EP1843753A2 - Compositions pour la lyophilisation de proteines - Google Patents

Compositions pour la lyophilisation de proteines

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Publication number
EP1843753A2
EP1843753A2 EP06709174A EP06709174A EP1843753A2 EP 1843753 A2 EP1843753 A2 EP 1843753A2 EP 06709174 A EP06709174 A EP 06709174A EP 06709174 A EP06709174 A EP 06709174A EP 1843753 A2 EP1843753 A2 EP 1843753A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lyophilization
proteins
liquid composition
compositions
solution
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06709174A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Stéphanie PASSOT
Fernanda Fonseca
Michèle MARIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1843753A2 publication Critical patent/EP1843753A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin

Definitions

  • the present invention relates to the use of liquid compositions in the context of the implementation of the lyophilization process on specific proteins, previously diluted in these compositions, for the stabilization of these proteins in the dry state after lyophilization and, where appropriate, in the liquid state after rehydration of the lyophilizate obtained.
  • the stability of the proteins is generally insufficient to allow their distribution and use in liquid form [I].
  • the vacuum lyophilization process involves three essential steps: (1) freezing which converts most of the water present to ice; (2) primary drying which allows the sublimation of the ice after decreasing the pressure and increasing the temperature; (3) secondary desiccation which allows the desorption of the remaining unfrozen water by increasing the temperature.
  • Freeze-dried products characterized by a very low residual water content (less than 0.05 g of water per g of product) have several advantages: a lifetime of several years, storage at room temperature or at + 4 ° C C thus facilitating their distribution and handling as well as instant rehydration properties.
  • Carpenter et al. [3] has stated a formulation rule based on the combination of four compounds: (1) a buffering agent not crystallizing during the freezing step; and / or (2) a stabilizer preserving the conformation of the protein in an amorphous solid matrix (most often a disaccharide such as sucrose or trehalose), and / or (3) a stabilizing agent for stability product physics (mannitol, glycine, starch hydroxylethyl or bovine serum albumin), and / or 4) a nonionic surfactant agent to reduce protein aggregation. Nevertheless, from this rule, multiple combinations remain possible, because of the diversity of the molecules and their variable concentration.
  • the formulation step and the lyophilization process are closely related to each other. • The development of the method depends on the properties of the formulation chosen and conversely any variation in the method may alter the physical state of the formulation. In addition, freeze-drying is a time-consuming and expensive process because of the high dehydration times (cycles of one to several days). Today, it therefore becomes essential to take into account the criterion of improving the productivity of the process from the formulation stage by selecting appropriate excipients.
  • Tmax the highest possible resulting from the applied operating conditions (temperature and shelf 'chamber pressure). If the temperature of the product is higher than Tmax, the material will lose the porous structure formed during the freezing step and collapse on itself, this phenomenon is called “collapse” or “collapse” [4]. Generally collapsed products have higher residual water content, longer rehydration times. Although the biological activity of the protein can be preserved, their non-compliant visual appearance prevents their commercialization.
  • Tmax associated with the collapse temperature (Tcoll) depends on the physical properties of the frozen product.
  • Tmax will correspond to the eutectic temperature (Te) of the solute.
  • Tmax will be associated with the glass transition temperature of the maximum cryo-concentrated phase (Tg ').
  • Tcoll the collapse temperature
  • Tg ' the glass transition temperature of the maximum cryo-concentrated phase
  • the present invention is essentially intended to provide liquid compositions for lyophilization:
  • Tg ' glass transition temperature
  • Tcoll collapse temperature
  • compositions comprising:
  • a filler having a collapse temperature of between -18 ° C and 0 ° C
  • the collapse temperature of the composition thus obtained is between -16 ° C. and -10 ° C., making it possible to reach the fixed objective.
  • the present invention relates to the use of a liquid composition in the context of the implementation of the lyophilization process on specific proteins, previously diluted in said composition, for the stabilization of these proteins to the dry state after freeze-drying, and optionally in the liquid state after rehydration of the obtained lyophilizate, said composition having a crystalline structure or amorphous solid in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • liquid composition being such that:
  • the ratio by weight of the bulking agent on the stabilizing agent is greater than 3: 1, when said composition has a predominantly crystalline structure after lyophilization,
  • the ratio by weight of the stabilizing agent on the protein is greater than 1: 1,
  • bulking agent in the foregoing and the following, is meant any agent imparting mechanical strength to the final product, and contributing to the improvement of the appearance of the freeze-dried product and the robustness of the material. by reducing the risk of collapse of the product during the process.
  • crylapse temperature in what precedes and what follows, is meant the temperature from which the sublimation of the ice is accompanied by a loss of structure of the dry region of the product.
  • this temperature is measured by cryo-microscopy according to the methods described in the literature [5, 10].
  • stabilizing agent in the foregoing and the following is meant any compound protecting the protein during lyophilization and storage. It must be at least in the amorphous solid state (vitreous state) after freezing and dehydration, and be able to replace the water by forming hydrogen bonds with the protein.
  • the above-mentioned buffer solution is such that it does not crystallize upon freezing said composition (particularly at lower product temperatures to -35 0 C, for example between -45 ° C and -35 ° C).
  • nonionic surfactant in the foregoing and the following, is meant any compound reducing the adsorption of the protein on a surface (walls of the flasks, stopper, air-water interface, water-ice interface , for example) ; especially when the protein is present in very low concentration.
  • composition as defined above, characterized in that the filler is chosen from:
  • polyols such as mannitol or inositol, preferably mannitol, or amino acids, such as glycine or alanine, preferably glycine, when said compositions have a predominantly crystalline structure after lyophilization,
  • - or polysaccharides in particular those having an equivalent dextrose (DE) less than 10, such as maltodextrin, dextran, or hydroxyethyl starch (also referred to as HES for hydroxyethyl starch), preferably maltodextrin, when said compositions exhibit an amorphous solid structure after lyophilization.
  • DE dextrose
  • HES hydroxyethyl starch
  • DE equivalent dextrose
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of a composition as defined above, characterized in that the stabilizing agent is chosen from:
  • polyvinylpyrrolidone PVP
  • polyvinyl alcohol PVA
  • polymers having a molecular weight of less than 30 IcDa preferably PVP, when said compositions have a predominantly crystalline structure after lyophilization
  • compositions have an amorphous solid structure after lyophilization.
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use of a composition as defined above, characterized in that the surfactant is selected from Tween 80 (Polysorbate 80: Polyoxyethylene sorbitan monooleate), Tween 20 ( Polysorbate 20: Polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Triton X-100 (Octyl phenoxy polyethoxyethanol), or Brij 35 (Polyethylene glycol dodecyl ether), preferably Tween 80.
  • the surfactant is selected from Tween 80 (Polysorbate 80: Polyoxyethylene sorbitan monooleate), Tween 20 ( Polysorbate 20: Polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Triton X-100 (Octyl phenoxy polyethoxyethanol), or Brij 35 (Polyethylene glycol dodecyl ether), preferably Tween 80.
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of a composition as defined above, characterized in that the buffer solution is a solution of Tris HCl (pH 7.8), or potassium phosphate, preferably a Tris-HCl solution.
  • the buffer solution is a solution of Tris HCl (pH 7.8), or potassium phosphate, preferably a Tris-HCl solution.
  • a liquid composition as defined above also referred to as MnP below, having a solid structure which is predominantly crystalline in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • the invention relates more particularly to the above-mentioned use of a liquid composition as defined above, also referred to hereinafter GP, having a solid structure which is predominantly crystalline in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • liquid compositions as defined above, having an amorphous solid structure in the dry state after lyophilization comprise:
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of a liquid composition as defined above, also referred to as MdSW below, having an amorphous solid structure in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • the subject of the invention is more particularly the above-mentioned use of liquid compositions as defined above, characterized in that the proteins determined to be freeze-dried are proteins of pharmaceutical or analytical interest, in particular proteins of about 2000 to 3000 amino acids (or molar mass of about 300 kDa), at a concentration of 3 ⁇ g / mL to 10 ⁇ g / mL (between 0.0003% and 0.001%) in the liquid composition.
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of a liquid composition as defined above, characterized in that the stability of the lyophilized proteins is such that the activity of the proteins after storage in the freeze-dried state of 6 month at 25 0 C is at least 80% of the activity of these same proteins before lyophilization.
  • the activity of the proteins after rehydration of the lyophilisate with water osmosis and storage in the liquid state of 3 months at 4 ° C is at least 50% of the activity of these same proteins before lyophilization; by way of illustration, this threshold of 50% is reached in the case of the rehydration of the lyophilizate of toxin A, when the latter has been lyophilized in the aforementioned MnP, GP and MdSW compositions, and in the case of the rehydration of lyophilizate of toxin B, when the latter was lyophilized in the MnP and GP compositions (see the detailed description below).
  • the subject of the invention is also a process for lyophilization of determined proteins, characterized in that it comprises:
  • a step of freezing the solution obtained in the preceding step at a temperature between -35 ° C. and -45 ° C., in particular about -38 ° C., at a speed of between 0.3 ° C./min and l ° C / min,
  • a step of primary drying of the frozen solution obtained during the preceding step by decreasing the pressure (in particular at a pressure of about 10 Pa at 20 Pa) and increasing the temperature of said frozen solution to a value limit, below -18 ° C,
  • a secondary drying step by increasing the temperature of the product to about 20 0 C to 26 0 C, and maintaining the product at this temperature for a time between 6h and 10h.
  • the aforementioned freeze-drying method according to the invention is characterized in that the duration of the primary drying step is reduced by a factor of between 1.5 and 2, compared to the implementation of a freeze-drying process. conventional method not using the liquid compositions defined above for the stabilization of previously diluted proteins in said liquid compositions.
  • the invention also relates to the application of the lyophilization process as defined above, to the stabilization of proteins in the dry state after lyophilization, in particular under the conditions described above.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining stable proteins in solution, in particular under the conditions described above, characterized in that it comprises a step of rehydration of the lyophilizate, obtained by carrying out the freeze-drying process as defined above, with osmosis water.
  • the invention also relates to a method for screening liquid compositions as defined above, for carrying out the method of lyophilization on specific proteins, said liquid compositions being chosen from those for which:
  • the activity of the proteins after storage in the freeze-dried state of 6 months at 25 ° C. is at least 80% of the activity of these same proteins before lyophilization
  • the activity of the proteins after rehydration of the lyophilizate with osmosis water and storage in the 3-month liquid state at 4 ° C. is at least 50% of the activity of these same proteins. before lyophilization.
  • the collapse temperature (Tcoll) of the liquid compositions is between -16 ° C. and -10 ° C.
  • the invention also relates to a liquid composition, having a crystalline structure or amorphous solid in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • liquid composition being such that:
  • the ratio by weight of the bulking agent on the stabilizing agent is greater than 3: 1, when said composition has a predominantly crystalline structure after lyophilization,
  • the ratio by weight of the stabilizing agent on the protein, when it is present in said composition is greater than 1: 1,
  • the invention relates more particularly to a liquid composition as defined above, characterized in that the filler is chosen from:
  • polyols such as mannitol or inositol, preferably mannitol, or amino acids, such as glycine or palanine, preferably glycine, when said compositions have a predominantly crystalline structure after lyophilization,
  • compositions in particular those having an equivalent dextrose (DE) of less than 10, such as maltodextrin, dextran or hydroxyethyl starch, preferably maltodextrin, when said compositions exhibit an amorphous solid structure after lyophilization.
  • DE dextrose
  • the invention more particularly relates to a liquid composition as defined above, characterized in that the stabilizing agent is chosen from:
  • compositions have an amorphous solid structure after lyophilization.
  • the invention relates more particularly to a liquid composition as defined above, characterized in that the surfactant is selected from Tween 80, Tween 20, Triton X-100 or Brij 35, preferably Tween 80 .
  • the invention more particularly relates to a liquid composition as defined above, characterized in that the buffer solution is a solution of Tris HCl (pH 7.8), or potassium phosphate, preferably a solution of Tris HCl.
  • the buffer solution is a solution of Tris HCl (pH 7.8), or potassium phosphate, preferably a solution of Tris HCl.
  • the invention more particularly relates to a liquid composition as defined above, having a predominantly crystalline structure in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • the invention more particularly relates to a liquid composition as defined above, having a predominantly crystalline structure in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • the subject of the invention is more particularly a liquid composition as defined above. above, having an amorphous solid structure in the dry state after lyophilization, and comprising:
  • the invention also relates to a liquid composition as defined above, characterized in that it comprises a specific protein chosen from proteins of pharmaceutical or analytical interest, in particular proteins of approximately 2000 to 3000 amino acids (or molar mass of about 300 kDa), at a concentration of about 3 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL (ie 0.0003% and 0.001%) in the liquid composition.
  • a specific protein chosen from proteins of pharmaceutical or analytical interest, in particular proteins of approximately 2000 to 3000 amino acids (or molar mass of about 300 kDa), at a concentration of about 3 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL (ie 0.0003% and 0.001%) in the liquid composition.
  • a filler present at a concentration of between 40 g / l and 60 g / l and conferring a mechanical strength on the porous structure when the ice leaves and thus avoiding the entrainment of the protein with water vapor during the primary drying stage,
  • All mixtures contain at least: a filler and / or stabilizer, and a buffer consisting of a 10 mM solution of tris-HCl (pH 7.8), resulting in a final rate ratio of about 4% to about 6%. % of dry matter.
  • the formulas have a final concentration of toxin A and toxin B of 5.14 ⁇ g / ml and 3.88 ⁇ g / ml respectively.
  • These fillers can also act as a stabilizer and, in this case, if this molecule is associated with another filler, it is added to only 10 g / L.
  • toxins A and B Two model proteins have been studied: toxins A and B produced by Clostridium difficile. These proteins are used in diagnostic kits and must be rehydrated before use. Toxins A and B are large proteins (from 260 to 308 KDa). These proteins were obtained in the industrial laboratory and introduced into the liquid compositions at a final concentration of toxin A and toxin B of 5.14 ⁇ g / ml and 3.88 ⁇ g / ml respectively (Table I).
  • the thermal analysis of solutions and freeze-dried products was conducted using a differential scanning calorimeter with power compensation (DSC, Pyris model 1, Perkin Elmer LLC, Norwallk, CT, USA) equipped with a source of liquid nitrogen (CryoFill, Perkin Elmer).
  • DSC differential scanning calorimeter with power compensation
  • Equipment calibration was performed using cyclohexane, mercury and gallium.
  • 15 ⁇ L of liquid sample, or 10 mg of freeze-dried sample was placed in an aluminum capsule and an empty capsule was used as a reference. Cooling and heating rates were set at 10 0 CmIn "1.
  • the glass transition temperature is defined as the median value of the specific heat change associated with the glass transition event.
  • liquid samples were cooled to -120 ° C and then heated to 25 ° C. This thermal cycle was repeated. For some liquid samples including a charging agent crystalline, specific thermal cycles were applied to promote the total crystallization of the filler (mannitol or glycine).
  • the freeze-dried samples were cooled to -40 ° C. and then heated to 200 ° C.
  • specific thermal cycles were applied, such as isothermal retention. ("Annealing"), or a sequence repetition of short heating and holding steps (Perkin Elmer Stepscan DSC software).
  • the collapse temperature (collapse temperature, Tcoll) was measured using a cryo-desiccation cell (Linkam Scientific Instruments, Surrey, UK) equipped with a nitrogen cooling system and a temperature controller. .
  • a 5 ⁇ L sample was placed on a 16 mm diameter quartz slide and covered with a 13 mm diameter quartz slide.
  • a metal template, placed between the two blades, ensures a constant thickness of the sample.
  • Silicon oil was deposited between the sample and the temperature control plate. Direct observations of the lyophilized structure were obtained via a Nikon Elipse E600 microscope (Nikon, Japan).
  • the collapse temperature (Tcoll) determined corresponds to the minimum temperature from which, during freeze-drying, the structure established during freezing is lost [5].
  • the measurement protocol is described in an earlier publication [5].
  • the sample was frozen at 10 0 CnUn "1 to a temperature slightly below its Tg value. After lowering the pressure in the cell (about 1 Pa), the temperature of the sample was maintained for 10 to 20 min until a dry region is obtained which is wide enough to detect a deterioration of the structure, then the temperature has been gradually increased in steps of 5 ° C, or I 0 C when the beginning of collapse
  • the compositions comprising a crystalline loading agent (mannitol or glycine) have been observed, a holding step at -20 ° C. for 20 minutes has been applied after the freezing step to allow the total crystallization of the agent. charge.
  • the liquid compositions were distributed in 4 mL glass vials (with a final volume of 1 mL).
  • the flasks previously placed in a tray were placed on the shelf of a freeze dryer SMH 15 (Usifroid, Maurepas, France).
  • the following steps have been applied: (1) cooling the shelf to -60 ° C. at a speed of 1 ° C./min and maintaining the shelf at -60 ° C. for 2 hours; (2) reducing the pressure to 10 Pa, increasing the shelf temperature to -25 0 C and maintaining the shelf at -25 ° C for 50h; (3) increase the shelf temperature up to 25 ° C and maintain the temperature for 8h.
  • the vacuum was broken by injecting a stream of dry nitrogen gas, the flasks were quickly capped and packaged under vacuum in aluminum bags.
  • Thermocouples (types K) were placed at the bottom of two bottles in order to follow the temperature of the product. During sublimation (primary desiccation), the temperature of the product was maintained at about -34 ° C.
  • the antigenic activity of toxins A and B was measured by a quantitative ELISA test developed by bioMérieux. The activity was measured immediately after lyophilization, after storage for 6 months at 25 ° C. in the freeze-dried state and after storage for 3 months at 4 ° C. in the liquid state after rehydration. The coefficient of variation of this assay method is 15%.
  • liquid compositions are classified into two categories:
  • compositions comprising a filler present in the amorphous solid state after freezing they are characterized by a value of the glass transition temperature of the cryo-concentrated phase (Tg ') close to the collapse temperature (Tcoll) .
  • Tg ' glass transition temperature of the cryo-concentrated phase
  • Tcoll collapse temperature
  • the compositions based on maltodextrin have Tcoll values greater than 10 0 C than those based on polyvinylpyrrolidone (PVP).
  • compositions comprising a filler present in the crystalline state after freezing they are characterized by Tcoll values largely higher (from 10 0 C to 20 0 C) to the values of Tg '.
  • Tcoll collapse temperature representative of the loss of the freeze-dried structure appears as a more relevant criterion to consider for the optimization of the freeze-drying process.
  • Table II Synthesis of the physical properties of the 29 liquid compositions studied
  • the antigenic activity of the two proteins represents more than 80% of the antigenic activity before lyophilization for all the liquid compositions tested. No loss of antigenic activity was therefore observed.
  • the liquid compositions MnP and GP including 4% of a crystalline filler (mannitol or glycine, respectively) and 1% of a stabilizing agent, polyvinylpyrrolidone, ensure the stability of the two proteins both in the freeze-dried state. in the liquid state.
  • a non-ionic surfactant agent, Tween 80 denoted W
  • Tween 80 does not significantly improve the stability of the two proteins (cf MnPW and GPW with respect to MnP and GP, respectively).
  • liquid composition MdSW. Including 4% maltodextrin, 1% sucrose and 0.02% Tween 80, appears very effective for the stabilization of the two proteins in the freeze-dried state.
  • these three liquid compositions (MnP, GP and MdSW) have high Tcoll collapse temperature values (-15 ° C. to -14 ° C.), thus making it possible to shorten the lyophilization cycle.
  • the unit in which the activity of the protein is expressed is the percentage calculated with respect to the antigenic activity before lyophilization, knowing that the activity immediately after lyophilization is greater than 80%.
  • the value given is the average of two measurements.
  • the criterion of stability is an activity greater than or equal to 80.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de compositions liquides dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de lyophilisation sur des protéines, en vue de la stabilisation de ces protéines, lesdites compositions comprenant : un agent de charge ayant une température d'effondrement comprise entre -180C et 00C, un agent stabilisateur, une solution tampon, et, le cas échéant, un agent surfactant non ionique.

Description

COMPOSITIONS POUR LA LYOPHILISATION DE PROTEINES
La présente invention a pour objet l'utilisation de compositions liquides dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de lyophilisation sur des protéines déterminées, préalablement diluées dans ces compositions, en vue de la stabilisation de ces protéines à l'état sec après lyophilisation, et, le cas échéant à l'état liquide après réhydratation du lyophilisât obtenu.
La stabilité des protéines est généralement insuffisante pour permettre leur distribution et utilisation sous forme liquide [I]. Ainsi, pour assurer leur stabilité sur des périodes de stockage de plusieurs mois, les protéines sont lyophilisées. Le procédé de lyophilisation sous vide comporte trois étapes essentielles : (1) la congélation qui convertit la majeure partie de l'eau présente en glace ; (2) la dessiccation primaire qui permet la sublimation de la glace après diminution de la pression et augmentation de la température ; (3) la dessiccation secondaire qui permet la désorption de l'eau restante non congelée par augmentation de la température. Les produits lyophilisés, caractérisés par une teneur en eau résiduelle très faible (inférieure à 0,05 g d'eau par g de produit) présentent plusieurs avantages : une durée de vie de plusieurs années, un stockage à température ambiante ou à +4°C facilitant ainsi leur distribution et manipulation ainsi que des propriétés de réhydratation instantanée.
Cependant, même si le procédé de lyophilisation améliore la stabilité de la protéine, il génère différents stress susceptibles de dénaturer la protéine. L'ajout d'excipients, comme les sucres, polyols ou acides aminés, est donc nécessaire pour protéger la protéine lors des étapes de congélation et de déshydratation. D'autres excipients, comme les polymères, sels, ions, peuvent aussi être utilisés pour leurs propriétés d'agent de charge ou de pouvoir tampon. Une grande variété de molécules, seules ou en combinaisons, à diverses concentrations,' assurant une protection efficace a été répertoriée dans la littérature' [2]. Ainsi, l'étape de formulation est complexe et le développement de nouvelles protéines lyophilisées reste une démarche longue et empirique.
Récemment, Carpenter et al. [3] a énoncé une règle • de formulation reposant sur l'association de quatre composés : (1) un agent tampon ne cristallisant pas lors de l'étape de congélation ; et/ou (2) un agent stabilisateur préservant la conformation de la protéine au sein d'une matrice solide amorphe (le plus souvent un disaccharide comme du saccharose ou du tréhalose), et/ou (3) un agent de charge assurant la stabilité physique du produit (mannitol, glycine, hydroxyléthyl d'amidon ou albumine de sérum bovin), et/ou 4) un agent surfactant non ionique pour réduire l'agrégation des protéines. Néanmoins, à partir de cette règle, de multiples combinaisons demeurent possibles, en raison de la diversité des molécules et de leur concentration variable.
L'étape de formulation et le procédé de lyophilisation sont étroitement reliés entre eux. Le • développement du procédé dépend des propriétés de la formulation choisie et inversement toute variation du procédé risque de modifier l'état physique de la formulation. De plus, la lyophilisation est un procédé long et coûteux en raison des temps de déshydratation importants, (cycles de un à plusieurs jours). Aujourd'hui, il devient donc indispensable de prendre en compte le critère d'amélioration de la productivité du procédé dès l'étape de formulation en sélectionnant des excipients appropriés.
Considérant la conduite du procédé de lyophilisation, la dessiccation primaire, étape la plus longue du procédé, doit être pratiquée à la température produit la plus haute possible (Tmax) résultant des conditions opératoires appliquées (température étagère et' pression de la chambre). Si la température du produit est supérieure à Tmax, le matériau va perdre la structure poreuse formée lors de l'étape de congélation et s'effondrer sur lui-même, ce phénomène est appelé « collapse » ou « effondrement » [4]. Généralement les produits effondrés présentent des teneurs en eau résiduelle plus élevées, des temps de réhydratation plus longs. Même si l'activité biologique de la protéine peut être conservée, leur aspect visuel non conforme empêche leur commercialisation. La valeur de Tmax, associée à la température d'effondrement (Tcoll) dépend des propriétés physiques du produit congelé. Si le matériau est essentiellement cristallin après congélation, Tmax correspondra à la température eutectique (Te) du soluté. En revanche, si le matériau est à l'état solide amorphe après congélation, Tmax sera associée à la température de transition vitreuse de la phase cryo-concentrée au maximum (Tg'). Dans le cas de matériaux complexes, comprenant des tissus ou des cellules par exemple, la valeur de la température d'effondrement Tcoll (et donc Tmax) sera comprise entre Te ou la température de fusion et Tg' [5]. L'analyse enthalpique différentielle et la cryo-microscopie sont les deux méthodes généralement utilisées pour caractériser le comportement physique des formulations pharmaceutiques [4, 6-9]. La cryo-microscopie permet de déterminer visuellement la température d'effondrement (Tcoll), c'est-à-dire la température à partir de laquelle la sublimation de la glace s'accompagne de l'effondrement de la partie sèche [10]. La présente invention a essentiellement pour but de fournir des compositions liquides pour la lyophilisation :
- ne présentant pas d'excipient d'origine animale,
- assurant une bonne productivité du procédé de lyophilisation (cycle court et robustesse de la formule),
- préservant l'activité des protéines à applications pharmaceutiques au cours d'un stockage à l'état lyophilisé (conditions extrêmes : 6 mois à 250C), et le cas échéant, au cours d'un stockage à l'état liquide après réhydr,atation (conditions extrêmes : 3 mois à 40C).
Cherchant à développer une approche rationnelle pour la mise au point de formules lyophilisées en liaison avec la productivité du procédé, les inventeurs ont choisi de considérer la température de transition vitreuse (Tg') et la température d'effondrement (Tcoll) comme critères de sélection.
Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que les compositions comprenant :
- un agent de charge ayant une température d'effondrement comprise entre — 18°C et 0°C,
- un agent stabilisateur,
- une solution tampon,
- et, le cas échéant, un agent surfactant non ionique, dans des proportions telles que la température d'effondrement de la composition ainsi obtenue est comprise entre -16°C et -100C, permettaient d'atteindre l'objectif fixé.
A ce titre, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une composition liquide dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de lyophilisation sur des protéines déterminées, préalablement diluées dans ladite composition, en vue de la stabilisation de ces protéines à l'état sec après lyophilisation, et, le cas échéant à l'état liquide après réhydratation du lyophilisât obtenu, ladite composition présentant une structure cristalline ou solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant :
- environ 40g/L à 60 g/L d'un agent de charge ayant une température d'effondrement comprise entre -180C et O0C,
- environ 10 g/L à 20 g/L d'un agent stabilisateur,
- environ 10 mM à 20 mM d'une solution tampon, ladite solution tampon ne cristallisant pas lors de la congélation de ladite composition, j
- et, le cas échéant, environ 0,1 g/L à 0,4 g/L d'un agent surfactant non ionique, ladite composition liquide étant telle que :
* le ratio en masse de l'agent de charge sur l'agent stabilisateur est supérieur à 3 :1, lorsque ladite composition présente une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
* le ratio en masse de l'agent stabilisateur sur la protéine est supérieur à 1 : 1,
* elle ne contient pas d'excipient d'origine animale,
* elle a une température d'effondrement comprise entre -16°C et -10°C.
Par l'expression « agent de charge », dans ce qui précède et ce qui suit, on entend tout agent conférant une résistance mécanique au produit final, et contribuant à l'amélioration de l'aspect du produit lyophilisé et à la robustesse du matériau en réduisant les risques d'effondrement du produit au cours du procédé.
Par l'expression « température d'effondrement », dans ce qui précède et ce qui suit, on entend la température à partir de laquelle la sublimation de la glace s'accompagne d'une perte de structure de la région sèche du produit. Avantageusement, cette température est mesurée par cryo-microscopie selon les méthodes décrites dans la littérature [5, 10].
Par l'expression « agent stabilisateur », dans ce qui précède et ce qui suit, on entend tout composé protégeant la protéine au cours de la lyophilisation et du stockage. Il doit être pour partie au moins à l'état solide amorphe (état vitreux) après congélation et déshydratation, et être capable de remplacer l'eau en formant des liaisons hydrogène avec la protéine.
Avantageusement,, comme indiqué ci-dessus, la solution tampon susmentionnée est telle qu'elle ne cristallise pas lors de la congélation de ladite composition (notamment à des températures de produit inférieures à -350C, par exemple comprises entre -45°C et -35°C).
Par l'expression « agent surfactant non ionique », dans ce qui précède et ce qui suit, on entend tout composé réduisant l'adsorption de la protéine sur une surface (parois du flacons, bouchon, interface air-eau, interface eau-glace, par exemple) ; notamment quand la protéine est présente en très faible concentration.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, d'une composition telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que l'agent de charge est choisi parmi :
- les polyols, tel que le mannitol ou l'inositol, de préférence le mannitol, ou les acides aminés, telle que la glycine ou l'alanine, de préférence la glycine, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou les polysaccharides, notamment ceux ayant un dextrose équivalent (DE) inférieur à 10, tels que la maltodextrine, le dextrane, ou l'amidon hydroxyéthyl (encore désigné HES pour hydroxyethyl starch), de préférence la maltodextrine, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
Le dextrose équivalent (DE) susmentionné est un indice de comportement des polysaccharides qui varie comme l'inverse de la masse molaire. Une maltodextrine de DE compris entre 6 et 10 présente une masse molaire d'environ 100 000 g/mol.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, d'une composition telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que l'agent stabilisateur est choisi parmi :
- le polyvinylpyrolidone (PVP), ou l'alcool polyvinylique (PVA), à savoir des polymères présentant une masse molaire inférieure à 30 IcDa, de préférence le PVP, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou le saccharose, le tréhalose, le maltose ou le lactose, de préférence le saccharose, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, d'une composition telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que l'agent surfactant est choisi parmi le Tween 80 (Polysorbate 80 : Polyoxyethylene sorbitan monooleate), le Tween 20 (Polysorbate 20 : Polyoxyethylene sorbitan monolaurate), le Triton X-100 (Octyl phenoxy polyethoxyethanol), ou le Brij 35 (Polyèthylene glycol dodecyl ether), de préférence le Tween 80.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, d'une composition telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que la solution tampon est une solution de Tris HCl (pH 7,8), ou de phosphate de potassium, de préférence une solution de Tris-HCl.
Avantageusement, les compositions liquides telles que définies ci-dessus, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, comprennent:
- environ 40g/L à 60 g/L d'un agent de charge tel que défini ci-dessus,
- environ 10 g/L à 20 g/L d'un agent stabilisateur tel que défini ci-dessus,
- environ 10 mM à 20 mM d'une solution tampon telle que définie ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, d'une composition liquide telle que définie ci-dessus, encore désignée MnP ci-après, présentant une structure solide majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de mannitol en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone (PVP) en tant qu'agent stabilisateur, - et 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, d'une composition liquide telle que définie ci-dessus, encore désignée GP ci-après, présentant une structure solide majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de glycine en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- et 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
; Avantageusement, les compositions liquides telles que définies ci-dessus, présentant une structure solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, comprennent:
- environ 40g/L à 60 g/L d'un agent de charge tel que défini ci-dessus, •
- environ 10 g/L à 20 g/L d'un agent stabilisateur tel que défini ci-dessus,
- environ 10 mM à 20 mM d'une solution tampon telle que définie ci-dessus,
- et environ 0,1 g/L à 0,4 g/L d'un agent surfactant non ionique tel que défini ci-dessus. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, d'une composition liquide telle que définie ci-dessus, encore désignée MdSW ci-après, présentant une structure solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de maltodextrine en tant qu'agent de charge, - 10 g/L de saccharose en tant qu'agent stabilisateur,
- 0,2 g/L de Tween 80 en tant qu'agent surfactant,
- et 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de compositions liquides telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que les protéines déterminées à lyophiliser sont des protéines d'intérêt pharmaceutique, ou analytique, notamment des protéines d'environ 2000 à 3000 acides aminés (ou de masse molaire d'environ 300 kDa), à une concentration de 3 μg/mL à 10 μg/mL (soit entre 0.0003% et 0.001%) dans la composition liquide.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, d'une composition liquide telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la stabilité des protéines lyophilisées est telle que l'activité des protéines après un stockage à l'état lyophilisé de 6 mois à 250C est d'au moins 80% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation.
Le cas échéant, l'activité des protéines après réhydratation du ' lyophilisât avec de l'eau osmosée et un stockage à l'état liquide de 3 mois à 4°C est d'au moins à 50% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation ; à titre d'illustration, ce seuil de 50% est atteint dans le cas de la réhydratation du lyophilisât de la toxine A, lorsque cette dernière a été lyophilisée dans les compositions MnP, GP et MdSW susmentionnées, et dans le cas de la réhydratation du lyophilisât de la toxine B, lorsque cette dernière a été lyophilisée dans les compositions MnP et GP (voir la description détaillée ci-après).
L'invention a également pour objet un procédé de lyophilisation de protéines déterminées, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de dilution des protéines dans une composition telle que définie ci-dessus, dans des proportions telles que les protéines représentent environ 0.0003% à 0.001% de matière sèche dans la composition liquide (par exemple 0.0004% en toxine A et 0.0005% en toxine B),
- une étape de congélation de la solution obtenue lors de l'étape précédente à une température comprise entre -35°C et -45°C, notamment d'environ -38°C, à une vitesse comprise entre 0.3°C/min et l°C/min,
- une étape de dessiccation primaire de la solution congelée obtenue lors de l'étape précédente par diminution de la pression (notamment à une pression d'environ 10 Pa à 20 Pa) et augmentation de la température de ladite solution congelée jusqu'à une valeur limite, inférieure à -18°C,
- une étape de dessiccation secondaire par augmentation de la température du produit jusqu'à environ 200C à 260C, et maintien du produit à cette température pendant un temps compris entre 6h et 1Oh.
Avantageusement le procédé susmentionné de lyophilisation selon l'invention, est caractérisé en ce que la durée de l'étape de dessiccation primaire est réduite d'un facteur compris entre 1.5 et 2, par rapport à la mise en oeuvre d'un procédé de lyophilisation classique n'utilisant pas les compositions liquides définies ci-dessus pour la stabilisation des protéines préalablement diluées dans lesdites compositions liquides.
L'invention concerne également l'application du procédé de lyophilisation tel que défini ci- dessus, à la stabilisation des protéines à l'état sec après lyophilisation, notamment dans les conditions décrites ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de protéines stables en solution, notamment dans les conditions décrites ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réhydratation du lyophilisât, obtenu par mise en œuvre du procédé de lyophilisation tel que défini ci-dessus, avec de l'eau osmosée.
L'invention concerne également un procédé de criblage de compositions liquides telles que définies ci-dessus, pour la mise en oeuvre du procédé de lyophilisation sur des protéines déterminées, lesdites compositions liquides étant choisies parmi celles pour lesquelles :
- l'activité des protéines après un stockage à l'état lyophilisé de 6 mois à 250C est d'au moins 80% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation,
- le cas échéant, l'activité des protéines après réhydratation du lyophilisât avec de l'eau osmosée et un stockage à l'état liquide de 3 mois à 4°C est d'au moins 50% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation.
- la température d'effondrement (Tcoll) des compositions liquides est comprise entre -16°C et -100C.
L'invention a également pour objet une composition liquide, présentant une structure cristalline ou solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant :
- environ 40g/L à 60 g/L d'un agent de charge ayant une température d'effondrement comprise entre -18°C et O0C,
- environ 10 g/L à 20 g/L d'un agent stabilisateur,
- environ 10 mM à 20 mM d'une solution tampon, ladite solution tampon ne cristallisant pas lors de la congélation de ladite composition,
- et, le cas échéant, environ 0,1 g/L à 0,4 g/L d'un agent surfactant non ionique, ladite composition liquide étant telle que :
* le ratio en masse de l'agent de charge sur l'agent stabilisateur est supérieur à 3 :1, lorsque ladite composition présente une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
* le ratio en masse de l'agent stabilisateur sur la protéine, lorsque celle-ci est présente dans ladite composition, est supérieur à 1 :1,
* elle ne contient pas d'excipient d'origine animale,
* elle a une température d'effondrement comprise entre -16°C et— 100C.
L'invention concerne plus particulièrement une composition liquide telle que définie ci- dessus, caractérisée en ce que l'agent de charge est choisi parmi :
- les polyols, tel que le mannitol ou l'inositol, de préférence le mannitol, ou les acides aminés, telle que la glycine ou Palanine, de préférence la glycine, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou les polysaccharid.es, notamment ceux ayant un dextrose équivalent (DE) inférieur à 10, tels que la maltodextrine, le dextrane ou l'amidon hydroxyéthyl, de préférence la maltodextrine, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
L'invention a plus particulièrement pour objet une composition liquide telle que définie ci- dessus, caractérisée en ce que l'agent stabilisateur est choisi parmi :
- Ie1 polyvinylpyrolidone (PVP), ou l'alcool polyvinylique (PVA), de préférence IePVP, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou le saccharose, le tréhalose, le maltose ou le lactose, de préférence le saccharose, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
L'invention concerne plus particulièrement une composition liquide telle que définie ci- dessus, caractérisée en ce que l'agent surfactant est choisi parmi le Tween 80, le Tween 20, le Triton X-IOO ou le Brij 35, de préférence le Tween 80.
L'invention a plus particulièrement pour objet une composition liquide telle que définie ci- dessus, caractérisée en ce que la solution tampon est une solution de Tris HCl (pH 7,8), ou de phosphate de potassium, de préférence une solution de Tris HCl.
L'invention concerne plus particulièrement une composition liquide telle que définie ci- dessus, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de mannitol en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
L'invention a plus particulièrement pour objet une composition liquide telle que définie ci- dessus, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant: ,
- 40 g/L de glycine en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
L'invention a plus particulièrement pour objet une composition liquide telle que définie ci- dessus, présentant une structure solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de maltodextrine en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L dans la composition liquide de saccharose en tant qu'agent stabilisateur, <
- 0,2 g/L de Tween 80 en tant qu'agent surfactant,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
L'invention concerne également une composition liquide telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine déterminée choisie parmi les protéines d'intérêt pharmaceutique, ou analytique, notamment des protéines d'environ 2000 à 3000 acides aminés (ou de masse molaire d'environ 300 kDa),à une concentration d'environ entre 3 μg/mL et 10 μg/mL (soit 0.0003% et 0.001%) dans la composition liquide.
La présente invention sera davantage détaillée à l'aide de la description qui suit des compositions liquides telles que définies ci-dessus, de leur utilisation dans le cadre de la mise en œuvre de la lyophilisation des toxines A et B de Clostridium difficile, et de la meilleure stabilité de ces protéines ainsi lyophilisées par rapport aux mêmes protéines lyophilisées par les techniques classiques dans ce domaine.
I. Démarche
1) Refiles de mélange a) En raison des contraintes de sécurité sanitaires, aucun excipient d'origine animale n'a été utilisé. Ainsi la l'albumine de sérum bovin (BSA), souvent proposée dans la littérature comme agent de charge et stabilisateur a été écartée. b) Après la sélection de 8 molécules, un criblage préliminaire des compositions liquides a été effectué d'après leurs propriétés physiques. 29 compositions liquides (cf. Tableau I) ont été finalement établies selon la règle suivante :
« Tous les mélanges contiennent au minimum :
- un agent de charge (et/ou stabilisateur) présent à une concentration comprise entre 40 g/L et 60 g/L et conférant une résistance mécanique à la structure poreuse lors du départ de la glace et évitant ainsi l'entraînement de la protéine avec la vapeur d'eau lors de l'étape de dessiccation primaire,
- et un agent tampon ne cristallisant pas lors de l'étape de congélation, soit un tampon Tris-HCl présent à une concentration de 10 mM. » ' Tableau I. Composition des 29 compositions liquides testées (a)
Agent de charge et/ ou
Agent de charge Stabilisateur Stabilisateur Cryoprotecteur Surfactant (cristallin) (solide amorphe) (solide amorphe) (b)
Glycine Mannitol PVP Maltodextrine Sucrose Maltose PEG TweenδO '
(25 KDa) (5-8 DE)
G Mn P Md S M E W
Md 40g/L
MdW 40g/L 0.02%
MdSW 40g/L 10g/L 0.02%
MdS 40g/L lOg/L
MdE 40g/L 10g/L
MdSE 40g/L 10g/L 10g/L
P 40g/L
PE 40g/L lOg/L
PW 40g/L 0.02%
PS 40g/L 10g/L
PM 40g/L lOg/L
PSW 40g/L 10g/L 0.02%
G 40g/L
GM 40g/L lOg/L
GS 40g/L lOg/L
GSW 40g/L 10g/L 0.02%
GSE 40g/L lOg/L 10g/L
GE 40g/L lOg/L
GW 40g/L 0.02%
GMd 40g/L 10g/L
GP 40g/L 10g/L
GPW 40g/L lOg/L 0.02%
GPE 40g/L 10g/L lOg/L
Mn 40g/L
MnP 40g/L 10g/L
MnS 40g/L 10g/L
MnW 40g/L 0.02%
MnPW 40g/L 10g/L 0.02%
S 40g/L
(a) Critère de définition des 29 formules :
Tous les mélanges contiennent au minimum : un agent de charge et/ou stabilisateur, et un tampon constitué d'une solution 10 mM de tris-HCl (pH 7.8), d'où une formule à un taux final voisin de 4% à 6% de matière sèche.
Les formules présentent une concentration finale en toxine A et en toxine B de 5.14μg/mL et 3.88μg/mL respectivement. (b) : Ces agents de charge peuvent aussi jouer le rôle de stabilisateur et, dans ce cas, si cette molécule est associée à un autre agent de charge, elle n'est ajoutée qu'à 10 g/L.
2) Mesure des propriétés physiques des compositions liquides et évaluation de la stabilité des protéines lyophilisées avec ces compositions a) Afin de sélectionner la composition liquide répondant au compromis « stabilité » des protéines et « bonne productivité » du procédé de lyophilisation, les propriétés physiques (températures de transition vitreuse et d'effondrement) ont été mesurées. b) La stabilité des protéines a été évaluée après lyophilisation, après 6 mois de stockage à 25°C à l'état lyophilisé et après 3 mois de stockage à 4°C à l'état liquide après réhydratation. La méthode de suivi de l'activité des protéines est spécifique des protéines étudiées.
IL Matériels et Méthodes
1) Protéines de l'étude
Deux protéines modèles ont été étudiées : les toxines A et B produites par Clostridium difficile. Ces protéines sont utilisées dans des kits de diagnostic et doivent être réhydratées avant utilisation. Les toxines A et B sont des protéines de taille importante (de 260 à 308 KDa). Ces protéines ont été obtenues en laboratoire industriel et introduites dans les compositions liquides à raison d'une concentration finale en toxine A et en toxine B de 5.14μg/mL et 3.88μg/mL respectivement (Tableau I).
2) Analyse enthalpique différentielle
L'analyse thermique des solutions et des produits lyophilisés a été conduite à l'aide d'un calorimètre différentiel à balayage à compensation de puissance (DSC, modèle Pyris 1 ; Perkin Elmer LLC, Norwallk, CT, USA) équipé d'une source d'azote liquide (CryoFill, Perkin Elmer). L'étalonnage de l'équipement a été réalisé à l'aide du cyclohexane, du mercure et du gallium. 15 μL d'échantillon liquide, ou 10 mg d'échantillon lyophilisé ont été placé dans une capsule d'aluminium et une capsule vide a été utilisée comme référence. Les vitesses de refroidissement et de chauffage ont été fixées à 100CmIn"1. La température de transition vitreuse est définie comme la valeur médiane de la variation de chaleur spécifique associée à l'événement de transition vitreuse.
Les échantillons liquides ont été refroidis jusqu'à -120°C puis chauffés jusqu'à 250C. Ce cycle thermique a été répété. Pour certains échantillons liquides comprenant un agent de charge cristallin, des cycles thermiques spécifiques ont été appliqués afin de favoriser la cristallisation totale de l'agent de charge (mannitol ou glycine).
, Les échantillons lyophilisés ont été refroidis jusqu'à -4O0C puis chauffés jusqu'à 2000C. Pour éliminer toute interférence du signal avec des phénomènes de relaxation enthalpique, des cycles thermiques spécifiques ont été appliqués tels qu'un maintien en isotherme (« annealing »), ou une répétition de séquence de courtes étapes de chauffage et de maintien (logiciel Stepscan DSC de Perkin Elmer).
3) Crvo-microscopie
La température d'effondrement (dite de collapse, Tcoll) a été mesurée en utilisant une cellule de cryo-dessiccation (Linkam Scientific Instruments, Surrey, UK) équipée d'un système de refroidissement à l'azote et d'un programmateur de température. Un échantillon de 5 μL a été placé sur une lame de quartz de 16 mm de diamètre et recouvert d'une lamelle de quartz de 13 mm de diamètre. Un gabarit métallique, placé entre les deux lames, assure une épaisseur constante de l'échantillon. De l'huile de silicone a été déposée entre l'échantillon et la plaque de régulation de la température. Les observations directes de la structure lyophilisée ont été obtenues par l'intermédiaire d'un microscope de type Nikon Elipse E600 (Nikon, Japan). La température d'effondrement (Tcoll) déterminée correspond à la température minimale à partir de laquelle, au cours de la lyophilisation, il y a perte de la structure établie lors de la congélation [5].
Le protocole de mesure est décrit dans une publication antérieure [5]. L'échantillon a été congelé à 100CnUn"1 jusqu'à une température légèrement inférieure à sa valeur de Tg'. Après abaissement de la pression dans la cellule (environ 1 Pa), la température de l'échantillon a été maintenue pendant 10 à 20 min jusqu'à l'obtention d'un région sèche suffisamment large pour détecter une détérioration de la structure. Puis, la température a été progressivement augmentée par pas de 5°C, ou I0C lorsque le début d'effondrement a été observé. Povir les compositions comprenant un agent de charge cristallin (mannitol ou glycine), une étape de maintien- à -200C pendant 20 min a été appliquée après l'étape de congélation pour permettre la cristallisation totale de l'agent de charge.
4) Cycle de lyophilisation
Les compositions liquides ont été réparties dans des flacons en verre de 4 mL (avec un volume final de 1 mL). Les flacons préalablement déposés dans un plateau ont été placés sur l'étagère d'un lyophilisateur SMH 15 (Usifroid, Maurepas, France). Les étapes suivantes ont été appliquées: (1) refroidissement de l'étagère jusqu'à -600C à une vitesse de l°C/min et maintien de l'étagère à -6O0C pendant 2 heures ; (2) diminution de la pression jusqu'à 10 Pa, augmentation de la température étagère à -250C et maintien de l'étagère à -25°C pendant 5Oh ; (3) augmentation de la température étagère jusqu'à 25°C et maintien de la température pendant 8h. A la fin du cycle, le vide a été cassé par injection d'un courant d'azote gazeux sec, les flacons ont rapidement été bouchés et conditionnés sous vide dans des sachets en aluminium.
Des thermocouples (types K) ont été placés au fond de deux flacons afin de suivre la température du produit. Pendant la sublimation (dessiccation primaire), la température du produit a été maintenue à environ -340C.
5) Mesure de l'activité antigénique
L'activité antigénique des toxines A et B a été mesurées par un test quantitatif de type ELISA, développé par bioMérieux. L'activité a été mesurée immédiatement après lyophilisation, après un stockage de 6 mois à 25°C à l'état lyophilisé et après un stockage de 3 mois à 4°C à l'état liquide après réhydratation. Le coefficient de variation de cette méthode de dosage est de 15%.
III. Résultats
1) Les propriétés physiques (cf. Tableau II)
Selon le comportement physique de l'agent de charge lors de la congélation, les 29 compositions liquides sont classées en deux catégories :
- les compositions comportant un agent de charge présent à l'état solide amorphe après congélation : elles sont caractérisées par une valeur de la température de transition vitreuse de la phase cryo-concentrée (Tg') proche de la température d'effondrement (Tcoll). Les compositions à base de maltodextrine possèdent des valeurs de Tcoll supérieures de 100C à celles des compositions à base de polyvinylpyrolidone (PVP).
- les compositions comportant un agent de charge présent à l'état cristallin après congélation : elles sont caractérisées par des valeurs de Tcoll largement supérieures (de 100C à 200C) aux valeurs de Tg'.
La température d'effondrement Tcoll, représentatif de la perte de la structure lyophilisée apparaît comme un critère plus pertinent à considérer pour l'optimisation du procédé de lyophilisation. Tableau II. Synthèse des propriétés physiques des 29 compositions liquides étudiées
DSC Cryo-microscopie
Tg' (0C) Te (0C) Tcoll (0C) Tmelt (0C)
Solide amorphe (Te' voisin de Tcoll)
Md -13 . -10
MdW -14 -9
MdSW -15 -14
MdS -17 -14
MdE 40 -18 -15
MdSE -16 -21 -18
P -27 -25
PE -23 -22 -26
PW -26 -26
PM -24 -26
PS -28 -27
PSW -28 -27
S -36 -35
Solide cristallin CTe' « TcolD
G* — . -4 -16 -5/-4
GM* -37 -4 -15 -5/-4
GS* -38 -4 -15 -5/-4
GSW* -39 -4 -15 -5/-4 .
GSE* ' -38 -19 ; -4 -18 -5/-4
GE* — -17 ; -4 -16 -5/-4
GW* - — -4 -20 -5/-4
GMd* -20 -4 -10 -5/-4
GP* -28 -4 -15 -5/-4
GPW* -27 -4 -15 -5/-4
GPE* • — -18 ; -4 -18 -5/-4
Mn* -32; -25 -2 -10 -3/-2
MnP* -25 -2 -14 -2,1-2
MnS* -38 -2 -20 -3/-2
MnW* -32 ; -25 -2 -10 -3/-2
MnPW* -26 -2 -15 -3/-2
(a) mesurée par DSC, valeur moyenne de deux mesures au minimum
(b) mesurée par cryomicroscopie, valeur moyenne de deux mesures au minimum Tg' : Température de transition vitreuse de la phase cryo-concentrée
Tcoll : Température de collapse (effondrement) Te : Température eutectique
Tmelt : Température de fusion de la solution
* : Application d'un cycle thermique spécifique permettant la cristallisation complète de l'argent de charge
(mannitol, glycine)
2) L'activité des protéines (cf. Tableau III)
Immédiatement après lyophilisation, l'activité antigénique des deux protéines représente plus de 80% de l'activité antigénique avant lyophilisation pour l'ensemble des compositions liquides testées. Aucune perte d'activité antigénique n'a été donc observée.
En vue de la sélection des compositions liquides les plus performantes, les critères de stabilité suivants ont été retenus : une activité antigénique supérieure à 80% de la valeur avant lyophilisation après un stockage de 6 mois à 250C à l'état lyophilisé et/ou une activité antigénique d'au moins 50% après un stockage de 3 mois à 4°C à l'état liquide.
Les compositions liquides MnP et GP, incluant 4% d'un agent de charge cristallin (mannitol ou glycine, respectivement) et 1% d'un agent stabilisateur, le polyvinylpyrolidone, assurent la stabilité des deux protéines aussi bien à l'état lyophilisé qu'à l'état liquide. L'ajout d'un agent surfactant non ionique, le Tween 80 (noté W), n'améliore pas signifîcativement la stabilité des deux protéines (cf MnPW et GPW par rapport à MnP et GP, respectivement).
La composition liquide MdSW., incluant 4% de maltodextrine, 1% de saccharose et 0,02% de Tween 80, apparaît très efficace pour la stabilisation des deux protéines à l'état lyophilisé. s
De plus, ces trois compositions liquides (MnP, GP et MdSW) présentent des valeurs de température d'effondrement Tcoll élevées (-150C à -14°C), rendant ainsi possible le raccourcissement du cycle de lyophilisation.
Tableau III. Activité antigénique des protéines lyophilisées après un stockage de 6 mois à 2S°C à l'état sec et après un stockage de 3 mois à 4°C à l'état liquide après réhydratation
Toxine A Toxine B
T coll 0 5Q Sec Liquide Sec Liquide 6 mois à 25°C 3 mois à 4e 1C 6 mois à 25°C 3 mois à 4°C
Solide amorphe
Md -10 54 0 68 6
MdW -9 81 5 89 5
MdSW -14 86 50 89 8
MdS -14 61 0 78 - 3
MdE -15 83 96 77 12
MdSE -18 88 77 65 1.5
P -25 72 68 94 82
PE -26 89 85 73 62
PW -26 81 67 103 96
PM -26 90 95 75 44
PS -27 85 79 87 83
PSW -27 96 81 111 110
S -35 94 7 90 14
Solide cristallin
G -16 17 59 55 97
GM -15 71 100 75 86
GS -15 84 72 80 27 •
GSW -15 74 86 101 139
GSE -18 72 84 77 110
GE -16 30 18 61 90
GW -20 7 85 48 93
GMd -10 67 6 83 11
GP -15 87 72 96 48
GPW -15 90 85 92 55
GPE -18 77 83 91 95
Mn -10 21 95 43 51
MnP -14 95 84 89 70
MnS -20 84 46 78 63
MnW -10 11 83 60 122
MnPW -15 99 43 102 13
(a) L'unité dans laquelle est exprimée l'activité de la protéine est le pourcentage calculé par rapport à l'activité antigénique avant lyophilisation, sachant que l'activité immédiatement après lyophilisation est supérieure à 80%. La valeur donnée résulte de la moyenne de deux mesures. On prend pour critère de stabilité une activité supérieure ou égale à 80. Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une composition liquide dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de lyophilisation sur des protéines déterminées préalablement diluées dans ladite composition, en vue de la stabilisation de ces protéines à l'état sec après lyophilisation, et, le cas échéant à l'état liquide après réhydratation du lyophilisât obtenu, ladite composition présentant une structure majoritairement cristalline ou solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant :
- environ 40g/L à 60 g/L d'un agent de charge ayant une température d'effondrement comprise entre -18°C et 00C, '
- environ 10 g/L à 20 g/L dans la composition liquide d'un agent stabilisateur,
- environ 10 raM à 20 mM d'une solution tampon, ladite solution tampon ne cristallisant pas lors de la congélation de ladite composition,
- et, le cas échéant, environ 0,1 g/L à 0,4 g/L d'un agent surfactant non ionique, ladite composition liquide étant telle que :
* le ratio en masse de l'agent de charge sur l'agent stabilisateur est supérieur à 3 :1, lorsque ladite composition présente une structure majoritairement cristalline après lyophilisation
* le ratio en masse de l'agent stabilisateur sur la protéine est supérieur à 1 :1,
* elle ne contient pas d'excipient d'origine animale,
* elle a une température d'effondrement comprise entre -16°C et -10°C.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de charge est choisi' parmi :
- les polyols, tel que le mannitol ou l'inositol, de préférence le mannitol ou les acides aminés, telle que la glycine ou l'alanine, de préférence la glycine, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou les polysaccharides, notamment ceux ayant un dextrose équivalent (DE) inférieure à 10, tels que la maltodextrine, le dextrane, ou l'amidon hydroxyéthyl, de préférence la maltodextrine, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'agent stabilisateur est choisi parmi : , '
- le polyvinylpyrolidone (PVP), ou l'alcool polyvinylique (PVA), de préférence le PVP, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou le saccharose, le tréhalose, le maltose ou le lactose, de préférence le saccharose, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent surfactant est choisi parmi le Tween 80, le Tween 20, le Triton X-100, ou le Brij 35, de préférence le Tween 80. ' .
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la solution tampon est une solution de Tris HCl (pH 7,8), ou de phosphate de potassium, de préférence une solution
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, d'une composition liquide, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de mannitol en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, d'une composition liquide, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de glycine en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, d'une composition liquide, présentant une structure solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de maltodextrine en tant qu'agent de charge, - 10 g/L de saccharose en tant qu'agent stabilisateur,
- 0,2 g/L de Tween 80 en tant qu'agent surfactant,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que les protéines déterminées sont des protéines d'intérêt pharmaceutique, ou analytique, notamment des protéines d'environ 2000 à 3000 acides aminés (ou de masse molaire d'environ 300 IdDa), représentant environ entre 3 μg/mL et 10 μg/mL (soit .0.0003% et 0.001%) de matière sèche dans la composition liquide.
10. Utilisation d'une composition liquide selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la stabilité des protéines lyophilisées est telle que :
- l'activité des protéines après un stockage à l'état lyophilisé de 6 mois à 25°C est d'au moins 80% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation,
- le cas échéant, l'activité des protéines après réhydratation du lyophilisât et un stockage à l'état liquide de 3 mois à 4°C est d'au moins 50% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation.
11. Procédé de lyophilisation de protéines déterminées, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de dilution des protéines dans une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 8, dans des proportions telles que les protéines représentent environ 0.0003% à 0.001% de matière sèche dans la composition liquide,
- une étape de congélation de la solution obtenue lors de l'étape précédente à une température de produit comprise entre -35°C et -45°C, notamment d'environ -38°C, à une vitesse comprise entre 0.3°C/min et l°C/min,
- une étape de dessiccation primaire de la solution congelée obtenue lors de l'étape précédente par diminution de la pression et augmentation de la température de ladite solution congelée jusqu'à une température limite inférieure à -18°C,
- une étape de dessiccation secondaire par augmentation de la température du produit jusqu'à environ 2O0C à 260C pendant un temps compris entre 6h et 1Oh.
12. Procédé de lyophilisation selon la revendication 11, caractérisé en ce que la durée de l'étape de dessiccation primaire est réduite d'un facteur compris entre 1.5 et 2, par rapport à la mise en oeuvre d'un procédé de lyophilisation classique n'utilisant pas les compositions définies dans l'une des revendications 1 à 10 pour la solubilisation préalable des protéines à lyophiliser.
13. Application du procédé de lyophilisation selon la revendication 11 ou 12, à la stabilisation des protéines à l'état sec après lyophilisation.
14. Procédé d'obtention de protéines sous forme stabilisée en solution, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réhydratation du lyophilisât obtenu par mise en œuvre du procédé de lyophilisation selon la revendication 11 ou 12.
15. Procédé de criblage de compositions liquides telles que définies dans l'une des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre de procédés de lyophilisation de protéines déterminées, lesdites compositions liquides étant choisies parmi celles pour lesquelles :
- l'activité des protéines après un stockage à l'état lyophilisé de 6 mois à 25°C est d'au moins 80% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation,
- le cas échéant, l'activité des protéines après réhydratation du lyophilisât et un stockage à l'état liquide de 3 mois à 4°C est d'au moins 50% de l'activité de ces mêmes protéines avant lyophilisation.
- la température d'effondrement des compositions liquides est comprise entre -16°C et - 100C.
16. Composition liquide, présentant une structure majoritairement cristalline ou solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant :
- environ 40g/L à 60 g/L d'un agent de charge ayant une température d'effondrement comprise entre -18°C et 00C,
- environ 10 g/L à 20 g/L d'un agent stabilisateur,
- environ 10 mM à 20 mM d'une solution tampon, ladite solution tampon ne cristallisant pas lors de la congélation de ladite composition,
- et, le cas échéant, environ 0,1 g/L à 0,4 g/L d'un agent surfactant non ionique, ladite composition liquide étant telle que :
* le ratio en niasse de l'agent de charge sur l'agent stabilisateur est supérieur à 3 :1, lorsque ladite composition présente une structure majoritairement cristalline après lyophilisation
* le ratio en massé de l'agent stabilisateur sur la protéine, lorsque celle-ci est présente dans ladite composition, est supérieur à 1 :1,
* elle ne contient pas d'excipient d'origine animale,
* elle a une température d'effondrement comprise entre -16°C et -1O0C.
17. Composition liquide selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'agent de charge est choisi parmi :
- les polyols, tel que le mannitol ou l'inositol, de préférence le mannitol, ou les acides aminés, telle que la glycine ou l'alanine, de préférence la glycine lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou les polysaccharides, notamment ceux ayant un dextrose équivalent (DE) inférieur à 10, tels que la maltodextrine, le dextrane, ou l'amidon > hydroxyéthyl, de préférence la maltodextrine, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
18. Composition liquide selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce que l'agent stabilisateur est choisi parmi :
- le polyvinylpyrolidone (PVP), ou l'alcool polyvinylique (PVA), de préférence le PVP, lorsque lesdites compositions présentent une structure majoritairement cristalline après lyophilisation,
- ou le saccharose, le tréhalose, le maltose ou le lactose, de préférence le saccharose, lorsque lesdites compositions présentent une structure solide amorphe après lyophilisation.
19. Composition liquide selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que l'agent surfactant est choisi parmi le Tween 80, le Tween 20, le Triton X-100, ou le Brij 35, de préférence le Tween 80.
20. Composition liquide selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que la solution tampon est une solution de Tris HCl (pH 7,8), ou de phosphate de potassium, de préférence une solution de Tris-HCl.
21. Composition liquide selon l'une des revendications 16 à 20, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de mannitol en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
22. Composition liquide selon l'une des revendications 16 à 20, présentant une structure majoritairement cristalline à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de glycine en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de polyvinylpyrolidone en tant qu'agent stabilisateur,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
23. Composition liquide selon l'une des revendications 16 à 20, présentant une structure solide amorphe à l'état sec après lyophilisation, et comprenant:
- 40 g/L de maltodextrine en tant qu'agent de charge,
- 10 g/L de saccharose en tant qu'agent stabilisateur,
- 0,2 g/L de Tween 80 en tant qu'agent surfactant,
- 1OmM d'une solution de Tris HCl (pH 7,8).
24. Composition liquide selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine déterminée choisie parmi les protéines d'intérêt pharmaceutique, ou analytique, notamment des protéines d'environ 2000 à 3000 acides aminés (ou de masse molaire d'environ 300 kDa), représentant environ entre 3 μg/mL et 10 μg/mL (soit 0.0003% et 0.001%) de matière sèche dans la composition liquide.
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