EP1996522A2 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung von glaspipetten oder glaskapillaren - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur herstellung von glaspipetten oder glaskapillaren

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Publication number
EP1996522A2
EP1996522A2 EP07723536A EP07723536A EP1996522A2 EP 1996522 A2 EP1996522 A2 EP 1996522A2 EP 07723536 A EP07723536 A EP 07723536A EP 07723536 A EP07723536 A EP 07723536A EP 1996522 A2 EP1996522 A2 EP 1996522A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
glass
glass pipette
pipette
radiation field
heat radiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07723536A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Albrecht Lepple-Wienhues
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flyion GmbH
Original Assignee
Flyion GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Flyion GmbH filed Critical Flyion GmbH
Publication of EP1996522A2 publication Critical patent/EP1996522A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03B—MANUFACTURE, SHAPING, OR SUPPLEMENTARY PROCESSES
    • C03B23/00—Re-forming shaped glass
    • C03B23/04—Re-forming tubes or rods
    • C03B23/07—Re-forming tubes or rods by blowing, e.g. for making electric bulbs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
    • C03B—MANUFACTURE, SHAPING, OR SUPPLEMENTARY PROCESSES
    • C03B23/00—Re-forming shaped glass
    • C03B23/04—Re-forming tubes or rods
    • C03B23/045—Tools or apparatus specially adapted for re-forming tubes or rods in general, e.g. glass lathes, chucks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the invention relates to a method for the production of glass pipettes or glass capillaries and a device for the production of glass pipettes or glass capillaries.
  • the pipettes or capillaries are intended in particular for performing patch-clamp experiments.
  • lipid membrane As is known, the interior of living cells is surrounded by a lipid membrane which seals off the processes inside the cell from the outside environment. These lipid membranes are largely impermeable to charged particles. For this purpose, special transport proteins embedded in the membranes transport the charged particles (ions) through the membrane. These transport proteins thus form the basis for a variety of physiological functions.
  • the patch-clamp technique allows the direct measurement of currents generated by the ion transporters in the membrane with high temporal resolution.
  • the resulting advantages are known. For example, it is possible to determine directly the effect of signal molecules or pharmacologically active substances on a target protein.
  • the patch-clamp technique allows precise control of the electrical and chemical environment of a membrane and also allows the application of signal molecules, pharmacologically active substances, etc. to both sides of a membrane.
  • the patch-clamp technique is known in the art and is widely used, it should be dispensed with further basic embodiments.
  • the usual procedure in the patch-clamp technique is to mechanically approximate a glass capillary or glass (micro-) pipette of a cell and thus of its cell membrane and to fix it there by suction. This leads to an electrically dense connection between the cell membrane and the tip of the pipette.
  • This electrically sealed connection is a prerequisite for a high-resolution, low-noise measurement of small and very small currents.
  • the electrically sealed connection is often referred to as a "seal.”
  • a so-called “gigaseal” is required; H. an electrically sealed connection in which the electrical resistance reaches the gigaohm range.
  • resistors of 10 G ohms and above are needed to assure that even small ions such as protons do not pass uncontrollably between cell membrane and glass surface.
  • the glass pipettes or glass capillaries used for prior art patch clamp experiments typically have a cone-shaped tip and a portion adjacent to this tip that is substantially tube-shaped.
  • Such pipettes or capillaries are generally produced by conventional glass blowing technology. by drawing (pulling) glass tubes after or at melting of the area where the conical constriction and tip is to be created.
  • Such pipettes or capillary tubes with conical tip are then used both for those techniques in which the glass capillary is introduced from the outside to the cell membrane, and in those techniques in which the cell is fixed inside the capillary to form a gigaseal.
  • the object of the invention is to provide a new method by means of which glass pipettes or glass capillaries can be produced.
  • this should make new pipettes or capillaries accessible, which can be advantageously used in the case of patch pipettes.
  • Clamp techniques can be used in which the cell or corresponding biological structure is fixed inside the capillary to form a Gigaseals.
  • a glass pipette or glass capillary having a cone-shaped tip and a substantially tubular portion adjoining the tip is fixed in a holding device.
  • the fixed glass pipette is placed in the heat radiation field of a heater. This is preferably done so that the fixed glass pipette is moved by means of a positioning in the heat radiation field of the heater.
  • the glass pipette is softened, in particular melted, at least in the region of the tip, in particular in the region of the base surface of the cone, and optionally also in the part of the tube-shaped section adjoining the tip. This softening is preferably carried out in sections. Before softening and / or in the softened state, the interior of the glass pipette and thus also its softened area is subjected to a gas pressure. This results in that the
  • Jump-shaped should mean here that the enlargement / enlargement of the diameter takes place over a short length, in particular over a length of less than 150 ⁇ m.
  • the diameter in particular from a value of less than 50 ⁇ m at the base surface, should be extended to a diameter of at least 100 ⁇ m in the tubular section of the glass pipette.
  • the thus expanded glass pipette is removed from the heat radiation field of the heater again, preferably the Glass pipette is moved with the help of the positioning of the heat radiation field.
  • the method according to the invention is designed in such a way that the sudden enlargement of the diameter of the glass pipette is controlled and preferably also controlled by means of an optical observation device.
  • a cone is known to be a structure that has the shape of a cone or truncated cone. Accordingly, in the invention, the pipette / capillary has a tip with the shape of such a cone. Due to its production process (usually pulling / pulling from a capillary), this tip is not geometrically exactly conical in shape, but can essentially be described by such a cone shape. Since the tip is necessarily open, d. H. is not closed, it will be in the case of the invention is usually a cone in the form of a truncated cone.
  • a truncated cone is a body of revolution that results from cutting a smaller cone from a straight circular cone parallel to the base surface.
  • two parallel circular surfaces of which one designates the larger as the base surface and the smaller than the top surface. If this is again transferred to the case of the present invention, the cone of the tip with its (larger) base surface adjoins the tubular portion at the pipette / capillary.
  • the claimed method of the invention has the advantage that compared to the prior art, a much more pronounced, jump-shaped widening of the diameter of the capillary / pipette can be achieved, starting from the point at which the cell at is fixed to the corresponding patch clamp measurements inside the capillary / pipette, towards the tubular portion of the larger diameter capillary / pipette.
  • This is done according to the invention in that a larger part of the pipette, preferably by section-wise melting and widening successively, in diameter is increased.
  • the desired expanded contour of the pipette can be achieved over a length which is greater than the extent of the heat radiation field.
  • the measure according to the invention preferably to provide a radial heat radiation field, also contributes to the success of the method according to the invention.
  • the process procedure described has the further advantage that the diameter enlargement desired for the glass pipettes and glass capillaries can be observed in a defined manner under optical control and optionally controlled.
  • the glass pipette or glass capillary to be processed directly from a device for pulling such glass pipettes is transferred to the holding device. In this way it is ensured that freshly drawn (freshly gepullte) capillaries (further) are processed by the method according to the invention. Under certain circumstances, it is also advantageously possible to use the same holding device for pulling the glass pipettes, which is also used to fix the pipette for the method according to the invention.
  • the fixed glass pipette is introduced into the heat radiation field of a heating device.
  • the advantageous embodiment of the heater will be explained later in connection with the device according to the invention.
  • the holding device is introduced by means of the positioning device for introducing the fixed glass pipette into the heat radiation field only in one spatial direction (eg x-direction) must be moved.
  • the glass pipette is usually set in the holding device such that the movement in the x-direction corresponds to a movement in the axial direction (longitudinal direction) of the glass pipette.
  • the movement in the x-direction is expedient anyway and usually provided, as with this movement (syakkeit) and the introduction and removal (replacement) of the pipette is accomplished in the holding device.
  • the abovementioned embodiments also apply accordingly to the removal of the expanded glass pipette from the heat radiation field of the heating device.
  • the glass pipette can cool down.
  • the cooling can be accelerated, preferably by blowing with air, for example through a cooling valve.
  • the interior of the glass pipette is subjected to a gas pressure, so that the desired extension of the diameter of the pipette occurs. It is basically preferred if the interior of the pipette is subjected to a continuous (constant) gas pressure.
  • a proportional valve may be provided. This pressurization can take place before and / or during the softening / melting of the glass pipette.
  • pressure pulses wherein both the duration of the pressure pulses and the pauses between individual pressure pulses can be varied. It is also possible to change the pressure values of individual pressure pulses. With all these measures, a more targeted procedure is possible.
  • the pressures in the invention are between 0.1 and 10 bar (10 to 1,000 KPa). Prints in the Order of 1 bar (100 KPa) are preferred. Usually, air is used as the gas.
  • the jump-like widening of the diameter of the glass pipette is controlled by means of an optical observation device.
  • an optical observation device for this purpose, a wide variety of parameters of the optically imaged shape of the pipette can be selected. In principle, such an entire contour line of a glass pipette can be observed during the process.
  • the (foremost) tip of the cone is not necessarily chosen as the starting point or point of origin for these measurements.
  • At (fixed) distance from this "zero position" at least one diameter of the glass pipette can be followed before, during or after the expansion of the pipette with the gas pressure
  • the length of the tip between the base surface and the top surface of the cone it has also been found to be advantageous in the case of the length of the tip between the base surface and the top surface of the cone to be determined before, during and after the expansion, the location of the top surface of the cone being in accordance with the location of the foremost one
  • the value of the length of the tip together with at least one diameter at a distance from the foremost point, preferably with the three diameter values is determined in this way Control of the geometry of the expanded pipette available.
  • the invention also encompasses a device for the production of glass pipettes or glass capillaries, which are provided in particular for patch clamp experiments, with the following devices: a holding device for fixing the glass pipette. a heating device for softening, in particular melting, regions of the glass pipette with the aid of a heat radiation field. a positioning device for controlled movement and positioning of the glass pipette at least in its axial direction with respect to the heating device. Preferably, the holding device is moved by means of this positioning device. a device for defined loading of the interior of the glass pipette with a gas pressure. an observation device for optically observing the glass pipette, in particular the region of the tip of the Glaspipet- te, during the heating and during the application of the following devices: a holding device for fixing the glass pipette. a heating device for softening, in particular melting, regions of the glass pipette with the aid of a heat radiation field. a positioning device for controlled movement and positioning of the glass pipette at
  • Glass pipette with gas pressure a control / control device for selecting and influencing the parameters of the method carried out with the device, in particular for influencing the temperature in the heating device, the gas pressure and the movement (in particular in the axial direction of the pipette) of the positioning device.
  • the holding device is a clamping device for the pipette or capillary.
  • the pipette can be fixed in a simple manner in the holding device and remove it again.
  • the glass pipette in the invention is preferably in the holding device pressure-tight fixable.
  • any suitable heating device for generating heat radiation can be used to generate a heat radiation field.
  • This may be, for example, a gas flame (eg acetylene flame) or an infrared laser.
  • the heating device is a so-called heating filament.
  • Such heating filaments are known to the person skilled in the art.
  • the heating device in particular the Schufilament, substantially annular or U-shaped forms, so that it accordingly surrounds the glass pipette at least partially on its outer circumference.
  • the heating device in particular the Schufilament, substantially annular or U-shaped forms, so that it accordingly surrounds the glass pipette at least partially on its outer circumference.
  • the heater allows a clear view of the optical detection on the pipette. This can be achieved in particular in that the heating device or the Schufilament is tilted against the longitudinal direction of the glass pipette. This is preferably done at an angle of about 45 °.
  • the heating device is designed such that its heating power is current-controlled. This allows a particularly simple change of the heat radiation field when softening the glass pipette.
  • the device for defined loading of the interior of the glass pipette is formed with a gas pressure, preferably for continuous pressurization.
  • a gas pressure preferably for continuous pressurization.
  • this has a proportional valve for controllable continuous pressurization.
  • optical observation devices for optical observation of the glass pipette during melting and pressurization with gas pressure basically all possible optical observation devices can be used, for example, those with CCD or CMOS technology.
  • an observation device is used in the invention, which can be described as a measuring microscope with CCD camera. So it is a magnifying lens, for example, with 10x magnification, used, which is combined with a CCD camera.
  • This camera can be designed as a grayscale camera.
  • This observation device is focused on the tip of the pipette, wherein expediently an automatic focusing device is provided.
  • the control / monitoring device in the device according to the invention preferably comprises an image processing system, with the help of which the change of the .Oußenkontur the pipette can be followed during the heating and during the pressurization.
  • a recording of the corresponding image sequence can also be provided.
  • the device according to the invention may also comprise a device for drawing glass pipettes or glass capillaries. In this way it is possible to introduce freshly drawn pipettes or capillaries directly into the device according to the invention.
  • FIG. 2 shows a pipette or capillary which can be produced with the method according to the invention and the device according to the invention in a schematic representation.
  • the schematic diagram of FIG. 1 shows, on the one hand, some essential components of the device according to the invention and, on the other hand, a rough course of the method according to the invention.
  • a glass pipette or glass capillary 1 is shown, which is fixed in a holding device 2 (clamping device).
  • the holding device 2 is provided with a positioning device (not shown), by means of which the capillary 1 fixed in the holding device 2 in the x direction, i. H. in the axial direction of the capillary 1 is movable.
  • FIG. 1 shows a heating device 3 in the form of a U-shaped heating filament which can generate a radially homogeneous heat radiation field for softening or melting the capillary 1.
  • an observation device 4 is provided in Fig. 1, which consists of a lamp 5, a microscope lens 6 and a CCD camera 7. With the aid of this movable observation device 4, the pipette 1 is observable during the softening / melting process and during the pressurization of the pipette with gas pressure. To ensure this, the heating filament is tilted by approx. 45 ° to the direction of observation.
  • FIG. 1 Further details of a device according to the invention are not shown in FIG. 1, in particular not the device for defined loading of the interior of the glass pipette with a gas pressure and possibly existing control and monitoring devices.
  • FIG. 1 The sequence of the method according to the invention is also indicated schematically in FIG. 1, wherein the shape and approximate position of the capillary 1 in the process stages I 1 II, III and IV is shown.
  • this first section is that in the process control, which (with respect to the capillary) farthest from the top of the capillary.
  • the softened / melted first capillary section is widened by the gas pressure.
  • the next (second) capillary section is moved into the heat radiation field by appropriate movement of the capillary in the x-direction.
  • This next (second) capillary section is closer to the top of the capillary than the first, already expanded capillary section.
  • the glass of the capillary is also softened or melted at the second capillary section, a corresponding widening takes place here as well, due to the continuously existing gas pressure, which is likewise optically controlled again. This is shown schematically in process stage III in FIG. 1.
  • the procedure according to the invention is such that the gas pressure is kept constant throughout the process.
  • the energy content of the heat radiation field can be varied (for example by controlling the current of the heating filament used).
  • the closer the section is to the tip of the capillary the lower the energy content / heating power used. This is because the wall thickness of the glass capillary usually decreases towards the tip.
  • a fourth and last method step is shown in FIG. 1, in which the region of the tip of the capillary itself is widened.
  • that capillary section which is closest to the tip or comprises this tip is introduced into the heat radiation field by movement in the x direction and is widened by the constant gas pressure still applied.
  • the final characteristic shape of the pipette / capillary with the sudden expansion of the diameter of the base surface of the remaining cone-shaped tip towards the substantially tubular portion of the pipette / capillary.
  • FIG. 2 shows the shape and dimensions of an exemplified glass pipette or glass capillary, as used with the invention
  • Characteristic is the sudden widening of the diameter diameter of the capillary between the region of the cone-shaped tip and the adjoining this tip substantially tubular portion of the capillary.
  • FIG. 2 also shows four values as determined for controlling and controlling the sudden enlargement of the diameter in the production of such pipettes or capillaries in the method according to the invention.
  • the original position (zero position) is selected at the (foremost) tip of the cone.
  • the four values that are determined are then the length of the peak between zero position / original position (on the top surface of the cone) and the base surface of the cone.
  • the diameter values in the tubular section are determined at three (predetermined) points.
  • the three diameter values in the tubular section are 138.9 ⁇ m, 169.0 ⁇ m and 189.0 ⁇ m. It goes without saying that these are merely exemplary values which in no way limit the subject matter of the present invention.

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Abstract

Bei einem Verfahren zur Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren wird eine Pipette oder Kapillare (1), die eine konusförmige Spitze und einen sich an die Spitze anschließenden röhrchenförmigen Abschnitt aufweist, in einer Halteeinrichtung (2) fixiert, die fixierte Glaspipette (1) wird in das Wärmestrahlungsfeld einer Heizeinrichtung (3) eingebracht, die Glaspipette wird mindestens im Bereich der Spitze erweicht, - das Innere der Glaspipette wird mit einem Gasdruck beaufschlagt, derart, daß sich der Durchmesser der Pipette zwischen der Basisfläche des Konus und dem röhrchenförmigen Abschnitt sprungförmig über eine geringe Länge erweitert, die so aufgeweitete Glaspipette (1) aus dem Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung (3) entfernt, und die sprungförmige Erweiterung des Durchmessers der Glaspipette (1) mit Hilfe einer optischen Beobachtungseinrichtung (4) kontrolliert und vorzugsweise gesteuert wird. Entsprechend besteht eine Vorrichtung für die Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren (1) aus einer Halteeinrichtung, einer Heizeinrichtung, einer Positioniereinrichtung, einer Einrichtung zur Druckbeaufschlagung, einer Beobachtungseinrichtung und einer Steuerungs-, Kontrolleinrichtung.

Description

Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Glaspipetten oder Glas- kapillaren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glaspipetten o- der Glaskapillaren sowie eine Vorrichtung für die Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren. Dabei sind die Pipetten oder Kapillaren insbesondere zur Durchführung von Patch-Clamp-Experimenten vorgesehen.
Bekanntlich ist das Innere lebender Zellen von einer Lipidmembran umgeben, die die Abläufe im Inneren der Zelle gegenüber der äußeren Umgebung abschottet. Diese Lipidmembranen sind für geladene Teilchen weitgehend undurchlässig. Dafür übernehmen spezielle Transport- proteine, die in die Membranen eingelagert sind, den Transport der geladenen Teilchen (Ionen) durch die Membran hindurch. Diese Transportproteine bilden somit die Basis für eine Vielzahl von physiologischen Funktionen.
Die zellbiologische Forschung wurde revolutioniert durch die sogenannte Patch-Clamp-Methode, die von Sakmann und Neher 1981 entwickelt wurde. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt die direkte Messung von Strömen, die durch die lonentransporter in der Membran erzeugt werden, mit hoher zeitlicher Auflösung. Die daraus resultierenden Vorteile sind be- kannt. So kann man beispielsweise die Wirkung von Signalmolekülen oder pharmakologisch aktiven Substanzen auf ein Targetprotein direkt feststellen. Außerdem erlaubt es die Patch-Clamp-Technik, die elektrische und chemische Umgebung einer Membran exakt zu kontrollieren und ermöglicht auch die Anwendung von Signalmolekülen, pharmakolo- gisch aktiven Substanzen usw. auf beide Seiten einer Membran. In Anbetracht der Tatsache, daß die Patch-Clamp-Technik dem Fachmann bekannt ist und vielfach angewendet wird, soll hier auf weitere grundsätzliche Ausführungen verzichtet werden.
Die übliche Vorgehensweise bei der Patch-Clamp-Technik ist es, eine Glaskapillare oder Glas(mikro-)pipette einer Zelle und damit ihrer Zellmembran mechanisch anzunähern und dort durch Ansaugen zu fixieren. Dies führt zu einem elektrisch dichten Verbund zwischen Zellmembran und Spitze der Pipette. Diese elektrisch dichte Verbindung ist eine Vor- aussetzung für eine hochauflösende rauscharme Messung kleiner und kleinster Ströme. Die elektrisch dichte Verbindung wird häufig auch als „seal" bezeichnet. Um vernünftige Patch-Clamp-Messungen durchzuführen, ist ein sogenanntes „Gigaseal" erforderlich, d. h. eine elektrisch dichte Verbindung, bei der der elektrische Widerstand den Gigaohm- Bereich erreicht. Üblicherweise benötigt man Widerstände von 10 Giga- ohm und mehr, um zu gewährleisten, daß auch kleine Ionen wie Protonen nicht unkontrolliert zwischen Zellmembran und Glasoberfläche hindurchtreten.
Die beschriebene Patch-Clamp-Technik mit der Kontaktierung der Glaspipette auf die Zellmembran „von außen" wurde in der Vergangenheit mit Vorteil dadurch abgewandelt, daß die Zelle oder entsprechende biologische Struktur in das Innere einer Glaskapillare oder Glas(mikro-)pi- pette eingebracht wurde. Bezüglich der genauen Vorgehensweise wird hierzu auf die WO 02/10747 A2 verwiesen. Die damit erreichten Vorteile lassen sich ebenfalls dieser Offenlegungsschrift entnehmen.
Die Glaspipetten oder Glaskapillaren, die für Patch-Clamp-Experimente des Standes der Technik verwendet werden, besitzen in der Regel eine konusförmige Spitze und einen sich an diese Spitze anschließenden Abschnitt, der im wesentlichen röhrchenförmig ist. Solche Pipetten oder Kapillaren werden in der Regel durch übliche Glasbläsertechnik herge- stellt, nämlich durch das Ziehen (Pullen) von Glasröhrchen nach oder bei Aufschmelzung des Bereichs, an dem die konusförmige Verengung und Spitze erzeugt werden soll. Derartige Pipetten oder Kapillaren mit konusförmiger Spitze werden dann sowohl für diejenigen Techniken ver- wendet, bei denen die Glaskapillare von außen an die Zellmembran herangeführt wird, als auch bei denjenigen Techniken, bei denen die Zelle im Inneren der Kapillare unter Ausbildung eines Gigaseals fixiert wird.
Bei den letztgenannten Techniken (Fixierung der Zelle im Inneren der Kapillare) kann es dann zu Schwierigkeiten kommen, wenn im Inneren der Kapillare ein, insbesondere rascher, Austausch der dort enthaltenen Lösungen erforderlich wird. Wie erwähnt, soll bei Patch-Clamp-Experi- menten häufig die Wechselwirkung der Membranproteine und/oder des Inneren der Zelle mit von außen an die Membran herangebrachten Wirkstoffen oder Wirkstoffkandidaten untersucht werden. Dieses Heranbringen der entsprechenden Substanzen an die Membran soll grundsätzlich möglichst rasch erfolgen. Bei chemisch gesteuerten Vorgängen an der Membran ist dies häufig sogar zwingend erforderlich.
Aufgrund ihrer Form und Geometrie sind die bisher bekannten Pipetten und Kapillaren für einen solchen raschen Lösungswechsel bzw. für ein rasches Heranbringen von Wirkstoffen oder Wirkstoffkandidaten an die Zellmembran nicht optimal. Bei den Patch-Clamp-Techniken, bei denen die Zelle im Inneren der Kapillare fixiert wird, wollte man ja gerade, zumindest an der Stelle der Fixierung, eine möglichst enge Form der Kapillare bzw. des Konus bereitstellen.
Es ist zwar aus der Veröffentlichung von Miriam B. Goodman und Shawn R. Lockery (Journal of Neuroscience Methods 100 (2000), Seiten 13 bis 15) bekannt, die Spitzen von Pipetten durch sogenanntes „pressure polishing" zu bearbeiten. Dort wird die Spitze einer üblichen Kapilla- re oder Pipette mit Hilfe eines Gasdrucks erweitert. Dazu wird ein V-förmiges Filament, das als punktförmige Heizquelle wirkt, mit seiner Spitze auf die Spitze der Glaspipette gerichtet. Durch das erzeugte im wesentlichen kugelförmige Wärmestrahlungsfeld wird lediglich die unmittelbare Spitze der Pipette aufgeschmolzen und aufgeweitet. Der so erhaltene erweiterte Abschnitt am Konus der Pipette erreicht dadurch maximal einen Durchmesser von ca. 30 bis 35 μm und ist deshalb für eine Anwendung bei Techniken, die die Zelle im Inneren der Kapillare/Pipette fixieren, nicht geeignet. Dementsprechend beschäftigt sich die genannte Veröffentlichung auch ausschließlich mit den üblichen Patch-Clamp- Techniken, bei denen die Glaskapillare von außen an die Membran einer Zelle herangeführt wird.
Dementsprechend stellt sich die Erfindung die Aufgabe, ein neues Ver- fahren bereitzustellen, mit dessen Hilfe Glaspipetten oder Glaskapillaren hergestellt werden können. Insbesondere sollen damit neue Pipetten oder Kapillaren zugänglich sein, die auf vorteilhafte Weise bei Patch-
Clamp-Techniken eingesetzt werden können, bei denen die Zelle oder entsprechende biologische Struktur im Inneren der Kapillare unter Aus- bildung eines Gigaseals fixiert ist.
Weiter ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Bereitstellung solcher Pipetten oder Kapillaren zu entwickeln, insbesondere eine Vorrichtung zur Durchführung des neuen Verfahrens.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch die Vorrichtung nach den Merkmalen des Anspruchs 10. Bevorzugte Ausführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 9 bzw. 11 bis 20 definiert. Der Wortlaut sämtlicher An- sprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren, die insbesondere für Patch-Clamp-Experimente vorgesehen sind, umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:
- Zunächst wird eine Glaspipette oder Glaskapillare, die eine konus- förmige Spitze und einen sich an die Spitze anschließenden im wesentlichen röhrchenförmigen Abschnitt aufweist, in einer Halteeinrichtung fixiert. Die fixierte Glaspipette wird in das Wärmestrahlungsfeld einer Heizeinrichtung eingebracht. Dies geschieht vorzugsweise so, daß die fixierte Glaspipette mit Hilfe einer Positioniereinrichtung in das Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung hineinbewegt wird. Die Glaspipette wird zumindest im Bereich der Spitze, insbesondere im Bereich der Basisfläche des Konus, und gegebenenfalls auch im sich an die Spitze anschließenden Teil des röhrchenförmigen Abschnitts erweicht, insbesondere aufgeschmolzen. Dieses Erweichen erfolgt vorzugsweise abschnittsweise. Vor dem Erweichen und/oder im erweichten Zustand wird das Innere der Glaspipette und damit auch deren erweichter Bereich mit einem Gasdruck beaufschlagt. Dies resultiert darin, daß sich der
Durchmesser der Pipette zwischen der Basisfläche des Konus und dem röhrchenförmigen Abschnitt der Glaspipette sprungförmig auf einen größeren Durchmesser als an der Basisfläche erweitert. Sprungförmig soll hier bedeuten, daß die Vergrößerung/Erweite- rung des Durchmessers über eine geringe Länge erfolgt, insbesondere über eine Länge von weniger als 150 μm. Vorzugsweise soll dabei der Durchmesser, insbesondere von einem Wert von weniger als 50 μm an der Basisfläche, auf einen Durchmesser von mindestens 100 μm im röhrchenförmigen Abschnitt der Glaspipet- te erweitert werden.
Die so aufgeweitete Glaspipette wird aus dem Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung wieder entfernt, wobei vorzugsweise die Glaspipette mit Hilfe der Positioniereinrichtung aus dem Wärmestrahlungsfeld herausbewegt wird.
Schließlich ist das erfindungsgernäße Verfahren so ausgestaltet, daß die sprungförmige Erweiterung des Durchmessers der Glas- pipette mit Hilfe einer optischen Beobachtungseinrichtung kontrolliert und vorzugsweise auch gesteuert wird.
Zur Erläuterung wird noch folgendes angemerkt.
Bei einem Konus handelt es sich bekanntlich um ein Gebilde, das die Form eines Kegels oder Kegelstumpfes aufweist. Dementsprechend besitzt bei der Erfindung die Pipette/Kapillare eine Spitze mit der Form eines solchen Konus. Diese Spitze ist, bedingt durch ihren Herstellungsprozeß (in der Regel Ziehen/Pullen aus einer Kapillare), geomet- risch nicht exakt konusförmig, läßt sich aber im wesentlichen durch eine solche Konusform beschreiben. Da die Spitze zwingend offen, d. h. nicht geschlossen, ist, wird es sich im Falle der Erfindung in der Regel um einen Konus in Form eines Kegelstumpfes handeln.
Ein Kegelstumpf ist ein Rotationskörper, der dadurch entsteht, daß man von einem geraden Kreiskegel parallel zur Basisfläche einen kleineren Kegel abschneidet. Auf diese Weise entstehen zwei parallele Kreisflächen, von denen man die größere als Basisfläche und die kleinere als Deckfläche bezeichnet. Überträgt man dies wiederum auf den Fall der vorliegenden Erfindung, so schließt sich hier bei der Pipette/Kapillare der Konus der Spitze mit seiner (größeren) Basisfläche an den röhrchenförmigen Abschnitt an.
Das von der Erfindung beanspruchte Verfahren hat den Vorteil, daß ge- genüber dem Stand der Technik eine wesentlich ausgeprägtere, sprungförmige Aufweitung des Durchmessers der Kapillare/Pipette erreicht werden kann, und zwar ausgehend von der Stelle, an der die Zelle bei den entsprechenden Patch-Clamp-Messungen im Inneren der Kapillare/ Pipette fixiert wird, hin zu dem röhrchenförmigen Abschnitt der Kapillare/ Pipette mit größerem Durchmesser. Dies erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß ein größerer Teil der Pipette, vorzugsweise durch abschnitts- weises Aufschmelzen und Aufweiten nacheinander, im Durchmesser vergrößert wird. Insbesondere durch die abschnittsweise Vorgehensweise kann die erwünschte aufgeweitete Kontur der Pipette auf einer Länge erreicht werden, die größer ist als die Ausdehnung des Wärmestrahlungsfeldes. Darüber hinaus trägt auch die erfindungsgemäße Maßnah- me, vorzugsweise ein radiales Wärmestrahlungsfeld vorzusehen, zum Erfolg der erfindungsgemäßen Verfahrensführung bei.
Die beschriebene Verfahrensführung hat den weiteren Vorteil, daß die für die Glaspipetten und Glaskapillaren erwünschte Durchmesserver- größerung unter optischer Kontrolle definiert beobachtet und gegebenenfalls gesteuert werden kann. Dies bedeutet, daß Pipetten oder Kapillaren, die die erwünschte sprungförmige Durchmesservergrößerung nicht aufweisen, nicht erst bei einer aufwendigen Kontrolle bereits hergestellter Pipetten/Kapillaren geprüft und aussortiert werden müssen, sondern daß diese Kontrolle während des Herstellungsprozesses selbst gezielt vorgenommen werden kann. Auf diese Weise ist es aber nicht nur möglich, falsch hergestellte Pipetten oder Kapillaren schon bei der Herstellung auszusortieren. Es ist darüber hinaus möglich, die Form der Pipetten und Kapillaren gezielt einzustellen und entsprechend den jewei- ligen Vorgaben abzuwandeln. Dies erlaubt eine in hohem Maße automatisierte Fertigung, die weit über das hinausgeht, was bisher bei der Herstellung von Pipetten oder Kapillaren, insbesondere von solchen für Patch-Clamp-Experimente möglich war. Die genannten Vorteile und weitere Vorteile werden im folgenden noch näher erläutert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die zu bearbeitende Glaspipette oder Glaskapillare direkt aus einer Vorrichtung zum Ziehen solcher Glaspipetten in die Halteeinrichtung überführt wird. Auf diese Weise ist gewährleistet, daß frisch gezogene (frisch gepullte) Kapillaren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren (weiter-)bearbeitet werden. Unter Umständen ist es mit Vorteil auch möglich, für das Ziehen der Glaspipetten dieselbe Halteeinrichtung zu verwenden, die auch zur Fixierung der Pipette für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt wird.
Wie bereits erläutert, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die fixierte Glaspipette in das Wärmestrahlungsfeld einer Heizeinrichtung eingebracht. Die vorteilhafte Ausgestaltung der Heizeinrichtung wird später noch im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erläutert. Auf diese Ausführungen wird ausdrücklich Bezug genommen und verwiesen.
In diesem Zusammenhang ist es selbstverständlich möglich, die Heizeinrichtung relativ zur fixierten Glaspipette zu bewegen. Da jedoch der Erweichungs- bzw. Aufschmelzvorgang in der Heizeinrichtung bei der Erfindung vorzugsweise optisch beobachtet werden kann, ist es bevor- zugt, nicht die Heizeinrichtung relativ zur Glaspipette, sondern die Glaspipette mit der Halteeinrichtung relativ zur Heizeinrichtung zu bewegen. Dies geschieht vorzugsweise mit Hilfe einer Positioniereinrichtung, die entweder bereits Teil der Halteeinrichtung ist oder mit dieser Halteeinrichtung zusammenwirkt. In diesem Zusammenhang ist es selbstverständlich möglich, die fixierte Glaspipette beim Einbringen in das Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung in allen drei Raumrichtungen (x-, y-, z-Richtung) zu bewegen. In vielen Fällen ist es jedoch einfacher, die Heizeinrichtung und die Halteeinrichtung in zwei Raumrichtungen (z. B. y- und z-Richtung) relativ zu- einander vorzufixieren, so daß zum Einbringen der fixierten Glaspipette in das Wärmestrahlungsfeld die Halteeinrichtung mit Hilfe der Positioniereinrichtung nur noch in einer Raumrichtung (z. B. x-Richtung) be- wegt werden muß. In diesen Fällen ist die Glaspipette in der Regel derart in der Halteeinrichtung festgelegt, daß die Bewegung in x-Richtung einer Bewegung in axialer Richtung (Längsrichtung) der Glaspipette entspricht. Die Bewegung in x-Richtung ist ohnehin zweckmäßig und in der Regel vorgesehen, da mit dieser Bewegung(smöglichkeit) auch das Einbringen und Ausbringen (Auswechseln) der Pipette in die Halteeinrichtung bewerkstelligt wird.
Die vorgenannten Ausführungen gelten selbstverständlich entsprechend auch für das Herausbewegen der aufgeweiteten Glaspipette aus dem Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung. Hierbei ist es zur Vereinfachung der Steuerung selbstverständlich bevorzugt, wenn die Glaspipette nach dem Aufweiten im wesentlichen in die Ausgangsstellung zurückbewegt wird, in der sie sich vor dem Einbringen in das Wärmestrahlungsfeld befunden hat. Dort kann die Glaspipette abkühlen. Um sicher auszuschließen, daß die Pipette während eines allmählichen Abkühlens noch ihre Form verändert, kann das Abkühlen beschleunigt werden, vorzugsweise durch Anblasen mit Luft, beispielsweise durch ein Kühlventil.
Wie erläutert, wird das Innere der Glaspipette mit einem Gasdruck be- aufschlagt, damit die erwünschte Erweiterung des Durchmessers der Pipette eintritt. Dabei ist es grundsätzlich bevorzugt, wenn das Innere der Pipette dazu mit einem kontinuierlichen (konstanten) Gasdruck beaufschlagt wird. Hierzu kann beispielsweise ein Proportionalventil vorgesehen sein. Diese Druckbeaufschlagung kann bereits vor und/oder wäh- rend des Erweichens/Aufschmelzens der Glaspipette erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, hier mit Druckpulsen zu arbeiten, wobei sowohl die Dauer der Druckpulse als auch die Pausen zwischen einzelnen Druckpulsen variiert werden können. Es ist auch möglich, die Druckwerte einzelner Druckpulse zu verändern. Mit all diesen Maßnahmen ist eine ge- zieltere Verfahrensführung möglich. In der Regel liegen die Drucke bei der Erfindung zwischen 0,1 und 10 bar (10 bis 1.000 KPa). Drucke in der Größenordnung von 1 bar (100 KPa) sind bevorzugt. Üblicherweise wird als Gas Luft verwendet.
Wie ebenfalls bereits erläutert, wird die sprungförmige Erweiterung des Durchmessers der Glaspipette (und gegebenenfalls auch der Erwei- chungs- und Aufschmelzvorgang) mit Hilfe einer optischen Beobachtungseinrichtung kontrolliert. Hierzu können die unterschiedlichsten Parameter der optisch abgebildeten Form der Pipette ausgewählt werden. Grundsätzlich kann so eine gesamte Konturlinie einer Glaspipette wäh- rend des Verfahrens beobachtet werden. Bei vereinfachten Ausführungen wird als Ausgangspunkt oder Ursprungspunkt für diese Messungen nicht notwendigerweise aber sinnvollerweise die (vorderste) Spitze des Konus ausgewählt. Im (festen) Abstand von dieser „Nullage" kann dann mindestens ein Durchmesser der Glaspipette vor, während oder nach der Aufweitung der Pipette mit dem Gasdruck verfolgt werden. In diesem Zusammenhang hat es sich bewährt, drei Durchmesserwerte mit festem Abstand von der vordersten Spitze der Glaspipette zu beobachten. In Weiterbildung hat es sich auch als Vorteil erwiesen, wenn die Länge der Spitze zwischen Basisfläche und Deckfläche des Konus vor, wäh- rend und nach der Aufweitung bestimmt wird. Der Ort der Deckfläche des Konus stimmt dabei mit dem Ort der vordersten Spitze des Konus und damit mit der Ursprungslage (Nullage) überein. Vorzugsweise wird der Wert der Länge der Spitze zusammen mit mindestens einem Durchmesser im Abstand von der vordersten Spitze, vorzugsweise mit den genannten drei Durchmesserwerten, bestimmt. Auf diese Weise stehen insgesamt vier Meßwerte zur Kontrolle der Geometrie der aufgeweiteten Pipette zur Verfügung.
Der Ordnung halber sei noch festgehalten, daß das Gesamtverfahren bei der geschilderten bevorzugten Verfahrensführung im wesentlichen von drei Verfahrensparametern bestimmt wird, nämlich
Temperatur des Wärmestrahlungsfelds, das auf die fixierte Glaspipette wirkt. x-Position der fixierten Glaspipette, und Gasdruck für die Durchmesseraufweitung.
Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt die Erfindung auch eine Vorrichtung für die Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren, wobei diese insbesondere für Patch-Clamp-Experimente vorgesehen sind, mit den folgenden Einrichtungen: einer Halteeinrichtung für die Fixierung der Glaspipette. einer Heizeinrichtung zum Erweichen, insbesondere Aufschmel- zen, von Bereichen der Glaspipette mit Hilfe eines Wärmestrahlungsfelds. einer Positioniereinrichtung zur kontrollierten Bewegung und Positionierung der Glaspipette mindestens in deren axialer Richtung in Bezug auf die Heizeinrichtung. Vorzugsweise wird dabei die HaI- teeinrichtung mit Hilfe dieser Positioniereinrichtung bewegt. einer Einrichtung zur definierten Beaufschlagung des Inneren der Glaspipette mit einem Gasdruck. einer Beobachtungseinrichtung zur optischen Beobachtung der Glaspipette, insbesondere des Bereichs der Spitze der Glaspipet- te, während des Aufheizens und während der Beaufschlagung der
Glaspipette mit Gasdruck. einer Steuerungs-/Kontrolleinrichtung zur Auswahl und Beeinflussung der Parameter des mit der Vorrichtung durchgeführten Verfahrens, insbesondere zur Beeinflussung der Temperatur in der Heizeinrichtung, des Gasdrucks und der Bewegung (insbesondere in axialer Richtung der Pipette) der Positioniereinrichtung.
Zur Erläuterung der Funktion der einzelnen Einrichtungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird sowohl auf die noch folgenden Ausfüh- rungen, als auch auf die bereits gemachten Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren Bezug genommen und ausdrücklich verwiesen. Die Erläuterungen zum erfindungsgemäßen Verfahren sollen aus- drücklich auch Bestandteil der Erläuterungen zur erfindungsgemäßen Vorrichtung sein und umgekehrt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrich- tung handelt es sich bei der Halteeinrichtung um eine Klemmvorrichtung für die Pipette oder Kapillare. Auf diese Weise läßt sich die Pipette in einfacher Weise in der Halteeinrichtung fixieren und wieder aus dieser entfernen.
Um Druckverluste bei der Aufweitung der Pipette zu vermeiden und die Kontrollierbarkeit der Verfahrensführung zu verbessern, ist die Glaspipette bei der Erfindung vorzugsweise in der Halteeinrichtung druckdicht fixierbar.
Zur Erzeugung eines Wärmestrahlungsfelds kann grundsätzlich jede geeignete Heizeinrichtung zur Erzeugung von Wärmestrahlung (IR- Strahlung) eingesetzt werden. Hier kann es sich beispielsweise um eine Gasflamme (z. B. Acetylenflamme) handeln oder um einen Infrarotlaser. Es ist jedoch bevorzugt, wenn es sich bei der Heizeinrichtung um ein sogenanntes Heizfilament handelt. Derartige Heizfilamente sind dem Fachmann bekannt.
In Weiterbildung ist bei der Erfindung die Heizeinrichtung, insbesondere das Heizfilament, im wesentlichen ringförmig oder auch U-förmig ausge- bildet, so daß es dementsprechend die Glaspipette an ihrem Außenumfang mindestens teilweise umgibt. Ein derartiges Einschließen der Glaspipette zur Erzeugung eines radial homogenen Wärmestrahlungsfeldes läßt sich in einfacher Weise mit solchen U-förmigen Heizeinrichtungen bzw. Heizfilamenten erzeugen.
Da die Pipette insbesondere während der Erweichung des Glases im Wärmestrahlungsfeld, insbesondere beim teilweisen Aufschmelzen, und bei der Aufweitung durch Gasdruck beobachtet werden soll, ist es von Vorteil, wenn die Heizeinrichtung einen freien Blick für die optische De- tektion auf die Pipette zuläßt. Dies kann insbesondere dadurch erreicht werden, daß die Heizeinrichtung bzw. das Heizfilament gegen die Längsrichtung der Glaspipette schräggestellt ist. Dies geschieht vorzugsweise in einem Winkel von ca. 45 °.
In Weiterbildung ist die Heizeinrichtung so ausgestaltet, daß deren Heizleistung stromgesteuert ist. Dies ermöglicht eine besonders einfache Änderung des Wärmestrahlungsfeldes beim Erweichen der Glaspipette.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Einrichtung zur definierten Beaufschlagung des Inneren der Glaspipette mit einem Gasdruck, vorzugsweise zur kontinuierlichen Druckbeaufschlagung ausgebildet. Vorzugsweise weist diese zur regelbaren kontinuierlichen Druckbeaufschlagung ein Proportionalventil auf. Die damit verbundenen Vorteile wurden im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereits erläutert.
Zur optischen Beobachtung der Glaspipette beim Aufschmelzen und beim Beaufschlagen mit Gasdruck können grundsätzlich alle möglichen optischen Beobachtungseinrichtungen eingesetzt werden, beispielsweise solche mit CCD- oder CMOS-Technik. Vorzugsweise wird bei der Erfindung eine Beobachtungseinrichtung eingesetzt, die man als Meß- mikroskop mit CCD-Kamera bezeichnen kann. Es wird also ein Vergrößerungsobjektiv, beispielsweise mit 10fach-Vergrößerung, eingesetzt, das mit einer CCD-Kamera kombiniert ist. Diese Kamera kann als Grauwertkamera ausgebildet sein. Diese Beobachtungseinrichtung wird auf die Spitze der Pipette fokussiert, wobei zweckmäßig eine automati- sehe Fokussiereinrichtung vorgesehen ist. Die Steuerungs-/Kontrolleinrichtung bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfaßt vorzugsweise ein Bildverarbeitungssystem, mit dessen Hilfe die Änderung der .Außenkontur der Pipette während des Aufheizens und während der Druckbeaufschlagung verfolgt werden kann. Eine Aufzeich- nung der entsprechenden Bildfolge kann ebenfalls vorgesehen sein.
Schließlich kann die erfindungsgemäße Vorrichtung noch eine Einrichtung zum Ziehen von Glaspipetten oder Glaskapillaren umfassen. Auf diese Weise wird es möglich, frisch gezogene Pipetten oder Kapillaren direkt in die erfindungsgemäße Vorrichtung einzubringen.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die beschriebenen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 eine schematische Prinzipskizze zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung, und
Fig. 2 eine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung herstellbare Pipette oder Kapillare in sche- matischer Darstellung. Die Prinzipskizze gemäß Fig. 1 zeigt zum einen einige wesentliche Bestandteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und zum anderen einen groben Ablauf des erfindungsgernäßen Verfahrens.
So ist in Fig. 1 eine Glaspipette oder Glaskapillare 1 dargestellt, die in einer Halteeinrichtung 2 (Klemmvorrichtung) fixiert ist. Die Halteeinrichtung 2 ist mit einer Positioniereinrichtung (nicht dargestellt) versehen, mit deren Hilfe die in der Halteeinrichtung 2 fixierte Kapillare 1 in x- Richtung, d. h. in axialer Richtung der Kapillare 1 bewegbar ist.
Weiter zeigt Fig. 1 eine Heizeinrichtung 3 in Form eines U-förmigen Heizfilaments, das ein radial homogenes Wärmestrahlungsfeld zur Erweichung bzw. Aufschmelzung der Kapillare 1 erzeugen kann. Weiter ist in Fig. 1 eine Beobachtungseinrichtung 4 vorgesehen, die aus einer Lampe 5, einer Mikroskopoptik 6 und einer CCD-Kamera 7 besteht. Mit Hilfe dieser beweglichen Beobachtungseinrichtung 4 ist die Pipette 1 während des Erweichungs-/Aufschmelzvorganges und während der Beaufschlagung der Pipette mit Gasdruck beobachtbar. Um dies zu gewährleisten, ist das Heizfilament um ca. 45 ° zur Beobach- tungsrichtung schräg gestellt.
Weitere Einzelheiten einer erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in Fig. 1 nicht dargestellt, insbesondere nicht die Einrichtung zur definierten Beaufschlagung des Inneren der Glaspipette mit einem Gasdruck und ge- gebenenfalls vorhandene Steuerungs- und Kontrolleinrichtungen.
Der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der Fig. 1 ebenfalls schematisch angedeutet, wobei die Form und ungefähre Position der Kapillare 1 in den Verfahrensstadien I1 II, III und IV gezeigt ist.
So wird die in der Halteeinrichtung 2 fixierte Kapillare 1 im Verfahrensstadium I in das Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung 3 in x-Rich- tung hineinbewegt, so daß der (erste) aufzuweitende Kapillarabschnitt im Wärmestrahlungsfeld zu liegen kommt. Vorzugsweise handelt es sich bei diesem ersten Abschnitt um denjenigen bei der Verfahrensführung, der (bezogen auf die Kapillare) am weitesten von der Spitze der Kapilla- re entfernt ist.
Sobald sich der aufzuweitende (erste) Abschnitt der Kapillare im Wärmestrahlungsfeld befindet, wird das Innere der Kapillare mit einem konstanten Gasdruck von ca. 1 bar beaufschlagt. Grundsätzlich ist es auch möglich, eine bereits mit dem Gasdruck beaufschlagte Kapillare in das Wärmestrahlungsfeld einzubringen.
Wie Verfahrensstadium Il in Fig. 1 schematisch zeigt, wird der erweichte/aufgeschmolzene erste Kapillarabschnitt durch den Gasdruck aufge- weitet. Sobald dies unter der erfindungsgemäß vorgesehenen optischen Kontrolle (in dem erwünschten Ausmaß) geschehen ist, wird durch entsprechende Bewegung der Kapillare in x-Richtung der nächste (zweite) Kapillarabschnitt in das Wärmestrahlungsfeld hineinbewegt. Dieser nächste (zweite) Kapillarabschnitt liegt näher an der Spitze der Kapillare als der erste, bereits aufgeweitete Kapillarabschnitt. Sobald das Glas der Kapillare auch am zweiten Kapillarabschnitt erweicht bzw. aufgeschmolzen ist, erfolgt hier ebenfalls durch den kontinuierlich vorhandenen Gasdruck eine entsprechende Aufweitung, die ebenfalls wieder optisch kontrolliert wird. Dies ist in Verfahrensstadium III in Fig. 1 schema- tisch dargestellt.
Im vorliegenden Fall wird bei der Erfindung so vorgegangen, daß der Gasdruck während der gesamten Verfahrensführung konstant gehalten wird. In diesem Fall kann bei der gewählten Vorgehensweise, bei der abschnittsweise in Richtung auf die Spitze der Kapillare aufgeweitet wird, der Energieinhalt des Wärmestrahlungsfeldes (z. B. durch Steuerung des Stromes des verwendeten Heizfilaments) variiert werden. Übli- cherweise werden dabei, je näher der Abschnitt an der Spitze der Kapillare liegt, immer geringer werdende Energieinhalte/Heizleistungen verwendet. Dies liegt daran, daß die Wandstärke der Glaskapillare üblicherweise in Richtung auf die Spitze abnimmt. Mit gleichem Ergebnis könnte man aber auch so vorgehen, daß der E- nergieinhalt/Heizleistung während der gesamten Verfahrensdauer konstant gehalten wird und der Gasdruck, je näher man an die Spitze der Kapillare kommt, entsprechend verringert wird.
Im Verfahrensstadium IV ist in Fig. 1 ein vierter und letzter Verfahrensschritt dargestellt, bei dem der Bereich der Spitze der Kapillare selbst aufgeweitet wird. Dazu wird derjenige Kapillarabschnitt, der der Spitze am nächsten liegt bzw. diese Spitze umfaßt, durch Bewegung in x-Rich- tung in das Wärmestrahlungsfeld eingebracht und durch den immer noch anliegenden konstanten Gasdruck aufgeweitet. Auf diese Weise entsteht dann die abschließende charakteristische Form der Pipette/ Kapillare mit der sprungförmigen Erweiterung des Durchmessers von der Basisfläche der verbliebenen konusförmigen Spitze hin zum im wesentlichen röhrchenförmigen Abschnitt der Pipette/Kapillare.
Abschließend wird, was in Fig. 1 nicht mehr dargestellt ist, die in erwünschter Weise aufgeweitete Pipette in x-Richtung vollständig aus dem Wärmestrahlungsfeld herausbewegt, oder dieses Wärmestrahlungsfeld wird abschaltet. Dann erfolgt üblicherweise ein allmähliches Kühlen der endgeformten Pipette an Luft. Dieses Abkühlen kann zusätzlich durch Anblasen der Pipette mit kalter Luft mittels einer nicht dargestellten Vorrichtung beschleunigt werden.
Fig. 2 zeigt die Form und die Abmessungen einer beispielhaft hergestell- ten Glaspipette oder Glaskapillare, wie sie mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten werden können. Charakteristisch ist die sprungförmige Aufweitung des Durch- messers der Kapillare zwischen dem Bereich der konusförmigen Spitze und dem sich an diese Spitze anschließenden im wesentlichen röhrchenförmigen Abschnitt der Kapillare.
Fig. 2 zeigt auch, wie in der Beschreibung geschildert, vier Werte, wie sie zur Kontrolle und Steuerung der sprungförmigen Erweiterung des Durchmessers bei der Herstellung solcher Pipetten oder Kapillaren beim erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Wie geschildert, wird die Ursprungslage (Nullage) an der (vordersten) Spitze des Konus ge- wählt. Die vier Werte, die bestimmt werden, sind dann zum einen die Länge der Spitze zwischen Nullage/Ursprungslage (an der Deckfläche des Konus) und der Basisfläche des Konus. Desweiteren werden an drei (vorbestimmten) Stellen die Durchmesserwerte im röhrchenförmigen Abschnitt bestimmt.
Im vorliegenden Fall beträgt die Länge der Spitze 31 ,4 μm. Die drei Durchmesserwerte im röhrchenförmigen Abschnitt betragen 138,9 μm, 169,0 μm und 189,0 μm. Es versteht sich von selbst, daß es sich hier nur um Beispielwerte handelt, die den Gegenstand der vorliegenden Er- findung in keiner Weise beschränken können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren, insbesondere für Patch-Clamp-Experimente, bei dem mindestens eine Glaspipette oder Glaskapillare (1), die eine konusförmige Spitze und einen sich an die Spitze anschließenden im wesentlichen röhrchenförmigen Abschnitt aufweist, in einer Halteeinrichtung (2) fixiert wird, die fixierte Glaspipette (1) in das Wärmestrahlungsfeld einer Heizeinrichtung (3) eingebracht wird, wobei vorzugsweise die fixierte Glaspipette mit Hilfe einer Positioniereinrichtung in das Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung bewegt wird, die Glaspipette zumindest im Bereich der Spitze, insbesondere im Bereich der Basisfläche des Konus, und gegebenenfalls auch im sich an die Spitze anschließenden Teil des röhrchenförmigen Abschnitts erweicht, vorzugsweise aufgeschmolzen wird, wobei das Erweichen vorzugsweise abschnittsweise erfolgt. das Innere der Glaspipette (1 ) vor dem Erweichen und/oder im erweichten Zustand mit einem Gasdruck beaufschlagt wird, derart, daß sich der Durchmesser der Pipette zwischen der Basisfläche des Konus und dem röhrchenförmigen Abschnitt der Glaspipette sprungförmig, d. h. über eine geringe Länge auf einen größeren Durchmesser als an der Basisfläche, insbesondere auf einen Durchmesser von mindestens 100 μm, erweitert, wobei die so aufgeweitete Glaspipette (1) aus dem Wärmestrahlungsfeld der Heizeinrichtung (3) entfernt wird, wobei vorzugsweise die Glaspipette mit Hilfe der Positioniereinrichtung aus dem Wärmestrahlungsfeld herausbewegt wird, die sprungförmige Erweiterung des Durchmessers der Glaspipette (1 ) mit Hilfe einer optischen Beobachtungseinrichtung (4) kontrolliert und vorzugsweise gesteuert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Glaspipette direkt aus einer Vorrichtung zum Ziehen solcher Glaspipetten in die Halteeinrichtung überführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Glaspipette beim Einbringen und beim Entfernen aus dem Wärmestrahlungsfeld im wesentlichen nur axial, d. h. in Richtung ihrer Längsrichtung, mit Hilfe der Positioniereinrichtung bewegt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Glaspipette nach dem Erweichen in dem Wärmestrahlungsfeld im wesentlichen in die Ausgangsstellung zurückbewegt wird, in der sie sich vor dem Einbringen in das Wärmestrahlungsfeld befunden hat.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein kontinuierlicher Gasdruck im Inneren der Glaspipette aufgebaut wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Längsabschnitte der Glaspipette nacheinander in das Wärmestrahlungsfeld eingebracht und dort durch Beaufschlagung mit Gasdruck aufgeweitet werden, wobei vorzugsweise die resultierende aufgeweitete Kontur der Glaspipette in deren axialer Richtung eine größere Länge besitzt als die Ausdehnung des Wärmestrahlungsfelds in dieser axialen Richtung.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kontrolle und Steuerung der sprungför- migen Erweiterung des Durchmessers die Änderung der Außenkontur der Glaspipette beobachtet wird, wobei vorzugsweise die Änderung von Abmessungen der Glaspipette an vordefinierten Stellen bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Durchmesser der Glaspipette, vorzugsweise drei Durchmesser, mit festem Abstand von der Spitze der Glaspipette bestimmt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der Spitze zwischen Basisfläche und Deckfläche des Konus bestimmt wird.
10. Vorrichtung für die Herstellung von Glaspipetten oder Glaskapillaren (1 ), insbesondere für Patch-Clamp-Experimente, mit einer Halteeinrichtung (2) zur Fixierung der Glaspipette (1), einer Heizeinrichtung (3) zum Erweichen, insbesondere Aufschmelzen, von Bereichen der Glaspipette mit Hilfe eines Wärmestrahlungsfelds, einer Positioniereinrichtung zur kontrollierten Bewegung und Positionierung der Glaspipette mindestens in deren axialer Richtung in Bezug auf die Heizeinrichtung, wobei vorzugsweise die Halteeinrichtung mit Hilfe dieser Positioniereinrichtung bewegbar ist, einer Einrichtung zur definierten Beaufschlagung des Inneren der Glaspipette mit einem Gasdruck, einer Beobachtungseinrichtung (4) zur optischen Beobachtung der Glaspipette, insbesondere des Bereichs der Spitze der Glaspipette, während des Aufheizens und der Beaufschlagung der Glaspipette mit Gasdruck, und einer Steuerungs-/Kontro!ieinrichtung zur Auswahl und Beeinflussung der Parameter des mit der Vorrichtung durchgeführten Verfahrens, insbesondere zur Beeinflussung der Temperatur in der Heizeinrichtung, des Gasdrucks und der Bewegung der Positioniereinrichtung.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Halteeinrichung (2) um eine Klemmvorrichtung handelt.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Glaspipette in der Halteeinrichtung druckdicht fixierbar ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Heizeinrichtung (3) um ein sogenanntes Heizfilament handelt.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Heizeinrichtung (3), insbesondere das Heizfilament, U-förmig ausgebildet ist und dementsprechend die Glaspipette an ihrem Außenumfang mindestens teilweise umgibt.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Heizeinrichtung (3), insbesondere das Heizfilament, gegen die Längsrichtung der Glaspipette schräg gestellt ist, vorzugsweise in einem Winkel von ca. 45 °.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Heizleistung der Heizeinrichtung stromgesteuert ist.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur definierten Beaufschlagung des Inneren der Glaspipette mit einem konstanten Gasdruck ausgebildet ist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Beobachtungseinrichtung um ein Meßmikroskop (6) mit CCD-Kamera (7) handelt.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuerungs-/Kontrolleinhchtung ein Bildverarbeitungssystem umfaßt, mit dessen Hilfe die Änderung der Außenkontur der Glaspipette während des Aufheizens und während der Druckbeaufschlagung verfolgt werden kann.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 19, weiter gekennzeichnet durch eine Einrichtung zum Ziehen von Glaspipetten o- der Glaskapillaren.
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