EP2029744A2 - Arn de transfert chimerique et son utilisation pour la production d'arn par une cellule - Google Patents

Arn de transfert chimerique et son utilisation pour la production d'arn par une cellule

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EP2029744A2
EP2029744A2 EP07788885A EP07788885A EP2029744A2 EP 2029744 A2 EP2029744 A2 EP 2029744A2 EP 07788885 A EP07788885 A EP 07788885A EP 07788885 A EP07788885 A EP 07788885A EP 2029744 A2 EP2029744 A2 EP 2029744A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
trna
rna
seq
chimeric
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07788885A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédéric Dardel
Luc Ponchon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Descartes
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Descartes
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Paris Descartes filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2029744A2 publication Critical patent/EP2029744A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid

Definitions

  • the present invention relates to the use of a chimeric tRNA, including RNA, for the production of said RNA by a cell.
  • RNA production in large quantities relies, for the most part, on three distinct technologies: chemical synthesis, enzymatic synthesis in vitro, and RNA purification produced in vivo, generally in isolated eukaryotic or prokaryotic cells.
  • RNA molecule in amounts of the order of 100 ⁇ g to 10 mg.
  • This technology is, however, limited to relatively short molecules, generally comprising less than 50 ribonucleotides, and all the more so since the synthesis is carried out on a large scale. for quantities greater than one milligram. This technology is also relatively expensive.
  • Enzymatic synthesis in vitro allows the production of RNA molecules using a purified enzyme, a DNA template, and ribonucleotide triphosphates (Milligan et al (1987) Nucleic Acids Res 15: 8783-8798). Unlike chemical synthesis, there is no size limit for synthesized molecules. However, for large quantities, its use remains delicate with very variable production yields and highly dependent on the sequence of RNA molecules to be produced. In addition, the purification is laborious and requires in particular multiple electrophoresis and electroelutions. This technology is also relatively expensive.
  • RNA molecules that are naturally produced by the cells and that are relatively abundant, such as tRNAs (Meinnel et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16: 8095- 8096, Normanly et al (1986) Proc Natl Acad ScL 83: 6548-6552, Tisne ef al (2000) RNA 6: 1403-1412), the ribonucleotide part of ribonuclease P (Meinnel & Blanquet (1995)). J. Biol Chem 270: 15908-15914) or mtRNA (Gaudin et al (2003) J. Mol Biol 331: 457-471).
  • This technology has never been systematically applied to RNAs other than natural RNAs, notably because of important predictable technical obstacles such as the instability of the RNA products, the low expression yield or the purification difficulties.
  • An object of the invention is therefore to provide a means of producing RNA without the disadvantages encountered for the technologies mentioned above.
  • the tRNAs are fundamental molecules of peptide biosynthesis which, once loaded with their respective amino acids by the aminoacyl-tRNA synthetases, ensure, thanks to the ribosome, the translation of the genetic message carried by the messenger RNA into peptide sequences (Hopper & Phisicky (2003), Genes dev 17: 162-180).
  • the present invention results from the unexpected demonstration that it is possible to produce large amounts of an RNA molecule from cells expressing a modified tRNA, for example so that a part of the stem-loop of the anticodon is replaced by the coding sequence of the RNA molecule.
  • the modified tRNA containing the RNA molecule is readily purified in large amounts from the cells, the RNA molecule to be produced subsequently excisable from the chimeric tRNA.
  • the present invention thus relates to the use of a nucleic acid encoding a chimeric transfer RNA (tRNA), which chimeric tRNA originates from the modification of an tRNA by insertion of an RNA into the stem-loop of the anticodon of said tRNA and / or by substitution of all or part of the anticodon loop stem of said tRNA with an RNA, for the production of said RNA, or a portion of said RNA, in a cell.
  • tRNA chimeric transfer RNA
  • RNA refers to the production of the RNA itself, or a portion of that RNA, but also to the production of RNA.
  • the production is from the transcription of the nucleic acid by the cell. Transcription of the nucleic acid leads to chimeric tRNA. If necessary, this chimeric tRNA can be cleaved in or out of the cell to release the RNA.
  • the RNA defined above substitutes all or part of the stem-loop of the anticodon between the first ribonucleotide, included, of the rod-loop of the anticodon and the last ribonucleotide, included, of the stem-loop of the anticodon.
  • RNA RNA (included in the chimeric tRNA) with a yield greater than that which would be obtained in the absence of the tRNA part, and to protect the RNA (included in the chimeric tRNA) of a degradation, in particular linked to certain cellular components.
  • tRNA The general characteristics of a tRNA are well known to those skilled in the art.
  • a tRNA is formed of a single ribonucleotide chain which is capable of folding to adopt a characteristic secondary structure called clover.
  • This characteristic secondary structure includes:
  • a pair of ribonucleotides is formed by the non-covalent pairing of the purine and pyrimidine bases of the two ribonucleotides by weak bonds, such as hydrogen bonds, which may especially be Watson-Crick type bonds. well known to those skilled in the art.
  • 2 ribonucleotides are present between the first 7 ribonucleotides on the 5 'side of the ribonucleotide chain and the arm and D loop, 1 ribonucleotide is present between the arm and the loop D, on the one hand, and the rod and the loop of the anticodon, on the other hand, 1 ribonucleotide is present between rod and the loop of the anticodon, on the one hand, and the variable loop, d 'somewhere else.
  • tRNA comprises 17 ribonucleotides, providing the three-dimensional structure of tRNA and recognition by cellular enzymes, namely: U 8 , Ai 4 , (A or G) 15 , Gi 8 , G 19 , A2 1 , G 53 , U 54 , U 55 , C 56 , (A or G) 57 , A 58 , (C or U) 60 , C 6 , C 74 , C 75 , A 76 .
  • the ribonucleotides indicated correspond to the sequence of the tRNA as transcribed before possible post-transcriptional modifications of certain ribonucleotides by the cellular machinery.
  • the tRNA defined above may be selected from the group consisting of archaeal, bacterial, viral, protozoan, fungus, algae, plant or animal tRNAs.
  • tRNAs that can be used according to the invention also comprise all the tRNAs described by SRocl et al. (1998) "Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes”. Nucleic Acids Res. 26: 148-153 or those available on the website: http://www.uni-bayreuth.de/departments/biochemie/trna/.
  • tRNA also encompasses structures obtained by modifying an tRNA as defined above or natural variants of an tRNA as defined above, under provided that these modified structures or these variants retain the functionalities of the unmodified tRNA, namely in particular the interaction with proteins such as EF-Tu factor (see, for example, Rodnina et al., (2005) FEBS Lett. : 938-942) or CCAse (see for example Augustin et al (2003) J. Mol Biol 328: 985-994).
  • proteins such as EF-Tu factor (see, for example, Rodnina et al., (2005) FEBS Lett. : 938-942) or CCAse (see for example Augustin et al (2003) J. Mol Biol 328: 985-994).
  • RNA according to the invention is any ribonucleic chain, which preferably comprises from 6 to 5,000 ribonucleotides, more preferably from 6 to 1,000 ribonucleotides, and more preferably from 6 to 300 ribonucleotides.
  • all or part of the RNA defined above is chosen from the list consisting of an antisense RNA, an RNA interfering with an aptamer, a ribozyme, a viral RNA, a ribosomal RNA, and a nucleolar RNA.
  • antisense RNA means an RNA capable of binding to a target nucleic acid sequence (DNA or RNA) so as to limit or prevent its operation, in particular the antisense RNA can bind to a target messenger RNA in order to prevent its translation (see for example Tafech et al., (2006) Curr Med 13:
  • Interfering RNA refers to an RNA capable of preventing or limiting the expression of a target gene by the interference phenomenon (see, for example, Tafech et al., (2006) Curr Med Med 13: 863 -881).
  • aptamer refers to an RNA capable of binding to a target compound, such as a biological macromolecule, for example of a protein nature. (see for example Nimjee et al (2005) Ann Rev Med 56: 555-583).
  • ribozyme denotes an RNA capable of catalyzing one or more chemical reactions (see, for example, Fiammenga & Jaschke (2005) Curr Opin Biotechnol 16: 614-621).
  • viral RNA refers to an RNA or part of RNA carried or encoded by a virus.
  • ribosomal RNA and “nucleolar RNA” respectively refers to an RNA or part of the RNA constituting the ribosome or the nucleolus.
  • the RNA is structured.
  • structured RNA means an RNA capable of adopting a secondary structure and possibly a preferred tertiary structure.
  • the RNA comprises a purification tag, the purification tag preferably being selected from the group consisting of a ribozyme or an aptamer.
  • purification label denotes a motif, preferably of a ribonucleotide nature, capable of promoting the separation, for example an affinity separation, of the chimeric tRNA that comprises it, from the medium in which it is located.
  • the ribozyme is preferably selected from the group consisting of a hairpin ribozyme, a hammerhead ribozyme, or a leadzyme (see, for example, Doherty & Doudna (2000) Ann. Rev Biochem 69: 597-615).
  • the aptamer is preferably selected from the group consisting of avidin, dextran (sephadex TM), biotin, or arginine binding aptamer.
  • Chimeric tRNA is preferably selected from the group consisting of avidin, dextran (sephadex TM), biotin, or arginine binding aptamer.
  • the chimeric tRNA is such that the two ribonucleotides that follow the ribonucleotide that precedes the stem-loop of the anticodon in the tRNA before modification are paired with the two ribonucleotides that precede the ribonucleotide that follows the stem loop of the anticodon in tRNA before modification.
  • the chimeric tRNA is such that the two base pairs of the end of the rod of the anticodon directed towards the arm T and the arm D of the tRNA are conserved.
  • the chimeric tRNA is such that the first two ribonucleotides of the RNA are paired with the last two ribonucleotides of the RNA.
  • I 1 chimeric tRNA defined above has the formula (I):
  • A represents adenine or one of its analogues
  • C represents cytosine or one of its analogues
  • G represents guanosine or one of its analogues
  • U represents uridine or one of its analogues
  • each of the Ns which may be identical or different, represents any ribonucleotide
  • each of (N), identical or different, represents any ribonucleotide, which may be present or absent, R represents A or G, or their analogues, Y represents U or C, or their analogues
  • each of the X-Zs which may be identical or different, represents an A-U, U-A, G-C, C-G, G-U or U-G pair, or their analogues,
  • N-ribonucleotides at the 1-position and the N-position at the 72-position may be paired or not
  • -R 1 represents a sequence of 3 to 20 ribonucleotides
  • R 2 represents 1 inserted RNA, namely a sequence of 6 to 5000 ribonucleotides, more preferably from 6 to 1000 ribonucleotides, and more preferably from 6 to 300 ribonucleotides.
  • analog defines any ribonucleotide derivatives derived from the post-transcriptional tRNA modification enzyme activity of the cell in which they are produced.
  • the analogs of ribonucleotides A, C, G and U that can be found in a tRNA depend on the cell in which this tRNA is produced and the position of the ribonucleotide considered in the tRNA.
  • a large number of analogs are given in SRocl et al. (1998) "Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes”. Nucleic Acids Res., 26, 148-153 and on the database "RNA modification database"
  • Analogs of A may be more particularly selected from the group consisting of 1-methyl-A, inosine and 2'-O-methyl-A.
  • Analogs of C may be more particularly selected from the group consisting of 5-methyl-C and 2'-O-methyl-C.
  • Analogs of G may be more particularly selected from the group consisting of 7-methyl-G and 2'-O-methyl-G.
  • the U analogues may be more particularly selected from the group consisting of pseudouridine, ribothymidine, 2'-O-methyl-ribothymidine, dihydrouridine, 4-thiouridine and 3- (3-amino) -3-carboxypropyl) uridine.
  • FIG. 1 a general representation of a chimeric tRNA according to the invention is thus given in FIG.
  • the chimeric tRNA defined above has one of the following formulas:
  • -G m represents 2'-O-methyl-guanosine
  • T represents ribothymidine
  • ⁇ represents pseudouridine
  • - m7 G represents 7-methyl-guanine
  • - V 7 represents 3- (3-amino-3-carboxypropyl) -uridine
  • R 3 represents a sequence of 6 to 5000 ribonucleotides, more preferably from 6 to 1000 ribonucleotides, and more preferably from 6 to 300 ribonucleotides.
  • Formulas (II), (IV) and (VI) represent a modified human Lys 3 tRNA.
  • the formulas (III), (V) and (VII) represent a tRNA m Met E. modified coli.
  • the tRNA portion is linked to a dextran binding aptamer (sephadex TM).
  • formulas (VI) and (VII) the tRNA portion is linked to a streptavidin binding aptamer.
  • the point between the ribonucleotides G and U of the acceptor rod means that they are linked via two hydrogen bonds in a non Watson type pairing. -Crick, this notation is well known to those skilled in the art.
  • the chimeric tRNA defined above does not comprise the rod of the essentially intact anticodon of the tRNA from which it comes. This means, in particular, that in the chimeric tRNA, between the ribonucleotide that precedes the rod-loop of the anticodon in the tRNA before modification and the ribonucleotide that follows the stem loop of the anticodon in the tRNA before modification, the anticodon stem of the tRNA before modification is no longer present.
  • the cell in which tRNA is produced is preferably isolated, especially when it is an animal or human cell.
  • the cell may be a cell of any type, eukaryotic or prokaryotic.
  • the cell is a bacterial type cell. In a particularly preferred manner the cell is of the type
  • the nucleic acid encoding the chimeric tRNA defined above is a DNA.
  • this DNA is included in an expression vector comprising a promoter and a terminator operably linked to the nucleic acid, as well as an origin of replication and a selection marker.
  • the nucleic acid defined above is introduced into the cell in which it expresses a chimeric tRNA as defined above.
  • the means for introducing and expressing a nucleic acid in a cell are well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a chimeric tRNA as defined above.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding a
  • the present invention also relates to an expression vector comprising a nucleic acid as defined above, a promoter and a terminator, operably linked to the nucleic acid, as well as an origin of replication and a selection marker.
  • the present invention also relates to a cell comprising a nucleic acid as defined above or an expression vector as defined above.
  • the cell is a bacterium, in particular of the E. coli type.
  • the present invention also relates to a second nucleic acid, suitable for the preparation of a nucleic acid as defined above, comprising, in the sense
  • the sequence defined in (i) extends from the 5 'end of said tRNA to second ribonucleotide of the rod of the anticodon and the sequence defined in (ii) extends from the penultimate ribonucleotide of the rod of the anticodon to the 3 'end of said tRNA.
  • sequence of the second nucleic acid as defined above, suitable for the preparation of a nucleic acid as defined above, is chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 1;
  • SEQ ID NO: 1 is suitable for the preparation of a chimeric tRNA of formula (II).
  • SEQ ID NO: 2 is suitable for the preparation of a chimeric tRNA of formula (III).
  • SEQ ID NO: 3 is suitable for the preparation of a chimeric tRNA of formula (IV)
  • SEQ ID NO: 4 is suitable for the preparation of a chimeric tRNA of formula (V)
  • SEQ ID NO: 5 is adapted to the preparation a chimeric tRNA of formula (VI)
  • SEQ ID NO: 6 is suitable for the preparation of a chimeric tRNA of formula (VII)
  • the present invention also relates to an expression vector comprising a second nucleic acid as defined above, suitable for the preparation of a nucleic acid as defined above, a promoter and a terminator, operably linked to the nucleic acid, as well as an origin of replication and a selection marker.
  • the sequence of this expression vector is preferably chosen from the group consisting of:
  • SEQ ID NO: 7 to 12 include SEQ ID NO: 1 to 6, respectively.
  • the promoter is selected from the group consisting of Ipp, lac, tac and trc promoters and ⁇ p ara. coli, the bacteriophage lambda pL promoter or the bacteriophage T7 promoter.
  • the terminator is a terminator of ribosomal RNA operons, in particular chosen from the group consisting of rrnA, rrnB and rrnC.
  • the selection marker is an antibiotic resistance gene, chosen in particular from the group consisting of an ampicillin, kanamycin or chloramphenicol resistance gene.
  • the present invention also relates to a process for producing an RNA in which:
  • cultured cells are cultured with a nucleic acid as defined above;
  • the chimeric tRNA is recovered from the cultured cells or the culture supernatant of the cultured cells,
  • the chimeric tRNA is cleaved to recover the RNA to be produced in isolated form.
  • the present invention also relates to a kit for the production of an RNA using a chimeric tRNA comprising it, which kit comprises at least:
  • RNA to be produced a means of cleaving a chimeric tRNA making it possible to release the RNA to be produced; - optionally at least one restriction enzyme cutting at the restriction site defined above;
  • kits may also contain a purification ligand binding to the purification label optionally included in the chimeric tRNA.
  • the expression vector is a bacterial plasmid and the cells are bacteria.
  • the cleavage means consists of RNase H and two oligonucleotides complementary to one part of the sequence of the chimeric tRNA preceding the 5 'end of the RNA to produce and part of the chimeric tRNA sequence following the 3 'end of the RNA to be produced.
  • RNase degrades oligonucleotide-RNA hybrids, which releases RNA.
  • the bacteria are of Escherichia coli type
  • the expression vector is represented by SEQ ID NO: 7 and the oligonucleotides are represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, or the expression vector is represented by SEQ ID NO: 8 and the oligonucleotides are represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, or
  • the expression vector is represented by SEQ ID NO: 9 and the oligonucleotides are represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, or
  • the expression vector is represented by SEQ ID NO: 10 and the oligonucleotides are represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, or
  • the expression vector is represented by SEQ ID NO: 11 and the oligonucleotides are represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, or
  • the expression vector is represented by SEQ ID NO: 12 and the oligonucleotides are represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
  • the invention also relates to the use of a chimeric tRNA as defined above. above, to resolve the three-dimensional structure of inserted or substituted RNA, by applying the nuclear magnetic resonance technique to a solution of chimeric tRNA or by applying the X-ray diffraction technique to tRNA crystals chimerical. Indeed, advantageously, the structure of the inserted or substituted RNA is conserved in 1 chimeric tRNA relative to RNA in isolated form. In addition, in the context of crystallography, the presence of the tRNA portion can promote the crystallization of the chimeric tRNA as a whole.
  • the tRNA crystallographic structure data can be used for the resolution of the crystallographic structure of the chimeric tRNA as a whole, especially during the step of phasing or molecular replacement.
  • the invention also relates to the use, in vitro, ex vivo, or in vivo, of a chimeric tRNA as defined above, as antisense RNA, interfering RNA, aptamer, or ribozyme, when the RNA inserted or substituted is an antisense RNA, an interfering RNA, an aptamer, or a ribozyme, respectively.
  • the chimeric tRNAs of the invention are such that the activity of the inserted or substituted RNA is conserved relative to the RNA in isolated form.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a chimeric tRNA as defined above as an active substance, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • chimeric tRNAs according to the invention can be used for the production of RNA chemotapes, in particular using RNA molecules obtained in a combinatorial manner. These RNA libraries can be used to screen for potential pharmacological targets. In contrast, chimeric tRNAs according to the invention can be screened, especially when they express RNAs that are potential pharmacological targets, such as bacterial ribosomal RNAs or viral RNAs, using drug candidates.
  • RNA partners such as, for example, direct purification of ribonucleoprotein complexes, which would make it possible in particular to identify the partners, protein or other, of a given RNA.
  • RNA partners such as, for example, direct purification of ribonucleoprotein complexes
  • FIG. 1 represents the structure of a chimeric tRNA according to the invention.
  • the conserved part of the tRNA is named tRNA chassis.
  • the nucleotides indicated in parentheses are optional.
  • the nucleotides indicated in bold and gray represent the conserved or semi-conserved positions.
  • Figure 2 shows the structure of a chimeric Lys 3 tRNA incorporating the epsilon domain of human hepatitis B virus.
  • Figure 3 shows the structure of a chimeric Lys 3 tRNA incorporating the epsilon domain of human hepatitis B virus (left) and the corresponding HSQC spectrum.
  • the chimeric RNA was dialyzed against distilled water, then freeze-dried and finally solubilized in a 90% H 2 O / 10% D 2 O mixture at a concentration of 1 mmol / L (total volume approximately 400 ⁇ l).
  • the spectral region shown corresponds to the displacements (vertical and horizontal axes, ppm) of NH imino groups involved in base pairing.
  • Each AU or GC pairing in the RNA corresponds to a given peak. This spectrum is a "signature" of the 2D and 3D structure of the RNA studied.
  • Figure 5 shows the result of RNase H digestion of a chimeric Lys 3 tRNA incorporating the epsilon domain of human hepatitis B virus.
  • L 1 chimeric tRNA (about 50 ug) was hybridized with two oligonucleotides complementary DNA regions 5 1 and 3 'of the epsilon RNA in a 1: 1: 1 and incubated at 37 ° C in the presence of RNAse H E. coli (10 units / nmol DNA) in 100 mM NaCl buffer, 5 mM MgCl 2 , 50 mM Tris-HCl pH 7.5.
  • RNA is revealed by ultraviolet (UV) shading.
  • Left track untreated chimeric tRNA.
  • Right track marker.
  • Figure 6 shows the result of a dimerization experiment of a chimeric tRNA incorporating the domain of dimerization of HIV viral genomic RNA.
  • the chimeric tRNA 1 was incubated in the presence of 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, then loaded onto an acrylamide gel of 8% non-denaturing (native conditions). The migration is carried out at 4 ° C to avoid the merger of the base pairings. The presence of the RNA species is revealed by UV shading.
  • Left track Chimeric tRNA control.
  • Right track chimeric tRNA carrying the dimerization sequence of HIV.
  • Figure 7 shows the absorption spectrum of malachite green in the absence and in the presence of a chimeric tRNA incorporating a malachite green binding aptamer.
  • the graph represents the absorption (ordinate axis, arbitrary units) as a function of the wavelength (abscissa axis, in nm).
  • the spectra are those of aqueous solutions of malachite green at the same concentration (about 100 nmol / L), in the presence or absence of chimeric tRNA.
  • chimeric tRNA bearing the specific aptamer of the dye there is a significant exaltation of the absorption and a redshift of the maximum. This displacement is not observed with a control chimeric tRNA.
  • This phenomenon is similar to that observed for the aptamer alone (without tRNA framework) and shows that its inclusion within the chimeric tRNA does not affect its functional properties.
  • Figure 8 shows the result of an experiment to determine the dissociation constant (Kd) between a chimeric tRNA incorporating a malachite green binding aptamer and malachite green.
  • Figure 9 shows the structure of chimeric human Lys 3 tRNAs incorporating dextran (Sephadex TM) (A) and streptavidin (B) binding attachments and chimeric m Met tRNAs incorporating dextran binding aptamers. (sephadex TM) (C) and streptavidin (D).
  • Figure 10 shows the electrophoretic profile of the purification steps of a chimeric Lys 3 tRNA incorporating a sephadex TM binding aptamer.
  • the sephadex TM beads were first equilibrated in buffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl), placed in the presence of the total cellular RNAs obtained by phenol extraction, then the everything was stirred for 30 minutes. at 4 ° C. The beads were washed three times with buffer A and RNAs comprising a sephadex TM binding aptamer were eluted with soluble dextran. The different fractions were then analyzed by acrylamide-urea gel electrophoresis. From left to right: total RNA, RNA not retained on the beads, washing 1, 2 and 3, RNA retained on the beads (before elution), RNA eluted with soluble dextran.
  • buffer A 50 mM Tris-HCl pH 7.5
  • Figure 11 depicts the structure of a chimeric human Lys 3 tRNA incorporating a streptavidin and epsilon binding aptamer of human HBV.
  • Human lys 3 tRNA was modified to incorporate the epsilon domain of hepatitis B virus ( Figure 2).
  • pBSTNav-Lys expression vector comprising the coding sequence of the human tRNA Lys 3 modified by insertion of restriction sites Eag ⁇ , EcoRV and SacII was prepared (SEQ ID NO: 7), then the area of the sequence Human hepatitis B virus epsilon (SEQ ID NO: 17) was inserted between the Eag I and Sac II sites to give the pBSTNav-Lys-epsilon vector.
  • This vector has been used to transform E. coli bacteria. These were then cultured in a rich medium (Luria-Broth, LB) in the presence of ampicillin at a concentration of 100 ⁇ g / ml, for 14-15 hours at 37 ° C. The bacteria were recovered by centrifugation (30 min at 4000 rpm for 1 liter of culture). The pellet was solubilized in 8.6 ml of a 10 mM Mg acetate buffer, 10 mM Tris-HCl pH 7.4. 10 ml of phenol saturated in this same buffer were then added and the whole was stirred gently for 1 h at room temperature and then centrifuged for 30 min. at 10,000 rpm.
  • tRNAs were then purified on anion exchange resin (60 mL of phase, Q-Sepharose, Pharmacia). The purification was carried out in 50 mM sodium phosphate pH 6.5, with a gradient ranging from 500 mM to 650 mM d NaCl over 475 mL with a flow rate of 0.5 mL / min. Chimeric L 1 tRNA is elected after the endogenous tRNAs, shorter. After this step, from 1 liter of culture, at the end of the ion exchange, about 50 mg of purified chimeric tRNA ( lys 3 + epsilon tRNA) are obtained.
  • anion exchange resin 60 mL of phase, Q-Sepharose, Pharmacia
  • the chimeric Lys 3 tRNA comprising the epsilon domain of the 15 N nitrogen-labeled hepatitis B virus by applying the procedure described above to a culture of bacteria grown on enriched medium (Spectra-9N medium, Spectra Stable Isotopes, or equivalent), has been characterized by nuclear magnetic resonance (NMR).
  • enriched medium Spectra-9N medium, Spectra Stable Isotopes, or equivalent
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • RNA production method according to the invention makes it possible to obtain properly structured RNAs and that, moreover, the chimeric tRNAs according to the invention are useful for the resolution of NMR structures of RNA molecules without it is necessary to separate them from the chimeric tRNA.
  • the chimeric Lys 3 tRNA comprising the epsilon domain of the hepatitis B virus could be crystallized (FIG. 4).
  • This also demonstrates the interest of the RNA production method according to the invention for the resolution of crystallographic structures. This interest is reinforced by the fact that in the case where the crystallographic structure of the tRNA from which the chimeric tRNA is formed is known, it is then possible to use this structure for the step of phasing or molecular replacement when resolution of the crystallographic structure of the chimeric tRNA as a whole.
  • epsilon domain of the hepatitis B was separated from tRNA Lys 3 chimerical by digestion with RNase H.
  • oligonucleotides SEQ ID NOs: 13 and 14
  • chimeric Lys3 PARNt in a molar ratio of 1: 1.
  • the mixture thus obtained (approximately 100 ⁇ l) is heated to 95 ° C in a water bath, then after cooling to room temperature is added a buffer so as to obtain in final concentration 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 50 mM Tris-HCl pH 7.5 and RNase H of E. coli (10 U / nmol DNA) which is allowed to act at 37 ° C for 4 hours.
  • the result of digestion is shown in Figure 5.
  • pBSTNav-Met expression vector comprising the coding sequence of I ⁇ RNt m Met of Escherichia coli modified by insertion of the Eag I, EcoRV and Sac I restriction sites was prepared (SEQ ID NO: 8), and then the epsilon domain sequence of hepatitis B virus (SEQ ID NO: 17) was inserted between the Eag1 and SacII sites to give the pBSTNav-Met-epsilon vector.
  • SEQ ID NO: 8 the epsilon domain sequence of hepatitis B virus
  • the dimerization of HIV genomic site was inserted within the human tRNA Lys 3 or I ⁇ RNt m Met of Escherichia Coli, as described in Example 1, respectively, by inserting a DNA encoding the site dimerization (SEQ ID NO: 18) in the expression vectors pBSTNav-Lys (SEQ ID NO: 7) and pBSTNav-Met (SEQ ID NO: 8) after cleavage by the restriction enzymes Eag1 and Sac11.
  • the process for producing I 1 corresponding chimeric tRNA and yields are similar to those of Example 1.
  • An aptamer binding to malachite green was inserted within the human tRNA Lys 3, as described in Example 1 by inserting a DNA encoding the aptamer (SEQ ID NO: 19) the expression vector pBSTNav-Lys (SEQ ID NO: 7) after cleavage by the restriction enzymes Eag1 and Sac11.
  • the method of producing the corresponding chimeric tRNA and the yields are similar to those of Example 1.
  • the functionality of the aptamer was monitored by verifying that the chimeric tRNA was able to bind malachite green - the dye binding to the aptamer resulting in an increase in its molar extinction coefficient (Figure 7). .
  • the dissociation constant of the chimeric tRNA according to the invention for malachite green was estimated at 50 ⁇ 10 -9 mol / l (FIG. 8), which is similar to the value measured for the aptamer alone.
  • chimeric including an aptamer according to the invention can therefore be used directly as an aptamer, without the need to cleave the tRNA frame.
  • This chimeric tRNA is useful, for example for screening antibiotic compounds acting on this region of the bacterial ribosome, such as, for example, aminoglycosides and their analogs.
  • An aptamer that binds to streptavidin was inserted within the human tRNA Lys 3 or tRNA m Met of Escherichia Coli, as described in Example 1, respectively by inserting a DNA encoding aptamer (SEQ ID NO: 21) in the expression vector pBSTNav-Lys (SEQ ID NO: 7) and pBSTNav-Met (SEQ ID NO: 8) after cleavage by the restriction enzymes Eag1 and Sac11, for give pBSTNav-Lystrepta and pBSTNav-Met-strepta (see Figure 9).
  • an aptamer that binds to Sephadex TM (beads derivative of dextran sold by Pharmacia) was inserted within the human tRNA Lys 3 or tRNA m Met of Escherichia Coli, as described in Example 1, respectively, by inserting a DNA encoding the aptamer (SEQ ID NO: 22) into the expression vector pBSTNav-Lys (SEQ ID NO: 7) and pBSTNav-Met (SEQ ID NO: 8) after cleavage with restriction enzymes Eag1 and Sac11, to give pBSTNav-Lys-sepha and pBSTNav-Met-sepha (see Figure 9).
  • LyS 3 tRNA comprising a sephadex TM binding aptamer
  • RNA solution obtained after phenol extraction as shown in Example 1 was directly purified using sephadex TM beads.
  • the Sephadex TM beads were first equilibrated in buffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ), placed in the presence of the RNAs, and then all was added. stirred for 30 min. at 4 ° C. The beads were washed three times with buffer A and the RNAs comprising a sephadex TM binding aptamer were eluted with soluble dextran (Sigma-Aldrich). The results of this purification are shown in Figure 10.
  • RNAs have thus been expressed using this system, notably the epsilon domain of the human hepatitis B virus (HBV) (SEQ ID NO: 23) (FIG.
  • RNA particularly useful for screening for antibodies directed against the bacterial ribosome is RNA particularly useful for screening for antibodies directed against the bacterial ribosome.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique codant un ARN de transfert (ARNt) chimérique, lequel ARNt chimérique provient de la modification d'un ARNt par insertion d'un ARN dans la tige-boucle de l'anticodon dudit l'ARNt et/ou par substitution de tout ou partie de la tige boucle de l'anticodon dudit l'ARNt par un ARN, pour la production dudit ARN, ou d'une partie dudit ARN, dans une cellule.

Description

ARN de transfert chimérique et son utilisation pour la production d'ARN par une cellule
La présente invention concerne, en particulier, l'utilisation d'un ARNt chimérique, comprenant un ARN, pour la production dudit ARN par une cellule.
A l'heure actuelle, la production d'ARN en grandes quantités fait appel, pour l'essentiel, à trois technologies distinctes : la synthèse chimique, la synthèse enzymatique in vitro, et la purification d'ARN produits in vivo, généralement dans des cellules eucaryotes ou procaryotes isolées.
La synthèse chimique (Marshal & Kaiser (2004), Curr. Opin. Chem. Biol. 8 : 222- 229) permet de produire une molécule d'ARN dans des quantités de l'ordre de 100 μg à 10 mg. Cette technologie est cependant limitée à des molécules relativement courtes, comprenant en général moins de 50 ribonucléotides, et ce d'autant plus que la synthèse est réalisée à grande échelle, Le. pour des quantités supérieures au milligramme. Cette technologie est en outre relativement coûteuse.
La synthèse enzymatique in vitro permet de produire des molécules d'ARN en utilisant une enzyme purifiée, une matrice d'ADN et des ribonucléotides triphosphates (Milligan et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15 : 8783-8798). Contrairement à la synthèse chimique il n'y a pas de limite de taille des molécules synthétisées. Toutefois, pour de grandes quantités, son utilisation reste délicate avec des rendements de production très variables et fortement dépendants de la séquence des molécules d'ARN à produire. De plus, la purification s'avère laborieuse et nécessite notamment de multiples électrophorèses et électroélutions. Cette technologie est également relativement coûteuse.
Enfin, la purification d'ARN produits in vivo permet principalement d'obtenir des molécules d'ARN naturellement produites par les cellules et relativement abondantes, telles que des ARNt (Meinnel ef al. (1988) Nucl. Acids Res. 16 : 8095-8096 ; Normanly ef al. (1986) Proc. Natl. Acad. ScL 83 : 6548-6552 ; Tisne ef al. (2000) RNA 6 : 1403- 1412), la partie ribonucléotidique de la ribonucléase P (Meinnel & Blanquet (1995) J. Biol. Chem. 270 : 15908-15914) ou l'ARNtm (Gaudin ef al. (2003) J. Mol. Biol. 331 : 457-471). Cette technologie n'a jamais été appliquée systématiquement à des ARN autre que des ARN naturels, notamment en raison d'obstacles techniques prévisibles importants comme l'instabilité des ARN produits, la faiblesse du rendement d'expression ou les difficultés de purification.
Un objet de l'invention est donc de fournir un moyen de production d'ARN dépourvu des inconvénients rencontrés pour les technologies mentionnées ci-dessus. Les ARNt sont des molécules fondamentales de la biosynthèse peptidique qui, une fois chargés de leurs acides aminés respectifs par les aminoacyl-ARNt synthétases, assurent, grâce au ribosome, la traduction du message génétique porté par les ARN messagers en séquences peptidiques (Hopper & Phisicky (2003), Gènes dev. 17 :162-180 ).
Le document Médina & Joshi (1999) Nucl. Acids Res. 27 : 1698-1708 décrit un
ARNt chimérique dans lequel un ribozyme est inséré entre deux bases successives de la boucle de l'anticodon de l'ARNtLyS 3 humain. Toutefois, cet ARNt chimérique est produit in vitro avec les inconvénients inhérents à cette technologie mentionnés ci- dessus.
La présente invention découle de la mise en évidence inattendue qu'il est possible de produire des quantités importantes d'une molécule d'ARN à partir de cellules exprimant un ARNt modifié, par exemple de façon qu'une partie de la tige- boucle de l'anticodon soit remplacée par la séquence codante de la molécule d'ARN. L'ARNt modifié contenant la molécule d'ARN est aisément purifié, en grande quantité, à partir des cellules, la molécule d'ARN à produire pouvant ensuite être excisée de l'ARNt chimérique.
La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'un acide nucléique codant un ARN de transfert (ARNt) chimérique, lequel ARNt chimérique provient de la modification d'un ARNt par insertion d'un ARN dans la tige-boucle de l'anticodon dudit l'ARNt et/ou par substitution de tout ou partie de la tige boucle de l'anticodon dudit l'ARNt par un ARN, pour la production dudit ARN, ou d'une partie dudit ARN, dans une cellule.
Comme on l'entend ici, le terme « production » de TARN se réfère à la production de l'ARN en lui-même, ou d'une partie de cet ARN, mais également à la production de
PARN au sein de l'ARNt chimérique ou d'une partie de cet ARNt chimérique. De préférence, la production se fait à partir de la transcription de l'acide nucléique par la cellule. La transcription de l'acide nucléique conduit à l'ARNt chimérique. Si nécessaire, cet ARNt chimérique peut être clivé dans ou hors de la cellule pour libérer l'ARN. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'ARN défini ci-dessus substitue tout ou une partie de la tige-boucle de l'anticodon comprise entre le premier ribonucléotide, inclus, de la tige-boucle de l'anticodon et le dernier ribonucléotide, inclus, de la tige-boucle de l'anticodon.
L'utilisation selon l'invention d'un acide nucléique codant ARNt chimérique tel que défini ci-dessus dans le cadre de la production de l'ARN est particulièrement avantageuse car la présence de la partie ARNt, ou châssis ARNt1 permet notamment de produire TARN (inclus dans l'ARNt chimérique) avec un rendement supérieur à celui qui serait obtenu en l'absence de la partie ARNt, et de protéger l'ARN (inclus dans l'ARNt chimérique) d'une dégradation, notamment liée à certains composants cellulaires.
ARNt
Les caractéristiques générales d'un ARNt sont bien connues de l'homme du métier.
D'une manière préférée, un ARNt est formé d'une unique chaîne ribonucléotidique qui est susceptible de se replier pour adopter une structure secondaire caractéristique dite en trèfle. Cette structure secondaire caractéristique comprend :
(i) une tige acceptrice composée des 7 premiers ribonucléotides du côté 5' de la chaîne ribonucléotidique et des 7 ribonucléotides précédant les 4 derniers ribonucléotides du côté 3' de la chaîne ribonucléotidique, formant ainsi une structure double brin comprenant 6 ou 7 paires de ribonucléotides, les ribonucléotides constitués par le premier ribonucléotide du côté 5' de la chaîne ribonucléotidique et le ribonucléotide précédant les 4 derniers ribonucléotides du côté 3' de la chaîne ribonucléotidique pouvant ne pas être appariés ; (ii) un bras D constitué de 4 paires de ribonucléotides et une boucle D constituée de 8 à 10 ribonucléotides, formés par le repliement d'une partie de la chaîne ribonucléotidique suivant les 7 premiers ribonucléotides du côté 5' de la chaîne ribonucléotidique ; (iii) une tige de l'anticodon constituée de 5 paires de ribonucléotides et une boucle de l'anticodon constituée de 7 ribonucléotides (tige-boucle de l'anticodon), formées par le repliement d'une partie de la chaîne ribonucléotidique suivant le bras D et la boucle D ; (iv) une boucle variable constituée de 4 à 21 ribonucléotides, formée par une partie de la chaîne ribonucléotidique suivant le tige de l'anticodon et la boucle de l'anticodon ; (v) un bras T constitué de 5 paires de ribonucléotides et une boucle T constituée de 8 ribonucléotides, formés par le repliement d'une partie de la chaîne ribonucléotidique suivant la boucle variable et précédant les ribonucléotides du côté 3' de la chaîne ribonucléotidique qui participent à la constitution de la tige acceptrice.
Comme on l'entend ici, une paire de ribonucléotides est formée de l'appariement non covalent des bases puriques et pyrimidiques des deux ribonucléotides grâce à des liaisons faibles, telles que des liaisons hydrogènes, qui peuvent notamment être des liaisons de type Watson-Crick bien connues de l'homme du métier. De manière préférée également, depuis le côté 5' en direction du côté 3', 2 ribonucléotides sont présents entre les 7 premiers ribonuciéotides du côté 5' de la chaîne ribonucléotidique et le bras et la boucle D, 1 ribonucléotide est présent entre le bras et la boucle D, d'une part, et la tige et la boucle de l'anticodon, d'autre part, 1 ribonucléotide est présent entre tige et la boucle de l'anticodon, d'une part, et la boucle variable, d'autre part.
De manière préférée toujours, et selon la numérotation bien connue de l'homme du métier définie par Sprinzl et al. (1998) "Compilation of tRNA séquences and séquences of tRNA gènes". Nucleic Acids Res. 26 : 148-153, l'ARNt comprend 17 ribonucléotides, assurant la structure tridimensionnelle de l'ARNt et la reconnaissance par les enzymes cellulaires, à savoir : U8, Ai4, (A ou G)15, Gi8, G19, A21, G53, U54, U55, C56, (A ou G)57, A58, (C ou U)6O, C6i, C74, C75, A76. Les ribonucléotides indiqués correspondent à la séquence de l'ARNt tel que transcrit avant modifications post- transcriptionnelles éventuelles de certains ribonucléotides par la machinerie cellulaire. En particulier, l'ARNt défini ci-dessus peut-être sélectionné parmi le groupe constitué des ARNt d'archée, de bactérie, de virus, de protozoaire, de champignon, d'algue, de plante ou d'animal.
Les ARNt utilisables selon l'invention comprennent également l'ensemble des ARNt décrit par Sprinzl et al. (1998) "Compilation of tRNA séquences and séquences of tRNA gènes". Nucleic Acids Res. 26 : 148-153 ou ceux disponibles sur le site : http://www.uni-bayreuth.de/departments/biochemie/trna/.
Dans le cadre de l'invention, le terme « ARNt » englobe également des structures obtenues en modifiant un ARNt tel qu'il est défini ci-dessus ou des variants naturels d'un ARNt tel qu'il est défini ci-dessus, sous réserve que ces structures modifiées ou ces variants conservent les fonctionnalités de l'ARNt non modifié, à savoir notamment l'interaction avec des protéines telles que le facteur EF-Tu (voir par exemple Rodnina et al. (2005) FEBS. Lett. 579 : 938-942) ou la CCAse (voir par exemple Augustin et al. (2003) J. Mol. Biol. 328 : 985-994).
ARN
L'ARN selon l'invention est une chaîne ribonucléique quelconque, qui de préférence comprend de 6 à 5 000 ribonucléotides, plus préférentiellement de 6 à 1 000 ribonucléotides, et plus préférentiellement encore de 6 à 300 ribonucléotides.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, tout ou partie de l'ARN défini ci-dessus est choisi dans la liste constituée d'un ARN antisens, d'un ARN interfèrent, d'un aptamère, d'un ribozyme, d'un ARN viral, d'un ARN ribosomique, et d'un ARN nucléolaire.
On désigne par « ARN antisens » un ARN susceptible de se lier à une séquence nucléique cible (ADN ou ARN) de façon à limiter ou à empêcher son fonctionnement, en particulier les ARN antisens peuvent se lier à un ARN messager cible de façon à empêcher sa traduction (voir par exemple Tafech et al. (2006) Curr. Med. Chem. 13 :
863-881).
On désigne par « ARN interfèrent » un ARN susceptible d'empêcher ou de limiter l'expression d'un gène cible par le phénomène d'interférence (voir par exemple Tafech et al. (2006) Curr. Med. Chem. 13 : 863-881).
On désigne par « aptamère » un ARN susceptible de se lier à un composé cible, telle qu'une macromolécule biologique, par exemple de nature protéique. (voir par exemple Nimjee et al. (2005) Ann. Rev. Med. 56 : 555-583).
On désigne par « ribozyme » un ARN susceptible de catalyser une ou plusieurs réactions chimiques (voir par exemple Fiammenga & Jaschke (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16 : 614-621).
On désigne par « ARN viral » un ARN ou une partie d'ARN portée ou codée par un virus.
On désigne respectivement par « ARN ribosomique » et « ARN nucléolaire », un ARN ou une partie d'ARN constitutif du ribosome ou du nucléole.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'ARN est structuré. On désigne par « ARN structuré » un ARN susceptible d'adopter une structure secondaire et éventuellement une structure tertiaire préférentielle.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'ARN comprend une étiquette de purification, l'étiquette de purification étant de préférence choisie dans le groupe constitué d'un ribozyme ou d'un aptamère.
On désigne par « étiquette de purification » un motif, de préférence de nature ribonucléotidique, susceptible de favoriser la séparation, par exemple une séparation par affinité, de l'ARNt chimérique qui le comprend, du milieu dans lequel il se trouve. Le ribozyme est de préférence choisi dans le groupe constitué d'un ribozyme en épingle à cheveux (hairpin), d'un ribozyme à tête de marteau (hammerhead) ou d'un leadzyme (voir par exemple Doherty & Doudna (2000) Ann. Rev Biochem. 69 : 597- 615).
L'aptamère est de préférence choisi dans le groupe constitué d'un aptamère de liaison à l'avidine, au dextran (sephadex™), à la biotine ou à l'arginine. ARNt chimérique
De préférence, lorsque TARN substitue tout ou une partie de la tige-boucle de l'anticodon comprise entre le premier ribonucléotide, inclus, de la tige-boucle de l'anticodon et le dernier ribonucléotide, inclus, de la tige-boucle de l'anticodon, l'ARNt chimérique est tel que les deux ribonucléotides qui suivent le ribonucléotide qui précède la tige-boucle de l'anticodon dans l'ARNt avant modification sont appariés avec les deux ribonucléotides qui précèdent le ribonucléotide qui suit la tige boucle de l'anticodon dans l'ARNt avant modification. Ainsi, dans un cas particulier, l'ARNt chimérique est tel que les deux paires de bases de l'extrémité de la tige de l'anticodon dirigée vers le bras T et le bras D de l'ARNt sont conservées. Dans un autre cas particulier l'ARNt chimérique est tel que les deux premiers ribonucléotides de l'ARN s'apparient aux deux derniers ribonucléotides de l'ARN.
De préférence, I1ARNt chimérique défini ci-dessus présente la formule (I) suivante :
A C C
N
X-Z X-Z
(I) dans laquelle :
- A représente l'adénine ou un de ses analogues, C représente la cytosine ou un des ses analogues, G représente la guanosine ou un de ses analogues et U représente l'uridine ou un de ses analogues,
- chacun des N, identiques ou différents, représente un ribonucléotide quelconque,
- chacun des (N), identiques ou différents, représente un ribonucléotide quelconque, qui peut être présent ou absent, - R représente A ou G, ou leurs analogues, - Y représente U ou C, ou leurs analogues
- chacun des X-Z, identiques ou différents, représente une paire A-U, U-A, G-C, C-G, G-U ou U-G, ou leurs analogues,
- les ribonucléotides N en position 1 et N en position 72 peuvent être appariés ou non, - Ri représente une séquence de 3 à 20 ribonucléotides,
- R2 représente I1ARN inséré, à savoir une séquence de 6 à 5 000 ribonucléotides, plus préférentiellement de 6 à 1 000 ribonucléotides, et plus préférentiellement encore de 6 à 300 ribonucléotides.
Comme on l'entend ici, le terme « analogue » définit des éventuels dérivés du ribonucléotide provenant de l'activité d'enzymes de modification post-transcriptionnelles d'ARNt de la cellule dans laquelle ils sont produits. Les analogues des ribonucléotides A, C, G et U que l'on peut trouver dans un ARNt dépendent de la cellule dans laquelle est produit cet ARNt et de la position du ribonucléotide considéré dans l'ARNt. Un grand nombre d'analogues sont donnés dans Sprinzl et al. (1998) "Compilation of tRNA séquences and séquences of tRNA gènes". Nucleic Acids Res., 26, 148-153 et sur la base de données "RNA modification database"
(http://medstat.med.utah.edu/RNAmods/). Les analogues de A peuvent être plus particulièrement sélectionnés dans le groupe constitué de la 1-méthyl-A, de l'inosine et de la 2'-O-méthyl-A. Les analogues de C peuvent être plus particulièrement sélectionnés dans le groupe constitué de la 5-méthyl-C et de la 2'-O-methyl-C. Les analogues de G peuvent être plus particulièrement sélectionnés dans le groupe constitué de la 7-méthyl-G et de la 2'-O-méthyl-G. Les analogues de U peuvent être plus particulièrement sélectionnés dans le groupe constitué de la pseudouridine, de la ribothymidine, de la 2'-O-méthyl-ribothymidine, de la dihydrouridine, de la 4-thiouridine et de la 3-(3-amino-3-carboxypropyl)-uridine.
Dans la formule ci-dessus, qui utilise les conventions bien connues de l'homme du métier de représentation des ARNt, les liaisons covalentes qui relient entre eux les ribonucléotides de la chaîne ribonucléique ne sont pas représentées et les traits entre les ribonucléotides N-N, X-Z et C-G représentent des liaisons faibles, de préférence de type hydrogène. En revanche, les traits reliant R2 à X et Z et R1 à N et X représentent des liaisons covalentes.
A titre d'exemple une représentation générale d'un ARNt chimérique selon l'invention est ainsi donnée dans la Figure 1.
De manière préférentielle, l'ARNt chimérique défini ci-dessus présente l'une des formules suivantes :
(«) (III)
(IV) (V)
A A
C C
C C
G A
G-C G-C
C-G G-C
C-G C-G
C-G U-A
(Vl) (VII)
dans lesquelles : - D représente la dihydrouridine,
-Gm représente la 2'-O-méthyl-guanosine
- T représente la ribothymidine,
- Ψ représente la pseudouridine,
- m7G représente la 7-méthyl-guanine, - V7 représente la 3-(3-amino-3-carboxypropyl)-uridine,
- R3 représente une séquence de 6 à 5 000 ribonucléotides, plus préférentiellement de 6 à 1 000 ribonucléotides, et plus préférentiellement encore de 6 à 300 ribonucléotides.
Les formules (II), (IV) et (Vl) représentent un ARNtLys 3 humain modifié. Les formules (III), (V) et (VII) représentent un ARNtm Met d'E. coli modifié. Dans les formules (IV) et (V) la partie ARNt est liée à un aptamère se liant au dextran (sephadex™). Dans les formules (Vl) et (VII) la partie ARNt est liée à un aptamère se liant à la streptavidine. Par ailleurs, dans les formules (II), (IV) et (Vl) le point entre les ribonucléotides G et U de la tige acceptrice signifie qu'ils sont liés par l'intermédiaire de deux liaisons hydrogène dans un appariement de type non Watson-Crick, cette notation est bien connue de l'homme du métier.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'ARNt chimérique défini ci-dessus ne comprend pas la tige de l'anticodon essentiellement intacte de l'ARNt dont il provient. Ceci signifie, notamment, que dans l'ARNt chimérique, entre le ribonucléotide qui précède la tige-boucle de l'anticodon dans l'ARNt avant modification et le ribonucléotide qui suit la tige boucle de l'anticodon dans l'ARNt avant modification, la tige de l'anticodon de l'ARNt avant modification n'est plus présente.
Cellule
La cellule dans lequel est produit l'ARNt est de préférence isolée, notamment lorsqu'il s'agit d'une cellule animale ou humaine. Par ailleurs la cellule peut être une cellule de tout type, eucaryote ou procaryote. De préférence, la cellule est une cellule de type bactérien. De manière particulièrement préférée la cellule est de type
Escherichia coli.
Acide nucléique
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'acide nucléique codant pour l'ARNt chimérique défini ci-dessus est un ADN. De préférence, cet ADN est compris dans un vecteur d'expression comprenant un promoteur et un terminateur liés de manière opérationnelle à l'acide nucléique, ainsi qu'une origine de réplication et un marqueur de sélection.
De préférence, l'acide nucléique défini ci-dessus est introduit dans la cellule au sein de laquelle il exprime un ARNt chimérique tel que défini ci-dessus. Les moyens d'introduction et d'expression d'un acide nucléique dans une cellule sont bien connus de l'homme du métier.
La présente invention concerne également un ARNt chimérique tel que défini ci- dessus. La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour un
ARNt chimérique tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus, un promoteur et un terminateur, liés de manière opérationnelle à l'acide nucléique, ainsi qu'une origine de réplication et un marqueur de sélection.
La présente invention concerne également une cellule comprenant un acide nucléique tel que défini ci-dessus ou un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. De préférence, la cellule est une bactérie, notamment du type E. coli. La présente invention concerne également un deuxième acide nucléique, adapté à la préparation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, comprenant, dans le sens
5'-3', au moins :
(i) une séquence codant pour une partie d'un ARNt s'étendant de l'extrémité 5' dudit ARNt au ribonucléotide précédant le premier ribonucléotide de la tige de l'anticodon ou à un ribonucléotide de la tige ou de la boucle de l'anticodon ;
(ii) éventuellement une séquence codant pour tout ou partie d'une étiquette de purification ;
(iii) au moins un site de coupure d'une enzyme de restriction ; (iv) éventuellement une séquence codant pour tout ou partie d'une étiquette de purification ;
(v) une séquence codant pour une partie de l'ARNt s'étendant d'un ribonucléotide de la tige ou de la boucle de l'anticodon en aval du ribonucléotide de (i) ou du ribonucléotide suivant le dernier ribonucléotide de la tige de l'anticodon à l'extrémité 3' dudit ARNt. sous réserve que la séquence du deuxième acide nucléique dans son ensemble ne soit pas la séquence codante de l'ARNt.
De préférence, dans le deuxième acide nucléique tel que défini ci-dessus, adapté à la préparation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, la séquence définie en (i) s'étend de l'extrémité 5' dudit ARNt au deuxième ribonucléotide de la tige de l'anticodon et la séquence définie en (ii) s'étend de l'avant dernier ribonucléotide de la tige de l'anticodon à l'extrémité 3' dudit ARNt.
De préférence, la séquence du deuxième acide nucléique tel que défini ci- dessus, adapté à la préparation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, est choisie parmi le groupe constitué de : - SEQ ID NO 1 ;
- SEQ ID NO 2 ;
- SEQ ID NO 3 ; - SEQ ID NO 4 ; - SEQ ID NO 5 ; - SEQ ID NO 6.
SEQ ID NO : 1 est adapté à la préparation d'un ARNt chimérique de formule (II). SEQ ID NO : 2 est adapté à la préparation d'un ARNt chimérique de formule (III). SEQ ID NO : 3 est adapté à la préparation d'un ARNt chimérique de formule (IV) SEQ ID NO : 4 est adapté à la préparation d'un ARNt chimérique de formule (V) SEQ ID NO : 5 est adapté à la préparation d'un ARNt chimérique de formule (Vl) SEQ ID NO : 6 est adapté à la préparation d'un ARNt chimérique de formule (VII)
La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un deuxième acide nucléique tel que défini ci-dessus, adapté à la préparation d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, un promoteur et un terminateur, liés de manière opérationnelle à l'acide nucléique, ainsi qu'une origine de réplication et un marqueur de sélection. La séquence de ce vecteur d'expression est de préférence choisie parmi le groupe constitué de :
- SEQ ID NO 7 ;
- SEQ ID NO 8 ; - SEQ ID NO 9 ;
- SEQ ID NO 10 ;
- SEQ ID NO 11 ;
- SEQ ID NO 12.
SEQ ID NO : 7 à 12 comprennent respectivement SEQ ID NO : 1 à 6. De préférence, dans les vecteurs ci-dessus, le promoteur est choisi dans le groupe constitué des promoteurs Ipp, lac, tac et trc et ara d'£. coli, du promoteur pL du bactériophage lambda ou du promoteur du bactériophage T7.
De préférence, dans les vecteurs ci-dessus, le terminateur est un terminateur d'opérons d'ARN ribosomiques, notamment choisi dans le groupe constitué de rrnA, de rrnB et de rrnC.
De préférence, dans les vecteurs ci-dessus, le marqueur de sélection est un gène de résistance à un antibiotique, notamment choisi dans le groupe constitué d'un gène de résistance à l'ampicilline, à la kanamycine ou au chloramphénicol.
La présente invention concerne également un procédé de production d'un ARN dans lequel :
- on cultive des cellules transformées par un acide nucléique tel que défini ci-dessus ;
- on récupère l'ARNt chimérique à partir des cellules cultivées ou du surnageant de culture des cellules cultivées,
- éventuellement on clive l'ARNt chimérique pour récupérer l'ARN à produire sous forme isolée.
La présente invention concerne également un kit destiné à la production d'un ARN à l'aide d'un ARNt chimérique le comprenant, lequel kit comprend au moins :
- un vecteur d'expression comprenant un deuxième acide nucléique tel que défini ;
- un moyen de clivage d'un ARNt chimérique permettant de libérer l'ARN à produire ; - éventuellement au moins une enzyme de restriction coupant au niveau du site de restriction défini ci-dessus ;
- éventuellement des cellules aptes à être transformées par un acide nucléique et à produire un ARNt chimérique. Le kit ci-dessus peut également contenir un ligand de purification se liant à l'étiquette de purification comprise le cas échéant dans l'ARNt chimérique.
Dans un mode de réalisation particulier du kit défini ci-dessus, le vecteur d'expression est un plasmide bactérien et les cellules sont des bactéries.
Dans un autre mode de réalisation particulier du kit tel que défini ci-dessus, le moyen de clivage est constitué de RNase H et de deux oligonucléotides complémentaires respectivement à une partie de la séquence de l'ARNt chimérique précédant l'extrémité 5' de l'ARN à produire et à une partie de la séquence de l'ARNt chimérique suivant l'extrémité 3' de l'ARN à produire.
Avantageusement, la RNase dégrade les hybrides oligonucléotide-ARN, ce qui libère l'ARN.
Dans un mode de réalisation préféré du kit tel que défini ci-dessus :
- les bactéries sont de type Escherichia coli ;
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 7 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, ou - le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 8 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 9 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 10 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 11 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 12 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16. L'invention concerne également l'utilisation d'un ARNt chimérique tel que défini ci-dessus, pour résoudre la structure tridimensionnelle de l'ARN inséré ou substitué, en appliquant la technique de la résonance magnétique nucléaire à une solution de l'ARNt chimérique ou en appliquant la technique de la diffraction aux rayons X à des cristaux de l'ARNt chimérique. En effet, avantageusement, la structure de l'ARN inséré ou substitué est conservée dans I1ARNt chimérique par rapport à TARN sous forme isolée. De plus, dans le cadre de la cristallographie, la présence de la partie ARNt peut favoriser la cristallisation de l'ARNt chimérique dans son ensemble. En outre, si un ARNt de structure cristallographique connue est utilisé pour la production de l'ARNt chimérique, alors les données de structure cristallographique de l'ARNt peuvent être utilisées pour la résolution de la structure cristallographique de l'ARNt chimérique dans son ensemble, notamment lors de l'étape de phasage ou de remplacement moléculaire.
L'invention concerne également l'utilisation, in vitro, ex vivo, ou in vivo, d'un ARNt chimérique tel que défini ci-dessus, en tant qu'ARN antisens, ARN interfèrent, aptamère, ou ribozyme, lorsque l'ARN inséré ou substitué est respectivement un ARN antisens, un ARN interfèrent, un aptamère, ou un ribozyme.
En effet, avantageusement et le cas échéant, les ARNt chimérique de l'invention sont tels que l'activité de l'ARN inséré ou substitué est conservée par rapport à l'ARN sous forme isolée.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ARNt chimérique tel que défini ci-dessus à titre de substance active, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En outre, les ARNt chimériques selon l'invention peuvent être utilisés pour la réalisation de chimiothèques d'ARN, notamment à l'aide de molécules d'ARN obtenues de manière combinatoire. Ces chimiothèques d'ARN peuvent être utilisées afin de cribler des cibles pharmacologiques potentielles. A contrario, on peut cribler des ARNt chimériques selon l'invention, notamment lorsqu'ils expriment des ARN qui sont des cibles pharmacologiques potentielles, comme des ARN ribosomiques bactériens ou des ARN viraux, à l'aide de candidats médicaments.
Enfin, l'expression des ARNt chimériques au sein de cellules permet d'envisager des co-purification avec des partenaires des ARN, comme par exemple une purification directe de complexes ribonucléoprotéiques, ce qui permettrait notamment l'identification des partenaires, protéiques ou autres, d'un ARN donné. L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples suivants qui n'ont aucune valeur limitative. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1
La figure 1 représente la structure d'un ARNt chimérique selon l'invention. La partie conservée de l'ARNt est nommée châssis ARNt. Les nucléotides indiqués entre parenthèses sont optionnels. Les nucléotides indiqués en gras et grisé correspondent aux positions conservées ou semi-conservées.
Figure 2 La figure 2 représente la structure d'un ARNtLys 3 chimérique incorporant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B humaine.
Figure 3
La figure 3 représente la structure d'un ARNtLys 3 chimérique incorporant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B humaine (à gauche) et le spectre HSQC correspondant
(à droite). Le spectre enregistré à 15°C sur un spectromètre 600 MHz Bruker Avance.
L'ARN chimérique a été dialyse contre de l'eau distillée, puis lyophilisé et enfin solubilisé dans un mélange 90% H2O/10% D2O à la concentration de 1 mmol/L (volume total environ 400 μL). La région spectrale montrée correspond aux déplacements (axes verticaux et horizontaux, ppm) des groupements NH imino impliqués dans les appariements de bases. A chaque appariement A-U ou G-C dans l'ARN correspond un pic donné. Ce spectre est une "signature" de la structure 2D et 3D de l'ARN étudié. On y retrouve les pics correspondant au châssis ARNt, d'une part, et à I1ARN epsilon, d'autre part, ce qui montre que, dans l'ARN chimérique, chacune des deux parties constituantes conserve sa structure propre. La numérotation des ribonucléotides dans le spectre HSQC correspond à celle donnée pour l'ARNt chimérique représenté.
Figure 4
La figure 4 représente des photographies de cristaux d'un ARNtLys 3 chimérique incorporant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B humaine - Cristaux obtenus par diffusion de vapeur en goutte assise, au moyen du kit Natrix® (Hampton Research) sur un robot de cristallisation CyBio HTPC. La goutte représente un volume total de 1 μL. Figure 5
La figure 5 représente le résultat de la digestion à la RNase H d'un ARNtLys 3 chimérique incorporant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B humaine. L1ARNt chimérique (environ 50 μg) est hybride à deux oligonucléotides ADN complémentaires des régions en 51 et 3' de l'ARN epsilon dans un rapport 1 :1:1 , puis incubé à 37°C en présence de RNAse H d'E. coli (10 unités/nmol ADN) dans un tampon 100 mM NaCI, 5mM MgCI2, 50 mM Tris-HCI pH 7,5. Des aliquots sont prélevés à divers temps d'incubation, puis analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-urée 16% en conditions dénaturantes. La présence d'ARN est révélée par ombrage aux ultraviolets (UV). Piste de gauche : ARNt chimérique non traité. Piste de droite : marqueur. Au centre, de gauche à droite : points de la cinétique de coupure après 1h, 2h et 3h d'incubation respectivement.
Figure 6 La figure 6 représente le résultat d'une expérience de dimérisation d'un ARNt chimérique incorporant le domaine de dimérisation de l'ARN génomique viral du VIH. L1ARNt chimérique a été incubé en présence de 100 mM NaCI, 5mM MgCI2, 50 mM Tris-HCI pH 7,5, puis déposé sur un gel d'acrylamide 8% non dénaturant (conditions natives). La migration est effectuée à 4°C pour éviter la fusion des appariements de bases. La présence des espèces d'ARN est révélée par ombrage UV. Piste de gauche : ARNt chimérique contrôle. Piste de droite : ARNt chimérique portant la séquence de dimérisation du VIH. Les deux ARN insérés dans les ARNt chimériques ayant la même taille (environ 110 ribonucléotides), la différence de migration en conditions natives traduit la formation du dimère d'ARN, via les séquences de I1ARN viral.
Figure 7
La figure 7 représente le spectre d'absorption du vert de malachite en absence et en présence d'un ARNt chimérique incorporant un aptamère de liaison au vert de malachite. Le graphe représente l'absorption (axe des ordonnées, unités arbitraires) en fonction de la longueur d'onde (axe des abscisses, en nm). Les spectres sont ceux de solutions aqueuses de vert de malachite à la même concentration (environ 100 nmol/L), en présence ou en absence d'ARNt chimérique. En présence d'ARNt chimérique portant l'aptamère spécifique du colorant, on observe une exaltation importante de l'absorption et un décalage vers le rouge du maximum. Ce déplacement n'est pas observé avec un ARNt chimérique contrôle. Ce phénomène est analogue à celui observé pour l'aptamère seul (sans châssis ARNt) et montre que son inclusion au sein de l'ARNt chimérique n'affecte pas ses propriétés fonctionnelles.
Figure 8 La figure 8 représente le résultat d'une expérience de détermination de la constante de dissociation (Kd) entre un ARNt chimérique incorporant un aptamère de liaison au vert de malachite et le vert de malachite. La courbe montre le signal de fluorescence (axe des ordonnées, unité arbitraires) émis par le colorant en fonction de la concentration d'ARNt chimérique ajouté dans la cuve du spectrophotofluorimètre (axe des abscisses, x10"7 mol/L) (longueur d'onde d'excitation = 610 nm, longueur d'onde d'émission = 645 nm). Le Kd est déterminé par ajustement non-linéaire itératif de la courbe théorique aux valeurs expérimentales mesurées.
Figure 9 La figure 9 représente la structure d'ARNtLys 3 humains chimériques incorporant des aptamères de liaison au dextran (sephadex™) (A) et à la streptavidine (B) et d'ARNtm Met chimériques incorporant des aptamères de liaison au dextran (sephadex™) (C) et à la streptavidine (D).
Figure 10
La figure 10 représente le profil électrophorétique des étapes de purification d'un ARNtLys 3 chimérique incorporant un aptamère de liaison au sephadex™. Les billes de sephadex™ ont tout d'abord été équilibrées dans un tampon A (Tris-HCI 50 mM pH 7,5 ; NaCI 100 mM ; MgCb 5 mM), mises en présence des ARN cellulaires totaux obtenus par extraction phénoiique, puis le tout a été agité pendant 30 min. à 4°C. Les billes ont été lavées trois fois à l'aide du tampon A puis les ARN comprenant un aptamère de liaison au sephadex™ ont été élues à l'aide de dextran soluble. Les différentes fractions ont ensuite été analysées par électrophorèse sur gel acrylamide- urée. De gauche à droite : ARN totaux, ARN non retenus sur les billes, lavages 1 , 2 et 3, ARN retenus sur les billes (avant élution), ARN élues par du dextran soluble.
Figure 11
La figure 11 représente la structure d'un ARNtLys3 humains chimériques incorporant un aptamère de liaison à la streptavidine et au domaine epsilon du VHB humain. EXEMPLES
Exemple 1
Production d'un ARNt chimérique comprenant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B
L'ARNtLys 3 humain a été modifié pour incorporer le domaine epsilon du virus de l'hépatite B (Figure 2).
Brièvement, un vecteur d'expression pBSTNav-Lys comprenant la séquence codante de l'ARNtLys 3 humain modifiée par insertion des sites de restriction Eag\, EcoRV et Sacll a été préparé (SEQ ID NO : 7), puis la séquence du domaine epsilon du virus de l'hépatite B humaine (SEQ ID NO : 17) a été insérée entre les sites Eag\ et Sacll pour donner le vecteur pBSTNav-Lys-epsilon.
Ce vecteur a été utilisé pour transformer des bactéries E. coli. Celles-ci ont ensuite été mises en culture dans un milieu riche (Luria-Broth, LB) en présence d'ampicilline à la concentration de 100 μg/ml, pendant 14-15 heures à 37°C. Les bactéries ont été récupérées par centrifugation (30 min. à 4000 tpm pour 1 litre de culture). Le culot a été solubilisé dans 8,6 ml d'un tampon 10 mM Mg acétate, 10 mM Tris-HCI pH 7,4. 10 ml de phénol saturé dans ce même tampon ont alors été ajoutés et le tout a été agité doucement pendant 1 h à température ambiante puis centrifugé 30 min. à 10 000 tpm. A la phase aqueuse ont alors été ajoutés 0,1 volume de NaCI 5M et 2 volumes d'éthanol pur. Le tout a été centrifugé 30 min. à 10 000 tpm (4°C) et le culot a été récupéré et solubilisé dans 5 ml de NaCI 1 M. Le solubilisât a été centrifugé 30 min à 10 000 tpm (4°C) puis le surnageant a été récupéré. 2,5 volumes d'éthanol ont alors été ajoutés et une nouvelle centrifugation 30 min à 10 000 tpm (4°C) a été effectuée. Le culot a été récupéré et dissous dans de l'eau. A partir d'un litre de culture dans du milieu LB (Luria-Broth) on obtient environ 100 mg d'ARN totaux.
Dans certains cas, les ARNt ont ensuite été purifiés sur résine échangeuse d'anion (60 mL de phase, Q-sepharose, Pharmacia). La purification s'est effectuée dans le phosphate de sodium pH 6,5 50 mM, avec un gradient allant de 500 mM à 650 mM d de NaCI sur 475 mL avec un débit de 0,5 mL/min. L1ARNt chimérique est élue après les ARNt endogènes, plus courts. Après cette étape, à partir d'1 litre de culture, en fin d'échangeuse d'ion, on obtient environ 50 mg d'ARNt chimérique (ARNtLys 3 + epsilon) purifié. L'ARNtLys 3 chimérique comprenant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B marqué à l'azote 15N en appliquant la procédure décrite ci-dessus à une culture de bactéries cultivée sur un milieu enrichi (milieu Spectra-9N, Spectra Stable Isotopes, ou équivalent), a été caractérisé par résonance magnétique nucléaire (RMN). Le spectre HSQC (corrélation simple-quantum hétéronucléaire 1H-15N) présenté dans la Figure 3 montre ainsi que le domaine epsilon est structuré conformément à sa conformation naturelle. Ceci démontre que le procédé de production d'ARN selon l'invention permet d'obtenir des ARN correctement structurés et que de surcroît les ARNt chimériques selon l'invention sont utiles pour la résolution de structures RMN de molécules d'ARN sans qu'il soit nécessaire de séparer celles-ci de l'ARNt chimérique.
Par ailleurs, l'ARNtLys 3 chimérique comprenant le domaine epsilon du virus de l'hépatite B a pu être cristallisé (Figure 4). Ceci démontre également l'intérêt du procédé de production d'ARN selon l'invention pour la résolution de structures cristallographiques. Cet intérêt est renforcé par le fait dans le cas où la structure cristallographique de l'ARNt à partir duquel est formé l'ARNt chimérique est connue, il est alors possible d'utiliser cette structure pour l'étape de phasage ou de remplacement moléculaire lors de la résolution de la structure cristallographique de l'ARNt chimérique dans son ensemble.
Enfin, le domaine espilon du virus de l'hépatite B a été séparé de I'ARNtLys 3 chimérique par digestion à la RNase H.
Brièvement, deux oligonucléotides (SEQ ID NO : 13 et 14) en solution aqueuse sont mis en présence de PARNtLys3 chimérique dans un rapport molaire 1 :1. Le mélange ainsi obtenu (environ 100 μL) est porté à 95°C en bain marie, puis après refroidissement à température ambiante on ajoute un tampon de façon à obtenir en concentration finale 100 mM NaCI, 5mM MgCI2, 50 mM Tris-HCI pH 7,5 et de la RNase H d'E. coli (10 U / nmol ADN) que l'on laisse agir à 37°C pendant 4 heures. Le résultat de la digestion est présenté dans la Figure 5.
De la même manière que ci-dessus, un vecteur d'expression pBSTNav-Met comprenant la séquence codante de IΑRNtm Met d'Escherichia coli modifiée par insertion des sites de restriction Eag\, EcoRV et Sacll a été préparé (SEQ ID NO : 8), puis la séquence du domaine epsilon du virus de l'hépatite B (SEQ ID NO : 17) a été insérée entre les sites Eagl et Sacll pour donner le vecteur pBSTNav-Met-epsilon. Exemple 2
Production d'un ARNt chimérique comprenant le site de dimérisation génomique du virus de l'immunodéficience humaine (VIH)
Le site de dimérisation génomique du VIH a été inséré au sein de l'ARNtLys 3 humain ou de IΑRNtm Met d'Escherichia coli, comme cela a été décrit dans l'Exemple 1. respectivement par insertion d'un ADN codant le site de dimérisation (SEQ ID NO : 18) dans les vecteurs d'expression pBSTNav-Lys (SEQ ID NO : 7) et pBSTNav-Met (SEQ ID NO : 8) après coupure par les enzymes de restriction Eag\ et Sacll. Le procédé de production de I1ARNt chimérique correspondant et les rendements sont analogues à ceux de l'Exemple 1.
La fonctionnalité du site de dimérisation de TARN génomique du VIH au sein du châssis formé par l'ARNt a été contrôlée par électrophorèse en gel natif 8% acrylamide en absence d'urée, à 4°C (Figure 6). Dans ces conditions, on observe la migration d'une espèce correspondant au double de la taille attendue pour l'ARNt chimérique, ce qui démontre la formation du dimère et donc le caractère fonctionnel de la séquence d'ARN viral insérée dans le châssis ARNt
Exemple 3 Production d'un ARNt chimérique comprenant un aptamère de liaison au vert malachite
Un aptamère de liaison au vert de malachite a été inséré au sein de l'ARNtLys 3 humain, comme cela a été décrit dans l'Exemple 1. par insertion d'un ADN codant l'aptamère (SEQ ID NO : 19) dans le vecteur d'expression pBSTNav-Lys (SEQ ID NO : 7) après coupure par les enzymes de restriction Eag\ et Sacll. Le procédé de production de l'ARNt chimérique correspondant et les rendements sont analogues à ceux de l'Exemple 1.
La fonctionnalité de l'aptamère a été contrôlée en vérifiant que l'ARNt chimérique était bien capable de lier le vert de malachite - la liaison du colorant à l'aptamère se traduisant par une augmentation de son coefficient d'extinction molaire (Figure 7). La constante de dissociation de l'ARNt chimérique selon l'invention pour le vert malachite a été estimée à 50.10"9 mol/L (Figure 8). ce qui est semblable à la valeur mesurée pour l'aptamère seul. Avantageusement, les ARNt chimériques comprenant un aptamère selon l'invention peuvent donc être utilisés directement comme aptamère, sans qu'il soit nécessaire de cliver le châssis ARNt.
Exemple 4 Production d'un ARNt chimérique comprenant une portion de l'ARNr 16S d'E. coli
Une partie de l'ARNr 16S d'E. coli a été insérée au sein de l'ARNtLys 3 humain comme cela a été décrit dans l'Exemple 1, par insertion d'un ADN codant la portion d'ARNr (SEQ ID NO : 20) dans le vecteur d'expression pBSTNav-Lys (SEQ ID NO : 7) après coupure par les enzymes de restriction Eag\ et Sacll.
Cet ARNt chimérique est utile, par exemple pour cribler des composés antibiotiques agissant sur cette région du ribosome bactérien, comme par exemple les aminoglycosides et leurs analogues.
Exemple 5
Production d'un ARNt chimérique comprenant un aptamère de liaison à la streptavidine ou au sephadex™
Un aptamère de liaison à la streptavidine a été inséré au sein de l'ARNtLys 3 humain ou de l'ARNtm Met d'Escherichia coli, comme cela a été décrit dans l'Exemple 1, respectivement par insertion d'un ADN codant l'aptamère (SEQ ID NO : 21) dans le vecteur d'expression pBSTNav-Lys (SEQ ID NO : 7) et pBSTNav-Met (SEQ ID NO : 8) après coupure par les enzymes de restriction Eag\ et Sacll, pour donner pBSTNav-Lys- strepta et pBSTNav-Met-strepta (voir Figure 9). De même, un aptamère de liaison au sephadex™ (billes de dérivé de dextran commercialisées par Pharmacia) a été inséré au sein de l'ARNtLys 3 humain ou de l'ARNtm Met d'Escherichia coli, comme cela a été décrit dans l'Exemple 1 , respectivement par insertion d'un ADN codant l'aptamère (SEQ ID NO : 22) dans le vecteur d'expression pBSTNav-Lys (SEQ ID NO : 7) et pBSTNav-Met (SEQ ID NO : 8) après coupure par les enzymes de restriction Eag\ et Sacll, pour donner pBSTNav-Lys- sepha et pBSTNav-Met-sepha (voir Figure 9).
La fonctionnalité de l'ARNtLyS 3 comprenant un aptamère de liaison au sephadex™ est présentée à titre d'exemple. Pour ceci, une solution d'ARN obtenue après extraction au phénol comme cela est présenté dans l'Exemple 1 , a été directement purifiée à l'aide de billes de sephadex™.
Brièvement, les billes de sephadex™ ont tout d'abord été équilibrées dans un tampon A (Tris-HCI 50 mM pH 7,5 ; NaCI 100 mM ; MgCI2 5 mM), mise en présence des ARN, puis le tout a été agité pendant 30 min. à 40C. Les billes ont été lavées trois fois à l'aide du tampon A puis les ARN comprenant un aptamère de liaison au sephadex™ ont été élues à l'aide de dextran soluble (Sigma-AIdrich). Les résultats de cette purification sont présentés Figure 10.
Par ailleurs, deux sites de restriction Sa/I et Aatïï ont été insérés dans la partie correspondant à la séquence codant l'aptamère ce qui permet de fournir un système complet de production et de purification d'ARN constitué des vecteurs pBSTNav-Lys- sepha, pBSTNav-Met-sepha, pBSTNav-Lys-strepta et pBSTNav-Met-strepta (SEQ ID NO : 9 à 12). Plusieurs ARN ont ainsi été exprimés à l'aide de ce système, notamment le domaine epsilon du virus de l'hépatite B (VHB) humain (SEQ ID NO : 23) (Figure 11), le domaine epsilon du HBV de canard (SEQ ID NO : 24), et le domaine d'interaction de I1ARN ribosomique 23S avec la protéine ribosomique L20 (SEQ ID NO : 25), ce dernier ARN étant notamment utile pour le criblage d'antibiotiques dirigés contre le ribosome bactérien.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un acide nucléique codant un ARN de transfert (ARNt) chimérique, lequel ARNt chimérique provient de la modification d'un ARNt par insertion d'un ARN dans la tige-boucle de l'anticodon dudit I1ARNt et/ou par substitution de tout ou partie de la tige boucle de l'anticodon dudit l'ARNt par un ARN, pour la production dudit ARN, ou d'une partie dudit ARN, dans une cellule procaryote.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle l'ARN substitue tout ou une partie de la tige-boucle de l'anticodon comprise entre le premier ribonucléotide, inclus, de la tige-boucle de l'anticodon et le dernier ribonucléotide, inclus, de la tige-boucle de l'anticodon.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'ARNt chimérique présente la formule (I) suivante:
A C C
' N-N72 X-Z X-Z X-Z
(I) dans laquelle :
- A représente l'adénine ou un de ses analogues, C représente la cytosine ou un des ses analogues, G représente la guanosine ou un de ses analogues et U représente l'uridine ou un de ses analogues,
- chacun des N, identiques ou différents, représente un ribonucléotide quelconque,
- chacun des (N), identiques ou différents, représente un ribonucléotide quelconque, qui peut être présent ou absent, - R représente A ou G, ou leurs analogues, - Y représente U ou C, ou leurs analogues
- chacun des X-Z, identiques ou différents, représente une paire A-U, U-A, G-C, C-G, G-U ou U-G, ou leurs analogues,
- les ribonucléotides N en position 1 et N en position 72 peuvent être appariés ou non, - Ri représente une séquence de 3 à 20 ribonucléotides,
- R2 représente l'ARN inséré, à savoir une séquence de 6 à 300 ribonucléotides.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'ARNt est sélectionné parmi le groupe constitué des ARNt d'archée, de bactérie, de virus, de protozoaire, de champignon, d'algue, de plante ou d'animal.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle tout ou partie de l'ARN est choisi dans la liste constituée d'un ARN antisens, d'un ARN interfèrent, d'un aptamère, d'un ribozyme, d'un ARN viral, d'un ARN ribosomique, et d'un ARN nucléolaire.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle l'ARN est structuré.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle l'ARN comprend une étiquette de purification.
8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle l'étiquette de purification est choisie dans le groupe constitué d'un ribozyme ou d'un aptamère.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'ARNt chimérique présente l'une des formules suivantes :
A A C C C C G A
G-C G-C C-G G-C C-G C-G C-G U-A G-C A-U
C <-
U GA A τ ψ C
dans lesquelles :
- D représente la dihydrouridine,
- T représente la ribothymidine,
- Ψ représente la pseudouridine,
- m7G représente la 7-méthyl-guanine, - V7 représente la 3-(3-amino-3-carboxypropyl)-uridine, - R3 représente une séquence de 6 à 300 ribonucléotides.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle l'acide nucléique est compris dans un vecteur d'expression comprenant un promoteur et un terminateur liés de manière opérationnelle à l'acide nucléique, ainsi qu'une origine de réplication et un marqueur de sélection.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle l'ARNt chimérique ne comprend pas la tige de l'anticodon substantiellement intacte de l'ARNt dont il provient.
12. ARNt chimérique tel que défini dans la revendication 11.
13. Acide nucléique codant pour un ARNt chimérique tel que défini dans la revendication 12.
14. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini dans la revendication 13, un promoteur et un terminateur, liés de manière opérationnelle à l'acide nucléique, ainsi qu'une origine de réplication et un marqueur de sélection.
15. Cellule comprenant un acide nucléique tel que défini dans la revendication 13 ou un vecteur d'expression tel que défini dans la revendication 14.
16. Acide nucléique adapté à la préparation d'un acide nucléique tel que défini dans la revendication 13, comprenant, dans le sens 5'-3', au moins : (i) une séquence codant pour une partie d'un ARNt s'étendant de l'extrémité 5' dudit
ARNt au ribonucléotide précédant le premier ribonucléotide de la tige de l'anticodon ou à un ribonucléotide de la tige ou de la boucle de l'anticodon ;
(ii) éventuellement une séquence codant pour tout ou partie d'une étiquette de purification ; (iii) au moins un site de coupure d'une enzyme de restriction ;
(iv) éventuellement une séquence codant pour tout ou partie d'une étiquette de purification ;
(v) une séquence codant pour une partie de l'ARNt s'étendant d'un ribonucléotide de la tige ou de la boucle de l'anticodon en aval du ribonucléotide de (i) ou du ribonucléotide suivant le dernier ribonucléotide de la tige de l'anticodon à l'extrémité 3' dudit ARNt. sous réserve que la séquence du deuxième acide nucléique dans son ensemble ne soit pas la séquence codante de l'ARNt.
17. Acide nucléique selon la revendication 16, dont la séquence est choisie parmi le groupe constitué de :
- SEQ ID NO : 1 ;
- SEQ ID NO : 2 ; - SEQ ID NO : 3 ;
- SEQ ID NO : 4 ; - SEQ ID NO : 5 ;
- SEQ ID NO : 6.
18. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini dans la revendication 16 ou 17, un promoteur et un terminateur, liés de manière opérationnelle à l'acide nucléique, ainsi qu'une origine de réplication et un marqueur de sélection.
19. Vecteur d'expression selon la revendication 18, dont la séquence est choisie parmi le groupe constitué de :
- SEQ ID NO 7 ; - SEQ ID NO 8 ;
- SEQ ID NO 9 ;
- SEQ ID NO 10 ;
- SEQ ID NO 11 ; - SEQ ID NO 12.
20. Procédé de production d'un ARN dans lequel :
- on cultive des cellules procaryotes transformées par un acide nucléique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 11 ;
- on récupère l'ARNt chimérique à partir des cellules cultivées ou du surnageant de culture des cellules cultivées,
- éventuellement on clive l'ARNt chimérique pour récupérer l'ARN à produire sous forme isolée.
21. Kit destiné à la production d'un ARN à l'aide d'un ARNt chimérique le comprenant, lequel kit comprend au moins : - un vecteur d'expression tel que défini dans la revendication 18 ou 19 ;
- un moyen de clivage d'un ARNt chimérique permettant de libérer l'ARN à produire ;
- éventuellement au moins une enzyme de restriction coupant au niveau du site de restriction défini dans la revendication 16 ; - éventuellement des cellules aptes à être transformées par un acide nucléique et à produire un ARNt chimérique.
22. Kit selon la revendication 21 , dans lequel le vecteur d'expression est un plasmide bactérien et les cellules sont des bactéries.
23. Kit selon la revendication 21 ou 22, dans lequel le moyen de clivage est constitué de RNase H et de deux oligonucléotides complémentaires respectivement à une partie de la séquence de PARNt chimérique précédant l'extrémité 5' de l'ARN à produire et à une partie de la séquence de l'ARNt chimérique suivant l'extrémité 3' de l'ARN à produire.
24. Kit selon la revendication 23, dans lequel :
- les bactéries sont de type Escherichia coli ;
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 7 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 8 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 9 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, ou - le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 10 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 11 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, ou
- le vecteur d'expression est représenté par SEQ ID NO : 12 et les oligonucléotides sont représentés par SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16.
25. Utilisation d'un ARNt chimérique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 11 , pour résoudre la structure tridimensionnelle de l'ARN inséré ou substitué, en appliquant la technique de la résonance magnétique nucléaire à une solution de l'ARNt chimérique ou en appliquant la technique de la diffraction aux rayons X à des cristaux de PARNt chimérique.
26. Utilisation in vitro ou ex vivo d'un ARNt chimérique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 11 , en tant qu'ARN interfèrent ou aptamère lorsque l'ARN inséré ou substitué est respectivement un ARN interfèrent ou un aptamère.
27. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active au moins un ARNt chimérique tel que défini dans la revendication 11 , en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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