EP1831690A1 - Three-dimensional nanostructured and microstructured supports - Google Patents
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Classifications
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Definitions
- the present invention relates to functional elements which comprise microstructures comprising biofunctionalizable or biofunctionalized nanoparticles arranged on a support, processes for producing these functional elements and the use thereof.
- WO 03/056336 A2 describes the preparation and use of microstructures of biofunctionalized nanoparticles which can be used in a wide variety of detection and analysis methods.
- microstructures described therein can be improved in terms of their sensitivity, especially in cases where a high detection accuracy is required.
- the present invention is therefore based on the technical problem, means and methods for the production of miniaturized Develop carrier systems with immobilized biological molecules, such as gene chips and protein chips, in which the disadvantages known in the prior art are eliminated, in particular a further increased detection sensitivity is provided and in which the biomolecules in particular under receipt and Protected their biological activity in high packing density are immobilized on a support or can be immobilized and which are suitable for use in a variety of screening and analysis systems, for example in medical Messr and monitoring technology, and in biocomputers.
- the present invention solves the underlying technical problem by providing a functional element, comprising a carrier having a surface and at least one arranged on the support surface microstructure, wherein the microstructure of a plurality of three-dimensionally stacked layers of nanoparticles is formed and wherein the nanoparticles molecule-specific recognition sites which allow addressability within the microstructure.
- the invention thus provides multi-dimensionally constructed microstructures comprising a plurality of nanoparticle layers which, in a preferred embodiment, are formed including at least one biomolecule-stabilizing agent.
- These multi-dimensionally arranged layers of nanoparticles drastically increase the reaction surfaces of the functional element provided for the desired detection reactions, wherein the inclusion of the protein-stabilizing agent in a preferred embodiment simultaneously achieves that when using proteins or peptides as biological active molecules their natural structure and function is preserved.
- the several three-dimensionally arranged layers of nanoparticles in particular also in a thickness of 10 nm to 10 .mu.m, preferably 50 nm to 2.5 .mu.m, in particular 100 nm to 1, 5 .mu.m stable on the surface of Stay arranged carrier, even if they are rinsing and / or washing steps also longer duration and intensity exposed.
- the inventively provided three-dimensionally arranged plurality of layers of nanoparticles surprisingly remains stable on the support surface and thus allows, contrary to expectations, a high detection accuracy even with very small amounts of analyte to be detected.
- the resistance of the three-dimensional microstructures made of nanoparticles which is made possible in accordance with the invention, makes it possible to produce functional layers which can bind spatially resolved specific analytes.
- the three-dimensional microstructured nanoparticle layers meet all the conditions for use for the production of biological sensor surfaces.
- the present invention thus provides a functional element on the surface of which one or more microstructures are arranged, each microstructure consisting of many nanoparticles in multiple layers with identical or non-identical molecule-specific recognition sites.
- the microstructures of the functional elements may include or be provided with biofunctions. This means that the molecule-specific recognition points of the nanoparticles forming the microstructure can recognize and bind corresponding molecules, in particular organic molecules having a biological function or activity. These molecules may be, for example, nucleic acids or proteins. To the molecules that bind to the molecule-specific If recognition sites of the nanoparticles are bound, then other molecules can be bound, for example molecules of a sample to be analyzed.
- the present invention does not intend to bind biological molecules directly to a planar surface, but rather to immobilize them to a plurality of three-dimensional nanoparticle surfaces, before or after Immobilization can be used to form a microstructure.
- the functional elements according to the invention which comprise nanoparticular systems with molecule-specific recognition sequences for binding biological molecules, offer several decisive advantages over conventional systems, for example those in which the biological molecules are immobilized directly on the support.
- the nanoparticles used according to the invention are extremely flexible and inert systems. They can consist, for example, of a wide variety of cores, for example organic polymers or inorganic materials.
- Inorganic nanoparticles such as silica particles offer the advantage that they are chemically inert and mechanically stable. While surfmers and molecular imprinted polymers have soft nuclei, nanoparticles with silica or iron cores do not swell in solvents. Non-swellable particles do not change their morphology, even if they are suspended several times in solvents for a long time.
- Functional elements according to the invention which comprise non-swellable particles can therefore be used without problems in analysis or microstructuring processes which require solvent application without adversely affecting the state of the nanoparticles or immobilized biological molecules.
- Functional elements which contain such nanoparticles can therefore also be used for purifying the biological molecules to be immobilized from complex mixtures of substances which contain undesired substances such as detergents or salts, the molecules to be immobilized optimally over any desired length of washing process Substance mixtures can be separated.
- superparamagnetic or ferromagnetic nanoparticles with an iron oxide core can be arranged in a magnetic field along the field lines. This property of iron oxide nanoparticles can be used to directly build microstructures, in particular nanoscopic interconnects.
- the functional elements according to the invention can be used to immobilize a wide variety of biological molecules while retaining their biological activity.
- the nanoparticles used to form the microstructures have molecule-specific recognition sites, in particular functional chemical groups, which can bind the molecule to be immobilized in such a way that the molecular regions required for the biological activity are present in a state corresponding to the native molecular state.
- the biomolecules may be bound covalently and / or noncovalently to the nanoparticles, as required.
- the nanoparticles can have different functional groups, so that either different biomolecules or biomolecules having different functional groups with preferred orientation can be immobilized.
- the biomolecules can both non-directionally and directionally immobilized on the nanoparticles, with almost any desired orientation of the biomolecules is possible.
- the immobilization of the biomolecules on the nanoparticles also stabilizes the biomolecules.
- At least one biomolecule-stabilizing agent in particular at least one protein-stabilizing agent, is included in the microstructure.
- Such agents further enhance the stabilization of biomolecules.
- the addition of at least one biomolecule-stabilizing additive, in particular at least one protein-stabilizing additive preserves the functionality of nanoparticle-bound biological molecules, in particular peptides or proteins, within the particle layers when they are dried on a substrate, thus guaranteeing the shelf life of nanoparticulate functional layers.
- the shelf life is up to one year, preferably up to 8 months, especially 3 months.
- the inclusion according to the invention of at least one biomolecule-stabilizing agent, in particular of at least one protein-stabilizing agent, into the microstructure thus protects the function, in particular the biological function, and the effectiveness of the functional elements according to the invention.
- the nanoparticles used to form the microstructures have a comparatively very high surface to volume ratio and accordingly can bind a large amount of a biological molecule per mass. Compared to systems in which biological molecules are bound directly to a planar support, a functional element can thus bind a significantly larger amount of the biological molecules per unit area.
- the menu According to the invention, the size of the molecules bound per unit area, that is to say the packing density, is so great because several particle layers are stacked on top of one another to produce the microstructure on the carrier surface.
- a further increase in the amount of biological molecules bound per unit area can be achieved by first coating the nanoparticles with hydrogels and then with biological molecules.
- the preparation according to the invention and the use of a plurality of three-dimensionally arranged layers of nanoparticles increases the reactive surface compared to previously used planar affinity surfaces. Therefore, the microstructures according to the invention can bind more analyte.
- the nanoparticle multilayers or multilayers bind the more analyte the more nanoparticles are immobilized per surface.
- the analyte concentrations and the signal intensity achieved are linearly correlated with one another after binding of the analytes to the nanoparticulate surfaces.
- the nanoparticles used according to the invention have a diameter of 5 nm to 500 nm. Using such nanoparticles, it is therefore possible to produce functional elements which have very small microstructures of any shape in the nanometer to micrometer range. The use of the nanoparticles to generate the microstructures therefore allows a hitherto unattained miniaturization of the functional elements, which is accompanied by significant improvements of significant parameters of the functional elements.
- the nanoparticles used according to the invention show a very good adhesion to the materials used for the preparation of the carrier or carrier surfaces.
- the particles As a result, they can easily be used for a large number of carrier systems and thus for a large number of different functional elements with a wide variety of application areas.
- the microstructures formed using the nanoparticles are very homogeneous, which leads to a location-independent signal intensity.
- the functional elements according to the invention may have different microstructures on their carrier surface which consist of different nanoparticles with different molecule-specific recognition sites. Accordingly, these different microstructures can also be assigned different biofunctions.
- the functional elements can therefore contain juxtaposed microstructures which contain or can be provided with different biological molecules.
- a functional element may therefore contain, for example, several different proteins or several different nucleic acids or at the same time proteins and nucleic acids.
- the functional elements according to the invention can be prepared in a simple manner using known methods. For example, it is very easy to produce stable suspensions using nanoparticle suspending agents. Nanoparticle suspensions behave like solutions and are thus compatible with microstructuring processes. Nanoparticle suspensions can therefore be deposited directly, for example using conventional methods such as needle-ring printers, lithographic methods, inkjet methods and / or microcontact methods, onto suitable carriers which have been previously pretreated with a bonding agent for firmly adhering the nanoparticles , By a suitable choice of the connection
- the microstructure formed can be formed such that it can be partially or completely detached from the carrier surface of the functional element at a later time, for example by changing the pH or the temperature, and optionally transferred to the carrier surface of another functional element.
- the functional elements according to the invention can be embodied in various forms and can therefore also be used in very different areas.
- the functional elements according to the invention may be biochips, for example gene or protein arrays, which are used in medical analysis or diagnostics.
- the functional elements according to the invention can also be used as an electronic component, for example as a molecular circuit, in medical measurement and monitoring technology or in a biocomputer.
- a “functional element” is understood to mean an element which, either alone or as part of a more complex device, that is to say in connection with other similar or different functional elements, performs at least one defined function
- the individual constituents of a functional element can perform different functions within a functional element and can contribute to the overall function of the element to varying degrees or in different ways
- a functional element comprises a Carrier with a carrier surface on which defined layers of nanoparticles are arranged three-dimensionally as microstructure (s), the nanoparticles being provided with biological functions, for example biological molecules such as nucleic acids, proteins and / or PNA molecules, and / or being provided and these are preferably protected by the inclusion of at least one biomolecule-stabilizing agent, in particular a protein-stabilizing agent.
- biomolecule-stabilizing agents in particular “protein-unstabilizing agents” are meant according to the invention agents which stabilize the three-dimensional structure of proteins, ie secondary, tertiary, quaternary, under drought stress and thus the functionality of the proteins in the dry state, the is called after evaporation of the solvent.
- the protein-stabilizing agent is a saccharide, in particular sucrose, lactose, glucose, trehalose or maltose, a polyalcohol, in particular inositol, ethylene glycol, glycerol, sorbitol, xylithol, mannitol or 2-methyl-2,4-diene pentanediol, an amino acid, in particular sodium glutamate, proline, alpha-alanine, beta-alanine, glycine, lysine HCl or 4-hydroxyproline, a polymer, in particular polyethylene glycol, dextran, polyvinylpyrrolidone, an inorganic salt, in particular sodium sulfate, ammonium sulfate, potassium phosphate , Magnesium sulfate or sodium fluoride, an organic salt, in particular sodium acetate, sodium polyethylenes, sodium caprylate, propionate, lactate or succinate, or trimethylamine N
- a “carrier” is understood to mean that component of the functional element which primarily determines the volume and the external shape of the functional element.
- the term “carrier” means in particular a solid matrix.
- the carrier may be of any size and shape, such as a ball, cylinder, rod, wire, plate or foil.
- the carrier may be both a hollow body and a solid body.
- a solid body is meant, in particular, a body which essentially has no cavities and can consist entirely of a material or a combination of materials.
- the solid body can also consist of a layer sequence of the same or different materials.
- the carrier of the functional element in particular the carrier surface, consists of a metal, a metal oxide, a polymer, glass, a semiconductor material or ceramic.
- the support or its surface is at least about 60%, preferably about 70%, more preferably about 80%, and most preferably about 100% of any of the foregoing materials or a combination of such materials.
- the support of the functional element consists of materials such as transparent glass, silica, metals, metal oxides, polymers and copolymers of dextranes or amides, for example acrylamide derivatives, cellulose, nylon, or polymeric materials such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polystyrene or polymethyl methacrylate or a polycarbonate of bisphenol A.
- the surface of the functional element carrier is planar or also prestructured, for example contains supply and discharge lines.
- the surface of the carrier and the carrier itself can be impermeable and / or porous.
- Such carriers are for example membranes or filters.
- the area sections, not covered by the microstructure, of the surface of the carrier contain functionalities or chemical compounds which prevent non-specific attachment of biomolecules to these surface sections.
- these chemical compounds are polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextran or a mixture thereof.
- the surface of the functional element carrier contains an ethylene oxide layer.
- At least one layer of a connecting means is arranged between the carrier surface and the microstructure.
- the connecting agent serves for the firm binding of the nanoparticles to the carrier surface of the functional element.
- the choice of the bonding agent depends on the surface of the support material and the nanoparticles to be bound.
- the connection means they are preferably charged or uncharged polymers.
- the bonding agents are preferably weak or strong polyelectrolyte, ie their charge density is pH-dependent or pH-independent.
- the bonding agent consists of poly (diallyldimethylammonium chloride), a sodium salt of poly (styrenesulfonic acid), a sodium salt of poly (vinylsulfonic acid), poly (allylamine hydrochloride), linear / branched poly (ethyleneimine), poly ( acrylic acid), poly (methacrylic acid) or a mixture of these.
- the polymer may also be a hydrogel.
- the bonding agent may also be a charged-gas plasma layer, such as a polyelectrolyte, or a plasma layer having chemically reactive groups.
- the compound can also be a self-assembled monolayer based on silane, thiol, phosphate or fatty acid.
- the bonding agent layer consists of at least one layer of a bonding agent.
- the bonding agent layer can also consist of several layers of different bonding agents, for example of an anionic plasma layer and a cationic polymer layer or of a plurality of polymer layers which are alternately anionic and cationic.
- Another preferred embodiment of the invention relates to bonding agents whose properties, for example their cohesive properties, can be changed by an external stimulus and which can therefore be switched from the outside.
- the cohesion properties of the connecting agent can be reduced to such an extent by changing the pH, the ion concentration and / or the temperature that the microstructures bound to the carrier surface of the functional element can be detached and, if appropriate, transferred to the carrier surface of another functional element ,
- the support in particular the support surface, is pretreated with a surface-activating agent prior to the application of the bonding layers and microstructures in order to improve the bonding of the bonding layers and microstructures to the support or to its surface
- the surfaces of the support can be activated, for example, by means of chemical processes, for example using primers or an acid or a base.
- the surface activation can also be done using a plasma.
- the surface activation may also include the application of a self-assembled monolayer.
- microstructure in the range of individual micrometers or nanometers are understood as meaning a "microstructure.”
- microstructure is understood to mean a structure consisting of at least two individual components in the form of several three-dimensionally arranged layers of nanoparticles with molecule-specific recognition sites is arranged on the surface of a carrier, wherein a certain surface portion of the surface of the carrier is covered, which has a defined shape and a defined surface area and which is smaller than the carrier surface.
- the microstructure is in the shape of a circle, the diameter of the circle is in the micrometer range. If the microstructure is designed as a rectangle, for example, the width of this rectangle is in the micrometer range. According to the invention, provision is made in particular for the at least one surface-length parameter, which determines the surface section covered by the microstructure, to be smaller than 999 ⁇ m. Since the microstructure according to the invention consists of at least two nanoparticles, the lower limit of this surface-length parameter is 10 nm.
- the three-dimensionally arranged layers of nanoparticles, which form the microstructure in their entirety have a total thickness of 10 nanometers to 10 micrometers.
- three-dimensional support means a support which is suitable for the attachment of functional groups or biomolecules the surface of a, possibly microstructured, nanoparticle aggregate, where one aggregate means two, three or many layers of nanoparticles which are arranged one above the other, in particular the explicit expansion into the third te dimension by the aforementioned application of, optionally microstructured, nanoparticle multiple or multilayer reactive surface per occupied footprint.
- the area section covered by the microstructure according to the invention can have any desired geometric shape, for example that of a circle, an ellipse, a square, a rectangle or a line.
- the microstructure can also be composed of a plurality of regular and / or irregular geometric shapes.
- the functional element according to the invention is, for example, a gene chip or a protein array, the microstructure preferably has a circular or elliptical-like shape.
- the functional element according to the invention is an electronic component for use in a biocomputer, the microstructure may also have a circuit-like shape. According to the invention it is also provided that a plurality of microstructures of the same or different shape are arranged at a distance from one another on the carrier surface of a functional element.
- the microstructures are applied to the surface of the functional element carrier by means of a ring / pin by means of lithographic processes, such as photolithography or micro-pen lithography, ink-jet techniques or micro-contact printing processes, for example.
- lithographic processes such as photolithography or micro-pen lithography, ink-jet techniques or micro-contact printing processes, for example.
- the selection of the method by means of which the microstructure or microstructures are applied to the surface of the functional element depends on the surface of the carrier material, the nanoparticles containing the microparticles. Ro Design should form, and the subsequent application of the functional element.
- nanoparticle is understood as meaning a particulate binding matrix which has first molecule-specific recognition sites comprising functional chemical groups
- the nanoparticles used according to the invention comprise a core with a surface on which the first functional groups are arranged, which are located in the By virtue of the interaction between the first and second functional groups, the biomolecule is immobilized on the nanoparticle and thus on the microstructure of the functional element and / or can be immobilized thereon.
- the nanoparticles used according to the invention for forming the microstructures have a size of less than 500 nm, preferably less than 150 nm.
- "addressable” means that the microstructure is retrievable and / or detectable after application of the nanoparticles to the carrier surface If the microstructure is applied to the carrier surface using, for example, a mask or a stamp, the address of the On the one hand, microstructure results from the coordinates x and y of the region of the carrier surface on which the microstructure is applied, on the other hand, the address of the microstructure results from the molecule-specific recognition sites on the surface of the nanoparticles, which retrieves or retrieves If the microstructure is biologically is functionalizable, ie nanoparticles with molecule-specific recognition sites to which no biomolecules are bound, the microstructure can be rediscovered and / or demonstrated that one or more biomolecules bind specifically to the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles forming the microstructure however, to the surface portions of the support surface that are not covered by the microstructure.
- the immobilized molecule is labeled with detection markers such as fluorophores, spin labels, gold particles, radioactive labels, etc.
- detection of the microstructure can be accomplished using appropriate detection methods.
- the microstructure is biofunctionalized, that is to say comprises nanoparticles to whose molecule-specific recognition sites one or more biomolecules are already bound, "addressable” means that these biomolecules can be found and / or detected by interaction with complementary structures of further molecules or by metrological methods, only the microstructure consisting of nanoparticles shows corresponding signals, but not the surface sections of the carrier surface, which are not covered by the microstructure.
- the matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry MALDI-TOF
- MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
- MS which has become an important method for the analysis of a wide variety of substances, in particular proteins, waveguide spectroscopy, fluorescence, impedance
- the biological molecule while maintaining its biological activity on the surface of the ro Quilt forming nanoparticles is bound or immobilized or can be bound or immobilized, wherein the molecule is preferably directionally bound or becomes.
- the biological activity of a molecule is understood to mean all functions that it performs in an organism in its natural cellular environment.
- the molecule is a protein, it may be specific catalytic or enzymatic functions, immune defense functions, transport and storage function, regulatory function, transcriptional and translational functions, and the like.
- the biological function may be, for example, the coding of a gene product or that the nucleic acid is useful as a template for the synthesis of other nucleic acid molecules or as a binding motif for regulatory proteins.
- Retention of biological activity means that a biological molecule, after immobilization on the surface of a nanoparticle, can exert the same or nearly the same biological functions to at least similar extent as the same molecule in a non-immobilized state under suitable in vitro conditions the same molecule in its natural cellular environment.
- the term "directionally immobilized” or “directed immobilization” means that a molecule is bound at defined positions within the molecule to the molecule-specific recognition sequences of a nanoparticle such that the three-dimensional structure is for biological activity required domain (s) is not changed from the non-immobilized state and that this domain (s), for example for cellular reactants, is / are freely accessible to them upon contact with other native cellular reactants.
- Directed immobilized also means that when immobilizing a molecular species, all or nearly all of the individual molecules, but at least more than 80%, preferably more than 85% of all molecules on the surface of the nanoparticles forming the microstructure have an identical or nearly identical orientation reproducibly take.
- the biological molecule immobilized or immobilizable on the microstructure of the functional element according to the invention is in particular a nucleic acid, a protein, a protein complex, a PNA molecule, a fragment thereof or a mixture thereof.
- nucleic acid is understood as meaning a molecule which consists of at least two nucleotides connected via a phosphodiester bond.
- Nucleic acids may be both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid.
- the nucleic acid can be both single-stranded and double-stranded. In the context of the present invention, therefore, a nucleic acid can also be an oligonucleotide.
- the nucleic acid bound to the microstructure of the functional element according to the invention preferably has a length of at least 10 bases.
- a nucleic acid may be of natural or synthetic origin.
- the nucleic acid may be modified by genetic engineering methods against the wild-type nucleic acid and / or unnatural and / or unusual nucleic acid. Contain linoleic acid components.
- the nucleic acid may be linked to other types of molecules, such as proteins.
- a "protein” is understood to mean a molecule which comprises at least two amino acids which are linked to one another via an amide bond
- a protein may therefore also be a peptide, for example an oligopeptide, a polypeptide or, for example Such a protein may be of natural or synthetic origin
- the protein may be modified by genetic engineering methods from the wild-type protein and / or may contain unnatural and / or unusual amino acids
- the protein may be derivatized from the wild-type form.
- a protein may in particular be an enzyme, a receptor, a cytokine, a structural protein Antigen or an antibody be.
- Antibody means a polypeptide that is substantially encoded by one or more immunoglobulin genes, or fragments thereof that specifically bind / bind and detect an analyte (antigen) Antibodies are, for example, as intact immunoglobulins or as one Series of fragments generated by cleavage with various peptidases. “Antibody” also means modified antibodies (eg, oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies). “Antibody” also includes antibody fragments which are either modified by whole antibody modification or by de novo synthesis using DNA Recombination techniques have been generated. The term “antibody” includes both intact molecules and fragments thereof, such as Fab, F (ab ') 2 and Fv 1 which can bind the epitope determinant.
- protein complex means an aggregating unit of at least two proteins
- a “protein complex” may also include nucleic acids, metal ions and other substances.
- PNA Protein Nucleic Acid or Polyamide Nucleic Acid
- PNA Peptide Nucleic Acid or Polyamide Nucleic Acid
- DNA DNA
- PNA sequences comprise a polyamide backbone of N- (2-aminoethyl) glycine units and have no glucose units and no phosphate groups.
- molecule-specific recognition sites are understood as meaning regions of the nanoparticle which allow a specific interaction between the nanoparticle and biological molecules as target molecules.
- the interaction can be based on targeted attractive interaction between one or more pairs of first functional molecules Groups of the nanoparticle and the first functional groups binding, complementary second functional groups of the target molecules, so the biological molecules are based.
- Single interacting pairs of functional groups between nanoparticles and biological molecule are each spatially fixed to the nanoparticle and the biological molecule arranged Fixation need not be a rigid arrangement, but rather can be carried out quite flexible.
- the attractive interaction between the functional groups of the nanoparticles and the biological molecules can be carried out in the form of non-covalent bonds such as van der Waals bonds, hydrogen bonds, ⁇ - ⁇ bonds, electrostatic interactions or hydrophobic interactions. Also conceivable are reversible covalent bonds as well as mechanisms based on complementarity of shape or form.
- the inventively provided interactions between the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles and the target molecule thus based on directed interactions between the pairs of functional groups and on the spatial arrangement of these pairs forming groups to each other on the nanoparticle and the target molecule. This interaction results in a covalent or non-covalent affinity bond between the two binding partners, such that the biological molecule is immobilized on the surface of the nanoparticles forming the microstructure.
- the first functional groups which are part of or form the molecule-specific recognition sites on the surface of the nanoparticle are selected from the group consisting of active ester, alkyl ketone group, aldehyde group, amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, Hydrazine group, hydrazide group, thiol group, thioester group, oligohistidine group, strep-tag I 1 strep-tag II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin.
- the molecule-specific recognition site is a larger molecule such as a protein, an antibody, etc., which contains the first functional groups.
- the molecule-specific recognition site may also be a molecular complex consisting of several proteins and / or antibodies and / or nucleic acids, at least one of these molecules containing the first functional groups.
- a protein may comprise, as a molecule-specific recognition sequence, an antibody and an associated protein.
- the antibody may also comprise a streptavidin group or a biotin group.
- the antibody linked to the antibody may be a receptor, for example, an MHC protein, cytokine, a T cell receptor such as the CD-8 protein, and others capable of binding a ligand.
- a molecular complex can also comprise a plurality of proteins and / or peptides, for example a biotinylated protein which binds a further protein in a complex and additionally a peptide.
- the second functional group ie the functional group of the biomolecule to be immobilized, is selected according to the invention from the group consisting of the group consisting of active ester, alkyl ketone group, aldehyde group, amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group , Thioester group, oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin.
- the first and second functional groups may have been generated by, for example, molecular imprinting.
- the first and second functional groups may also be active esters, such as the so-called surfmers.
- a nanoparticle used according to the invention therefore has on its surface a first functional group which is covalently or non-covalently linked to a second functional group of a biomolecule to be immobilized, the first functional group being a group other than the second functional group.
- the two binding groups must be complementary to one another, ie be able to form a covalent or non-covalent bond with one another.
- the second functional group is a hydrazine or hydrazide group.
- the second functional group is an alkyl ketone, in particular methyl ketone or aldehyde group.
- the second complementary functional group is a thioester group. If the first functional group used is a thioester group, according to the invention the second functional group is a thiol group.
- the second functional complementary group is an oligohistidine group.
- the second functional complementary group is a metal ion chelate complex.
- Strep-Tag I 1 Strep-Tag II, Biotin or Desthiobiotin is used as the first functional group
- Streptavidin, Streptactin, Avidin or Neutravidin is used as the second complementary functional group.
- streptavidin, streptactin, avidin or neutravidin is used as the first functional group
- strep-tag I 1 Strep-Tag II, biotin or desthiobiotin is used as the second complementary functional group.
- a chitin binding domain is used as the second functional complementary group.
- a chitin binding domain is used as the first functional group
- chitin or a chitin derivative is used as the second functional complementary group.
- first and / or second functional groups may be connected to the biomolecule or nanoparticle core to be immobilized by means of a spacer or may be introduced by means of a spacer to the nanoparticle core or into the biomolecule.
- the spacer serves on the one hand as a spacer of the functional group to the core or biomolecule, on the other hand as a support for the functional group.
- such a spacer can be alkylene groups or ethylene oxide oligomers having from 2 to 50 carbon atoms, which in a preferred embodiment is substituted and has heteroatoms.
- the second functional groups are a natural constituent of the biomolecule, in particular of a protein.
- a protein of medium size ie a size of about 50 kDa with about 500 amino acids
- reactive amino groups there are about 20 to 30 reactive amino groups, which in principle come into question as a functional group for immobilization.
- it is the amino group at the N-terminal end of a protein. All other free amino groups, in particular those of the lysine residues, are also suitable for the immobilization.
- Arginine with its guanidium group is also considered as a functional group.
- the second functional groups into the biomolecule by means of genetic engineering, biochemical, enzymatic and / or chemical derivatization or chemical synthesis methods.
- the derivatization should be such that the biological activity is retained after immobilization.
- unnatural amino acids can be inserted into the protein molecule by genetic engineering or during chemical protein synthesis, for example together with spacers or linkers.
- Such unnatural amino acids are compounds which have an amino acid function and a radical R and are not defined by a naturally occurring genetic code, these amino acids most preferably having a thiol group.
- It can also be provided according to the invention to modify a naturally occurring amino acid, for example lysine, for example by derivatization of its side chain, in particular its primary amino group, with the carboxylic acid function of levulinic acid.
- tags can be introduced into the protein by modification of a protein, wherein tags, ie labels, are added to the protein, preferably to the C-terminus or the N-terminus.
- tags can also be arranged intramolecularly.
- a protein is modified by adding at least one strep tag, for example a strep tag I or strep tag II or biotin.
- a Strep tag is also understood as meaning functional and / or structural equivalents, provided that they can bind streptavidin groups and / or their equivalents.
- a protein is also provided according to the invention by adding a His tag containing at least three histidine residues, but preferably one oligohistidine.
- the His tag introduced into the protein can then bind to a metal chelating complex-comprising molecule-specific recognition site.
- proteins which are modified for example, with unnatural amino acids, natural, but unnaturally derivatized amino acids or specific strep tags, or bind antibody-bound proteins with nanoparticle surfaces which are complementary to them, that a suitable specific, in particular non-covalent binding of the proteins and thus a directed immobilization of the proteins to the surfaces takes place.
- these molecules can additionally be covalently bound, in For example, with a crosslinker such as glutaric dialdehyde. This will make the protein surfaces more stable.
- the nanoparticles deposited to form a microstructure on the carrier surface of the functional element have, in addition to the surface with the molecule-specific recognition sites, a nucleus.
- a "core" of a nanoparticle is understood as meaning a chemically inert substance which serves as a carrier for the molecule to be immobilized
- the core is a compact or hollow particle with a size of 5 nm to 500 nm ,
- the core of the nanoparticles used according to the invention consists of an inorganic material such as a metal, for example Au, Ag or Ni, silicon, SiO 2 , SiO, a silicate, Al 2 O 3 , SiO 2 ⁇ Al 2 O 3 , Fe 2 O 3 , Ag 2 O, TiO 2 , ZrO 2 , Zr 2 O 3 , Ta 2 O 5 , zeolite, glass, indium tin oxide, hydroxyapatite, a Q-dot or a mixture thereof or contains this.
- a metal for example Au, Ag or Ni, silicon, SiO 2 , SiO, a silicate, Al 2 O 3 , SiO 2 ⁇ Al 2 O 3 , Fe 2 O 3 , Ag 2 O, TiO 2 , ZrO 2 , Zr 2 O 3 , Ta 2 O 5 , zeolite, glass, indium tin oxide, hydroxyapatite, a Q-dot or a mixture thereof or contains this.
- the core consists of or contains an organic material.
- the organic polymer is polypropylene, polystyrene, polyacrylate, a polyester of lactic acid, or a mixture thereof.
- the cores of the nanoparticles used according to the invention can be prepared using conventional methods known in the art, such as sol-gel synthesis, emulsion polymerization, suspension polymerization, and the like. After preparation of the cores, the surfaces of the cores are transformed by chemical modification reactions with the specific first functional For example, using conventional methods such as graft polymerization, silanization, chemical derivatization, etc. One way to produce surface-modified nanoparticles in one step, the use of Surfmeren in the emulsion polymerization. Another possibility is molecular imprinting.
- molecular embossing is meant the polymerization of monomers in the presence of templates, which can form a relatively stable complex with the monomer during the polymerization.
- the materials thus prepared can specifically bind template molecules to the template molecules structurally related molecular species or molecules that structurally related or identical groups have the template molecules or parts thereof.
- a template is therefore a substance present in the monomer mixture during the polymerization to which the polymer formed has an affinity.
- reactive surfmers possess functionalizable end groups that can be reacted under mild conditions with nucleophiles such as primary amines (amino acids, peptides, proteins), thiols, or alcohols. In this way, a variety of biologically active polymeric nanoparticles accessible.
- the density of the first functional groups and the distance between these groups can be optimized according to the invention for each molecule to be immobilized.
- the environment of the first functional groups on the surface can also be prepared in a corresponding manner with regard to the most specific possible immobilization of a biomolecule.
- additional functions are anchored in the core, which enable a simple detection of the nanoparticle cores and thus of the microstructures using suitable detection methods.
- These functions may, for example, be fluorescent labels, UV / Vis labels, superparamagnetic functions, ferromagnetic functions and / or radioactive labels.
- Suitable methods for detecting nanoparticles include, for example, fluorescence or UV-Vis spectroscopy, fluorescence or light microscopy, MALDI mass spectrometry, waveguide spectroscopy, impedance spectroscopy, electrical and radiometric methods. A combination of the methods can be used for the detection of nanoparticles.
- the core surface can be obtained by applying additional functions, such as fluorescence labeling. ments, UV / Vis markings, superparamagnetic functions, ferromagnetic functions and / or radioactive markings.
- additional functions such as fluorescence labeling. ments, UV / Vis markings, superparamagnetic functions, ferromagnetic functions and / or radioactive markings.
- the core of the nanoparticles be surface-modified with an organic or inorganic layer having the first functional groups and the additional functions described above.
- the core surface has chemical compounds which serve for steric stabilization and / or for preventing a conformational change of the immobilized molecules and / or for preventing the addition of further biologically active compounds to the core surface.
- chemical compounds are preferably polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextran or a mixture thereof.
- Nanoparticles with ion-exchange functions are particularly suitable for optimizing the MALDI analysis, since it can bind interfering ions.
- the biological molecule immobilized on the microstructure of the functional element has markers which enable a simple detection of the biological molecules immobilized on the microstructure using suitable detection methods.
- These labels may be, for example, a fluorescent label, a UV / Vis label, a superparamagnetic label, act table function, a ferromagnetic function and / or a radioactive marker.
- suitable detection methods for these labels are, for example, fluorescence or UV-VIS spectroscopy, MALDI mass spectrometry, waveguide spectroscopy, impedance spectroscopy, electrical and radiometric methods or a combination of these methods.
- a further embodiment of the invention relates to a functional element having at least one biological molecule immobilized on the microstructure, to which immobilized molecule at least one further biological molecule is covalently or noncovalently bound.
- the molecule immobilized on the microstructure is a protein, for example, a second protein or an antibody may be bound thereto, for example by protein-protein interaction or by antibody-antigen binding.
- the molecule immobilized on the microstructure is a nucleic acid, for example, a protein may be bound thereto.
- a further preferred embodiment of the invention relates to a functional element whose microstructure (s) consists of several superimposed layers of the same nanoparticles, each individual layer being firmly bound to the underlying layer via the already described bonding layers of suitable polymers.
- Yet another preferred embodiment of the invention relates to a functional element, on the support surface of which a plurality of different microstructures are arranged side by side, which are made of
- Such functional elements therefore contain side by side microstructures to which different biological molecules are immobilized or can be immobilized.
- the support surface of such functional elements may therefore for example comprise at the same time microstructures on which proteins are or may be immobilized, and microstructures on which nucleic acids are or may be immobilized.
- the functional element can also have microstructures to which different proteins or different nucleic acids are or can be immobilized simultaneously.
- a further embodiment of the invention relates to a functional element in which the surface portions of the support surface, which are not covered by the microstructure, are modified by applying additional functionalities or chemical compounds.
- These may in particular be functionalities or chemical compounds which prevent a non-specific attachment of biomolecules to the regions of the carrier surface which are not covered by the microstructure.
- these chemical compounds are polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextran or a mixture thereof.
- the surface of the functional element carrier contains an ethylene oxide layer.
- the present invention likewise relates to a method for producing a functional test according to the invention, wherein at least one layer of a bonding agent and then at least one microstructure consisting of nanoparticles with molecule-specific recognition sequences are applied to the surface of a suitable substrate.
- the surface of a functional element is pre-structured before the application of the bonding agent layer.
- a layer of a compound can then be applied to the prestructured carrier surface, which prevents non-specific attachment of biological molecules to the carrier surface.
- This is preferably an ethylene oxide layer.
- the surface of the support of the functional element according to the invention is activated after the pre-structuring and before the application of the bonding agent layer. Activation may also include purification.
- the activation of the surface of the support of the functional element can be carried out according to the invention using a chemical process, in particular using primers or acids or bases. However, according to the invention it is also possible to activate the surface of the carrier using a plasma. The activation may also include the application of a SeIf-Assembled monolayer.
- the bonding agent in a structured manner to the surface of the carrier.
- Structured means in context of the invention in that a bonding agent layer defined in terms of shape and area is applied to the carrier surface, the bonding agent layer thus applied defining the surface portion of the carrier surface to be covered later by the microstructure.
- the microstructure is then applied by dipping the functional element support in a nanoparticle suspension, wherein the nanoparticles adhere only to the structured applied bonding agent layer, but not to the surface portions of the support surface, which have no bonding agent layer. In this way, a microstructure defined in terms of shape and area is produced.
- the net surface charge of functional nanoparticles depends on the surface modification and the suspension medium. A surface charge different from 0 stabilizes the particle suspension (electro-static repulsion).
- aqueous solutions as suspending medium are well suited for microstructured nanoparticle layers to be applied to polyelectrolyte-coated surfaces (for example silicon or glass).
- the particles generally carry a net negative charge.
- the zeta potentials of functionalized nanoparticles are
- the structured bonding agent layer is applied, for example, by means of a needle-ring printer, an ink-jet method, for example a piezoelectric or thermo-process, or a microcontact printing method.
- a lithographic process in particular the photolithography or the micropen lithography process, the carrier surface is covered with the bonding agent and then the bonding agent layer thus produced is patterned by means of the lithographic process.
- the microstructure to be applied can be designed such that the microstructure or parts thereof can be switched from the outside, for example by changing the pH, the ion concentration or the temperature, at a later time again (debond on command). This allows, for example, a microstructure to be transferred from one functional element to another.
- Stable nanoparticle suspensions can be prepared simply by suspending the nanoparticles in liquids, in particular aqueous media, if appropriate using additional constituents, for example pH agents, suspending aids, etc.
- the carrier In the second embodiment of the method according to the invention for producing a functional element, it is provided to first provide the carrier with a bonding agent layer covering the entire carrier surface. This can be done for example by immersing the carrier in a suspension or solution of the bonding agent.
- the microstructure is subsequently produced by, for example, using a nanoparticle suspension using a needle-ring printer, an ink-jet printer. driving, for example, a piezoelectric or thermal process, or a MikroWallet horrbacters structured applied and thus a shape and area defined microstructure is generated.
- a lithographic process in particular the photolithography or micropen lithography process
- the carrier surface is covered with the nanoparticle suspension and then the nanoparticle layer thus produced is patterned by means of the lithographic process.
- the nanoparticles applied to the microstructure on the carrier surface of a functional element according to the invention may be biofunctionalizable nanoparticles, ie nanoparticles which have only molecule-specific recognition sites but to which no biological molecules are yet bound.
- biofunctionalized nanoparticles for structuring the carrier surface ie nanoparticles at whose molecule-specific recognition sites biological molecules have already been immobilized while retaining their biological activity.
- the immobilized biological molecule is in particular a protein, a PNA molecule or a nucleic acid.
- the nanoparticles After the nanoparticles have been applied to the carrier surface of the functional element, it is possible in accordance with the invention to subsequently further convert the particles.
- the particles contain reactive esters, they can be used to directly bind proteins.
- the nanoparticles can also be implemented in order to provide them with additional functions.
- the present invention also relates to the use of the functional element according to the invention for the examination of an analyte in a sample and / or for its isolation and / or purification therefrom, wherein the functional element according to the invention is used, for example, as a gene array or gene chip or as a protein chip. Array is executed.
- an "analyte” is understood as meaning a substance in which the type and amount of its individual constituents are determined and / or which is to be separated off from mixtures the analyte to proteins, nucleic acid, carbohydrates and the like.
- the analyte is a protein, peptide, drug, contaminant, toxin, pesticide, antigen or nucleic acid.
- a sample is meant an aqueous or organic solution, emulsion, dispersion or suspension containing an analyte as defined above in isolated and purified form or as part of a complex mixture of different substances
- a sample may also be a culture medium, such as a fermentation medium, in which organisms, for example, a biological fluid, such as blood, lymph, tissue fluid, etc., are taken
- a sample in the sense of the invention may also be an aqueous solution, emulsion, dispersion or suspension of an isolated and purified analyte
- a sample may already have been subjected to purification steps. but can also un have been purified.
- the present invention therefore also relates to the use of the functional element according to the invention for carrying out analysis and / or detection methods, these methods being MALDI mass spectrometry, fluorescence or UV-VIS spectroscopy, fluorescence or light microscopy, waveguide spectroscopy, an electrical method such as impedance spectroscopy or a combination of these methods.
- the present invention also relates to the use of a functional element according to the invention for controlling cell adhesion or cell growth.
- the present invention also relates to the use of a functional element according to the invention for the detection and / or isolation of biological molecules.
- a functional element according to the invention to whose microstructures one, preferably single-stranded, nucleic acid is immobilized, can be used to detect a complementary nucleic acid in a sample and / or to isolate this complementary nucleic acid.
- a functional element according to the invention, to whose microstructures a protein is immobilized can be used for example for the detection and / or isolation of a protein interacting with the immobilized protein from a sample.
- the present invention also relates to the use of a functional element according to the invention for the development of pharmaceutical preparations.
- the invention also relates to the use of the functional elements according to the invention for the investigation of the effects and / or side effects of pharmaceutical preparations.
- the functional elements according to the invention can likewise be used for the diagnosis of diseases, for example for the identification of pathogens and for the identification of mutated genes which lead to the development of diseases.
- Another possible use of the functional elements according to the invention consists in the investigation of microbiological contamination of surface waters, groundwater and soil. Likewise, the functional elements of the invention can be to investigate the microbiological contamination of food or animal feed.
- a further preferred use of the functional elements according to the invention is the use of the functional element according to the invention as an electronic component, for example as a molecular circuit, etc., in medical technology or in a biocomputer.
- the use of the functional element according to the invention as optical memory in optical information processing is particularly preferred, the functional element according to the invention in particular comprising photoreceptor proteins immobilized on microstructures, which can convert light directly into a signal.
- the present invention also relates to a method for the identification and / or detection of analytes in a solution or suspension.
- a functional element according to the invention is provided in a first process step, which is brought into contact with an analyte-containing solution or suspension in a second process step.
- unbound analyte is removed from the functional element according to the invention by washing with a biocompatible washing liquid.
- a detection method is carried out.
- the biocompatible washing liquid is water and / or buffer, e.g. B. Phosphate buffered saline: PBS, and / or buffer with the addition of a detergent, eg. TritonX-100.
- the support may be sequentially stored in water and buffer at room temperature, if appropriate, with a detergent or buffer, if appropriate with a detergent, and water, for example, for 30 min each.
- a fluorescence detection method or a MALDI mass spectrometry method is used as the detection method for analytes in a solution or suspension.
- a method of the aforementioned type for identifying and / or detecting analytes in a solution or suspension is particularly preferred, after performing the aforementioned first three method steps in a fourth method step, according to which in a preferred embodiment a fluorescence detection method is used fluorescence-labeled analyte and / or fluorescently labeled biologically active bound to the nanoparticle molecule is excited with light and read with light.
- the analyte and / or the biological molecule bound to the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles is preferably fluorescence-labeled.
- FIG. 1 shows scanning electron micrographs of a three-dimensional nanoparticle microstructure (detail of a microspot, diameter -150 ⁇ m), produced by 5 times the application of a 16% nanoparticle suspension in aqueous trehalose solution (5% w / v).
- FIG. 2 shows scanning electron micrographs of nanoparticle layers (sections of microspots, diameter -150 ⁇ m), produced by 5 times the application of nanoparticle suspension (1%, 2%, 4%, 8%, 16% and 32%). ) in aqueous trehalose solution (5% w / v) on polyelectrolyte-coated silicon surfaces. The particle surfaces were incubated for 2 h in PBS buffer and washed for 30 min each in PBS / 0.1% TritonX-100, PBS and MilliQ water.
- FIG. 3 shows scanning force micrographs (100 ⁇ 100 ⁇ m 2 ) of three-dimensional nanoparticle microstructures (sections of microspots, diameter -150 ⁇ m), produced by 5-fold application of 2%, 16% and 32% nanoparticle suspension in aqueous trehalose solution (5% (w / v)) on polyelectrolyte-coated silicon surfaces.
- FIG. 4 shows the fluorescence scan of a nanoparticle microarray. Hase IgG nanoparticles were spotted, incubated with Cy5- labeled anti-rabbit IgG. The bound amount of analyte per spot increases with the amount of particles transferred per spot.
- FIG. 5 shows the linear relationship between signal intensity and analyte concentration.
- Goat IgG or rabbit IgG nanoparticles were spotted. Incubation was carried out with Cy5-labeled anti-goat or Cy3-labeled anti-rabbit IgG in different concentrations. Sample concentrations left: 0.04 - 4 pM, right: 4 - 400 pM. Left: The sensitivity (slope) increases for higher particle amounts / spot.
- FIG. 6 shows the fluorescence scan of a nanoparticle microarray.
- Goat IgG or hare IgG nanoparticles were spotted in suspensions with different solids contents. Incubation was carried out with a solution of Cy5-labeled anti-goat or Cy3-labeled anti-rabbit IgG.
- the nanoparticulate microstructures selectively bind only the specific interaction partners of the immobilized capture molecules.
- FIG. 7 shows the dependence of the functional integrity of particle-bound capture proteins on the trehalose concentration in the spotting suspension.
- FIG. 8 shows the dependence of the functional integrity of particle-bound catcher proteins on the trehalose concentration in FIG.
- IgG nanoparticles or rabbit IgG nanoparticles were incubated after 5 weeks of storage with Cy5-labeled anti-goat IgG and Cy3-labeled anti-hase IgG.
- FIG. 9 shows a light micrograph of the gold substrate before nanoparticles were immobilized thereon (25 ⁇ ) and a photograph of the streptavidin particle-coated surface (1000 ⁇ , dark field).
- the upper spectrum (blue) is a MALDI-TOF spec- trum of the analyte solution with which the nanoparticle surface was incubated (biotinylated and non-biotinylated insulin).
- the lower spectrum is the MALDI-TOF spectrum of nanoparticle-bound molecules after incubation.
- Example 1 Preparation of nanoparticle-based protein biochips for fluorescence readout
- nanoparticle-based protein biochips which are suitable for fluorescence readout
- glass substrates are used.
- the adhesion of nanoparticles to surfaces is largely mediated by electrostatic interaction.
- For adsorption of protein-coated nanoparticles on the substrate are mostly
- the substrates are incubated at RT for 20 min in an aqueous polycation solution (0.02 M poly (allylamine) (based on the monomer), pH 8.5), for 5 min in MiIIiQ- H 2 O and then centrifuged dry.
- aqueous polycation solution 0.2 M poly (allylamine) (based on the monomer), pH 8.5
- a 1 wt .-% aqueous suspension of the silica particles is 10
- 1 mg carboxy-functionalised silica particles is mixed with 4 .mu.l of a solution of IgG (11, 3 mg / ml) and 10 .mu.l of a solution of EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N '- ethylcarbodiimide hydrochloride, 3.8 mg / mL ) and made up to 1 ml with MES buffer (pH 4.5).
- the particles are used to coat in 5% (w / v) aqueous trehalose solution ( Figures 7, 8).
- hare and / or goat IgG-coated nanoparticles are transferred onto the pretreated glass substrate with the aid of a pin-ring spotter.
- concentration of the suspensions used is 0.5% - 50% (w / v) ( Figure 1-6).
- Per pin contact with the surface about 50 pl of suspension are transferred, it is printed five times per spot.
- the resulting nanoparticle layers are 100 nm - 1500 nm thick.
- the Spof diameter is about 150 microns.
- the placement of the individual spots on the substrate is freely programmable.
- the nanoparticle surfaces are first blocked for one hour with a 3% (w / v) solution of BSA in PBS buffer, then incubated for 1.5 h in the dark at RT with the analyte solution and then each 30 min in PBS / 0.1% TritonX 100, washed in PBS and MilliQ water. All steps are performed in glass slide racks.
- the analyte solution consists of fluorescence-labeled IgG molecules dissolved in PBS buffer (Figure 4: 40 pM Cy5-labeled anti-hase IgG 1 Figure 5: 0.04 pM, 0.4 pM and 4 pM and 4 pM, 40 pM and 400 pM Cy5-labeled anti-goat IgG, Figure 6: 400 pM Cy3-labeled anti-rabbit antibody and 400 pM Cy5-labeled anti-goat antibody). Chip selection:
- the fluorescence signal of the bound analyte molecules is detected in a commercial chip reader system from ArrayWorx.
- the exposure times are between 0.1s and 2s and are kept constant within an experiment.
- the signal intensities are stored in the form of gray scale graduations.
- the evaluation of the data takes place with the help of the program Aida of the company Raytest, Berlin.
- Gold surfaces in this case the MALDI target itself, are rubbed off with acetone, sonicated for 3 minutes in 1: 1 isopropanol / HCl (0.2 M), rinsed with isopropanol and blown dry with nitrogen. They are then incubated for 20 min at RT in aqueous polyanion solution (0.02 M (based on the monomer) poly (acrylic acid) in MiIIiQ-H 2 O, pH 8.5), washed for 5 min in MiIIiQ-H 2 O. , 20 min in polycation solution (see Example 1) incubated, washed for a further 5 min and blown dry with nitrogen.
- aqueous polyanion solution 0.02 M (based on the monomer) poly (acrylic acid) in MiIIiQ-H 2 O, pH 8.5
- Silica particles are synthesized as in Example 1 and subsequently amino- and carboxy-functionalized.
- Streptavidin binding to silica particles 2.68 nmol of streptavidin are introduced into 10 ml of 0.1 M MES buffer (pH 5). 5 mg of the carboxy particles are added. For this purpose, 2 ⁇ mol of EDC are added. After shaking at RT for 3 hours, the particles are washed once with 10 ml of MES buffer (pH 5) and once with 10 ml of phosphate buffer (pH 7).
- streptavidin particles Approximately 250 ⁇ g streptavidin particles are suspended in 10 ⁇ l MiIIiQ-H 2 O + 5% trehalose and dried ⁇ L-wise on the substrate surface (about 2 mm 2 ).
- the nanoparticle surfaces are first blocked for one hour with a 3% (w / v) solution of BSA in PBS buffer, then incubated for 1.5 h at RT with the analyte solution and then for 30 min in PBS / 0.1% TritonX 100, washed in PBS and MiIIiQ water.
- the analyte solution is a mixture of one to three times biotinylated and unbiotinylated insulin dissolved in PBS buffer (about 3: 1, total concentration about 250 nM).
- Matrix A saturated solution of 3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid in 6: 4 (v / v) 0.1% trifluoroacetic acid (pA) and acetonitrile (HPLC grade) was dissolved, applied to the particle layer and air dried.
- a mass spectrometer HP G 2025A LD-TOF modified with a time lag focusing (TLF) unit (Future, GSG company) was used.
- the data was collected using a Le Croy 500 MHz oscilloscope.
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Abstract
The invention relates to functional elements that comprise microstructures which are arranged on a support and contain bifunctionalized nanoparticles. The invention also relates to a method for producing the same and to the use thereof.
Description
Dreidimensionale nano- und mikrostrukturierte TrägerThree-dimensional nano- and microstructured supports
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft Funktionselemente, die auf einem Träger angeordnete, aus biofunktionalisierbaren oder biofunktionali- sierten Nanopartikeln bestehende Mikrostrukturen umfassen, Verfah- ren zur Herstellung dieser Funktionselemente sowie die Verwendung derselben.The present invention relates to functional elements which comprise microstructures comprising biofunctionalizable or biofunctionalized nanoparticles arranged on a support, processes for producing these functional elements and the use thereof.
Die Untersuchung von biologischen Molekülen wie DNA oder Proteinen spielt in den unterschiedlichsten Bereichen eine immer wichtigere Rolle, beispielsweise in der Umweltanalytik zum Nachweis von Mikroorganismen, in der klinischen Diagnostik zur Identifizierung von Erregern oder zur Bestimmung von Resistenzen gegen Medikamente usw. Unabhängig von der speziellen Anwendung müssen diese Analyseverfahren immer die gleichen Anforderungen erfüllen. Insbesondere sollten sie schnell und kostengünstig durchführbar sein, gleichzeitig aber sehr empfindlich sein und zuverlässig reproduzierbare Ergebnisse liefern.The study of biological molecules such as DNA or proteins plays an increasingly important role in a wide variety of fields, for example in environmental analysis for the detection of microorganisms, in clinical diagnostics for the identification of pathogens or for the determination of drug resistance, etc. Regardless of the specific application These analytical methods must always meet the same requirements. In particular, they should be quick and inexpensive to carry out, but at the same time be very sensitive and provide reliably reproducible results.
So beschreibt die WO 03/056336 A2 die Herstellung und Verwendung von Mikrostrukturen aus biofunktionalisierten Nanopartikeln, welche in unterschiedlichsten Nachweis- und Analyseverfahren ein- gesetzt werden können.Thus, WO 03/056336 A2 describes the preparation and use of microstructures of biofunctionalized nanoparticles which can be used in a wide variety of detection and analysis methods.
Die dort beschriebenen Mikrostrukturen sind jedoch verbesserungsfähig hinsichtlich ihrer Sensitivität, insbesondere in Fällen, in denen eine hohe Nachweisgenauigkeit erforderlich ist.However, the microstructures described therein can be improved in terms of their sensitivity, especially in cases where a high detection accuracy is required.
Der vorliegenden Erfindung liegt also das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren zur Erzeugung von miniaturisierten
Trägersystemen mit daran immobilisierten biologischen Molekülen, beispielsweise von Gen-Chips und Protein-Chips, zu entwickeln, bei denen die im Stand der Technik bekannten Nachteile beseitigt sind, insbesondere eine nochmals erhöhte Nachweissensitivität bereitge- stellt wird und bei denen die Biomoleküle insbesondere unter Erhalt und Schutz ihrer biologischen Aktivität in hoher Packungsdichte an einem Träger immobilisiert sind oder immobilisiert werden können und die zur Verwendung in unterschiedlichsten Screening- und Analytiksystemen, beispielsweise in der medizinischen Messr und Über- wachungstechnik, und in Biocomputern geeignet sind.The present invention is therefore based on the technical problem, means and methods for the production of miniaturized Develop carrier systems with immobilized biological molecules, such as gene chips and protein chips, in which the disadvantages known in the prior art are eliminated, in particular a further increased detection sensitivity is provided and in which the biomolecules in particular under receipt and Protected their biological activity in high packing density are immobilized on a support or can be immobilized and which are suitable for use in a variety of screening and analysis systems, for example in medical Messr and monitoring technology, and in biocomputers.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Funktionselementes, umfassend einen Träger mit einer Oberfläche und mindestens eine auf der Trägeroberfläche angeordnete Mikrostruktur, wobei die Mikrostruktur aus mehreren dreidimensional übereinander angeordneten Schichten von Nanopartikeln gebildet ist und wobei die Nanopartikel molekülspezifische Erkennungsstellen aufweisen, die innerhalb der Mik- rostruktur eine Adressierbarkeit ermöglichen.The present invention solves the underlying technical problem by providing a functional element, comprising a carrier having a surface and at least one arranged on the support surface microstructure, wherein the microstructure of a plurality of three-dimensionally stacked layers of nanoparticles is formed and wherein the nanoparticles molecule-specific recognition sites which allow addressability within the microstructure.
Die Erfindung stellt also mehrdimensional aufgebaute Mikrostruktu- ren aus mehreren Nanopartikelschichten bereit, die in bevorzugter Ausführung unter Einschluss mindestens eines Biomolekül- stabilisierenden Agens gebildet werden. Diese mehrdimensional angeordneten Schichten von Nanopartikeln vergrößern in drastischer Art und Weise die für die erwünschten Nachweisreaktionen zur Ver- fügung gestellten Reaktionsflächen des Funktionselementes, wobei gleichzeitig durch den Einschluss des proteinstabilisierenden Agens in einer bevorzugten Ausführungsform erreicht wird, dass bei Verwendung von Proteinen oder Peptiden als biologisch aktive Moleküle
deren natürliche Struktur und Funktion erhalten bleibt. Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die mehreren dreidimensional angeordneten Schichten von Nanopartikeln, insbesondere auch in einer Dicke von 10 nm bis 10 μm, bevorzugt 50 nm bis 2,5 μm, ins- besondere 100 nm bis 1 ,5 μm stabil auf der Oberfläche des Trägers angeordnet bleiben, auch wenn sie Spül- und/oder Waschschritten auch längerer Dauer und Intensität ausgesetzt werden. Die erfindungsgemäß vorgesehene dreidimensional angeordnete Vielzahl von Schichten von Nanopartikeln bleibt überraschenderweise stabil auf der Trägeroberfläche und ermöglicht so wider Erwarten eine hohe Nachweisgenauigkeit auch bei Kleinstmengen an nachzuweisendem Analyten. Die erfindungsgemäß ermöglichte Beständigkeit der dreidimensionalen Mikrostrukturen aus Nanopartikeln ermöglicht es, Funktionsschichten zu erzeugen, die ortsaufgelöst spezifische Analy- ten binden können. Damit erfüllen die dreidimensionalen mikrostrukturierten Nanopartikelschichten alle Bedingungen für einen Einsatz zur Herstellung biologischer Sensoroberflächen.The invention thus provides multi-dimensionally constructed microstructures comprising a plurality of nanoparticle layers which, in a preferred embodiment, are formed including at least one biomolecule-stabilizing agent. These multi-dimensionally arranged layers of nanoparticles drastically increase the reaction surfaces of the functional element provided for the desired detection reactions, wherein the inclusion of the protein-stabilizing agent in a preferred embodiment simultaneously achieves that when using proteins or peptides as biological active molecules their natural structure and function is preserved. Surprisingly, it could be shown that the several three-dimensionally arranged layers of nanoparticles, in particular also in a thickness of 10 nm to 10 .mu.m, preferably 50 nm to 2.5 .mu.m, in particular 100 nm to 1, 5 .mu.m stable on the surface of Stay arranged carrier, even if they are rinsing and / or washing steps also longer duration and intensity exposed. The inventively provided three-dimensionally arranged plurality of layers of nanoparticles surprisingly remains stable on the support surface and thus allows, contrary to expectations, a high detection accuracy even with very small amounts of analyte to be detected. The resistance of the three-dimensional microstructures made of nanoparticles, which is made possible in accordance with the invention, makes it possible to produce functional layers which can bind spatially resolved specific analytes. Thus, the three-dimensional microstructured nanoparticle layers meet all the conditions for use for the production of biological sensor surfaces.
Die vorliegende Erfindung stellt also ein Funktionselement bereit, auf dessen Oberfläche ein oder mehrere Mikrostrukturen angeordnet sind, wobei jede Mikrostruktur aus vielen Nanopartikeln in mehreren Schichten mit identischen oder nicht-identischen molekülspezifischen Erkennungsstellen besteht. Die Mikrostrukturen der Funktionselemente können Biofunktionen aufweisen beziehungsweise damit versehen werden. Das heißt, die molekülspezifischen Erken- nungsstellen der die Mikrostruktur bildenden Nanopartikel können entsprechende Moleküle, insbesondere organische Moleküle mit einer biologischen Funktion oder Aktivität, erkennen und diese binden. Bei diesen Molekülen kann es sich beispielsweise um Nucleinsäuren oder Proteine handeln. An die Moleküle, die an die molekülspezifi-
sehen Erkennungsstellen der Nanopartikel gebunden sind, können dann andere Moleküle gebunden werden, beispielsweise zu analysierende Moleküle einer Probe. Im Unterschied zu im Stand der Technik bekannten Systemen, beispielsweise herkömmlichen Gen- oder Protein-Arrays, sieht die vorliegende Erfindung also vor, biologische Moleküle nicht direkt an eine planare Oberfläche zu binden, sondern an mehrere dreidimensionale Nanopartikeloberflächen zu immobilisieren, die vor oder nach der Immobilisierung zur Bildung einer Mikrostruktur eingesetzt werden.The present invention thus provides a functional element on the surface of which one or more microstructures are arranged, each microstructure consisting of many nanoparticles in multiple layers with identical or non-identical molecule-specific recognition sites. The microstructures of the functional elements may include or be provided with biofunctions. This means that the molecule-specific recognition points of the nanoparticles forming the microstructure can recognize and bind corresponding molecules, in particular organic molecules having a biological function or activity. These molecules may be, for example, nucleic acids or proteins. To the molecules that bind to the molecule-specific If recognition sites of the nanoparticles are bound, then other molecules can be bound, for example molecules of a sample to be analyzed. In contrast to systems known in the prior art, for example conventional gene or protein arrays, the present invention therefore does not intend to bind biological molecules directly to a planar surface, but rather to immobilize them to a plurality of three-dimensional nanoparticle surfaces, before or after Immobilization can be used to form a microstructure.
Die erfindungsgemäßen Funktionselemente, die nanopartikuläre Systeme mit molekülspezifischen Erkennungssequenzen zur Bindung biologischer Moleküle umfassen, bieten gegenüber herkömmlichen Systemen, beispielsweise solchen, bei denen die biologischen Moleküle direkt am Träger immobilisiert sind, mehrere entscheiden- de Vorteile.The functional elements according to the invention, which comprise nanoparticular systems with molecule-specific recognition sequences for binding biological molecules, offer several decisive advantages over conventional systems, for example those in which the biological molecules are immobilized directly on the support.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Nanopartikel stellen äußerst flexible und inerte Systeme dar. Sie können beispielsweise aus den verschiedensten Kernen bestehen, zum Beispiel organischen Polymeren oder anorganischen Materialien. Dabei bieten anorganische Nanopartikel wie Silica-Partikel den Vorteil, dass sie chemisch ausgesprochen inert und mechanisch stabil sind. Während Surfmere und molekular geprägte Polymere weiche Kerne besitzen, zeigen Nanopartikel mit Silica- oder Eisenkernen in Lösungsmitteln keine Quellung. Nicht-quellbare Partikel verändern ihre Morphologie nicht, auch wenn sie mehrmals über längere Zeit in Lösungsmitteln suspendiert werden. Erfindungsgemäße Funktionselemente, die nicht- quellbare Partikel umfassen, können daher problemlos in Analyseoder Mikrostrukturierungsverfahren eingesetzt werden, die die Ver-
wendung von Lösungsmitteln erfordern, ohne dass der Zustand der Nanopartikel oder der immobilisierten biologischen Moleküle nachteilig beeinflusst wird. Funktionselemente, die solche Nanopartikel enthalten, lassen sich daher auch zur Aufreinigung der zu immobilisie- renden biologischen Moleküle aus komplexen Substanzgemischen, die nicht-erwünschte Substanzen wie Detergenzien oder Salze enthalten, verwenden, wobei die zu immobilisierenden Moleküle über beliebig lange Waschprozesse hinweg optimal aus solchen Substanzgemischen abgetrennt werden können. Andererseits können sich superparamagnetische oder ferromagnetische Nanopartikel mit einem Eisenoxid-Kern in einem Magnetfeld entlang der Feldlinien anordnen. Diese Eigenschaft von Eisenoxid-Nanopartikeln lässt sich benutzen, um direkt Mikrostrukturen, insbesondere nanoskopische Leiterbahnen aufzubauen.The nanoparticles used according to the invention are extremely flexible and inert systems. They can consist, for example, of a wide variety of cores, for example organic polymers or inorganic materials. Inorganic nanoparticles such as silica particles offer the advantage that they are chemically inert and mechanically stable. While surfmers and molecular imprinted polymers have soft nuclei, nanoparticles with silica or iron cores do not swell in solvents. Non-swellable particles do not change their morphology, even if they are suspended several times in solvents for a long time. Functional elements according to the invention which comprise non-swellable particles can therefore be used without problems in analysis or microstructuring processes which require solvent application without adversely affecting the state of the nanoparticles or immobilized biological molecules. Functional elements which contain such nanoparticles can therefore also be used for purifying the biological molecules to be immobilized from complex mixtures of substances which contain undesired substances such as detergents or salts, the molecules to be immobilized optimally over any desired length of washing process Substance mixtures can be separated. On the other hand, superparamagnetic or ferromagnetic nanoparticles with an iron oxide core can be arranged in a magnetic field along the field lines. This property of iron oxide nanoparticles can be used to directly build microstructures, in particular nanoscopic interconnects.
Die erfindungsgemäßen Funktionselemente lassen sich zur Immobilisierung unterschiedlichster biologischer Moleküle verwenden, wobei deren biologische Aktivität erhalten bleibt. Die zur Bildung der Mikrostrukturen verwendeten Nanopartikel weisen molekülspezifische Erkennungsstellen, insbesondere funktionelle chemische Gruppen auf, die das zu immobilisierende Molekül so binden können, dass die für die biologische Aktivität erforderlichen Molekülbereiche in einem dem nativen Molekülzustand entsprechenden Zustand vorliegen. In Abhängigkeit von den auf der Nanopartikel-Oberfläche vorhandenen funktionellen Gruppen können die Biomoleküle je nach Bedarf kova- lent und/oder nicht-kovalent an den Nanopartikeln gebunden sein. Die Nanopartikel können unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweisen, so dass sich entweder unterschiedliche Biomoleküle oder Biomoleküle mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen mit bevorzugter Ausrichtung immobilisieren lassen. Die Biomoleküle können
sowohl ungerichtet als auch gerichtet an den Nanopartikeln immobilisiert werden, wobei nahezu jede gewünschte Ausrichtung der Biomoleküle möglich ist. Durch die Immobilisierung der Biomoleküle an den Nanopartikeln wird auch eine Stabilisierung der Biomoleküle er- reicht.The functional elements according to the invention can be used to immobilize a wide variety of biological molecules while retaining their biological activity. The nanoparticles used to form the microstructures have molecule-specific recognition sites, in particular functional chemical groups, which can bind the molecule to be immobilized in such a way that the molecular regions required for the biological activity are present in a state corresponding to the native molecular state. Depending on the functional groups present on the nanoparticle surface, the biomolecules may be bound covalently and / or noncovalently to the nanoparticles, as required. The nanoparticles can have different functional groups, so that either different biomolecules or biomolecules having different functional groups with preferred orientation can be immobilized. The biomolecules can both non-directionally and directionally immobilized on the nanoparticles, with almost any desired orientation of the biomolecules is possible. The immobilization of the biomolecules on the nanoparticles also stabilizes the biomolecules.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist in die Mikrostruktur mindestens ein biomolekülstabilisierendes Agens, insbesondere mindestens ein proteinstabilisierendes Agens, eingeschlossen. Durch solche Agenzien wird die Stabilisierung der Biomoleküle weiter verstärkt. Der Zusatz mindestens eines biomolekülstabilisierenden Additivs, insbesondere mindestens eines proteinstabilisierenden Additivs, erhält die Funktionalität Nanopartikel-gebundener biologischer Moleküle, insbesondere Peptide oder Proteine, innerhalb der Partikelschichten, wenn diese auf einem Substrat eingetrocknet werden, und garantiert so die Lagerfähigkeit nanopartikulärer Funktionsschichten. Dabei beträgt die Lagerfähigkeit bis ein Jahr, bevorzugt bis 8 Monate, insbesondere 3 Monate. Der erfindungsgemäße Einschluss mindestens eines biomolekülstabilisierenden Agens, insbesondere mindestens eines proteinstabilisierenden Agens, in die Mikrostruktur schützt also die Funktion, vor allem die biologische Funktion, und die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Funktionselemente.According to the invention, preferably at least one biomolecule-stabilizing agent, in particular at least one protein-stabilizing agent, is included in the microstructure. Such agents further enhance the stabilization of biomolecules. The addition of at least one biomolecule-stabilizing additive, in particular at least one protein-stabilizing additive, preserves the functionality of nanoparticle-bound biological molecules, in particular peptides or proteins, within the particle layers when they are dried on a substrate, thus guaranteeing the shelf life of nanoparticulate functional layers. The shelf life is up to one year, preferably up to 8 months, especially 3 months. The inclusion according to the invention of at least one biomolecule-stabilizing agent, in particular of at least one protein-stabilizing agent, into the microstructure thus protects the function, in particular the biological function, and the effectiveness of the functional elements according to the invention.
Die zur Bildung der Mikrostrukturen verwendeten Nanopartikel besitzen ein vergleichsweise sehr großes Oberfläche-Volumen-Verhältnis und können dementsprechend eine große Menge eines biologischen Moleküls pro Masse binden. Im Vergleich zu Systemen, bei denen biologische Moleküle direkt an einem planaren Träger gebunden sind, kann ein Funktionselement somit pro Flächeneinheit eine erheblich größere Menge der biologischen Moleküle binden. Die Men-
ge der pro Flächeneinheit gebundenen Moleküle, das heißt die Packungsdichte, ist erfindungsgemäß deshalb so groß, weil zur Erzeugung der Mikrostruktur auf der Trägeroberfläche mehrere Partikel- Lagen übereinander geschichtet werden. Eine weitere Erhöhung der pro Flächeneinheit gebundenen Menge biologischer Moleküle kann dadurch erreicht werden, dass die Nanopartikel zunächst mit Hydro- gelen und dann mit biologischen Molekülen beschichtet werden.The nanoparticles used to form the microstructures have a comparatively very high surface to volume ratio and accordingly can bind a large amount of a biological molecule per mass. Compared to systems in which biological molecules are bound directly to a planar support, a functional element can thus bind a significantly larger amount of the biological molecules per unit area. The menu According to the invention, the size of the molecules bound per unit area, that is to say the packing density, is so great because several particle layers are stacked on top of one another to produce the microstructure on the carrier surface. A further increase in the amount of biological molecules bound per unit area can be achieved by first coating the nanoparticles with hydrogels and then with biological molecules.
Die erfindungsgemäße Herstellung und Verwendung mehrerer dreidimensional angeordneter Schichten von Nanopartikeln erhöht die reaktive Oberfläche gegenüber bisher benutzen planaren Affinitätsoberflächen. Daher können die erfindungsgemäßen Mikrostrukturen mehr Analyt binden. Die Nanopartikel-Mehrfach- oder Multischichten binden umso mehr Analyt, je mehr Nanopartikel pro Fläche immobilisiert werden. Dabei sind die Analytkonzentrationen und die erzielte Signalintensität nach Anbindung der Analyten an die nanopartikulä- ren Oberflächen linear miteinander korreliert.The preparation according to the invention and the use of a plurality of three-dimensionally arranged layers of nanoparticles increases the reactive surface compared to previously used planar affinity surfaces. Therefore, the microstructures according to the invention can bind more analyte. The nanoparticle multilayers or multilayers bind the more analyte the more nanoparticles are immobilized per surface. The analyte concentrations and the signal intensity achieved are linearly correlated with one another after binding of the analytes to the nanoparticulate surfaces.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel besitzen einen Durchmesser von 5 nm bis 500 nm. Unter Verwendung solcher Nanopartikel lassen sich daher Funktionselemente herstellen, die sehr kleine Mikrostrukturen beliebiger Form im Nanometer- bis Mikrometerbereich aufweisen. Die Verwendung der Nanopartikel zur Erzeugung der Mikrostrukturen erlaubt daher eine bislang nicht erreichte Miniaturisierung der Funktionselemente, die mit erheblichen Verbesserungen signifikanter Parameter der Funktionselemente einhergeht.The nanoparticles used according to the invention have a diameter of 5 nm to 500 nm. Using such nanoparticles, it is therefore possible to produce functional elements which have very small microstructures of any shape in the nanometer to micrometer range. The use of the nanoparticles to generate the microstructures therefore allows a hitherto unattained miniaturization of the functional elements, which is accompanied by significant improvements of significant parameters of the functional elements.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel zeigen auf den Materialien, die zur Herstellung der Träger beziehungsweise Trägeroberflächen verwendet werden, eine sehr guten Haftung. Die Partikel
können dadurch problemlos für eine Vielzahl von Trägersystemen und somit für eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionselemente mit unterschiedlichsten Anwendungsgebereichen verwendet werden. Die unter Verwendung der Nanopartikel gebildeten Mikrostrukturen sind sehr homogen, was zu einer ortsunabhängigen Signalintensität führt.The nanoparticles used according to the invention show a very good adhesion to the materials used for the preparation of the carrier or carrier surfaces. The particles As a result, they can easily be used for a large number of carrier systems and thus for a large number of different functional elements with a wide variety of application areas. The microstructures formed using the nanoparticles are very homogeneous, which leads to a location-independent signal intensity.
Die erfindungsgemäßen Funktionselemente können auf ihrer Trägeroberfläche unterschiedliche Mikrostrukturen aufweisen, die aus unterschiedlichen Nanopartikeln mit unterschiedlichen molekülspezifischen Erkennungsstellen bestehen. Dementsprechend können die- se unterschiedlichen Mikrostrukturen auch mit unterschiedlichen Biofunktionen belegt werden. Die Funktionselemente können also nebeneinander Mikrostrukturen enthalten, die unterschiedliche biologischen Molekülen enthalten beziehungsweise damit versehen werden können. Ein Funktionselement kann daher beispielsweise mehrere unterschiedliche Proteine oder mehrere unterschiedliche Nucleinsäu- ren oder gleichzeitig Proteine und Nucleinsäuren enthalten.The functional elements according to the invention may have different microstructures on their carrier surface which consist of different nanoparticles with different molecule-specific recognition sites. Accordingly, these different microstructures can also be assigned different biofunctions. The functional elements can therefore contain juxtaposed microstructures which contain or can be provided with different biological molecules. A functional element may therefore contain, for example, several different proteins or several different nucleic acids or at the same time proteins and nucleic acids.
Die erfindungsgemäßen Funktionselemente lassen sich auf einfache Weise unter Verwendung bekannter Verfahren herstellen. Beispielsweise lassen sich unter Verwendung geeigneter Suspendiermittel aus Nanopartikeln sehr einfach stabile Suspensionen erzeugen. Na- nopartikel-Suspensionen verhalten sich wie Lösungen und sind dadurch kompatibel mit Mikrostrukturierungsverfahren. Nanopartikel- suspensionen können daher direkt, beispielsweise unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie Nadel-Ring-Printer, lithographi- scher Verfahren Tintenstrahlverfahren und/oder Mikrokontaktverfah- ren, strukturiert auf geeignete Träger abgeschieden werden, die zuvor mit einem Verbindungsmittel zur festen Anhaftung der Nanopartikel vorbehandelt wurden. Durch eine geeignete Wahl des Verbin-
dungsmittels kann die gebildete Mikrostruktur so ausgebildet werden, dass sie zu einem späteren Zeitpunkt teilweise oder vollständig von der Trägeroberfläche des Funktionselementes, beispielsweise durch Änderung des pH-Wertes oder der Temperatur, gelöst und gegebe- nenfalls auf die Trägeroberfläche eines anderen Funktionselementes übertragen werden kann.The functional elements according to the invention can be prepared in a simple manner using known methods. For example, it is very easy to produce stable suspensions using nanoparticle suspending agents. Nanoparticle suspensions behave like solutions and are thus compatible with microstructuring processes. Nanoparticle suspensions can therefore be deposited directly, for example using conventional methods such as needle-ring printers, lithographic methods, inkjet methods and / or microcontact methods, onto suitable carriers which have been previously pretreated with a bonding agent for firmly adhering the nanoparticles , By a suitable choice of the connection The microstructure formed can be formed such that it can be partially or completely detached from the carrier surface of the functional element at a later time, for example by changing the pH or the temperature, and optionally transferred to the carrier surface of another functional element.
Die erfindungsgemäßen Funktionselemente können in unterschiedlichster Form ausgeführt sein und lassen sich daher auch in sehr unterschiedlichen Bereichen einsetzen. Beispielsweise kann es sich bei den erfindungsgemäßen Funktionselementen um Biochips, beispielsweise Gen- oder Protein-Arrays, handeln, die in der medizinischen Analyse oder Diagnostik eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Funktionselemente lassen sich aber auch als Elektronikbaustein, beispielsweise als molekularer Schaltkreis, in der medizini- sehen Mess- und Überwachungstechnik oder in einem Biocomputer verwenden.The functional elements according to the invention can be embodied in various forms and can therefore also be used in very different areas. For example, the functional elements according to the invention may be biochips, for example gene or protein arrays, which are used in medical analysis or diagnostics. However, the functional elements according to the invention can also be used as an electronic component, for example as a molecular circuit, in medical measurement and monitoring technology or in a biocomputer.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Funktionselement" ein Element verstanden, das entweder allein o- der als Bestandteil einer komplexeren Vorrichtung, das heißt im Zu- sammenhang mit weiteren ähnlichen oder anders gearteten Funktionselementen, mindestens eine definierte Funktion ausübt. Ein Funktionselement umfasst mehrere Bestandteile, die aus gleichen oder unterschiedlichen Materialien bestehen können. Die einzelnen Bestandteile eines Funktionselementes können innerhalb eines Funktionselementes unterschiedliche Funktionen ausüben und können in unterschiedlichem Maße oder in unterschiedlicher Art und Weise zur Gesamtfunktion des Elementes beitragen. In der vorliegenden Erfindung umfasst ein Funktionselement einen Träger mit
einer Trägeroberfläche, auf der definierte Schichten von Nanoparti- keln dreidimensional als Mikrostruktur(en) angeordnet ist/sind, wobei die Nanopartikel mit biologischen Funktionen, beispielsweise biologischen Molekülen wie Nucleinsäuren, Proteinen und/oder PNA- Molekülen versehen sind und/oder versehen werden können und diese bevorzugt durch den Einschluss mindestens eines Biomolekül- stabilisierenden Agens, insbesondere eines proteinstabilisierenden Agens, geschützt werden.In connection with the present invention, a "functional element" is understood to mean an element which, either alone or as part of a more complex device, that is to say in connection with other similar or different functional elements, performs at least one defined function The individual constituents of a functional element can perform different functions within a functional element and can contribute to the overall function of the element to varying degrees or in different ways In the present invention, a functional element comprises a Carrier with a carrier surface on which defined layers of nanoparticles are arranged three-dimensionally as microstructure (s), the nanoparticles being provided with biological functions, for example biological molecules such as nucleic acids, proteins and / or PNA molecules, and / or being provided and these are preferably protected by the inclusion of at least one biomolecule-stabilizing agent, in particular a protein-stabilizing agent.
Unter „Biomolekül-stabilisierenden Agenzien", insbesondere „prote- instabilisierenden Agenzien", werden erfindungsgemäß Agenzien verstanden, die die dreidimensionale Struktur von Proteinen, also Sekundär-, Tertiär-, Quartärstruktur, unter Trockenstress stabilisieren und damit die Funktionalität der Proteine im Trockenzustand, das heißt nach Verdampfen des Lösungsmittels, erhalten.By "biomolecule-stabilizing agents", in particular "protein-unstabilizing agents" are meant according to the invention agents which stabilize the three-dimensional structure of proteins, ie secondary, tertiary, quaternary, under drought stress and thus the functionality of the proteins in the dry state, the is called after evaporation of the solvent.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das proteinstabilisierende Agens ein Saccharid, insbesondere Sucrose, Lactose, Glucose, Tre- halose oder Maltose, ein Polyalkohol, insbesondere Inositol, Ethy- lenglycol, Glyzerol, Sorbitol, Xylithol, Mannitol oder 2-Methyl-2,4- pentandiol, eine Aminosäure, insbesondere Natriumglutamat, Prolin, alpha-Alanin, beta-Alanin, Glyzin, Lysin-HCI oder 4-Hydroxyprolin, ein Polymer, insbesondere Polyethylenclycol, Dextran, Polyvinylpyr- rolidon, ein anorganisches Salz, insbesondere Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat oder Natriumfluo- rid, ein organisches Salz, insbesondere Natriumacetat, Natriumpoly- ethylen, Natriumcaprylat, Propionat, Lactat oder Succinat, oder Tri- methylamin N-oxid, Sarcosin, Betain, gamma-Aminobuttersäure, Oc- topin, Alanopin, Strombin, Dimethylsulfoxid oder Ethanol oder eine Mischung aus den genannten Stoffen.
Unter einem „Träger" wird derjenige Bestandteil des Funktionselementes verstanden, der hauptsächlich das Volumen und die äußere Gestalt des Funktionselementes bestimmt. Der Begriff „Träger" bedeutet insbesondere eine feste Matrix. Der Träger kann eine beliebi- ge Größe und eine beliebige Form aufweisen, beispielsweise die einer Kugel, eines Zylinders, einer Stange, eines Drahtes, einer Platte oder einer Folie. Der Träger kann sowohl ein Hohlkörper als auch ein Vollkörper sein. Mit einem Vollkörper ist insbesondere ein Körper gemeint, der im Wesentlichen keine Hohlräume aufweist und voll- ständig aus einem Material oder einer Material-Kombination bestehen kann. Der Vollkörper kann auch aus einer Schichtabfolge gleicher oder unterschiedlicher Materialien bestehen.In a preferred embodiment, the protein-stabilizing agent is a saccharide, in particular sucrose, lactose, glucose, trehalose or maltose, a polyalcohol, in particular inositol, ethylene glycol, glycerol, sorbitol, xylithol, mannitol or 2-methyl-2,4-diene pentanediol, an amino acid, in particular sodium glutamate, proline, alpha-alanine, beta-alanine, glycine, lysine HCl or 4-hydroxyproline, a polymer, in particular polyethylene glycol, dextran, polyvinylpyrrolidone, an inorganic salt, in particular sodium sulfate, ammonium sulfate, potassium phosphate , Magnesium sulfate or sodium fluoride, an organic salt, in particular sodium acetate, sodium polyethylenes, sodium caprylate, propionate, lactate or succinate, or trimethylamine N-oxide, sarcosine, betaine, gamma-aminobutyric acid, octopine, alanopine, strombin, Dimethyl sulfoxide or ethanol or a mixture of the substances mentioned. A "carrier" is understood to mean that component of the functional element which primarily determines the volume and the external shape of the functional element. The term "carrier" means in particular a solid matrix. The carrier may be of any size and shape, such as a ball, cylinder, rod, wire, plate or foil. The carrier may be both a hollow body and a solid body. By a solid body is meant, in particular, a body which essentially has no cavities and can consist entirely of a material or a combination of materials. The solid body can also consist of a layer sequence of the same or different materials.
Erfindungsgemäß besteht der Träger des Funktionselementes, insbesondere die Träger-Oberfläche, aus einem Metall, einem Metall- oxid, einem Polymer, Glas, einem Halbleitermaterial oder Keramik. Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet dies, dass entweder der Träger vollständig aus einem der vorstehend genannten Materialien besteht oder dieses im Wesentlichen enthält oder vollständig aus einer Kombination dieser Materialien besteht oder diese im We- sentlichen enthält oder dass die Oberfläche des Trägers vollständig aus einem der vorstehend genannten Materialien besteht oder diese im Wesentlichen enthält oder vollständig aus einer Kombination dieser Materialien besteht oder diese im Wesentlichen enthält. Der Träger oder seine Oberfläche besteht dabei zumindest zu etwa 60%, vorzugsweise zu etwa 70%, bevorzugter zu etwa 80% und am bevorzugtesten zu etwa 100% aus einem der vorstehend genannten Materialien oder einer Kombination solcher Materialien.
In bevorzugter Ausführungsform besteht der Träger des Funktionselementes aus Materialien, wie transparentem Glas, Siliciumdioxid, Metallen, Metalloxiden, Polymeren und Copolymeren von Dextranen oder Amiden, beispielsweise Acrylamid-Derivaten, Cellulose, Nylon, oder polymeren Materialien, wie Polyethylenterephthalat, Cellulose- acetat, Polystyrol oder Polymethylmethacrylat oder einem Polycar- bonat von Bisphenol A.According to the invention, the carrier of the functional element, in particular the carrier surface, consists of a metal, a metal oxide, a polymer, glass, a semiconductor material or ceramic. In the context of the invention, this means that either the carrier consists entirely of or contains substantially all of the materials mentioned above or consists entirely of or comprises essentially a combination of these materials, or that the surface of the carrier consists entirely of one of the materials the above-mentioned materials or contains them substantially or consists entirely of a combination of these materials or substantially contains. The support or its surface is at least about 60%, preferably about 70%, more preferably about 80%, and most preferably about 100% of any of the foregoing materials or a combination of such materials. In a preferred embodiment, the support of the functional element consists of materials such as transparent glass, silica, metals, metal oxides, polymers and copolymers of dextranes or amides, for example acrylamide derivatives, cellulose, nylon, or polymeric materials such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polystyrene or polymethyl methacrylate or a polycarbonate of bisphenol A.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Oberfläche des Funktionselement-Trägers planar oder auch vorstrukturiert ist, beispiels- weise Zu- und Ableitungen enthält. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Oberfläche des Trägers und der Träger selber undurchlässig und/oder porös sein kann. Solche Träger sind beispielsweise Membranen oder Filter. Erfindungsgemäß ist ebenfalls vorgesehen, dass die von der Mikrostruktur nicht abgedeckten Flächenab- schnitte der Oberfläche des Trägers Funktionalitäten beziehungsweise chemische Verbindungen enthalten, die eine unspezifische Anlagerung von Biomolekülen an diese Flächenabschnitte verhindern. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen chemischen Verbindungen um Polyethylenglykole, Oligoethylenglykole, Dextran oder ein Gemisch davon. Besonders bevorzugt enthält die Oberfläche des Funktionselement-Trägers eine Ethylenoxid-Schicht.According to the invention, it is provided that the surface of the functional element carrier is planar or also prestructured, for example contains supply and discharge lines. According to the invention, it is provided that the surface of the carrier and the carrier itself can be impermeable and / or porous. Such carriers are for example membranes or filters. According to the invention, it is likewise provided that the area sections, not covered by the microstructure, of the surface of the carrier contain functionalities or chemical compounds which prevent non-specific attachment of biomolecules to these surface sections. Preferably, these chemical compounds are polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextran or a mixture thereof. Particularly preferably, the surface of the functional element carrier contains an ethylene oxide layer.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass zwischen der Trägeroberfläche und der Mikrostruktur mindestens eine Schicht eines Verbindungsmittels angeordnet ist. Das Verbin- dungsmittel dient zur festen Bindung der Nanopartikel an der Trägeroberfläche des Funktionselementes. Die Auswahl des Verbindungsmittels richtet sich nach der Oberfläche des Trägermaterials und den zu bindenden Nanopartikeln. Bei dem Verbindungsmittel
handelt es sich vorzugsweise um geladene oder ungeladene Polymere.In a preferred embodiment of the invention it is provided that at least one layer of a connecting means is arranged between the carrier surface and the microstructure. The connecting agent serves for the firm binding of the nanoparticles to the carrier surface of the functional element. The choice of the bonding agent depends on the surface of the support material and the nanoparticles to be bound. In the connection means they are preferably charged or uncharged polymers.
Die Verbindungsmittel sind vorzugsweise schwache oder starke Po- lyelktrolythe, das heißt ihre Ladungsdichte ist pH-abhängig oder pH- unabhängig. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Verbindungsmittel aus Poly(diallyl-dimethyl-ammoniumchlorid), einem Natriumsalz der Poly(styrolsulfonsäure), einem Natriumsalz der Poly(vinylsulfonsäure), Poly(allylamin-hydrochlorid), linearem/verzweigtem Poly(ethylenimin), Poly(acrylsäure), Po- ly(methacrylsäure) oder einem Gemisch aus diesen.The bonding agents are preferably weak or strong polyelectrolyte, ie their charge density is pH-dependent or pH-independent. In a preferred embodiment, the bonding agent consists of poly (diallyldimethylammonium chloride), a sodium salt of poly (styrenesulfonic acid), a sodium salt of poly (vinylsulfonic acid), poly (allylamine hydrochloride), linear / branched poly (ethyleneimine), poly ( acrylic acid), poly (methacrylic acid) or a mixture of these.
Bei dem Polymer kann es sich auch um ein Hydrogel handeln. Bei dem Verbindungsmittel kann es sich auch um eine Plasmaschicht mit geladenen Gruppen, wie einen Polyelektrolyten, oder eine Plasmaschicht mit chemisch reaktiven Gruppen handeln. Das Verbin- dungsmittel kann auch ein Self-Assembled-Monolayer auf Silan-, Thiol-, Phosphat- oder Fettsäure-Basis sein. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Verbindungsmittelschicht aus mindestens einer Schicht eines Verbindungsmittels besteht. Die Verbindungsmittelschicht kann jedoch auch aus mehreren Schichten unterschiedli- eher Verbindungsmittel bestehen, beispielsweise aus einer anionischen Plasma-Schicht und einer kationischen Polymerschicht oder aus mehreren Polymerschichten, die abwechselnd anionisch und kationisch sind.The polymer may also be a hydrogel. The bonding agent may also be a charged-gas plasma layer, such as a polyelectrolyte, or a plasma layer having chemically reactive groups. The compound can also be a self-assembled monolayer based on silane, thiol, phosphate or fatty acid. According to the invention, it is provided that the bonding agent layer consists of at least one layer of a bonding agent. However, the bonding agent layer can also consist of several layers of different bonding agents, for example of an anionic plasma layer and a cationic polymer layer or of a plurality of polymer layers which are alternately anionic and cationic.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Ver- bindungsmittel, deren Eigenschaften, beispielsweise ihre Kohäsi- onseigenschaften, durch einen äußeren Stimulus verändert werden können und die daher von außen schaltbar sind. Beispielsweise
können die Kohäsionseigenschaften des Verbindungsmittel durch Änderung des pH-Wertes, der lonenkonzentration und/oder der Temperatur soweit vermindert werden, dass die unter Verwendung des Verbindungsmittels an der Trägeroberfläche des Funktionsele- mentes gebundenen Mikrostrukturen abgelöst und gegebenenfalls auf die Trägeroberfläche eines anderen Funktionselementes übertragen werden können.Another preferred embodiment of the invention relates to bonding agents whose properties, for example their cohesive properties, can be changed by an external stimulus and which can therefore be switched from the outside. For example For example, the cohesion properties of the connecting agent can be reduced to such an extent by changing the pH, the ion concentration and / or the temperature that the microstructures bound to the carrier surface of the functional element can be detached and, if appropriate, transferred to the carrier surface of another functional element ,
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Träger, insbesondere die Trägeroberfläche, vor dem Aufbringen der Verbindungsschichten und Mikrostrukturen mit einem Oberflächen-aktivierenden Mittel vorbehandelt wird, um die Bindung der aufzutragenden Verbindungsschichten und Mikrostrukturen am Träger beziehungsweise an dessen Oberfläche zu verbessern. Die Oberflächen des Trägers können beispielsweise mittels chemischer Verfahren, beispielsweise unter Verwendung von Primern oder einer Säure beziehungsweise einer Base, aktiviert werden. Die Oberflächenaktivierung kann auch unter Verwendung eines Plasmas erfolgen. Die Oberflächenaktivierung kann auch das Aufbringen eines Self-Assembled-Monolayers umfassen.In a further preferred embodiment of the invention, it is provided that the support, in particular the support surface, is pretreated with a surface-activating agent prior to the application of the bonding layers and microstructures in order to improve the bonding of the bonding layers and microstructures to the support or to its surface , The surfaces of the support can be activated, for example, by means of chemical processes, for example using primers or an acid or a base. The surface activation can also be done using a plasma. The surface activation may also include the application of a self-assembled monolayer.
Unter einer „Mikrostruktur" werden Strukturen im Bereich einzelner Mikrometer oder Nanometer verstanden. Insbesondere im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Mikrostruktur" eine Struktur verstanden, die aus mindestens zwei Einzelkomponenten in Form von mehreren dreidimensional angeordneten Schichten von Nanopartikeln mit molekülspezifischen Erkennungsstellen besteht und auf der Oberfläche eines Trägers angeordnet ist, wobei ein bestimmter Flächenabschnitt der Oberfläche des Trägers abgedeckt wird, der eine definierte Form und einen definierten Flächeninhalt
aufweist und der kleiner als die Träger-Oberfläche ist. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass mindestens einer der Flächen-Längen-Parameter, der den durch die Mikrostruktur abgedeckten Flächenabschnitt bestimmt, im Mikrometerbereich liegt. Weist die Mikrostruktur beispielsweise die Form eines Kreises auf, liegt der Durchmesser des Kreises im Mikrometerbereich. Ist die Mikrostruktur als Rechteck ausgeführt, liegt beispielsweise die Breite dieses Rechteckes im Mikrometerbereich. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass der mindestens eine Flächen-Längen- Parameter, der den von der Mikrostruktur abgedeckten Flächenabschnitt bestimmt, kleiner als 999 μm ist. Da die Mikrostruktur erfindungsgemäß aus mindestens zwei Nanopartikeln besteht, liegt die untere Grenze dieses Flächen-Längenparameters bei 10 nm.Structures in the range of individual micrometers or nanometers are understood as meaning a "microstructure." In particular in the context of the present invention, "microstructure" is understood to mean a structure consisting of at least two individual components in the form of several three-dimensionally arranged layers of nanoparticles with molecule-specific recognition sites is arranged on the surface of a carrier, wherein a certain surface portion of the surface of the carrier is covered, which has a defined shape and a defined surface area and which is smaller than the carrier surface. According to the invention, provision is made in particular for at least one of the surface-length parameters, which determines the area section covered by the microstructure, to lie in the micrometer range. For example, if the microstructure is in the shape of a circle, the diameter of the circle is in the micrometer range. If the microstructure is designed as a rectangle, for example, the width of this rectangle is in the micrometer range. According to the invention, provision is made in particular for the at least one surface-length parameter, which determines the surface section covered by the microstructure, to be smaller than 999 μm. Since the microstructure according to the invention consists of at least two nanoparticles, the lower limit of this surface-length parameter is 10 nm.
In einer bevorzugten Ausführung weisen die dreidimensional ange- ordneten Schichten von Nanopartikeln, die die Mikrostruktur bilden in ihrer Gesamtheit, eine Gesamtdicke von 10 Nanometer bis 10 Mikrometer auf. Erfindungsgemäß wird eine Dicke von 50 Nanometer bis 2,5 Mikrometer, insbesondere aber eine Dicke von 100 Nanometer bis 1 ,5 Mikrometer, bevorzugt.In a preferred embodiment, the three-dimensionally arranged layers of nanoparticles, which form the microstructure in their entirety, have a total thickness of 10 nanometers to 10 micrometers. According to the invention, a thickness of 50 nanometers to 2.5 micrometers, but in particular a thickness of 100 nanometers to 1, 5 micrometers, is preferred.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „dreidimensionaler" Träger im Gegensatz zu einem zweidimensionalen Träger, der auf einer planaren Fläche eine, gegebenenfalls mikrostrukturierte, Monolage Fänger- bzw. Analyt-Moleküle bindet, ein Träger, der für die Anbindung von funktionellen Gruppen oder Biomolekülen die Oberfläche eines, gegebenenfalls mikrostrukturierten, Nanoparti- kel-Haufwerks vorsieht, wobei ein Haufwerk zwei, drei oder viele Schichten von Nanopartikeln, die übereinander angeordnet sind, meint. Insbesondere vergrößert die explizite Ausdehnung in die drit-
te Dimension durch das genannte Aufbringen von, gegebenenfalls mikrostrukturierten, Nanopartikel-Mehrfach- oder Multischichten die reaktive Oberfläche pro belegter Grundfläche.In the context of the present invention, in contrast to a two-dimensional support which, on a planar surface, binds an optionally microstructured monolayer to capture molecules or analyte molecules, "three-dimensional" support means a support which is suitable for the attachment of functional groups or biomolecules the surface of a, possibly microstructured, nanoparticle aggregate, where one aggregate means two, three or many layers of nanoparticles which are arranged one above the other, in particular the explicit expansion into the third te dimension by the aforementioned application of, optionally microstructured, nanoparticle multiple or multilayer reactive surface per occupied footprint.
Der von der erfindungsgemäßen Mikrostruktur abgedeckte Flächen- abschnitt kann eine beliebige geometrische Form aufweisen, beispielsweise die eines Kreises, einer Ellipse, eines Quadrates, eines Rechteckes oder einer Linie. Die Mikrostruktur kann aber auch aus mehreren regelmäßigen und/oder unregelmäßigen geometrischen Formen zusammengesetzt sein. Handelt es sich bei dem erfin- dungsgemäßen Funktionselement beispielsweise um einen Gen- Chip oder ein Protein-Array, so weist die Mikrostruktur vorzugsweise eine kreis- oder ellipsenähnliche Form auf. Handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Funktionselement um einen Elektronikbaustein zur Verwendung in einem Biocomputer, kann die Mikrostruktur auch eine Schaltkreis-ähnliche Form aufweisen. Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass auf der Trägeroberfläche eines Funktionselementes mehrere Mikrostrukturen gleicher oder unterschiedlicher Form mit einem Abstand zueinander angeordnet sind.The area section covered by the microstructure according to the invention can have any desired geometric shape, for example that of a circle, an ellipse, a square, a rectangle or a line. However, the microstructure can also be composed of a plurality of regular and / or irregular geometric shapes. If the functional element according to the invention is, for example, a gene chip or a protein array, the microstructure preferably has a circular or elliptical-like shape. If the functional element according to the invention is an electronic component for use in a biocomputer, the microstructure may also have a circuit-like shape. According to the invention it is also provided that a plurality of microstructures of the same or different shape are arranged at a distance from one another on the carrier surface of a functional element.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Mikrostrukturen bei- spielsweise unter Verwendung eines Nadel-Ring-Printers per Ring/Pin mittels lithografischer Verfahren, wie Photolithographie oder Mikropen-Lithographie, Tintenstrahltechniken oder Mikrokontakt- druckverfahren auf die Oberfläche des Funktionselement-Trägers aufgetragen werden. Die Auswahl des Verfahrens, mit dessen Hilfe die Mikrostruktur beziehungsweise Mikrostrukturen auf die Oberfläche des Funktionselementes aufgebracht werden, richtet sich nach der Oberfläche des Trägermaterials, den Nanopartikeln, die die Mik-
rostruktur bilden sollen, und der späteren Anwendung des Funktionselementes.According to the invention, it is provided that the microstructures are applied to the surface of the functional element carrier by means of a ring / pin by means of lithographic processes, such as photolithography or micro-pen lithography, ink-jet techniques or micro-contact printing processes, for example. The selection of the method by means of which the microstructure or microstructures are applied to the surface of the functional element depends on the surface of the carrier material, the nanoparticles containing the microparticles. Rostruktur should form, and the subsequent application of the functional element.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Nanopartikel" eine partikuläre Bindematrix verstanden, die erste funktionelle chemische Gruppen umfassende molekülspezifische Erkennungsstellen aufweist. Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel umfassen einen Kern mit einer Oberfläche, auf der die ersten funktionellen Gruppen angeordnet sind, die in der Lage sind, komplementäre zweite funktionelle Gruppen eines Biomoleküls kova- lent oder nicht-kovalent zu binden. Durch Wechselwirkung zwischen den ersten und zweiten funktionellen Gruppen ist das Biomolekül an dem Nanopartikel und damit an der Mikrostruktur des Funktionselementes immobilisiert und/oder kann daran immobilisiert werden. Die erfindungsgemäß zur Bildung der Mikrostrukturen verwendeten Na- nopartikel weisen eine Größe von kleiner 500 nm, vorzugsweise kleiner 150 nm auf.In the context of the present invention, a "nanoparticle" is understood as meaning a particulate binding matrix which has first molecule-specific recognition sites comprising functional chemical groups The nanoparticles used according to the invention comprise a core with a surface on which the first functional groups are arranged, which are located in the By virtue of the interaction between the first and second functional groups, the biomolecule is immobilized on the nanoparticle and thus on the microstructure of the functional element and / or can be immobilized thereon. The nanoparticles used according to the invention for forming the microstructures have a size of less than 500 nm, preferably less than 150 nm.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „adressierbar", dass die Mikrostruktur nach dem Auftragen der Nanopartikel auf die Trägeroberfläche wieder auffindbar und/oder nachweisbar ist. Wird die Mikrostruktur beispielsweise unter Verwendung einer Maske oder eines Stempels auf die Trägeroberfläche aufgetragen, resultiert die Adresse der Mikrostruktur einerseits aus den Koordinaten x und y des von der Maske oder dem Stempel vorgegebenen Bereiches der Trägeroberfläche, auf den die Mikrostruktur aufgetra- gen wird. Andererseits resultiert die Adresse der Mikrostruktur aus den molekülspezifischen Erkennungsstellen auf der Oberfläche der Nanopartikel, die ein Wiederauffinden beziehungsweise einen Nachweis der Mikrostruktur erlauben. Wenn die Mikrostruktur bio-
funktionalisierbar ist, das heißt Nanopartikel mit molekülspezifischen Erkennungsstellen umfasst, an die keine Biomoleküle gebunden sind, kann die Mikrostruktur dadurch wieder aufgefunden und/oder nachgewiesen werden, dass ein oder mehrere Biomoleküle spezi- fisch an die molekülspezifischen Erkennungsstellen der die Mikrostruktur bildenden Nanopartikel binden, nicht jedoch an die Flächenabschnitte der Trägeroberfläche, die nicht von der Mikrostruktur abgedeckt sind. Wenn das immobilisierte Molekül beispielsweise mit Detektionsmarkern wie Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln, radioaktiven Markern etc., markiert ist, kann der Nachweis der Mikrostruktur unter Verwendung entsprechend geeigneter Nachweisverfahren erfolgen. Wenn die Mikrostruktur biofunktionalisiert ist, das heißt Nanopartikel umfasst, an deren molekülspezifische Erkennungsstellen bereits ein oder mehrere Biomoleküle gebunden sind, bedeutet „addressierbar", dass diese Biomoleküle durch Wechselwirkung mit komplementären Strukturen weiterer Moleküle oder mittels messtechnischer Verfahren aufgefunden und/oder nachgewiesen werden können, wobei nur die aus Nanopartikeln bestehende Mikrostruktur entsprechende Signale zeigt, nicht jedoch die Flächen- abschnitte der Trägeroberfläche, die nicht von der Mikrostruktur abgedeckt sind. Als Nachweisverfahren kann beispielsweise die Matrixunterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektro- metrie (MALDI-TOF-MS) eingesetzt werden, die sich zu einem wichtigen Verfahren zur Analyse von unterschiedlichsten Substanzen, insbesondere Proteinen, entwickelt hat. Weitere Nachweisverfahren sind Wellenleiterspektroskopie, Fluoreszenz, Impedanzspektroskopie, radiometrische und elektrische Verfahren.In the context of the present invention, "addressable" means that the microstructure is retrievable and / or detectable after application of the nanoparticles to the carrier surface If the microstructure is applied to the carrier surface using, for example, a mask or a stamp, the address of the On the one hand, microstructure results from the coordinates x and y of the region of the carrier surface on which the microstructure is applied, on the other hand, the address of the microstructure results from the molecule-specific recognition sites on the surface of the nanoparticles, which retrieves or retrieves If the microstructure is biologically is functionalizable, ie nanoparticles with molecule-specific recognition sites to which no biomolecules are bound, the microstructure can be rediscovered and / or demonstrated that one or more biomolecules bind specifically to the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles forming the microstructure however, to the surface portions of the support surface that are not covered by the microstructure. For example, when the immobilized molecule is labeled with detection markers such as fluorophores, spin labels, gold particles, radioactive labels, etc., detection of the microstructure can be accomplished using appropriate detection methods. If the microstructure is biofunctionalized, that is to say comprises nanoparticles to whose molecule-specific recognition sites one or more biomolecules are already bound, "addressable" means that these biomolecules can be found and / or detected by interaction with complementary structures of further molecules or by metrological methods, only the microstructure consisting of nanoparticles shows corresponding signals, but not the surface sections of the carrier surface, which are not covered by the microstructure.For example, the matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF) can be used as detection method. MS), which has become an important method for the analysis of a wide variety of substances, in particular proteins, waveguide spectroscopy, fluorescence, impedance spectroscopy, radiometric and electrical Process.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das biologische Molekül unter Erhalt seiner biologischen Aktivität an der Oberfläche der die Mik-
rostruktur bildenden Nanopartikel gebunden oder immobilisiert ist oder gebunden oder immobilisiert werden kann, wobei das Molekül vorzugsweise gerichtet gebunden ist oder wird. Unter der biologischen Aktivität eines Moleküls werden alle Funktionen verstanden, die dieses in einem Organismus in seiner natürlichen zellulären Umgebung ausübt. Wenn das Molekül ein Protein ist, kann es sich um spezifische katalytische oder enzymatische Funktionen, Funktionen in der Immunabwehr, Transport- und Speicherfunktion, Regulationsfunktion, Transkriptions- und Translationsfunktionen und ähnliche handeln. Handelt es sich bei dem Molekül um eine Nucleinsäure, kann die biologische Funktion beispielsweise in der Codierung eines Genproduktes bestehen oder darin, dass die Nucleinsäure als Matrize zur Synthese weiterer Nucleinsäuremoleküle oder als Bindungsmotiv für regulatorische Proteine verwendbar ist. „Beibehaltung der biologischen Aktivität" bedeutet, dass ein biologisches Molekül nach Immobilisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktionen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben kann wie das gleiche Molekül in nicht- immobilisiertem Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen be- ziehungsweise das gleiche Molekül in seiner natürlichen zellulären Umgebung.According to the invention, it is provided that the biological molecule, while maintaining its biological activity on the surface of the rostruktur forming nanoparticles is bound or immobilized or can be bound or immobilized, wherein the molecule is preferably directionally bound or becomes. The biological activity of a molecule is understood to mean all functions that it performs in an organism in its natural cellular environment. When the molecule is a protein, it may be specific catalytic or enzymatic functions, immune defense functions, transport and storage function, regulatory function, transcriptional and translational functions, and the like. When the molecule is a nucleic acid, the biological function may be, for example, the coding of a gene product or that the nucleic acid is useful as a template for the synthesis of other nucleic acid molecules or as a binding motif for regulatory proteins. "Retention of biological activity" means that a biological molecule, after immobilization on the surface of a nanoparticle, can exert the same or nearly the same biological functions to at least similar extent as the same molecule in a non-immobilized state under suitable in vitro conditions the same molecule in its natural cellular environment.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „gerichtet immobilisiert" oder „gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül an definierten Positionen innerhalb des Moleküls so an den molekülspezifischen Erkennungssequenzen eines Nanopartikel gebunden wird beziehungsweise ist, dass beispielsweise die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Domäne(n) gegenüber dem nicht-immobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese Domäne(n), beispielsweise Bindungsta-
sehen für zelluläre Reaktionspartner, bei Kontakt mit anderen nati- ven zellulären Reaktionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind.In the context of the present invention, the term "directionally immobilized" or "directed immobilization" means that a molecule is bound at defined positions within the molecule to the molecule-specific recognition sequences of a nanoparticle such that the three-dimensional structure is for biological activity required domain (s) is not changed from the non-immobilized state and that this domain (s), for example for cellular reactants, is / are freely accessible to them upon contact with other native cellular reactants.
„Gerichtet immobilisiert" bedeutet auch, dass bei der Immobilisierung einer Molekülspezies alle oder nahezu alle individuellen Moleküle, mindestens jedoch mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 85% aller Moleküle auf der Oberfläche der die Mikrostruktur bildenden Nano- partikel eine identische oder nahezu identische Ausrichtung reproduzierbar einnehmen."Directed immobilized" also means that when immobilizing a molecular species, all or nearly all of the individual molecules, but at least more than 80%, preferably more than 85% of all molecules on the surface of the nanoparticles forming the microstructure have an identical or nearly identical orientation reproducibly take.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das an der Mikrostruktur des erfindungsgemäßen Funktionselementes immobilisierte oder immobilisierbare biologische Molekül insbesondere eine Nucleinsäure, ein Protein, ein Proteinkomplex, ein PNA-Molekül, ein Fragment davon oder ein Gemisch davon ist.According to the invention, it is provided that the biological molecule immobilized or immobilizable on the microstructure of the functional element according to the invention is in particular a nucleic acid, a protein, a protein complex, a PNA molecule, a fragment thereof or a mixture thereof.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Nucleinsäure ein Molekül verstanden, das aus mindestens zwei über eine Phosphodiesterbindung verbundenen Nucleotiden besteht. Bei Nucleinsäuren kann es sich sowohl um eine Desoxyribonucleinsäure als auch eine Ribonucleinsäure handeln. Die Nucleinsäure kann sowohl einsträngig als auch zweisträngig vorliegen. Im Kontext der vor- liegenden Erfindung kann eine Nucleinsäure also auch ein Oligonuc- leotid sein. Die an der Mikrostruktur des erfindungsgemäßen Funktionselementes gebundene Nucleinsäure weist vorzugsweise eine Länge von mindestens 10 Basen auf. Eine Nucleinsäure kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Die Nucleinsäure kann durch gentechnische Verfahren gegenüber der Wildtyp-Nucleinsäure modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Nuc-
leinsäurebausteine enthalten. Die Nucleinsäure kann mit Molekülen anderer Art, beispielsweise mit Proteinen, verbunden sein.In the context of the present invention, a nucleic acid is understood as meaning a molecule which consists of at least two nucleotides connected via a phosphodiester bond. Nucleic acids may be both deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid. The nucleic acid can be both single-stranded and double-stranded. In the context of the present invention, therefore, a nucleic acid can also be an oligonucleotide. The nucleic acid bound to the microstructure of the functional element according to the invention preferably has a length of at least 10 bases. A nucleic acid may be of natural or synthetic origin. The nucleic acid may be modified by genetic engineering methods against the wild-type nucleic acid and / or unnatural and / or unusual nucleic acid. Contain linoleic acid components. The nucleic acid may be linked to other types of molecules, such as proteins.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Protein" ein Molekül verstanden, das mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfasst. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann ein Protein also auch ein Peptid, zum Beispiel ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder zum Beispiel eine Protein-Domäne sein. Ein derartiges Protein kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Das Protein kann durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Das Protein kann gegenüber der Wildtyp-Form derivati- siert sein, beispielsweise Glykosylierungen aufweisen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusioniert sein oder mit Molekülen anderer Art, beispielsweise mit Kohlenhydraten, verbunden sein. Erfindungsgemäß kann ein Protein insbesondere ein Enzym, ein Rezeptor, ein Cytokin, ein Strukturprotein, ein Antigen oder ein Antikörper sein.In the context of the present invention, a "protein" is understood to mean a molecule which comprises at least two amino acids which are linked to one another via an amide bond, In the context of the present invention, a protein may therefore also be a peptide, for example an oligopeptide, a polypeptide or, for example Such a protein may be of natural or synthetic origin The protein may be modified by genetic engineering methods from the wild-type protein and / or may contain unnatural and / or unusual amino acids The protein may be derivatized from the wild-type form. It may be shortened, it may be fused with other proteins or be associated with molecules of another kind, for example with carbohydrates According to the invention, a protein may in particular be an enzyme, a receptor, a cytokine, a structural protein Antigen or an antibody be.
„Antikörper" bedeutet ein Polypeptid, das im wesentlichen von einem oder mehreren Immunglobulin-Genen codiert wird, oder Fragmente davon, das/die einen Analyten (Antigen) spezifisch bindet/binden und erkennt/erkennen. Antikörper kommen beispielsweise als intakte Immunglobuline oder als eine Reihe von Fragmenten vor, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. „Antikörper" bedeutet auch modifizierte Antikörper (z.B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper). „Antikörper" umfasst auch Antikörper- Fragmente, die entweder mittels Modifikation ganzer Antikörper oder mittels de novo-Synthese unter Verwendung von DNA-
Rekombinationstechniken erzeugt worden sind. Der Begriff „Antikörper" umfaßt sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie Fab, F(ab')2 und Fv1 die die Epitop-Determinante binden können."Antibody" means a polypeptide that is substantially encoded by one or more immunoglobulin genes, or fragments thereof that specifically bind / bind and detect an analyte (antigen) Antibodies are, for example, as intact immunoglobulins or as one Series of fragments generated by cleavage with various peptidases. "Antibody" also means modified antibodies (eg, oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies). "Antibody" also includes antibody fragments which are either modified by whole antibody modification or by de novo synthesis using DNA Recombination techniques have been generated. The term "antibody" includes both intact molecules and fragments thereof, such as Fab, F (ab ') 2 and Fv 1 which can bind the epitope determinant.
Erfindungsgemäß bedeutet „Proteinkomplex" eine zusammengehö- rende Einheit aus mindestens zwei Proteinen. Neben den Proteinen kann ein „Proteinkomplex" darüber hinaus auch Nucleinsäuren, Metallionen und andere Stoffe beinhalten.According to the invention, "protein complex" means an aggregating unit of at least two proteins In addition to the proteins, a "protein complex" may also include nucleic acids, metal ions and other substances.
Bei PNA (Peptide Nucleic Acid oder Polyamide Nucleic Acid)- Molekülen handelt es sich um Moleküle, die nicht negativ geladen sind und in gleicher Weise wie DNA wirken (Nielsen et al., 1991 , Science, 254, 1497-1500; Nielsen et al., 1997, Biochemistry, 36, 5072-5077; Weiler et al., 1997, Nuc. Acids Res., 25, 2792-2799). PNA-Sequenzen umfassen ein Polyamid-Grundgerüst aus N-(2- Aminoethyl)-glycin-Einheiten und besitzen keine Glucose-Einheiten und keine Phosphat-Gruppen.PNA (Peptide Nucleic Acid or Polyamide Nucleic Acid) molecules are molecules that are not negatively charged and act in the same way as DNA (Nielsen et al., 1991, Science, 254, 1497-1500; Nielsen et al ., 1997, Biochemistry, 36, 5072-5077; Weiler et al., 1997, Nuc. Acids Res., 25, 2792-2799). PNA sequences comprise a polyamide backbone of N- (2-aminoethyl) glycine units and have no glucose units and no phosphate groups.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „molekülspezifischen Erkennungsstellen" Bereiche des Nanoparti- kels verstanden, die eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Nanopartikel und biologischen Molekülen als Zielmolekülen ermögli- chen. Die Wechselwirkung kann auf gerichteter attraktiver Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren Paaren aus ersten funktionellen Gruppen des Nanopartikels und die ersten funktionellen Gruppen bindenden, komplementären zweiten funktionellen Gruppen der Zielmoleküle, also der biologischen Moleküle, beruhen. Ein- zelne interagierende Paare funktioneller Gruppen zwischen Nanopartikel und biologischem Molekül sind jeweils räumlich fixiert an dem Nanopartikel und dem biologischen Molekül angeordnet. Diese
Fixierung braucht keine starre Anordnung zu sein, sondern kann vielmehr durchaus flexibel ausgeführt sein. Die attraktive Wechselwirkung zwischen den funktionellen Gruppen der Nanopartikel und der biologischen Moleküle kann in Form von nicht-kovalenten Bin- düngen wie van-der-Waals-Bindungen, Wasserstoffbrücken- Bindungen, π-π-Bindungen, elektrostatischen Wechselwirkungen oder hydrophoben Wechselwirkungen ausgeführt sein. Denkbar sind auch reversible kovalente Bindungen ebenso wie Mechanismen, die auf Komplementarität der Gestalt oder Form beruhen. Die erfin- dungsgemäß vorgesehenen Wechselwirkungen zwischen den molekülspezifischen Erkennungsstellen der Nanopartikel und dem Zielmolekül beruhen also auf gerichteten Wechselwirkungen zwischen den Paaren der funktionellen Gruppen und auf der räumlichen Anordnung dieser die Paarbildung eingehenden Gruppen zueinander an dem Nanopartikel sowie dem Zielmolekül. Diese Wechselwirkung führt zu einer affinen Bindung kovalenter oder nicht-kovalenter Art zwischen den beiden Bindungspartnern, dergestalt, dass das biologische Molekül an der Oberfläche der die Mikrostruktur bildenden Nanopartikel immobilisiert wird.In the context of the present invention, "molecule-specific recognition sites" are understood as meaning regions of the nanoparticle which allow a specific interaction between the nanoparticle and biological molecules as target molecules.The interaction can be based on targeted attractive interaction between one or more pairs of first functional molecules Groups of the nanoparticle and the first functional groups binding, complementary second functional groups of the target molecules, so the biological molecules are based.Single interacting pairs of functional groups between nanoparticles and biological molecule are each spatially fixed to the nanoparticle and the biological molecule arranged Fixation need not be a rigid arrangement, but rather can be carried out quite flexible. The attractive interaction between the functional groups of the nanoparticles and the biological molecules can be carried out in the form of non-covalent bonds such as van der Waals bonds, hydrogen bonds, π-π bonds, electrostatic interactions or hydrophobic interactions. Also conceivable are reversible covalent bonds as well as mechanisms based on complementarity of shape or form. The inventively provided interactions between the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles and the target molecule thus based on directed interactions between the pairs of functional groups and on the spatial arrangement of these pairs forming groups to each other on the nanoparticle and the target molecule. This interaction results in a covalent or non-covalent affinity bond between the two binding partners, such that the biological molecule is immobilized on the surface of the nanoparticles forming the microstructure.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die ersten funktionellen Gruppen, die Bestandteil der molekülspezifischen Erkennungsstellen auf der Oberfläche des Nanoparti- kels sind oder diese bilden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aktivester, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Oligohistidingruppe, Strep-Tag I1 Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass die molekülspezifische Erkennungsstelle ein größeres Molekül wie ein Protein, ein Antikörper etc. ist, das die ersten funktionellen Gruppen enthält. Die molekülspezifische Erkennungsstelle kann auch ein Molekülkomplex sein, der aus mehreren Proteinen und/oder Antikörpern und/oder Nuclein- säuren besteht, wobei mindestens eines dieser Moleküle die ersten funktionellen Gruppen enthält. Ein Protein kann als molekülspezifische Erkennungssequenz beispielsweise einen Antikörper und ein damit verbundenes Protein umfassen. Der Antikörper kann dabei auch eine Streptavidin-Gruppe oder eine Biotin-Gruppe umfassen. Bei dem mit dem Antikörper verbundenen Protein kann es sich um einen Rezeptor handeln, beispielsweise ein MHC-Protein, Cytokin, einen T-Zell-Rezeptoren wie das CD-8-Protein und andere, der einen Liganden binden kann. Ein Molekülkomplex kann auch mehrere Proteine und/oder Peptide umfassen, beispielsweise ein biotinylier- tes Protein, das in einem Komplex ein weiteres Protein und zusätzlich ein Peptid bindet.In a preferred embodiment of the present invention, the first functional groups which are part of or form the molecule-specific recognition sites on the surface of the nanoparticle are selected from the group consisting of active ester, alkyl ketone group, aldehyde group, amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, Hydrazine group, hydrazide group, thiol group, thioester group, oligohistidine group, strep-tag I 1 strep-tag II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin. According to the invention, it is also provided that the molecule-specific recognition site is a larger molecule such as a protein, an antibody, etc., which contains the first functional groups. The molecule-specific recognition site may also be a molecular complex consisting of several proteins and / or antibodies and / or nucleic acids, at least one of these molecules containing the first functional groups. For example, a protein may comprise, as a molecule-specific recognition sequence, an antibody and an associated protein. The antibody may also comprise a streptavidin group or a biotin group. The antibody linked to the antibody may be a receptor, for example, an MHC protein, cytokine, a T cell receptor such as the CD-8 protein, and others capable of binding a ligand. A molecular complex can also comprise a plurality of proteins and / or peptides, for example a biotinylated protein which binds a further protein in a complex and additionally a peptide.
Die zweite funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe des zu immobilisierenden Biomoleküls, ist erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aus der Gruppe bestehend aus Aktivester, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Aminogruppe, Carboxygrup- pe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Hydrazingruppe, Hydra- zidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Oligohistidingruppe, Strep- Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chi- tinbindedomäne, Metallchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avi- din und Neutravidin.The second functional group, ie the functional group of the biomolecule to be immobilized, is selected according to the invention from the group consisting of the group consisting of active ester, alkyl ketone group, aldehyde group, amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, hydrazine group, hydrazide group, thiol group , Thioester group, oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin.
Die ersten und zweiten funktionellen Gruppen können beispielsweise durch molekulares Prägen erzeugt worden sein. Die ersten und zwei-
ten funktionellen Gruppen können auch Aktivester, wie die sogenannten Surfmere sein.The first and second functional groups may have been generated by, for example, molecular imprinting. The first and second functional groups may also be active esters, such as the so-called surfmers.
Ein erfindungsgemäß verwendetes Nanopartikel weist also an seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe auf, die kovalent oder nicht-kovalent mit einer zweiten funktionellen Gruppe eines zu immobilisierenden Biomoleküls verknüpft wird, wobei die erste funktionelle Gruppe eine andere Gruppe als die zweite funktionelle Gruppe ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine ko- valente oder nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.A nanoparticle used according to the invention therefore has on its surface a first functional group which is covalently or non-covalently linked to a second functional group of a biomolecule to be immobilized, the first functional group being a group other than the second functional group. The two binding groups must be complementary to one another, ie be able to form a covalent or non-covalent bond with one another.
Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe beispielsweise eine Alkylketongruppe, insbesondere Methyl keton- oder Aldehydgruppe verwendet, ist die zweite funktionelle Gruppe eine Hydra- zin- oder Hydrazidgruppe. Wird umgekehrt eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe als erste funktionelle Gruppe verwendet, ist erfindungsgemäß die zweite funktionelle Gruppe eine Alkylketon, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe. Wird erfindungsgemäß eine Thiolgruppe als erste funktionelle Gruppe verwendet, ist die zweite komplementäre funktionelle Gruppe eine Thioestergruppe. Wird als erste funktionelle Gruppe eine Thioestergruppe verwendet, ist erfindungsgemäß die zweite funktionelle Gruppe eine Thiolgruppe.If, for example, an alkyl ketone group, in particular methyl ketone or aldehyde group, is used according to the invention as the first functional group, the second functional group is a hydrazine or hydrazide group. Conversely, if a hydrazine or hydrazide group is used as the first functional group, according to the invention the second functional group is an alkyl ketone, in particular methyl ketone or aldehyde group. According to the invention, when a thiol group is used as the first functional group, the second complementary functional group is a thioester group. If the first functional group used is a thioester group, according to the invention the second functional group is a thiol group.
Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe ein Metallio- nenchelatkomplex verwendet, ist die zweite funktionelle komplemen- täre Gruppe eine Oligohistidingruppe. Wird als erste funktionelle Gruppe eine Oligohistidingruppe verwendet, ist die zweite funktionelle komplementäre Gruppe ein Metalionenchelatkomplex.
Wird als erste funktionelle Gruppe Strep-Tag I1 Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin verwendet, wird als zweite komplementäre funktionelle Gruppe Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt. Wird als erste funktionelle Gruppe Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt, wird als zweite komplementäre funktionelle Gruppe Strep-Tag I1 Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin eingesetzt.If, according to the invention, a metal ion chelate complex is used as the first functional group, the second functional complementary group is an oligohistidine group. When an oligohistidine group is used as the first functional group, the second functional complementary group is a metal ion chelate complex. If Strep-Tag I 1 Strep-Tag II, Biotin or Desthiobiotin is used as the first functional group, Streptavidin, Streptactin, Avidin or Neutravidin is used as the second complementary functional group. If streptavidin, streptactin, avidin or neutravidin is used as the first functional group, strep-tag I 1 Strep-Tag II, biotin or desthiobiotin is used as the second complementary functional group.
Wird in einer weiteren Ausführungsform Chitin oder ein Chitinderivat als erste funktionelle Gruppe eingesetzt, wird als zweite funktionelle komplementäre Gruppe eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt. Wird als erste funktionelle Gruppe eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt, wird als zweite funktionelle komplementäre Gruppe Chitin oder ein Chitinderivat eingesetzt.In a further embodiment, when chitin or a chitin derivative is used as the first functional group, a chitin binding domain is used as the second functional complementary group. When a chitin binding domain is used as the first functional group, chitin or a chitin derivative is used as the second functional complementary group.
Die vorgenannten ersten und/oder zweiten funktionellen Gruppen können erfindungsgemäß mit Hilfe eines Spacers mit dem zu immobilisierenden Biomolekül beziehungsweise dem Nanopartikel-Kern verbunden beziehungsweise mittels eines Spacers an den Nanopartikel-Kern oder in das Biomolekül eingeführt werden. Der Spacer dient also einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppe zum Kern beziehungsweise Biomolekül, andererseits als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein derartiger Spacer kann erfindungsgemäß Alkylen-Gruppen oder Ethylenoxid-Oligomere mit 2 bis 50 C- Atomen darstellen, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist.The abovementioned first and / or second functional groups may be connected to the biomolecule or nanoparticle core to be immobilized by means of a spacer or may be introduced by means of a spacer to the nanoparticle core or into the biomolecule. The spacer serves on the one hand as a spacer of the functional group to the core or biomolecule, on the other hand as a support for the functional group. According to the invention, such a spacer can be alkylene groups or ethylene oxide oligomers having from 2 to 50 carbon atoms, which in a preferred embodiment is substituted and has heteroatoms.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die zweiten funktionellen Gruppen ein natürlicher Bestandteil des Biomoleküls, insbesondere eines Proteins, sind.
Bei einem Protein mittlerer Größe, also einer Größe von etwa 50 kDA mit etwa 500 Aminosäuren, gibt es etwa 20 bis 30 reaktive Ami- no-Gruppen, die prinzipiell als funktionelle Gruppe zur Immobilisierung in Frage kommen. Insbesondere handelt es sich dabei um die Amino-Gruppe am N-terminalen Ende eines Proteins. Auch alle anderen freien Amino-Gruppen, insbesondere die der Lysinreste, kommen für die Immobilisierung in Frage. Auch Arginin mit seiner Guanidium-Gruppe kommt als funktionelle Gruppe in Betracht.In a preferred embodiment of the invention, it is provided that the second functional groups are a natural constituent of the biomolecule, in particular of a protein. In the case of a protein of medium size, ie a size of about 50 kDa with about 500 amino acids, there are about 20 to 30 reactive amino groups, which in principle come into question as a functional group for immobilization. In particular, it is the amino group at the N-terminal end of a protein. All other free amino groups, in particular those of the lysine residues, are also suitable for the immobilization. Arginine with its guanidium group is also considered as a functional group.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die zweiten funktionellen Gruppen mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in das Biomolekül einzuführen. Die Derivatisierung sollte so erfolgen, dass die biologische Aktivität nach der Immobilisierung erhalten bleibt.In a further preferred embodiment of the invention, it is provided to introduce the second functional groups into the biomolecule by means of genetic engineering, biochemical, enzymatic and / or chemical derivatization or chemical synthesis methods. The derivatization should be such that the biological activity is retained after immobilization.
Ist das Biomolekül ein Protein, können beispielsweise unnatürliche Aminosäuren durch gentechnische Verfahren oder während einer chemischen Proteinsynthese in das Proteinmolekül eingefügt werden, beispielsweise zusammen mit Spacern oder Linkern. Derartige unnatürliche Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäure- funktion und einen Rest R aufweisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, wobei diese Aminosäuren in besonders bevorzugter Weise eine Thiol-Gruppe aufweisen. Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure, beispielsweise Lysin, zu mo- difizieren, zum Beispiel durch Derivatisierung ihrer Seitenkette, insbesondere deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion von Lävulinsäure.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können funktionelle Gruppen durch Modifikation eines Proteins in dieses eingeführt werden, wobei dem Protein Tags, also Markierungen, hinzugefügt werden, vorzugsweise an den C- Terminus oder den N-Terminus. Diese Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. Insbesondere ist vorgesehen, dass ein Protein dadurch modifiziert wird, dass mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise ein Strep-Tag I oder Strep-Tag Il oder Biotin hinzugefügt wird. Erfindungsgemäß werden unter einem Strep-Tag auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern sie Streptavidin-Gruppen und/oder dessen Äquivalente binden können. Der Begriff „Streptavidin" erfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente. Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, ein Protein durch Hinzu- fügen von einem His-Tag, das mindestens drei Histidin-Reste, vorzugsweise jedoch eine Oligohistidin-Gruppe umfasst, zu modifizieren. Der in das Protein eingeführte His-Tag kann dann an eine einen Metallchelatkomplex umfassende molekülspezifische Erkennungsstelle binden.If the biomolecule is a protein, for example unnatural amino acids can be inserted into the protein molecule by genetic engineering or during chemical protein synthesis, for example together with spacers or linkers. Such unnatural amino acids are compounds which have an amino acid function and a radical R and are not defined by a naturally occurring genetic code, these amino acids most preferably having a thiol group. It can also be provided according to the invention to modify a naturally occurring amino acid, for example lysine, for example by derivatization of its side chain, in particular its primary amino group, with the carboxylic acid function of levulinic acid. In a further preferred embodiment of the present invention, functional groups can be introduced into the protein by modification of a protein, wherein tags, ie labels, are added to the protein, preferably to the C-terminus or the N-terminus. However, these tags can also be arranged intramolecularly. In particular, it is envisaged that a protein is modified by adding at least one strep tag, for example a strep tag I or strep tag II or biotin. According to the invention, a Strep tag is also understood as meaning functional and / or structural equivalents, provided that they can bind streptavidin groups and / or their equivalents. The term "streptavidin" therefore also encompasses its functional and / or structural equivalents for the purposes of the present invention. A protein is also provided according to the invention by adding a His tag containing at least three histidine residues, but preferably one oligohistidine. The His tag introduced into the protein can then bind to a metal chelating complex-comprising molecule-specific recognition site.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also vorgesehen, Proteine, die beispielsweise mit unnatürlichen Aminosäuren, natürlichen, aber unnatürlich derivatisierten Aminosäuren oder spezifischen Strep-Tags modifiziert sind, oder Antikörper-gebundene Proteine mit dazu komplementär reaktiven Nanopartikel-Oberflächen derart zur Bindung zu bringen, dass eine geeignete spezifische, insbesondere nicht-kovalente Anbindung der Proteine und damit eine gerichtete Immobilisierung der Proteine an die Oberflächen erfolgt. Nach der Ausrichtung der bioaktiven Moleküle über Tag-Bindestellen können diese Moleküle zusätzlich kovalent gebunden werden, bei-
spielsweise auch mit einem Crosslinker wie Glutardialdehyd. Dadurch werden die Protein-Oberflächen stabiler.In a preferred embodiment of the invention, it is thus provided that proteins which are modified, for example, with unnatural amino acids, natural, but unnaturally derivatized amino acids or specific strep tags, or bind antibody-bound proteins with nanoparticle surfaces which are complementary to them, that a suitable specific, in particular non-covalent binding of the proteins and thus a directed immobilization of the proteins to the surfaces takes place. After alignment of the bioactive molecules via tag-binding sites, these molecules can additionally be covalently bound, in For example, with a crosslinker such as glutaric dialdehyde. This will make the protein surfaces more stable.
Die zur Bildung einer Mikrostruktur auf der Trägeroberfläche des Funktionselementes abgeschiedenen Nanopartikel weisen neben der Oberfläche mit den molekülspezifische Erkennungsstellen einen Kern auf. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Kern" eines Nanopartikels ein chemisch inerter Stoff verstanden, der als Träger für das zu immobilisierende Molekül dient. Erfindungsgemäß ist der Kern ein kompaktes oder hohles Par- tikel mit einer Größe von 5 nm bis 500 nm.The nanoparticles deposited to form a microstructure on the carrier surface of the functional element have, in addition to the surface with the molecule-specific recognition sites, a nucleus. In the context of the present invention, a "core" of a nanoparticle is understood as meaning a chemically inert substance which serves as a carrier for the molecule to be immobilized According to the invention, the core is a compact or hollow particle with a size of 5 nm to 500 nm ,
In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der Kern der erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel aus einem anorganischen Material wie einem Metall, beispielsweise Au, Ag o- der Ni, Silicium, SiO2, SiO, einem Silikat, AI2O3, SiO2^AI2O3, Fe2O3, Ag2O, TiO2, ZrO2, Zr2O3, Ta2O5, Zeolith, Glas, Indiumzinnoxid, Hydro- xylapatit, einem Q-Dot oder einem Gemisch davon oder enthält dieses.In a preferred embodiment of the present invention, the core of the nanoparticles used according to the invention consists of an inorganic material such as a metal, for example Au, Ag or Ni, silicon, SiO 2 , SiO, a silicate, Al 2 O 3 , SiO 2 ^ Al 2 O 3 , Fe 2 O 3 , Ag 2 O, TiO 2 , ZrO 2 , Zr 2 O 3 , Ta 2 O 5 , zeolite, glass, indium tin oxide, hydroxyapatite, a Q-dot or a mixture thereof or contains this.
In einer weiteren bevorzugter Ausführungsform der Erfindung besteht der Kern aus einem organischen Material oder enthält dieses. Vorzugsweise ist das organische Polymer Polypropylen, Polystyrol, Polyacrylat, ein Polyester von Milchsäure oder ein Gemisch davon.In a further preferred embodiment of the invention, the core consists of or contains an organic material. Preferably, the organic polymer is polypropylene, polystyrene, polyacrylate, a polyester of lactic acid, or a mixture thereof.
Die Herstellung der Kerne der erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel kann unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, wie Sol-Gel-Synthese-Verfahren, Emulsionspo- lymerisation, Suspensionspolymerisation usw. erfolgen. Nach Herstellung der Kerne werden die Oberflächen der Kerne durch chemische Modifizierungsreaktionen mit den spezifischen ersten funktio-
nellen Gruppen versehen, beispielsweise unter Verwendung üblicher Verfahren wie Pfropf-Polymerisation, Silanisierung, chemischer Deri- vatisierung etc. Eine Möglichkeit, oberflächenmodifizierte Nanoparti- kel in einem Schritt zu erzeugen, besteht im Einsatz von Surfmeren in der Emulsionspolymerisation. Eine weitere Möglichkeit ist das molekulare Prägen.The cores of the nanoparticles used according to the invention can be prepared using conventional methods known in the art, such as sol-gel synthesis, emulsion polymerization, suspension polymerization, and the like. After preparation of the cores, the surfaces of the cores are transformed by chemical modification reactions with the specific first functional For example, using conventional methods such as graft polymerization, silanization, chemical derivatization, etc. One way to produce surface-modified nanoparticles in one step, the use of Surfmeren in the emulsion polymerization. Another possibility is molecular imprinting.
Unter molekularem Prägen wird die Polymerisation von Monomeren in Gegenwart von Templaten verstanden, die mit dem Monomer einen während der Polymerisation relativ stabilen Komplex bilden kön- nen. Nach dem Auswaschen der Template können die so hergestellten Materialien Templatmoleküle, den Templatmolekülen strukturverwandte Molekülspezies oder Moleküle, die den Templatmolekülen oder Teilen davon strukturverwandte oder identische Gruppen aufweisen, wieder spezifisch binden. Ein Templat ist daher eine in der Monomermischung während der Polymerisation vorhandene Substanz, zu der das gebildete Polymer eine Affinität aufweist.By molecular embossing is meant the polymerization of monomers in the presence of templates, which can form a relatively stable complex with the monomer during the polymerization. After washing out the template, the materials thus prepared can specifically bind template molecules to the template molecules structurally related molecular species or molecules that structurally related or identical groups have the template molecules or parts thereof. A template is therefore a substance present in the monomer mixture during the polymerization to which the polymer formed has an affinity.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt erfolgt die Herstellung oberflächenmodifizierter Nanopartikel mittels Emulsionspolymerisation unter Einsatz von Surfmeren. Surfmere sind amphiphile Monomere (Surfmer = Surfactant + Monomer), die auf der Oberfläche von Latexpartikeln einpolymerisiert werden können und diese stabilisieren. Reaktive Surfmere verfügen zusätzlich über funktionalisierbare Endgruppen, die unter milden Bedingungen mit Nucleophilen, wie primären Aminen (Aminosäuren, Peptiden, Proteinen), Thiolen oder Alko- holen umgesetzt werden können. Auf diese Weise ist eine Vielzahl biologisch aktiver polymerer Nanopartikel zugänglich. Druckschriften, die den Stand der Technik sowie Möglichkeiten und Grenzen der Anwendung von Surfmeren wiedergeben, sind 1)8 5,177,165,
US 5,525,691 , US 5,162,475, US 5,827,927 und JP 4 018 929. Arbeiten zur Synthese von Surfmeren mit reaktiven Endgruppen wurden unter anderem von Nagai et al. (Polymer 1996, 37(1 ), 1257- 1266; Journal of Colloid and Interface Science 1995, 172, 63-70), Asua et al. (J. Applied Polym. Sei. 1997, 66, 1803-1820) und Guyot et al. (Curr. Opin. Colloid Interface Sei. 1996, 1(5), 580-586) veröffentlicht.According to the invention, the production of surface-modified nanoparticles by means of emulsion polymerization using surfermers is particularly preferred. Surfmers are amphiphilic monomers (Surfmer = surfactant + monomer), which can be copolymerized on the surface of latex particles and stabilize them. In addition, reactive surfmers possess functionalizable end groups that can be reacted under mild conditions with nucleophiles such as primary amines (amino acids, peptides, proteins), thiols, or alcohols. In this way, a variety of biologically active polymeric nanoparticles accessible. References which represent the state of the art as well as possibilities and limitations of the use of surfers are 1 ) 8 5,177,165, US 5,525,691, US 5,162,475, US 5,827,927 and JP 4 018 929. Synthesis of reactive end-capped surfermers has been described, inter alia, by Nagai et al. (Polymer 1996, 37 (1), 1257-1266; Journal of Colloid and Interface Science 1995, 172, 63-70), Asua et al. (Applied Polym., 1997, 66, 1803-1820) and Guyot et al. (Curr Opin, Colloid Interface, Sci., 1996, 1 (5), 580-586).
Die Dichte der ersten funktionellen Gruppen und der Abstand dieser Gruppen zueinander können erfindungsgemäß für jedes zu immobi- lisierende Molekül optimiert werden. Auch die Umgebung der ersten funktionellen Gruppen auf der Oberfläche kann im Hinblick auf eine möglichst spezifische Immobilisierung eines Biomoleküls in entsprechender Weise vorbereitet werden.The density of the first functional groups and the distance between these groups can be optimized according to the invention for each molecule to be immobilized. The environment of the first functional groups on the surface can also be prepared in a corresponding manner with regard to the most specific possible immobilization of a biomolecule.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass im Kern zusätzliche Funktionen verankert sind, die unter Verwendung geeigneter Nachweisverfahren eine einfache Detektion der Nanopartikel-Kerne und damit der Mikrostrukturen ermöglichen. Bei diesen Funktionen kann es sich beispielsweise um Fluoreszenzmarkierungen, UV/Vis-Markierungen, superparamagnetische Funktio- nen, ferromagnetische Funktionen und/oder radioaktive Markierungen handeln. Geeignete Verfahren zum Nachweis von Nanopartikeln umfassen beispielsweise Fluoreszenz- oder UV-Vis-Spektroskopie-, Fluoreszenz- oder Licht-Mikroskopie-, MALDI-Massenspektrometrie-, Wellenleiterspektroskopie-, Impedanzspektroskopie-, elektrische und radiometrische Verfahren. Auch eine Kombination der Verfahren kann zur Detektion der Nanopartikel verwandt werden. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Kern-Oberfläche durch Aufbringen zusätzlicher Funktionen wie Fluoreszenzmarkie-
rungen, UV/Vis-Markierungen, superparamagnetischer Funktionen, ferromagnetischer Funktionen und/oder radioaktiver Markierungen modifiziert sein kann. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Kern der Nanopartikel mit einer organischen oder anorganischen Schicht oberflächenmodifiziert sein, die die ersten funktionellen Gruppen und die vorstehend beschriebenen zusätzlichen Funktionen aufweist.In a preferred embodiment of the invention it is provided that additional functions are anchored in the core, which enable a simple detection of the nanoparticle cores and thus of the microstructures using suitable detection methods. These functions may, for example, be fluorescent labels, UV / Vis labels, superparamagnetic functions, ferromagnetic functions and / or radioactive labels. Suitable methods for detecting nanoparticles include, for example, fluorescence or UV-Vis spectroscopy, fluorescence or light microscopy, MALDI mass spectrometry, waveguide spectroscopy, impedance spectroscopy, electrical and radiometric methods. A combination of the methods can be used for the detection of nanoparticles. In a further embodiment, it is provided that the core surface can be obtained by applying additional functions, such as fluorescence labeling. ments, UV / Vis markings, superparamagnetic functions, ferromagnetic functions and / or radioactive markings. In yet another embodiment of the invention, it is provided that the core of the nanoparticles be surface-modified with an organic or inorganic layer having the first functional groups and the additional functions described above.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Kern-Oberfläche chemische Verbindungen aufweist, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung der immobilisierten Moleküle und/oder zur Verhinderung der Anlagerung weiterer biologisch aktiver Verbindungen an die Kern-Oberfläche dient. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen chemischen Verbindungen um Polyethylenglykole, Oligoethylengly- kole, Dextran oder ein Gemisch davon.In another embodiment of the invention it is provided that the core surface has chemical compounds which serve for steric stabilization and / or for preventing a conformational change of the immobilized molecules and / or for preventing the addition of further biologically active compounds to the core surface. These chemical compounds are preferably polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextran or a mixture thereof.
Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, dass auf der Oberfläche der Nanopartikel-Keme separat oder zusätzlich lonenaus- tausch-Funktionen verankert sind. Nanopartikel mit lonenaustausch- Funktionen sind insbesondere zur Optimierung der MALDI-Analyse geeignet, da dadurch störende Ionen gebunden werden können.According to the invention, there is also the possibility that separately or additionally ion exchange functions are anchored on the surface of the nanoparticle core. Nanoparticles with ion-exchange functions are particularly suitable for optimizing the MALDI analysis, since it can bind interfering ions.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das an der Mikrostruktur des Funktionselementes immobilisierte biologische Molekül Markierungen aufweist, die eine einfache De- tektion der an der Mikrostruktur immobilisierten biologischen Molekü- Ie unter Verwendung geeigneter Nachweisverfahren ermöglichen. Bei diesen Markierungen kann es sich beispielsweise um eine Fluoreszenzmarkierung, eine UV/Vis-Markierung, eine superparamagne-
tische Funktion, eine ferromagnetische Funktion und/oder eine radioaktive Markierung handeln. Wie vorstehend ausgeführt, kommen als Nachweisverfahren für diese Markierungen beispielsweise Fluoreszenz- oder UV-VIS-Spektroskopie, MALDI-Massenspektrometrie, Wellenleiterspektroskopie-, Impedanzspektroskopie-, elektrische und radiometrische Verfahren oder eine Kombination dieser Verfahren in Betracht.In a further embodiment of the invention, it is provided that the biological molecule immobilized on the microstructure of the functional element has markers which enable a simple detection of the biological molecules immobilized on the microstructure using suitable detection methods. These labels may be, for example, a fluorescent label, a UV / Vis label, a superparamagnetic label, act table function, a ferromagnetic function and / or a radioactive marker. As stated above, suitable detection methods for these labels are, for example, fluorescence or UV-VIS spectroscopy, MALDI mass spectrometry, waveguide spectroscopy, impedance spectroscopy, electrical and radiometric methods or a combination of these methods.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Funktionselement mit mindestens einem an der Mikrostruktur immobilisierten biologischen Molekül, wobei an dieses immobilisierte Molekül mindestens ein weiteres biologisches Molekül kovalent oder nicht- kovalent gebunden ist. Wenn das an der Mikrostruktur immobilisierte Molekül ein Protein ist, kann daran beispielsweise ein zweites Protein oder ein Antikörper, beispielsweise durch Protein-Protein- Interaktion oder durch Antikörper-Antigen-Bindung, gebunden sein. Wenn das an der Mikrostruktur immobilisierte Molekül eine Nuclein- säure ist, kann daran beispielsweise ein Protein gebunden sein.A further embodiment of the invention relates to a functional element having at least one biological molecule immobilized on the microstructure, to which immobilized molecule at least one further biological molecule is covalently or noncovalently bound. When the molecule immobilized on the microstructure is a protein, for example, a second protein or an antibody may be bound thereto, for example by protein-protein interaction or by antibody-antigen binding. If the molecule immobilized on the microstructure is a nucleic acid, for example, a protein may be bound thereto.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Funktionselement, dessen Mikrostruktur(en) aus mehreren überein- andergelagerten Schichten der gleichen Nanopartikel besteht, wobei jede einzelne Schicht über die bereits beschriebenen Verbindungsschichten aus geeigneten Polymeren fest an die darunter liegende Schicht gebunden wird.A further preferred embodiment of the invention relates to a functional element whose microstructure (s) consists of several superimposed layers of the same nanoparticles, each individual layer being firmly bound to the underlying layer via the already described bonding layers of suitable polymers.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Funktionselement, auf dessen Trägeroberfläche nebeneinander mehrere unterschiedliche Mikrostrukturen angeordnet sind, die ausYet another preferred embodiment of the invention relates to a functional element, on the support surface of which a plurality of different microstructures are arranged side by side, which are made of
Nanopartikeln mit unterschiedlichen molekülspezifische Erken-
nungsstellen bestehen. Derartige Funktionselemente enthalten daher nebeneinander Mikrostrukturen, an die unterschiedliche biologische Moleküle immobilisiert sind oder immobilisiert werden können. Die Trägeroberfläche solcher Funktionselemente kann daher bei- spielsweise gleichzeitig Mikrostrukturen umfassen, an denen Proteine immobilisiert sind oder werden können, und Mikrostrukturen, an denen Nucleinsäuren immobilisiert sind oder werden können. Das Funktionselement kann aber auch Mikrostrukturen aufweisen, an die unterschiedliche Proteine oder unterschiedliche Nucleinsäuren gleichzeitig immobilisiert sind oder werden können.Nanoparticles with different molecule-specific exist. Such functional elements therefore contain side by side microstructures to which different biological molecules are immobilized or can be immobilized. The support surface of such functional elements may therefore for example comprise at the same time microstructures on which proteins are or may be immobilized, and microstructures on which nucleic acids are or may be immobilized. However, the functional element can also have microstructures to which different proteins or different nucleic acids are or can be immobilized simultaneously.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Funktionselement, bei dem die Flächenabschnitte der Trägeroberfläche, die nicht von der Mikrostruktur abgedeckt sind, durch Aufbringen zusätzlicher Funktionalitäten beziehungsweise chemischer Verbindungen modifiziert sind. Dabei kann es sich insbesondere um Funktionalitäten beziehungsweise chemische Verbindungen handeln, die eine unspezifische Anlagerung von Biomolekülen an die nicht von der Mikrostruktur abgedeckten Bereiche der Trägeroberfläche verhindern. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen chemischen Verbin- düngen um Polyethylenglykole, Oligoethylenglykole, Dextran oder ein Gemisch davon. Besonders bevorzugt enthält die Oberfläche des Funktionselement-Trägers eine Ethylenoxid-Schicht.A further embodiment of the invention relates to a functional element in which the surface portions of the support surface, which are not covered by the microstructure, are modified by applying additional functionalities or chemical compounds. These may in particular be functionalities or chemical compounds which prevent a non-specific attachment of biomolecules to the regions of the carrier surface which are not covered by the microstructure. Preferably, these chemical compounds are polyethylene glycols, oligoethylene glycols, dextran or a mixture thereof. Particularly preferably, the surface of the functional element carrier contains an ethylene oxide layer.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Funktionstestes, wobei auf die Ober- fläche eines geeigneten Trägers mindestens eine Schicht eines Verbindungsmittels und danach mindestens eine Mikrostruktur bestehend aus Nanopartikeln mit molekülspezifischen Erkennungssequenzen aufgetragen wird.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Oberfläche eines Funktionselementes vor dem Auftragen der Verbindungsmittel-Schicht vorstrukturiert wird. Nach der Vorstrukturierung der Trägeroberfläche kann dann eine Schicht einer Verbindung auf der vorstrukturierten Trägeroberfläche ausgebracht werden, die eine unspezifische Anlagerung von biologischen Molekülen an der Trägeroberfläche verhindert. Vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Ethylenoxid- Schicht.The present invention likewise relates to a method for producing a functional test according to the invention, wherein at least one layer of a bonding agent and then at least one microstructure consisting of nanoparticles with molecule-specific recognition sequences are applied to the surface of a suitable substrate. According to the invention, it is provided that the surface of a functional element is pre-structured before the application of the bonding agent layer. After the pre-structuring of the carrier surface, a layer of a compound can then be applied to the prestructured carrier surface, which prevents non-specific attachment of biological molecules to the carrier surface. This is preferably an ethylene oxide layer.
In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des Trägers des erfindungsgemäßen Funktionselementes nach der Vorstrukturierung und vor dem Ausbringen der Verbindungsmittel-Schicht aktiviert wird. Erfindungsgemäß kann die Aktivierung auch eine Reinigung umfassen. Die Aktivierung der O- berfläche des Trägers des Funktionselementes kann erfindungsge- maß unter Verwendung eines chemischen Verfahrens, insbesondere unter Verwendung von Primern oder Säuren beziehungsweise Basen, erfolgen. Erfindungsgemäß besteht aber auch die Möglichkeit, die Oberfläche des Trägers unter Verwendung eines Plasmas zu aktivieren. Die Aktivierung kann auch das Aufbringen eines SeIf- Assembled-Monolayers umfassen.In a preferred embodiment of the invention, it is provided that the surface of the support of the functional element according to the invention is activated after the pre-structuring and before the application of the bonding agent layer. Activation may also include purification. The activation of the surface of the support of the functional element can be carried out according to the invention using a chemical process, in particular using primers or acids or bases. However, according to the invention it is also possible to activate the surface of the carrier using a plasma. The activation may also include the application of a SeIf-Assembled monolayer.
Zur erfindungsgemäßen Erzeugung der Mikrostrukturen auf der Trägeroberfläche des Funktionselementes lassen sich prinzipiell die folgenden zwei Ausführungsformen einsetzen.For the generation according to the invention of the microstructures on the carrier surface of the functional element, the following two embodiments can be used in principle.
In der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Funktionselementes ist vorgesehen, zunächst das Verbindungsmittel strukturiert auf die O- berfläche des Trägers aufzutragen. „Strukturiert" bedeutet im Kontext
der Erfindung, dass eine bezüglich Form und Fläche definierte Verbindungsmittel-Schicht auf die Trägeroberfläche aufgetragen wird, wobei die so aufgetragene Verbindungsmittel-Schicht den später von der Mikrostruktur abzudeckenden Flächenabschnitt der Trägerober- fläche definiert. Die Mikrostruktur wird dann durch Eintauchen des Funktionselement-Trägers in eine Nanopartikel-Suspension aufgetragen, wobei die Nanopartikel nur an der strukturiert aufgebrachten Verbindungsmittel-Schicht haften bleiben, nicht jedoch an den Flächenabschnitten der Trägeroberfläche, die keine Verbindungsmittel- Schicht aufweisen. Auf diese Weise wird eine bezüglich Form und Fläche definierte Mikrostruktur erzeugt.In the first embodiment of the method according to the invention for producing a functional element according to the invention, provision is initially made to apply the bonding agent in a structured manner to the surface of the carrier. "Structured" means in context of the invention in that a bonding agent layer defined in terms of shape and area is applied to the carrier surface, the bonding agent layer thus applied defining the surface portion of the carrier surface to be covered later by the microstructure. The microstructure is then applied by dipping the functional element support in a nanoparticle suspension, wherein the nanoparticles adhere only to the structured applied bonding agent layer, but not to the surface portions of the support surface, which have no bonding agent layer. In this way, a microstructure defined in terms of shape and area is produced.
Die Netto-Oberflächenladung funktioneller Nanopartikel ist abhängig von der Oberflächen-Modifikation und vom Suspensionsmedium. Eine von 0 verschiedene Oberflächenladung stabilisiert die Partikel- Suspension (elektro-statische Abstoßung).The net surface charge of functional nanoparticles depends on the surface modification and the suspension medium. A surface charge different from 0 stabilizes the particle suspension (electro-static repulsion).
Es hat sich gezeigt, dass wässrige Lösungen als Suspensionsmedium gut geeignet sind, um Nanopartikelschichten mikrostrukturiert auf Polyelektrolyt-beschichtete Oberflächen (zum Beispiel Silizium oder Glas) aufzubringen. In diesem Medium tragen die Partikel im Allge- meinen eine negative Nettoladung. So betragen die Zeta-Potentiale von funktionalisierten Nanopartikeln zum BeispielIt has been found that aqueous solutions as suspending medium are well suited for microstructured nanoparticle layers to be applied to polyelectrolyte-coated surfaces (for example silicon or glass). In this medium, the particles generally carry a net negative charge. For example, the zeta potentials of functionalized nanoparticles are
Carboxy-funktionalisierte Nanopartikel in MiIIiQ-HaO: - 45 mVCarboxy-functionalized nanoparticles in MiIIiQ-HaO: - 45 mV
Hase-lgG-Partikel in MiIIiQ-H2O: - 40 mVRabbit IgG particles in MiIIiQ-H 2 O: - 40 mV
Hase-lgG-Partikel in MiIIiQ-H2O + 5% Trehalose: - 37 mV Ziege-lgG-Partikel in MiIIiQ-H2O: - 36 mVRabbit IgG particles in MiIIiQ-H 2 O + 5% trehalose: - 37 mV goat IgG particles in MiIIiQ-H 2 O: - 36 mV
Ziege-lgG-Partikel in MiIIiQ-H2O + 5% Trehalose: - 24 mVGoat IgG particles in MiIIiQ-H 2 O + 5% trehalose: - 24 mV
SAv-Partikel in MiIIiQ-H2O + 0,5% Trehalose: - 53 mVSAv particles in MiIIiQ-H 2 O + 0.5% trehalose: - 53 mV
StrepTactinΘ-Partikel in MiIIiQ-H2O: - 43 mVStrepTactinΘ particles in MiIIiQ-H 2 O: - 43 mV
Protein G-Partikel in MiIIiQ-H2O: - 49 mV.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die strukturierte Verbindungsmittel-Schicht beispielsweise mittels eines Nadel-Ring-Printers, eines Tintenstrahlverfahrens, beispielsweise eines Piezo- oder Thermo-Verfahrens, oder eines Mikrokontaktdruckverfahrens aufge- tragen wird. Bei Verwendung eines lithografischen Verfahrens, insbesondere des Photolithographie- oder des Mikropen-Lithographie- Verfahrens wird die Trägeroberfläche mit dem Verbindungsmittel bedeckt und dann wird die so erzeugte Verbindungsmittel-Schicht mittels des lithographischen Verfahrens strukturiert. Durch eine ge- eignete Wahl des Verbindungsmittels kann die aufzutragende Mikrostruktur so gestaltet werden, dass sich die Mikrostruktur oder Teile davon von außen schaltbar, beispielsweise mittels Änderung des pH- Wertes, der lonenkonzentration oder der Temperatur, zu einem späteren Zeitpunkt wieder lösen lässt/lassen (debond on command). Damit lässt sich beispielsweise eine Mikrostruktur von einem Funktionselement auf ein anderes übertragen.Protein G particles in MiIIiQ-H 2 O: - 49 mV. According to the invention, it is provided that the structured bonding agent layer is applied, for example, by means of a needle-ring printer, an ink-jet method, for example a piezoelectric or thermo-process, or a microcontact printing method. When using a lithographic process, in particular the photolithography or the micropen lithography process, the carrier surface is covered with the bonding agent and then the bonding agent layer thus produced is patterned by means of the lithographic process. By a suitable choice of the bonding agent, the microstructure to be applied can be designed such that the microstructure or parts thereof can be switched from the outside, for example by changing the pH, the ion concentration or the temperature, at a later time again (debond on command). This allows, for example, a microstructure to be transferred from one functional element to another.
Stabile Nanopartikel-Suspensionen lassen sich durch Suspendieren der Nanopartikel in Flüssigkeiten, insbesondere wässrigen Medien, gegebenenfalls unter Verwendung zusätzlicher Bestandteile, bei- spielsweise pH-Mittel, Suspendierhilfen etc., einfach herstellen.Stable nanoparticle suspensions can be prepared simply by suspending the nanoparticles in liquids, in particular aqueous media, if appropriate using additional constituents, for example pH agents, suspending aids, etc.
In der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Funktionselementes ist vorgesehen, zunächst den Träger mit einer die gesamte Trägeroberfläche abdeckenden Verbindungsmittel-Schicht zu versehen. Dies kann beispielsweise durch Eintauchen des Trägers in eine Suspension oder Lösung des Verbindungsmittels erfolgen. Anschließend wird die Mikrostruktur dadurch erzeugt, dass eine Nanopartikelsuspension beispielsweise unter Verwendung eines Nadel-Ring-Printers, eines Tintenstrahlver-
fahrens, zum Beispiel eines Piezo- oder Thermo-Verfahrens, oder eines Mikrokontaktdruckverfahrens strukturiert aufgetragen und somit eine bezüglich Form und Fläche definierte Mikrostruktur erzeugt wird. Bei Verwendung eines lithografischen Verfahrens, insbesonde- re des Photolithographie- oder des Mikropen-Lithographie- Verfahrens, wird die Trägeroberfläche mit der Nanopartikelsuspensi- on bedeckt und dann wird die so erzeugte Nanopartikelschicht mittels des lithographischen Verfahrens strukturiert.In the second embodiment of the method according to the invention for producing a functional element, it is provided to first provide the carrier with a bonding agent layer covering the entire carrier surface. This can be done for example by immersing the carrier in a suspension or solution of the bonding agent. The microstructure is subsequently produced by, for example, using a nanoparticle suspension using a needle-ring printer, an ink-jet printer. driving, for example, a piezoelectric or thermal process, or a Mikrokontaktdruckverfahrens structured applied and thus a shape and area defined microstructure is generated. When using a lithographic process, in particular the photolithography or micropen lithography process, the carrier surface is covered with the nanoparticle suspension and then the nanoparticle layer thus produced is patterned by means of the lithographic process.
Bei den zur Erzeugung von Mikrostrukturen auf der Trägeroberfläche eines erfindungsgemäßen Funktionselementes aufgetragenen Na- nopartikeln kann es sich um biofunktionalisierbare Nanopartikel handeln, also Nanopartikel, die lediglich molekülspezifische Erkennungsstellen aufweisen, an die jedoch noch keine biologischen Moleküle gebunden sind. Erfindungsgemäß ist es aber auch möglich, zur Strukturierung der Trägeroberfläche biofunktionalisierte Nanopartikel zu verwenden, das heißt Nanopartikel, an deren molekülspezifische Erkennungsstellen bereits biologische Moleküle unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität immobilisiert wurden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das immobilisierte biologische Molekül insbe- sondere ein Protein, ein PNA-Molekül oder eine Nucleinsäure ist.The nanoparticles applied to the microstructure on the carrier surface of a functional element according to the invention may be biofunctionalizable nanoparticles, ie nanoparticles which have only molecule-specific recognition sites but to which no biological molecules are yet bound. However, it is also possible according to the invention to use biofunctionalized nanoparticles for structuring the carrier surface, ie nanoparticles at whose molecule-specific recognition sites biological molecules have already been immobilized while retaining their biological activity. According to the invention, it is provided that the immobilized biological molecule is in particular a protein, a PNA molecule or a nucleic acid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, das gleiche Verbindungsmittel und/oder die gleichen Nanopartikeln mehrmals aufzutragen, um mehrlagige fest haftende Mikrostrukturen zu erzeugen. Erfindungsgemäß ist es möglich, eines der vorstehend beschriebenen Verfahren bis zu zehnmal zu wiederholen. Die vorstehend beschriebenen Verfahren können aber auch unter Verwendung unterschiedlicher Verbindungsmittel und/oder unterschiedlicher Nanopartikel wiederholt werden, um Funktionsele-
mente mit unterschiedlichen Mikrostrukturen, die unterschiedliche Funktionen aufweisen, herzustellen.In a further preferred embodiment of the invention, it is provided to apply the same bonding agent and / or the same nanoparticles several times in order to produce multilayer, firmly adhering microstructures. According to the invention, it is possible to repeat one of the methods described above up to ten times. However, the methods described above can also be repeated using different bonding agents and / or different nanoparticles in order to obtain functional elements with different microstructures that have different functions to produce.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, superparamagnetische oder ferromagnetische Eisen- oxid-Nanopartikel unter Verwendung eines Magnetfeldes auf einer Trägeroberfläche strukturiert anzuordnen und auf diese Weise direkt Mikrostrukturen, insbesondere nanoskopische Leiterbahnen aufzubauen.In a further preferred embodiment of the invention, it is provided to arrange superparamagnetic or ferromagnetic iron oxide nanoparticles structured using a magnetic field on a carrier surface and in this way directly construct microstructures, in particular nanoscopic printed conductors.
Nach dem Aufbringen der Nanopartikel auf die Trägeroberfläche des Funktionselementes besteht erfindungsgemäß die Möglichkeit, die Partikel anschließend weiter umzusetzen. Enthalten die Partikel beispielsweise Reaktivester, so können diese zur direkten Bindung von Proteinen verwendet werden. Die Nanopartikel können aber auch umgesetzt werden, um sie mit zusätzlichen Funktionen zu versehen. Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, die aus Nanoparti- keln bestehenden Mikrostrukturen zusätzlich zu fixieren, indem die Partikel beispielsweise untereinander und/oder mit dem Verbindungsmittel kovalent quervernetzt werden.After the nanoparticles have been applied to the carrier surface of the functional element, it is possible in accordance with the invention to subsequently further convert the particles. For example, if the particles contain reactive esters, they can be used to directly bind proteins. However, the nanoparticles can also be implemented in order to provide them with additional functions. According to the invention, it is also possible to additionally fix the microstructures consisting of nanoparticles by, for example, crosslinking the particles covalently with one another and / or with the bonding agent.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfin- dungsgemäßen Funktionselementes zur Untersuchung eines Analy- ten in einer Probe und/oder zu dessen Isolierung und/oder Aufreinigung daraus, wobei das erfindungsgemäße Funktionselement beispielsweise als Gen-Array oder Gen-Chip oder als Protein-Array ausgeführt ist. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Analyten" eine Substanz verstanden, bei der Art und Menge ihrer Einzelbestandteile bestimmt und/oder die aus Gemischen abgetrennt werden soll. Insbesondere handelt es sich bei
dem Analyten um Proteine, Nucleinsäure, Kohlenhydrate und ähnliche. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist der Analyt ein Protein, Peptid, Wirkstoff, Schadstoff, Toxin, Pestizid, Antigen oder eine Nucleinsäure. Unter einer „Probe" wird eine wässrige oder or- ganische Lösung, Emulsion, Dispersion oder Suspension verstanden, die einen vorstehend definierten Analyten in isolierter und aufgereinigter Form oder als Bestandteil eines komplexen Gemisches unterschiedlicher Substanzen enthält. Bei einer Probe kann es sich beispielsweise um eine biologische Flüssigkeit, wie Blut, Lymphe, Gewebeflüssigkeit etc., handeln, also eine Flüssigkeit, die einem lebenden oder toten Organismus, Organ oder Gewebe entnommen wurde. Eine Probe kann jedoch auch ein Kulturmedium, beispielsweise ein Fermentationsmedium, sein, in dem Organismen, beispielsweise Mikroorganismen, oder menschliche, tierische oder pflanzliche Zellen kultiviert wurden. Bei einer Probe im Sinne der Erfindung kann es sich jedoch auch um eine wässrige Lösung, Emulsion, Dispersion oder Suspension eines isolierten und aufgereinigten Analyten handeln. Eine Probe kann bereits Aufreinigungsschritten unterworfen worden sein, kann aber auch ungereinigt vorliegen.The present invention also relates to the use of the functional element according to the invention for the examination of an analyte in a sample and / or for its isolation and / or purification therefrom, wherein the functional element according to the invention is used, for example, as a gene array or gene chip or as a protein chip. Array is executed. In the context of the present invention, an "analyte" is understood as meaning a substance in which the type and amount of its individual constituents are determined and / or which is to be separated off from mixtures the analyte to proteins, nucleic acid, carbohydrates and the like. In a preferred embodiment of the invention, the analyte is a protein, peptide, drug, contaminant, toxin, pesticide, antigen or nucleic acid. By a "sample" is meant an aqueous or organic solution, emulsion, dispersion or suspension containing an analyte as defined above in isolated and purified form or as part of a complex mixture of different substances However, a sample may also be a culture medium, such as a fermentation medium, in which organisms, for example, a biological fluid, such as blood, lymph, tissue fluid, etc., are taken However, a sample in the sense of the invention may also be an aqueous solution, emulsion, dispersion or suspension of an isolated and purified analyte A sample may already have been subjected to purification steps. but can also un have been purified.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Funktionselementes zur Durchführung von Analyse- und/oder Detektionsverfahren, wobei es sich bei diesen Verfahren um MALDI-Massenspektrometrie, Fluoreszenz- oder UV-VIS- Spektroskopie, Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie, Wellenleiter- Spektroskopie, ein elektrisches Verfahren wie Impedanzspektroskopie oder eine Kombination dieser Verfahren handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Funktionselementes zur Steuerung der Zelladhäsion oder des Zellwachstums.The present invention therefore also relates to the use of the functional element according to the invention for carrying out analysis and / or detection methods, these methods being MALDI mass spectrometry, fluorescence or UV-VIS spectroscopy, fluorescence or light microscopy, waveguide spectroscopy, an electrical method such as impedance spectroscopy or a combination of these methods. The present invention also relates to the use of a functional element according to the invention for controlling cell adhesion or cell growth.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Funktionselementes zum Nachweis und/oder Isolierung biologischer Moleküle. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Funktionselement, an dessen Mikrostrukturen eine, vorzugsweise einzelsträngige Nucleinsäure immobilisiert ist, zum Nachweis einer komplementären Nucleinsäure in einer Probe und/oder zur Isolierung dieser komplementären Nucleinsäure eingesetzt werden. Ein erfindungsgemäßes Funktionselement, an dessen Mikrostrukturen ein Protein immobilisiert ist, kann beispielsweise zum Nachweis und/oder zur Isolierung eines mit dem immobilisierten Protein in Wechselwirkung tretenden Proteins aus einer Probe ein- gesetzt werden.The present invention also relates to the use of a functional element according to the invention for the detection and / or isolation of biological molecules. For example, a functional element according to the invention, to whose microstructures one, preferably single-stranded, nucleic acid is immobilized, can be used to detect a complementary nucleic acid in a sample and / or to isolate this complementary nucleic acid. A functional element according to the invention, to whose microstructures a protein is immobilized, can be used for example for the detection and / or isolation of a protein interacting with the immobilized protein from a sample.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Funktionselementes zur Entwicklung von pharmazeutischen Präparaten. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Funktionselemente zur Untersuchung der Wirkungen und/oder Nebenwirkungen von pharmazeutischen Präparaten. Die erfindungsgemäßen Funktionselemente lassen sich ebenfalls zur Diagnose von Krankheiten, beispielsweise zur Identifizierung von Krankheitserregern und zur Identifizierung von mutierten Genen, die zur Entstehung von Krankheiten führen, verwenden. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Funktionselemente besteht bei der Untersuchung von mikrobiologischen Kontaminationen von Oberflächengewässern, Grundwasser und Böden. Ebenso lassen sich die erfindungsgemäßen Funktionselemente
zur Untersuchung der mikrobiologischen Kontamination von Nahrungsmitteln beziehungsweise Tierfutter einsetzen.The present invention also relates to the use of a functional element according to the invention for the development of pharmaceutical preparations. The invention also relates to the use of the functional elements according to the invention for the investigation of the effects and / or side effects of pharmaceutical preparations. The functional elements according to the invention can likewise be used for the diagnosis of diseases, for example for the identification of pathogens and for the identification of mutated genes which lead to the development of diseases. Another possible use of the functional elements according to the invention consists in the investigation of microbiological contamination of surface waters, groundwater and soil. Likewise, the functional elements of the invention can be to investigate the microbiological contamination of food or animal feed.
Eine weitere bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Funktionselemente besteht im Einsatz des erfindungsgemäßen Funkti- onselementes als Elektronikbaustein, beispielsweise als molekularer Schaltkreis etc., in der Medizintechnik oder in einem Biocomputer. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Funktionselementes als optischer Speicher in der optischen Informationsverarbeitung, wobei das erfindungsgemäße Funktionselement insbesondere an Mikrostrukturen immobilisierte Photorezeptor- Proteine umfasst, die Licht direkt in ein Signal umwandeln können.A further preferred use of the functional elements according to the invention is the use of the functional element according to the invention as an electronic component, for example as a molecular circuit, etc., in medical technology or in a biocomputer. The use of the functional element according to the invention as optical memory in optical information processing is particularly preferred, the functional element according to the invention in particular comprising photoreceptor proteins immobilized on microstructures, which can convert light directly into a signal.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von Analyten in einer Lösung oder einer Suspension. Gemäß des Verfahrens wird in einem ersten Ver- fahrensschritt ein erfindungsgemäßes Funktionselement bereitgestellt, das in einem zweiten Verfahrensschritt mit einer Analyt- haltigen Lösung oder Suspension in Kontakt gebracht wird. Anschließend wird in einem dritten Verfahrensschritt nicht-gebundener Analyt von dem erfindungsgemäßen Funktionselement durch Wa- sehen mit einer biokompatiblen Waschflüssigkeit entfernt. In einem vierten anschließenden Verfahrensschritt wird ein Nachweisverfahren durchgeführt.The present invention also relates to a method for the identification and / or detection of analytes in a solution or suspension. According to the method, a functional element according to the invention is provided in a first process step, which is brought into contact with an analyte-containing solution or suspension in a second process step. Subsequently, in a third process step, unbound analyte is removed from the functional element according to the invention by washing with a biocompatible washing liquid. In a fourth subsequent process step, a detection method is carried out.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist die biokompatible Waschflüssigkeit Wasser und/oder Puffer, z. B. Phosphat- buffered Saline: PBS, und/oder Puffer mit Zusatz eines Detergenz, z. B. TritonX-100. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung kann der Träger bei Raumtemperatur sequentiell in Wasser und Puffer,
gegebenenfalls mit einem Detergenz, oder Puffer, gegebenenfalls mit einem Detergenz, und Wasser z.B. je 30 min gewaschen werden.In a preferred method according to the invention the biocompatible washing liquid is water and / or buffer, e.g. B. Phosphate buffered saline: PBS, and / or buffer with the addition of a detergent, eg. TritonX-100. In a preferred embodiment of the invention, the support may be sequentially stored in water and buffer at room temperature, if appropriate, with a detergent or buffer, if appropriate with a detergent, and water, for example, for 30 min each.
In einer bevorzugten Verfahrensform wird als Nachweisverfahren für Analyte in einer Lösung oder Suspension ein Fluoreszenznachweisverfahren oder ein MALDI-Massenspektrometrieverfahren angewendet.In a preferred method form, a fluorescence detection method or a MALDI mass spectrometry method is used as the detection method for analytes in a solution or suspension.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist daher ein Verfahren der vorgenannten Art zur Identifizierung und/oder zum Nachweis von Analyten in einer Lösung oder einer Suspension, wobei nach Durchführen der vorgenannten ersten drei Verfahrensschritte in einem vierten Verfahrensschritt, gemäß dem in bevorzugter Ausführungsform ein Fluoreszenznachweisverfahren eingesetzt wird, ein fluoreszenzmarkierter Analyt und/oder fluoreszenzmarkiertes biologisch aktives an dem Nanopartikel gebundenes Molekül mit Licht angeregt und mit Licht ausgelesen wird.According to the invention, therefore, a method of the aforementioned type for identifying and / or detecting analytes in a solution or suspension is particularly preferred, after performing the aforementioned first three method steps in a fourth method step, according to which in a preferred embodiment a fluorescence detection method is used fluorescence-labeled analyte and / or fluorescently labeled biologically active bound to the nanoparticle molecule is excited with light and read with light.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist bei der Verwendung eines Fluoreszenzverfahrens der Analyt und/oder das an die molekülspezifischen Erkennungsstellen der Nanopartikel gebundene biologische Molekül fluoreszenz-markiert.In accordance with the invention, when using a fluorescence method, the analyte and / or the biological molecule bound to the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles is preferably fluorescence-labeled.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous embodiments of the invention will become apparent from the dependent claims.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert.
Figur 1 zeigt rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen einer dreidimensionalen Nanopartikel-Mikrostruktur (Ausschnitt eines Mikro- spots, Durchmesser -150 μm), erzeugt durch 5-faches Auftragen einer 16%igen Nanopartikel-Suspension in wässriger Trehaloselö- sung (5% w/v).The invention will be explained in more detail with reference to the following figures and examples. FIG. 1 shows scanning electron micrographs of a three-dimensional nanoparticle microstructure (detail of a microspot, diameter -150 μm), produced by 5 times the application of a 16% nanoparticle suspension in aqueous trehalose solution (5% w / v).
Links: Die nanopartikuläre 3D-Struktur direkt nach dem Aufspotten der Nanopartikel auf einen Polyelektrolyt-beschichteten Siliziumträger. Rechts: Dieselbe Struktur nach 2 h Inkubation in PBS-Puffer und je 30 min Waschen in PBS/0,1% TritonX-100, PBS und MiIIiQ- Wasser.Left: The nanoparticulate 3D structure directly after spiking the nanoparticles onto a polyelectrolyte-coated silicon substrate. Right: The same structure after 2 h incubation in PBS buffer and 30 min each wash in PBS / 0.1% TritonX-100, PBS and MiIIiQ water.
Figur 2 zeigt rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Nano- partikel-Schichten (Ausschnitte aus Mikrospots, Durchmesser -150 μm), erzeugt durch 5-faches Auftragen von Nanopartikel-Suspension (1%, 2%, 4%, 8%, 16% und 32%) in wässriger Trehaloselösung (5% (w/v)) auf Polyelektrolyt-beschichtete Silizium-Oberflächen. Die Partikel-Oberflächen wurden 2 h in PBS-Puffer inkubiert und je 30 min in PBS/0,1% TritonX-100, PBS und MilliQ-Wasser gewaschen.FIG. 2 shows scanning electron micrographs of nanoparticle layers (sections of microspots, diameter -150 μm), produced by 5 times the application of nanoparticle suspension (1%, 2%, 4%, 8%, 16% and 32%). ) in aqueous trehalose solution (5% w / v) on polyelectrolyte-coated silicon surfaces. The particle surfaces were incubated for 2 h in PBS buffer and washed for 30 min each in PBS / 0.1% TritonX-100, PBS and MilliQ water.
Figur 3 zeigt rasterkraftmikroskopische Aufnahmen (100x100 μm2) von dreidimensionalen Nanopartikel-Mikrostrukturen (Ausschnitte aus Mikrospots, Durchmesser -150 μm), erzeugt durch 5-faches Auftragen von 2%iger, 16%iger und 32%iger Nanopartikel- Suspension in wässriger Trehaloselösung (5% (w/v)) auf Polyelektrolyt-beschichtete Silizium-Oberflächen. 3D-Darstellung, Graustufen- Darstellung, Höhenprofil entlang der in der Graustufendarstellung markierte Linie.FIG. 3 shows scanning force micrographs (100 × 100 μm 2 ) of three-dimensional nanoparticle microstructures (sections of microspots, diameter -150 μm), produced by 5-fold application of 2%, 16% and 32% nanoparticle suspension in aqueous trehalose solution (5% (w / v)) on polyelectrolyte-coated silicon surfaces. 3D representation, gray scale representation, height profile along the line marked in the gray scale representation.
Figur 4 zeigt den Fluoreszenzscan eines Nanopartikel-Microarrays. Gespottet wurden Hase-lgG-Nanopartikel, inkubiert wurde mit Cy5-
markiertem Anti-Hase-lgG. Die gebundene Analytmenge pro Spot nimmt mit der Menge an pro Spot übertragenen Partikeln zu.FIG. 4 shows the fluorescence scan of a nanoparticle microarray. Hase IgG nanoparticles were spotted, incubated with Cy5- labeled anti-rabbit IgG. The bound amount of analyte per spot increases with the amount of particles transferred per spot.
Figur 5 zeigt den linearen Zusammenhang von Signalintensität und Analyt-Konzentration. Gespottet wurden Ziege-IgG- bzw. Hase-IgG- Nanopartikel. Inkubiert wurde mit Cy5-markiertem Anti-Ziege- bzw. Cy3-markiertem Anti-Hase-lgG in unterschiedlichen Konzentrationen. Probenkonzentrationen links: 0,04 - 4 pM, rechts: 4 - 400 pM. Links: Die Empfindlichkeit (Steigung) nimmt für höhere Partikelmengen/Spot zu.FIG. 5 shows the linear relationship between signal intensity and analyte concentration. Goat IgG or rabbit IgG nanoparticles were spotted. Incubation was carried out with Cy5-labeled anti-goat or Cy3-labeled anti-rabbit IgG in different concentrations. Sample concentrations left: 0.04 - 4 pM, right: 4 - 400 pM. Left: The sensitivity (slope) increases for higher particle amounts / spot.
Figur 6 zeigt den Fluoreszenzscan eines Nanopartikel-Microarrays. Gespottet wurden Ziege-IgG- bzw. Hase-IgG-Nanopartikel in Suspensionen mit unterschiedlichem Feststoffgehalt. Inkubiert wurde mit einer Lösung von Cy5-markiertem Anti-Ziege- bzw. Cy3-markiertem Anti-Hase-lgG. Die nanopartikulären Mikrostrukturen binden selektiv nur die spezifischen Wechselwirkungspartner der immobilisierten Fänger-Moleküle.FIG. 6 shows the fluorescence scan of a nanoparticle microarray. Goat IgG or hare IgG nanoparticles were spotted in suspensions with different solids contents. Incubation was carried out with a solution of Cy5-labeled anti-goat or Cy3-labeled anti-rabbit IgG. The nanoparticulate microstructures selectively bind only the specific interaction partners of the immobilized capture molecules.
Figur 7 zeigt die Abhängigkeit des Funktionserhalts von partikelgebundenen Fängerproteinen von der Trehalose-Konzentration in der Spotting-Suspension.FIG. 7 shows the dependence of the functional integrity of particle-bound capture proteins on the trehalose concentration in the spotting suspension.
Oben: Fluoreszenzscan eines Nanopartikel Microarrays: Gespottet wurden Streptavidin-Nanopartikel. Inkubiert wurde nach 2 Wochen Lagerung mit biotinyliertem, Alexa647- markiertem Cytochrom C und Alexa546-markiertem Zell-Lysat (nicht biotinyliert).Top: Fluorescence scan of a nanoparticle microarray: streptavidin nanoparticles were spotted. Incubation was after 2 weeks of storage with biotinylated, Alexa647-labeled cytochrome C and Alexa546-labeled cell lysate (not biotinylated).
Unten: Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vom Trehalosegehalt der Spotting-Suspension: Gespottet wurden Streptavidin- Nanopartikel bzw. Protein G-Nanopartikel. Inkubiert wurde nach 2
Wochen Lagerung mit biotinyliertem, Alexa647- markiertem Cytoch- rom C und Alexa546-markiertem Zell-Lysat (nicht biotinyliert) bzw. mit F ITC-markiertem Maus-lgG.Bottom: Fluorescence intensity as a function of the trehalose content of the spotting suspension: Streptavidin nanoparticles or protein G nanoparticles were spotted. Was incubated after 2 Weeks of storage with biotinylated, Alexa647-labeled cytochrome C and Alexa546-labeled cell lysate (not biotinylated) or with F ITC-labeled mouse IgG.
Figur 8 zeigt die Abhängigkeit des Funktionserhalts von partikelge- bundenen Fängerproteinen von der Trehalose-Konzentration in derFIG. 8 shows the dependence of the functional integrity of particle-bound catcher proteins on the trehalose concentration in FIG
Spotting-Suspension. Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vomSpotting suspension. Fluorescence intensity as a function of
Trehalosegehalt der Spotting. Suspension: Gespottet wurden Ziege-Trehalose content of spotting. Suspension: Spotted were goats
IgG-Nanopartikel bzw. Hase-lgG-Nanopartikel. Beide Chip-Sorten wurden nach 5 Wochen Lagerung mit Cy5-markiertem Anti-Ziege- IgG und Cy3-markiertem Anti-Hase-IgG inkubiert.IgG nanoparticles or rabbit IgG nanoparticles. Both chip types were incubated after 5 weeks of storage with Cy5-labeled anti-goat IgG and Cy3-labeled anti-hase IgG.
Figur 9 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme des Goldsubstrats bevor Nanopartikel darauf immobilisiert wurden (25x) und eine Aufnahme der Streptavidin-Partikel beschichteten Oberfläche (1000x, Dunkelfeld). Das obere Spektrum (blau) ist ein MALDI-TOF Spekt- rum der Analytlösung mit der die Nanopartikel-Oberfläche inkubiert wurde (biotinyliertes und nicht-biotinyliertes Insulin). Das untere Spektrum ist das MALDI-TOF Spektrum der nanopartikel- gebundenen Moleküle nach der Inkubation.FIG. 9 shows a light micrograph of the gold substrate before nanoparticles were immobilized thereon (25 ×) and a photograph of the streptavidin particle-coated surface (1000 ×, dark field). The upper spectrum (blue) is a MALDI-TOF spec- trum of the analyte solution with which the nanoparticle surface was incubated (biotinylated and non-biotinylated insulin). The lower spectrum is the MALDI-TOF spectrum of nanoparticle-bound molecules after incubation.
Beispiel 1: Herstellung von Nanopartikel-basierten Proteinbiochips zur Fluoreszenz-AusleseExample 1: Preparation of nanoparticle-based protein biochips for fluorescence readout
Substrat:substrate:
Zur Herstellung von Nanopartikel-basierten Proteinbiochips, die für die Fluoreszenz-Auslese geeignet sind, werden Glas-Substrate verwendet. Die Haftung der Nanopartikel auf Oberflächen wird größten- teils durch elektrostatische Wechselwirkung vermittelt. Zur Adsorption Protein-beschichteter Nanopartikel auf dem Substrat sind meistFor the preparation of nanoparticle-based protein biochips, which are suitable for fluorescence readout, glass substrates are used. The adhesion of nanoparticles to surfaces is largely mediated by electrostatic interaction. For adsorption of protein-coated nanoparticles on the substrate are mostly
ät~.
positiv geladene Oberflächen erforderlich. Kommerziell erhältliche Glasobjektträger, die positive Gruppen an den Oberflächen aufweisen, werden ohne weitere Vorbehandlung mit Protein-beschichteten Nanopartikeln bedruckt.ät ~. positively charged surfaces required. Commercially available glass slides which have positive groups on the surfaces are printed with protein-coated nanoparticles without further pretreatment.
Herkömmliche Glasoberflächen werden in einer 2 Vol.-% wässrigen HELLMANEX®-Lösung 90 min bei 4O0C gereinigt. Nach Waschen in MiIIiQ-H2O (entionisiertes Wasser, 18 MΩ) werden die Glas- Objekträger in einer 3:1 (v/v) NH3/H2O2-Lösung 40 min bei 700C hydroxyliert (NH3: puriss. p.a. -25% in Wasser, H2O2: zur Analyse, ISO Reag., stabilisiert).Conventional glass surfaces are in a 2 vol .-% aqueous solution HELLMANEX® 90 min at 4O 0 C purified. After washing in MiIIiQ-H 2 O (deionized water, 18 MΩ), the glass slides are hydroxylated in a 3: 1 (v / v) NH 3 / H 2 O 2 solution at 70 ° C. for 40 min (NH 3 : puriss. pa -25% in water, H 2 O 2 : for analysis, ISO Reag., stabilized).
Nach gründlichem Waschen in MiIIiQ- H2O werden die Substrate bei RT 20 min in einer wässrigen Polykationlösung (0,02 M Po- ly(allylamin) (bezogen auf das Monomer), pH 8,5) inkubiert, 5 min in MiIIiQ- H2O gewaschen und anschließend trockenzentrifugiert.After thorough washing in MiIIiQ-H 2 O, the substrates are incubated at RT for 20 min in an aqueous polycation solution (0.02 M poly (allylamine) (based on the monomer), pH 8.5), for 5 min in MiIIiQ- H 2 O and then centrifuged dry.
Synthese von Silica-Partikeln:Synthesis of silica particles:
Zu 200 ml_ Ethanol werden 12 mmol Tetraethoxysilan und 90 mmol NH3 gegeben. Dann wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt. Es resultieren 650 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Parti- kelgröße von 125 nm.To 200 ml of ethanol are added 12 mmol of tetraethoxysilane and 90 mmol of NH 3 . Then it is stirred for 24 h at room temperature. Subsequently, the particles are cleaned by multiple centrifugation. This results in 650 mg of silica particles with a mean particle size of 125 nm.
Aminofunktionalisierung von Silica-Partikeln:Aminofunctionalization of silica particles:
Eine 1 Gew.-% wässrige Suspensiom der Silica-Partikel wird mit 10A 1 wt .-% aqueous suspension of the silica particles is 10
Vol.-% 25% Ammoniak versetzt. Dann werden 20 Gew.-% Ami- nopropyltriethoxysilan, bezogen auf die Partikel, zugegeben und es wird 1h bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel werden durch
mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Ami- nogruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat- Puffer: + 35 mV).Vol .-% 25% ammonia added. Then 20% by weight of aminopropyltriethoxysilane, based on the particles, are added and the mixture is stirred for 1 h at room temperature. The particles are going through purified by repeated centrifugation and carry functional amino groups on their surface (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: + 35 mV).
Carboxyfunktionalisierung von Silica-Partikeln:Carboxy Functionalization of Silica Particles:
10 ml_ einer 2 Gew.-% Suspension aminofunktionalisierter Nanopar- tikel werden in Tetrahydrofuran aufgenommen. Dazu werden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5-minütigen Behandlung mit Ultraschall wird 1 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Die Partikel werden durch mehrfache Zentrifugation gereinigt und tragen funktionelle Carboxygruppen auf ihrer Oberfläche (Zeta-Potenzial in 0,1 M Acetat-Puffer: - 35 mV). Die mittlere Partikelgröße beträgt 170 nm.10 ml of a 2% by weight suspension of amino-functionalized nanoparticles are taken up in tetrahydrofuran. 260 mg of succinic anhydride are added. After a 5-minute treatment with ultrasound, it is stirred for 1 h at room temperature (RT). The particles are purified by multiple centrifugation and carry functional carboxy groups on their surface (zeta potential in 0.1 M acetate buffer: - 35 mV). The mean particle size is 170 nm.
IgG-Anbindung an Silica-Partikel:IgG binding to silica particles:
1 mg carboxyfunktionalisierter Silica-Partikel wird mit 4 μL einer IgG- Lösung (11 ,3 mg/ ml_) und 10 μL einer EDC-Lösung (N-(3- Dimethylaminopropyl)-N'- ethylcarbodiimid Hydrochlorid; 3,8 mg /ml_) versetzt und mit MES-Puffer (pH 4,5) auf 1 ml_ aufgefüllt.1 mg carboxy-functionalised silica particles is mixed with 4 .mu.l of a solution of IgG (11, 3 mg / ml) and 10 .mu.l of a solution of EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N '- ethylcarbodiimide hydrochloride, 3.8 mg / mL ) and made up to 1 ml with MES buffer (pH 4.5).
Es wird 3 h bei Raumtemperatur geschüttelt, anschließend werden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt (Zeta-Potenzial von IgG-Partikeln in MilliQ-Wasser: - 40 mV)It is shaken for 3 h at room temperature, then the particles are purified by repeated centrifugation (zeta potential of IgG particles in MilliQ water: - 40 mV)
Konservierung der Proteinfunktion in Nanopartikelschichten:Conservation of protein function in nanoparticle layers:
Zur Stabilisierung der Funktion Nanopartikel-gebundener Fänger- Proteine in Nanopartikelschichten werden die Partikel zur Beschich-
tung in 5% (w/v) wässriger Trehalose-Lösung suspendiert (Abbildungen 7, 8).To stabilize the function of nanoparticle-bound capture proteins in nanoparticle layers, the particles are used to coat in 5% (w / v) aqueous trehalose solution (Figures 7, 8).
Herstellung der Nanopartikel-Protein-Microarrays:Preparation of nanoparticle protein microarrays:
Zur Herstellung Fluoreszenz-auslesbarer IgG-Nanopartikel-Chips werden Hase- und/oder Ziege-lgG-beschichtete Nanopartikel mit Hilfe eines Pin-Ring Spotters auf das vorbehandelte Glas-Substrat übertragen. Die Konzentration der verwendeten Partikel- Suspensionen beträgt 0,5% - 50% (w/v) (Abbildung 1-6). Pro Nadel- Kontakt mit der Oberfläche werden ca. 50 pl Suspension übertragen, es wird fünf Mal pro Spot gedruckt. Die resultierenden Nanopartikel- Schichten sind 100 nm - 1500 nm dick. Der Spof-Durchmesser beträgt ca. 150 μm. Die Platzierung der einzelnen Spots auf dem Substrat ist frei programmierbar.To produce fluorescence-readable IgG nanoparticle chips, hare and / or goat IgG-coated nanoparticles are transferred onto the pretreated glass substrate with the aid of a pin-ring spotter. The concentration of the suspensions used is 0.5% - 50% (w / v) (Figure 1-6). Per pin contact with the surface, about 50 pl of suspension are transferred, it is printed five times per spot. The resulting nanoparticle layers are 100 nm - 1500 nm thick. The Spof diameter is about 150 microns. The placement of the individual spots on the substrate is freely programmable.
Einsatz der Nanopartikel-Protein-Biochips:Use of nanoparticle protein biochips:
Die Nanopartikel-Oberflächen werden zunächst eine Stunde lang mit einer 3%igen (w/v) Lösung von BSA in PBS-Puffer geblockt, anschließend für 1 ,5 h im Dunkeln bei RT mit der Analyt-Lösung inkubiert und dann jeweils 30 min in PBS/0,1%TritonX 100, in PBS und in MilliQ-Wasser gewaschen. Alle Schritte werden in Glas- Objektträgerständern durchgeführt.The nanoparticle surfaces are first blocked for one hour with a 3% (w / v) solution of BSA in PBS buffer, then incubated for 1.5 h in the dark at RT with the analyte solution and then each 30 min in PBS / 0.1% TritonX 100, washed in PBS and MilliQ water. All steps are performed in glass slide racks.
Die Analyt-Lösung besteht aus in PBS-Puffer gelösten Fluoreszenzmarkierten IgG-Molekülen (Abbildung 4: 40 pM Cy5-markiertes AntiHase IgG1 Abbildung 5: 0,04 pM, 0,4 pM und 4 pM bzw. 4 pM, 40 pM und 400 pM Cy5-markiertes Anti-Ziege IgG, Abbildung 6: 400 pM Cy3-markiertes Anti-Hase Antikörper und 400 pM Cy5-markiertes Anti-Ziege Antikörper).
Chip-Auslese:The analyte solution consists of fluorescence-labeled IgG molecules dissolved in PBS buffer (Figure 4: 40 pM Cy5-labeled anti-hase IgG 1 Figure 5: 0.04 pM, 0.4 pM and 4 pM and 4 pM, 40 pM and 400 pM Cy5-labeled anti-goat IgG, Figure 6: 400 pM Cy3-labeled anti-rabbit antibody and 400 pM Cy5-labeled anti-goat antibody). Chip selection:
Das Fluoreszenz-Signal der gebundenen Analyt-Moleküle wird in einem kommerziellen Chip-Reader System der Firma ArrayWorx, detektiert. Die Belichtungszeiten liegen zwischen 0,1s und 2s und werden innerhalb eines Experiments konstant gehalten. Die Signalintensitäten werden in Form von Grauwertabstufungen gespeichert. Die Auswertung der Daten erfolgt mit Hilfe des Programms Aida der Firma Raytest, Berlin.The fluorescence signal of the bound analyte molecules is detected in a commercial chip reader system from ArrayWorx. The exposure times are between 0.1s and 2s and are kept constant within an experiment. The signal intensities are stored in the form of gray scale graduations. The evaluation of the data takes place with the help of the program Aida of the company Raytest, Berlin.
Beispiel 2: Herstellung von Nanopartikel-Schichten für die MALDI- TOF-AnalvseExample 2 Production of Nanoparticle Layers for MALDI-TOF Analysis
Substrat:substrate:
Goldoberflächen, in diesem Fall das MALDI-Target selbst, werden mit Aceton abgerieben, 3 min in 1:1 Isopropanol/HCI (0,2 M) mit Ultraschall behandelt, mit Isopropanol gespült und mit Stickstoff tro- ckengeblasen. Anschließend werden sie 20 min bei RT in wässriger Polyanionlösung (0,02 M (bezogen auf das Monomer) Po- ly(acrylsäure) in MiIIiQ- H2O, pH 8,5) inkubiert, 5 min in MiIIiQ- H2O gewaschen, 20 min in Polykationlösung (s. Bsp 1) inkubiert, weitere 5 min gewaschen und mit Stickstoff trockengeblasen.Gold surfaces, in this case the MALDI target itself, are rubbed off with acetone, sonicated for 3 minutes in 1: 1 isopropanol / HCl (0.2 M), rinsed with isopropanol and blown dry with nitrogen. They are then incubated for 20 min at RT in aqueous polyanion solution (0.02 M (based on the monomer) poly (acrylic acid) in MiIIiQ-H 2 O, pH 8.5), washed for 5 min in MiIIiQ-H 2 O. , 20 min in polycation solution (see Example 1) incubated, washed for a further 5 min and blown dry with nitrogen.
Partikel:Particle:
Silica-Partikel werden wie in Beispiel 1 synthetisiert und anschließend amino- und carboxy-funktionalisiert.Silica particles are synthesized as in Example 1 and subsequently amino- and carboxy-functionalized.
Streptavidin-Anbindung an Silica-Partikel:
Man legt 2,68 nmol Streptavidin in 10 mL 0,1 m MES-Puffer (pH 5) vor. Dazu gibt man 5 mg der Carboxy-Partikel. Dazu werden 2 μmol EDC gegeben. Nach 3-stündigem Schütteln bei RT werden die Partikel einmal mit 10 mL MES-Puffer (pH 5) und einmal mit 10 mL Phosphat-Puffer (pH 7) gewaschen.Streptavidin binding to silica particles: 2.68 nmol of streptavidin are introduced into 10 ml of 0.1 M MES buffer (pH 5). 5 mg of the carboxy particles are added. For this purpose, 2 μmol of EDC are added. After shaking at RT for 3 hours, the particles are washed once with 10 ml of MES buffer (pH 5) and once with 10 ml of phosphate buffer (pH 7).
Konservierung der Proteinfunktion in Nanopartikelschichten: Zur Stabilisierung der Funktion Nanopartikel-gebundener Fänger- Proteine in Nanopartikelschichten werden die Partikel zur Beschich- tung in 5% (w/v) wässriger Trehalose-Lösung suspendiert.Preservation of protein function in nanoparticle layers: To stabilize the function of nanoparticle-bound capture proteins in nanoparticle layers, the particles are suspended for coating in 5% (w / v) aqueous trehalose solution.
Herstellung der Nanopartikel-Schicht:Production of the nanoparticle layer:
Ca. 250 μg Streptavidin-Partikel werden in 10 μL MiIIiQ- H2O + 5% Trehalose suspendiert und μL-weise auf der Substrat-Oberfläche (ca. 2 mm2) eingetrocknet.Approximately 250 μg streptavidin particles are suspended in 10 μl MiIIiQ-H 2 O + 5% trehalose and dried μL-wise on the substrate surface (about 2 mm 2 ).
Einsatz der Nanopartikel-Oberfläche:Use of the nanoparticle surface:
Die Nanopartikel-Oberflächen werden zunächst eine Stunde lang mit einer 3%igen (w/v) Lösung von BSA in PBS-Puffer geblockt, anschließend für 1 ,5 h im bei RT mit der Analyt-Lösung inkubiert und dann jeweils 30 min in PBS/0,1%TritonX 100, in PBS und in MiIIiQ- Wasser gewaschen.The nanoparticle surfaces are first blocked for one hour with a 3% (w / v) solution of BSA in PBS buffer, then incubated for 1.5 h at RT with the analyte solution and then for 30 min in PBS / 0.1% TritonX 100, washed in PBS and MiIIiQ water.
Die Analyt-Lösung ist eine Mischung aus in PBS-Puffer gelöstem ein- bis dreifach biotinyliertem und unbiotinyliertem Insulin (ca. 3:1 , Gesamtkonzentratiom ca. 250 nM).The analyte solution is a mixture of one to three times biotinylated and unbiotinylated insulin dissolved in PBS buffer (about 3: 1, total concentration about 250 nM).
Massenspektrometrische Analyse:Mass spectrometric analysis:
Matrix:
Es wurde eine gesättigte Lösung von 3,5-Dimethoxy-4 hydroxy Zimtsäure in 6:4 (v/v) 0,1% Trifluoressigsäure (p.A.) und Acetonitril (HPLC Grade) gelöst, auf die Partikelschicht aufgegeben und luftge- trocknet.Matrix: A saturated solution of 3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid in 6: 4 (v / v) 0.1% trifluoroacetic acid (pA) and acetonitrile (HPLC grade) was dissolved, applied to the particle layer and air dried.
Hardware:Hardware:
Es wurde ein Massenspektrometer (HP G 2025A LD-TOF) modifiziert mit einer time-lag-focusing (TLF) Einheit (Future, Firma GSG) verwendet. Die Datengewinnung erfolgte über ein Le Croy 500 MHz Oszilloskop.
A mass spectrometer (HP G 2025A LD-TOF) modified with a time lag focusing (TLF) unit (Future, GSG company) was used. The data was collected using a Le Croy 500 MHz oscilloscope.
Claims
1. Funktionselement, umfassend einen Träger mit einer Oberfläche und mindestens eine auf der Trägeroberfläche angeordnete Mikrostruktur, wobei die Mikrostruktur aus mehreren dreidimensional übereinander angeordneten Schichten von Nanopartikeln gebildet ist und wobei die Nanopartikel molekülspezifische Erkennungsstellen aufweisen, die innerhalb der Mikrostruktur eine Adressierbarkeit ermöglichen.A functional element comprising a support having a surface and at least one microstructure arranged on the support surface, wherein the microstructure is formed from a plurality of layers of nanoparticles stacked three-dimensionally above one another and wherein the nanoparticles have molecule-specific recognition sites which allow addressability within the microstructure.
2. Funktionselement nach Anspruch 1 , wobei die Mikrostruktur unter Einschluss mindestens eines Biomolekül-stabilisierenden A- gens, insbesondere mindestens eines proteinstabilisierendes A- gens, gebildet ist.2. Functional element according to claim 1, wherein the microstructure is formed including at least one biomolecule-stabilizing A gene, in particular at least one protein-stabilizing A gene.
3. Funktionselement nach Anspruch 1 oder 2, wobei die dreidimensional angeordneten Schichten eine Dicke von 10 nm bis 10 μm, bevorzugt 50 nm bis 2,5 μm, insbesondere 100 nm bis 1 ,5 μm aufweist.3. Functional element according to claim 1 or 2, wherein the three-dimensionally arranged layers has a thickness of 10 nm to 10 .mu.m, preferably 50 nm to 2.5 .mu.m, in particular 100 nm to 1, 5 microns.
4. Funktionselement nach Anspruch 2 oder 3, wobei das proteinstabilisierende Agens ein Saccharid ist, insbesondere Sucrose, Lactose, Glucose, Trehalose oder Maltose, oder ein Polyalkohol ist, insbesondere Inositol, Ethylenglykol, Glyzerol, Sorbitol, Xylitol, Man- nitol oder 2-Methyl-2,4-pentandiol, oder eine Aminosäure ist, insbesondere Natriumglutamat, Prolin, α-Alanin, ß-Alanin, Glyzin, Lysin- HCL oder 4-Hydroxyprolin, oder ein Polymer ist, insbesondere PoIy- ethylenglykol, Dextran oder Polyvinylpyrrolidon, oder ein anorgani- sches Salz ist, insbesondere Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat oder Natriumflurid, oder ein organi- sches Salz ist, insbesondere Natriumacetat, Natriumpolyethylen, Natriumcaprylat, Propionat, Lactat oder Succinat, oder Trimethyla- min-N-oxid, Sarcosin, Betain, gamma-Aminobuttersäure, Octopin, Alanopin, Strombin, Dimethylsulfoxid oder Ethanol ist, oder ein Ge- misch davon ist.4. Functional element according to claim 2 or 3, wherein the protein stabilizing agent is a saccharide, in particular sucrose, lactose, glucose, trehalose or maltose, or a polyalcohol, in particular inositol, ethylene glycol, glycerol, sorbitol, xylitol, man nitol or 2- Is methyl-2,4-pentanediol, or an amino acid, in particular sodium glutamate, proline, α-alanine, β-alanine, glycine, lysine-HCL or 4-hydroxyproline, or is a polymer, in particular polyethylene glycol, dextran or polyvinylpyrrolidone, or an inorganic salt, in particular sodium sulfate, ammonium sulfate, potassium phosphate, magnesium sulfate or sodium fluoride, or an organic is salt, in particular sodium acetate, sodium polyethylene, sodium caprylate, propionate, lactate or succinate, or trimethylamine N-oxide, sarcosine, betaine, gamma-aminobutyric acid, octopine, alanopine, strombin, dimethyl sulfoxide or ethanol, or a mixture it is.
5. Funktionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mikrostruktur einen Flächenabschnitt der Trägeroberfläche abdeckt und mindestens einer der Flächen-Längen-Parameter des abgedeckten Flächenabschnitts der Trägeroberfläche kleiner als 999 μm und mindestens 10 nm ist.5. Functional element according to one of claims 1 to 4, wherein the microstructure covers a surface portion of the support surface and at least one of the surface-length parameters of the covered surface portion of the support surface is less than 999 microns and at least 10 nm.
6. Funktionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Träger und/oder die Oberfläche des Trägers aus einem Metall, Metalloxid, Polymer, Halbleitermaterial, Glas und/oder Keramik besteht.6. Functional element according to one of claims 1 to 5, wherein the carrier and / or the surface of the carrier consists of a metal, metal oxide, polymer, semiconductor material, glass and / or ceramic.
7. Funktionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Oberfläche des Trägers planar oder vorstrukturiert ist, wobei der Träger undurchlässig und/oder porös sein kann.7. Functional element according to one of claims 1 to 6, wherein the surface of the carrier is planar or prestructured, wherein the carrier may be impermeable and / or porous.
8. Funktionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Oberfläche des Trägers eine Schicht einer chemischen Verbin- düng aufweist, die eine unspezifische Anlagerung von biologischen Molekülen an der Trägeroberfläche verhindert.8. Functional element according to one of claims 1 to 7, wherein the surface of the carrier has a layer of a chemical compound düng, which prevents nonspecific attachment of biological molecules to the support surface.
9. Funktionseiement nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zwischen der Trägeroberfläche und der Mikrostruktur eine Schicht eines Verbindungsmittels angeordnet ist. 9. Functional element according to one of claims 1 to 8, wherein between the support surface and the microstructure, a layer of a connecting means is arranged.
10. Funktionselement nach Anspruch 9, wobei das Verbindungsmittel ein Polymer mit geladenen oder ungeladenen chemisch reaktiven Gruppen ist, wobei das Verbindungsmittel ein schwacher oder ein starker Polyelektrolyt ist, wobei das Verbindungsmittel insbeson- dere Poly(diallyl-dimethyl-ammoniumchlorid), ein Natriumsalz der Poly(styrolsulfonsäure), ein Natriumsalz der Poly(vinylsulfonsäure), Poly(allylamin-hydrochlorid), lineares oder verzweigtes Po- ly(ethylenimin), Poly(acrylsäure), Poly(methacrylsäure) oder ein Gemisch davon ist.10. Functional element according to claim 9, wherein the bonding agent is a polymer having charged or uncharged chemically reactive groups, wherein the bonding agent is a weak or a strong polyelectrolyte, wherein the bonding agent, in particular poly (diallyl-dimethyl-ammonium chloride), a sodium salt of Poly (styrenesulfonic acid), a sodium salt of poly (vinylsulfonic acid), poly (allylamine hydrochloride), linear or branched poly (ethyleneimine), poly (acrylic acid), poly (methacrylic acid), or a mixture thereof.
11. Funktionselement nach Anspruch 10, wobei das Polymer ein Hydrogel ist.11. The functional element of claim 10, wherein the polymer is a hydrogel.
12. Funktionselement nach Anspruch 9, wobei das Verbindungsmittel eine Plasmaschicht mit geladenen oder ungeladenen chemisch reaktiven Gruppen oder ein Self-Assembled Monolayer auf Silan-.Thiol-, Phosphat- oder Fettsäurebasis ist.12. Functional element according to claim 9, wherein the connecting means is a plasma layer with charged or uncharged chemically reactive groups or a self-assembled monolayer on silane .Thiol-, phosphate or fatty acid-based.
13. Funktionselement nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Verbindungsmittel durch Änderung des pH-Wertes, der lonen- konzentration oder der Temperatur schaltbar ist.13. Functional element according to one of claims 9 to 12, wherein the connecting means by changing the pH, the ion concentration or the temperature is switchable.
14. Funktionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Nanopartikel einen Kern und eine die molekülspezifischen Erkennungsstellen aufweisende Oberfläche umfassen.14. Functional element according to one of claims 1 to 13, wherein the nanoparticles comprise a core and a surface having the molecule-specific recognition sites.
15. Funktionselement nach Anspruch 14, wobei ein oder mehrere biologisch aktive Moleküle an den molekülspezifischen Erkennungsstellen kovalent und/oder nicht-kovalent gebunden sind. 15. Functional element according to claim 14, wherein one or more biologically active molecules at the molecule-specific recognition sites are covalently and / or non-covalently bound.
16. Funktionselement nach Anspruch 15, wobei die Moleküle unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität gebunden sind.The functional element of claim 15, wherein the molecules are bound to retain their biological activity.
17. Funktionselement nach Ansprüche 15 oder 16, wobei es sich bei den gebundenen Molekülen um Proteine, Proteinkomplexe, Nuc- leinsäuren, PNA-Moleküle, Fragmente davon und/oder eine Kombination davon handelt.17. The functional element according to claims 15 or 16, wherein the bound molecules are proteins, protein complexes, linoleic acids, PNA molecules, fragments thereof and / or a combination thereof.
18. Funktionselement nach Anspruch 17, wobei die Proteine Antikörper, Antigene, Enzyme, Cytokine, Rezeptoren oder Strukturproteine sind.18. Functional element according to claim 17, wherein the proteins are antibodies, antigens, enzymes, cytokines, receptors or structural proteins.
19. Funktionselement nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die molekülspezifischen Erkennungsstellen ein oder mehrere erste funktionelle Gruppen und die gebundenen Moleküle die ersten funktionellen Gruppen bindende komplementäre zweite funktionelle Gruppen umfassen.19. The functional element of claim 14, wherein the molecule-specific recognition sites comprise one or more first functional groups and the bound molecules comprise the complementary second functional groups that bind the first functional groups.
20. Funktionselement nach Anspruch 19, wobei die ersten funktionellen Gruppen und die die ersten funktionellen Gruppen bindenden komplementären zweiten funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aktivester, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimi- dogruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thi- oestergruppe, Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthi- obiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallche- latkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.20. The functional element of claim 19, wherein the first functional groups and the first functional group-binding complementary second functional groups are selected from the group consisting of active ester, alkyl ketone group, aldehyde group, amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, hydrazine group, hydrazide group, Thiol group, thioester group, oligohistidine group, Strep-Tag I, Strep-Tag II, destiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin.
21. Funktionselement nach Anspruch 19 oder 20, wobei die ers- ten und die zweiten funktionellen Gruppen durch molekulares Prägen erzeugt sind. 21. Functional element according to claim 19 or 20, wherein the first and the second functional groups are produced by molecular imprinting.
22. Funktionselement nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , wobei die ersten funktionellen Gruppen Bestandteil eines Spacers sind o- der über Spacer mit der Oberfläche der Nanopartikel verbunden sind.22. Functional element according to one of claims 19 to 21, wherein the first functional groups are part of a spacer o- are connected via spacers with the surface of the nanoparticles.
23. Funktionselement nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , wobei die komplementären zweiten funktionellen Gruppen Bestandteil eines Spacers sind oder über Spacer mit den Molekülen verbunden sind.23. Functional element according to one of claims 19 to 21, wherein the complementary second functional groups are part of a spacer or are connected via spacers with the molecules.
24. Funktionselement nach einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei der Kern der Nanopartikel aus einem organischen Material besteht oder dieses enthält.24. Functional element according to one of claims 14 to 23, wherein the core of the nanoparticles consists of or contains an organic material.
25. Funktionselement nach Anspruch 24, wobei das organische Material ein organisches Polymer ist.25. The functional element of claim 24, wherein the organic material is an organic polymer.
26. Funktionselement nach Anspruch 24 oder 25, wobei das or- ganische Polymer Polypropylen, Polystyrol, Polyacrylat oder ein Gemisch davon ist.26. A functional element according to claim 24 or 25, wherein the organic polymer is polypropylene, polystyrene, polyacrylate or a mixture thereof.
27. Funktionselement nach einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei der Kern aus einem anorganischen Material besteht oder dieses enthält.27. Functional element according to one of claims 14 to 23, wherein the core consists of or contains an inorganic material.
28. Funktionselement nach Anspruch 27, wobei das anorganische Material ein Metall wie Au1 Ag oder Ni, Silicium, SiO2, SiO, ein Silikat, AI2O3, SiO2^AI2O3, Fe2O3, Ag2O, TiO2, ZrO2, Zr2O3, Ta2O5, Zeolith, Glas, Indiumzinnoxid, Hydroxylapatit, ein Q-Dot oder ein Gemisch davon ist. 28. Functional element according to claim 27, wherein the inorganic material is a metal such as Au 1 Ag or Ni, silicon, SiO 2 , SiO, a silicate, Al 2 O 3 , SiO 2 ^ Al 2 O 3 , Fe 2 O 3 , Ag 2 O, TiO 2 , ZrO 2 , Zr 2 O 3 , Ta 2 O 5 , zeolite, glass, indium-tin oxide, hydroxyapatite, a Q-dot, or a mixture thereof.
29. Funktionselement nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei der Kern eine Größe von 5 nm bis 500 nm aufweist.29. Functional element according to one of claims 24 to 28, wherein the core has a size of 5 nm to 500 nm.
30. Funktionselement nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei der Kern mindestens eine zusätzliche Funktion aufweist.30. Functional element according to one of claims 24 to 29, wherein the core has at least one additional function.
31. Funktionselement nach Anspruch 30, wobei die zusätzliche Funktion im Kern verankert ist und eine Fluoreszenzmarkierung, eine UVΛ/is-Markierung, eine superparamagnetische Funktion, eine ferromagnetische Funktion und/oder eine radioaktive Markierung ist.The functional element of claim 30, wherein the additional function is anchored in the nucleus and is a fluorescent label, a UVΛ / is label, a superparamagnetic function, a ferromagnetic function and / or a radioactive label.
32. Funktionselement nach Anspruch 30, wobei die Oberfläche des Kerns mit einer die ersten funktionellen Gruppen enthaltenden organischen oder anorganischen Schicht modifiziert ist, die eine Fluoreszenzmarkierung, eine UV/Vis-Markierung, eine superparamagnetische Funktion, eine ferromagnetische Funktion und/oder eine radioaktive Markierung aufweist.32. The functional element of claim 30, wherein the surface of the core is modified with an organic or inorganic layer containing the first functional groups, which is a fluorescent label, a UV / Vis label, a superparamagnetic function, a ferromagnetic moiety and / or a radioactive label having.
33. Funktionselement nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei die Oberfläche des Kerns eine chemische Verbindung aufweist, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung der immobilisierten Moleküle und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbin- düng an den Kern dient.33. Functional element according to one of claims 30 to 32, wherein the surface of the core has a chemical compound for the steric stabilization and / or for preventing a conformational change of the immobilized molecules and / or for preventing the addition of another biologically active compound to fertil serves the core.
34. Funktionselement nach Anspruch 33, wobei die chemische Verbindung ein Polyethylenglykol, ein Oligoethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon ist.34. The functional element of claim 33, wherein the chemical compound is a polyethylene glycol, an oligoethylene glycol, dextran or a mixture thereof.
35. Funktionselement nach einem der vorhergehenden Ansprü- che, wobei die gebundenen Moleküle einen Marker aufweisen. 35. Functional element according to one of the preceding claims, wherein the bound molecules have a marker.
36. Funktionselement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an die gebundenen Moleküle weitere Moleküle gebunden sind.36. Functional element according to one of the preceding claims, wherein further molecules are bound to the bound molecules.
37. Funktionselement nach einem der vorhergehenden Ansprü- che, wobei auf der Trägeroberfläche mehrere Mikrostrukturen angeordnet sind, die aus Nanopartikeln mit unterschiedlichen molekülspezifischen Erkennungsstellen bestehen.37. Functional element according to one of the preceding claims, wherein on the carrier surface a plurality of microstructures are arranged, which consist of nanoparticles with different molecule-specific recognition sites.
38. Funktionselement nach Anspruch 37, wobei an den Mikrostrukturen unterschiedliche Moleküle gebunden sind.38. The functional element according to claim 37, wherein different molecules are bound to the microstructures.
39. Funktionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 38, erhältlich durch Auftragen einer oder mehrerer Mikrostrukturen auf die Trägeroberfläche unter Verwendung eines Nadel-Ring-Printers, oder erhältlich durch Auftragen einer oder mehrerer Mikrostrukturen auf die Trägeroberfläche unter Verwendung eines lithografischen Ver- fahrens, wobei bevorzugt das lithographische Verfahren Photolithographie oder Mikropen-Lithographie ist, oder erhältlich durch Auftragen einer oder mehrerer Mikrostrukturen auf die Trägeroberfläche unter Verwendung eines Tintenstrahlverfahrens, oder erhältlich durch Auftragen einer oder mehrerer Mikrostrukturen auf die Träger- Oberfläche unter Verwendung eines Mikrokontaktdruckverfahrens.39. Functional element according to one of claims 1 to 38, obtainable by applying one or more microstructures on the support surface using a needle-ring printer, or obtainable by applying one or more microstructures on the support surface using a lithographic process, wherein preferably, the lithographic process is photolithography or micro-pen lithography, or obtainable by applying one or more microstructures to the support surface using an ink jet process, or obtainable by applying one or more microstructures to the support surface using a microcontact printing process.
40. Verfahren zur Herstellung eines Funktionselementes nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf die Oberfläche eines Trägers mindestens eine Schicht eines Verbindungsmittels und danach mindestens eine dreidimensionale mehrschichtige Mik- rostruktur enthaltend Nanopartikel mit molekülspezifischen Erkennungsstellen aufgetragen und vorher, gleichzeitig oder anschließend das mindestens eine proteinstabilisierende Agens in die Mikrostruktur eingebracht wird.40. A method for producing a functional element according to any one of the preceding claims, wherein applied to the surface of a support at least one layer of a bonding agent and then at least one three-dimensional multilayer microstructure containing nanoparticles with molecule-specific recognition sites and before, simultaneously or subsequently the at least one protein stabilizing agent is introduced into the microstructure.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Oberfläche des Trägers vor dem Auftragen der Verbindungsmittel-Schicht gereinigt und/oder aktiviert wird.41. The method of claim 40, wherein the surface of the carrier is cleaned and / or activated prior to application of the bonding agent layer.
42. Verfahren nach Anspruch 41 , wobei die Trägeroberfläche chemisch aktiviert wird.42. The method of claim 41, wherein the support surface is chemically activated.
43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Trägeroberfläche mit Ladungen versehen wird.43. The method of claim 42, wherein the carrier surface is provided with charges.
44. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, wobei die Trägeroberfläche durch Aufbringen eines Primers aktiviert wird.44. The method of claim 42 or 43, wherein the carrier surface is activated by applying a primer.
45. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, wobei eine SeIf- Assembly-Schicht auf die Trägeroberfläche aufgebracht wird.45. The method of claim 42 or 43, wherein a SeIf assembly layer is applied to the carrier surface.
46. Verfahren nach Anspruch 41 , wobei die Trägeroberfläche mit- tels eines Plasmas aktiviert wird.46. The method of claim 41, wherein the support surface is activated by means of a plasma.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 46, wobei auf die Trägeroberfläche eine bezüglich Form und Fläche definierte Verbindungsmittel-Schicht aufgebracht wird und der Träger danach in eine Nanopartikel-Suspension eingetaucht wird, so dass durch Anhaften der Nanopartikel an der aufgebrachten Verbindungsmittel-Schicht eine bezüglich Form und Fläche definierte Mikrostruktur erzeugt wird.47. The method according to claim 40, wherein a bonding agent layer defined in terms of shape and area is applied to the carrier surface and the carrier is then immersed in a nanoparticle suspension such that the nanoparticles adhere to the applied bonding agent layer a microstructure defined in terms of shape and area is generated.
48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei die bezüglich Form und Fläche definierte Verbindungsmittel-Schicht mittels eines Nadel- Ring-Printers, eines lithografischen Verfahrens, eines Tintenstrahl- verfahrens oder eines Mikrokontaktdruckverfahrens aufgetragen wird.48. The method according to claim 47, wherein the bonding agent layer defined in terms of shape and area is conveyed by means of a needle Ring printers, a lithographic process, an ink jet method or a micro contact printing method is applied.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 48, wobei der Träger in eine Suspension oder Lösung des Verbindungsmittels eingetaucht wird, so dass eine die gesamte Trägeroberfläche abdeckende Verbindungsmittel-Schicht erzeugt wird, und danach die Na- nopartikel so aufgetragen werden, dass eine bezüglich Form und Fläche definierte Mikrostruktur erzeugt wird.49. A method according to any one of claims 40 to 48, wherein the carrier is immersed in a suspension or solution of the bonding agent so as to form a bonding agent layer covering the entire backing surface, and then the nanoparticles are applied so that one respects Shape and surface defined microstructure is generated.
50. Verfahren nach Anspruch 49, wobei die bezüglich Form und Fläche definierte Mikrostruktur mittels eines Nadel-Ring-Printers, eines lithografischen Verfahrens, eines Tintenstrahlverfahrens oder eines Mikrokontaktdruckverfahrens aufgetragen wird.50. The method of claim 49, wherein the microstructure defined in terms of shape and area is applied by means of a needle-ring printer, a lithographic process, an inkjet process or a microcontact printing process.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 50, wobei das Verbindungsmittel und die Nanopartikel mehrmals auf die Trägeroberfläche aufgebracht werden.51. The method according to any one of claims 40 to 50, wherein the bonding agent and the nanoparticles are applied several times on the carrier surface.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 51 , wobei vor, nach oder vor und nach dem Aufbringen der Nanopartikel biologisch aktive Moleküle an die molekülspezifischen Erkennungsstellen der Nanopartikel gebunden werden.52. The method according to any one of claims 40 to 51, wherein biologically active molecules are bound to the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles before, after or before and after the application of the nanoparticles.
53. Verfahren nach Anspruch 52, wobei die Bindung der biologisch aktiven Moleküle an die molekülspezifischen Erkennungsstellen der Nanopartikel erfolgt, indem die erste funktionelle Gruppen aufweisenden molekülspezifischen Erkennungsstellen der Nanopar- tikel mit den die ersten funktionellen Gruppen bindenden, komplementären zweiten funktionellen Gruppen aufweisenden Molekülen derart in Kontakt gebracht werden, dass kovalente und/oder nicht- kovalente Bindungen zwischen den funktionellen Gruppen der molekülspezifischen Erkennungsstellen und der Moleküle erfolgen.53. The method of claim 52, wherein the binding of the biologically active molecules to the molecule-specific recognition sites of the nanoparticles takes place by the first functional molecule-specific recognition sites of the nanoparticles tikel having the first functional group-binding, complementary second functional groups having molecules be contacted in such a way that covalent and / or non-covalent bonds between the functional groups of the molecule-specific recognition sites and the molecules take place.
54. Verfahren nach Anspruch 53, wobei die ersten funktionellen Gruppen und die die ersten funktionellen Gruppen bindenden komplementären zweiten funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aktivester, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogrup- pe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.54. The method of claim 53, wherein the first functional groups and the first functional group-binding complementary second functional groups are selected from the group consisting of active ester, alkyl ketone group, aldehyde group, amino group, carboxy group, epoxy group, maleimido group, hydrazine group, hydrazide group, Thiol group, thioester group, oligohistidine group, Strep tag I, Strep tag II, desthiobiotin, biotin, chitin, chitin derivatives, chitin binding domain, metal chelate complex, streptavidin, streptactin, avidin and neutravidin.
55. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 54, wobei die biologisch aktiven Moleküle unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität gebunden werden.55. The method of any one of claims 52 to 54, wherein the biologically active molecules are bound to retain their biological activity.
56. Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 55, wobei es sich bei den Molekülen um Proteine, Proteinkomplexe, Antigene, Nuc- leinsäuren, PNA-Moleküle oder Fragmente davon handelt.56. Method according to claim 52, wherein the molecules are proteins, protein complexes, antigens, nucleic acids, PNA molecules or fragments thereof.
57. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der An- Sprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselementes, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 zur Durchführung eines Detektionsverfahrens.57. Use of a functional element according to any one of arrival claims 1 to 39 or a functional element, prepared by a method according to any one of claims 40 to 56 for carrying out a detection method.
58. Verwendung nach Anspruch 57, wobei das Detektionsverfah- ren MALDI-Massenspektrometrie, Fluoreszenz- oder UV-Vis- Spektroskopie, Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie, Wellenleiterspektroskopie, Impedanzspektroskopie oder ein anderes ma- senspektrometrisches, optiales, gravimetrisches oder elektrisches Verfahren oder eine Kombination davon ist.58. Use according to claim 57, wherein the detection method is MALDI mass spectrometry, fluorescence or UV-vis spectroscopy, fluorescence or light microscopy, waveguide spectroscopy, impedance spectroscopy or another mathematical senspektrometrisches, optiales, gravimetric or electrical method or a combination thereof.
59. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der Ansprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselementes, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 zur Steuerung der Zelladhäsion oder des Zellwachstums.59. Use of a functional element according to any one of claims 1 to 39 or a functional element, prepared by a method according to any one of claims 40 to 56 for the control of cell adhesion or cell growth.
60. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der Ansprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselementes, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 zur Entwick- lung von pharmazeutischen Präparaten.60. Use of a functional element according to any one of claims 1 to 39 or a functional element, prepared by a method according to any one of claims 40 to 56 for the development of pharmaceutical preparations.
61. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der Ansprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselementes hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 zur Analyse der Wirkungen und/oder Nebenwirkungen von pharmazeutischen Präparaten.61. Use of a functional element according to any one of claims 1 to 39 or a functional element prepared by a method according to any one of claims 40 to 56 for analyzing the effects and / or side effects of pharmaceutical preparations.
62. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der Ansprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselementes hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 zur Diagnose von Krankheiten.62. Use of a functional element according to any one of claims 1 to 39 or a functional element prepared by a method according to any one of claims 40 to 56 for the diagnosis of diseases.
63. Verwendung nach Anspruch 62, wobei das Funktionselement zur Identifizierung von Krankheitserregern eingesetzt wird.63. Use according to claim 62, wherein the functional element is used for the identification of pathogens.
64. Verwendung nach Anspruch 62, wobei das Funktionselement zur Identifizierung von mutierten Genen bei einem Menschen oder einem Tier eingesetzt wird. 64. The use of claim 62, wherein the functional element is used to identify mutant genes in a human or animal.
65. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der Ansprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselements hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 zur Analyse der mikrobiologischen Kontamination von Proben.65. Use of a functional element according to any one of claims 1 to 39 or a functional element produced by a method according to any one of claims 40 to 56 for analyzing the microbiological contamination of samples.
66. Verwendung nach Anspruch 65, wobei die Probe eine Wasser- oder Bodenprobe ist.66. Use according to claim 65, wherein the sample is a water or soil sample.
67. Verwendung nach Anspruch 65, wobei die Probe aus einem Nahrungsmittel oder Tierfutter stammt.Use according to claim 65, wherein the sample is derived from a food or animal feed.
68. Verwendung eines Funktionselementes nach einem der An- Sprüche 1 bis 39 oder eines Funktionselementes, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 56 als Elektronikbaustein in einem Biocomputer.68. Use of a functional element according to any one of the claims 1 to 39 or a functional element, produced by a method according to one of claims 40 to 56 as an electronic component in a biocomputer.
69. Verfahren zur Identifizierung und/oder Nachweis eines Analy- ten in einer Lösung oder Suspension, wobei in einem ersten Verfah- rensschritt a) ein Funktionselement nach einem der Ansprüchen 1 bis 39 bereitgestellt wird, anschließend in einem zweiten Verfahrensschritt b) das Funktionselement mit der Analyt-haltigen Lösung oder Suspension in Kontakt gebracht wird und anschließend in einem dritten Verfahrensschritt c) mittels einer biokompatiblen Waschflüssig- keit nicht-gebundener Analyt von dem Funktionselement entfernt und anschließend in einem vierten Verfahrensschritt d) ein Nachweisverfahren durchgeführt.69. Method for identifying and / or detecting an analyte in a solution or suspension, wherein in a first method step a) a functional element according to one of claims 1 to 39 is provided, then in a second method step b) the functional element The analyte-containing solution or suspension is brought into contact and then in a third step c) by means of a biocompatible washing liquid non-bound analyte of the functional element removed and then carried out in a fourth step d) a detection method.
70. Verfahren nach Anspruch 69, wobei die biokompatible Waschflüssigkeit Wasser oder physiologische Kochsalzlösung ist. 70. The method of claim 69, wherein the biocompatible wash fluid is water or physiological saline.
71. Verfahren nach einem der Ansprüche 69 oder 70, wobei das in Schritt d) durchgeführte Nachweisverfahren ein Fluoreszenznachweisverfahren oder ein MALDI-Massenspektrometrieverfahren ist.71. The method of claim 69, wherein the detection method performed in step d) is a fluorescence detection method or a MALDI mass spectrometry method.
72. Verfahren nach Anspruch 71 , wobei das durchgeführte Nachweisverfahren ein Fluoreszenznachweisverfahren ist und wobei der Analyt und/oder das gebundene biologische Molekül fluoreszenzmarkiert ist. 72. The method of claim 71, wherein the performed detection method is a fluorescence detection method and wherein the analyte and / or the bound biological molecule is fluorescently labeled.
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