a thick front end 122.
  • the core 121 is surrounded by a coil 123 through which a current for generating a magnetic field can flow.
  • the switching on and off of the magnetic field takes place here by corresponding switching on and off of the current.
  • Mechanical actuating means for moving a permanent magnet or a shielding sleeve can be dispensed with in the embodiment shown here.
  • the magnetic field generating device is formed by the electromagnet 120 in this embodiment. In general, any type of magnetic field generating device for use in the method according to the invention is conceivable, as long as this allows the switching on and off of a magnetic field.
  • FIGS. 3A to 3E With reference to the FIGS. 3A to 3E will be described below an embodiment of the method according to the invention.
  • This is an in Figure 1A shown mixing rod, but with a long permanent magnet used.
  • Figures 1B and 2 shown to use mixing rods or otherwise constructed mixing rods. It is only necessary to ensure that the mixing rod allows selective generation of a magnetic field at least at its front end.
  • the mixing vessel 10 may contain a predominantly liquid mixture 30 with magnetically attractable particles 40 therein.
  • the particles 40 may be particles 40 sedimented from the mixture.
  • the particles 40 have accumulated on the bottom 11 of the mixing vessel 10.
  • the particles 40 may be particles or beads that are attracted to a magnetic field, ie that have, for example, a ferro-, ferri-, para- or superparamagnetic material and at least partially have a surface that is capable of For example, to bind contaminants or biological target molecules such as nucleic acids or proteins.
  • the bondable surface may be formed by the magnetic material itself or at least partially often completely by a non-magnetic material such as a polymer or a SiO 2 -containing material, which may also be functionalized.
  • the particles have a typical particle diameter of about 500 nm to 25 microns, preferably from about 1 to 20 microns and more preferably from about 4 to 16 microns. It goes without saying that the particles have a certain size distribution.
  • the surfaces of the particles 40 are functionalized, the functionalization depending on the specific analytical or diagnostic application and is irrelevant to the inventive method.
  • Such magnetic particles are already known in various embodiments and for various applications from the prior art.
  • the mixture 30 may be any homogeneous or heterogeneous mixture that may be present in the applications described, and one has sufficient low viscosity in order to carry out the inventive method can.
  • they are mixtures which have a considerable proportion of liquid constituents.
  • it is a lysis, binding, washing or elution solution or a mixture containing specific or biological, substances or impurities to be examined or separated.
  • the mixture is a biological sample, it may be untreated or pretreated, for example as a lysate, and may also contain solid components such as cell residues. The nature of the mixture is irrelevant to the performance of the process.
  • a mixing rod 1 With its front end 3 ahead, which faces the bottom 11 of the mixing vessel 10, immersed. This is done, for example, by lowering the mixing rod 1 along its longitudinal extent. The downward movement of the mixing rod 1 is in FIG. 3A indicated by an arrow. However, the front end 3 of the mixing rod 1 may already be immersed in the mixture 30 and is then only lowered.
  • the permanent magnet 4 can be pushed by actuation of the rod 5 to the front end 3 of the mixing rod 1, so that there is a sufficiently strong magnetic field is built up.
  • the permanent magnet 3 may already be located at the front end 3 of the mixing rod 1 when it is lowered. Regardless of the way in which the permanent magnet 3 is guided to the front end 3 of the mixing rod 1, this is at least temporarily at the front end 3 when the mixing rod 1 is close to the bottom 11 of the mixing vessel 10. This situation is in FIG. 3B shown.
  • the front end 3 of the mixing rod 1 preferably does not touch the bottom 11 of the mixing vessel, but is somewhat spaced therefrom, typically defined.
  • the mixing rod can be up about 0.5 to 2 mm are brought to the bottom 11 of the mixing vessel. This distance has been found in most applications to be sufficient to avoid collisions of the mixing rod with the bottom of the mixing vessel.
  • the distance to the bottom is preferably 0.1 to 2 mm, more preferably 0.3 to 1 mm, and most preferably 0.5 to 0.6 mm.
  • the particles 40 are attracted to the magnetic field generated by the permanent magnet 4 in the region of the front end 3 of the mixing rod 1 and move away from the ground into the mixture, but adhere only to a slight extent on the outer surface of the mixing rod. 1 , or the sleeve 2.
  • the particles 40 are lifted from the bottom 11 and can be pulled away from the ground by the mixing rod 1.
  • the mixing rod 1 is pulled upwards together with the permanent magnet 4 located at the front end 3, as in FIG FIG. 3C indicated by an arrow.
  • This upward movement can take place comparatively slowly, so that the adhering particles 40 do not detach from the mixing rod 1.
  • the movement should not be too slow, since otherwise the proportion of the particles adhering to the mixing rod can become too large.
  • the permanent magnet 4 is pulled by the rod 5 relative to the sleeve 2 also upwards, ie from removed front end 3 of the mixing rod.
  • the permanent magnet 4 can be pulled up comparatively quickly, for example, jerky.
  • jerk it is preferably meant that the magnet has a velocity at which it has a time of from 0.05 to 1 s, more preferably from 0.2 to 0.4 s, and most preferably from 0.25 to 0.3 s travels a distance of 100 mm.
  • the path can therefore also be n * 100 mm, where n> 0 and where the associated travel times in this case are also to be multiplied by n.
  • the aim of this measure is to reduce the effect of the magnetic field at the front end 3 of the mixing rod 1 sufficiently fast or off, so that the particles are no longer attracted to the mixing rod 1.
  • the permanent magnet 4 can be withdrawn sufficiently quickly from the front end 3 of the mixing rod 1, so that the particles 40 can not follow the movement due to friction and the viscosity of the mixture 30.
  • the preferably cone-shaped front end of the mixing rod 3 also counteracts a "walking" of the particles 40.
  • the comparatively rapid pulling up of the permanent magnet 4 is in Figure 3D indicated by a long arrow.
  • the permanent magnet 4 is brought to a position above the mixture 30, so that in the mixture 30 no effective magnetic field is formed.
  • the mixing vessel 10 calculated from the bottom 11, be filled to a height of, for example, about 15 mm.
  • the particles 40 can then be brought to a height of, for example, about 10 mm and released there.
  • the pulling up of the mixing rod 1 and the permanent magnet 4 need not be done exactly in the manner described above. It is also possible to retract the permanent magnet 4 at least partially and slightly offset in time already when pulling up the mixing rod 1. Regardless of the specific way chosen, the goal is to pick up the particles 40 from the bottom 11 and continue to "up", i. from the bottom of the mixing vessel, so that they can then be better suspended in the mixture 30. It should be recorded by the mixing rod 1 largely all particles sedimented at the bottom 11 40.
  • the particles 40 are preferably not or only in small quantities adhere to the mixing rod 1. For the best possible suspension of the particles, it is sufficient if they are raised sufficiently far from the ground 11 by the action of the magnetic field. It is still sufficient if the particles 40 are lifted so far that they afterwards can be easily distributed by the subsequent onset of mixing movement of the mixing rod 1 in the mixture.
  • the mixing movement of the mixing rod 1, which follows the "switching off” of the magnetic field at the front end 3 of the mixing rod, is in FIG. 3E shown.
  • the mixing rod 1 repeatedly moves up and down, distributing the high-particulate matter 40 in the mixture 30.
  • the stroke of the mixing movement and the frequency are adjusted so that on the one hand sufficient mixing is ensured and on the other hand a " Spilling over "the mixture from a mixing vessel into an adjacent mixing vessel is safely avoided.
  • the mixing movement can take place at a frequency of about 1 Hz to about 20 Hz.
  • the mixing movement of the mixing rod 1 is particularly effective when the mixing rod displaces a not inconsiderable part of the solution volume, as this causes the liquid level to migrate.
  • the change in the liquid level is, for example, from the comparison of FIGS. 3A and 3B clearly.
  • the mixing movement can in particular also be gentler compared to those mixing devices in which no magnetic field-assisted picking up of the particles 40 takes place and which require more vigorous mixing movements in order to stir up the sedimented particles.
  • the lifting height of the mixing rod 1 during the mixing process can be, for example, 30 to 100% of the liquid column.
  • mixing movements for example a rotation of the mixing rod 1
  • rotational movements especially in parallel processing of multiple mixing vessels, each with associated mixing rod require a higher mechanical effort than strokes. Therefore, in the case of corresponding devices or robots with a large number of, for example, arrayed mixing rods, these are preferably movable only along their longitudinal extent, especially since such a movement is already required for the insertion of the mixing rods and thus no additional mechanism is required.
  • the particles 40 are removed by the method according to the invention, as in FIG. 3E indicated, largely uniformly suspended or resuspended in the entire volume of the mixture 30 to above including above the front end 3. This can make better use of resources.
  • the sedimented particles 40 can be taken up again by the permanent magnet 4. Partial sedimentation is in FIG. 4A indicated. Regardless of whether any sectionedimentation occurs, by re-switching the magnetic field after a certain time or at regular intervals, the particles 40 are again raised sufficiently far, whereby a safe suspensions or resuspension of the particles 40 is ensured.
  • the permanent magnet 4 for example during a downward movement of the mixing rod 1, is moved towards the front end 3 of the mixing rod 1, so as to build up a sufficiently strong magnetic field there.
  • the speed and the stroke of the downward movement which in the event that the mixing rod 1 does not move simultaneously with the permanent magnet 4, but the permanent magnet 4 moves to the mixing rod 1, higher than that Speed or greater than the stroke of the downward movement of the mixing rod 1, so that preferably permanent magnet 4 and mixing rod 1 arrive at the same time at the bottom of the vessel.
  • FIG. 4C shows that the particles 40 are drawn again from the front end 3 of the mixing rod 1 from the ground into the mixture.
  • Figure 4D indicated pulling up of the mixing rod 1 with subsequent rapid startup of the permanent magnet 4
  • the particles 40 moved up from the front end 3 are again brought to a defined height and released there. This is followed by a renewed mixing movement of the mixing rod 1.
  • Figure 4E indicated.
  • the re-collection or suspending of the particles 40 by the mixing rod can take place, for example, during a downward and upward movement of the mixing movement. It is also possible for the mixing movement to be interrupted or slowed down in order not to hinder the suspension by the mixing movement.
  • FIG. 5 represents a lift diagram for the lifting movement of the mixing rod 1 and the permanent magnet 4.
  • curve 50 shows the stroke movement of the mixing rod or the sleeve 2 and curve 51, the lifting movement of the permanent magnet 4 as a function of time t.
  • the lifting heights h are shown relative to a separate reference point, for example the bottom 11 of the mixing vessel 10.
  • a first phase 61 the sleeve 2 and the permanent magnet 3 are moved together downwards and then together again up to a predefined height, wherein the permanent magnet 4 is in the region of the front end 3 of the mixing rod.
  • This lifting movement can take place comparatively slowly and serves to raise the sedimented particles 40, which are brought to the predefined height.
  • a second phase 62 a rapid movement away of the permanent magnet 4 from the front end 3 of the sleeve 2 and the mixing rod 1, while the sleeve 2 can also be pulled up a little. Due to the rapid pulling up of the permanent magnet 4 from the front end 3, the particles are released.
  • phase 63 in which essentially only the sleeve 2 is moved to produce a mixing movement. It is also possible to move along the permanent magnet 4, wherein this should have a sufficient distance to the liquid surface of the mixture 30.
  • the mixing movement is in FIG. 5 represented by periodic or oscillating strokes.
  • phase 64 in which a slower compared to the mixing movements stroke movement takes place and the permanent magnet 4 can be moved asymmetrically to the lifting movement of the sleeve 2 and the mixing rod 1.
  • the permanent magnet 4 is moved, for example, very quickly towards the front end 3, when the front end 3 of the mixing rod 1 in the vicinity of the bottom 11 of the mixing vessel 10 is located. This is to prevent that still suspended particles are pulled down again.
  • the upward movement of the sleeve 2 takes place together with the permanent magnet 4, which is withdrawn quickly at a defined height again from the front end 3 of the mixing rod.
  • phase 65 by a re-mixing without magnetic field.
  • Phases shown can also merge into each other. For example, it is possible to perform the magnetic field-assisted picking up of the particles during the mixing movement.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Suspendieren oder Resuspendieren von magnetisch anziehbaren Partikeln bereitgestellt. Dabei wird zumindest ein Mischgefäßes (10), das zumindest teilweise mit einer Mischung (30) gefüllt ist, in welcher magnetisch anziehbare Partikel (40) am Boden (11) des Mischgefäßes (1) zumindest teilweise sedimentiert sind, bereitgestellt. Ein wirksamen Magnetfeld, das zumindest im Bereich des vorderen Endes (3) des Mischstabs (1) wirkt, wird durch die Magnetfelderzeugungseinrichtung (4) eingeschaltet während der Mischstab (1) in der Mischung (30) eingetaucht ist. Anschließend wird das Magnetfeld zusammen mit dem Mischstab vom Boden (11) des Mischgefäßes (10) weg bewegt, wobei die Bewegung des Magnetfeldes zusammen mit dem Mischstab so erfolgt, dass zumindest ein Teil der magnetisch anziehbaren Partikel (40) vom Boden (11) des Mischgefäßes (10) hochgehoben werden und der Anteil der Partikel, die am Mischstab haften, minimiert wird. Das Magnetfeld wird in einer zuvor definierten Entfernung vom Boden, die größer ist als die Entfernung vom Boden bei Einschalten des Magnetfeldes, ausgeschaltet. Danach werden wiederholte Mischbewegungen des Mischstabs (1) durchgeführt ohne dass am vorderen Ende (3) des Mischstabs (1) ein eingeschaltetes Magnetfeld vorlieget, bis die in der Mischung (30) vorliegenden magnetisch anziehbaren Partikel ausreichend suspendiert bzw. resuspendiert sind.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Suspendieren von Partikeln, insbesondere magnetisch anziehbare Partikel und Beads wie ferro- und/oder paramagnetische Partikel, in einer beispielsweise für diagnostische oder analytische Zwecke verwendeten flüssigen Mischung.
  • Im Bereich der Probenvorbereitung und Probenverarbeitung für analytische oder diagnostische Untersuchungen werden zunehmend Verfahren verwendet, die auf der Nutzung magnetisch anziehbarer Partikel beruhen, an die entweder insbesondere biologische Zielmoleküle oder aber Verunreinigungen binden können. Magnetisch anziehbare Partikel lassen sich durch geeignete Magnetfelder von der Mischung, in welcher sie suspendiert sind, trennen. Dies gilt insbesondere für automatisierte Verfahren, da auf diese Weise eine große Anzahl von Proben innerhalb kurzer Zeit ohne aufwendige Zentrifugationsschritte analysiert werden können. Dies gestattet einen großen Probendurchsatz und ermöglicht, den Aufwand bei umfangreichen und insbesondere parallelen Untersuchungen erheblich zu reduzieren. Wichtige Einsatzgebiete sind die Aufreinigung biologischer oder medizinischer Proben, generell die Abtrennung und Isolierung insbesondere biologischer Zielmoleküle, die medizinische Diagnostik sowie pharmazeutische Screening-Methoden zur Identifizierung potentieller Arzneimittelwirkstoffe.
  • Verfahren zum Abtrennen von magnetisch anziehbaren Partikeln sind beispielsweise in DE 44 21 058 , DE 103 31 254 , DE 10 2005 004 664 , WO 94/18565 , WO 99/42832 , WO 02/40173 , WO 2005/044460 , US 5 942 124 und US 6 448 092 offenbart. Das Grundprinzip der darin beschriebenen Verfahren beruht darauf, dass eine Abtrennvorrichtung, beispielsweise ein Magnetstab, in eine üblicherweise flüssige Mischung eingetaucht und durch Wirkung des Magnetfeldes die in der Mischung enthaltenen magnetisch anziehbaren Partikel an der Oberfläche der Abtrennvorrichtung aufkonzentriert werden. Die Abtrennvorrichtung wird dann mit den anheftenden Partikeln aus der Lösung geführt.
  • Der Einsatz von externen Magnetfeldern zum Mischen und Abtrennen von magnetischen Partikeln ist in WO 2006/010584 beschrieben. Dazu sind um ein besonders gestaltetes Mischgefäß herum Polschuhè angeordnet, mit denen veränderbare Magnetfelder erzeugt werden können.
  • Zum Mischen von Partikeln ist es ebenfalls bekannt, Mischstäbe zu verwenden, die durch Rotation, wie beispielsweise in US 2006/0118494 beschrieben, die Mischung in Bewegung versetzen und dabei die Partikel in der Mischung verwirbeln. Rotationslösungen sind jedoch insbesondere bei automatisierter Parallelverarbeitung sehr aufwendig.
  • Insbesondere wenn im Verlauf von Separations- und/oder Aufreinigungsprozessen die magnetischen Partikel mit mehreren Lösungen in Kontakt treten, z.B. in Binde- oder Waschvorgängen, kommt es häufig zu Ausbeuteverlusten der Zielmoleküle, die an die magnetischen Partikel binden, oder unzureichenden Aufreinigungsergebnissen, wenn die Partikel in den Lösungen oder Mischungen nicht ausreichend suspendiert sind, sondern sich am Boden absetzen. Zudem weisen die bei derartigen Prozessen verwendeten Partikel per se eine hohe Tendenz zur Sedimentierung auf. Daher wird in den beschriebenen Prozessen versucht, die magnetischen Partikel zumindest zeitweise durch mechanische Mischbewegungen in der Schwebe zu halten bzw. die sedimentierten Partikel zu resuspendieren.
  • Ein Problem, das sich bei der praktischen Anwendung der Prozesse des Standes der Technik gezeigt hat, liegt darin, dass die mit den Zielmolekülen, insbesondere den biologischen Zielmolekülen, oder den Verunreinigungen behafteten Partikel bei Erzeugung eines magnetischen Feldes und direkter oder indirekter Sammlung der magnetischen Partikel am Magneten nicht mehr als Partikel am Magneten haften, sondern eher als Klumpen bzw. Flocken. Das führt dazu, dass nach Freisetzung der Partikel vom Magneten zum Beispiel zum Waschen der Partikel oder Eluieren der daran gebundenen Bestandteile, diese sich nur schwer in Suspension bringen lassen und sehr schnell wieder sedimentieren. Auch dadurch kann es zu schlechten Aufreinigungsergebnissen kommen.
  • Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, mit dem insbesondere sedimentierte Partikel in einer Lösung möglichst einfach suspendiert bzw. resuspendiert werden können.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Suspendieren bzw. Resuspendieren von magnetisch anziehbaren Partikeln. Das Verfahren umfasst die Schritte:
    • Bereitstellen zumindest eines Mischgefäßes, das zumindest teilweise mit einer Mischung gefüllt ist, in welcher sich magnetisch anziehbare Partikel befinden, die zumindest teilweise am Boden des Mischgefäßes sedimentiert sind;
    • Bereitstellen zumindest eines Mischstabs mit einem dem Boden des Mischgefäßes zugewandten vorderen Ende, wobei der Mischstab eine Magnetfelderzeugungseinrichtung zum wahlweisen Erzeugen eines Magnetfelds zumindest im Bereich des vorderen Endes aufweist;
    • Einschalten eines wirksamen Magnetfeldes, das zumindest im Bereich des vorderen Endes des Mischstabs wirkt, durch die Magnetfelderzeugungseinrichtung während der Mischstab in der Mischung eingetaucht ist;
    • Bewegung des Magnetfeldes vom Boden des Mischgefäßes weg, wobei die Bewegung des Magnetfeldes so erfolgt, dass zumindest ein Teil der magnetisch anziehbaren Partikel vom Boden des Mischgefäßes hochgehoben werden und der Anteil der Partikel, die am Mischstab haften, minimiert wird;
    • Ausschalten des Magnetfeldes in einer zuvor definierten Entfernung vom Boden, die größer ist als die Entfernung vom Boden bei Einschalten des Magnetfeldes;
    • Durchführung wiederholter Mischbewegungen des Mischstabs ohne dass am vorderen Ende des Mischstabs ein eingeschaltetes Magnetfeld vorlieget, um die in der Mischung vorliegenden magnetisch anziehbaren Partikel zu suspendieren bzw. resuspendieren.
  • Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung sollen unter "magnetisch anziehbaren Partikeln" solche Partikel und Beads verstanden werden, die von einem Magnetfeld angezogen werden können. Beispiele dafür sind Partikel und Beads, die ferro-, ferri-, paramagnetische und/oder superparamagnetische Materialen sowie magnetisierbare Materialien aufweisen. Die magnetischen oder magnetisierbaren Partikel weisen meist zumindest teilweise eine Oberfläche aus einem nicht magnetischen oder magnetisierbaren Material auf, das letztendlich die Bindung der biologischen Zielmoleküle oder Verunreinigungen bewirkt. Die Größe solcher Partikel kann im Bereich von etwa 500 nm bis etwa 25 µm liegen.
  • Bei dem Mischgefäß kann es sich insbesondere um jedes im Bereich der Analytik und Diagnostik typischerweise verwendete Gefäß handeln. Beispielsweise kann es sich um ein einzelnes separates und unabhängiges Reaktionsgefäß für chemische, biologische und/oder medizinische Anwendungen handeln oder um ein solches Reaktionsgefäß, das zusammen mit einem oder mehreren weiteren üblicherweise gleichartigen Reaktionsgefäßen eine Einheit bildet beispielsweise in Form einer sogenannten Multiwellplatte. Die Reaktionsgefäße können in einer stapelbaren Platte vereint sein. Derartige Platten werden üblicherweise im Bereich der Biotechnologie zur manuellen oder automatisierten Durchführung von Aufreinigungen biologischer Proben bzw. Isolierungen spezieller Bestandteile, beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, bzw. für Downstream-Prozesse wie Assays, PCR o. ä. verwendet. Dabei kann jedes Reaktions- oder Mischgefäß eine Mischung mit darin enthaltenen magnetisch anziehbaren Partikeln aufweisen. In den Mischungen können weitere Substanzen enthalten sein, z.B. gelöst oder suspendiert.
  • Üblicherweise werden die magnetischen Partikel als Pulver oder als Suspension zu einer unbehandelten oder vorbehandelten Probe gegeben. Die Partikel sinken dann meist zunächst auf den Boden. Dies sollte auch der Fall sein, wenn die magnetischen Partikel als Suspension vorgelegt und mit der Probe oder einer Mischung versetzt werden. Typischerweise befinden sich die magnetisch anziehbaren Partikel zum Zeitpunkt der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens daher überwiegend am Boden des Mischgefäßes, d. h. die Partikel sind sedimentiert. In diesem Fall werden die Partikel in der Mischung wieder resuspendiert. Andererseits ist es möglich, dass sich die pulverartigen Partikel im Mischgefäß befinden, bevor eine Probe bzw. Mischung hinzugefügt wird. In diesem Fall dient das Verfahren zum Suspendieren der am Boden des Mischgefäßes angesammelten magnetisch anziehbaren Partikel.
  • Der zum Suspendieren bzw. Resuspendieren verwendete Mischstab weist zumindest eine Magnetfelderzeugungseinrichtung auf. Zweck dieser Einrichtung ist es, ein wirksames Magnetfeld insbesondere im Bereich des vorderen Endes des Mischstabs wahlweise zu erzeugen, d.h. es kann dort ein wirksames Magnetfeld ein- und wieder ausgeschaltet werden. Unter "einschalten" des Magnetfeldes an einem Ort wird dabei verstanden, dass ein wirksames Magnetfeld an diesem Ort erzeugt wird (beispielsweise durch Einschalten eines dort befindlichen Elektromagneten) oder dass ein Magnetfeld an diesen Ort transportiert wird (beispielsweise durch Bewegung eines Permanentmagneten). Unter letzteren Bedingungen gilt das Magnetfeld erst dann als eingeschaltet, wenn die gesamte Magnetfeldstärke am Ort wirkt, d.h. wenn das Magnetfeld sich noch auf dem Weg zum Ort befindet, gilt es noch nicht als eingeschaltet. Unter dem Begriff "ausschalten" wird dagegen verstanden, dass kein wirksames Magnetfeld im Bereich des vorderen Endes (mehr) erzeugt wird bzw. ein zuvor erzeugtes Magnetfeld entfernt wird. Ein Magnetfeld ist dann "wirksam" im Sinne der vorliegenden Erfindung, wenn mit ihm die Partikel in der Mischung bewegt und insbesondere zum Mischstab hingezogen werden können. "Einschalten" und "Ausschalten" bezieht sich daher auf die wahlweise Erzeugung eines Magnetfeldes insbesondere im Bereich des vorderen Endes des Mischstabs. Generell kann das Magnetfeld nicht nur im Bereich des vorderen Endes des Mischstabs erzeugt werden, sondern sich auch über die Länge des Stabes hin ausdehnen. Es sollte jedoch vorzugsweise vermieden werden, dass der dem vorderen Ende des Mischstabs entgegengesetzte Pol des Magneten ebenfalls in die Mischung eintaucht. Es versteht sich von selbst, dass die Stärke des erforderlichen Magnetfeldes in Abhängigkeit von der Viskosität der Lösung sowie der Größe, Gewicht und dem magnetischen Material der Partikel gewählt werden muss.
  • Mit dem Mischstab, der bereits in der Lösung eingetaucht ist oder der erst in die Lösung gebracht wird, werden die sich am Boden des Mischgefäßes befindenden Partikel zunächst vom Boden in Richtung des vorderen Endes des Mischstabs gezogen. Dies erfolgt beispielsweise dadurch, dass der Mischstab vorzugsweise zusammen mit der Magnetfelderzeugungseinrichtung mit seinem vorderen Ende zum Boden des Mischgefäßes gebracht wird. Dabei ist es jedoch nicht nur nicht erforderlich, sondern auch aus Gründen der Konstruktion und der Prozesssicherung nicht gewünscht, dass das vordere Ende des Mischstabs den Boden berührt. Insbesondere wenn der Mischstab mit seinem vorderen Ende in der Nähe des Bodens und damit in der Nähe der dort befindlichen Partikel ist, wird im Bereich des vorderen Endes mit der Magnetfelderzeugungseinrichtung ein Magnetfeld erzeugt, mit dem die Partikel zum Mischstab hingezogen werden. Wahlweise kann der Mischstab auch zusammen mit der Magnetfelderzeugungseinrichtung, die bereits ein Magnetfeld erzeugt, auf den Boden des Mischgefäßes zu bewegt werden oder eine bereits ein Magnetfeld erzeugende Magnetfelderzeugungseinrichtung kann in Richtung des vorderen Endes des Mischstabs, der bereits in der Nähe des Bodens des Mischgefäßes positioniert ist, bewegt werden. Die Magnetfelderzeugungseinrichtung wird dann vorzugsweise zusammen mit dem Mischstab zumindest teilweise vom Boden weg aus der Mischung herausgezogen. Insbesondere die Stärke des erzeugten Magnetfeldes sowie die Beschleunigung und die Geschwindigkeit, mit der das Magnetfeld aus der Mischung herausbewegt wird, sollten dabei vorzugsweise so abgestimmt sein, dass die sedimentierten magnetischen Partikel sich vom Boden in die Mischung bewegen aber nicht unbedingt am Mischstab haften bleiben.
  • Vorzugsweise wird dies dadurch erzielt, dass das magnetische Feld sich immer in Bewegung befindet und Verweilzeiten insbesondere in der Nähe des Bodens minimiert werden. Bei Verwendung eines Permanentmagneten kann dies dadurch erreicht werden, dass der Magnet sich zunächst auf den Boden zu bewegt (sei es zusammen mit dem Mischstab oder zum vorderen Ende des sich dort bereits befindlichen Mischstabs hin). Wenn sich der Magnet in ausreichender Nähe zum Boden befindet, um die Partikel über das Magnetfeld anziehen zu können, erfolgt eine Bewegungsumkehr des Magneten und dieser wird nun zusammen mit dem Mischstab wieder vom Boden weg bewegt. Die Verweilzeit des Magneten in der Nähe des Bodens sollte dabei gerade so gewählt werden, dass die Partikel sich zwar auf diesen zu bewegen, sich jedoch zumindest möglichst nicht vollständig am Mischstab sammeln. Die Anhaftung eines Teils der Partikel am Mischstab kann normalerweise auch bei sorgfältiger Abstimmung der Bedingungen nicht vollständig vermieden werden, der Anteil sollte aber so klein wie möglich gehalten werden. Der minimale Abstand des Mischstabes zum Boden beträgt vorzugsweise 0,1 bis 2 mm, weiter bevorzugt 0,3 bis 1 mm und am meisten bevorzugt 0,5 bis 0,6 mm. Der minimale Abstand des Magneten zur inneren Spitze des Mischstabes vor der Bewegungsumkehr des Magneten beträgt vorzugsweise > 0 bis 10 mm, weiter bevorzugt 0,3 bis 8 mm und am meisten bevorzugt 0,5 bis 5 mm. Dabei umfassen die oben spezifizierten Abstandsbereiche vom untersten (distalen) Ende des Magneten zum untersten (distalen) inneren Ende des Mischstabes vorzugsweise sowohl den Fall, dass beide an ihrem unteren Ende parallel verlaufende Konturen aufweisen als auch, dass beide an ihrem unteren Ende unterschiedliche Konturen aufweisen.
  • Bei Verwendung von Elektromagneten können diese bereits in erheblicher Entfernung des Bodens eingeschaltet werden. Unter diesen Umständen läuft der erste Verfahrensschritt der Anhebung der Partikel vorzugsweise analog dem bei Verwendung des Permanentmagneten ab. Wird der Elektromagnet erst aktiviert wenn er sich in der Nähe des Bodens befindet, so sollte die Bewegung des Magnetfeldes zusammen mit dem Mischstab vom Boden weg direkt nach Erzeugung des Magnetfeldes und Beschleunigung der Partikel in Richtung des Mischstabes erfolgen.
  • Vorzugsweise sollte die Verweilzeit des eingeschalteten Magneten mit einer Feldstärke im Bereich von 0,5 bis 1,5 T an der Stelle, an der der Abstand des Mischstabs mit integriertem Magneten zum Boden minimal ist (vorzugsweise 0,1 bis 2 mm, weiter bevorzugt 0,3 bis 1 mm und am meisten bevorzugt 0,5 bis 0,6mm) 0,02 bis 5 s, weiter bevorzugt 0,04 bis 3 s, noch weiter bevorzugt 0,1 bis 0,5 s und am meisten bevorzugt 0,2 s betragen. Bei Verwendung eines Permanentmagneten sollte der Verfahrweg des Magneten zunächst eine Beschleunigung des unbewegten Magneten auf eine Verfahrgeschwindigkeit (vorzugsweise a1 * t1) in Richtung des Gefäßbodens aufweisen, wobei der Magnet entweder zusammen mit dem Mischstab oder auf den sich bereits in größerer Nähe zum Gefäßboden befindlichen Mischstab hin beschleunigt werden kann. Optional kann der Magnet dann weiter eine in Richtung des Gefäßbodens gerichtete konstante Verfahrgeschwindigkeit a1 * t1 aufweisen, wobei sich der Magnet dabei wiederum gleichzeitig mit dem Mischstab oder auf diesen zu bewegen kann. Anschließend wird der Magnet mit einer negativen Beschleunigung (vorzugsweise a2 * t2) auf eine Geschwindigkeit von 0 beschleunigt. Diese negative Beschleunigung kann auch direkt nach der positiven Beschleunigung folgen. Der Mischstab kann entsprechend dieselbe negative Beschleunigung erfahren oder bereits vorher auf eine Geschwindigkeit von 0 beschleunigt worden sein. Nach Durchlaufen dieses Verfahrwegs sollte sich der Magnet zusammen mit dem Mischstab vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit 0 an der Position befinden, an der der Abstand von Magnet und Mischstab zum Gefäßboden jeweils minimal ist. Diesem Verfahrweg liegt vorzugsweise folgende Funktion zu Grunde: s t = ½a 1 * t 1 2 + a 1 * t 1 * t 3 + ½a 2 * t 2 2 ,
    Figure imgb0001
     wobei a1 die Beschleunigung des Magneten bzw. des Mischstabes, t1 die Zeit, die benötigt wird, um die Verfahrgeschwindigkeit des Magneten bzw. des Mischstabes in Richtung des Gefäßbodens zu erreichen, t3 die Zeit, während der eine konstante Verfahrgeschwindigkeit in Richtung des Gefäßbodens vorliegt, t2 die Zeit, die benötigt wird, um die Verfahrgeschwindigkeit des Magneten bzw. des Mischstabes in Richtung des Gefäßbodens auf 0 zu reduzieren, und s die zurückgelegte Strecke darstellen und wobei vorzugsweise a1 = -a2 und t1=t2 ist. Der Verfahrweg des Mischstabs kann dabei parallel zu dem des Magneten oder aber verschieden zu diesem ablaufen. Die Funktion, die dem Verfahrweg des Mischstabs zu Grunde liegt, sollte dabei der des Magneten entsprechen, wobei die einzelnen Parameter für den Magneten und den Mischstab unterschiedliche Werte aufweisen können. Wenn die Verfahrwege für Magnet und Mischstab unterschiedlich verlaufen, sollte zumindest gewährleistet sein, dass, wenn der Magnet seine Position in minimalem Abstand zum Gefäßboden mit der Geschwindigkeit 0 erreicht hat, auch der Mischstab sich in minimaler Entfernung zum Gefäßboden befindet und die Geschwindigkeit 0 aufweist.
  • Darauf folgt die oben spezifizierte Verweilzeit des Magneten vorzugsweise in minimalem Abstand zum Boden, woraufhin der Magnet nun zusammen mit dem Mischstab bevorzugt ein dem obigen analogen Verfahrweg jedoch in Richtung der Gefäßöffnung durchläuft. Die Dauern t1 und t2 der Beschleunigungen liegen dabei vorzugsweise im Bereich von 0,02 bis 5 s, weiter bevorzugt von 0,04 bis 3 s und noch weiter bevorzugt von 0,1 bis 0,5 s.
  • Es ist jedoch ebenfalls denkbar, dass der oben beschriebene Verfahrweg sowohl für den Mischstab als auch für den Magneten unabhängig voneinander durch andere Funktionen dargestellt wird, als durch die oben beispielsweise angeführte, solange der Ablauf aus Abwärtsbewegung, Stoppen in minimalem Abstand zum Gefäßboden, Verweilzeit und Aufwärtsbewegung generell dem obigen entspricht.
  • Bei Verwendung eines Elektromagneten, der eingeschaltet wird, bevor er den minimalen Abstand zum Boden erreicht hat, sollte der Verfahrweg analog dem für den Permanentmagneten sein. Bei Verwendung eines Elektromagneten, der erst eingeschaltet wird, wenn er den minimalen Abstand zum Boden eingenommen hat, sollte der Verfahrweg dem oben dargestellten Verfahrweg des Permanentmagneten in Richtung der Gefäßöffnung entsprechen.
  • Sofern die Partikel ausreichend weit angehoben wurden, beispielsweise bis auf eine definierte Höhe, werden sie freigegeben, d.h. die Bewegungsrichtung der Partikel wird nicht mehr durch das Magnetfeld beeinflusst. Dies erfolgt vorzugsweise durch Abschalten des Magnetfeldes oder Entfernen der Magnetfelderzeugungseinrichtung aus dem Mischstab. Gleichzeitig mit der Freigabe der Partikel oder kurz danach wird der Mischstab in eine Mischbewegung gebracht, mit der er die Partikel möglichst homogen in der Lösung verteilt. Bei der Mischbewegung handelt es sich typischerweise um ein wiederholtes Auf- und Abbewegen des Mischstabs, d.h. um eine vertikale Bewegung des Mischstabs. Generell ist auch eine rotierende Bewegung oder eine Kombination aus vertikaler und rotierender Bewegung des Mischstabs denkbar. Die Anzahl der Mischvorgänge ist nicht festgelegt und wird vom Anwender üblicherweise danach bestimmt, welcher Grad an homogener Verteilung der Partikel in der Mischung gewünscht ist. Die Partikel sind daher vorzugsweise dann ausreichend suspendiert bzw. resuspendiert, wenn der Grad der Suspendierung oder Resuspendierung den Anforderungen des Anwenders bzw. der bestmöglichen Suspendierung oder Resuspendierung der Partikel im vorliegenden System entspricht. In den meisten Fällen werden die Partikel dann ausreichend suspendiert sein, wenn der Anteil der nach dem Anheben und Suspendieren wieder sedimentierten Partikel noch relativ klein ist.
  • Es hat sich bei Versuchen gezeigt, dass die sedimentierten Partikel mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wirksam vom Boden aufgehoben und in der Lösung suspendiert bzw. resuspendiert werden können. Es handelt sich dabei also vorzugsweise nicht um einen Separationsprozess im eigentlichen Sinne, bei dem die Partikel möglichst quantitativ am Magneten bzw. an einer diesen umgebenden Hülse festgehalten und aus dem Mischgefäß entfernt werden, sondern die Partikel sollen nur wieder in Suspension gebracht werden, insbesondere um eine möglichst optimale Bindung, Waschwirkung, Elution oder Ähnliches zu erzielen. Das Magnetfeld wird dabei vorzugsweise nur zum Anheben der sedimentierten Partikel genutzt, während das Verteilen der Partikel in der Lösung durch die Mischbewegung des Mischstabs mit ausgeschaltetem Magnetfeld erfolgt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren hat dadurch den Vorteil, dass das bloße Verteilen der bereits vom Boden angehobenen Partikel durch vergleichsweise sanfte Mischbewegungen erfolgen kann. Ein Aufwirbeln der sedimentierten Partikel ausschließlich mit starken Mischbewegungen, wie es ohne Einsatz eines Magnetfeldes erforderlich wäre, ist nicht notwendig. Beim erfindungsgemäßen Verfahren muss daher die Lösung nicht sehr stark bewegt werden, wodurch die Gefahr eine Kreuzkontamination von benachbarten Mischgefäßen bei automatisierter Parallelverarbeitung erheblich verringert wird.
  • Außerdem braucht der Mischstab zum Anheben der sedimentierten Partikel beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht vollständig zum Boden geführt werden, sondern lediglich in die Nähe des Bodens gebracht werden. Dadurch werden Stöße des Mischstabs auf den Boden des Mischgefäßes vermieden. Bei Aufwirbelung der sedimentierten Partikel ausschließlich durch eine Mischbewegung des Mischstabs und ohne Einsatz eines Magnetfeldes muss der Mischstab direkt bis zum Boden gebracht werden, da ansonsten die Gefahr besteht, dass ein Großteil der Partikel nicht aufgewirbelt wird. Insbesondere bei Gefäßen, die keinen flachen Boden aufweisen, kann ein rein mechanisches Mischen dazu führen, dass die Partikel nicht suspendiert bzw. resuspendiert, sondern vielmehr an den Boden gedrückt werden. Zudem erfordert ein derartiges rein mechanisches Resuspendierungsverfahren einen hohen konstruktiven Aufwand, um Zusammenstöße von Boden und Mischgefäß und damit verbundene Beschädigungen des Bodens und ein Austreten der Mischung auszuschließen bzw. zu minimieren.
  • Die oben genannte Aufgabe kann gemäß einer weiteren Ausführungsform durch ein Verfahren zum Suspendieren bzw. Resuspendieren von magnetisch anziehbaren Partikeln gelöst werden. Das Verfahren umfasst dabei:
    • Bereitstellen zumindest eines Mischgefäßes, das zumindest teilweise mit einer Lösung gefüllt ist, in welcher magnetisch anziehbare Partikel am Boden des Mischgefäßes sedimentiert sind;
    • Bereitstellen zumindest eines Mischstabs mit einem dem Boden des Mischgefäßes zugewandten vorderen Ende, wobei der Mischstab eine Magnetfelderzeugungseinrichtung zum wahlweisen Erzeugen eines Magnetfelds im Bereich des vorderen Endes aufweist;
    • wobei durch das am vorderen Ende des in die Lösung eingetauchten Mischstabs erzeugte Magnetfeld zumindest ein Teil der magnetisch anziehbaren Partikel vom Boden des Mischgefäßes hochgehoben und nachfolgend durch wiederholte Mischbewegungen des Mischstabs ohne am vorderen Ende des Mischstabs erzeugtes Magnetfeld in der Lösung suspendiert bzw. resuspendiert werden.
  • Diese Ausführungsform kann mit einzelnen Aspekten und Merkmalen der zuvor und nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen geeignet kombiniert werden, insbesondere hinsichtlich des Aufbaus des Mischstabs, der Art der Magnetfelderzeugung sowie des zeitlichen Ablaufs der Mischbewegung und der Magnetfelderzeugung.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Vorrichtung zum Suspendieren oder Resuspendieren von magnetisch anziehbaren Partikeln bereitgestellt, Die Vorrichtung weist auf:
    • zumindest einen Mischstab mit einem vorderen Ende, wobei der Mischstab eine Magnetfelderzeugungseinrichtung zum wahlweisen Erzeugen eines Magnetfelds im Bereich des vorderen Endes aufweist;
    • wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einer der hierin beschriebenen Ausführungsformen eingerichtet ist.
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand von in den anhängenden Figuren gezeigten Ausführungsformen beschrieben, aus denen sich weitere Vorteile und Modifikationen ergeben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die konkret beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern kann in geeigneter Weise modifiziert und abgewandelt werden. Es liegt im Rahmen der Erfindung, einzelne Merkmale und Merkmalskombinationen einer Ausführungsform mit Merkmalen und Merkmalskombinationen einer anderen Ausführungsform geeignet zu kombinieren, um zu weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen zu gelangen.
  • Figuren 1A und 1B zeigen eine erste und eine zweite Ausführungsform eines Mischstabs.
  • Figur 2 zeigt eine dritte Ausführungsform eines Mischstabs.
  • Figuren 3A bis 3E zeigen einzelne Sequenzen des Ablaufs einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Figuren 4A bis 4E zeigen einzelne Sequenzen des Ablaufs einer weiteren Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens
  • Figur 5 zeigt ein Hubdiagramm eines Mischstabs mit beweglichem Permanentmagneten gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Die in den Figuren gezeigten Ausführungsformen sind nicht maßstabsgetreu, sondern dienen lediglich der Veranschaulichung der entsprechenden Ausführungsformen. Dabei können einzelne Merkmale vergrößert bzw. verkleinert dargestellt sein. Gleiche Elemente sind in den Figuren mit gleichen Bezugszeichen versehen.
  • Figur 1A zeigt eine erste Ausführungsform eines Mischstabs 101. Der Mischstab kann beispielsweise eine langgestreckte zylindrische Form aufweisen. Der Mischstab 101 weist eine beispielsweise zylinderförmige oder rotationssymmetrische äußere Hülse 102 aus einem typischerweise nicht-magnetischen Material auf. Das Material der Hülse 102 sollte vorzugsweise so gewählt werden, dass es Magnetfelder nicht oder nur unwesentlich abschwächt. Beispielsweise kann die Hülse 102 aus einem inerten Kunststoff bestehen, der beispielsweise weitgehend formstabil ist. Zum Erreichen der Formstabilität kann die Materialdicke der Hülse 102 entsprechend gewählt werden. Es ist ebenso möglich, die Hülse durch weitere Strukturen, beispielsweise auf der Innenseite der Hülse 102, zu verstärken, wobei die Strukturen dann aus einem anderen Material als die Hülse 102 bestehen können. Verbundmaterialien sind ebenfalls möglich. Weiterhin kann die Hülse 102 auf ihrer Außenseite strukturiert sein. An ihrem vorderen Ende 103 ist die Hülse 102 typischerweise verschlossen. Dieses Ende bildet gleichzeitig das vordere Ende 103 des Mischstabs 101.
  • Im Mischstab 101 gemäß der ersten Ausführungsform ist innerhalb der Hülse 102 ein Permanentmagnet 104 bewegbar, insbesondere in Längsrichtung der Hülse 102, angeordnet. Der Permanentmagnet 104 kann in der Hülse 102 durch einen Stab 105 in Längsrichtung bewegt werden, d.h. insbesondere aus dem Bereich des vorderen Endes 103 heraus und wieder in den Bereich des vorderen Endes 103 hinein gebracht werden. Dies erfolgt beispielsweise mittels einer entsprechenden Betätigungseinrichtung, die hier nicht dargestellt ist. Der Mischstab 101 ist ebenfalls beispielsweise in Längsrichtung bewegbar. Dabei können Mischstab 101 und Permanentmagnet 104 unabhängig voneinander bewegt werden. Der bewegbare Permanentmagnet 104 bildet in dieser Ausführungsform die Magnetfelderzeugungseinrichtung.
  • Der Mischstab 101 kann, wie in Figur 1A gezeigt, in ein Mischgefäß 110 eingeführt werden. Das Mischgefäß 110 kann beispielsweise aus einem formstabilen weichen Material bestehen, das teilweise flexibel sein kann. Beispielsweise kann ein Kunststoff für das Mischgefäß verwendet werden. Dabei kann das Material des oder der Mischgefäße 110 weicher als das Material der Hülse 102 sein. Typischerweise können mehrere Mischgefäße 110 nebeneinander zu einer hier nicht dargestellten Platte zusammengefasst sein.
  • Figur 1A zeigt ein Mischgefäß 110 mit einem spitz zulaufenden, beispielsweise etwa konusförmigen Boden 111. Das vordere Ende 103 des Mischstabs 101 kann der Form des Mischgefäßes 110 angepasst sein und kann ebenfalls spitz, beispielsweise etwa konusförmig zulaufen. Andere Formen für den Boden 111 des Mischgefäßes und das vordere Ende 103 des Mischstabes sind ebenfalls möglich, beispielsweise etwa konkav-förmig, kegelig, flach oder rund. Generell sind auch Freiformflächen als Formen für den Boden 111 des Mischgefäßes und das vordere Ende 103 des Mischstabes denkbar, obwohl diese aus Gründen der Konstruktion, der Herstellung und des Verfahrensablaufs weniger bevorzugt sind. Günstig ist, wenn der Permanentmagnet 104 eine vertikale Ausdehnung hat, die so bemessen ist, dass sein oberes Ende (sein Nordpol N im gezeigten Ausführungsbeispiel) selbst bei voll eingetauchtem Mischstab 103 stets oberhalb des Flüssigkeitsspiegels liegt.
  • Der Permanentmagnet 104 erzeugt gemäß der in Figur 1A gezeigten Ausführungsform ein Magnetfeld, das im Wesentlichen in Längsrichtung des Mischstabs 110 verläuft. Dies ist in Figur 1A durch die Anordnung der Pole (Nord und Süd) angedeutet. Es ist ebenfalls möglich, dass das Magnetfeld eine andere Ausrichtung, beispielsweise eine in Bezug auf die Längserstreckung des Mischstabes 101 laterale Ausrichtung aufweist. Der Permanentmagnet 104 ist in Figur 1A in Längsrichtung des Mischstabs 101 vergleichsweise kurz dargestellt. Es ist auch möglich, dass der Permanentmagnet 104 eine andere Ausdehnung in Längsrichtung aufweist, beispielsweise deutlich länger. Ebenso kann der Permanentmagnet 104 durch zwei oder mehrere Permanentmagneten gebildet werden.
  • Die räumlich Lage des durch den Permanentmagneten 104 erzeugten Magnetfelds in Bezug auf das vordere Ende 103 des Mischstabs 101 kann durch Verschieben des Permanentmagneten 104 verändert werden. Wird der Permanentmagnet 104 bis zum vorderen Ende 103 des Mischstabs 101 geschoben, wirkt dort das durch den Permanentmagneten 104 erzeugte Magnetfeld. Ein "wirksames" Magnetfeld ist daher im vorderen Bereich des Mischstabs 101 "eingeschaltet". Wird dagegen der Permanentmagnet 104 ausreichend weit vom vorderen Ende 103 des Mischstabs 101 entfernt, ist die Wirkung des vom Permanentmagneten 104 erzeugten Magnetfelds am vorderen Ende 103 soweit abgeschwächt, dass dort kein zum Anheben von magnetisch anziehbaren Partikeln wirksames Magnetfeld mehr vorhanden ist. Das Magnetfeld ist daher am vorderen Ende 103 des Mischstabs 101 "ausgeschaltet".
  • Eine andere Ausführungsform zum Ein- und Ausschalten des Magnetfelds zeigt Figur 1B. Diese umfasst einen im Vergleich zum Permanentmagneten 104 aus Figur 1A in Längsrichtung vergleichsweise langen Permanentmagneten 106, der von einer Abschirmhülse 107 aus beispielsweise ferromagnetischem Material umgeben ist. Sowohl der Permanentmagnet 106 als auch die Abschirmhülse 107 können in Längsrichtung des Mischstabs 101 bewegbar angeordnet sein und durch entsprechende, hier nicht gezeigte Betätigungseinrichtungen unabhängig voneinander bewegt werden. Zum "Einschalten" des Magnetfeldes kann beispielsweise die Abschirmhülse 107 vom vorderen Ende 103 zurückgezogen werden, um den hier gezeigten Südpol des Permanentmagneten 106 freizulegen. Dadurch können die Feldlinien durch die Hülse 102 dringen und außerhalb des Mischstabs 101 verlaufen. Zum "Ausschalten" des Magnetfeldes wird die Abschirmhülse 107 wieder über den Permanentmagneten 106 geschoben und schirmt dadurch das vom Permanentmagneten erzeugte Magnetfeld nach außen ab. Alternativ kann auch der Permanentmagnet 106 vom vorderen Ende 103 zurückgezogen werden. Der Permanentmagnet 106 bildet zusammen mit der Abschirmhülse 107 in dieser Ausführungsform die Magnetfelderzeugungseinrichtung.
  • Die in den Figuren 1A und 1B gezeigten Ausführungsformen bewirken ein Ein- und Ausschalten des Magnetfeldes durch Verschieben von Permanentmagneten bzw. Abschirmhülsen. Im Gegensatz dazu zeigt Figur 2 eine Ausführungsform, bei der das Magnetfeld durch einen Elektromagneten 120 erzeugt wird. Der Elektromagnet 120 weist einen Kern 121 mit einem beispielsweise dicken, vorderen Ende 122 auf. Der Kern 121 ist von einer Spule 123 umgeben, durch welche ein Strom zum Erzeugen eines Magnetfelds fließen kann. Das Ein- und Ausschalten des Magnetfelds erfolgt hier durch entsprechendes Ein- und Ausschalten des Stroms. Auf mechanische Betätigungsmittel zum Bewegen eines Permanentmagnets bzw. einer Abschirmhülse kann bei der hier gezeigten Ausführungsform verzichtet werden. Die Magnetfelderzeugungseinrichtung wird bei dieser Ausführungsform vom Elektromagneten 120 gebildet. Generell ist jede Art einer Magnetfelderzeugungseinrichtung zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren denkbar, solange diese das Ein- und Ausschalten eines Magnetfeldes ermöglicht.
  • Mit Bezug auf die Figuren 3A bis 3E soll nachfolgend eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben werden. Dabei wird ein in Figur 1A gezeigter Mischstab, jedoch mit langem Permanentmagneten, verwendet. Es ist jedoch auch möglich, die anderen in Figuren 1B und 2 gezeigten Mischstäbe oder auch anders aufgebaute Mischstäbe zu verwenden. Dabei ist lediglich darauf zu achten, dass der Mischstab ein wahlweises Erzeugen eines Magnetfelds mindestens an seinem vorderen Ende gestattet.
  • Zunächst wir ein Mischgefäß 10 bereitgestellt. Das Mischgefäß 10 kann eine überwiegend flüssige Mischung 30 mit darin befindlichen magnetisch anziehbaren Partikeln 40 enthalten. Im Weiteren wird lediglich von Partikeln gesprochen. Beispielsweise kann es sich bei den Partikeln 40 um aus der Mischung sedimentierte Partikel 40 handeln. Die Partikel 40 haben sich am Boden 11 des Mischgefäßes 10 angesammelt. Alternativ ist es möglich, dass das Mischgefäß 10 ohne Mischung 30, sondern nur mit den sich am Boden 11 befindenden Partikeln 40 entweder als Pulver oder in Suspension bereitgestellt wird, und nachfolgend dann die Mischung 30 in das Mischgefäß 10 überführt wird.
  • Bei den Partikeln 40 kann es sich um Partikel oder Beads handeln, die von einem magnetischen Feld angezogen werden, d.h. die beispielsweise ein ferro-, ferri-, para- oder superparamagnetisches Material aufweisen und zumindest teilweise eine Oberfläche besitzen, die in der Lage ist, beispielsweise Verunreinigungen oder biologische Zielmoleküle wie Nukleinsäuren oder Proteine zu binden. Die bindungsfähige Oberfläche kann dabei durch das magnetische Material selber oder zumindest teilweise häufig auch vollständig durch ein nichtmagnetisches Material beispielsweise ein Polymer oder ein SiO2-haltige Material, die auch funktionalisiert sein können, gebildet werden. Die Partikel weisen einen typischen Partikeldurchmesser von etwa 500 nm bis 25 µm, vorzugsweise von etwa 1 bis 20 µm und besonders bevorzugt von etwa 4 bis 16 µm auf. Es versteht sich von selbst, dass die Partikel eine gewisse Größenverteilung aufweisen. In einigen Fällen sind die Oberflächen der Partikel 40 funktionalisiert, wobei die Funktionalisierung von der konkreten analytischen bzw. diagnostischen Anwendung abhängt und für das erfindungsgemäße Verfahren unerheblich ist. Derartige magnetische Partikel sind bereits in verschiedenen Ausgestaltungen und für verschiedene Anwendungsbereiche aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Bei der Mischung 30 kann es sich um jedwede homogene oder heterogene Mischung handeln, die bei den beschriebenen Anwendungen vorliegen kann und eine ausreichende geringe Viskosität aufweist, um das erfindungsgemäße Verfahren durchführen zu können. Insbesondere handelt es sich um Mischungen, die einen erheblichen Anteil flüssiger Bestandteile aufweisen. Beispielsweise handelt es sich um eine Lyse-, Binde-, Wasch- oder Elutionslösung oder um eine Mischung, die zu untersuchende bzw. abzutrennende spezifische, meist biologische, Substanzen oder Verunreinigungen enthält. Wenn es sich bei der Mischung um eine biologische Probe handelt, kann diese unbehandelt oder vorbehandelt beispielsweise als Lysat vorliegen und auch feste Bestandteile wie Zellreste aufweisen. Die Art der Mischung ist für die Durchführung des Verfahrens unerheblich.
  • In die Mischung 30 wird ein Mischstab 1 mit seinem vorderen Ende 3 voran, welches zum Boden 11 des Mischgefäßes 10 weist, eingetaucht. Dies erfolgt beispielsweise durch Absenken des Mischstabs 1 entlang dessen Längserstreckung. Die Abwärtsbewegung des Mischstabs 1 ist in Figur 3A mit einem Pfeil angedeutet. Das vordere Ende 3 des Mischstabs 1 kann jedoch auch bereits in die Mischung 30 eingetaucht sein und wird dann lediglich abgesenkt.
  • Gleichzeitig mit dem Absenken des Mischstabs 1 kann der Permanentmagnet 4 durch Betätigung des Stabs 5 zum vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 geschoben werden, damit dort ein ausreichend starkes Magnetfeld aufgebaut wird. Der Permanentmagnet 3 kann sich jedoch auch bereits am vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 befinden, wenn dieser abgesenkt wird. Unabhängig von der Art und Weise, wie der Permanentmagnet 3 zum vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 geführt wird, befindet sich dieser zumindest zeitweilig dann am vorderen Ende 3, wenn sich der Mischstab 1 nahe am Boden 11 des Mischgefäßes 10 befindet. Diese Situation ist in Figur 3B dargestellt. Wie dort angedeutet, berührt das vordere Ende 3 des Mischstabs 1 vorzugsweise nicht den Boden 11 des Mischgefäßes, sondern ist von diesem etwas, typischerweise definiert, beabstandet. Dadurch kann einerseits sichergestellt werden, dass ein gewisser Spielraum bei der relativen vertikalen Anordnung des Mischgefäßes 10 zum Mischstab 1 besteht. Andererseits können bei paralleler Bearbeitung von mehreren Mischgefäßen 10, die beispielsweise zu Multiwellplatten zusammengesetzt sind, Fertigungstoleranzen der einzelnen Mischgefäße, insbesondere bei Kunststoffplatten mit integral geformten Mischgefäßen, ausgeglichen werden. Schließlich kann vermieden werden, dass der Mischstab auf den Boden stößt und so das Mischgefäß 10 beschädigt und unter Umständen zu einem Austreten der Mischung führt. Beispielsweise kann der Mischstab bis auf etwa 0,5 bis 2 mm an den Boden 11 des Mischgefäßes herangeführt werden. Dieser Abstand hat sich bei den meisten Anwendungen als hinreichend herausgestellt, um Zusammenstöße des Mischstabs mit dem Boden des Mischgefäßes zu vermeiden. Vorzugsweise beträgt der Abstand zum Boden vorzugsweise 0,1 bis 2 mm, weiter bevorzugt 0,3 bis 1 mm und am meisten bevorzugt 0,5 bis 0,6 mm.
  • Wie Figur 3B zu entnehmen ist, werden die Partikel 40 vom durch den Permanentmagneten 4 im Bereich des vorderen Endes 3 des Mischstabs 1 erzeugten Magnetfeld angezogen und bewegen sich dabei vom Boden weg in die Mischung hinein, haften aber nur in geringfügigem Maße an der äußeren Oberfläche des Mischstabs 1, bzw. der Hülse 2. Dadurch werden die Partikel 40 vom Boden 11 aufgehoben und können durch den Mischstab 1 vom Boden weggezogen werden. Dazu wird der Mischstab 1 zusammen mit dem sich am vorderen Ende 3 befindenden Permanentmagneten 4 nach oben gezogen, wie in Figur 3C durch einen Pfeil angedeutet. Diese Aufwärtsbewegung kann vergleichsweise langsam erfolgen, damit sich die anhaftenden Partikel 40 nicht vom Mischstab 1 lösen. Die Bewegung sollte aber nicht zu langsam sein, da ansonsten der Anteil der am Mischstab haftenden Partikel zu groß werden kann.
  • Sofern der Mischstab weit genug nach oben gezogen ist, wobei das vordere Ende 3 des Mischstabs mit den daran anhaftenden Partikeln 40 in der Mischung 3 eingetaucht bleiben soll, wird der Permanentmagnet 4 durch den Stab 5 relativ zur Hülse 2 ebenfalls nach oben gezogen, d.h. vom vorderen Ende 3 des Mischstabs entfernt. Der Permanentmagnet 4 kann dabei vergleichsweise schnell nach oben gezogen werden, beispielsweise ruckartig. Mit ruckartig ist dabei vorzugsweise gemeint, dass der Magnet eine Geschwindigkeit aufweist, bei der er in einer Zeit von 0,05 bis 1 s, weiter bevorzugt 0,2 bis 0,4 s und am meisten bevorzugt 0,25 bis 0,3 s einen Weg von 100 mm zurücklegt. Da die vorigen Angaben lediglich der Beschreibung der Geschwindigkeit dienen, kann der Weg daher auch n*100mm betragen, wobei n>0 und wobei die dazugehörigen Verfahrzeiten in diesem Falle ebenfalls mit n zu multiplizieren sind. Ziel dieser Maßnahme ist es, die Wirkung des Magnetfeldes am vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 ausreichend schnell zu vermindern oder auszuschalten, so dass die Partikel nicht mehr vom Mischstab 1 angezogen werden. Dadurch, dass der Permanentmagnet 4 vom vorderen Ende 3 entfernt wird, wird das Magnetfeld dort abgeschwächt und ist nicht mehr ausreichend stark, um die Partikeln 40 anzuziehen. Die Partikel 40 werden dadurch freigegeben, d.h. die Bewegungsrichtung der Partikel wird nicht mehr durch das Magnetfeld bestimmt.
  • Um zu vermeiden, dass beim Hochziehen des Permanentmagneten 4 die Partikel 40, die sich noch in Suspension befunden haben oder zu dem Teil der Partikel gehören, die doch am Mischstab haften, entlang der äußeren Oberfläche des Mischstabs 1 mit nach oben wandern, sollte der Permanentmagnet 4 ausreichend schnell vom vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 zurückgezogen werden, so dass die Partikel 40 aufgrund von Reibung und der Viskosität der Mischung 30 nicht der Bewegung folgen können. Das vorzugsweise konusförmig ausgebildete vordere Ende des Mischstabes 3 wirkt einem "Mitwandern" der Partikel 40 ebenfalls entgegen. Das vergleichsweise rasche Hochziehen des Permanentmagneten 4 ist in Figur 3D durch einen langen Pfeil angedeutet. Typischerweise wird der Permanentmagnet 4 bis auf eine Position oberhalb der Mischung 30 gebracht, so dass in der Mischung 30 kein wirksames Magnetfeld mehr ausgebildet wird.
  • Bei analytischen und diagnostischen Untersuchungen werden typischerweise vergleichsweise geringe Flüssigkeits- bzw. Lösungsmengen, beispielsweise wenige Milliliter, verwendet. Beispielsweise kann das Mischgefäß 10, gerechnet vom Boden 11, bis in eine Höhe von beispielsweise etwa 15 mm aufgefüllt sein. Die Partikel 40 können dann bis in eine Höhe von beispielsweise etwa 10 mm gebracht und dort freigegeben werden.
  • Das Hochziehen des Mischstabs 1 und des Permanentmagneten 4 muss nicht genau in der vorstehend beschriebenen Weise erfolgen. Es ist auch möglich, den Permanentmagneten 4 bereits beim Hochziehen des Mischstabs 1 zumindest teilweise und zeitlich leicht versetzt zurückzuziehen. Unabhängig von der konkret gewählten Weise ist es das Ziel, die Partikel 40 vom Boden 11 aufzunehmen und weiter nach "oben", d.h. vom Boden des Mischgefäßes entfernt, zu bringen, damit sie dann besser in der Mischung 30 suspendiert werden können. Es sollen dabei weitgehend alle am Boden 11 sedimentierten Partikel 40 vom Mischstab 1 aufgenommen werden.
  • Die Partikel 40 sollen dabei vorzugsweise nicht oder nur in geringen Mengen am Mischstab 1 haften. Für eine möglichst optimale Suspension der Partikel genügt es , wenn sie durch die Wirkung des Magnetfelds vom Boden 11 ausreichend weit angehoben werden. Es genügt dabei weiterhin, wenn die Partikel 40 soweit hochgehoben werden, dass sie danach leicht durch die nachfolgend einsetzende Mischbewegung des Mischstabs 1 in der Mischung verteilt werden können.
  • Die Mischbewegung des Mischstabs 1, die sich an das "Ausschalten" des Magnetfelds am vorderen Ende 3 des Mischstabs anschließt, ist in Figur 3E gezeigt. In dieser Ausführungsform des Verfahrens bewegt sich der Mischstab 1 wiederholt hoch und runter und verteilt dabei die hochgenommenen Partikel 40 in der Mischung 30. Der Hub der Mischbewegung sowie die Frequenz werden so angepasst, dass zum einen ein ausreichendes Durchmischen gewährleistet ist und zum anderen ein "Überschwappen" der Mischung aus einem Mischgefäß in ein benachbartes Mischgefäß sicher vermieden wird. Beispielsweise kann die Mischbewegung mit einer Frequenz von etwa 1 Hz bis etwa 20 Hz erfolgen. Die Mischbewegung des Mischstabs 1 ist insbesondere dann wirkungsvoll, wenn der Mischstab einen nicht unerheblichen Teil des Lösungsvolumens verdrängt, da dadurch der Flüssigkeitspegel wandert. Die Änderung des Flüssigkeitspegels ist beispielsweise aus dem Vergleich der Figuren 3A und 3B deutlich erkennbar. Die Mischbewegung kann insbesondere auch sanfter im Vergleich zu solchen Mischvorrichtungen erfolgen, bei denen kein magnetfeldunterstütztes Aufnehmen der Partikel 40 erfolgt und die heftigere Mischbewegungen benötigen, um die sedimentierten Partikel aufzuwirbeln. Die Hubhöhe des Mischstabs 1 beim Mischvorgang kann beispielsweise 30 bis 100% der Flüssigkeitssäule betragen.
  • Andere Mischbewegungen, beispielsweise eine Rotation des Mischstabs 1, sind ebenfalls möglich. Allerdings erfordern Rotationsbewegungen insbesondere bei Parallelverarbeitung von mehreren Mischgefäßen mit jeweils zugeordnetem Mischstab einen höheren mechanischen Aufwand als Hubbewegungen. Daher sind bei entsprechenden Vorrichtungen bzw. Robotern mit einer Vielzahl von beispielsweise arrayförmig angeordneten Mischstäben diese bevorzugt lediglich längs ihrer Längserstreckung bewegbar, zumal eine solche Bewegung bereits für das Einführen der Mischstäbe erforderlich ist und somit keine zusätzliche Mechanik benötigt wird.
  • Im Ergebnis werden die Partikel 40 durch das erfindungsgemäße Verfahren, wie in Figur 3E angedeutet, weitgehend gleichmäßig im gesamten Volumen der Mischung 30 bis einschließlich oberhalb des oberhalb des vorderen Endes 3 suspendiert bzw. resuspendiert. Dadurch können die Ressourcen besser ausgenutzt werden.
  • Sofern es trotz der Mischbewegung zu einer erneuten Teilsedimentation der Partikel 40 kommt, können die sedimentierten Partikel 40 durch den Permanentmagneten 4 erneut aufgenommen werden. Eine Teilsedimentation ist in Figur 4A angedeutet. Unabhängig davon, ob eine eventuelle Teilsedimentation auftritt, können durch erneutes Einschalten des Magnetfeldes nach einer gewissen Zeit oder in regelmäßigen Abständen die Partikel 40 erneut ausreichend weit angehoben werden, wodurch ein sicheres Suspendieren bzw. Resuspendieren der Partikel 40 gewährleistet wird.
  • Zum eventuellen Aufnehmen der Partikel 40 wird der Permanentmagnet 4, beispielsweise während einer Abwärtsbewegung des Mischstabs 1, zum vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 hin bewegt, um so dort ein ausreichend starkes Magnetfeld aufzubauen. Die Bewegung des Permanentmagneten 4, angetrieben durch den Stab 5 und eine hier nicht dargestellte Betätigungsvorrichtung, ist in Figur 4B durch einen langen Pfeil gekennzeichnet. Dessen Länge soll in dem dort gezeigten Ausführungsbeispiel die Geschwindigkeit und den Hub der Abwärtsbewegung darstellen, die für den Fall, dass sich der Mischstab 1 nicht gleichzeitig mit dem Permanentmagneten 4 bewegt, sondern sich der Permanentmagnet 4 auf den Mischstab 1 zu bewegt, höher als die Geschwindigkeit bzw. größer als der Hub der Abwärtsbewegung des Mischstabs 1 sind, so dass vorzugsweise Permanentmagnet 4 und Mischstab 1 gleichzeitig am Gefäßboden ankommen.
  • Figur 4C zeigt, dass die Partikel 40 erneut vom vorderen Ende 3 des Mischstabs 1 vom Boden weg in die Mischung gezogen werden. Durch ein in Figur 4D angedeutetes Hochziehen des Mischstabs 1 mit anschließendem raschen Hochfahren des Permanentmagneten 4 werden die vom vorderen Ende 3 hochbewegten Partikel 40 erneut bis in eine definierte Höhe gebracht und dort freigegeben. Es schließt sich dann eine erneute Mischbewegung des Mischstabs 1 ein. Dies ist in Figur 4E angedeutet.
  • Das erneute Aufsammeln bzw. Suspendieren der Partikel 40 durch den Mischstab kann beispielsweise während einer Ab- und Aufwärtsbewegung der Mischbewegung erfolgen. Es ist auch möglich, dass zum Aufsammeln die Mischbewegung unterbrochen oder verlangsamt wird, um das Suspendieren durch die Mischbewegung nicht zu behindern.
  • Zur Verdeutlichung dieser Situation wird auf Figur 5 verwiesen, die ein Hubdiagramm für die Hubbewegung des Mischstabs 1 und des Permanentmagneten 4 darstellt. Dabei zeigt Kurve 50 die Hubbewegung des Mischstabs bzw. der Hülse 2 und Kurve 51 die Hubbewegung des Permanentmagneten 4 in Abhängigkeit von der Zeit t. Die Hubhöhen h sind relativ zu einem separaten Bezugspunkt, beispielsweise dem Boden 11 des Mischgefäßes 10, dargestellt.
  • In einer ersten Phase 61 werden die Hülse 2 und der Permanentmagnet 3 gemeinsam nach unten und dann wieder gemeinsam bis auf eine vordefinierte Höhe nach oben bewegt, wobei sich der Permanentmagnet 4 im Bereich des vorderen Endes 3 des Mischstabs befindet. Diese Hubbewegung kann vergleichsweise langsam erfolgen und dient der Anhebung der sedimentierten Partikel 40, welche bis zur vordefinierten Höhe gebracht werden. Dann erfolgt in einer zweiten Phase 62 ein rasches Wegbewegen des Permanentmagneten 4 vom vorderen Ende 3 der Hülse 2 bzw. des Mischstabs 1, während die Hülse 2 ebenfalls noch ein wenig hochgezogen werden kann. Durch das rasche Hochziehen des Permanentmagneten 4 vom vorderen Ende 3 werden die Partikel freigegeben. Es schließt sich eine dritte Phase 63 an, in welcher im Wesentlichen nur die Hülse 2 zum Erzeugen einer Mischbewegung bewegt wird. Es ist auch möglich, den Permanentmagneten 4 mitzubewegen, wobei dieser dabei einen ausreichenden Abstand zur Flüssigkeitsoberfläche der Mischung 30 haben sollte. Die Mischbewegung ist in Figur 5 durch periodische oder oszillierende Hubbewegungen dargestellt.
  • Optional kann sich ein erneutes Anheben und Suspendieren der Partikel 40 anschließen. Dies ist durch die Phase 64 angedeutet, in denen eine im Vergleich zu den Mischbewegungen langsamere Hubbewegung erfolgt und der Permanentmagnet 4 unsymmetrisch zur Hubbewegung der Hülse 2 bzw. des Mischstabs 1 bewegt werden kann. Dabei wird der Permanentmagnet 4 beispielsweise sehr rasch zum vorderen Ende 3 hin bewegt, wenn sich das vordere Ende 3 des Mischstabs 1 in der Nähe des Bodens 11 des Mischgefäßes 10 befindet. Dadurch soll verhindert werden, dass noch suspendierte Partikel erneut nach unten gezogen werden. Dann erfolgt die Aufwärtsbewegung der Hülse 2 zusammen mit dem Permanentmagneten 4, der erst in einer definierten Höhe wieder vom vorderen Ende 3 des Mischstabs rasch zurückgezogen wird. Daran schließt sich in Phase 65 ein erneutes Mischen ohne Magnetfeld an.
  • Die in Figur 5 gezeigten Phasen können auch ineinander übergehen. Beispielsweise ist es möglich, das magnetfeldunterstützte Aufnehmen der Partikel während der Mischbewegung durchzuführen.
  • Die Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern umfasst geeignete Modifikation innerhalb des durch die Ansprüche aufgezeigten Rahmens. Die anhängenden Ansprüche sind als erster, nicht bindender Versuch zu verstehen, die Erfindung mit allgemeinen Worten zu beschreiben.
    • Bezugszeichenliste
    • 1, 101
    Mischstab
    2, 102
    Hülse
    3, 103
    vorderes Ende des Mischstabs
    4, 104
    Permanentmagnet
    5, 105
    Stab
    106
    Permanentmagnet
    107
    Abschirmhülse
    10, 110
    Mischgefäß
    11, 111
    Boden des Mischgefäßes
    30
    Mischung
    40
    Partikel
    50
    Hubkurve des Mischstabs
    51
    Hubkurve des Permanentmagneten
    61
    erste Phase
    62
    zweite Phase
    63
    dritte Phase
    64
    vierte Phase
    65
    fünfte Phase
    120
    Elektromagnet
    121
    Kern
    122
    Ende des Elektromagnets
    123
    Spule

Claims (10)

  1. Verfahren zum Suspendieren oder Resuspendieren von magnetisch anziehbaren Partikeln, mit den Schritten:
    - Bereitstellen zumindest eines Mischgefäßes (10), das zumindest teilweise mit einer Mischung (30) gefüllt ist, in welcher sich magnetisch anziehbare Partikel (40) befinden, die zumindest teilweise am Boden (11) des Mischgefäßes (10) sedimentiert sind;
    - Bereitstellen zumindest eines Mischstabs (1) mit einem dem Boden (11) des Mischgefäßes (10) zugewandten vorderen Ende (3), wobei der Mischstab (1) eine Magnetfelderzeugungseinrichtung (4) zum wahlweisen Erzeugen eines Magnetfelds zumindest im Bereich des vorderen Endes (3) aufweist;
    - Einschalten eines wirksamen Magnetfeldes, das zumindest im Bereich des vorderen Endes (3) des Mischstabs (1) wirkt, mit Hilfe der Magnetfelderzeugungseinrichtung (4) während der Mischstab (1) in der Mischung (30) eingetaucht ist;
    - Bewegung des Magnetfeldes zusammen mit dem Mischstab vom Boden (11) des Mischgefäßes (10) weg, wobei die Bewegung des Magnetfeldes zusammen mit dem Mischstab so erfolgt, dass zumindest ein Teil der magnetisch anziehbaren Partikel (40) vom Boden (11) des Mischgefäßes (10) hochgehoben werden und der Anteil der Partikel, die am Mischstab haften, minimiert wird;
    - Ausschalten des Magnetfeldes in einer zuvor definierten Entfernung vom Boden, die größer ist als die Entfernung vom Boden bei Einschalten des Magnetfeldes;
    - Durchführung wiederholter Mischbewegungen des Mischstabs (1) ohne dass am vorderen Ende (3) des Mischstabs (1) ein eingeschaltetes Magnetfeld vorliegt, um die in der Mischung (30) vorliegenden magnetisch anziehbaren Partikel zu suspendieren bzw. resuspendieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach mehrmaligen Mischbewegungen das Magnetfeld am vorderen Ende (3) des Mischstabs (1) erneut erzeugt wird, um magnetisch anziehbare Partikel (40) erneut anzuheben.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zum Mischen der Mischstab (1) entlang seiner Längsrichtung hin- und her bewegt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Magnetfeld am vorderen Ende (3) des Mischstabs (1) zumindest dann eingeschaltet wird, wenn sich der Mischstab (1) mit seinem vorderen Ende (3) in einem definierten minimalen Abstand zum Boden (11) des Mischgefäßes (10) befindet.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Mischstab (1) zumindest einen Permanentmagneten (4) aufweist, der in Längsrichtung des Mischstabs (1) bewegbar ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei zum Einschalten des Magnetfelds im Bereich des vorderen Endes (3) des Mischstabs (1) der Permanentmagnet (4) zum vorderen Ende (3) des Mischstabs (1) hin bewegt und zum Ausschalten des Magnetfelds vom vorderen Ende (3) weg bewegt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Permanentmagnet (4) beim Ausschalten des Magnetfeldes ruckartig vom vorderen Ende (3) des Mischstabs (1) weg bewegt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Mischstab (100) zumindest einen Permanentmagneten (106) im Bereich seines vorderen Endes (103) und zumindest eine den Permanentmagneten (106) umgebende und in Längsrichtung des Mischstabs (100) verschiebbare Abschirmhülse (107) aufweist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Mischstab (100) einen Elektromagneten (120) zum Erzeugen des Magnetfelds aufweist.
  10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den magnetisch anziehbaren Partikeln (40) um ferro-, ferri-, paramagnetische und/oder superparamagnetische Partikel handelt.
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