EP1976875A2 - Inhibition de la réponse immunitaire anti-fviii - Google Patents

Inhibition de la réponse immunitaire anti-fviii

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Publication number
EP1976875A2
EP1976875A2 EP06847152A EP06847152A EP1976875A2 EP 1976875 A2 EP1976875 A2 EP 1976875A2 EP 06847152 A EP06847152 A EP 06847152A EP 06847152 A EP06847152 A EP 06847152A EP 1976875 A2 EP1976875 A2 EP 1976875A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fragment
deglycosylated
factor viii
fviii
factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06847152A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Srini V. Kaveri
Sébastien LACROIX-DESMZES
Jagadeesh Bayry
Suryasarathi 6th floor Brigham and Women's Hospital DASGUPTA
Abdessatar Chtourou
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
LFB Biotechnologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, LFB Biotechnologies SAS filed Critical Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Publication of EP1976875A2 publication Critical patent/EP1976875A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/736—Glucomannans or galactomannans, e.g. locust bean gum, guar gum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Definitions

  • the invention relates to inhibiting the anti-FVIII immune response by blocking the endocytosis of the 'FVIII (Factor VIII) by the cells are capable of endocytosing the antigen the immune system.
  • Hemophilia A is a hereditary condition related to an abnormality of the X chromosome, which results in an inability to coagulate in people with this disease, This disease is the result of mutations on the gene of a protein involved in coagulation, the factor HIV (FVIII), which determine either a complete absence of FVIIl in the blood, or a partial deficit.
  • Hemophilia A is the most common defect affecting blood coagulation: it affects 1 in 5000 men in France, and represents 80% of patients with hemophilia.
  • the other type of hemophilia, hemophilia B affects 20% of patients with hemophilia; it is caused by a deficiency in another factor of coagulation, factor IX.
  • Treatment current hemophilia ⁇ type A or B) is to be administered intravenously deficient clotting factor or missing.
  • FVIiI Fractionation and Biotechnologies (LFB) or international pharmaceutical laboratories, as well as in the form of recombinant drugs derived from genetic engineering.
  • DNA coding for FVIiI has been isolated and expressed in mammalian cells ( Wood et al., Nature (1984) 312: 330-337), and its amino acid sequence deduced from the cDNA.
  • the secreted FVIIII is a glycoprotein with a molecular weight of 300 Kda (2332 amino acids) playing a key role. in the activation of the intrinsic pathway of coagulation.
  • Inactive PVIII consists of six domains: Al (residues 1-372), A2 (residues 373-740), B (residues 741-1648), A3 (residues 1649-2019), C1 (residues 2020-2172), and C2 (residues 2173-2332), from the N-terminus to the Cterminal end.
  • FVIII interacts with von Willebrand factor (VWF), which protects it from plasma proteases. It is in this form that FVIII circulates in the blood.
  • FVTiI dissociates from VWF after cleavage with thrombin.
  • FViII circulates in the plasma
  • This heterodimer is composed of a heavy chain (Al, A2) and a light chain (A3, Cl, C2)
  • Activated factor X converts prothrombin to thrombin
  • thrombin converts fibrinogen to fibrin
  • a clot forms
  • the major problem encountered with the administration of FVIII is the appearance in the patient of antibodies directed against FVIII, called "inhibitory antibodies.” These antibodies neutralize the procoagulant activity of FVIiI, which is rendered inactive as soon that it is perfused, so the coagulation factor administered is destroyed before it can stop the bleeding, which is a serious complication of hemophilia, the treatment becoming ineffective.
  • some genetically non-haemophiliac patients may develop inhibitors against endogenous PVIII: this is an acquired hemophilia.
  • FVII1 The mechanisms by which anti-FVIII antibodies interfere with the function of FVII1 are numerous, and include interference in proteolytic cleavage of FVII and in the interaction of FVIII with different partners such as Von Willebrand Factor (VWF), pho ⁇ pholipids. (PL), factor IX, activated factor X (FXa) or APC (Activated Frotein C).
  • VWF Von Willebrand Factor
  • PL pho ⁇ pholipids.
  • FXa activated factor X
  • APC Activated Frotein C
  • the first step in initiating a specific immune response of FVIII is endocytosis.
  • Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells (APCs), and one of the few types of APCs capable of activating primary naive T cells. DCs are therefore able to initiate a specific immune response of the antigen (1,2), CD endocytosent the antigen via a receptor or by macropinocytosis; receptor mediated endocytosis being advantageous for in vivo DCs.
  • the surface of the CD presents many endocytic receptors most of which is dependent on divalent ions, mainly calcium ( Figure 1).
  • RLC type C lectin receptors
  • MR mannose receptor
  • CD206 mannose receptor
  • CD209 the drug, PEC-205
  • Mannan is a ligand for these mannose-sensitive RLCs, particularly for MR and DC-SiGN (3-5).
  • the DC-SIGN molecule of dendritic cells binds to T-cell ICAM-3 molecules. This specific interaction appears to play an important role in the initiation of the immunological synapse between dendritic cells and LTs. Activation of the lymphocytes is inhibited by an anti-DC-SIGN blocking antibody.
  • the FVIII molecule contains 25 consensus sequences (Asn-Xxx-Thr / Ser) which are potential N-linked glycosylation sites, of which 20 have been shown to be glycosylated (6). Some N-linked glycosylations are maintained on FVIU-BDD (recombinant FVIII lacking B domain, Refacto, Wyeth) (7). Both plasma-derived FVIII and recombinant FVIII showed similar glycosylation profiles with residues ending in galactose or mannose (8, 9),
  • FViII and FVI11-BDD are thus candidate ligands for RLCs on the surface of the dendritic cell.
  • Another strategy for controlling the more recent FViXI inhibitory antibodies is the administration of anti-idiotypic antibodies (antibodies with the ability to interact with the variable region of other antibodies) to neutralize the inhibitory antibodies (St. RemyJM et al, (1999) Vox Sang; 77 (suppl 1); 21-24) * Because of the complexity of the in vivo analysis of this polyclonal immune response, teams have isolated monoclonal antibodies directed against certain domains of the immune system. FVIII. Thus, a monoclonal human IgG4kappa antibody, LE2E9, was isolated.
  • This antibody is directed against the Cl domain of FVIII and inhibits the cofactor activity of FVIII and its binding to VWF (Jacquemin et al (2000) Blood 95: 156-163).
  • a human monoclonal antibody against the C2 domain of FVII named BO2C11 (IgG4kappa), produced from a memory B cell repertoire of a patient with hemophilia A with inhibitors, was isolated ( Jacquemin et al., Blood 1998 JuI 15 ; 92 (2): 496-506).
  • BO2C11 recognizes the C2 domain of FViII and inhibits its binding to VWF and phospholipids. It completely inhibits the procoagulant activity of native and activated FVIII.
  • Another example of a monoclonal antibody is the antibody B0HB2, directed against the A2 domain of FVIII.
  • the BOIIB2 antibody inhibits the activity of FVIII by 99%. By binding to the A2 domain, it can interfere with and inhibit the binding of FIXa, which has a low affinity binding site in this region of FVIIi and therefore inhibits activity
  • the second possible mode of action is its interference in the equilibrium between the hetero-dimer (A2: A1 and A3: Cl: C2) form of FVIII and the hetero-trimer form (A2 and Al and A3).
  • the Applicant has surprisingly observed that it is possible to blog the endocytosis of PVIII by the cells of the immune system capable of endocyting the antigen and, by way of Consequently, to inhibit the formation of inhibitory anti-FVIII antibodies and to increase the half-life of FVIII.
  • a deglycosylated wine Factor or a fragment thereof for which the ability to interact and the ability to be endocyted by cells capable of endocyting an antigen are decreased or inhibited compared to native Factor VIII.
  • this deglycosylated factor VIII or the fragment thereof has a decreased or inhibited capacity to interact with the receptors present on the surface of said cells capable of endocyting an antigen, in particular with the specific receptors of the mannose and more particularly with the CD206 mannose receptor or the DC-SlGN CD209 receptor (Dendritic cell-Specific Inter ⁇ ellular adhesion molecule 3 (ICAM-3) - Grabbing Non-integrin).
  • IAM-3 Dendritic cell-Specific Inter ⁇ ellular adhesion molecule 3
  • said cells capable of endocyting an antigen are antigen presenting cells (APCs) and, in particular, dendritic cells or B lymphocytes.
  • APCs antigen presenting cells
  • said cells capable of endocyting an antigen are selected from macrophages, endothelial cells, sinusoidal endothelial cells of the liver, Kupffer cells of the liver.
  • Factor VIII or the fragment thereof is deglycosylated without resorting to one or more of the enzymes selected from the group consisting of a neuraiainida.se, a toeta- galactosidase and alpha-mannosidase.
  • the wine factor or the fragment thereof is deglycosylated by the action of a single enzyme of the endoglucosidase type and, in particular, of the endo-beta-N-acetylglucosaininidase type,
  • the enzyme used has the ability to cut oligomannose and hybrid-type hydrate structures, but does not have the ability to cut complex-type carbohydrate structures.
  • said endo-beta-N-acetylglucosaminidase-type enzyme is selected from the group consisting of endo-beta-N-acetylglucosaminidase Fl and endo-beta-N-acetylglucosaminidase H, by For example, the endc-beta-N- acetylglu ⁇ osaminidase Fl of Cbrys & obacteri ⁇ m
  • the deglycosylated factor VI11 of the invention or the fragment thereof is used as a medicament, in particular for the treatment of haemophiliac patients, and in particular for the treatment of haemophilia. type A or type B.
  • the deglycosylated factor VIII of the invention or the fragment thereof is also used for the preparation of a medicament for the treatment of hemophilia patients or for the treatment of hemophilia type A or type B, and may advantageously be used in combination with exogenous wine factor.
  • the Factor VIII deglycosylated of the invention or fragment thereof can be used for the preparation of a medicament for increasing 'the half-life of exogenous Factor Vlil or intended to decrease the immunogenicity of an exogenous factor VIII in haemophiliac patients.
  • Another aspect of the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least minus the deglycosylated ViII Factor of the invention or a fragment thereof, as well as one or more pharmaceutically acceptable adjuvant (s) and / or excipient (s).
  • a final subject of the invention concerns the use of a composition comprising mannan for the preparation of a medicament for the treatment of haemophiliac patients, or the treatment of hemophilia type A or B, according to one embodiment in particular, this composition comprising mannan is used to prepare a medicament intended to increase the half-life of an exogenous wine factor or to reduce the immunogenicity of an exogenous factor VIII in haemophiliac patients.
  • the mannan composition further comprises an exogenous factor VIIi of native type and / or a deglycosylated factor VIII or a fragment thereof according to the invention,
  • N residue which residue may be included in a polypeptide such as for example, native or deglycosylated FVIII
  • N Asparagine
  • N Asparagine
  • the basic structure is formed by the linking of two N-acetylglucosamine residues (GIcNAc) bound in (31.4). glycoside with the protein (by asparagine), the other is linked to a mannose residue in ⁇ 1,4, itself linked to 2 mannose residues, in ⁇ 1,6 and ⁇ l, 3; for example :
  • glycan structures are formed by the addition of monosaccharides to terminal mannoses. Depending on the nature of the sugar, there are three types of glycan structures:
  • oligomannose type structures, which correspond to the addition of mannose residues to the basic structure; for example :
  • FIG. 1 Schematic representation of FVII and CD membrane receptors
  • Figure 2f Measurement of the intemalisation of ⁇ 2M in the presence or absence of RAP or mannan
  • Figure 3a Measurement of relative intemalisation (%) of FVIII and FVIII-BDD in the presence of anti-MR and anti-DC antibodies -SlGN
  • FIG. 3b Measurement of Internalization (%) of FVIII by HD420 Cells as a Function of FVIII Concentration ( ⁇ M)
  • FIG. 3c Measurement of the Intensity of Bonding to CTI1D1-3 and CTLD4-7 Constructs as a function of FVIII concentration in FViIl,
  • FIG. 5a Measurement of the inhibition of the pro-coagulant activity of FVIII (%)
  • the main object of the present invention is a compound capable of inhibiting the interaction of Factor VIII with cells capable of endocyting the antigen and endocytosis of Factor VIII by said cells.
  • the Applicant has shown that certain compounds are capable of inhibiting endocytosis of FVII1 by dendritic cells such as mannan and demannosylated FVIII *
  • mannan thus inhibits the proliferation of FViII-specific T cells without blocking the pro-coagulant activity of FVIiI or the interaction of FVII1 with VWF.
  • this compound may be capable of inhibiting the interaction of FVIXI with a receptor present on cells capable of endocyting the antigen and responsible for endocytosis of FVIII by said cells.
  • the object of the present invention thus includes both compounds other than FVII1 that block receptors on cells responsible for endocytosis of FVIII, a complete modified FVTii molecule or a fragment thereof, of which the binding capacity with the cells responsible for its exidocytosis is lower than that of native FVIII.
  • each of these two types of compound inhibits endocytosis of FVIII by immune system cells capable of endocyting the antigen.
  • said FVIiI compound inhibits its own interaction and endocytosis by the cells capable of endocyting it: it is therefore a Modified FVIII or a fragment of it dorxt endocytosis is decreased compared to native FVIII.
  • this FVI11 is modified relative to the native FVIII in its glycosylation.
  • said receptor is specific for mannose and, in a particularly preferred manner, said mannose-specific receptor is the CD206 mannose receptor or the CD209 DC-SlGN receptor (dendritic ⁇ ell-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM- 3) nonintegrin grabbing).
  • CD206 mannose receptor or the CD209 DC-SlGN receptor (dendritic ⁇ ell-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM- 3) nonintegrin grabbing).
  • CD209 DC-SlGN receptor dendritic ⁇ ell-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM- 3) nonintegrin grabbing
  • said cells capable of endocyting the antigen are antigen presenting cells, for example dendritic cells or B cells.
  • the compound according to the invention is then able to inhibit the endocytosis of FVIII by the antigen presenting cells, thus to inhibit the presentation of FVIII peptides which initiates the immune response. Therefore, the compound according to the invention then inhibits the production of anti-FVIII antibodies and decreases the immunogenicity of FVIII.
  • said cells capable of endocyting the antigen are chosen from macrophages, endothelial cells, sinusoidal endothelial cells of the liver and liver Kesffer cells. These cells endocyte FVIII for the purpose of eliminating it.
  • the compound according to the invention by inhibiting the endocytosis of FVIII by these cells decreases this route of elimination of FVIII, increases the amount of circulating FVII1 therefore increases the half-life of FVIII.
  • Another object of the invention is the use of a compound according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of hemophiliacs in association with exogenous FVII1.
  • this drug is intended to decrease the immunogenicity of exogenous FVIII in hemophiliac patients and / or. to increase the half-life of exogenous FVIII in hemophiliac patients.
  • the drug is administered with exogenous FVIII or a fragment thereof for its pro-coagulant activity.
  • ⁇ iannan is used for the manufacture of a medicament for the treatment of hemophiliacs in association with exogenous FVIII, by decreasing the immunogenicity of exogenous FVIII in; hemophilia patients and / or increasing the half-life of FVIIi exxgene in hemophiliac patients.
  • a further object of the invention is the use of a modified FVIII or a fragment thereof whose endocytosis by the cells capable of endocyting the antigen is decreased compared to the native FVIII for the manufacture of In particular, this FVIII or fragment of FVII1 is demannosylated.
  • said drug consists of a FVIII less immunogenic than the native FVIII, whose half-life is increased compared to the native FVIII, but which has fully retained its pro-coagulant activity.
  • a further object of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one compound according to the invention and one or more pharmaceutically acceptable adjuvant (s) and / or excipient (s).
  • CDs were prepared from monocytes as previously described (29) with a change of culture media. Briefly, mononuclear cells were isolated from heparinized buffy coats of healthy adult donors by adherence to plastic cell culture dishes in RPMI 1S40 medium supplemented with 10% human AB serum, glutamine and antibiotics for 60 minutes. The non-adherent cells were removed by gentle washing with 3 times.
  • Adherent monocytes were cultured in X-VIVO medium (Cambrex Bio Sciences, Paris, France) supplemented with 1% human AB serum, antibiotics and in the presence of 500 IU / ml recombinant human interleukin-4 (rhIL- 4), R & D Systems (Lille, France) and 1000 IU / ml of recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF), Immunotools (Friesoythe, Germany). Half of the medium, including all supplements, was replaced every other day. After 5 days of culture, the non-adherent and slightly adherent cells corresponding to the fraction enriched in CD were harvested, washed and used for subsequent experiments.
  • FVIiI fluorescein-5-isothiocyanate
  • EXAMPLE 3 Binding of the mannose receptor constructs to, FVIII in ELISA
  • ELLA (Nunc; MAXISORP) plates were overlaid overnight with serial dilutions of FVIII forms (starting at 50 ⁇ g / ml) in 154 mM NaCl.
  • TTBS buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM Ca 2+, 154 mM NaCl and 0.05% Tween-20) was used.
  • the non-reactive sites were blocked with TBS buffer (TTBS without Tween-20) containing 3% BSA.
  • the plates were then incubated with the constructs at 2 or 10 ⁇ g / ml for 2 h at room temperature in TTBS buffer. containing 3% BSA.
  • the binding of the MR constructs was detected using a murine antibody specific for the HRP-conjugated human IgG Fc portion (clone JDC-10, Southern Biotechnology Associates, Inc. AL, USA).
  • the activity of HRP has been revealed with the OPD substrate (o- phenylenediamine, Sigma). Absorbance was measured at 492 run.
  • the plates were coated with each form of FVIII (5.56 ⁇ g / ml). Different concentrations of mannan were incubated with 10 ⁇ g / ml of the CTLD (4-7) -Fc construct for 30 min at room temperature before incubation with FVII coated plates. The absorbance was measured as described herein. ⁇ above.
  • CTLDs 4 to 7 have an affinity for mannosylated architectures not CTLDs 1 to 3.
  • the mannan shows specific binding to CTLD (4-7) -Fc.
  • Both FVIII and FVIII-BDD show a dose-dependent interaction specifically with CTLD (4-7) -Fc whereas they do not bind to the CTLD construct (1-3) indicating that glycosylation ( probably the exposed mannosylation) outside the B domain of FVIII allows the molecule to interact with the MR.
  • CDs obtained in Example r 1 (0,4x10 5 cells / 96-well plate wells with 100 .mu.l / well) were incubated with different doses (0.029, 0.057, 0.143 and 0.358 uM) ligands fluorescent conjugates (FVIU- FITC, BDD-FVIU-FITC) obtained in Example 2 in the medium X-VlVO for 0, 15, 60 and 120 min at 4 ⁇ C or 37 0 C. After the incubation period, the cells were washed with cold PBS and analyzed by flow cytometry. To study the involvement of receptors in internalization, the cells were preincubated for 30 min at 37 ° C.
  • FVIII The study of the internalization of FVIII was also carried out in the presence of 20 ug / IFIL monoclonal antibody anti ⁇ mannose receptor ⁇ P ⁇ M-1 isotype IgGl) or monoclonal anti-DC-SIGN (A2N-D1 isotype IgG1 ) or IgG j . , murine conjugated with PE-Cy (BD Pharmingen, France).
  • ⁇ MFI calculated represent the differential labeling of the FVII-positive CDs after 2 hours of incubation at 37 ° C. and 40 ° C. The results demonstrate that the internalisation of FVII is an active process , an incubation period of 2 hours and a concentration, 0.143 uM ligand were selected for subsequent experiences.
  • Figure 2d The specificity of mannan for mannose-sensitive RLCs was confirmed using dextran, a ligand typical of mannose-sensitive RLCs, and lucifer yellow (Iy), whose internalization proceeds exclusively by macropinocytosis independent of any receptor. The internalization of dextran was blocked at 80% in the presence of mannan while that of Iy was not affected.
  • Figure 2e The internalization of dextran was blocked at 80% in the presence of mannan while that of Iy was not affected.
  • FVII1 can interact with different endocytic receptors.
  • Activated ⁇ 2M a mannosylated protein that specifically targets the CD91 / LRP endocytic receptor, has been used as a model antigen. It has been determined that the expression of mannosylated residues on ⁇ 2M does not influence the internalization of the antigen when other endocytic receptors are involved. Thus, the internalization of ⁇ 2M was completely inhibited in the presence of an excess of RAP while the mannan showed no effect. Indirectly, these results suggest that the mannosylated portions present on FViil are unique and make FVin more attractive to antigen presenting cells (APCs) than other mannosylated antigens.
  • APIs antigen presenting cells
  • the increased inhibition with mannan may result from the fact that the MR has several hydrocarbon recognition domains (CDRs): the inhibition is therefore more efficient by the polyhydrocarbon mannan than by the PAM-I antibody which is directed only against the 4th CDR of the MR.
  • CDRs hydrocarbon recognition domains
  • the AZN-D1 antibody did not inhibit the internalization of FVlil by immature CDs, whereas that of FVIII-BDD was inhibited by 17.6%.
  • the expression of DC-SIGN by transfected B cells did not make it possible to increase endocytosis of FVIII.
  • Example 5 In vitro test for the proliferation of autologous CD4 + T cells
  • Example 1 The CDs of Example 1 were incubated with mannan (1 mg / ml) for 30 min at 37 ° C. FVIII dialyzed against RPMI-1640 medium (kogenate, Bayer) was added (40 ⁇ g / ml, 0.143 ⁇ M) for 2 hours. The cells were then washed and incubated with LPS (1 ⁇ g / 0.5 million cells) in complete medium for 48 hours. The cells were then washed and cultured (RPMI-1640, supplemented with 10% AB human male serum in 96-well round-bottomed cell dishes with 200 ⁇ l per well) with autologous CD4 + T cells.
  • RPMI-1640 supplemented with 10% AB human male serum in 96-well round-bottomed cell dishes with 200 ⁇ l per well
  • Figure 4a The CDs according to Example 1 are incubated alone or with mannan before the addition of FVIII. After ripening in the presence of LPS, the CDs are incubated with autologous CD4 + helper T cells. Mannan reduces the proliferation of T cells to levels comparable to negative controls.
  • Example 1 After washing, the CDs of Example 1 were resuspended in DMEM: F12 (1: 1) medium containing 10% FCS and 10,000 CDs were added to each well of a 96-well cell culture plate thoroughly. round. After incubation with mannan (1 mg / ml) in each well for 30 min, the CDs were cultured with 5000 D9E9 (FViII-specific T cell clone) in DMEM: F12 (1: 1) medium containing 10 % FCS and 20 U / ml rhlL-2 with different doses of full FVTIi or FVin-BDD
  • BO2C11 of EBV transformed B cells were cultured in the presence of 10 ⁇ g / ml of complete FVIII or FVIIi-BDD.
  • the control conditions were preserved in the absence of FVIII, D9E9 or CD.
  • hrFlX (Benefix, Baxter) was incubated with the cells in concentrations isomolar of FVII.
  • the supernatants were harvested at the end of the incubation period and tested for their IFN-Y production using the human IEN-Y Duo Set (DY285, R & D Systems) according to the manufacturer's instructions. Results: Figure 4b
  • FVII1 induces a dose-dependent activation of D9E9 cells which is inhibited up to 84%. presence of mannan (B). The proliferation of T cells is specific, as indicated by the absence of proliferation in the presence of FIX (A).
  • Mannan does not prevent the activation of D9E9 cells by autologous B cells pulsed with FVII, LE2E9 (C). This suggests that the potential effect of mannan to decrease the immunogenicity of FVIII may only be therapeutically exploited in a situation where FViII-specific B cells have not yet been stimulated (i.e., in patients previously untreated), or n r have not yet developed inhibitor after treatment.
  • Example 8 ELISA for the binding of FVIII to. VWF
  • ELLA plates (Nunc, Roskilde, Denmark) were coated with VWF (VWF, Willefactin, LFB, Les Ulis, France) at 2 ⁇ g / ml per well in PBS (pH 7.4) at 37 ° C. for 1 hour. . Plates were saturated with PBS containing 1% skim milk and 0.1% tween 20 for 1 hour at 37 ° C. FVI11 (0.3 ⁇ g / ml) was preincubated alone or with mannan (0.01 to 4 mg / ml) or with BO2C11 (human monoclonal anti-FVlil IgG) (0.05 to 40 ⁇ g / ml) in blocking buffer for 1 hour at 37 ° C.
  • VWF VWF, Willefactin, LFB, Les Ulis, France
  • Kiannan does not interfere with the interaction of FVIII with VWF.
  • EndoF1 is the only endoglycosidase capable of effectively cutting sugar residues on FVII1-BDD (see Figure 6).
  • FVIII-BDD is deglycosylated with EndoF1 according to the manufacturer's instructions, separated by SDS-PAGE and revealed by Western blotting.
  • 3.7 ⁇ g of FVII1-BDD are loaded into each well of 7.5% SDS-PAGE gels and transferred to nitrocellulose membranes. these are then revealed using 10 ⁇ g / ml of the CTLD (4-7) -Fc construct and anti-human IgG conjugated to alkaline phosphatase (left) or protogold (right) (see Figure 7).
  • the modification of the molecular weight of FVIII-BDD after incubation with EndoF1 confirms an effective deglycosylation of EndoF1.
  • FVI11-BDD Conjugate FITC treated or not treated with EndoF1 (0.143 ⁇ M) is incubated with CDs according to Example 1 (4 ⁇ 10 5 cells / well of 100 ⁇ l) in X-VIVO medium without serum at 37 ° C. C or 4 ⁇ C.
  • the cells optionally been pre-incubated with mannan (1 mg / ml) for 30 min at 37 0 C.
  • EndoF1 leaves N-acetylglucosamine residues which are also ligands of the mannose receptor.
  • ELISA plates are coated with FVIIi-BDD (5.56 ⁇ g / ml, 0.033 ⁇ M).
  • the VWF (0 to 1 ⁇ M) is incubated with 10 ⁇ g / ml of the CTLD (4-7) -Fc construct for 30 min at room temperature and added to the immobilized FVIII-BDD.
  • the binding of the construct to FVIII-BDD is revealed using HRP conjugated human anti-Fc antibody and OPD substrate (cf.
  • Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products, J Exp Me ⁇ 182: 389.

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Abstract

L'invention concerne un composé capable d'inhiber l'endocytose du FVIII (Facteur VIII) par les cellules du système immunitaire capables d'endocyter l'antigène et l'utilisation thérapeutique d'un tel composé pour la fabrication d'un, médicament destiné au traitement des hémophiles pour diminuer l'immunogénicité du FVIII et/ou augmenter la demi-vie du FVIII.

Description

Inhibition de la Réponse iπto&unit&ire anti-FVZXi
L'invention concerne l'inhibition de la réponse immunitaire anti-FVIlI par blocage de l'endocytose du ' FVIlI (Facteur VlII) par les cellules capables d'endocyter l'antigène du système immunitaire.
Domaine de l' invention
L'hémophilie A est une affection héréditaire liée à une anomalie du chromosome X, qui se traduit par une incapacité à coaguler chez les personnes atteintes, Cette maladie est le résultat de mutations sur le gène d'une protéine intervenant dans la coagulation, le facteur VIH (FVIII) , qui déterminent soit une absence totale du FVIIl dans le sang, soit un déficit partiel. L'hémophilie A est la plus commune des déficiences affectant la coagulation sanguine : elle touche en France 1 homme sur 5000, et représente 80% des patients atteints d'hémophilie. L'autre type d'hémophilie, l'hémophile B, touche 20% des patients atteints d'hémophilie ; elle est causée par une déficience en un autre facteur de coagulation, le facteur IX.
Le traitement ' actuel de l'hémophilie {de type A ou B) consiste à administrer par voie intraveineuse le facteur de coagulation déficient ou manquant. En
France, le FVI11 destiné au traitement des hémophiles est disponible sous forme de médicaments dérivés du sang fournis par le Laboratoire Français du
Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) ou des laboratoires pharmaceutiques internationaux, ainsi que sous forme de médicaments recombinants issus du génie S génétique. En effet, l'ADN codant pour le FVIiI a été isolé et exprimé dans des cellules de mammifères (Wood et al., Nature (1984) 312 : 330-337), et sa séquence en acides aminés déduite à partir de l 'ADNc- Le FVIlI sécrété est une glycoprotéine de masse moléculaire de 300 Kda (2332 acides aminés) jouant un rôle clé dans l'activation de la voie intrinsèque de la coagulation. Le PVIII inactif est constitué de six domaines : Al (résidus 1-372), A2 (résidus 373-740), B (résidus 741-1648), A3 (résidus 1649-2019), Cl (résidus 2020-2172), et C2 (résidus 2173-2332), de l'extrémité N-terminale à l'extrémité Cterminale. Après sécrétion, le FVIII interagit avec le facteur von Willebrand (VWF) qui le protège des protéases plasmatiques . C'est sous cette forme que le FVIII circule dans le sang. Le FVTiI se dissocie du VWF après clivage par la thrombine. Ce clivage aboutit à l'élimination du domaine B et à l'activation du FVIII sous la forme d'un hétérodimère constitué du domaine Al, du domaine A2 et de" la chaîne légère A3-C1-C2. C'est sous cette forme que le FViII circule dans le plasma. Cet hétérodimère est constitué d'une chaîne lourde (Al, A2) et d'une chaîne légère (A3, Cl, C2) . Lorsqu'il est perfusé à un patient hémophile, le FVIII se fixe sur le VWF dans la circulation sanguine du patient. Le FVIII activé agit comme cofacteur du facteur IX activé, accélérant la conversion du facteur X en facteur X activé. Le facteur X activé convertit la prothrombine en thrombine. La thrombine convertit alors le fibrinogène en fibrine et un caillot se forme . Le problème majeur rencontré lors de l'administration de FVIlI est l'apparition chez le patient d'anticorps dirigés contre le FVIII, appelés < anticorps inhibiteurs . Ces anticorps neutralisent l'activité procoagulante du FVIiI, qui est rendu inactif dès qu'il est perfusé. Ainsi, le facteur de coagulation administré est détruit avant d'avoir pu enrayer l'hémorragie, ce qui constitue une complication grave de l'hémophilie, le traitement devenant inefficace. De plus, certains patients non hémophiles génétiquement peuvent développer des inhibiteurs contre le PVIII endogène : il s'agit d'une hémophilie acquise. Les mécanismes par lesquels les anticorps anti-FVlll interfèrent avec la fonction du FVIIl sont nombreux, et incluent l'interférence dans le clivage protéolytique du FViII et dans l'interaction du FVIII avec différents partenaires coirαne le facteur Von Willebrand (VWF) , les phoεpholipides (PL) , le facteur IX, le facteur X activé (FXa) ou l'APC (Activated Frotein C) .
La première étape dans l'initiation d'une réponse immunitaire spécifique du FVIII est l ' endocytose. du FVlIl par. des cellules présentatrices d'antigène. Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d'antigène (CPA) les plus puissantes, et l'un des rares types de CPA capable d'activer les cellules T naïves primaires. Les CD sont donc capables d'initier une réponse immunitaire spécifique de l'antigène (1,2), Les CD endocytosent l'antigène par l'intermédiaire d'un récepteur ou par macropinocytose ; l'endocytose médiée par un récepteur étant avantageuse pour les CD in vivo. La ' surface de la CD présente nombre de récepteurs endocytiques dont la plupart est dépendante d'ions bivalents, principalement le calcium (Figure 1) . De nombreux récepteurs endocytiques, en raison de leurs domaines de reconnaissance hydrocarbonés (DRH) , sont spécifiques de résidus sucrés présents sur les antigènes et sont nommés récepteurs lectine de type C (RLC) . Les résidus mannose sur un antigène peuvent ainsi être reconnus par une série de RLCs, sensibles au mannose, sur la surface de la cellule dendritique qui comprend le récepteur mannose (MR, CD206) , le récepteur DC-SIGN (CD209) , la doctine,, PEC-205 (CD205) . Le , mannan est un ligand pour ces RLCs sensibles au mannose, en particulier pour MR et DC- SiGN (3-5) . La molécule DC-SIGN des cellules dendritiques se fixe aux molécules ICAM-3 des lymphocytes T. Cette interaction spécifique semble jouer un rôle important dans l'initiation de la synapse immunologique entre les cellules dendritiques et les LT. L'activâtion des lymphocytes est inhibée par un anticorps bloquant anti-DC-SIGN.
La molécule de FVIII contient 25 séquences consensus (Asn-Xxx-Thr/Ser) qui sont des sites potentiels de glycosylation liés à l'N, dont 20 ont été montrées être glycosylées (6) . Certaines glycosylations liées à 1'N sont maintenues sur le FVIU-BDD (FVIII recombinant dépourvu de domaine B, Refacto, Wyeth) (7). A la fois le FVIII dérivé du plasma et le FVIII recombinant ont montré des profils de glycosylation semblables avec les résidus se terminant par un galactose ou un mannose (8, 9) ,
Le FViII et le FVI11-BDD sont ainsi des ligands candidats pour les RLCs sur la surface de la cellule dendritique.
Art antérieur
II existe plusieurs traitements permettant d'atténuer les conséquences de la réponse immunitaire anti-FVIII, comme par exemple les traitements impliquant la desmopressine qui est une hormone synthétique stimulant la production de FVIIIr, mes agents promoteurs de la coagulation comme les concentrés de complexes prothrombiques ou les concentrés de complexes prothrombiques activés, le facteur ViIa recombinant et les perfusions de quantités importantes ou intermédiaires de FVlIl pour induire une tolérance. Toutefois, ces méthodes 'restent très couteuses et peu. efficaces.
Une autre stratégie de lutte contre les anticorps inhibiteurs du FViXI, plus récente, envisage l'administration d'anticorps anti-idiotypiques (anticorps ayant la. capacité d' interagir avec la région variable d'autres anticorps) neutralisant les anticorps inhibiteurs (Saint-RémyJM et al, (1999) Vox Sang ; 77 (suppl 1) ; 21-24) * Du fait de la complexité de l'analyse in vivo de cette réponse immunitaire polyclonale, des équipes ont isolé des anticorps monoclonaux dirigés contre certains domaines du FVIII. Ainsi, un anticorps humain monoclonal de type IgG4kappa, LE2E9, a été isolé. Cet anticorps est dirigé contre le domaine Cl du FViIi et inhibe l'activité cofacteur du FVIII et sa liaison au VWF (Jacquemin et al. (2000) Blood 95:156-163) . De la même façon, un anticorps monoclonal humain dirigé contre le domaine C2 du FVlII, nommé BO2C11 (IgG4kappa) , produit à partir d'un répertoire de cellules B mémoire d'un patient atteint d'hémophilie A avec inhibiteurs, a été isolé (Jacquemin et al. Blood 1998 JuI 15;92 (2) :496- 506) . BO2C11 reconnaît le domaine C2 du FViII et inhibe sa liaison au VWF et aux phospholipides. Il inhibe complètement l'activité procoagulante du FVIII natif et activé. Un autre exemple d'anticorps monoclonal est l'anticorps B0HB2, dirigé contre le domaine A2 du FVIiI. L'anticorps BOIIB2 inhibe à 99% l'activité du FVIlI, En se liant au domaine A2, il peut interférer et inhiber la fixation du FIXa qui possède un site de fixation de faible affinité dans cette région du FVIIi et dès lors inhiber l'activité enzymatique du FlXa, Le deuxième mode d'action envisageable est son interférence dans l'équilibre entre -la forme hétéro-dimère (A2:A1 et A3:Cl:C2) du FVIII et la forme hétéro-trimère (A2 et Al et A3:C1:C2) du FVIII en accélérant la dissociation du domaine A2 de ces complexes les rendant non fonctionnels- (Ananyeva 3SIM et al (2004) Blood Coagul Fibrinolysis . Mar;15 (2) :109-24. Revue) , Toutefois, la réponse immunitaire anti-FVIII est polyclonale, et les anticorps inhibiteurs du FVlII développés par un patient ne sont pas nécessairement tous dirigés contre un seul domaine du FVIII- Un traitement consistant en l'administration d'anticorps anti-idiotypiques dirigés contre des anticorps anti-FVTII dirigés contre un seul domaine du FVIIl ne pourrait neutraliser que de façon partielle la réponse immunitaire anti-FVHI développée chez le patient-
Aucun traitement n'est disponible pour agir avant l'apparition de la réponse immunitaire anti-FVIII et ainsi l'éviter.
Résumé de l ' invention
Pour pallier à de tels inconvénients de l'art antérieur, le Demandeur a observé de façon surprenante qu'il est 'possible de bloguer l'endocytose du PVIII par les cellules du système immunitaire capables d'endocyter l'antigène et, par voie de conséquence, d'inhiber la formation d'anticorps inhibiteurs anti- FVlII et d'augmenter la demi-vie du FVIII .
Conformément à un aspect de la présente invention, il est prévu un Facteur vin déglycosylé ou un fragment de celui-ci pour lequel la capacité à interagir et la capacité à être endocyté par des cellules capables d'endocyter un antigène sont diminuées ou inhibées par rapport au Facteur VIII natif.
Selon un autre mode particulièrement avantageux, ce Facteur VIII déglycosylé ou le fragment de celui-ci possède une capacité diminuée ou inhibée à interagir avec les 'récepteurs présents à la surface desdites cellules capables d'endocyter un antigène, en particulier avec les récepteurs spécifiques du mannose et plus particulièrement avec le récepteur mannose CD206 ou le récepteur DC-SlGN CD209 (Dendritic cell- Specific Interσellular adhésion molécule 3 (ICAM-3)- Grabbing Non-integrin) .
Selon une forme préférée de la présente invention, lesdites cellules capables d'endocyter un antigène sont des cellules présentatrices d'antigène (APCs) et, en particulier, des cellules dendritiques ou des lymphocytes B. Selon une autre forme préférée de l'invention, lesdites cellules capables d'endocyter un antigène sont choisies parmi des macrophages, des cellules endothéliales, des cellules endothéliales sinusoïdales du foie, des cellules de Kupffer du foie.
Selon un mode d'exécution préféré de la présente invention, le Facteur VIII ou le fragment de celui-ci est déglycosylé sans avoir recours à l'une ou à plusieurs des enzymes choisies dans le groupe constitué par une neuraiainida.se, une toeta- galactosidase et une alpha-mannosidase.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le Facteur vin ou le fragment de celui- ci est déglycosylé par l'action d'une seule enzyme de type endoglucosidase et, en particulier, de type endo- beta-N-acétylglucosaïninidase, Dans une forme préférée de la présente invention, l'enzyme utilisée possède la capacité de couper les structures d'hydrates de carbones de type oligomannoses et de type hybride, mais ne possède pas la capacité de couper les structures d'hydrates de carbones de type complexe..
Dans un mode de réalisation particulier, ladite enzyme de type endo-beta-N-acétylglucosaminida≤e est choisie dans le groupe constitué par l ' endo~beta-N- acétylglucosaminidase Fl et l ' endo-beta-N- acétylglucosaminidase H, par exemple, l ' endc—beta-N- acétylgluσosaminidase Fl de Cbrys&obacteriυm
(Fl&vobacteriυm) meningosepticum ou l ' endo-beta-N- acétylglucosaminidase H de Streptomyces piαatus,
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le Facteur Vl11 déglycosylé de l'invention ou le fragment de celui-ci est utilisé comme médicament, en particulier pour le traitement de patients hémophiles, et notamment pour le traitement de l'hémophilie de type A ou de type B. Selon un autre mode d'exécution de la présente invention, le Facteur Vïll déglycosylé de l'invention ou le fragment de celui-ci est également utilisé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients hémophiles, ou pour le traitement de l'hémophilie de type A ou de type B, et peut avantageusement être utilisé en association avec du Facteur vin exogène.
Selon encore un autre objet de la présente invention, le Facteur VlIi déglycosylé de l'invention ou le fragment de celui-ci peut être utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter ' la demi-vie d'un Facteur VlIl exogène ou destiné à diminuer l'immunogénàcité d'un Facteur VlII exogène chez les patients hémophiles.
Un autre aspect de la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins le Facteur ViII déglycosylé de l'invention ou un fragment de celui-ci, ainsi qu'un ou plusieurs adjuvant (s) et/ou excipient (s) phamaceutiquement acceptable (s) .
un dernier objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant du mannan pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients hémophiles, ou au traitement de l'hémophilie de type A ou B, Selon un mode de réalisation particulier, cette composition comprenant du mannan est utilisée pour préparer un médicament destiné à augmenter la demi-vie d'un Facteur vin exogène ou à diminuer l'immunogénicité d'un Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles. Selon un mode d'exécution avantageux, la composition de mannan comprend en outre un Facteur VIIi exogène de type natif et/ou un Facteur VIII déglycosylé ou un fragment de celui-ci selon l'invention,
De manière générale, aussi bien dans la description, et abrégé, que dans les revendications, les termes suivants qui sont rencontrés ont les significations suivantes, sauf stipulation différente :
De manière générale, aussi -bien dans la description, et abrégé, que dans les revendications, la définition d'une chaine d'hydrates de carbone liée à un résidu Asparagine (N) (lequel résidu peut être compris dans un polypeptide comme, par exemple, le FViïl natif ou déglycosylé) , est bien connue de l'homme du métier et possède une structure de base consistant en deux N- acetyl~glucosamin.es (GIcNAc) et trois mannoses et que sur cette structure viennent se greffer d'autres monosaccharides . La structure de base est formée par l'enchaînement de deux résidus N-acétylglucosamine (GIcNAc) lié en (31,4. L'un forme la liaison N- glycosidique avec la protéine (par l'asparagine) , L'autre est lié à un résidu mannose en β1,4, lui même lié à 2 résidus mannose, en α1,6 et αl,3 ; par exemple :
Les chaines d'hydrates de carbone liées à une Asparagine représentées dans la présente demande sont purement exemplatives et ne doivent pas être considérées comme limitant la présente invention de quelque manière que ce soit.
Des « antennes » sont formées par l' addition de monosaccharides sur les mannoses terminaux. Selon la nature du sucre, on distingue alors trois types de structures glycanniques :
les structures de type < oligomannose », qui correspondent à l'addition de résidus mannoses sur la structure de base ; par exemple :
- les structures de type « complexe », qui résultent de la liaison de résidus N-acétyllactosaminiques (LacNac : Ga1 βl,4 G1cNAc) sur les mannoses terminaux de la structure de base (l'ajout des GlNAc et GaI est séquentiel et résulte des activités des GlcNacT- 1,2,3,4 et 5, puis des GaIT) ; par exemple :
- les structures de type « hybride », qui sont, comme leur nom l'indique, un mélange des doux formes précédentes. Dans l'exemple presenté ci-dessous, le mannose de la branche αl,6 est substitué uniquement par des résidus mannoses alors que la branche αl,3 est substituée par un ou deux résidus N- acétyllactosaminiques :
Légende des Figures
Figure 1 : représentation schématique du FVlII et des récepteurs de la membrane des CDs
Figure 2a : Mesure de la différence entre les conditions 37*C et 4°C de l'internalisation du FVI II-BDD {~O-> et du FVIIl complet (- -)
Figure 2b Mesure de l' internaiisation du FVIII et du FVIIi-BDD en fonction du temps à 40C ou 370C
Figure 2c Mesure de l'internalisation relative du FVlIl (%) en présence de milieu, EDTA, manaan ou galactose.
Figure 2d Mesure de l'internalisation relative (%) du FVIIl, du FVIIi-BDD, du dextran et du T/FR2006/002892
12
Iy en présence ou non de mannan
Figure 2e Mesure de l' inhibition de l'intemalisation (%) du FVITI, du
FVIIi-BDD et du dextran en fonction d'une concentration croissante de mannan
Figure 2f Mesure de l'intemalisation de l'α2M en présence ou non de RAP ou de mannan Figure 3a Mesure de l'intemalisation relative (%) du FVIII et du FVIII-BDD en présence d'anticorps anti-MR et anti-DC-SlGN
Figure 3b Mesure de l'intemalisation (%) du FVIlI par les cellules HD420 en fonction de la concentration en FVIII (uM) Figure 3c Mesure de l'intensité de liaison aux constructions CTI^Dl-3 et CTLD4-7 en fonction de la concentration en FViIl,
FVIII-BDD et mannan (μg/ml)
Figure 3d Mesure de l'inhibition en % de la liaison du FVIII et du FVIIX-BDD aux constructions CTLDl-3 et CTLD4-7 en fonction de la concentration (μg/ml) en mannan
Figure 4a Mesure de la prolifération des cellules
T CD4+ {cpm) en fonction du rapport T
CD4+;CD.
Figure 4b Mesure de l'activation du clone TCD4+ humain anti-FVHl D9E9 par mesure de la production d'iFN-gamma
Figure 5a Mesure de l'inhibition de l'activité pro-coagulante du FVIII (%)
Figure 5b Mesure de l'inhibition de la liaison du
FVIII au VWF (%) par le mannan Figure 6 : Western-blot de la détection des sucres sur le FVlIl Figure 7 : Western-blot de la détection du FViII par CTLD (4-7) -Fc Figure 8 : Mesure de l'inhibition de l'internalisation du FVIII (%) après traitement ou non par l'Endo-Fl Figure 9 : Mesure de la liaison du CTLD(4-7)-Fc au
FVIJl-BDD (DO 492 nm) en fonction de la concentration en WF
Description détaillée de l' invention
L'objet principal de la présente invention est un composé capable d'inhiber l'interaction du Facteur VIII avec les cellules capables d'endocyter l'antigène et l'endocytose du Facteur VlII par lesdites cellules. En effet, le Demandeur a montré que certains composés sont capables d'inhiber l'endocytose du FVIIl par les cellules dendritigues comme le mannan et le FVIII démannosy1é*
Le Demandeur a également montré que le mannan inhibe ainsi la prolifération des cellules T spécifiques du FViII sans bloquer l'activité pro-coagulante du FVIiI ni l'interaction du FVIIl avec le VWF. En particulier, ce composé peut être capable d' inhiber l'interaction du FVIXI avec un récepteur présent sur les cellules capables d'endocyter l'antigène et responsable de l'endocytose du FVIII par lesdites cellules. L'objet de la présente invention comprend donc aussi bien des composés autres que le FVIIl qui bloquent les récepteurs sur les cellules responsables de l ' endocytose du FVIII, qu'une molécule de FVTii modifiée, complète ou un fragment de celle-ci, dont la capacité de liaison avec les cellules responsables de son exidocytose est plus faible que celle du FVIII natif. Ainsi, chacun de ces deux types de composé inMbe l'endocytose du FVIII par les cellules du système immunitaire capables d'endocyter l'antigène. Dans le cas d'une molécule de FVI11 modifiée ou d'un fragment de celle-ci, ledit composé de FVIiI inhibe sa propre interaction et sa propre endocytose par les cellules capables de l'endocyter : il s'agit donc d'un FVIII modifié ou d'un fragment de celui-ci dorxt l'endocytose est diminuée par rapport au FVIII natif. De manière préférée, ce FVI11 est modifié par rapport au FViIl natif au niveau de sa glycosylation.
Dans une forme préférée de l'invention ledit récepteur est spécifique pour le mannose et de manière particulièrement préférée ledit récepteur spécifique pour le mannose est le récepteur mannose CD206 ou le récepteur DC-SlGN CD209 (dendritic σell-specific intercellular adhésion molécule 3 (ICAM-3) -grabbing nonintegrin) .
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lesdites cellules capables d'endocyter l'antigène sont des cellules présentatrices d'antigène, par exemple des cellules dendritiques ou des lymphocytes B.
L e composé selon l'invention est alors capable d'inhiber l'endocytose du FVIII par les cellules présentatrices d'antigène, donc d'inhiber la présentation de peptides du FVIII qui initie la réponse immunitaire. Par conséquent, le composé selon l'invention inhibe alors la production d'anticorps anti-FVHI et diminue l ' immunogénicité du FVIII.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, lesdites cellules capables d'endocyter l'antigène sont choisies parmi les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules endothéliales sinusoïdales du foie, les cellules de Kesffer du foie. Ces cellules endocytent le FVIII dans le but de l'éliminer. Le composé selon l'invention en inhibant l'endocytose du FVIII par ces cellules diminue cette voie d'élimination du FVIII, augmente la quantité de FVIIl circulant donc augmente la demi-vie du FVIII.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un composé selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles en association avec du FVIIl exogène.
En particulier, ce médicament est destiné à diminuer l'immunogénicité du FVIII exogène chez les patients hémophiles et/ou. à augmenter la demi-vie du FVlII exogène chez les patients hémophiles.
Dans ce cas, le médicament est administré avec du FVIII exogène ou un fragment de celui-ci pour son activité pro-coagulante.
En particulier, le πiannan est utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles en association avec du FVIII exogène, en diminuant l'immunogénicité du FVIII exogène chez; les patients hémophiles et/ou en augmentant la demi-vie du FVIIi exxgène chez les patients hémophiles.
un objet supplémentaire de l'invention est l'utilisation d'un FVIII modifié ou d'un fragment de celui-ci dont l'endocytose par les cellules capables d'endocyter l'antigène est diminuée par rapport au FVIII natif pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémophiles En particulier, ce FVIII ou fragment de FVIIl est démannosy1é .
Dans ce cas, ledit médicament consiste en un FVIII moins iiτimunogène que le FVlIl natif, dont la demi-vie est augmentée par rapport au FVIII natif, mais qui a pleinement conservé son activité pro-coagulante.
Un objet supplémentaire de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon l'invention et un ou plusieurs adjuvant (s) et/ou excipient (s) pharmaceutiquement acceptable (s) .
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemple 1 : Préparation de CDs humaines dérivées de monocytes
Des CDs ont été préparées à partir de monocytes comme décrit précédemment (29) avec un changement de milieux de culture. En bref, des cellules mononuclées ont été isolées à partir de couches leucoplaquettaires (« buffy coats«) héparinées de donneurs adultes sains par adhérence aux boîtes de culture cellulaire en plastique en milieu RPMI 1S40 supplémenté avec 10% de sérum AB humain, de la glutamine et des antibiotiques pendant 60 minutes- Les cellules non-adhérentes ont été éliminées par 3 lavages doux avec du milieu. Les monocytes adhérents ont été cultivés dans du milieu X- VIVO 15 (Cambrex Bio Sciences, Paris, France) supplémenté avec 1% de sérum AB humain, des antibiotiques et en présence de 500 UI/ml d'interleukine 4 humaine recombinante (rhIL-4) , R&D Systems (Lille, France) et 1000 Ul/ml de facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaire humain recombinant (rhGM-CSF) , Immunotools (Friesoythe, Allemagne) . La moitié du milieu, y compris tous les suppléments, a été remplacée tous les deux jours. Après 5 jours de culture, les cellules non-adhérentes et peu adhérentes correspondant à la fraction enrichie en CD ont été récoltées, lavées et utilisées pour des expériences subséquentes -
Exemple 2 : Conjugaison du FVIH humain recombinant complet et du FVIII humain recombinant délété du domaine B avec la fluoreseéinβ
Du FVIII humain recombinant complet {1000 Ul, kogenate, Bayer) ou du FVIII humain recombinant délété du domaine B (FVIII-BDD) (1000 m, Refacto, Wyeth) ont été solubilisés dans l'eau et dialyses contre du tampon bicarbonate (pH 9.2) contenant du CaCl2, 5mM à 006/002892
4°c suivi par le couplage à la fluorescéine 5- isothiocyanate (isomère I, sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) pendant 7-8 heures à 40C. Le FVIiI marqué a ensuite été dialyse contre du milieu RPMI 1640 pour éliminer la FITC non couplée, Le FVIXI- FITC a été quantifié par la méthode Bradford en utilisant de l'albumine sérique bovine en tant que standard.
Exe mple 3 : Liaison des constructions du récepteur mannose au, FVIII en ELISA
Les constructions du récepteur mannose, CTLD(4-7)-FC et CR-FNIi-CTLD (1-3) -GR-Fc ont été gracieusement donnés par le Dr Luisa Martinez-Pomares, School of Molecular Médical Sciences, Queen's Médical Centre, University of Nottingham, UK. La liaison des constructions au FViIl humain recombinant complet et au FVIlI humain recombinant délété du domaine B a été testée soit directement en mesurant la liaison aux plaques ELISA recouvertes avec les ligands (le mannan a été utilisé comme contrôle positif) ou indirectement par des tests d'inhibition. Les plaques ELlSA (Nunc ; MAXISORP) ont été recouvertes durant la nuit avec des dilutions sériées des formes du FVlII (en commençant à 50 μg/ml) dans du NaCl 154 mM. Pour tous les lavages, le tampon TTBS (Tris-HCl 10 - mM, pH 7.5, Ca2+ 10 mM, NaCl 154 mM et 0,05% de Tween-20) a été utilisé. Les sites non-réactifs ont été bloqués par du tampon TBS (TTBS sans Tween-20) contenant 3% de BSA- Les plaques ont ensuite été incubées avec les constructions à 2 ou 10 μg/ïtil pendant 2h à température ambiante dans du tampon TTBS contenant 3% de BSA. La liaison des constructions du MR a été détectée en utilisant un anticorps murin spécifique de la partie Fc des IgG humaines conjuguée à la HRP (clone JDC-10, Southern Biotechnology Associates, Inc. AL, E-U) . L'activité de la HRP a été révélée avec le substrat OPD (o- phénylènediamine, Sigma) . L'absorbance a été mesurée à 492 run. Pour les tests d'inhibition, les plaques ont été recouvertes avec chaque forme de FVIII (5,56 μg/ml) . Différentes concentrations de mannan, ont été incubées avec 10 μg/ml de la construction CTLD(4-7) -Fc pendant 30 min à température ambiante avant l'incubation avec les plaques recouvertes de FViil, L'absorbance a été mesurée comme décrit ci~dessus. Résultats : Figures 3c et 3d Le récepteur mannose contient 8 domaines lectine de type C (CTLDs) ; les CTLDs 4 à 7 présentent une affinité pour les architectures mannosylées pas les CTLDs 1 à 3. Comme montré à la Figure 3c, le mannan montre une liaison spécifique au CTLD (4-7) -Fc. A la fois le FVIII et le FVIII-BDD montrent, une interaction dose- dépendante spécifiquement avec le CTLD (4-7) -Fc alors qu' ils ne se lient pas à la construction CTLD (1-3) indiquant que la glycosylation (probablement la mannosylation exposée) en dehors du domaine B du FVIII permet à la molécule d'interagir avec le MR. Le mannan pré-incubé avec le CTLD (4-7) -Fc inhibe la liaison des deux formes du FVIII au CTLD (4--) -Fc de façon dose-dépendante. Ceci pourrait refléter la situation des CDs où les MR sur les CDs sont saturés avec le mannan, inhibant ainsi l'endocytose du FVIIi.
Exemple 4 : Test in vitro de l'internalisation du FVIII par des CDs humaines dérivées de monocyte s
Matériel et méthodes
Les CDs obtenues dans lr Exemple 1 (0,4x105 cellules/puits de plaque de 96 puits avec 100 μl/puits) ont été incubées avec différentes doses (0,029, 0,057, 0,143 et 0,358 uM) de ligands conjugués fluorescents (FVIU-FITC, BDD-FVIU-FITC) obtenus dans l'Exemple 2 dans le milieu X-VlVO pendant 0, 15, 60 et 120 min à 4ÛC ou à 370C, Après la période d' incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS froid et analysées par cytométrie en flux. Pour étudier l'implication de récepteurs dans l'internalisation, les cellules ont été préincubées pendant 30 min à 370C avec 0, 0,001, 0,01, 0,1 et 1 mg/ml de mannan (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) avant l'ajout des ligands conjugués à la fluorescéine. En plus du FVIII-FITC et du FVIII- BDD-FITC, l'α2-macroglobulin-MA (0!2M) humaine conjuguée à la FITC de Biomac (Leipzig, Allemagne) , le dextran-FITC (poids moléculaire 40 000) de Molecular Probes (Leiden, Pays-Bas) et le Lucifer Yellow (LY-CH) de Sigma-Aldrich ont été utilisés. L'étude de l'internalisation du FViil a également été réalisée en présence de 20 μg/ïfil d'anticorps monoclonal anti¬ récepteur mannose {PΛM-1, isotype IgGl) ou d'anticorps monoclonal anti-DC-SIGN (A2N-D1, isotype IgGl) ou d'IgGj.,x murine conjuguée au PE-Cy (BD Pharmingen, France) . Pour étudier si DC-SlGN est impliqué dans l'endocytose du FVIlI, la lignée HD-420 de lymphocytes B transformée par EBV sauvage et transfectée ou non par DC-SlGN a été incubée avec différentes concentrations de FVIII-FITC (0, 0,036, 0,072 et 0,143 uM) pendant 2 heures dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de SVF (sérum de veau fœtal) et des antibiotiques. L'analyse a été faite comme pour les CDs. Résultats_ Figure 2a, b
Les CDs internalisent le FVIII complet et le FVIII-BDD proportionnellement à la dose et au temps. Les valeurs
ΔMFI calculées représentent le marquage différentiel des CDs positives au FVlII après 2 heures d'incubation à 370C et 40C- Les résultats démontrent que l' internaiisation du FVlII est un processus actif, une période d'incubation de 2 heures et une concentration en, ligand de 0,143 uM ont été choisies pour les expériences ultérieures.
Figure 2c
L'internalisation du FVIII par les CDs immatures a été significativement réduite en pré-incubant les cellules avec de l'EDTA 5mM (58,1±11,1% et 62,4+11,4% d'inhibition pour le PVIIl complet et le FVIII-BDD respectivement) , révélant ainsi un rôle des récepteurs dépendants des ions bivalents , Les récepteurs possibles du FVIII sur les CDs (c'est-à-dire CD91/LRP, ASGPR, récepteurs pour le mannosee) ont été étudiés en utilisant des ligands compétiteurs spécifiques. La protéine associées au récepteur (RAP) de 38 kD bloque l'endocytose des ligands par les membres de la famille des récepteurs des LDL tel que CD91/LRP. Un excès de RAP n'a pas permis d'empêcher l'endocytose du FVIlI par les CDs. De même, le D-galactose, ligand compétiteur pour le récepteur lectine de type C ASGPR, n'a pas significativeinent réduit l'internalisation du FVIIi, indépendamment de la présence ou de l'absence du domaine B, Par contre, l'ajout de maxman (1 mg/ml) a significative ement réduit l'endocytose du FVIII (35,0+10,0% et 41,3±17,2% d'inhibition pour le FVIiI complet et le FVIII-BDD respectivement ; p<0,05). Ceci indique que des RLCs sensibles au mannose sont impliqués directement ou indirectement dans l'internalisation du FVIIl,
Figure 2d La spécificité du mannan pour les RLCs sensibles au mannose a été confirmée en utilisant le dextran, un ligand typique des RLCs sensibles au mannose, et le lucifer yellow (Iy), dont l'internalisation procède exclusivemext par macropinocytose indépendante de tout récepteur. L'internalisation du dextran a été bloquée à 80% en présence de mannan alors que celle de Iy n'a pas été affectée. Figure 2e
L'effet neutralisant du mannan sur l'internalisation de l' antigène est proportionnelle à la dose pour le 'FVXII, le FVIII-BDD et le dextran, quelle que soit la concentration en antigène. De façon intéressante, une concentration de saturation semblable de maman a été atteinte pour les différents antigènes (100 μg/ml) , suggérant que l ' endocytose sensible au mannan de ces antigènes procède par des récepteurs sensibles au mannose semblables.
Figure 2f
Le FVIIl peut interagir avec différents récepteurs endocytiques . L'α2M activée, une protéine mannosylée qui cible spécifiquement le récepteur endocytique CD91/LRP, a été utilisée en tant qu'antigène modèle. Il a été déterminé que leexpression de résidus mannosylés sur l'α2M n'influence pas l'internalisation de l'antigène lorsque d'autres récepteurs endocytiques sont impliqués. Ainsi, l'internalisation de l'α2M a été complètement inhibée en présence d'un excès de RAP alors que le mannan n'a montré aucun effet. Indirectement, ces résultats suggèrent que les parties mannosylées présentes sur le FViil sont uniques et rendent le FVin plus attractif pour .les cellules présentatrices d'antigène (CPA) que d'autres antigènes mannosylés .
Figures 3a et 3b
Plusieurs récepteurs sur la surface des CDs et d'autres CPAs sont sensibles au mannan, comprenant le récepteur mannose MR (CD2Q6) et DC-SIGN (CD209). L'anticorps PAM-I (anti-MR) a inhibé l'internalisation du FVIIi de 20,22% et celle du FVIIi-BDD de 37,35%, indiquant ainsi l'implication du MR dans l' endocytose du FVIIl. Le fait que l'effet du mannan, sur l' endocytose du FVIIi ait été plus prononcée que celle de l'anticorps monoclonal anti-MR peut être expliqué par le fait que l' internaiisation du FVIII par les CDs implique plusieurs récepteurs sensibles au mannan non encore caractérisés. D'autre part, l'inhibition accrue avec le mannan peut résulter du fait que le MR présente plusieurs domaines de reconnaissance hydrocarbonés (CDRs) : l'inhibition est donc plus efficace par le mannan polyhydrocarboné que par l'anticorps PAM-I qui n'est dirigé que contre le 4ème CDR du MR.
L'anticorps AZN-Dl (anti-DC-SlGN) n'a pas inhibé l'internalisation du FVlil par les CDs immatures , alors que celle du FVIII-BDD a été inhibée de 17,6%. L'expression du DC-SIGN par des cellules B transfeσtées n'a pas permis d'augmenter l'endocytose du FVIlI.
Ces données suggèrent que le DC-SIGN joue un rôle mineur dans l'internalisation du FVlH par les CDs humaines .
Exemple 5 : Test in vitro de la prolifération des cellules T CD4+ autologues
Les CDs de l'Exemple 1 ont été incubées avec du mannan (1 mg/ml) pendant 30 min à 370C. Du FVlIl dialyse contre du milieu RPMI-1640 (kogenate, Bayer) a été ajouté (40 μg/ml, 0,143 uM) pendant 2 heures. Les cellules ont ensuite été lavées et incubées avec du LPS {1 μg/0,5 million de cellules) dans du milieu complet pendant 48 heures. Les cellules ont ensuite été lavées et mises en culture (RPMI-1640, supplémenté avec 10% de sérum masculin humain AB dans des plaques de culture cellulaire de 96 puits à fond rond avec 200 μl par puits) avec des cellules T CD4+ autologu.es obtenues des PBMC du donneur correspondant en utilisant le kit d'isolation cellulaire MACS (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) , Le nombre de cellules T CD4+ a été conservé constant dans chaque puits (100000 cellules/puits) alors que le nombre de CDs variait (5000, 10000 et 15000 CDs en triplicate) donnant un rapport cellule T:CD de 20:1, 10:1, 6,6:1. Après 4 jours de culture, 0,5 μCi de thymidine tritiée a été ajouté à chaque puits. Les cellules ont été récoltées après 16 heures et la radioactivité incorporée a été comptée. Résultats : Figure 4a Le mannan réduit jusqu'à 40% l'endocytose du FVIlI par les CDs humaines.
Figure 4a : Les CDs selon l'Exemple 1 sont incubées seules ou avec du mannan avant l'ajout de FVIII. Après la maturation en présence de LPS, les CDs sont incubées avec des cellules T helper CD4+ autologues. Le mannan réduit la prolifération des cellules T à des niveaux comparables à ceux des contrôles négatifs .
Exemple 6 : Test in vitro de l'activation des clones de cellules T spécifiques du FVIII
Après lavage, les CDs de l'Exemple 1 ont été resuspendues dans du milieu DMEM:F12 (1:1) contenant 10% de SVF et 10000 CDs ont été apportées dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire de 96 puits à fond rond. Après l'incubation avec le mannan (1 mg/ml) dans chaque puits pendant 30 min, les CDs ont été cultivées avec 5000 D9E9 (clone de cellule T spécifique du FViIi) dans du milieu DMEM:F12 (1:1) contenant 10% de SVF et 20 U/itil de rhlL-2 avec différentes doses de FVTIi complet ou de FVin-BDD
{10, 8, 6, 4, 2 μg/ml) pendant 20 heures à 37°C. De même que les cellules D9E9, les lignées LE2E9 et
BO2C11 de cellules B transformées par EBV ont été cultivées en présence de 10 μg/ml de FVIII complet ou de FVIIi-BDD, Les conditions contrôle ont été conservées en absence de FVIiI, D9E9 ou CDs. En tant que contrôle négatif, du hrFlX (Benefix, Baxter) a été incubé avec les cellules à des concentrations isomolaires du FVlIi. Les surnageants ont été récoltés à la fin de la période d'incubation et testés pour leur production d' IFN-Y en utilisant le Duo Set IEN-Y humain (DY285, R&D Systems) conformément aux instructions du fabricant. Résultats : Figure 4b
Le FVIIl induit uns activation dose-dépendante des cellules D9E9 gui est inhibée jusqu'à 84% en. présence de mannan (B) . La prolifération des cellules T est spécifique, comme indiqué par l'absence de prolifération en présence de FIX (A) .
Le mannan n'empêche pas l'activation des cellules D9E9 par les cellules B autologues puisées avec du FVlIl, LE2E9 (C). Ceci suggère que l'effet potentiel du mannan pour diminuer l'immunogénicité du FViii peut seulement être exploité thérapeutiquement dans une situation où les cellules B spécifiques du FViII n'ont pas encore été stimulées (c'est-à-dire chez des patients précédemment non traités), ou nr ayant pas encore développé d'inhibiteur après traitement.
Conclusion :
La diminution de l'internalisation du FVIII induite en présence de mannan résulte en une présentation amoindrie des peptides dérivés du FVIII aux cellules T CD4+ et par conséquent en une plus faible activation des lymphocytes T t
Exemple 7 s Test â© eoagulafcion
Du plasma humain normal a été incubé avec un volume identique de mannan (0 à 4000 mg/ml) pendant 2 heures à 370C. L'activité résiduelle du FVIlI a été mesurée dans un test de coagulation en une étape en utilisant la prothrombine placentaire humaine en tant qu'activateur (Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Allemagne) et du plasma dépourvu en FVIII (Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Allemagne) en tant que substrat et un Fibrintimer (Sysmex CA500, Dade Behring) . Les dilutions ont été faites dans le tampon, Owren-Koller (Diagnostica Stago, Asnières, France) . Résultats : Figure 5a Le mannan ne bloque pas l'activité pro-coagulante au PVIII.
Exemple 8 : ELISA pour la liaison du FVIII au. VWF
Les plaques ELlSA (Nunc, Roskilde, Danemark) ont été recouvertes de VWF (VWF, Willefactin, LFB, Les Ulis, France) à 2 μg/ml par puits dans du PBS (pH 7,4) à 370C pendant 1 heure. Les plaques ont été saturées avec du PBS contenant 1% de lait écrémé et 0,1% de tween 20 pendant 1 heure à 37°C. Le FVI11 (0,3 μg/ml) a été préincubé seul ou avec du mannan (0,01 à 4 mg/ml) ou avec du BO2C11 (IgG anti-FVlil monoclonale humaine) (0,05 à 40 μg/ml) dans du tampon de blocage pendant 1 heure à 370C puis ajouté à des puits recouverts de VWF et incubé pendant 1 heure à 370C. Une IgG anti-FVHl monoclonale murine (mAb6) (3 μg/ml) a été incubée à 370C pendant 1 heure. Les réactivités ont été révélées avec des anticorps IgG anti-souris de lapin couplés à la streptavidine peroxydase (Jackson Laboratories) et leur substrat. Les valeurs de liaison ont été corrigées par la liaison non-spécifique dans les puits contenant du VWF seul et ont été exprimées en pourcentage 'de la liaison résiduelle du FVIII. Aucune liaison du FViII n'a été observée sur les puits non recouverts .
Résultats : Figure 5b
Le Kiannan ne perturbe pas l'interaction du FVIII avec le VWF.
Exemple B : Etude de l'internalieation du FVIII démannosylé
Dans un premier temps, le FVIII-BDD est incubé avec trois différentes end.oglycosid.ases : EndoFl, fîndoF2 et EndoP3 (Sigma) , Les FvTII-BDD non traité, traité avec l'EndoFl, l'EndoF2 et l'EndoF3, sont séparés par SDS- PAGE et transférés sur membrane de nitrocellulose. Les sucres sont détectés avec un kit de détection des glycσprotéines (Sigma) , en utilisant la HRl? en tant que contrôle positif. L'EndoFl est la seule endoglycosidase capable de couper efficacement les résidus de sucre sur le FVIIl-BDD (cf. Figure 6) . Dans un deuxième temps, le FVIII-BDD est déglycosylé avec l'EndoFl selon les instructions du fabricant, séparé par SDS-PAGE et révélé par Western blot. 3,7 μg de FVIIl-BDD sont chargés dans chaque puits de gels SDS-PAGE à 7,5% et transférés en membranes de nitrocellulose. celles-ci sont ensuite révélées en utilisant 10 μg/ml de la construction CTLD (4-7) -Fc et une IgG anti-humaine conjuguée à la phosphatase alcaline (gauche) ou le protogold (droite) (cf. Figure 7) . La modification du poids moléculaire du FVIII-BDD après l'incubation avec l'EndoFl confirme une déglycosylation efficace de l'EndoFl. L'incubation du FVIII-BDD avec l'EndoFl résulte en la perte de la reconnaissance du FVIIl par la construction CTLD (4-7)- Fc, indiquant une élimination des résidus mannosylés . Enfin, l'inhibition de l' internalisation du FVIII-BDD marqué FITC démannosylé a été mesurée. Le FVI11-BDD conjugué FITC traité ou non à l'EndoFl (0,143 μM) est incubé avec des CDs selon l'Exemple 1 (4 x 105 cellules/puits de 100 μl) dans du milieu X-VIVO sans sérum à 37°C ou à 4ÛC. Préalablement, les cellules ont éventuellement été pré-incubées avec du mannan (1 mg/ml) pendant 30 min à 370C. Après 2 heures d'incubation, les cellules sont lavées et les intensités de florescen.ce moyenne (mfi) sont mesurées par FACS. L'internalisation du FVIII-BDD est exprimée par rapport à la mfi calculée en présence de FVIIi seul non traité (cf. Figure 8). L'inhibition de l'internalisation du FViIi-EDD était initialement de 45 ± 7% avec le itiannan sans déglycosylation. Elle est de 23,5 ± 14,4% après incubation avec l'EndoFl. Elle est encore diminuée de 32% en présence de mannan {résultats non présentés) , indiquant .que le FVIil traité par l'EndoFl est partiellement internalisé de façon dépendante du récepteur mannose. Ceci peut être expliqué soit :
- par le fait que le traitement du FVIII-BDD par l'EndoFl n'ote que partiellement les résidus mannosylés,
- soit par le fait que l'EndoFl laisse des résidus N-acétylglucosamines qui sont également des ligands du récepteur mannose.
Exemple 10 : Etude de l'influence du VWF sur la reconnaissance du FVIII par le récepteur mannose
Des plaques ELISA sont recouvertes de FVIIi-BDD (5,56 μg/ml, 0,033 uM) . Le VWF {0 à 1 uM) est incubé avec 10 μg/ml de la construction CTLD (4-7) -Fc pendant 30 min à température ambiante et ajouté au FVIII-BDD immobilisé. La liaison de la construction au FVIII-BDD est révélée en utilisant un anticorps anti-Fc humain de souris conjugué à la HRP et le substrat OPD (cf.
Figure 9 ) .
L'ajout de VWF soluble empêche CTLD (4-7) -Fc d' interagir avec le FVIII immobilisé de façon limitée
(43% d'inhibition, en excès de rapports VWF:FVIII), suggérant ainsi que le VWF interfère seulement partiellement avec la reconnaissance des résidus sucres sur le FVlII par le récepteur mannose. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci pour lequel la capacité à interagir et la capacité à être endocyté par des cellules capables d'endocyter un antigène sont diminuées ou inhibées par rapport au Facteur VlII natif,
2, Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon la revendication 1, pour lequel la capacité à interagir avec les récepteurs présents à la surface desdites cellules capables d'endocyter un antigène est diminuée ou inhibée.
3; Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon la revendication 2, pour lequel lesdits récepteurs sont des récepteurs spécifiques du mannose.
4, Facteur VlII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon la revendication 3, pour lequel lesditε récepteurs sont le récepteur mannose CD206 ou le récepteur DC-SIGN CD209 (Dendritic cell-Specific Intercellular adhésion molécule 3 (ICAM-3)- Grabbing Non-integrin) .
5. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour lequel lesdites cellules capables d'endocyter un antigène sont des cellules présentatrices d'antigène (APCS) .
6. Facteur ViII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon, la revendication 5, pour lequel lesdites cellules présentatrices d'antigène (APCs) sont des cellules dendritigues ou des lymphocytes B.
7. Facteur vin déglycαsylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour lequel lesdites cellules capables d'endocyter un antigène sont choisies parmi des macrophages, des cellules endothéliales, des cellules endothéliales sinusoïdales du foie, des cellules, de Kupffer du foie.
8. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour lequel la déglycosylation est obtenue sans l'utilisation d'une ou plusieurs enzymes choisies dans le groupe constitué par une neuraminidase, une beta- galactosidase et une alpha-mannosidase.
9. Facteur VlII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour lequel la déglycosylation est obtenue par l'action d'une seule enzyme de type endoglucosidase.
10. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon la revendication 9 , pour lequel ladite enzyme de type endoglucosidase est une endo-beta-N- acétylglucosaminidase .
11. Facteur VlII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon la revendication 10, pour lequel ladite endo- beta-N-acétylglucoεaminidase possède la capacité de couper les structures d'hydrates de carbones de type oligomannoses et de type hybride, et ne possède pas la capacité de couper les structures d'hydrates de carbone de type complexe.
12. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, pour lequel ladite endo-beta-N-acétylglucosaminidase est choisie dans le groupe constitué par l ' endo-beta- N-acétylglucosaminidase Fl et l'endo-beta-N- acétylglucosaminidase H.
13. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci .selon la revendications 12, pour lequel ladite endo- beta-N-acétylglucosaminidase Fl est l ' endo-beta-N- acétylglucosaminidase Fl de Chryseobacterium (Flavobacterium) meningosepticum.
14. Facteur vin déglycosylé ou fragment de celui-ci selon la revendications 12, pour lequel ladite endo- beta~N-acétylglucosaminidase H est l ' endo-beta-N- acétylglucoεaminidase H de Str&ptomyces picatus,
15. Facteur VlII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour utilisation comme médicament.
16. Facteur vuI déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour utilisation comme médicament pour le traitement de patients hémophiles .
17. Facteur VIII déglycosylé ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour utilisation comme médicament dans le traitement de l'hémophilie de type A ou B,
18. Utilisation du Facteur VIII déglycosylé ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients hémophiles .
19. Utilisation du Facteur VIII déglycosylé ou d'un , fragment de celui-ci selon la revendication 18 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients hémophiles en association avec du Facteur VIIi exogène.
20. Utilisation du Facteur VIII déglycosylé ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un, médicament destiné au traitement de l'hémophilie de type A ou B,
21. Utilisation du Facteur VlII déglycosylé ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la demi-vie d'un Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles.
22. Utilisation du Facteur VIII déglycosylé ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque deq revendications 1 à 14 pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer l'immunogénicité d'un Facteur VIII exogène chez les patients hémophiles.
23. Composition pharmaceutique comprenant au moins un Facteur VIII déglycosylé ou un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et un ou plusieurs adjuvant (s) et/ou excipient (s) pharmaceutiquement acceptable (s ).
24. Utilisation d'une composition comprenant du mannan pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des patients hémophiles .
25. Utilisation d'une composition comprenant du mannan pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'hémophilie de type A ou B.
26. Utilisation d'une composition comprenant du mannan pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la demi-vie d'un Facteur Vin exogène chez les patients hémophiles.
27. Utilisation d'une composition, comprenant du mannan pour la préparation d'un, médicament destiné à diminuer l'immunogénicité d'un Facteur ViII exogène chez les patients hémophiles .
28. Utilisation selon, l'une des revendications 24 à 27 pour laquelle la composition, comprenant du mannan comprend en outre un Facteur VIIl exogène de type natif et/ou un Facteur VIiI déglycosylé ou un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
EP06847152A 2005-12-22 2006-12-22 Inhibition de la réponse immunitaire anti-fviii Withdrawn EP1976875A2 (fr)

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