EP1981967A1 - Mrna-transfektion von adulten progenitorzellen zur spezifischen gewebsregeneration - Google Patents

Mrna-transfektion von adulten progenitorzellen zur spezifischen gewebsregeneration

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EP1981967A1
EP1981967A1 EP07703360A EP07703360A EP1981967A1 EP 1981967 A1 EP1981967 A1 EP 1981967A1 EP 07703360 A EP07703360 A EP 07703360A EP 07703360 A EP07703360 A EP 07703360A EP 1981967 A1 EP1981967 A1 EP 1981967A1
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EP
European Patent Office
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cells
progenitor cells
mrna
target tissue
progenitor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07703360A
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English (en)
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Inventor
Jan Torzewski
Vinzenz Hombach
Juliane Ingeborg Marie Wiehe
Jochen Greiner
Michael Schmitt
Markus Wiesneth
Oliver Zimmermann
Hubert Schrezenmeier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Ulm
Original Assignee
Universitaet Ulm
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Ulm filed Critical Universitaet Ulm
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to progenitor cells, drugs containing progenitor cells and their uses for specific tissue regeneration. Such methods are needed in all medical fields, especially in the treatment of cardiovascular, hematological, nephrological, neurological, dermatological, gastroenterological or orthopedic disorders.
  • the present invention is based on these known transfection methods and has as its object to provide methods and substances as well as medicaments and their production method, with which a tissue regeneration is possible.
  • the present invention makes use of the fact that in the prior art mRNA transfection methods are already known and successfully used for tumor therapy.
  • the invention is based on the fundamental idea and the recognition that progenitor cells can be transfected with mRNA which code for a protein, the settlement of the transfected progenitor cells in a specific target tissue and / or the differentiation of the transfected progenitor cells in Promotes cells of a particular type of target tissue. This makes it possible for the first time to introduce the progenitor cells into a specific target tissue in a targeted manner and to homing there or specifically to generate target cells which can then be used further elsewhere.
  • mRNA transfection is not subject to the strict legal regulations that apply to genetically modified cells. Because by an mRNA transfection, the transfected cell is not genetically engineered, but it produces only the coded by the mRNA protein. The mRNA is rapidly degraded within the transfected cell, so that after a short time the cell is back to its original state.
  • This mechanism is now utilized by the present invention by correspondingly transfecting the progenitor cells so that they receive an impulse during a short phase in order to differentiate into specific target cells or to settle in a specific target tissue. After degradation of the introduced mRNA and the protein encoded by this mRNA, there is an unchanged cell that is not different from the cells of the target tissue in autologous progenitor cells.
  • Progenitor cells are considered to be all cells which have not yet been terminally differentiated, in particular hematopoietic progenitor cells, neuronal progenitor cells, hepatic progenitor cells, skeletal muscle, skin and / or cord blood progenitor cells.
  • Stem cells in particular of non-embryonic origin, ie adult stem cells, tissue-specific adult stem cells and other not yet fully differentiated cells, are particularly advantageously used as progenitor cells.
  • the present invention is suitable for the treatment of cardiovascular, haematological, nephrological, neurological, skin, gastroenterological and / or orthopedic diseases in which tissue is to be regenerated, due to the possibility of tissue regeneration or to produce differentiated target cells of a particular target tissue.
  • Other clinical pictures can also be treated with the method according to the invention or the cells or medicaments according to the invention.
  • Fig. 1 + 2 e.g., transfection with adhesion molecules such as selectins or integrins or myocardial transcription factors such as GATA-4 or Nkx2.5
  • Fig. 1 + 2 e.g., transfection with adhesion molecules such as selectins or integrins or myocardial transcription factors such as GATA-4 or Nkx2.5
  • Fig. 1 + 2 e.g., transfection with adhesion molecules such as selectins or integrins or myocardial transcription factors such as GATA-4 or Nkx2.5
  • chronic degenerative myocardial diseases such as dilated cardiomyopathy or chronic ischemic cardiomyopathy: intravascular or intramyocardial application of mRNA-transfected progenitor cells such as CD34-positive progenitor cells or mesenchymal stem cells
  • Leukemias Improvement of bone marrow homing of hematopoietic progenitor cells by mRNA transfection of adhesion molecules after autologous or allogeneic stem cell transplantation
  • Leukemias induction of cell differentiation of the malignant cells by mRNA transfection
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • kidney progenitor cells such as mesenchymal stem cells (for example, transfection with renal transcription factors) for the treatment of chronic degenerative kidney disease
  • degenerative diseases of the nervous system such as M. Parkinson or M. Alzheimer: intravascular or intracerebral application of mRNA-transfected neuronal progenitor cells (eg Transfection with neuronal transcription factors) for the treatment of chronic degenerative diseases of the brain
  • adhesion molecules ie molecules which make possible the settlement of the transfected progenitor cell in the target tissue, or cardiac, hematopoietic, neuronal, renal or dermal transfection factors, which are the differentiation of the transfected progenitor cells into target cells of a corresponding target tissue promote:
  • Adhesion molecules ie molecules which make possible the settlement of the transfected progenitor cell in the target tissue, or cardiac, hematopoietic, neuronal, renal or dermal transfection factors, which are the differentiation of the transfected progenitor cells into target cells of a corresponding target tissue promote:
  • rollering factors in particular L-selectin, PSGL-I, sialyl Lewis X on leucocytes, P- or E-selectin, glycam-1, CD34, MadCAM-1 on endothelial cells, and
  • Adhesion raolecules in particular integrins such as ⁇ L ⁇ 2 (LFA-I) and ⁇ M b 2 (MAC-I) ⁇ x ⁇ 2 (pI50.95), ⁇ 4 ⁇ i, (VLA-4), ⁇ 5 ß! (VLA-5) and "Cellular adhesi- ons molecules” (CAMs) such as ICAM-I, -2, VCAM-I,
  • Hematopoietic transcription factors in particular PU-I, CEBP ⁇ , GATA-I, CD44, CD168, pI6, pI5, p21, p27 • Neuronal transcription factors
  • Renal transcription factors especially Sal I-I, Wnt family
  • FIG. 1 shows FACS analyzes of mRNA versus plasmid nucleofection of hematopoietic CD34-positive human progenitor cells (HPC);
  • Figure 2 shows the results of mRNA nucleofection of CD34-positive HPC with the cardiac Transcription factor Nkx2.5;
  • FIG. 1 shows the results of an mRNA nucleofection or a plasmid nucleofection of hematopoietic CD34-positive human progenitor cells (HPC) with the surface markers EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) and LNGFR (Low-Finite Nerve Growth Factor Receptor).
  • HPC human progenitor cells
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • LNGFR Low-Finite Nerve Growth Factor Receptor
  • Human CD34-positive hematopoietic progenitor cells Human CD34-positive HPC were isolated after G-CSF stimulation by leukapheresis. Immunomagnetic selection of CD34-positive cells was carried out using the CliniMACS TM system (Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). The cells were seeded in RPMI medium (Invitrogen, Düsseldorf, Germany) supplemented with 10% FCS and the growth factors IL-3 (10 ng / ml), IL-6 (20 ng / ml), and SCF (100 ng / ml ) at 37 0 C, 5% CO 2 cultured. Medium was changed every other day. The viability of the cells was determined by trypan blue staining resp. Flow cytometry (scatter exclusion) determined in the standard assay.
  • MSC Human mesenchymal stem cells
  • (a) Differentiation Assay For the differentiation assays, an initial cell number of 25,000 to 100,000 cells was seeded in cell culture bottles (NUNC), and differentiation was carried out with media from Cambrex (osteogenic and adipogenic differentiation) or Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany (FIG. chondrogenic and osteogenic differentiation). For detection of differentiated cells, the batches were fixed in 7% paraformaldehyde, (i) osteoblasts were switched to alkaline phosphatase activity, (ii) adipogenic differentiation was stained with saturated Oil RedO solution and (iii) chondrogenic differentiation "Alcian Blue Staining" tested.
  • NUNC cell culture bottles
  • the ⁇ LNGFR vector was generated by cloning the human truncated LNGFR gene into the eukaryotic pVAX1 expression vector (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, Germany).
  • the ⁇ LNGFR 834 bp fragment was amplified by polymerase chain reaction.
  • the pGEM4Z / EGFP / A64 plasmid was linearized with Spe I, the pVAX / delta LNGFR plasmid (Greiner et al., 2004, Homother, Transf. Med.) With Xho I (New England Biolabs, Frankfurt, Germany).
  • the linearized plasmids were purified by nucleotide removal kit (Qiagen, Hilden, Germany) and used as DNA templates for the in vitro transcription reaction, which was transcribed in a final 20 ⁇ l reaction mix at 37 ° C by T7 Opti-mRNA transcription kit (Cure Vac GmbH, Tübingen, Germany) to generate "5'-capped" in vitro transcribed mRNA.
  • CD34-positive HPC and MSC were pelleted and resuspended in human CD34 Cell Nucleofector TM Solutions (Amaxa GmbH, Cologne, Germany) at a cell density of 2-3x10 6 or 5x10 5 cells per 100 ⁇ l.
  • the cells were nucleotide-labeled with 5 ⁇ g mRNA or 2 ⁇ g plasmid DNA, the programs U-08 (for HPC) or C-17 (for MSC) of the nucleofector were used. After nucleofection, the cells were immediately mixed with 500 ⁇ l prewarmed culture medium and transferred to well plates with prewarmed medium. The cells were cultured at 37 0 C for 10 days.
  • the deltaLNGFR and EGFP expression of nucleofected and untransfected CD34-positive HPC and MSC was determined by flow cytometry 1, 3, 6, 8 and 10 days after transfection.
  • To detect deltaLNGFR the cells were incubated with "non-conjugated purified mouse monoclonal anti-human NGF antibody (Santa Cruz)" and a PE-labeled "anti mouse IgGi secondary antibody (Becton Dickinson)". Data were analyzed using Cellquest Version 3.1 software (Becton Dickinson).
  • FIG. 1A shows in the left column the nucleofection with mRNA of EGFP (upper image) or LNGFR (lower image). It can be seen that the detection of EGFP and LNGFR in the respective mRNA-transfected cells decays within a few days. Initially, however, mRNA transfection shows a very high efficiency of over 90% (EGFP / LNGFR positive cells / total number of cells). In plasmid nucleofection, only one nucleofection achieved efficiency of 60 to 70% ( Figure IA, right column), but the detection of proteins decays more slowly than in mRNA nucleofection.
  • Figure IB shows the viability of nucleated cells again for mRNA nucleofection in the left column and for plasmid nucleofection in the right column. It can be seen that mRNA transfection leads to very high viability with at least 50% viable cells (for both EGFP and LNGFR), while the viability of the transfected cells in plasmid nucleofection in particular is initially very low.
  • FIG. 2 shows the results of an mRNA nucleofection of CD34-positive HPC with the cardiac transcription factor Nkx 2.5.
  • Nkx2.5 the following protocol for mRNA transfection of Nkx2.5 was additionally used by means of nucleofection:
  • CD34-positive hematopoietic progenitor cells were pelleted, resuspended in 100 ⁇ l of "human CD34 Cell Nucleus TM Solution” (Amaxa GmbH, Cologne, Germany) and transcribed with 5 ⁇ g in vitro (CureVac, Tübingen, Germany) mRNA coding for the Nkx-2.5 protein mixed.
  • the cell suspension was nucleofixed with program U-08, then admixed with 500 ⁇ l preheated culture medium and transferred into 6-well plates with preheated culture medium. The cells were incubated for four hours at 37 0 C, 5% CO 2 before protein whole lysates were extracted.
  • FIG. 3 shows a FACS analysis of the mRNA nucleofection with EGFP mRNA or LNGFR mRNA of mesenchymal HPC. It can be seen that the efficiency of mRNA nucleofection is between 95.8% (for LNGFR) and 98.8% (for EGFP).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Progenitorzellen, Arzneimittel enthaltend Progenitorzellen sowie deren Verwendungen zur spezifischen Gewebsregeneration. Derartige Verfahren werden in sämtlichen medizinischen Bereichen benötigt, insbesondere bei der Behandlung kardiovaskulärer, hämatologischer, nephrologischer, neurologischer, dermatologischer, gastroenterologischer oder orthopädischer Erkrankungen. Die Progenitorzellen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen in einem Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert.

Description

mRNA-Transfektion von adulten Progenitorzellen zur spezifischen Gewebsregeneration
Die vorliegende Erfindung betrifft Progenitorzellen, Arzneimittel enthaltend Progenitorzellen sowie deren Verwendungen zur spezifischen Gewebsregeneration. Derartige Verfahren werden in sämtlichen medizinischen Bereichen benötigt, insbesondere bei der Behandlung kardiovaskulärer, hämatologischer, nephrolo- gischer, neurologischer, dermatologischer, gastroenterologischer oder orthopädischer Erkrankungen.
Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass Zellen mittels mRNA transfiziert werden können. Derartige transfizierte Zellen werden bisher dazu eingesetzt, um im Bereich der Tumortherapie geeignete transfi- zierte Zellen in das Tumorgewebe einzuschleusen. Damit ist es möglich, bestimmte Gewebetypen zu markieren und so einer gezielten Tumortherapie zugänglich zu machen. Entsprechende mRNA-Transfektionsverfahren sind beispielsweise in Smits et al . , Leukemia 2004, Seiten 1 bis 5, „RNA-based gene transfer for adult stem cells and T cells" beschrieben.
Die vorliegende Erfindung geht von diesen bekannten Transfektionsverfahren aus und macht es sich zur Aufgabe, Verfahren und Stoffe sowie Arzneimittel sowie deren Herstellungsverfahren anzugeben, mit denen eine Geweberegenerierung möglich wird.
Diese Aufgabe wird durch die Progenitorzellen nach Anspruch 1, das Arzneimittel nach Anspruch 2, deren Verwendung nach den Ansprüchen 3 bis 4, sowie die in den Ansprüchen nachfolgenden therapeutischen und nicht-therapeutischen Verfahren und Herstellungsverfahren gegeben. Vorteilhafte Weiterbildungen werden in den entsprechenden abhängigen Ansprüchen gegeben.
Die vorliegende Erfindung macht es sich zu Nutze, dass im Stand der Technik mRNA-Transfektionsverfahren bereits bekannt und für die Tumortherapie erfolgreich eingesetzt werden. Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung der grundlegende Gedanke und die Erkenntnis zugrunde, dass Progenitorzellen mit mRNA transfiziert werden können, die für ein Protein codieren, das die Ansiedlung der transfizierten Progenitorzellen in einem bestimmten Zielgewebe und/oder die Differenzierung der transfizierten Progenitorzellen in Zellen eines bestimmten Zielgewebetyps fördert. Hierdurch ist es erstmals möglich, die Progenitorzellen gezielt in ein bestimmtes Zielgewebe einzubringen und dort anzusiedeln (Homing) bzw. ge- zielt Zielzellen zu erzeugen, die dann anderweitig weiterverwendet werden können. Im Gegensatz zu sonstigen herkömmlichen gentechnischen Verfahren unterliegt die mRNA-Transfektion nicht den strengen gesetzlichen Regulierungen, die für gentechnisch veränderte Zellen gelten. Denn durch eine mRNA-Transfektion wird die transfizierte Zelle nicht gentechnisch verändert, sondern sie stellt lediglich das durch die mRNA codierte Protein her. Die mRNA wird innerhalb der transfizierten Zelle rasch abgebaut, so dass nach kurzer Zeit die Zelle wieder in ihrem ursprünglichen Zustand vorliegt.
Diesen Mechanismus macht sich nun die vorliegende Erfindung zu Nutze, indem die Progenitorzellen entspre- chend transfiziert werden, so dass sie während einer kurzen Phase einen Impuls bekommen, um in bestimmte Zielzellen auszudifferenzieren oder sich in einem bestimmten Zielgewebe anzusiedeln. Nach Abbau der eingebrachten mRNA und des Proteins, das durch diese mRNA codiert wurde, liegt eine unveränderte Zelle vor, die bei autologen Progenitorzellen sich nicht von den Zellen des Zielgewebes unterscheidet.
Als Progenitorzellen werden dabei sämtliche Zellen betrachtet, die noch nicht terminal ausdifferenziert sind, insbesondere hämatopoietische Progenitorzellen, neuronale Progenitorzellen, Progenitorzellen der Leber, des Skelettmuskels, der Haut und/oder Progenitorzellen aus Nabelschnurblut. Besonders vorteilhaft werden als Progenitorzellen Stammzellen, insbesondere nicht-embryonalen Ursprungs, also adulte Stammzellen, gewebespezifische adulte Stammzellen und andere noch nicht voll ausdifferenzierte Zellen verwendet.
Blau et al . , Cell, Band 105, S. 829-841 (2001) „The envolving concept of a stem cell: Entity or Function" geben einen Überblick über in der vorliegenden Erfindung verwendbare Progenitorzellen.
Die vorliegende Erfindung eignet sich aufgrund der Möglichkeit zur Geweberegeneration bzw. zur Herstellung ausdifferenzierter Zielzellen eines bestimmtes Zielgewebes zur Behandlung von kardiovaskulären, hä- motologischen, nephrologischen, neurologischen Erkrankungen, Hauterkrankungen, gastroenterologischen Erkrankungen und/oder orthopädischen Erkrankungen, bei denen Gewebe regeneriert werden soll. Auch weitere Krankheitsbilder sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. den erfindungsgemäßen Zellen oder Arzneimitteln behandelbar.
Im Folgenden wird eine nicht abschließende, jedoch beispielhafte Liste von Erkrankungen gegeben, wobei der Behandlungsmechanismus bzw. die zu verwendende transfizierende mRNA mit angegeben wird:
1. kardiovaskulären Erkrankungen
• z.B. Myokardinfarkt: intravasale oder intramyo- kardiale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen wie CD34 -positiven Progenitorzellen oder mesenchymalen Stammzellen, s. Abb. 1+2 (z.B. Transfektion mit Adhäsionsmolekülen wie Selektinen oder Integrinen oder myokardialen Transkriptionsfaktoren wie GATA-4 oder Nkx2.5) » z.B. chronisch degenerative Myokarderkrankungen wie Dilatative Kardiomyopathie oder chronisch ischämische Kardiomyopathie: intravasale oder intramyokardiale Applikation von mRNA-trans- fizierten Progenitorzellen wie CD34 -positiven Progenitorzellen oder mesenchymalen Stammzellen
(z.B. Transfektion mit Adhäsionsmolekülen wie VCAM/ICAM oder myokardialen Transkriptionsfaktoren wie GATA-4 oder Nkx2.5)
2. hämatologischen Systemerkrankungen
• z.B. Leukämien: Verbesserung des Knochenmarkho- mings von hämatopoetischen Progenitorzellen durch mRNA-Transfektion von Adhäsionsmolekülen nach autologer oder allogener Stammzelltrans- plantation
• z.B. Leukämien: Induktion einer Zelldifferenzierung der malignen Zellen durch mRNA-Transfektion
• mRNA-Transfektion von Differenzierungsfaktoren hämatopoetischer Progenitorzellen zur Differen- zierung bei reifungsgestörter Hämatopoese, z.B. bei Myelodysplastischem Syndrom (MDS)
• mRNA-Transfektion inhibitorischer RNA zur spezifischen Blockade von Translokationsprodukten von Leukämien zur Induktion einer Zelldifferenzie- rung
3. nephrologischen Erkrankungen
• z.B. Nierenzellersatz : intravasale oder intrare- nale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen der Niere wie mesenchymalen Stammzellen (z.B. Transfektion mit renalen Transkriptionsfaktoren) zur Behandlung chronisch degenerativer Nierenerkrankungen
4. neurologischen Erkrankungen
• z.B. degenerative Erkrankungen des Nervensystems wie M. Parkinson oder M. Alzheimer: intravasale oder intracerebrale Applikation von mRNA-trans- fizierten neuronalen Progenitorzellen (z.B. Transfektion mit neuronalen Transkriptionsfaktoren) zur Behandlung chronisch degenerativer Erkrankungen des Gehirns
5. Hauterkrankungen
• z.B. Hautzellersatz nach Verletzungen/Abschürfungen der Dermis durch intradermale oder intravasale Applikation von mRNA-transfizierten der- malen Progenitorzellen (z.B. Transfektion mit dermalen Transkriptionsfaktoren)
6. Gastroenterologischen Erkrankungen
» z.B. Ersatz von Inselzellen des Pankreas durch parenchymale oder intravasale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen bei Diabetes mellitus
7. Orthopädischen Erkrankungen
• z.B. Knorpelersatz durch durch parenchymale oder intravasale Applikation von mRNA-transfizierten Progenitorzellen des Knorpels/Knochens
Im Folgenden werden einige Proteine angegeben, deren für sie codierende mRNA vorteilhafterweise bei der vorliegenden Erfindung als zu transfizierende mRNA eingesetzt werden können. Es handelt sich dabei um Adhäsionsmoleküle, d.h. um Moleküle, die die Ansied- lung der transfizierten Progenitorzelle im Zielgewebe ermöglichen, bzw. um kardiale, hämatopoietische, neuronale, renale oder dermale Transfektionsfaktoren, die die Ausdifferenzierung der transfizierten Proge- nitorzellen in Zielzellen eines entsprechenden Zielgewebes fördern: Adhäsionsmoleküle :
• „Rolling Factors": insbesondere L-selectin, PSGL-I, Sialyl Lewis X auf Leukozyten, P- bzw. E- Selectin, Glycam-1, CD34, MadCAM-1 auf Endo- thelzellen sowie
• „Adhesion raolecules": insbesondere Integrine wie αLß2 (LFA-I) sowie αMb2 (MAC-I) αxß2 (pl50.95), α4ßi, (VLA-4), α5ß!(VLA-5) und „Cellular adhesi- ons molecules" (CAMs) wie ICAM-I, -2, VCAM-I,
Fibronectin auf Endothelzellen
Kardiale, hämatopoetische, neuronale, renale, dermale Transkriptionsfaktoren: • Kardiale Transkriptionsfaktoren: insbesondere
Nkx2.5, GATA-4
• Hämatopoetische Transkriptionsfaktoren: insbesondere PU-I, CEBPα, GATA-I, CD44, CD168, pl6, pl5, p21, p27 • Neuronale Transkriptionsfaktoren
• Renale Transkriptionsfaktoren: insbesondere SaIl-I, Wnt-Familie
• Dermale Transkriptionsfaktoren: insbesondere Egr-1
Im Folgenden werden nun einige Beispiele erfindungs- gemäßer Verfahren gegeben.
Es zeigen
Figur 1 FACS-Analysen der mRNA versus Plasmid- nukleofektion von hämatopoietischen CD34 positiven humanen Progenitorzellen (HPC) ;
Figur 2 die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion von CD34 positiven HPC mit dem kardialen Transkriptionsfaktor Nkx2.5 ; und
Figur 3 die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion von mesenchymalen HPC mit EGFP-mRNA und LNGFR-mRNA.
Figur 1 zeigt die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion bzw. einer Plasmidnukleofektion von hämatopoietischen CD34 positiven humanen Progenitorzellen (HPC) mit den Oberflächenmarkern EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) und LNGFR (Low-Finity Nerve Growth Factor Receptor) . Für diese Versuche wurden die folgenden Methoden und Protokolle verwendet:
Zellkultur
Humane CD34 -positive hämatopoetische Progenitorzellen (HPC) : Humane CD34 -positive HPC wurden nach G-CSF Stimulation mittels Leukapherese isoliert. Die immu- nomagnetische Selektion CD34 -positiver Zellen wurde mittels CliniMACS™ System (Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) durchgeführt. Die Zellen wurden in RPMI-Medium (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) , ergänzt mit 10 % FCS und den Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/ml) , IL-6 (20 ng/ml) , und SCF (100 ng/ml) bei 37 0C, 5 % CO2 kultiviert. Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Die Viabilität der Zellen wurde mittels Trypanblau-Färbung resp. Flow Zytometrie (scatter exclusion) im Standardassay bestimmt.
Humane mesenchymale Stammzellen (MSC) :
Spongiosa aus humanem Femur oder Tibia wurde nach Aufklärung und Einwilligung von Probanden im Alter zwischen 40 und 66 Lebensjahren gewonnen. MSC wurde aus dem Trabekelwerk nach Adhaesion an positiv gela- dene Plastikoberflächen (NUNC, Wiesbaden, Germany) für 24 Stunden in „complete αMEM (Cambrex, Verviers, Belgium)", ergänzt mit 20 % Hitze- inaktiviertem FBS (Gibco, Karlsruhe, Germany), isoliert. Frühe Passagen (Passage 2 - Passage 4) wurden für die Experimente verwendet. Die Zellen wurden nach 10 bis 14 Tagen mit Trypsin (Gibco) von den Zellkulturplatten gelöst und in einer Zelldichte von 100 bis 500 Zellen/cm2 neu ausgesät. Das Medium wurde 2*/Woche gewechselt. Die Viabilität wurde mittels Trypan-Blau-Aufnähme resp. Flow Zytrometrie (scatter exclusion) bestimmt.
Charakterisierung von MSC:
(a) Differenzierungsassay: Für die Differenzierungs- assays wurde eine initiale Zellzahl von 25.000 bis 100.000 Zellen in Zellkulturflaschen (NUNC) ausgesät, und die Differenzierung wurde mit Medien von Cambrex (osteogene und adipogene Differenzierung) oder Milte- nyi, Bergisch Gladbach, Germany (chondrogene und osteogene Differenzierung) induziert. Zur Detektion differenzierter Zellen wurden die Ansätze in 7 % Pa- raformaldehyd fixiert, (i) Osteoblasten wurden auf Alkalische Phosphatase Aktivität, (ii) adipogene Dif- ferenzierung wurde über eine Anfärbung mit saturierter „Oil RedO" Lösung und (iii) Chondrogene Differenzierung über „Alcian Blue-Färbung" getestet. Die Materialien für die Färbung wurden ausnahmslos von SIG- MA (Taufkirchen, Germany) gekauft, nur das „Alcian Blue staining kit" stammt von Dako, Hamburg, Germany. (b) Marker panel : Antikörper zur Charakterisierung von MSC: IgG (MOPC-21) , CD3 (HIT3a) , CD14 (M5E2), CD16 (3G8) , CD29 (HUTS-21) , CD34 (581) , CD44 (G44- 26) , CD45 (HI30) , CD73 (AD2) , CD90 (5E10) , CD146 (P1H12) , CD166 (3A6) und CD253 (GA-R2) . Alle Antikörper stammten von BD Pharmingen (Heidelberg, Germany) , ausgenommen CD48 (J4.57, Beckman Coulter, Krefeld, Germany) und CD66b (60H3, Beckman Coulter) sowie CD105 (Sn6, Biozol-Serotec, Eching, Germany) und CD133 (293C3, Miltenyi).
Plasmidkonstruktion
Der ΔLNGFR Vektor wurde durch Klonierung des humanen trunkierten LNGFR Gens in den eukaryoten pVAXl Ex- pressionvektor (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) generiert. Das ΔLNGFR 834 bp Fragment wurde mittels Polymerase chain reaction amplifiziert .
In vitro-Transkription
Das pGEM4Z/EGFP/A64 Plasmid wurde mit Spe I, das pVAX/deltaLNGFR plasmid (Greiner et al . 2004, He- mother. Transf. Med.) mit Xho I (New England Biolabs, Frankfurt, Germany) linearisiert . Die linearisierten Plasmide wurden mittels „nucleotid removal kit" (Qia- gen, Hilden, Germany) aufgereinigt und als DNA templates für die in vitro Transkriptionsreaktion verwendet. Die Transkription wurde in einem finalen 20 μl Reaktionsmix bei 37 0C mittels T7 Opti-mRNA Transkriptionskit (Cure Vac GmbH, Tübingen, Germany) angesetzt, um ,,5'-capped" in vitro-transkribierte mRNA zu generieren. Die Aufreinigung der mRNA wurde mittels DNase I Verdauung durchgeführt. Um einen PoIy A Schwanz an die mRNA von deltaLNGFR zu hängen, wurde ein PoIy(A) Tailing Kit (Ambion) benutzt. Die mRNAs von EGFP und delta LNGFR wurden abschließend mittels ,,LiCl precipitation" präzipitiert. Die mRNA- Konzentration wurde durch spektrophotometrische Analyse bei einer OD26o bestimmt. Die RNA wurde in AIi- quots bei -80 0C gelagert. Nukleofektion
CD34 -positive HPC und MSC wurden pelletiert und in humanen CD34 Cell Nucleofector™ Solutions (Amaxa GmbH, Köln, Germany) in einer Zelldichte von 2-3xlO6 oder 5xlO5 Zellen pro 100 μl resuspendiert. Die Zellen wurden mit 5 μg mRNA oder 2 μg plasmid DNA nukle- ofiziert, die Programme U- 08 (für HPC) oder C- 17 (für MSC) des Nukleofektors wurden verwendet. Nach der Nukleofektion wurden die Zellen sofort mit 500 μl vorgewärmtem Kulturmedium gemischt und in Wellplatten mit vorgewärmtem Medium transferiert. Die Zellen wurden bei 37 0C über 10 Tage kultiviert.
Evaluation der Genexpression mittels Flow-Zytometrie
Die deltaLNGFR- und EGFP-Expression nukleofizierter und nicht-transfizierter CD34 -positiver HPC und MSC wurde mittels Flowzytometrie 1, 3, 6, 8 und 10 Tage nach Transfektion bestimmt. Zur Detektion von deltaLNGFR wurden die Zellen mit „non-conjugated pu- rified mouse monoclonal anti-human NGF antibody (Santa Cruz) " und einem PE-markierten „anti mouse IgGi secondary antibody (Becton Dickinson) " inkubiert. Die Daten wurden mittels Cellquest Version 3.1 Software (Becton Dickinson) analysiert.
In Figur IA ist in der linken Spalte die Nukleofektion mit mRNA von EGFP (oberes Bild) bzw. LNGFR (un- teres Bild) dargestellt. Es ist zu erkennen, dass der Nachweis von EGFP und von LNGFR in den jeweiligen mRNA-transfizierten Zellen innerhalb weniger Tage abklingt. Anfänglich zeigt die mRNA-Transfektion jedoch eine sehr hohe Effizienz von über 90 % (EGFP/LNGFR- positive Zellen/Gesamtzahl der Zellen) . Bei der Plas- midnukleofektion wird lediglich eine Nukleofektions- effizienz von 60 bis 70 % erreicht (Figur IA, rechte Spalte) , wobei jedoch der Nachweis der Proteine langsamer abklingt als bei der mRNA-Nukleofektion.
Figur IB zeigt die Viabilitäten der nukleofizierten Zellen wiederum für die mRNA-Nukleofektion in der linken Spalte und für die Plasmidnukleofektion in der rechten Spalte. Es ist zu erkennen, dass die mRNA- Transfektion zu sehr hohen Viabilitäten mit wenigs- tens 50 % viablen Zellen führt (sowohl für EGFP als auch für LNGFR) , während die Viabilität der transfi- zierten Zellen bei der Plasmidnukleofektion insbesondere anfänglich sehr niedrig liegt.
Dies zeigt, dass mit dem vorliegenden Verfahren geeignete Faktoren in die Zellen eingebracht werden können, ohne die Nachteile der Plasmidnukleofektion (gentechnische Veränderung, geringe Viabilität der veränderten Zellen, Risiko der Tumorgenerierung) in Kauf zu nehmen.
In Figur IB wurden die jeweiligen Werte mit einer sog. „mock-Nukleofektion" verglichen, d.h. einer Kontrolle, bei der keinerlei mRNA oder Plasmide in die Zelle eingebracht wurden.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer mRNA-Nukleofektion von CD34 -positiven HPC mit dem kardialen Transkriptionsfaktor Nkx 2.5. Für diese Versuche wurde zusätz- lieh das folgende Protokoll für die mRNA-Transfektion von Nkx2.5 mittels Nukleofektion verwendet:
5xlO6 CD34 -positive hämatopoetische Progenitor Zellen wurden pelletiert, in 100 μl „human CD34 Cell Nucleo- fector™ Solution" (Amaxa GmbH, Köln, Germany) resuspendiert und mit 5 μg in vitro transkribierter (CureVac, Tübingen, Deutschland) mRNA, welche für das Nkx-2.5 Protein kodiert, gemischt. Die Zellsuspension wurde mit dem Programm U- 08 nukleofiziert , anschließend mit 500 μl vorgewärmten Kultur-Medium versetzt und in 6 -Well Platten mit vorgewärmtem Kultur-Medium transferiert. Die Zellen wurden für vier Stunden bei 37 0C, 5 % CO2 inkubiert, bevor Protein-Volllysate extrahiert wurden.
In Figur 2 zeigt sich die Expression von Nkx2.5 als eine Bande, die zwischen den beiden Markern mit 37.1 kD und 48,8 kD liegt. Durch diese Westernblot-Analyse konnte die Expression von Nkx2.5 aus der transfizier- ten mRNA sowohl 4 Stunden als auch 24 Stunden nach der Nukleofektion nachgewiesen werden.
Figur 3 zeigt eine FACS-Analyse der mRNA-Nukleo- fektion mit EGFP-mRNA bzw. LNGFR-mRNA von mesenchymalen HPC. Es ist zu erkennen, dass die Effizienz der mRNA-Nukleofektion zwischen 95,8 % (für LNGFR) und 98,8 % (für EGFP) liegt.

Claims

Patentansprüche
1. Progenitorzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit mRNA trans- fiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen in einem Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Pro- genitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert .
2. Arzneimittel enthaltend Progenitorzellen nach Anspruch 1.
3. Verwendung von Progenitorzellen zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei die Progenitorzellen mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebe- zellen fördert.
4. Verwendung nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von
kardiovaskulären Erkrankungen, hämatologischen Systemerkrankungen, nephrologischen Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Hauterkrankungen, Gastroenterologischen Erkrankungen und/oder orthopädischen Erkrankungen.
5. Verfahren zur gezielten Regenerierung von Ziel- zellen bzw. Zielgewebe in vitro dadurch gekennzeichnet, dass
Progenitorzellen mit mRNA transfiziert werden, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert, und die transfizierten Zellen den Zielzellen bzw. dem Zielgewebe zugegeben werden.
6. Verfahren zur gezielten Regenerierung von Zielzellen bzw. Zielgewebe eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass
Progenitorzellen mit mRNA transfiziert werden, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert, und die transfizierten Zellen appliziert werden.
7. Verwendung von Progenitorzellen, die mit mRNA transfiziert werden, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progenitorzellen in Zielzellen oder Zielgewebe- zellen fördert, in der Medizin.
8. Verwendung von Progenitorzellen, die mit mRNA transfiziert sind, die für ein Protein kodiert, das die Ansiedlung der Progenitorzellen im Zielgewebe und/oder die Differenzierung der Progeni- torzellen in Zielzellen oder Zielgewebezellen fördert, zur Behandlung eines Säugetieres.
9. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier ein Mensch ist.
10. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen peripher, insbe- sondere intravenös, intramuskulär, intrakutan, subkutan und/oder parenchymal appliziert werden.
11. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mRNA für mindestens eines der folgenden Proteine kodiert:
Rollingfactors wie L-Selectin, PSGL-I, Sialyl Lewis X auf Leukozyten, P-Selectin, E-Selectin, Glycam-1, CD34, MadCAM-1,
Integrine, insbesondere αLß2 (LFA-I) sowie αMß2(MAC-l) αxß2, α4ßi (pl50.95) , VLA-4, α5ßi (VLA- 5),
CAMs (Cellular Adhesion Molecules) , insbesondere ICAM-I, ICAM-2, VCAM-I und Fibronectin,
Kardiale Transkriptionsfaktoren, insbesondere Nkx2.5 und GATA-4,
Hämatopoietische Transkriptionsfaktoren, insbesondere PU-I, CEBPα, GATA-I, CD44, CD168, pl6, pl5, p21 und p27,
neuronale Transkriptionsfaktoren,
renale Transkriptionsfaktoren, insbesondere SaIl-I, Wnt-Proteine, und/oder
dermale Transkriptionsfaktoren, insbesondere Egr-1.
12. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Be- handlung mindestens einer der folgenden Indika- tionen kardiovaskulären Erkrankungen, hämatologischen Systemerkrankungen, nephrologischen Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen, Hauterkrankun- gen, Gastroenterologischen Erkrankungen und/oder orthopädischen Erkrankungen.
13. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass autologe oder allogene Pro- genitorzellen verwendet werden.
14. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektion der Progenitorzellen mit mRNA mittels Elektroporation, insbesondere Nukleotransfektionsverfahren erfolgt.
15. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Progenitorzellen Stamm- zellen, embryonale und/oder nichtembryonal
Stammzellen, adulte Stammzellen, gewebespezifische adulte Stammzellen, die spezifisch für das Zielgewebe oder ein anderes Gewebe sind, oder andere nicht voll ausdifferenzierte Zellen ver- wendet werden.
16. Zellen, Arzneimittel, Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Progenitorzellen hema- topoietische Progenitorzellen, neuronale Proge- nitorzelle und/oder Progenitorzellen der Leber, des Skelettmuskels und/oder der Haut und/oder Zellen aus Nabelschnurblut verwendet werden.
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