EP1824998A1 - Methode d'adressage d'acides nucleiques vers des plastes - Google Patents

Methode d'adressage d'acides nucleiques vers des plastes

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Publication number
EP1824998A1
EP1824998A1 EP05822884A EP05822884A EP1824998A1 EP 1824998 A1 EP1824998 A1 EP 1824998A1 EP 05822884 A EP05822884 A EP 05822884A EP 05822884 A EP05822884 A EP 05822884A EP 1824998 A1 EP1824998 A1 EP 1824998A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
seq
rna
nucleic acid
plastid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05822884A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Chantal Arar
Richard De Rose
Anne Duprat
Jacques Joyard
Maryse NICOLAÏ
Christophe Robaglia
Norbert Rolland
Daniel Salvi
Rodnay Sormani
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoplante Valor SAS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Genoplante Valor SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Genoplante Valor SAS filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1824998A1 publication Critical patent/EP1824998A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation

Definitions

  • the invention relates to nucleic acid sequences naturally imported into a plant cell plastid, and their use for targeting an RNA sequence of interest to a plant cell plastid, thus allowing expression in particular. of a protein of interest in a plant cell plastid.
  • subcellular mRNA localization is a key mechanism for directing gene products to individual subcellular compartments, or to specific regions of a cell or embryo, constituting thus an important mechanism for post-transcriptional regulation of gene expression.
  • This phenomenon of mRNA localization occurs in both unicellular organisms, animals and plants. Mechanisms that may contribute to this subcellular location of mRNA have been reviewed by Kloc et al. (2002).
  • Plastids are semi-autonomous organelles that exhibit great structural diversity and contain unique biosynthetic pathways.
  • chloroplasts are thought to be from an endosymbiosis between a photosynthetic bacterium and a eukaryotic cell. The proper functioning of this association requires a high level of integration between the chloroplast genome and the cellular genome of the plant.
  • Many chloroplast genes have been transferred to the nucleus of the host cell and the proteins encoded by these genes are then imported into the chloroplast (Martin and Herrmann 1998, Joyard et al. Chloroplast activity also regulates the expression of these genes at the transcriptional and post-transcriptional levels (Surpin et al., 2002, Petracek et al., 1997).
  • plastid function is highly dependent on proteins that are encoded in the nucleus, translated into the cytoplasm, and imported into plastids. Indeed, most of the genes encoding plastid proteins are nuclear and the proteins are translocated to plastids through a protein import machinery contained in the membrane of the plastid envelope. Surprisingly, the importation of RNA molecules from the nucleus or cytoplasm of the host cell to plastids has never been observed, despite the recognized role of RNA localization in the regulation of gene expression.
  • RNA sequences serving for the translocation of the genes in the chloroplasts are transformed with a CLS (Chloroplast Localization Sequence) of viral origin whose sequences are preferentially chosen from the sequences of the ASBVd, PLMVd, CChMVd, CChMVd or still ELVd and are never untransformed and / or endogenous RNA sequences as in the present invention.
  • CLS Chloroplast Localization Sequence
  • RNAs transcribed in the plant cell nucleus can be translocated to plastids, in particular to chloroplasts.
  • RNA of interest can be specifically addressed to a plant cell plastid by fusing this RNA of interest with a transcript of a nuclear gene detected in the plastids.
  • the transformation of plant cells with such a construction therefore makes it possible to translocate the RNA of interest to a plastid, then to express in the plastid the protein encoded by this RNA of interest.
  • the mRNA addressing mechanism to plastids identified by the inventors thus represents an alternative to the transformation of the plastid genome, in particular the chloroplast genome, used until now for a directed production of recombinant proteins in these organelles.
  • nucleic acid means a phosphate ester of a polymeric form of ribonucleosides (adenosine, guanosine, uridine or cytidine, "RNA molecules”) or of deoxyribonucleosides (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine, gold).
  • deoxycytidine; "DNA molecules”) or any phosphoester analogue thereof, such as phosphorothioates and thioesters, in single-stranded or double-stranded form.
  • An "addressing nucleic acid” is a DNA or RNA molecule whose transcribed sequence is that of a gene which is localized in the nucleus of a plant cell (ie a nuclear gene) and which produces by transcription a messenger RNA (mRNA) which is translocated from the nucleus to a plastid of said plant cell.
  • mRNA messenger RNA
  • transcribed sequence refers to an RNA sequence that is obtainable by transcription of a DNA sequence, or that has the sequence of a reference RNA sequence.
  • the addressing nucleic acid is a DNA molecule
  • the transcribed sequence is an mRNA sequence that derives from the sequence of the DNA molecule. If the nucleic acid of addressing is already an RNA molecule, the transcribed sequence is that of the RNA molecule.
  • An addressing nucleic acid is therefore characterized by a transcribed sequence which is that of an mRNA of a nuclear gene, said mRNA being naturally detectable in a plastid of a plant cell.
  • Said mRNA may have a predominantly cytoplasmic localization, a predominantly plastid localization, or be localized in equivalent amounts in the cytoplasm and in a plastid of the cell.
  • said mRNA has a predominantly plastid localization; its concentration in a plastid is then greater than its cytoplasmic concentration.
  • Said addressing nucleic acid is then characterized by a transcribed sequence which is that of an mRNA of a nuclear gene, said mRNA being characterized by a concentration in a plastid greater than its cytoplasmic concentration.
  • a "nucleic acid of interest” designates a DNA or RNA molecule whose transcribed sequence is to be addressed (if it is a DNA molecule) or that it is desired to address (if it is an RNA molecule) to a plastid of a plant cell.
  • Plasti an ovoid or spherical organelle a few microns long and delimited by a double membrane or envelope. Plasti are specific to plant cells and some Protists. These organelles have the role of synthesis and or storage of molecules. Plasti include the chloroplast which is the organelle in which photosynthesis takes place, the amyloplast where starch is stored, the etioplast in non-chlorophyllous tissues such as roots, the gerontoplast present in senescent tissues , the chromosplast that accumulates the pigments, and the proplast which is at the origin of the other plastids.
  • the inventors have demonstrated that, in plant cells, the mRNAs of certain nuclear genes have a subcellular localization at the level of plastids. These results show that there is a mechanism of translocation of mRNA from the nucleus and / or the cytosol of the plant cells to the plastids. In addition, constructs comprising such mRNA fused with a nucleic acid sequence of interest are also found at the plastid level. These results thus show that the transcripts of these nuclear genes constitute sequences of addressing towards plast ⁇ s.
  • nuclear genes having a transcript localized in plastids is particularly useful for translocating nucleic acid sequences of interest, particularly RNA sequences, to specific subcellular plastid compartments.
  • the invention therefore relates to a method of addressing an RNA of interest to a plastid of a plant cell, said method comprising the transformation of a plant cell with a nucleic acid of interest linked to a nucleic acid of addressing whose transcribed sequence is that of an mRNA of a nuclear gene, said mRNA being detectable in a plastid.
  • the nucleic acid for addressing has, for the sequence transcribed, the sequence of an mRNA of a nuclear gene that is endogenous to said plant cell.
  • the plastid may be selected from the group consisting of chloroplast, amyloplast, etioplast, gerontoplast, chromosplast and proplast.
  • said plastid is a chloroplast.
  • a given mRNA in a plastid of a plant cell is within the abilities of those skilled in the art.
  • extraction of plastid RNAs isolated from plant cells can be performed, and the presence of a given mRNA can be sought by hybridization with a probe specific for the mRNA.
  • the amount of mRNA isolated in a plastid can be compared to the quantity present in the rest of the cell, ie the cytosol and all the organelles other than the plastid (s) considered (s). ), or the amount present in total RNAs extracted from whole cells (cytoplasmic concentration).
  • said mRNA is characterized by a concentration in a plastid greater than its cytoplasmic concentration.
  • the concentration in a plastid of said mRNA is at least 2 times greater than its cytoplasmic concentration.
  • the determination of the respective concentrations of the mRNA in the plastid and the cytoplasm can be carried out according to the methods described in the present application.
  • the inventors have thus identified, by an on-chip screening study, a reproducible list of highly enriched nuclear messengers in the plastid fractions, in particular chloroplasts, of plant cells.
  • These mRNAs, as well as the genomic DNA sequences or the cDNAs of these nuclear genes - once transcribed - therefore constitute nucleic acids making it possible to address an RNA to which they are linked to a plastid compartment.
  • an addressing nucleic acid according to the invention has a DNA or RNA sequence whose transcribed sequence is that of an mRNA of a nuclear gene selected from the group consisting of one of the identified genes. in one of Tables I 1 II, III, or IV.
  • TAIR Access Numbers is the gene access number identified in the Arabidopsis Information Resource (TAIR) database (http://www.arabidopsis.org) that was formed from the sequencing of the Arabidopsis thaliana genome. . Board
  • At5g47250 disease resistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease resistance protein.
  • CC-NBS-LRR class At5g47250 disease resistance protein
  • putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease resistance protein.
  • At5g16770 myb DNA binding protein (AtMYB9)
  • At4g 16920 disease resistance protein TIR-NBS-LRR class
  • putative domain signature TIR-NBS-LRR exists, suggestive of a disease resistance protein
  • At4g23030 MATE efflux protein - related contains Pfam profile PF01554: Uncharacterized membrane protein family
  • At4g1 O51 O subtilisin-like serine protease contains similarity to subtilase; SP1 Gl: 9957714 from [Oryza sativa]
  • At3g 13290 transducin / WD-40 repeat protein family contains 2 WD-40 repeats (PF00400); autoantigen HUMAUTANT locus (GI: 533202) [Homo sapiens] and autoantigen locus HSU17474 (Gl: 596134) [Homo sapiens]
  • At5g08520 expressed protein contains similarity to l-box binding factor
  • At4g07340 contains similarity to Xenopus laevis replication protein A1 (SW: RFA 1 XENLA) At5g47790 expressed protein
  • At5g56160 cytosolic factor family (phosphoglyceride transfer protein family) similar to SEC14 cytosolic factor (SRP45816) [Candida lipolytica]
  • At3g59200 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At1g26930 Kelch repeat containing F-box protein family contains Pfar ⁇ rPF01344 Kelch motif, Pfam: PF00646 F-box domain
  • At1g53290 galactosyltransferase family contains Pfam profile: PF01762
  • RNA Recognition Pattern (RNA Recognition Pattern) (RRM)
  • At3g61510 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase putative similar to ACC synthases from Citrus sinensis [Gl: 6434142], Cucumis melo [GI: 695402], Cucumis sativus [Gl: 3641645]
  • At3g46020 RNA-binding protein, putative similar to Cold-inducible RNA-binding protein (Glycine-rich RNA-binding protein CIRP) from ⁇ Homo sapiens ⁇ SP
  • At3g20280 expressed protein contains Pfam profile: PF00628 PHD-finger, implications for chromatin-mediated transcriptional regulation
  • At4g 13650 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
  • At4g13810 disease resistance protein family contains leucine rich-repeat domains Pfam: PF00560, INTERPRO: IPR001611; similar to disease resistance protein [Lycopersicon esculentum] gi
  • At5g04220 C2 domain-containing protein GC donor splice site at exon 3; similar to Ca2 + - dependent lipid-binding protein (CLB1) GI: 2789434 from [Lycopersicon esculentum] '
  • At5g07650 formin homology 2 (FH2) domain-containing protein contains formin homology 2 domain, Pfam: PF02128
  • At5g60060 F-box protein family various predicted proteins, Arabidopsis thaliana; SKP1 interacting partner 2 (SKIP2) TIGR_Ath1: At5g67250
  • At5g14070 glutaredoxin protein family contains INTERPRO Domain IPR002109, Glutaredoxin (thioltransferase)
  • auxin response transcription factor 7 identical to auxin response factor 7 Gl: 4104929 from [Arabidopsis thaliana]
  • At1g61960 expressed protein similar to hypothetical protein G1: 5541664 from [Arabidopsis thaliana]
  • At2g14630 hypothetical protein contains PFAM profile PF03004: Transposase plant (Ptta / En / Spm family)
  • At5g16230 acyl-racyl-carrier-proteinini desaturase (stearoyl-ACP desaturase).
  • putative N c access Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR
  • At5g53210 bHLH protein family contains similarity to helix-loop-helix DNA-binding protein
  • At5g51030 short-chain dehydrogenase / reductase family protein contains INTERPRO family IPR002198 short chain dehydrogenase / reductase SDR family
  • At5g67540 glycosyl hydrolase family 43 contains similarity to xylanase Gl: 2645416 from [Caldicellulosiruptor saccharolyticus]
  • At5g50030 expressed protein contains similarity to pollen specific protein Bnm1 Brassica napus Gl: 1857671; contains Pfam profile PF04043: Plant invertase / pectin methylesterase inhibitor
  • At5g05190 expressed protein similar to
  • At2g33530 serine carboxypeptidase -related
  • At2g43690 receptor kinase kinase putative similar to receptor-like kinase LECRK1 [Arabidopsis thaliana] gi
  • UIpI protease family contains Pfam profile PF02902: UIpI protease family, C-terminal catalytic domain
  • At1g52700 hypothetical protein contains similarity to lysophospholipase GI: 1552244 from [Rattus norvegicus] '
  • At1g50980 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At2g 14520 CBS domain containing protein contains Pfam profiles PF00571: Domain CBS, PF01595: Domain of unknown function
  • At2g19190 light repressible protein kinase receptor putative similar to light repressible Access # Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR
  • At1g12190 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • WAK-like kinase contains similarity to serine / threonine kinase gb
  • At4g04400 hypothetical protein contains Pfam profile PF03384: Drosophila protein of unknown function, DUF287
  • At2g46740 FAD-linked oxidoreductase family strong similarity to At1g32300, At5g56490, At2g46750, At2g46760; contains PFQ1565: FAD binding domain
  • At1g62630 disease resistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease resistance protein.
  • At4g28630 ABC carry family protein identical to half-molecule ABC carry ATM 1 Gl: 9964117 from [Arabidopsis thaliana]
  • AtCg00320 trnfM tRNA-Phe
  • At1g04070 expressed a protein similar to the hypothetical mitochondrial import receptor subunit Z98597 from S. pombe. ESTs gb
  • At1g78100 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At1g34300 expressed protein contains similarity to receptor-like protein kinase Gl: 6979335 from [Qryza sativa]
  • At2g22290 GTP-binding protein putative similar to GTP-binding protein GI: 550072 from Homo sapiens
  • At3g24230 polysaccharide lyase family 1 (pectate lyase) similar to pectate iyase GP: 14531296 from [Fragaria x ananassaj
  • RNA-binding protein putative similar to RNA-binding protein from- [Nicotiana tabacum] Gl: 15822703, [Nicotiana sylvestris] Gl: 624925; contains Pfam profile: PF00076 RNA pattern recognition, (aka RRM, RBD, or RNP domain) Access # Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR region-binding protein [Homo sapiens] Gl: 12642795; contains Pfam profile PF00856: SET domain
  • At4g22170 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At4g30680 MA3 domain-containing protein similar to SP
  • At4g26660 expressed probable protein kinesin - Arabidopsis thaliana, Pir2: H71402
  • At4g33400 Dem-defused protein Dem (defective embryo and meristems) protein - Lycopersicon esculentum, PID: e321604
  • At4g24050 short-chain dehydrogenase / reductase family protein contains INTERPRO family IPR002198 short-chain dehydrogenase / reductase (SDR) superfamily
  • At5g03180 C3HC4-type zinc finger protein family various predicted proteins, Arabidopsis thaliana; contains Pfam profile PF00097: Zinc finger, C3HC4 type (RING finqer)
  • At5g65310 homeobox-leucine zipper protein ATHB-5 (HD-Zip protein ATHB-5) single to homeobox-leucine zipper protein ATHB-5 (HD-ZIP protein ATHB-5) (SP: P46667) [Arabidopsis thaliana]
  • At5g59940 CHP-rich zinc finger protein putative large number of predicted zinc finger proteins, Arabidopsis thaliana, Homo sapiens and others
  • At2g03820 nonsense-mediated m RNA decay protein -related
  • At5g44750 expressed protein contains DNA-damage-inducible protein P
  • At2g24950 hypothetical protein contains Pfam profile PF03080: Arabidopsis proteins of unknown function
  • At3g14517 pseudogene similar to L1 repeat, subfamily Tf, member 30 (LINE-element) [Mus musculus] (GB: NP_038605)
  • At1g56110 nucleolar protein Nop56 putative similar to XNop56 protein [Xenopus laevis] Gl: 14799394; contains PFam profile PF01798: Putative snoRNA binding domain
  • At5g66910 disease resistance protein DC-NBS-LRR class
  • putative domain signature Access # Description homologous genes identified in other organisms
  • At1g64460 phosphatidylinositol 3- and 4-kinase family contains PFAM profile PF00454: Phosphatidylinositol 3- and 4-kinase
  • At2g47490 mitochondrial carrier protein family contains Pfam profile: PF0Q153 mitochondrial carrier protein
  • At3g24700 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At3g46160 protein kinase-related contains eukaryotic protein kinase domain, INTERPRO: 1PR000719
  • At3g43200 pseudogenic, putative protein predicted proteins Arabidopsis thaliana
  • At3g10970 haloacid dehalogenase-like hydrolase [Zea mays] Gl: 10444400; contains interPro accession IPR005834: Haloacid dehalogenase-like hydrolase
  • At3g11320 phosphate translocator-related low similarity to phosphoenolpyruvate / phosphate translocator precursor [Mesembryanthemum crystallinum] G1: 9295275, phosphate translocator [Nicotiana tabacum] GI: 403023; contains Pfam profile: PF00892 Integra! pro membrane?
  • At4g27680_ expressed protein MSP1 protein Saccharomyces cerevisia, PIR2: A49506 At4g00670 hypothetical protein
  • At5g09560 RNA binding proteins, Arabidopsis thaliana
  • At5g47290 myb family transcription factor contains PFAM profile: PF00249 myb-like DNA binding domain
  • At1g21310 extensin family protein contains extensin-like region, Pfam: PF04554
  • acyl CoA diacylglycerol acyltransferase
  • At3g23280 auxin-regulated protein contains Pfam profile: PF00023 ankyrin repeat
  • At1g31150 expressed protein IS gb
  • At1g55550 kinesin-related protein Similar to Kinesin proteins; Contains kinesin motor domain protein pattern and kinesin heavy chain signature pattern
  • At2g14810 hypothetical protein At2g31470 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At3g06400 DNA-dependent ATPase, putative similar to DNA-dependent ATPase SNF2H Mus musculus GI: 14028669; contains Pfam profiles PF00271: Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain, PF00249: Myb-like DNA-binding domain
  • At3g04430 No apical meristem (NAM) protein family similar to CUC1 (GP: 12060422) ⁇ Arabidopsis thaliana ⁇
  • At2g39880 myb family transcription factor contains Pfam profile: PF00249 myb-like DNA-binding domain
  • At2g44210 expressed protein Pfam profile PF03080 Arabidopsis proteins of unknown function
  • At4g10040 cytochrome c several cytochrome c plant (for instance cucurbit, PIR1: CCPU)
  • At5g54130 calcium-binding E-hand family protein contains I NTERPRO: IPR002048 calcium-binding EF-hand domain
  • At5g 16530 auxin efflux carrier protein family contains auxin efflux carrier domain, Pfam: PF03547
  • At1g51150 DegP protease contains similarity to DegP2 protease Gl: 13172275 from [Arabidopsis thaiiana]
  • Nicotinamine synthase putative similar to Nicotinamine synthase [Lycopersicon esculentum] [GI: 4753801], Nicotinamine synthase 2 [Hordeum
  • At1g80300 adenine nucleotide translocase identical to adenine nucleotide translocase GB-.Z49227 [Thalianal Arabidopsis (FEBS Lett 374 (3), 351-355 (1995))
  • At1g17260 ATPase 10 membrane-type plasma (proton pump 10) (proton-exporting ATPase), putative strong similarity to SP
  • At3g27690 light harvesting chlorophyll A / B binding protein putative similar to chlorophyll A- Access # Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR
  • At1g06380 expressed protein similar to hypothetical protein Gl: 6598642 from [Arabidopsis thaliana]
  • GSA 2 glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase 2
  • GSA-AT 2 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase 2
  • GSA 1 At5g63570 glutamate-1-semialdehyde 2.1-aminomutase 1 (GSA 1) (glutamate-1-semialdehyde aminotransferase 1) (GSA-AT 1) identical to GSA 1 [SP]
  • At5g44020 vegetative storage protein-related
  • At1g12170 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • RNA helicase / RNAsell1 CAF protein [Arabidopsis thaliana] GI: 6102610; contains PFAM profiles PF00270: DEAD / DEAH box helicase, PF00271: Helicase conserved C-terminal domain
  • At1g55570 pectinesterase pectin methylesterase family similar to pectinesterase [Lycopersicon esculentum] [GI: 1944575]; BP10 protein [SP l At1g14000 protein kinase -related
  • At2g47460 Myb family transcription factor similar to myb-related DNA-binding protein Gl: 1020155 from [Arabidopsis thaliana]
  • Atomic acid induced protein (TWA) (TWA) (TWA) (TWA) (TWA) (TWA) (TWA) (TWA) (TLC) (TLC) (SEQ ID NO: 1) [SEQ ID NO: 1] [Phaseolus aureus]
  • At2g36840 ACT domain-containing protein contains Pfam profile ACT domain PF01842
  • At2g37080 myosin heavy chain -related
  • At3g21933 pseudogene contains Pfam profile: PF01657 Domain of unknown function
  • At3g 17470 calcium-binding EF-hand family protein contains INTERPRO: IPR002048 calcium-binding EF-hand domain
  • vacuolar ATP synthase subunit E related similar to vacuolar ATP synthase subunit E GB: Q39258 [Arabidopsis thaliana]
  • At4g 15040 subtilisin-like serine protease contains similarity to prepro-cucumizin GI: 807698 from [Cucumis melo] __
  • At5g54310 ARF GAP-like zinc finger-containing protein (ZIGA3) almost identical to ARF GAP-like zinc finger-containing protein ZIGA3 Gl: 10441352 from [Arabidopsis thaliana]
  • At4g13510 ammonium transport protein (AMT1) At4g13510 ammonium transport protein (AMT1)
  • At4g02630 protein kinase family contains protein kinase domain-, Pfam: PF00069; contains serine / threonine protein kinase domain, INTERPRO: IPR002290
  • Kelch repeat-containing protein low similarity to mgB protein, Dictyostelium discoideum, PIR: S68824; contains Pfam profile PF01344: Kelch pattern
  • At1g80050 adenine phosphoribosyltransferase almost identical to adenine phosphoribosyltransferase GI: 1402894 from [Arabidopsis thaliana]
  • At1g03590 protein phosphatase 2C similar to GB: AAB97706
  • At2g33580 protein kinase -related contains a protein kinase domain profile (PDOC00100)
  • At3g09600 myb family transcription factor contains Pfam profile: PF00249 myb-like DNA-binding domain
  • RNA Recognition Pattern (RRM) - containing protein contains InterPro entry 1PR000504: RNA-binding Region RNP-1 (RNA Recognition Pattern) (RRM)
  • At3g61510 1-aminocyclopropane-i-carboxylate synthase (ACC synthase), putative similar to ACC synthases from Citrus sinensis [Gl: 6434142], Cucumis melo [GI: 695402], Cucumis sativus [Gl: 3641645]
  • At3g46020 RNA-binding protein, putative similar to Cold-inducible RNA-binding protein (Glycine-rich RNA-binding protein CIRP) from ⁇ Homo sapiens ⁇ SP
  • At4g 13650 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
  • At5g04220 C2 domain-containing protein GC donor splice site at exon 3; similar to Ca2 + - dependent lipid-binding protein (CLB1) Gl: 2789434 from [Lycopersicon esculentum]
  • auxin response transcription factor 7 identical to auxin response factor 7 Gl: 4104929 from [Arabidopsis thaliana]
  • At1g61960 expressed protein similar to hypothetical protein G1: 5541664 from [Arabidopsis thaliana]
  • At2g 14630 hypothetical protein contains PFAM profile PF03004: Transposase plant (Ptta / En / Spm family)
  • At5g 16230 acyl- [acyl-carrier-protein] desaturase (stearoyl-ACP desaturase), putative similar to Acyl- [acyl-carrier protein] desaturase from Spinacia oleracea SP
  • At1g22170 expressed protein contains similarity to phosphoglycerate mutases
  • At3g49400 transducin / WD-40 repeat protein family contains 4 WD-40 repeats (PF00400); low similarity (47%) to Agamous-like MADS box protein AGL5 (SP: P29385) ⁇ Arabidopsis thaliana ⁇
  • At1g22210 trehalose-6-phosphate phosphatase, putative similar to trehalose-6-phosphate phosphatase (AtTPPB) GI: 2944180 from [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile PF02358: Trehalose phosphatase
  • At1g08100 high-affinity nitrate carry ACH2 identical to GB: AAC35884 from N 'of access Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR
  • At5g59640 serine / threonine-specific protein kinase - like putative protein serine / threonine kinase, Sorghum bicolor, EMBLSBRLK1
  • At5g42910 ABA-responsive element binding protein
  • At3g42480 Hypothetical protein hypothetical proteins - Arabidopsis thaliana
  • At4g24530 PsRTI 7-1 like protein PsRTI 7-1, Pisum sativum (pea), PATX: G1778376
  • WAK-like kinase contains similarity to serine / threonine kinase gb
  • At4g04400 hypothetical protein contains Pfam profile PF03384: Drosophila protein of unknown function, DUF287
  • At2g46740 FAD-linked oxidoreductase family strong similarity to At1g32300, At5g56490, At2g46750, At2g46760; contains PF01565: FAD binding domain
  • At1g62630 disease resistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease resistance protein.
  • At4g28630 ABC carry family protein identical to half-molecule ABC carry ATM 1 Gl: 9964117 from [Arabidopsis thaliana]
  • At1g04070 expressed a protein similar to the hypothetical mitochondrial import receptor subunit Z98597 from S. pombe. ESTs gb
  • At1g78100 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At1g11220 expressed protein contains similarity to a cotton fiber expressed protein GB-.AAC33276 from [Gossypium hirsutum]
  • At2g22290 GTP-binding protein putative similar to GTP-binding protein G1: 550072 from [Homo sapiens]
  • At2g45280 RAD51 C DNA repair protein -related
  • At3g46170 short chain dehydrogenase / reductase family protein contains similarity to 3-oxoacyl- [acyl-carrier protein] reductase SP: P51831 from [Bacillus subtilis]
  • At2g32430 galactosyltransferase family contains Pfam profile: PF01762 galactosyltransferase
  • At1q03060 putataive transport protein Similar to gb
  • At1g16190 DNA repair protein RAD23 putative similar to DNA repair by nucleotide excision (NER) RAD23 protein, isoform II Gl: 1914685 from [Daucus carota]
  • At5g66020 hypothetical non-consensus protein AT donor splice site at exon 7, TA donor splice site at exon 10, AT acceptor splice at exon 13, strong similarity to unknown protein
  • At2g43420 3-beta hydroxysteroid dehydrogenase / isomerase family contains Pfam profile PF01073 3-beta hydroxysteroid dehydrogenase / isomerase domain; similar to NAD (P) -dependent steroid dehydrogenase from Homo sapiens [SP]
  • At3g52200 dihydrolipoamide S-acetyltransferase (LTA3); nuclear gene encoding mitochondrial protein annotation based on on supporting cDNA gi
  • RNA pattern recognition - containing protein low similarity to splicing factor SC35 [Arabidopsis thaliana] Gl: 9843653; contains InterPro entry IPR000504: RNA-binding region RNP-1 (RNA recognition pattern) (RRM)
  • At3g06270 protein phosphatase 2C (PP2C), putative similar to protein phosphatase-2C (PP2C) GB: AAC36699 [Mesembryanthemum crystallinum]; contains Pfam orofile: PF00481 protein phosphatase 2C
  • At3g61600 POZ domain protein family contains Pfam PF00651: BTB / POZ domain; contains Interpro IPR000210 / PS50097: BTBB / POZ domain; TOZOBI (Gl: 12006855) [Arabidopsis thaliana]; similar to actinfilin ((31: 21667852) [Rattus norv?
  • At5g44040 expressed protein similar to unknown protein
  • At5g41060 DHHC-type zinc finger domain-containing protein contains Pfam profile N 0 Access Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR
  • DHHC-type zinc finger domain-containing protein contains PFAM profile PF01529: DHHC zinc finqer domain
  • At1g23460 polygalacturonase putative similar to polygalacturonase GB: BAA88472 G 1: 6624205 from (Cucumis sativus)
  • At2g41040 expressed protein at2g15050 lipid transfer protein putative similar to SP
  • At3g20030 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At4g26660 expressed probable protein kinesin - Arabidopsis thaliana, Pir2: H71402
  • At4g37710 expressed protein predicted protein Arabidopsis thaliana
  • At5g59940 CHP-rich zinc finger protein putative large number of predicted zinc finger proteins, Arabidopsis thaliana, Homo sapiens and others
  • cytochrome P450 putative similar to cytochrome P450 (CYP93A1) GI: 1435059 from [Glycine max]
  • At1g55880 pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzyme, beta family similar to SP
  • leucine rich repeat protein family contains leucine rich-repeat (LRR) Pfam domains: PF00560, INTERPRO: IPR001611; similar to Hcr2-0B [Lycopersicon esculentum] gi
  • At3g04460 expressed protein similar to peroxisomal biogenesis factor 12 GB: NP_000277 [Homo sapiens]
  • At4g07770 pseudogene similar to L1 repeat, subfamily Tf, member 30 (LINE-element) [Mus musculus] (GB: NP_038605)
  • At2g43640 signal recognition particle protein 14kD, ATSRP14 -related
  • At5g49270 expressed protein contains similarity to phytochelatin synthetase
  • At1g37045 an Arabidopsis thaliana hypothetical protein, which contains similarity to retrotransposon Athila (UK: AF076275) -related temporary automated functional assignment
  • At5g61700 ABC carry family protein ABC family carrier, Entamoeba histolytica, EMBL ⁇ H058
  • At1g31150 expressed protein IS gb
  • At1g55550 kinesin-related protein Similar to Kinesin proteins; Contains kinesin motor domain protein pattern and kinesin heavy chain signature pattern
  • AtPase SNF2H ATPase putative similar to DNA-dependent ATPase [Mus musculus] GI: 14028669; contains Pfam profiles PF00271: Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain, PF00249: Myb-like DNA-binding domain
  • At3g 16360 two-component phosphorelay mediator -related similar to two-component phosphorelay mediators (ATHP1-3) GB: BAA37110, GB: BAA37111, GB: BAA37112 [Arabidopsis thaliana]
  • At5g42130 mitochondrial carrier protein family contains Pfam profile: PF00153 mitochondrial carrier protein
  • At5g40220 MADS-box protein MADS-protein box, Arabidopsis thaliana, EMBLATY12776
  • At1g18120 pseudogenic, putative myrosinase-associated protein
  • UIpI protease family contains Pfam profile PF02902: UIpI protease family, C-terminal catalytic domain; Similar To At5g28170, At1g35110, At1g44880, At3g42530, At4g19320, At5g36020, At3g43010, At2g10350
  • At1g06520 phospholipid / glycerol acyltransferase family contains Pfam profile PF01553: Acyltransferase
  • At1g54550 F-box protein family contains Pfam: PF00646 F-box domain; contains TIGRFAM TIGR01640: F-box protein interaction domain
  • At4g30300 ABC carry family protein ribonuclease L inhibitor - Mus musculus, PIR2: JC6555
  • At5g 12970 C2 domain-containing protein contains INTERPRO: IPR000008 C2 domain
  • At5g 13080 WRKY family transcription factor DNA binding protein - Solanum tuberosum, EMBLAJ278507
  • At5g43270 squamosa promoter binding protein-related 2 (emb
  • At1g54760 MADS-box protein similar to MADS-box transcription factor Gl: 4837612 from [Antirrhinum majus]
  • At5g 15650 reversibly glycosylated polypeptide-3
  • At3g05240 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
  • ERD3 protein [Arabidopsis thaliana] Gl: 15320410; contains Pfam profile PF03141: Putative methyltransferase
  • At2g27240 expressed protein contains Pfam profile PF01027: Uncharacterized protein family UPF0005
  • At2g07240 UIpI family protease contains Pfam profile PF02902: UIpI family protease, C-terminal catalytic domain
  • At3g16010 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
  • At3g01930 expressed protein similar to the nodule-specific protein NIJ70 GB: AAC39500 [Lotus japonicus]
  • At4g31980 expressed protein EREBP-4 homolog Arabidopsis thaliana
  • At4g37170 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
  • At4g33030 UDP-sulfoquinovose synthase (sulfite: UDP-glucose sulfotransferase) (sulfolipid biosynthesis protein) (SQD1) identical to gi: 2736155
  • At5g06540 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
  • At5g37200 C3HC4-type zinc finger protein family low similarity to ring-H2 finger protein RHYIa from Arabidopsis thaliana [gi: 3790593], ring finger-H2 protein from Xenopus laevis [gi: 13752371]; contains Pfam domain zinc finger, C3HC4 type (RING finger) PF00097
  • At4g13170 6OS Ribosomal Protein L13A (RPL13aC) Ribosomal Protein L13a -Lupinus luteus, PID: e1237871
  • At1g60095 jacalin lectin family contains smnilarity to myrosinase-binding protein homolog [Arabidopsis thaliana] Gl: 2997767;
  • At1g01880 hypothetical protein contains similarity to DNA repair endonuclease GB: AAD47568 Gl: 5712619 from [Drosophila melanogasteri]
  • At1g35650 UIpI family protease PF02902 UIpI family protease, C-terminal catalytic domain; Similar to At1g21020, At3g26530, At1g08760, At1g08740, At2g29240
  • At2g 13230 retro-pol polprotein -related
  • At3g05340 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains I NTE RPRQ: I PR002885 PPR repeats
  • At3g02630 acyl- [acyl-carrier-protein] desaturase (stearoyl-ACP desaturase), putative similar to Acyl- [acyl-carrier protein] desaturase from Sesamum indicum Gl: 575942, Cucumis sativus SP
  • At4g03560 two-pore calcium channel (TPC1) single to two-pore calcium channel (TPC1) [Arabidopsis thaliana] gi
  • At5g 13680 protein expressed to similar protein (ref
  • At5g48700 ubiquitin family contains INTERPRO: IP R000626 ubiquitin domain
  • At5g23230 isocho ⁇ ' smatase hydrolase family low similarity to SP
  • At5g56040 leucine rich repeat protein kinase, putative contains leucine rich repeat (LRR) domains, Pfam: PF00560; contains protein kinase domain, Pfam: PF00069
  • At3g23955 pseudogene, similar to hypothetical protein GB: AAD29066
  • At1g31090 hypothetical protein contains similarity to gi
  • At1g74190 leucine rich repeat protein family contains leucine rich-repeat (LRR) Pfam domains: PF00560, INTERPRO: IPR00161 1; contains similarity to Cf-2.1 [Lycopersicon pimpinellifolium] gi
  • At3g26310 cytochrome P450 family contains Pfam profile: PF00067 cytochrome P450
  • At1g18750 MADS-box protein similar to homeodomain transcription factor (AGL30) GI: 3461830 from [Arabidopsis thaliana]
  • At2g39880 myb family transcription factor (MYB25) contains Pfam profile: PF00249 myb-like DNA-binding domain
  • At2g44210 expressed protein Pfam profile PF03080 Arabidopsis proteins of unknown function
  • At5g43670 protein transport protein SEC23 At5g43670 protein transport protein SEC23
  • auxin efflux carrier protein family contains auxin efflux carrier domain Pfam: PF03547
  • Nicotinamine synthase putative similar to Nicotianamine synthase [Lycopersicon esculentum] [GI: 4753801], Nicotinamine synthase 2 [Hordeum vulgare] [Gl: 4894912]
  • RNA Recognition Pattern (RRM) - containing protein contains InterPro entry IPR000504: RNA-binding region RNP-1 (RNA recognition pattern) (RRM); similar to GB: AAC33496
  • UIpI family protease contains Pfam profile PF02902: UIpI family protease, C-terminal catalytic domain
  • Cytochrome P450 86A1 Cytochrome P450 86A1 (CYPLXXXVI) (P450-dependent fatty acid omega-hydroxylase) (SP: P48422) [Arabidopsis thaliana]
  • At5g 16070 chaperonin putative similar to SWISS-PROT: P80317 T-complex protein 1, subunit zeta (TCP-1-zeta) [Mus musculus]; contains Pfam: PF00118 domain, TCP- 1 / cpn60 chaperonin family
  • At3g52680 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At1g37150 biotin holocarboxylase synthetase -related similar to biotin holocarboxylase synthetase GI: 4874309 from [Arabidopsis thaliana] contains non-consensus GG acceptor splice sites.
  • Atomic acid protein AAC12874 [Synechococcus PCC7942]
  • At1g16420 At1g79330, At1g79330, At1g79330, At1g79330, At1g79330; similar to latex-abundant protein [GI: 4235430] [Hevea brasiliensis]
  • auxin-responsive protein IAA13 (Indoleacetic acid-induced protein 13) identical to SP
  • At3g62680 proline-rich protein family contains proline-rich region, INTERPRO: IPR000694
  • At3g22180 DHHC-type zinc finger domain-containing protein contains PFAM profile PF01529: DHHC zinc finger domain
  • At3g21465 adenyl cyclase -related similar to adenyl cyclase GB: AAB87670 from [Nicotiana tabacum]
  • At1g10870 ARF GTPase-activating domain-containing protein
  • NAM No apical meristem (NAM) protein family contains Pfam PF02365: No apical meristem (NAM) domain
  • At2g32140 disease resistance protein TIR class
  • putative domain signature TIR exists, suggestive of a disease resistance protein.
  • At2g47280 family pectinesterase contains Pfam profile: PF01095 pectinesterase
  • At2g44310 calcium-binding EF-hand family protein contains INTERPRO: IPR002048 calcium-binding EF-hand domain
  • GNAT N-acetyltransferase
  • At3g20840 egg development protein putative similar to egg development protein AINTEGUMENTA (GI: 1209099) [Arabidopsis thaliana]
  • At3g46670 glucosyltransferase-related protein UDP-glucose glucosyltransferase - Arabidopsis thaliana, EMBL.-AB016819
  • Inositol polyphosphate 5-phosphatase II IP5PH inositol polyphosphate 5-phosphatase II [Arabidopsis thaliana] GI: 10444263 Isoform contains an AT-acceptor splice site at intron 6
  • At1g80480 expressed protein contains Viral RNA helicase domain
  • At4g10510 subtilisin-like serine protease contains similarity to subtilase; SP1 Gl: 9957714 from [Oryza sativa]
  • At5g05670 signal recognition particle receptor beta subunit-related protein
  • At1g53290 galactosyltransferase family contains Pfam profile: PF01762 galactosyltransferase; contains similarity to Avr9 elicitor response protein Gl: 4138265 from [Nicotiana tabacum]
  • At ⁇ g 16770 myb DNA binding protein (AtMYB9)
  • At3g59200 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At3g43380 Hypothetical protein hypothetical proteins - Arabidopsis thaliana
  • At5g38120 4-coumarate CoA ligase (4-coumaroyl-CoA synthase) family similar to 4CL2, Arabidopsis thaliana [gi: 12229665], 4Cl1, Nicotiana tabacum [gi: 12229631]; contains Pfam AMP-binding enzyme PF00501
  • At4g07750 transposon protein -related similar to putative Arabidopsis thaliana En / Spm transposon protein (GB: AC005396)
  • At1g36180 acetyl-CoA carboxylase -related similar to Gl: 1100253 from [Arabidopsis thaliana]
  • At4g30370 C3HC4-type zinc finger protein family contains Pfam profile: PF00097 zinc finger, C3HC4 type (RING finger)
  • At5g56410 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • At3g 13290 transducin / WD-40 repeat protein family contains 2 WD-40 repeats (PF00400); autoantigen HUMAUTANT locus (GI: 533202) [Homo sapiens] and autoantigen locus HSU17474 (Gl: 596134) [Homo sapiens]
  • At4g24690 ubiquitin-associated (UBA) / PB1 domain-containing protein contains Pfam profiles PF00627: Ubiquitin-associated (UBA) ITS-N domain, PF00569: Zinc finger type ZZ domain, PF00564: PB1 domain
  • At5g52610 F-box protein family contains F-box domain Pfam: PF00646
  • Homoe sapiens Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens, Homoe sapiens
  • At5g46180 ornithine-oxo-acid aminotransferase (omithin aminotransferase / omithine ketoacid aminotransferase), putative similar to SP
  • At5g47250 disease resistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease resistance protein.
  • At5g51440 heat shock protein putative similar to heat shock 22 kDa protein, precursor mitochondrial SP: Q96331 from [Arabidopsis thaliana]
  • At1g23720 proline-rich protein family contains proline-rich extensin domains, INTERPRO: IPR002965
  • At2g31380 knows tolerance-like protein
  • At5g49160 DNA cytosine-5) -methyltransferase (DNA methyltransferase) (DNA metase) (sp N 0 Access Description (homologous genes identified in other organisms) TAIR
  • At4g 13900 disease resistance protein family contains leucine rich-repeat domains Pfam: PF00560, INTERPRO: IPR001611; similar to Cf-4A protein [Lycopersicon esculentum]
  • At5g56160 cytosolic factor family (phosphoglyceride transfer protein family) similar to cytosolic factor SEC14 (SP: P45816) [Candida lipolytica]
  • 26S proteasome regulatory subunit S12 (RPN8), putative contains similarity to 26s proteasome regulatory subunit s12 (proteasome subunit p40) (mov34 protein) SP: P26516 from [Mus musculus]
  • At3g07440 expressed protein is hits to genscan model
  • At5g08520 expressed protein contains similarity to l-box binding factor
  • At4g07340 contains similarity to Xenopus laevis replication protein A1 (SW: RFA1_XENLA)
  • At1g54480 leucine rich repeat protein family contains leucine rich-repeat (LRR) Pfam domains: PF00560, INTERPRO: IPR001611; contains similarity to disease resistance protein Gl: 3894383 from [Lycopersicon esculentum]
  • LRR leucine rich-repeat
  • At4g34570 bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase 2 (DHFR-TS) (THY-2) identical to SP
  • At2g 14630 hypothetical protein contains PFAM profile PF03004: Transposase plant (Ptta / En / Spm family)
  • At3gO8943 pseudogene importin beta subunit similar to importin-betai GB: BAA34861, importin-beta2 GB: BAA34862 [Oryza sativa]; frameshift
  • At2g41970 protein kinase putative similar to Pto kinase interactor 1 (serine / threonine protein kinase) [Lycopersicon esculentum]
  • AtCg00040 matK maturase
  • At1g17170 glutathione transferase putative One of three repeated putative glutathione transferases. 72% identical to glutathione transferase [Arabidopsis thaliana]
  • AtCg00960 rrn4.5S 23S ribosomal RNA
  • At2g43640 signal recognition protein particle 14kD, ATSRP14 -related
  • At5g61700 ABC carry family protein ABC family transporter, Entamoeba histolytica, EMBLEH058
  • AtCgOI 050 ndhD NADH dehydrogenase subunit 4
  • At2g24640 ubiquitin carboxyl terminal hydrolase -related
  • At3g2519O integral membrane protein -related contains Pfam profile: PF01988 integral membrane protein; similar to nodulin-21 GB: CAA34506 [Glycine max]
  • At5g55050 GDSL-motif lipase / hydrolase protein similar to family II lipases EXL3 Gl: 15054386, EXL1 Gl: 15054382, EXL2 Gl: 15054384 from [Arabidopsis thaliana]; contains PFAM profile PF00657: GDSL-like Lipase / Acylhydrolase
  • At2g33330 expressed protein contains Pfam PF01657: Domain of unknown function
  • said targeting nucleic acid has a transcribed sequence which is that of an mRNA of a gene selected from the group consisting of the genes shown in Table V.
  • the genes shown in Table V correspond to the gene encoding the eukaryotic factor of initiation of the elF4E translation and to a selection of genes in Table III having an expression differential in favor of stroma versus chloroplast, in favor of stroma versus total RNA, and in favor of chloroplast versus total RNAs .
  • said addressing nucleic acid has a transcribed sequence which is that of a mRNA of the gene coding for the eukaryotic translation initiation factor elF4E (SEQ ID No.41) and / or its homologs in other species and more particularly in tomato and chilli (patent WO03 / 066900).
  • the transcribed sequence of the addressing nucleic acid used to implement the method according to the invention is preferably that of a mRNA of a nuclear gene that is endogenous (that is to say present naturally in the genome nuclear cell that is transformed) or that is exogenous to the plant cell (for example a nuclear gene whose mRNA was detected in a plastid in a cell belonging to another plant species than that of the transformed cell).
  • the nuclear gene is endogenous to the transformed plant cell.
  • nucleic acid of interest linked to a nucleic acid for addressing it is meant that the nucleic acid of interest and the nucleic acid of addressing are genetically linked, that is to say that they are part of of the same nucleotide construct (DNA, RNA or mixed DNA / RNA).
  • said nucleic acid of interest is fused to said nucleic acid for addressing.
  • the nucleic acid of interest may be a DNA or RNA sequence.
  • the addressing nucleic acid can be a DNA or RNA sequence.
  • the nucleic acid of interest related to the addressing nucleic acid may be a mixed DNA / RNA nucleic acid.
  • the nucleic acid of interest and the nucleic acid of addressing are both a DNA sequence.
  • the nucleic acid of interest and the nucleic acid of addressing are both an RNA sequence.
  • the plant cell can be transformed with a nucleic acid of interest linked to an addressing nucleic acid so as to obtain stable expression of at least said nucleic acid of interest.
  • the nucleic acid of interest linked to an addressing nucleic acid can be in the form of a construct comprising a DNA sequence of interest linked to an addressing DNA sequence. said construct being integrated into the nuclear genome of the plant cell. Transcription of this construct into the nucleus produces a transcript comprising an RNA sequence of interest linked to an addressing RNA sequence, the transcript then being directed to a plastid of the transformed cell.
  • the plant cell can also be transformed with a nucleic acid of interest linked to an address nucleic acid so as to obtain a transient expression of at least said nucleic acid of interest and this by methods known to the human the art such as the use of polyethylene glycol (PEG), a nontoxic molecule capable of inducing the destabilization of the plasma membrane and allowing the transfer of DNA therethrough.
  • PEG polyethylene glycol
  • the DNA molecules can then migrate to the nucleus, where some of them, with a greater or lesser efficiency, are likely to integrate into the chromosomes.
  • the DNA can also be encapsulated in liposomes, small artificial vesicles of phospholipids, able to fuse with protoplasts.
  • nucleic acid of interest linked to an addressing nucleic acid can therefore be in the form of a construct comprising an RNA sequence of interest linked to an addressing RNA sequence, said construct being integrated in the cytosol of the plant cell. This RNA construct is then directed to a plastid of the transformed cell.
  • Said nucleic acid of interest may be a sequence encoding a protein, in particular a heterologous protein.
  • heterologous protein is meant a protein that is not expressed by the untransformed plant cell. It could be of a recombinant protein normally expressed in a eukaryotic organism, for example a protein of human, animal or plant origin. It can be in particular:
  • a protein of therapeutic and / or prophylactic interest such as insulin, gastric lipase, collagen, or an allergen
  • a protein conferring resistance to a herbicide such as the precursor of acetolactate synthetase (ALS) (Lee et al., 1988), mutated acetolactate synthetase (Preston and Powles, 2002), or 3- enolpyruvylshikimate-5-phosphate synthetase (EPSP synthetase) (Klee et al., 1987);
  • a protein conferring a capacity to fix nitrogen or increased photosynthesis a protein conferring increased resistance to drought, to salt, or to extreme temperatures, for example;
  • a protein conferring resistance to pathogens such as insects, fungi, bacteria, viruses, etc.
  • pathogens such as insects, fungi, bacteria, viruses, etc.
  • a protease inhibitor for example a trypsin inhibitor (Hilder et al., 1987), a toxin, by for example the toxins of Bacillus thuringiensis (Vaeck et al., 1987, Fischhoff et al., 1987), etc.
  • Said nucleic acid of interest may also be a non-coding sequence, such as an antisense RNA sequence or a DNA sequence whose transcript is an antisense RNA, or an interfering RNA (RNAi, Sharp, 2001).
  • RNAi interfering RNA
  • antisense technology one skilled in the art can refer, for example, to "Antisense DNA and RNA” (CoId Spring Harbor Laboratory, D. Melton, 1988).
  • nucleotide construct comprising the nucleic acids of interest and of addressing can be prepared by any method known to those skilled in the art, for example by in vitro synthesis.
  • the nucleotide construct used to transform the plant cell in the method of addressing according to the invention is also the subject of the present application.
  • the invention more particularly relates to a nucleic acid construct comprising a nucleic acid of interest related to an addressing nucleic acid whose transcribed sequence is that of an mRNA of a nuclear gene selected from the group consisting of genes shown in Table V.
  • the nuclear gene is selected from the group of genes having the coding sequence SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID NoJ, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33, SEQ ID No.35, SEQ ID No.37, SEQ ID No.39 and SEQ ID No.41 identified in Arabidopsis thaliana and / or their homologous sequences in other species.
  • the nucleotide constructs used in the invention may be expression cassettes comprising a nucleic acid sequence of interest linked to a nucleic acid addressing sequence, associated with elements allowing the expression of the sequence.
  • nucleic acid of interest in plant cells including a promoter and a transcription terminator, or an activator. Other elements such as introns, enhancers, polyadenylation sequences and derivatives may also be present.
  • the expression cassette may also contain 5 'untranslated sequences called "leader". Such sequences can improve translation
  • transcription promoters can be used for expression in plant cells. It may be a constitutive promoter, such as the Actin-lntron-actin promoter, corresponding to the 5 'non-coding region of the rice actin 1 gene and its first intron (Mc Elroy et al., 1991; GenBank No. S44221). The presence of the first actin intron makes it possible to increase the level of expression of a gene when it is fused 3 'to a promoter. It can also be an inducible or tissue-specific promoter, for example so that the nucleic acid of interest is only sent to a plastid at certain stages of development of the plant, that under certain environmental conditions, or only in certain target tissues.
  • a constitutive promoter such as the Actin-lntron-actin promoter, corresponding to the 5 'non-coding region of the rice actin 1 gene and its first intron (Mc Elroy et al., 1991; GenBank No. S44221).
  • tissue-specific promoters include the promoter of Chlorella virus regulating the expression of the adenine methyltransferase gene (Mitra and Higgins, 1994) or the cassava mosaic virus promoter (Verdaguer et al., 1998). ) that are expressed primarily in green tissues, or the regulatory elements of the tomato gene2A11 promoter that allow for specific expression in fruits (Van Haaren and Houck, 1991).
  • Terminators include: the terminator 3 'Nos, terminator of the nopaline synthase which corresponds to the 3' non-coding region of the nopaline synthase gene from the plasmid Ti ⁇ 'Agrobacteirum tumefaciens nopaline strain (Depicker et al., 1982), and
  • the nucleic acid of interest may be associated or, if appropriate, consist of a coding sequence for a selection agent.
  • genes that confer resistance to an antibiotic such as hygromycin, kanamycin, bleomycin or streptomycin, or herbicides such as glufosinate, glyphosate or bromoxynil can be used.
  • said gene encoding a selection agent is selected from the bar gene (White et al 1990;. GenBank No. X17220), which confers resistance to the herbicide Basta ® (glufosinate) and the NPTII gene which confers resistance to the kanamycin (Bevan et al., 1983).
  • a vector in particular a plasmid, containing at least one nucleic acid construct as described above.
  • the invention furthermore relates to a cellular host, in particular a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens transformed by said vector.
  • a cellular host e is useful for transfecting plant cells with a vector according to the invention.
  • the invention also relates to a plant cell transformed with a nucleic acid of interest linked to an addressing nucleic acid whose transcribed sequence is that of an mRNA of a nuclear gene, said mRNA being detectable in a plastid.
  • said mRNA is an mRNA of a nuclear gene selected from the group consisting of the genes shown in Table V and the elF4E gene.
  • the transformation of plant cells can be carried out by transfer of a vector into the protoplasts, in particular after incubation of the latter in a solution of polyethylene glycol (PG) in the presence of divalent cations (Ca 2+ ) according to the method described in the article Krens et al. (1982).
  • PG polyethylene glycol
  • Ca 2+ divalent cations
  • the transformation of the plant cells can also be carried out by electroporation, in particular according to the method described in the article by Fromm et al. (1986).
  • the transformation of the plant cells can be carried out using a gene gun allowing the projection, at very high speed, of metal particles covered with the DNA sequences of interest, thus delivering genes within the cell nucleus. , especially according to the technique described in the article by Finer et al. (1992).
  • Another method of transformation of plant cells is that of cytoplasmic or nuclear microinjection.
  • the plant cells are transformed by a vector via a cellular host itself transformed by said vector, the cellular host being capable of infecting said plant cells by allowing integration into the genome of the latter, nucleic acid sequences of interest initially contained in the genome of the aforementioned vector.
  • the cellular host used is Agrobacterium tumefaciens, in particular according to the methods described in the articles by Bevan (1984) and An et al. (1986), or Agrobacterium rhizogenes, especially according to the method described in the article by Robaglia et al. (1987).
  • the transformation of the plant cells is carried out by the transfer of the T region of the Agrobacterium tumefaciens Ti tumor-inducing extrachromosomal circular plasmid, using a binary system (Watson et al., 1994).
  • helper plasmid Ti a modified plasmid that no longer has T-DNA but still contains vir virulence genes, necessary for the transformation of the plant cell. This plasmid is maintained in Agrobacterium.
  • the invention also relates to the production of transgenic plants capable of being regenerated from the transformed plant cell, as well as the transgenic plants thus obtained.
  • the invention also includes plant cells and tissues, as well as organs or parts of plants, including leaves, stems, roots, flowers, fruits, and / or seeds obtained from these plants.
  • the plant cell according to the invention is a plant cell selected from the group consisting of corn, wheat, tomato, tobacco, and rice.
  • the plastid targeting method according to the invention makes it possible to obtain the translocation of an RNA towards a plastid and therefore a localized expression at the level of the plastid of the possibly coded protein. by this RNA.
  • the production of proteins in the plastids of plant cells is advantageous in terms of ease of extraction, but also of stability, since certain proteases would be poorly represented in plastids, and in particular chloroplasts.
  • the invention thus relates to a method for producing at least one protein of interest in a plaste of a plant cell comprising the steps of: a) transforming a plant cell with a nucleic acid encoding a protein of interest related to an addressing nucleic acid, the transcribed sequence of said addressing nucleic acid being that of an mRNA of a nuclear gene, said mRNA being detectable in a plastid of a plant cell; and b) expressing said nucleic acid encoding a protein of interest.
  • the method of production contains an additional step of extracting the plastid proteins by the usual methods known to those skilled in the art.
  • the plastid may be selected from the group consisting of chloroplast, amyloplast, chromosplast, etioplast, gerontoplast, and proplast.
  • said plastid is a chloroplast.
  • said plastid detectable mRNA is characterized by a concentration in a plastid greater than its cytoplasmic concentration. More preferably, the concentration in a plastid of said mRNA is at least 2 times greater than its cytoplasmic concentration.
  • concentration in a plastid of said mRNA is at least 2 times greater than its cytoplasmic concentration.
  • said addressing nucleic acid according to the invention has a DNA or RNA sequence whose transcribed sequence is that of an mRNA of a nuclear gene selected from the group by the genes included in the invention.
  • Table V Said nuclear gene is therefore selected from the group of genes having coding sequence SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.
  • said addressing nucleic acid has a transcribed sequence which is that of a mRNA of the gene coding for the eukaryotic transcription initiation factor elF4E.
  • said nucleic acid encoding a protein of interest is fused to said nucleic acid for addressing.
  • the nucleic acid encoding a protein of interest and the nucleic acid for addressing may both be a DNA sequence.
  • the nucleic acid encoding a protein of interest and the nucleic acid for addressing may also both be an RNA sequence.
  • the plant cell may be transformed with said nucleic acid encoding a protein of interest related to an addressing nucleic acid so as to obtain transient or stable expression of the protein of interest, preferably so as to obtain stable expression.
  • the protein of interest may be a heterologous protein.
  • heterologous protein is meant a protein that is not expressed by the untransformed plant cell. It may be a recombinant protein normally expressed in a eukaryotic organism, for example a protein of bacterial, human, animal or plant origin. It may be in particular a protein of agronomic interest, such as a protein conferring on the plant a resistance to a herbicide (for example Basta), a protein (a toxin or protease, for example) conferring the plant is resistant to pathogens such as insects, fungi, bacteria, viruses, etc, a protein conferring a capacity to fix nitrogen or increased photosynthesis, a protein conferring increased resistance to drought, salt, or extreme temperatures.
  • the protein may also be a protein of industrial interest, such as an enzyme used in agrochemical processes.
  • the protein may also be a protein of therapeutic and / or prophylactic interest, such as insulin for example.
  • the invention is not limited to this method of production and any method known to those skilled in the art can be envisaged.
  • an operon for the production of proteins in the plastid can be envisaged.
  • An operon is a unit for expression and regulation of bacterial genes comprising structural genes and control elements in DNA, recognized by regulatory gene products.
  • the invention also includes the mode of implementation in which the RNA of interest is in the form of an operon type RNA, giving several proteins, after translation into the plastid.
  • a plastid protein production system comprising the lactose operon (inducible operon under negative control) may be used according to one embodiment of the invention.
  • mRNAs transcribed from nuclear genes, which have been localized in plastids, and in particular which are present in plastids with a concentration greater than their cytoplasmic concentration, make it possible to translocate an RNA sequence to which they are bound from the nucleus and / or cytosol of a plant cell to a plastid.
  • the invention thus proposes a method for identifying an RNA capable of addressing an RNA of interest to a plastid of a plant cell, in which the concentration of a candidate RNA in a plastid and in the cytoplasm is determined. of a plant cell, and where RNA capable of addressing an RNA of interest to a plastid of a plant cell is identified, an RNA whose concentration in the plastid is greater than its concentration in the cytoplasm .
  • an RNA capable of addressing an RNA of interest to a plastid of a plant cell an RNA whose concentration in the plastid is at least 2 times greater than its concentration in the cytoplasm is identified.
  • RNAs of interest a methodology as described in Example 1 can be used. For example, a total plastid RNA population and a total RNA population can be labeled, each with cy3 and cy5, respectively. To compare the relative concentration of an X gene in these two populations, one can proceed to a "dye swap", that is to say to respectively hybridize on two slides carrying an oligonucleotide specific for the X gene, mixtures (plastid RNA population) -cy3 + (total RNA population) -cy5 and (plastid RNA population) -cy5 + (total RNA population) -cy3.
  • a "dye swap" that is to say to respectively hybridize on two slides carrying an oligonucleotide specific for the X gene, mixtures (plastid RNA population) -cy3 + (total RNA population) -cy5 and (plastid RNA population) -cy5 + (total RNA population)
  • the level of hybridization to the oligonucleotide is quantified by measuring the mean of the fluorescence intensities cy3 and cy5, normalized by subtracting the local background noise, for the same population of RNA (acquisition of images using ArrayScanner Generation III, Molecular Dynamics, and digitizing images using ImageQuant 5.2, Amersham Biosciences).
  • the relative level of the X gene mRNA in the plastid RNAs relative to the total RNAs is then estimated by calculating the ratio of the mean fluorescence intensity in the plastid RNAs to the average fluorescence intensity in the total RNAs. .
  • an RNA can be identified for which the geometric mean of the average fluorescence intensities, in the plastid and total RNA populations, is greater than -2, and for which the ratio of the average In fluorescence intensity, in the total RNA, on the fluorescence intensity average, in the plastid RNAs is between 0 and 0.5.
  • the crude chloroplasts were obtained from Arabidopsis thaliana leaves according to a method derived from the protocol described by Ferro et al. (Mol CeII Proteomics, 2003). All operations were carried out at 0-5 ° C in buffers devoid of RNAse.
  • the plants (400-500 g of leaves) are placed in the dark at 4 ° C during the night before extraction, washed with deionized water and then dried on filter paper before grinding.
  • the material (400-500 g of leaves per 2 liters of grinding buffer containing: 0.4 M sorbitol, 20 mM tricine-KOH pH 8.4, 10 mM EDTA, 10 mM NaHCO3 and 0.1 mg / mL bovine serum albumin (BSA) degreased) twice 2 seconds in a low speed Waring Blendor.
  • the ground material is rapidly filtered through 4-5 layers of gauze and a layer of blutex nylon.
  • the filtered solution is equitably distributed in 6 centrifuge tubes (500 ml each) and centrifuged at 2070 g for 2 minutes (Sorvall GS 3 rotor). The supernatant is removed and the organelle pellets are taken up in a final volume of washing medium containing: 0.40 M sorbitol, 20 mM tricine-KOH, pH 7.6, 5 mM MgCl 2 , 2.5 mM EDTA. Place the chloroplast suspension (6 ml per tube) on top of the preformed Percoll gradients. Centrifuge the gradients at 13,300 g for 10 min (swinging rotor Sorvall HB-6).
  • the purity of the purified chloroplasts is controlled using different methods.
  • Enzymatic markers for example, Fumarase (EC 4.2.1.2), a marker of mitochondrial contamination; Hydroxypyruvate reductase (EC 1.1.1.81), marker of peroxisome contamination;
  • immunological markers for example, antibodies to the glycine decarboxylase subunit T (marker of mitochondrial contamination); antibodies directed against histone H3 (marker of contamination by nuclei).
  • Proteomic studies which failed to detect proteins derived from nuclei, mitochondria, or cytosol in the envelope of Arabidopsis plastids purified according to this protocol.
  • the chloroplasts read (adjust to a final volume of 21 ml) are deposited at the top of the sucrose gradients (3.5 ml per tube).
  • the tubes are centrifuged at 70000 g for 1 hour (Beckman SW41-T1 rotor). After this centrifugation step, the stroma located at the top of the gradient is taken for nucleic acid extractions. At the end of this step, the stroma yield is about 30 mg of protein.
  • the purity of the purified stroma is monitored by means of different immunological markers: for example, antibodies directed against the E 37 protein or the ceQORH protein (markers of contamination by the chloroplast envelope); antibodies against LHCPs (markers of thylakoid contamination). These studies failed to detect envelope proteins or thylakoids in purified stromal fractions according to this protocol.
  • a pellet of purified chloroplasts stored at -80 ° C. is suspended by vortex homogenization in 7 ml of extraction buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 2% SDS 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM aurintricarboxylic acid, 14.3 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.5% polyvinylpyrrolidone, MW 360,000) prepared extemporaneously, then placed in a water bath at 65 ° C. for 15 min, stirring every 2-3 minutes. minutes.
  • extraction buffer 50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 2% SDS 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM aurintricarboxylic acid, 14.3 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.5% polyvinylpyrrolidone, MW 360,000
  • the solution is divided and transferred to two tubes, followed by centrifugation at 12,500 g at room temperature for 15 minutes.
  • the supernatant is transferred to a new tube to which are added 0.35 ml of 3M KOAc, pH 4.8.
  • the solution is homogenized and left in the ice 30 minutes before centrifugation at 10000 g for 10 min at 4 ° C. (1)
  • the supernatant is transferred to a new tube and 2 ml of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (IAA) (25: 24: 1) is added.
  • the solution is homogenized by vortexing for 2 to 3 min and then centrifuged at 4000 g for 15 min.
  • Step (1) is repeated until homogenization and then 2 ml of chloroform are added to the aqueous phase, the solution is homogenized by vortexing for 2 to 3 min before centrifugation for 15 min at 4000 g.
  • the two supernatants are transferred to a single tube containing 100 mg of PVPP and incubated for 20 min at 78 ° C with gentle shaking every 2 to 3 minutes.
  • the tube is then cooled on ice. 2.85 ml of water and 10.85 ml of chloroform / IAA (24: 1) are added per 8 ml of supernatant, then the solution is vortexed for 2 to 3 min before centrifugation for 10 min at 4000 g.
  • the supernatant is transferred to a tube and 4 ml of chloroform / IAA (24: 1) are added, the whole is vortexed and then centrifuged for 10 min at 4000 g.
  • the supernatant is transferred to a new tube and 8 ml of isopropanol are added.
  • the mixture is mixed and incubated at -20 ° C. for 12 hours. After centrifugation at 5000 g for 45 min at 4 ° C., the pellet is washed with 70% ethanol before being taken up in 500 ⁇ l of water and centrifuged at 10,000 g for 5 min at 4 ° C.
  • the supernatant is then transferred to an Eppendorf tube where 1 ml of water and 391 ⁇ l of 8M LiCl are added and then left for 3 h at 4 ° C. After centrifugation at 10,000 g for 20 min at 40 ° C., the pellet is washed with 70% ethanol and then taken up in 100 ⁇ l of water without RNase.
  • TLES buffer Tris pH 100 mM, 100 mM LiCl, 10 mM pH 8 EDTA, 1% SDS , PVPP 1%, PVP 1%, 5 mM DTT
  • TLES buffer Tris pH 100 mM, 100 mM LiCl, 10 mM pH 8 EDTA, 1% SDS , PVPP 1%, PVP 1%, 5 mM DTT
  • the upper phase is removed.
  • 1 ml of TLES buffer is added to the residual phenolic phase, then the mixture is stirred and centrifuged. The upper phase is taken and collected with the one previously set aside.
  • a solution of LiCl 8M is added so as to obtain a final LiCl 2M concentration, RNA is thus precipitated overnight at 4 0 C. After centrifugation the pellet is taken up in 100 .mu.l of water.
  • RNA is purified using the Rneasy kit (Qiagen). According to the manufacturer's protocol, 350 ⁇ l of buffer RLT + 3.5 ⁇
  • Rneasy kit Qiagen
  • RNA is eluted by adding 30 ⁇ l of RNase free water to the column. After 1 minute, the whole is centrifuged for 1 minute 10000 rpm. Elution is repeated with 30 ⁇ l of H 2 O. The 2 eluates are combined and the solution is assayed.
  • the supernatant is again collected and collected with the first harvested supernatant.
  • One or more phenol / chloroform / isoamyl acid extractions (25: 24: 1) can be performed if a whitish interface between the aqueous phase and the phenolic phase is visible
  • a volume of chloroform / lsoamylic alcohol is added to the aqueous phase resulting from the extraction with the phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture. Vortexed for 2 min and before centrifugation for 10 min at 5000 g at 4 ° C. The supernatant is harvested and the concentration of the solution is adjusted to 2M LiCl with 8M LiCl. The RNA precipitates overnight at 4 ° C. The mixture is centrifuged for 45 min at 12000 rpm at 4 ° C. and then the pellet is resuspended with 100 ⁇ l of H 2 O MiIIiQ for Mini RNA Clean Up (Qiagen).
  • RNA is purified using the Rneasy kit (Qiagen). 350 ⁇ l of buffer RLT + 3.5 ⁇ l of ⁇ -Mercaptoethanol (added extemporaneously) and 250 ⁇ l of absolute ethanol are added, the mixture is homogenized and centrifuged for 15 seconds at 10000 rpm. 500 ⁇ l of RPE buffer are added to the membrane and the whole is centrifuged for 15 seconds at 10,000 rpm. The eluate is removed and the column is washed again with 500 ⁇ l of RPE buffer; the whole is centrifuged 2 minutes at 10000 rpm a first time then a second to remove traces of ethanol. RNA is eluted by adding 30 ⁇ l of RNase free water to the column. After 1 minute, the whole is centrifuged for 1 minute 10000 rpm. Elution is repeated with 30 ⁇ l of H 2 O. The 2 eluates are pooled and the solution is assayed.
  • RNA 3 ⁇ g of total RNA are placed in 8.5 ⁇ l of H 2 O without RNase.
  • 0.5 .mu.l of spike is added to 2 .mu.l of random nonamers.
  • the mixture is incubated for 10 minutes at 70 ° C. and then placed in ice for 1 min and centrifuged. The mixture is then incubated for 10 minutes at room temperature.
  • An incubation buffer to be added to the RNA, which comprises, for a probe, 4 ⁇ l of 5 ⁇ SSII buffer, 2 ⁇ l of 0.1 M DTT, 1 ⁇ l of a mixture of dNTPs, 1 ⁇ l of dCTP Cy3 or Cy5, 200 U Superscript II (Invitrogen).
  • the incubation mixture is added to the RNA and incubated for 10 minutes at room temperature and then for 3 hours at 42 ° C. 2 ⁇ l of 2.5 M NaOH are added. The whole is then incubated for 10 minutes at 37 ° C. and then 10 ⁇ l of 2 M HEPES buffer pH 8 are added.
  • the probes are purified using the QIAGEN Purification Kit according to the supplier's protocol. Briefly, 500 ⁇ l of buffer PB are added to the probe. The mixture is deposited on a column and then centrifuged for 2 min at 14000 rpm, the column is washed by adding 500 ⁇ l of PE wash buffer, centrifuged for 1 min 14000 rpm, the collection tube is emptied and 500 ⁇ l of PE washing buffer are added.
  • the whole is centrifuged for 1 min at 14000 rpm; the collection tube is emptied and 500 .mu.l of PE washing buffer are added, the whole is centrifuged for 1 min at 14000 rpm, the collector tube is emptied and then centrifuged for 1 min at 14000 rpm to dry the column properly.
  • the column is placed in a new collection tube, and 50 .mu.l of elution buffer are added to the membrane and left for 1 min at room temperature.
  • the whole is centrifuged for 1 min at 14000 rpm.
  • a second elution is carried out as previously using 50 .mu.l of elution buffer. Preparation of the blades (spotting)
  • the slides used for the hybridization are previously spotted using a robot (Lucidea spotter, Amersham Biosciences).
  • the 26000 oligonucleotides (set unigene 26K Operon), each corresponding to a gene of the Arabidopsis genome, are distributed in 384 format plates, in denaturing solution, at a concentration of 2 ⁇ M.
  • the 130 amplicons corresponding to the genes of the chloroplast genome and the mitochondrial transcripts are in denaturing solution at a concentration of 50 ng / ⁇ l.
  • the entire Arabidopsis matrix (nuclear genome and organelles) is deposited on Type 7 Star glass slides (Amersham Bioscience). The slides are dried in the spotter enclosure at a humidity of 50% overnight. Then, each slide is exposed under UV at 500 mJ for 15 seconds (cross-linking).
  • a dye-swap, or fluorochrome inversion is a second hybridization experiment with inversion of both fluorochromes in relation to the population. This corresponds to two hybridizations on two different slides. Data from hybridization of both slides is usually processed together.
  • 6 tubes are prepared as follows: 3 x tube A containing 50 pmoles Population A cy3 + 50 pmoles Population B cy5, and 3 x tube B containing 50 pmoles Population B cy3 + 50 pmoles Population A cy5 .
  • the probes are evaporated at speed vack.
  • Prehybridization of the slides the slides are prehybridized in a solution prepared extemporaneously of the following composition: 5X SSC, 0.1% SDS, 0.1% BSA. The solution is placed at 42 ° C. for 2 hours and then the slides are soaked in the buffer at 42 ° C. with stirring for 45 min. The slides are rinsed in 3 successive baths of water and then dried with nitrogen.
  • the coverslips are immersed in a 1% SDS solution and incubated in a sonicator for 5 minutes.
  • the coverslips are rinsed 5 times with milliQ water and then immersed in 70% EtOH.
  • the coverslips are dried with nitrogen.
  • each probe (tube A or B) is taken up in 10.5 ⁇ l H 2 O and 3 ⁇ l of fractionated DNA of herring sperm (0.1 mg / ml, Ci 1 mg / ml), and denatured 2 minutes at 95 ° C., 30% formamide, 1 ⁇ Amersham Biosciences hybridization buffer. The probes are denatured for 2 min at 95 ° C. and then stored in ice.
  • the probe is deposited on the coverslip and the slide covers the coverslip.
  • the whole is deposited in a Corning hybridization chamber and incubated in a water bath at 37 ° C. for 16 hours.
  • the slides are washed with stirring in the following successive baths: 2 ⁇ SSC 0.1% SDS 5 min at 37 ° C., 2 ⁇ SSC 0.1% SDS 5 min at 37 ° C., 0.2 ⁇ SSC 1 minute at room temperature, 0.1X SSC 1 min at room temperature and then in water.
  • the slides are dried with nitrogen and then scanned.
  • the optical reading of the chips is carried out using an ArrayScanner Generation III scanner (Molecular Dynamics) equipped with two lasers. These two lasers excite the two fluorescent molecules Cy3 and Cy5 by emission of the two respective wavelengths of 550 nm and 649 nm.
  • the photons emitted back by the fluorochromes are picked up by a photomultiplier (PMT) set at 700 V and transformed into an amplified electrical signal which is converted into two gray-level digital images, one for each wavelength.
  • PMT photomultiplier
  • Scanned images are viewed using ImageQuant 5.2 software (Amersham Biosciences) to monitor their overall quality. Then, the ArrayVision 7.0 software (Amersham Biosciences) allows the analysis of the images and the method used provides among other parameters a value of the intensities measured for each spot as well as the surrounding background noise. It is at this stage that the spots are annotated, the software assigns each spot its coordinates and the identifier of the gene that corresponds to it.
  • RNAstroma_ARNchloro For the RNAstroma_ARNchloro comparison, the normalization procedure is different. 3 technical repetitions or 3 swaps (6 slides) were performed. Background noise was subtracted from the intensities and the 6 slides were independently normalized by Loess Block Method (Lonnstedt and Speed, 2002). For each slide, the ratio stroma intensity / chloro intensity is calculated and then converted to Iog 2 - The average of the 6 values of Iog2 (ratio) is calculated and corresponds to M. The RatioAB is the ratio of the average of the intensities corresponding to the RNAstroma on the average intensities corresponding to RNA chloroplast.
  • a Bayesian statistical test (Yang et al., 2002) was applied to compare the 6 intensity values corresponding to the chloro RNA population to the 6 intensity values corresponding to the stroma RNA population.
  • the stroma / chloro ratio is the average of the 6 stroma / chloro ratios of each slide.
  • T is the value of the statistical test
  • pvalue is the corresponding p value
  • B is the probability that the chloro / stroma ratio is different from 0 on the probability that the ratio is equal to 1.
  • B is greater than 0 the gene has a greater probability of being differentially expressed than of being invariant.
  • the first selection of 287 genes was made from an RNA chloro / tRNA total comparison based on the following criteria: average AB ratios of swaps> 1, 5, variance ⁇ 0.001 or ratio> 5 if there is no no threshold of variance.
  • the second selection of 706 genes was made from a tRNA / RNAstroma comparison based on the following criteria: average ratio of 2 swaps ⁇ 0.66, variance ⁇ 0.001 or ratio> 0.2 if not there is no threshold of variance.
  • the 46 genes identified are the genes common to these two selections.
  • RNA probes Hybridization and synthesis analysis of RNA probes In situ hybridization was performed as described in Rodriguez et al. (1998) with digoxigenin-labeled antisense. RNA probes and Nothern blot assays were performed according to standard procedures (Sambrook et al., 1989). CDNA probes were scored by random priming using 32 P-dCTP and RNA probes were labeled by in vitro transcription using either 32 P-UTPoU digoxygenin (DIG RNA Labeling kit, Roche Diagnostics).
  • DIG RNA Labeling kit Roche Diagnostics
  • Chloroplast Purification and Nucleic Acid Extraction All operations were conducted at 0-5 ° C.
  • the crude chloroplasts were obtained from leaves (6 g of A. thaliana, 30 g of N. tabacum, 100 g of L sativa or 4 kg of S. oleracea). The plants were placed in the dark at 4 ° C overnight and the chloroplasts were extracted into isoosmotic buffer (A thaliana and N. tabacum: TRIS-HCl pH 8, 20 mM, EDTA, 0.33 M Sorbitol, 0.1% ⁇ mercaptoethanol, L Sativa: 0.4 M sorbitol, 10 mM NaCl, 50 mM MOPS pH 7, S.
  • oleracea 0.33 M sucrose, 20 mM MOPS pH 7.8) and purified by isopycnic centrifugation on Percoll gradients preformed (Douce and Joyard, 1982). Chloroplasts of N. tabacum were also obtained from protoplasts as described in Charbonnier et al. (1987).
  • RNA or I 7 chloroplast DNA sub-chloroplast fractions were extracted from intact chloroplasts or purified fractions under plastid-purified by extraction with phenol / chloroform and ethanol precipitation. For Southern blot analyzes, the chloroplast nucleic acids were treated with RNase and digested with the appropriate restriction enzymes.
  • AtelF4E1 cDNA was amplified by PCR and cloned upstream and in reading frame of the green fluorescent protein 4 gene (mGFP5) under the control of the 35S promoter of mosaic virus virus. cauliflower (CaMV) (von Arnim et al., 1998).
  • the chimeric gene cassette was then placed in the binary vector pPZP-BASTA (a derivative of pPZP, Hajdukiewicz et al., 1994). Transformation of Arabidopsis with Agrobacterium was performed according to Bechtold et al. (1983).
  • Particle bombardment using a pneumatic particle gun (Bio-Rad PDS-1000 / He, 1,550 psi helium pressure, 1 350 psi rupture discs, 10 cm target distance, microbeads in 1 ⁇ m gold) and observation by confocal laser microscopy (TCS-SP2, Leica, Deerfield, IL) were performed as described in Ferro et al. (2002).
  • a pneumatic particle gun Bio-Rad PDS-1000 / He, 1,550 psi helium pressure, 1 350 psi rupture discs, 10 cm target distance, microbeads in 1 ⁇ m gold
  • TCS-SP2 Leica, Deerfield, IL
  • ELFAE1 uRNA is localized in chloroplasts in four different plant species
  • Chloroplast RNA was also purified from Nicotiana tabacum; it was thus observed that an N. tabacum elF4E cDNA probe hybridized to chloroplast RNA (NtelF4E). Contamination of the chloroplast RNA preparation with nuclear or cytosolic RNA was excluded using a probe for U6 small nuclear RNA and a cDNA probe of the nitrite reductase (Mr) 1 gene, respectively. A chloroplast probe, PsbB, detected the corresponding mRNAs in all extracts.
  • chloroplasts were purified from Lactuca Sativa (lettuce), resulting in better chloroplast yields than purification from A thaliana. and N. tabacum. Chloroplasts were treated with a combination of trypsin and RNase to remove any RNA that could be protected by membrane-associated protein complexes. Hybridization with an L.sativa e. F4E probe (LselF4E) showed that LselF4E mRNA was protected from protease and RNase combination treatments.
  • Fusion of elF4E1 and GFP mRNAs is vectorized to chloroplasts
  • the mRNA encoding GFP Green Fluorescent Protein, mGFP5
  • GFP Green Fluorescent Protein, mGFP5
  • AtelF4E1 under the control of the CaMV 35S promoter and transgenic A. thaliana lines were produced.
  • a line expressing the hybrid mRNA was selected and used to prepare chloroplast RNA. Hybridization with a GFP probe has shown that hybrid mRNA is effectively located in the chloroplast fraction, as observed with AtelF4E1 mRNA.
  • the elF4E protein is one of the key regulators of general and specific translation in eukaryotes (Gingras et al., 1999) but it is not necessary for the translation of chloroplast mRNAs that lack the cap structure ("cap"). ) (Sugiura et al., 1998). A frequently observed mode of regulation of the translational activity of the cell is sequestration of elF4E by binding proteins (Gingras et al., 1999, Groisman et al., 2002).
  • chloroplast sequestration of elF4E mRNA may be a means of regulating the translational activity in the cytosol depending on the physiological status of the chloroplast.
  • RNA exchanges between cytosol and chloroplasts may be a new level of cellular integration in plants.
  • Chlorella virus adenine methyltransferase gene promoter is a strong promoter in plants. Plant Mol. Biol. 26, 85-93,
  • Petracek ME LF Dickey, Huber SC, Thompson WF. (1997) Light-regulated changes in abundance and polyribosome association of ferredoxin mRNA are dependent on photosynthesis. Plant CeII 9, 2291-300.
  • Van Haaren MJ Houck CM. (1991) Strong negative and positive regulatory elements contribute to the high-level fruit-specific expression of the tomato 2A11 gene. Plant Mol. Biol. 17.615-630.1991. van Heerden A, Browning KS. (1994) Expression in Escherichia coli of the two subunits of the isozyme form of wheat germ protein synthesis initiation factor 4F. Purification of the subunits and formation of an enzymatically active complex. J. Biol. Chem. 269: 17454-17457.
  • Verdaguer B, Kochko A, Fux Cl, Beachy RN, Fauquet C. (1998) Functional organization of the cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter. Plant Mol Biol., 37 (6): 1055-67.

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Abstract

L'invention concerne des séquences d'acides nucléiques naturellement importées dans un plaste de cellule végétale, et leur utilisation pour réaliser l'adressage d'une séquence d'ARN d'intérêt vers un plaste, permettant ainsi notamment l'expression dirigée d'une protéine d'intérêt dans un plaste de cellule végétale.

Description

Méthode d'adressage d'acides nucléiques vers des plastes
L'invention concerne des séquences d'acides nucléiques naturellement importées dans un plaste de cellule végétale, et leur utilisation pour réaliser l'adressage d'une séquence d'ARN d'intérêt vers un plaste de cellule végétale, permettant ainsi notamment l'expression dirigée d'une protéine d'intérêt dans un plaste de cellule végétale.
Un concept a émergé depuis une quinzaine d'années selon lequel la localisation subcellulaire d'ARNm serait un mécanisme clé pour diriger des produits de gènes vers des compartiments subcellulaires individuels, ou vers des régions spécifiques d'une cellule ou d'un embryon, constituant ainsi un mécanisme important de régulation post-transcriptionnelle de l'expression de gènes. Ce phénomène de localisation d'ARNm intervient à la fois chez les organismes unicellulaires, les animaux et les plantes. Les mécanismes susceptibles de contribuer à cette localisation subcellulaire d'ARNm ont été revus par Kloc et al. (2002).
Les premières preuves d'une localisation subcellulaire spécifique d'ARNm dans des cellules de plantes sont très récentes. Une polarisation cellulaire a ainsi été démontrée dans des cellules du xylème en différenciation dans lesquelles une localisation exclusive au niveau du pôle basai ou du pôle apical a été observée en fonction du type d'ARNm d'expansines, des protéines de la paroi cellulaire, considéré (Im et al., 2000). Des ARNm de protéines de stockage chez le riz ont par ailleurs été localisés dans des sous-domaines spécifiques du réticulum endoplasmique (Choi et al., 2000).
Les plastes sont des organites semi-autonomes qui présentent une grande diversité structurale et contiennent des voies biosynthétiques uniques. En particulier, les chloroplastes sont supposés être issus d'une endosymbiose entre une bactérie photosynthétique et une cellule eucaryote. Le fonctionnement approprié de cette association nécessite un haut niveau d'intégration entre le génome chloroplastique et le génome cellulaire de la plante. De nombreux gènes chloroplastiques ont été transférés vers le noyau de la cellule hôte et les protéines codées par ces gènes sont ensuite importées dans le chloroplaste (Martin et Herrmann, 1998 ; Joyard et al., 1998). L'activité chloroplastique régule aussi l'expression de ces gènes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel (Surpin et al., 2002 ; Petracek et al., 1997). Plus généralement, le fonctionnement des plastes est fortement dépendant des protéines qui sont codées dans le noyau, traduites dans le cytoplasme et importées dans les plastes. En effet, la plupart des gènes codant les protéines plastidiales sont nucléaires et les protéines sont donc transloquées vers les plastes grâce à une machinerie d'importation de protéines contenue dans la membrane de l'enveloppe des plastes. Etonnamment, l'importation de molécules d'ARN depuis le noyau ou le cytoplasme de la cellule hôte vers les plastes n'a jamais été observée, malgré le rôle reconnu de la localisation d'ARN dans la régulation de l'expression génétique.
Très récemment, des travaux montrant l'adressage d'ARN vers les chloroplastes ont été divulgués dans la demande de brevet internationale WO 2004/040973. Cependant, les séquences d'ARN servant à la translocation des gènes dans le chloroplastes sont transformées avec une séquence CLS (Chloroplast Localization Séquence) d'origine virale dont les séquences sont préférentiellement choisies parmi les séquences des virus ASBVd, PLMVd, CChMVd, CChMVd ou encore ELVd et ne sont jamais des séquences d'ARN non transformées et/ou endogènes comme dans la présente invention.
Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que des transcrits de certains gènes nucléaires, se retrouvent localisés dans des plastes, et ceci dans des cellules de différentes espèces végétales. Les inventeurs ont ainsi démontré pour la première fois que des ARN transcrits dans le noyau de cellules végétales peuvent être transloqués vers des plastes, en particulier vers des chloroplastes.
Les inventeurs ont en outre démontré qu'un ARN d'intérêt peut être adressé spécifiquement vers un plaste de cellule végétale en fusionnant cet ARN d'intérêt avec un transcrit d'un gène nucléaire détecté dans les plastes. La transformation de cellules végétales avec une telle construction permet donc de transloquer l'ARN d'intérêt vers un plaste, puis d'exprimer dans le plaste la protéine codée par cet ARN d'intérêt.
Le mécanisme d'adressage d'ARNm vers les plastes identifié par les inventeurs représente donc une alternative à la transformation du génome plastidial, en particulier du génome chloroplastique, utilisée jusqu'à présent pour une production dirigée de protéines recombinantes dans ces organites. Définitions
Dans le cadre de la présente demande on entend par "acide nucléique" un ester de phosphate d'une forme polymérique de ribonucléosides (adénosine, guanosine, uridine ou cytidine; "molécules ARN") ou de désoxyribonucléosides (désoxyadénosine, désoxyguanosine, désoxythymidine, or désoxycytidine; "molécules ADN"), ou un analogue phosphoester quelconque de ceux-ci, tels que des phosphorothioates et des thioesters, sous forme simple brin ou sous forme double brin.
Un "acide nucléique d'adressage" est une molécule d'ADN ou d'ARN dont la séquence transcrite est celle d'un gène qui est localisé dans le noyau d'une cellule végétale (à savoir un gène nucléaire) et qui produit par transcription un ARN messager (ARNm) qui est transloqué du noyau vers un plaste de ladite cellule végétale.
L'expression "séquence transcrite" désigne une séquence d'ARN qui est susceptible d'être obtenue par transcription d'une séquence d'ADN, ou qui a la séquence d'une séquence ARN de référence. Ainsi, si l'acide nucléique d'adressage est une molécule d'ADN, la séquence transcrite est une séquence d'ARNm qui dérive de la séquence de la molécule d'ADN. Si l'acide nucléique d'adressage est déjà une molécule d'ARN, la séquence transcrite est alors celle de la molécule d'ARN.
Un acide nucléique d'adressage est donc caractérisé par une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant naturellement détectable dans un plaste d'une cellule végétale. Ledit ARNm peut présenter une localisation majoritairement cytoplasmique, une localisation majoritairement plastidiale, ou être localisé en quantités équivalentes dans le cytoplasme et dans un plastide de la cellule. De préférence, ledit ARNm présente une localisation majoritairement plastidiale ; sa concentration dans un plaste est alors supérieure à sa concentration cytoplasmique. Ledit acide, nucléique d'adressage se caractérise alors par une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant caractérisé par une concentration dans un plaste supérieure à sa concentration cytoplasmique.
Un "acide nucléique d'intérêt" désigne une molécule d'ADN ou d'ARN dont on souhaite adresser la séquence transcrite (s'il s'agit d'une molécule d'ADN) ou que l'on souhaite adresser (s'il s'agit d'une molécule d'ARN) vers un plaste d'une cellule végétale.
Par "plaste" on désigne un organite ovoïde ou sphérique de quelques microns de long et délimité par une double membrane ou enveloppe. Les plastes sont spécifiques aux cellules végétales et à quelques Protistes. Ces organites ont pour rôle la synthèse et ou le stockage de molécules. Les plastes incluent le chloroplaste qui est l'organite dans lequel a lieu la photosynthèse, l'amyloplaste où a lieu le stockage de l'amidon, l'étioplaste présent dans les tissus non chlorophylliens comme les racines, le gérontoplaste présent dans les tissus sénescents, le chromosplaste qui accumule les pigments, et le proplaste qui est à l'origine des autres plastes.
Méthode d'adressage vers un plaste
Les inventeurs ont mis en évidence que, dans des cellules végétales, les ARNm de certains gènes nucléaires présentent une localisation subcellulaire au niveau de plastes. Ces résultats montrent qu'il existe un mécanisme de translocation d'ARNm depuis le noyau et/ou le cytosol des cellules végétales vers les plastes. En outre des constructions comprenant un tel ARNm fusionné avec une séquence d'acide nucléique d'intérêt sont également retrouvées au niveau des plastes. Ces résultats montrent donc que les transcrits de ces gènes nucléaires constituent des séquences d'adressage vers des plastβs.
L'utilisation de gènes nucléaires dont un transcrit est localisé dans les plastes est particulièrement utile pour transloquer des séquences d'acide nucléique d'intérêt, en particulier des séquences ARN, vers des compartiments subcellulaires plastidiaux spécifiques.
L'invention concerne donc une méthode d'adressage d'un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, ladite méthode comprenant la transformation d'une cellule végétale avec un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant détectable dans un plaste.
De manière préférée, l'acide nucléique d'adressage a pour séquence transcrite la séquence d'un ARNm d'un gène nucléaire qui est endogène à ladite cellule végétale. Le plaste peut être sélectionné dans le groupe constitué d'un chloroplaste, d'un amyloplaste, d'un étioplaste, d'un gérontoplaste, d'un chromosplaste et d'un proplaste. Préférentiellement ledit plaste est un chloroplaste.
La détection d'un ARNm donné dans un plaste d'une cellule végétale est à la portée de l'homme du métier. On peut par exemple procéder à une extraction des ARN de plastes isolés à partir de cellules végétales, et rechercher la présence d'un ARNm donné par hybridation avec une sonde spécifique de l'ARNm. La quantité d'ARNm isolée dans un plaste peut être comparée à la quantité présente dans le reste de la cellule, c'est-à-dire le cytosol et l'ensemble des organites autres que le ou les plaste(s) considéré(s), ou à la quantité présente dans les ARN totaux extraits à partir de cellules entières (concentration cytoplasmique). De préférence ledit ARNm est caractérisé par une concentration dans un plaste supérieure à sa concentration cytoplasmique. De préférence encore la concentration dans un plaste dudit ARNm est au moins 2 fois supérieure à sa concentration cytoplasmique. La détermination des concentrations respectives de l'ARNm dans le plaste et le cytoplasme peut être effectuée conformément aux méthodes décrites dans la présente demande.
Les inventeurs ont ainsi identifié, par une étude de criblage sur puce, une liste reproductible de messagers nucléaires fortement enrichis dans les fractions plastidiales, en particulier chloroplastiques, de cellules végétales. Ces ARNm, ainsi que Les séquences d'ADN génomique ou les ADNc de ces gènes nucléaires -une fois transcrites- constituent donc des acides nucléiques permettant d'adresser un ARN auquel ils sont liés vers un compartiment plastidial.
De préférence, un acide nucléique d'adressage selon l'invention a une séquence d'ADN ou d'ARN dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire sélectionné dans le groupe constitué de l'un des gènes identifiés dans l'un des tableaux I1 II, III, ou IV. Les numéros d'accès TAIR est le numéro d'accès au gène identifié dans la base de données TAIR (The Arabidopsis Information Resource ; http://www.arabidopsis.org) qui a été formée à partir du séquençage du génome de Arabidopsis thaliana. Tableau
N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At3g03480 transferase family similar to hypersensitivity-related gène GB:CAA64636 [Nicotiana tabacum]; contains Pfam transferase family domain PF0Q248
At5g47250 disease résistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease résistance protein. l At5g08100 Asparaginase
At2g33840 tyrosyl-tRNA synthetase -related
| At5g16770 myb DNA-binding protein(AtMYB9)
I At3g52520 hypothetical protein
At3g50440 hydrolase, alpha/beta fold family similar to ethylene-induced esterase [Citrus sinensis] Gl: 14279437, polyneuridine aldéhyde esterase [Rauvolfia serpentina] Gl:6651393; contains Pfam profile PF00561 : hydrolase, alpha/beta fold family
At4g 16920 disease résistance protein (TIR-NBS-LRR class), putative domain signature TIR-NBS-LRR exists, suggestive of a disease résistance protein
[ At5g65850 F-box protein family
| At5g54920 expressed protein strong similarity to unknown protein (pir
| At4g29905 expressed protein
At3g06920 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein low similarity to fertility restorer [Pétunia x hybrida] Gl:22128587; contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
At5g39730 avirulence induced gène (AIG) - like protein AIG2 PROTEIN, Arabidopsis thaliana, SWISSPROT:AIG2_ARATH
At4g23030 MATE efflux protein - related contains Pfam profile PF01554: Uncharacterized membrane protein family
At4g1 O51 O subtilisin-like serine protease contains similarity to subtilase; SP1 Gl:9957714 from [Oryza sativa]
At3g 13290 transducin / WD-40 repeat protein family contains 2 WD-40 repeats (PF00400); autoantigen locus HUMAUTANT (GI:533202) [Homo sapiens] and autoantigen locus HSU17474 (Gl:596134) [Homo sapiens]
I At3g43380 hypothetical protein hypothetical proteins - Arabidopsis thaliana
| At5g08520 expressed protein contains similarity to l-box binding factor
I At4g07340 contains similarity to Xenopus laevis replication protein A1 (SW: RFA 1 XENLA) j At5g47790 expressed protein
I At5g05670 signal récognition particle receptor beta subunit-related protein l At1g78890 expressed protein
At1g17230 leucine rich repeat protein family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069; contains leucine-rich repeats, Pfam:PF00560
At5g56160 sec14 cytosolic factor family (phosphoglyceride transfer protein family) similar to SEC14 cytosolic factor (SRP45816) [Candida lipolytica]
At1g07620 TP-binding protein -related similar to GB:M24537 from [Bacillus subtilis]
At5g45830 tumor-related protein-like
At4g00730 lomeodomain protein AHDP
At3g59200 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At1g26930 Kelch repeat containing F-box protein family contains PfarτrPF01344 Kelch motif, Pfam:PF00646 F-box domain
At1g79350 expressed protein
At1g53290 galactosyltransferase family contains Pfam profile: PF01762
N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
I At3g26090 expressed protein
| At3g13224 RNA récognition motif (RRM) - containing protein contains InterPro entry IPR000504: RNA-binding région RNP-1 (RNA récognition motif) (RRM)
| At3g20475 DNA mismatch repair MutS family similar to SP
At3g54220 scarecrow transcription factor (SCR)
| At3g61510 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (ACC synthase), putative similar to ACC synthases from Citrus sinensis [Gl:6434142], Cucumis melo [GI:695402], Cucumis sativus [Gl:3641645]
I At3g46020 RNA-binding protein, putative similar to Cold-inducible RNA-binding protein (Glycine-rich RNA-binding protein CIRP) from {Homo sapiens} SP
I At3g20280 expressed protein contains Pfam profile: PF00628 PHD-finger, implications for chromatin-mediated transcriptional régulation
At4g28780 GDSL-motif lipase/hydrolase protein similar to family II lipase EXL3 (GI:15054386), EXL1 (Gl: 15054382), EXL2 (GI:15054384) [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile PF00657: Lipase/Acylhydrolase with GDSL- like motif
At4g 13650 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
| At4g09580 expressed protein hypothetical protein - Arabidopsis thaliana,PIR2:B71448 l At4g18040 translation initiation factor elF4E
| At4g13810 disease résistance protein family (LRR) contains leucine rich-repeat domains Pfam:PF00560, INTERPRO:IPR001611 ; similar to disease résistance protein [Lycopersicon esculentum] gi
I At5g04220 C2 domain-containing protein GC donor splice site at exon 3; similar to Ca2+- dependent lipid-binding protein (CLB1) Gl:2789434 from [Lycopersicon esculentum] '
I At5g07650 formin homology 2 (FH2) domain-containing protein contains formin homology 2 domain, Pfam:PF02128
I At5g58430 leucine zipper-containing protein leucine zipper-containing protein, Lycopersicon esculentum, PIR:S21495
| At5g18240 transfactor-related protein
At5g48690 hypothetical protein
I At5g66460 glycosyl hydrolase family 5/cellulase ((1-4)-beta-mannan endohydrolase)
I At5g60060 F-box protein family various predicted proteins, Arabidopsis thaliana ; similar to SKP1 interacting partner 2 (SKIP2) TIGR_Ath1 :At5g67250
| At5g14070 glutaredoxin protein family contains INTERPRO Domain IPR002109, Glutaredoxin (thioltransferase)
| At4g10020 short-chain dehydrogenase/reductase family protein similar to sterol-binding dehydrogenase steroleosin Gl: 15824408 from [Sesamum indicum]
| At5g20730 auxin response transcription factor (ARF7) identical to auxin response factor 7 Gl:4104929 from [Arabidopsis thaliana]
I At5g65630 bromodomain-containing protein similar to 5.9 kb fsh membrane protein [Drosophila melanogaster] Gl:157455; contains Pfam profile PF00439: Bromodomain
I At2g02290 hypothetical protein and genefinder
| At1g78300 14-3-3 protein GF14 oméga (grf2) identical to GF14omega isoform Gl:487791 from [Arabidopsis thaliana]
| At1g61960 expressed protein similar to hypothetical protein Gl:5541664 from [Arabidopsis thaliana]
| At2g14630 hypothetical protein contains Pfam profile PF03004: Plant transposase (Ptta/En/Spm family)
At5g16230 acyl-racyl-carrier-proteini desaturase (stearoyl-ACP dësaturase). putative Nc d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At4g00750 dehydration-induced protein family similar to early-responsive to dehydration stress ERD3 protein [Arabidopsis thaliana] Gl:15320410; contains Pfam profile PF03141 : Putative methyltransferase
At4g37400, cytochrome P450 family similar to cytochrome P450 monooxygenase CYP91A2, Arabidopsis thaliana, D78607
At4g 15890 expressed protein
At4g09510 neutral invertase like protein Daucus carota mRNA, PID:e1372926
At4g 14720 expressed protein
At5g58000 expressed protein similar to unknown protein (gb
At5g39790 expressed protein δ'-AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE1 BETA-1 SUBUNIT, pig, SWISSPROT:AAKB_PIG
At5g01390 DnaJ protein family similar to SP
At5g53210 bHLH protein family contains similarity to helix-loop-helix DNA-binding protein
At5g51030 short-chain dehydrogenase/reductase family protein contains INTERPRO family IPR002198 short chain dehydrogenase/reductase SDR family
At5g67540 glycosyl hydrolase family 43 contains similarity to xylanase Gl:2645416 from [Caldicellulosiruptor saccharolyticus]
At5g50030 expressed protein contains similarity to pollen-specific protein Bnm1 Brassica napus Gl: 1857671 ; contains Pfam profile PF04043: Plant invertase/pectin methylesterase inhibitor
At5g05190 expressed protein similar to unknown protein (emb
At3g 12600 MutT/nudix family protein contains Pfam profile PF00293: NUDIX domain
At3g54180 cell division control protein 2 homolog B (CDC2B) identical to cell division control protein 2 homolog B [Arabidopsis thaliana] SWISS-PROT: P25859
At5g01640 expressed protein prenylated Rab acceptor 1 Homo sapiens, EMBL: AJ 133534
At5g53230 hypothetical protein similar to unknown protein (pir
At2g33530 serine carboxypeptidase -related
At2g43690 receptor lectin kinase, putative similar to receptor-like kinase LECRK1 [Arabidopsis thaliana] gi
At3g09110 hypothetical protein
At4g27130 translation initiation factor
At1g60220 UIpI protease family contains Pfam profile PF02902: UIpI protease family, C- terminal catalytic domain
At1g49140 NADH-ubiquinone oxidoreductase 12 kD subunit -related annotation temporarily based on supporting cDNA gi
At1g52700 hypothetical protein contains similarity to lysophospholipase Gl: 1552244 from [Rattus norvegicus] '
At4g39430 hypothetical protein
At1g50980 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At4g35600 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069
At2g 18980 peroxidase, putative identical to peroxidase ATP22a [Arabidopsis thaliana] gi
At2g27410 hypothetical protein
At2g 14520 CBS domain containing protein contains Pfam profiles PF00571 : CBS domain, PF01595: Domain of unknown function
At2g33770 ubiquitin-conjugating enzyme family low similarity to ubiquitin-conjugating BIR- domain enzyme APOLLON [Homo sapiens] GI:8489831 , ubiquitin-conjugating enzyme [Mus musculus] GI:3319990; contains Pfam profile PF00179:
Ubiquitin-conjugating enzyme
At2g24500 C2H2-type zinc finger protein -related likely a nucleic acid binding protein
At2g19190 light repressible receptor protein kinase, putative similar to light repressible N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At2g32590 hypothetical protein
At2g27280 hypothetical protein
At1g12190 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At1g22720 WAK-like kinase (WLK) contains similarity to serine/threonine kinase gb
At4g04400 hypothetical protein contains Pfam profile PF03384: Drosophila protein of unknown function, DUF287
At2g46740 FAD-linked oxidoreductase family strong similarity to At1g32300, At5g56490, At2g46750, At2g46760; contains PFQ1565: FAD binding domain
At1g62630 disease résistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC-NBS-LRR exists, suggestive of a disease résistance protein.
At2g 13900 CHP-rich zinc finger protein, putative
At4g28630 ABC transporter family protein identical to half-molecule ABC transporter ATM 1 Gl:9964117 from [Arabidopsis thaliana]
AtCg00320 trnfM : tRNA-Phe
At1g31320 latéral organ boundaries (LOB) domain family similar to latéral organ boundaries (LOB) domain-containing proteins from Arabidopsis thaliana
At1g24200 hypothetical protein similar to hypothetical protein, GB:AAB61107
At1g04070 expressed protein Contains similarity to hypothetical mitochondrial import receptor subunit gb Z98597 from S. pombe. ESTs gb
At1g53760 hypothetical protein
At1g72810 threonine synthase, putative strong similarity to SP
At1g10522 expressed protein
At1g78100 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At1g72410 hypothetical protein similar to N-term of COP1-lnteracting Protein 7 GB:BAA31739 [Arabidopsis thaliana]
At1g68720 deaminase -related similar to cytidine/deoxycytidyiate deaminase family protein GB:AAF73539 GI:8163170 from [Chlamydia muridarum]
At1g34300 expressed protein contains similarity to receptor-like protein kinase Gl:6979335 from [Qryza sativa]
At1g27850 transposon protein -related similar to En/Spm-like transposon protein GB.-AAB95292 GI:2088658 from [Arabidopsis thaliana]
At1g11220 expressed protein contains similarity to cotton fiber expressed protein GB:AAC33276 from [Gossypium hirsutum]
At1g73970 expressed protein
At1g66840 hypothetical protein
At1g01650 expressed protein
At2g26310 expressed protein and grail
At2g27490 expressed protein
At2g22290 GTP-binding protein, putative similar to GTP-binding protein GI:550072 from [Homo sapiens]
At2g45280 RAD51C DNA repair protein -related
At3g05460 expressed protein
At3g24230 polysaccharide lyase family 1 (pectate lyase) similar to pectate iyase GP: 14531296 from [Fragaria x ananassaj
At3g04605 Mutator-related transposase similar to MURA transposase of maize Mutator transposon
At3g52900 expressed protein chromosome assembly protein homolog, Aquifex aeolicus PIR:B70356
At3g08000 RNA-binding protein, putative similar to RNA-binding protein from- [Nicotiana tabacum] Gl: 15822703, [Nicotiana sylvestris] Gl:624925; contains Pfam profile: PF00076 RNA récognition motif, (a.k.a. RRM, RBD, or RNP domain) N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR region-binding protein [Homo sapiens] Gl: 12642795; contains Pfam profile PF00856: SET domain
At4g33840 glycosyl hydrolase family 10 xylan endohydrolase isoenzyme X-I, Hordeum vulgare,PID:g1813595
At4g29310 expressed protein hypothetical protein T27I1.4 Arabidopsis thaliana,PID:g3540181
At4g22170 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At4g30680 MA3 domain-containing protein similar to SP
At4g26660 expressed protein probable kinesin - Arabidopsis thaliana, Pir2:H71402
At4g25510 hypothetical protein
At4g33400 Dem -related protein Dem (defective embryo and meristems) protein - Lycopersicon esculentum, PID:e321604
At4g27980 expressed protein
At4g39050 kinesin-related protein kinesin motor protein - Ustilago maydis, PID:g2062750
At4g24050 short-chain dehydrogenase/reductase family protein contains INTERPRO family IPR002198 Short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) superfamily
At4g37710 expressed protein predicted protein, Arabidopsis thaliana
At5g42320 hypothetical protein
At5g64190 expressed protein strong similarity to unknown protein (gb
At5g51210 oleosin
At5g03180 C3HC4-type zinc finger protein family various predicted proteins, Arabidopsis thaliana ; contains Pfam profile PF00097: Zinc finger, C3HC4 type (RING finqer)
At5g65310 homeobox-leucine zipper protein ATHB-5 (HD-Zip protein ATHB-5) identical to homeobox-leucine zipper protein ATHB-5 (HD-ZIP protein ATHB-5) (SP:P46667) [Arabidopsis thaliana]
At5g59940 CHP-rich zinc finger protein, putative large number of predicted zinc finger proteins, Arabidopsis thaliana, Homo sapiens and others
At5g56120 expressed protein similar to unknown protein (dbj
At2g03820 nonsense-mediated m RNA decay protein -related
At1g61820 glycosyl hydrolase family 1 similar to beta-glucosidase Gl: 1155254 from [Prunus avium]
At5g44750 expressed protein contains similarity to DNA-damage-inducible protein P
At2g23400 dehydrodolichyl diphosphate synthase [DEDOL-PP synthase], putative similar to GI.796076
At4g11720 hypothetical protein histidine-rich glycoprotein precursor, Plasmodium lophurae, PIR1:KGZQHL
At3g26250 CHP-rich zinc finger protein, putative
At1g23150 expressed protein location of EST gb
At2g24950 hypothetical protein contains Pfam profile PF03080: Arabidopsis proteins of unknown function
At3g14517 pseudogene, similar to L1 repeat, Tf subfamily, member 30 (LINE-element) [Mus musculus] (GB:NP_038605)
At3g 16390 jacalin lectin family similar to myrosinase-binding protein homolog [Arabidopsis thaliana] Gl:2997767, epithiospecifier [Arabidopsis thaliana] Gl:16118845; contains Pfam profiles PF01419 jacalin-like lectin family, PF01344 Kelch motif
At2g35330 expressed protein
At1g56110 nucleolar protein Nop56, putative similar to XNop56 protein [Xenopus laevis] Gl:14799394; contains Pfam profile PF01798: Putative snoRNA binding domain
At5g66910 disease résistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
Gl:3264828 from [Gossypium hirsuturn]_ l At1g80960 îxpressed protein
| At1g67370 meiotic asynaptic mutant 1 identical to meiotic asynaptic mutant 1 [Arabidopsis thaliana] Gl:7939627; contains Pfam profiles PF02301 : DNA-binding HORMA domain, PF04433: SWIRM domain
| At1g64460 phosphatidylinositol 3- and 4-kinase family contains Pfam profile PF00454: Phosphatidylinositol 3- and 4-kinase
| At1s75980_ expressed protein
| At1g33800_ expressed protein
| At2g47490 mitochondrial carrier protein family contains Pfam profile: PF0Q153 mitochondrial carrier protein
At2g27950_ expressed protein
| At2g44830 protein kinase putative similar to protein kinase PVPK-1 [Phaseolus vulgaris] SWISS-PROT:P15792
| At3g24700 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
| At3g46160 protein kinase-related contains eukaryotic protein kinase domain, INTERPRO:1PR000719
At3g49670 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative CLAVATA1 receptor kinase, Arabidopsis thaliana, EMBL:ATU96879
I At3g43200 pseudogene, putative protein predicted proteins, Arabidopsis thaliana
| At3g10970 haloacid dehalogenase-like hydrolase family low similarity to genetic modifier [Zea mays] Gl: 10444400; contains interPro accession IPR005834: Haloacid dehalogenase-like hydrolase
| At3g51920_ calmodulin 9 identical to calmodulin 9 GI:5825602 from [Arabidopsis thaliana]
| At3g11320 phosphate translocator-related low similarity to phosphoenolpyruvate/phosphate translocator precursor [Mesembryanthemum crystallinum] Gl:9295275, phosphate translocator [Nicotiana tabacum] GI:403023; contains Pfam profile: PF00892 Integra! membrane pro?
I At4g27680_ expressed protein MSP1 protein, Saccharomyces cerevisia, PIR2:A49506 l At4g00670 hypothetical protein
| At4g31320 auxin-induced (indole-3-acetic acid induced) protein, putative (SAUR_c) similar to auxin-induced protein TGSAUR22 (Gl: 10185820) [Tulipa gesnerian]; similar to auxin-induced protein 15A (SP:P33081) from [Glycine max]
| At4g28980 cdk-activating kinase 1At identical to Cdk-activating kinase 1At [Arabidopsis thaliana] gi
| At4g16690 esterase/lipase/thioesterase family similar to ethylene-induced esterase [Citrus sinensis] GM4279437, polyneuridine aldéhyde esterase [Rauvolfia serpentina] Gl:6651393, SP
| At5g57730 hypothetical protein
I At5g09560 KH domain protein various predicted RNA binding proteins, Arabidopsis thaliana
[At5g59770 expressed protein protein tyrosine phosphatase-like protein, PTPLB, Mus musculus, EMBLAF169286
| At5g47290 myb family transcription factor contains PFAM profile: PF00249 myb-like DNA binding domain
| At5g52170 homeodomain protein similar to Anthocyaninless2 (ANL2) (GP:5702094) [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam PF00046: Homeobox domain and Pfam PF01852: START domain
At4g03260 leucine rich repeat protein family contains leucine rich repeat (LRR) domains, Pfam:PF00560
[Ât2g3i570 glutathione peroxidase, putative
At1g52060 jacalin lectin family similar to myrosinase-binding protein homolog [Arabidopsis N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR thaliana] Gl:2997767; contains Pfam profile PF01419 jacalin-like lectin domain
| At4g15396 cytochrome P450 -related similar to Cytochrome P450 9OC 1 (ROTUNDIFOLIA3) (SP:Q9M066) [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile: PF0QQ67: Cytochrome P450 {Arabidopsis thaliana}
| At2g2619Q expressed protein
At1g21310 extensin family protein contains extensin-like région, Pfam:PF04554
| At2g19450 diacylglycerol O-acyltransferase (acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase) (DGAT) identical to gi:5050913, gi:6625553
[ At2g16340 hypothetical protein
| At3g10860 ubiquinol-cytochrome C reductase complex ubiquinone-binding protein (QP-C) -related similar to ubiquinol-cytochrome C reductase complex ubiquinone- binding protein (QP-C) GB:P46269 [Solanum tuberosum]
[ At1g05650 polygalacturonase, putative similar to GB:AAC23398
| At1g49080 pse'ùdogene, putative transposon protein similar to Antirrhinum majus TNP2 protein gb
| At3g23280 auxin-regulated protein contains Pfam profile: PF00023 ankyrin repeat
| At1g28300 transcriptional factor B3 protein leafy cotylédon 2 nearly identical to LEAFY COTYLEDON 2 [Arabidopsis thaliana] Gl: 15987516; contains Pfam profile PF02362: B3 DNA binding domain
At1gO464O lipoyltransferase identical to GB:BAA78386
! At1g36310 expressed protein
| At1g47860 reverse transcriptase-related low similarity to reverse transcriptase [Arabidopsis thaliana] Gl:976278; contains Pfam profiles PF00078: Reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase), PF00096: Zinc finger, C2H2 type, PF03727: Hexokinase
| At1g61410 expressed protein similar to putative double- strand break repair protein Gl:9651817 from [Arabidopsis thaliana]
I AtIg 13940 expressed protein identical to hypothetical protein GB:AAD39280 GI:5080770 from [Arabidopsis thaliana]
| At1g65650 expressed protein similar to ubiquitin C-terminal hydrolase-like protein Gl:9759113 from [Arabidopsis thaliana]
! At1g31150 expressed protein EST gb
[ At1g69630 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
[ At1g36950 zinc finger protein -related similar to GB:AAC69857 from [Arabidopsis thaliana]
| At1g55550 kinesin-related protein Similar to Kinesin proteins; Contains kinesin motor domain protein motif and kinesin heavy chain signature motif
I At2g23890 expressed protein and genefinder
| At2g07030 Mutator-related transposase similar to MURA transposase of maize Mutator transposon
| At2g14810 hypothetical protein l At2g31470 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
| At3g46470 hypothetical protein
I At3g06400 DNA-dependent ATPase, putative similar to DNA-dependent ATPase SNF2H [Mus musculus] GI:14028669; contains Pfam profiles PF00271: Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain, PF00249: Myb-like DNA-binding domain
At3g04430 No apical meristem (NAM) protein family similar to CUC1 (GP: 12060422) {Arabidopsis thaliana}
| At3g51050 expressed protein hypothetical protein L1648.04 - Leishmania major, EMBL: LMFL1648 N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAlR
Gl:3461830 from [Arabidopsis thaiiana]
At5g47620 heterogeneous nuclear ribonucieoprotein (hnRNP), putative
At5g 17820 peroxidase, putative identical to peroxidase ATP13a [Arabidopsis thaiiana] gi
I At5g33370 GDSL-motif lipase/hydrolase protein similar to family II lipase EXL3 (Gl: 15054386), EXL1 (Gl: 15054382), EXL2 (Gl: 15054384) [Arabidopsis thaiiana]; contains Pfam profile PF00657: Lipase/Acylhydrolase with GDSL- like motif
I At2g39880 myb family transcription factor (MYB25) contains Pfam profile: PF00249 myb- like DNA-binding domain
I At2g20240 expressed protein
[ At2g02220 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative
| At2g44210 expressed protein Pfam profile PF03080: Arabidopsis proteins of unknown function
| At3g60150 hypothetical protein hypothetical protein F4I1.34 - Arabidopsis thaiiana, PIR:T02408
| At3g 12970 expressed protein
| At3g61910 No apical meristem (NAM) protein family no apical meristem (NAM) - Pétunia hybrida, EMBLPHDNANAM
I At3g09030 expressed protein identical to GB:AAD56319 [Arabidopsis thaiiana]
| At3g02250 auxin-independent growth promoter -related similar to auxin-independent growth promoter GB:A44226 [Nicotiana tabacum]
| At4g10040 cytochrome c several plant cytochrome c (for instance cucurbit, PIR1:CCPU)
I At4g23380 hypothetical protein predicted proteins, Arabidopsis thaiiana
! At4g23110 hypothetical protein
| At4g 13990 hypothetical protein
| At5g54130 calcium-binding ÈF-hand family protein contains I NTERPRO: IPR002048 calcium-binding EF-hand domain
! At5g43670 protein transport protein SEC23
| At5g59800 hypothetical protein
| At5g12270 oxidoreductase, 2OG-Fe(II) oxygenase family similarity to ripening protein E8, tomato, PIR:S01642; contains Pfam domain PF03171 , 2OG-Fe(II) oxygenase superfamily
] At5g 16530 auxin efflux carrier protein family contains auxin efflux carrier domain, Pfam:PF03547
! At4g35410 clathrin assembly protein AP19 homolog
| At4gO3916 hypothetical protein low similarity to SP
[ At2g14960 auxin-regulated protein -related l At2g15000 expressed protein
| At2g16390 SNF2 domain/helicase domain-containing protein low similarity to RAD54 [Drosophila melanogaster] Gl:1765914; contains Pfam profiles PF00271: Helicase conserved C-terminai domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain
At1g51150 DegP protease contains similarity to DegP2 protease Gl: 13172275 from [Arabidopsis thaiiana]
At1g66180 expressed protein
I At3g60830 actin - like protein actin 3, Drosophila melanogaster, PIR:A03000
| At2g21770 cellulose synthase, catalytic subunit, putative similar to gi:2827141 cellulose synthase catalytic subunit, Arabidopsis thaiiana (Ath-A) l AtCg00700 psbN : photosystem II protein N
| At1g09240 nicotianamine synthase, putative similar to nicotianamine synthase [Lycopersicon esculentum][GI:4753801], nicotianamine synthase 2 [Hordeum
Tableau II :
N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAlR
At3g54400 nucleoid DNA-binding - like protein nucleoid DNA-binding protein cnd41 , chloroplast, common tobacco, PIR:T01996
At2g 15570 thioredoxin M-type 3, -chloroplast precursor (TRX-M3) identical to SP trnY&trnE
At5g66140 2OS proteasome alpha subunit D2 (PAD2) (gb
At2g40510 4OS ribosomal protein S26 (RPS26A)
At1g80300 adenine nucleotide translocase identical to adenine nucleotide translocase GB-.Z49227 [Arabidopsis thalianal (FEBS Lett. 374 (3), 351-355 (1995))
At1g17260 ATPase 10, plasma membrane-type (proton pump 10) (proton-exporting ATPase), putative strong similarity to SP
At4g 15440 hydroperoxide lyase (HPOL) like protein
At4g22260 alternative oxidase, putative (IMMUTANS) identical to IMMUTANS from Arabidopsis thaliana [gi:4138855]; contains Pfam profile PF01786 alternative oxidase
At3g27690 light harvesting chlorophyll A/B binding protein, putative similar to chlorophyll A- N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
B binding protein 151 precursor (LHCP) GB:P27518 from [Gossypium hirsutum]
I At3g56690 calmodulin-binding protein identical to calmodulin-binding protein GI:6760428 from [Arabidopsis thaliana]
| At3g15640 cytochrome c oxidase subunit Vb -related similar to cytochrome oxidase IV GB:223590 [Bos taurus]; contains Pfam profile: PF01215 cytochrome c oxidase subunit Vb
At3g48425 endonuclease/exonuclease/phosphatase family similar to SP
At2g31670 expressed protein
| At4g26670 expressed protein
| At1g06380 expressed protein similar to hypothetical protein Gl:6598642 from [Arabidopsis thaliana]
| At4g11960 hypothetical protein hypothetical protein F7H19.70 - Arabidopsis thaliana, PID:e1310057
At1g78620 expressed protein
I At3g48730 glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase 2 (GSA 2) (glutamate-1- semialdehyde aminotransferase 2) (GSA-AT 2) identical to GSA2 [SP
I At5g63570 glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase 1 (GSA 1) (glutamate-1- semialdehyde aminotransferase 1) (GSA-AT 1) identical to GSA 1 [SP
| At3g44780 hypothetical protein
At4g28660 photosystem 11 protein W - like photosystem II protein W, Porphyra purpurea, PIR2:S73268
At5g44020 végétative storage protein-related
| At1g12170 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
| At1g46768 AP2 domain protein RAP2.1 identical to AP2 domain containing protein RAP2.1 Gl:2281627 from [Arabidopsis thaliana]
At1g13620 hypothetical protein
[ At1g77720 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069
| At1g35530 DEAD/DEAH box helicase, putative low similarity to RNA helicase/RNAselll CAF protein [Arabidopsis thaliana] GI:6102610; contains Pfam profiles PF00270: DEAD/DEAH box helicase, PF00271 : Helicase conserved C-terminal domain
| At1g55570 pectinesterase (pectin methylesterase) family similar to pectinesterase [Lycopersicon esculentum][GI:1944575]; nearly identical to pollen-specific BP10 protein [SP l At1g14000 protein kinase -related
| At1g35500 hypothetical protein
| At1g21lZ0 hypothetical protein
| At1g72330 alanine aminotransferase, putative similar to alanine aminotransferase 2 SP
I AtIg 18040 cell division protein kinase, putative similar to cell division protein kinase 7 [Homo sapiens] SWISS-PROT: P50613
| At1g08340 rac GTPase activating protein -related similar to rac GTPase activating protein 1 GI:3695059 from [Lotus japonicus]
[ At1g27260 hypothetical protein
| At4g38620 transcription factor (MYB4) -related
I At2g47460 myb family transcription factor similar to myb-related DNA-binding protein Gl: 1020155 from [Arabidopsis thaliana]
| At2g18010 auxin-induced (indole-3-acetic acid induced) protein family similarto auxin- induced protein TGSAUR22 (GM0185820) [Tulipa gesnerian] ;similar to indole- 3-acetic acid induced protein ARG7 (SP:P32295) [Phaseolus aureus]
I At2g36840 ACT domain-containing protein contains Pfam profile ACT domain PF01842
At2g37080 myosin heavy chain -related
N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At4g31980 ;xpressed protein EREBP-4 homolog, Arabidopsis thaliana
At3g 15700 hypothetical protein similar to N-term of NBS/LRR disease résistance protein GB:AAC26125 [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile: PF00931 NB-ARC domain
At3g21933 pseudogene contains Pfam profile: PF01657 Domain of unknown function
At3g 17470 calcium-binding EF-hand family protein contains INTERPRO:IPR002048 calcium-binding EF-hand domain
At3g60520 expressed protein
At3g08560 vacuolar ATP synthase subunit E -related similar to vacuolar ATP synthase subunit E GB:Q39258 [Arabidopsis thaliana]
At3g53330 plastocyanin-like domain containing protein similar to mavicyanin SP:P80728 from [Cucurbita pepo]
At4g 15040 subtilisin-like serine protease contains similarity to prepro-cucumisin GI:807698 from [Cucumis melo] __
At4q 10740 hypothetical protein
At4g37130 proline-rich protein-related
At5g37690 lipase family similar to family II lipase EXL3 (Gl: 15054386), EXL1 (Gl:15054382), EXL2 (GI:15054384) [Arabidopsis thaliana]
At5g46000 jacalin lectin family similar to myrosinase-binding protein homolog [Arabidopsis thaliana] Gl:2997767; contains Pfam profile PF01419 jacalin-like lectin domain
At5g54310 ARF GAP-like zinc finger-containing protein (ZIGA3) almost identical to ARF GAP-like zinc finger-containing protein ZIGA3 Gl: 10441352 from [Arabidopsis thaliana]
At5g 15490 UDP-glucose dehydrogenase-related protein UDP-glucose 6-dehydrogenase - Glycine max, EMBLU53418
At4g13510 ammonium transport protein (AMT1)
At4g02630 protein kinase family contains protein kinase domain-, Pfam:PF00069; contains serine/threonine protein kinase domain, INTERPRO:IPR002290
At1g56100 hypothetical protein
At1g74150 Kelch repeat-containing protein low similarity to mgB protein, Dictyostelium discoideum, PIR:S68824; contains Pfam profile PF01344: Kelch motif
At1g69770 chromomethylase -related similar to chromomethylase GB:AAB95486 [Arabidopsis arenosa]
At3g30810 hypothetical protein
At5g 18620 DNA-dependent ATPase, putative similar to DNA-dependent ATPase SNF2H [Mus musculus] GI:14028669; contains Pfam profiles PF00271 : Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain, PF00249: Myb-like DNA-binding domain
At1g62050 expressed protein
At3g25940 expressed protein
At1g80050 adenine phosphoribosyltransferase almost identical to adenine phosphoribosyltransferase GI:1402894 from [Arabidopsis thaliana]
At1g59312 hypothetical protein
At1g64960 expressed protein
At1g03370 C2 domain/GRAM domain-containing protein low similarity to SP
At1g03590 protein phosphatase 2C (PP2C) similar to GB:AAB97706
At4g17910 hypothetical protein predicted protein, Saccharomyces cerevisiae, PIR2:S56868
At2g33580 protein kinase -related contains a protein kinase domain profile (PDOC00100)
At2g44190 expressed protein
At2g 18480 mannitol transporter, putative similar to mannitol transporter [Apium graveolens var. dulce] Gl: 12004316; contains Pfam profile PF00083: major facilitator N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR superfamily protein
At2g46310 AP2 domain transcription factor, putative
At3g09600 myb family transcription factor contains Pfam profile: PF00249 myb-like DNA- binding domain
At3g26090 expressed protein
At3g 13224 RNA récognition motif (RRM) - containing protein contains InterPro entry 1PR000504: RNA-binding région RNP-1 (RNA récognition motif) (RRM)
At3g54220 scarecrow transcription factor (SCR)
At3g61510 1-aminocyclopropane-i-carboxylate synthase (ACC synthase), putative similar to ACC synthases from Citrus sinensis [Gl:6434142], Cucumis melo [GI:695402], Cucumis sativus [Gl:3641645]
At3g46020 RNA-binding protein, putative similar to Cold-inducible RNA-binding protein (Glycine-rich RNA-binding protein CIRP) from {Homo sapiens} SP
At4g28780 GDSL-motif lipase/hydrolase protein similar to family II lipase EXL3 (Gl: 15054386), EXL1 (Gl: 15054382), EXL2 (Gl: 15054384) [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile PF00657: Lipase/Acylhydrolase with GDSL-like motif
At4g 13650 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
At4g09580 expressed protein hypothetical protein - Arabidopsis thaliana, PIR2:B71448
At5g04220 C2 domain-containing protein GC donor splice site at exon 3; similar to Ca2+- dependent lipid-binding protein (CLB1) Gl:2789434 from [Lycopersicon esculentum]
At5g 18240 transfactor-related protein
At4g 10020 short-chain dehydrogenase/reductase family protein similar to sterol-binding dehydrogenase steroleosin Gl: 15824408 from [Sesamum indicum]
At5g20730 auxin response transcription factor (ARF7) identical to auxin response factor 7 Gl:4104929 from [Arabidopsis thaliana]
At5g65630 bromodomain-containing protein similar to 5.9 kb fsh membrane protein [Drosophila melanogaster] Gl: 157455; contains Pfam profile PF00439: • Bromodomain
At1g78300 14-3-3 protein GF14 oméga (grf2) identical to GF14omega isoform Gl:487791 from [Arabidopsis thaliana]
At1g61960 expressed protein similar to hypothetical protein Gl:5541664 from [Arabidopsis thaliana]
At2g 14630 hypothetical protein contains Pfam profile PF03004: Plant transposase (Ptta/En/Spm family)
At5g 16230 acyl-[acyl-carrier-protein] desaturase (stearoyl-ACP desaturase), putative similar to Acyl-[acyl-carrier protein] desaturase from Spinacia oleracea SP
At1g22170 expressed protein contains similarity to phosphoglycerate mutases
At4g08320 tetratricopeptide repeat (TPR)-containing protein glutamine-rich tetratricopeptide repeat (TPR) containing protein (SGT) - Rattus norvegicus, Pl D:e1285298 (SP
At5g49500 SRP54 (signal récognition particle 54 KDa) protein
At3g49400 transducin / WD-40 repeat protein family contains 4 WD-40 repeats (PF00400); low similarity (47%) to Agamous-like MADS box protein AGL5 (SP:P29385) {Arabidopsis thaliana}
At1g22210 trehalose-6-phosphate phosphatase, putative similar to trehalose-6-phosphate phosphatase (AtTPPB) GI:2944180 from [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile PF02358: Trehalose-phosphatase
At1 g68935 expressed protein
At1g24625 zinc finger protein 7, ZFP7
At1g08100 high-affinity nitrate transporter ACH2 identical to GB:AAC35884 from N' d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At5g49430 transducin / WD-40 repeat protein family similar to WD-repeat protein 9 (SP:Q9NSI6) {Homo sapiens}; contains Pfam PF00400: WD domain, G-beta repeat (4 copies)
At5g59640 serine/threonine-specific protein kinase - like putative protein serine /threonine kinase, Sorghum bicolor, EMBLSBRLK1
At5g06270 B-type cyclin -related similar to B-type cyclin G I -.849074 from [Nicotiana tabacum]
At5g65070 MADS-box protein
At5g01780 oxidoreductase, 2OG-Fe(II) oxygenase family low similarity to alkB protein - Escherichia coli, PIR:BVECKB, alkB [Caulobacter crescentus][GI:2055386]; contains Pfam domain PF03171 2OG-Fe(Il) oxygenase superfamily
At5g 15370 hypothetical protein
At5g42910 ABA-responsive élément binding protein, putative
At4g34060 hypothetical protein
At3g42480 hypothetical protein hypothetical proteins - Arabidopsis thaliana
At4g24530 PsRTI 7-1 like protein PsRTI 7-1 , Pisum sativum (pea), PATX:G1778376
At2g27280 hypothetical protein
At1g22720 WAK-like kinase (WLK) contains similarity to serine/threonine kinase gb
At4g04400 hypothetical protein contains Pfam profile PF03384: Drosophila protein of unknown function, DUF287
At2g46740 FAD-linked oxidoreductase family strong similarity to At1g32300, At5g56490, At2g46750, At2g46760; contains PF01565: FAD binding domain
At1g62630 disease résistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC- NBS-LRR exists, suggestive of a disease résistance protein.
At2g 13900 CHP-rich zinc finger protein, putative
At4g28630 ABC transporter family protein identical to half-molecule ABC transporter ATM 1 Gl:9964117 from [Arabidopsis thaliana]
At1g31320 latéral organ boundaries (LOB) domain family similar to latéral organ boundaries (LOB) domain-containing proteins from Arabidopsis thaliana
At1g24200 hypothetical protein similar to hypothetical- protein, GB:AAB61107
At1g04070 expressed protein Contains similarity to hypothetical mitochondrial import receptor subunit gb Z98597 from S. pombe. ESTs gb
At1g72810 threonine synthase, putative strong similarity to SP
At1g10522 expressed protein
At1g78100 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At1g68720 deaminase -related similar to cytidine/deoxycytidylate deaminase family protein GB:AAF73539 GI:8163170 from [Chlamydia muridaruml
At1g11220 expressed protein contains similarity to cotton fiber expressed protein GB-.AAC33276 from [Gossypium hirsutum]
At1g73970 expressed protein
At1g66840 hypothetical protein
AtIg01650 expressed protein
At2g26310 expressed protein and grail
At2g22290 GTP-binding protein, putative similar to GTP-binding protein Gl:550072 from [Homo sapiens]
At2g45280 RAD51 C DNA repair protein -related
At3g05460 expressed protein
At3g52900 expressed protein chromosome assembly protein homolog, Aquifex aeolicus, PIR:B70356
At4g04360 hypothetical protein
At4g26850 expressed protein N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At3g46170 short-chain dehydrogenase/reductase family protein contains similarity to 3- oxoacyl-[acyl-carrier protein] reductase SP:P51831 from [Bacillus subtilis]
At4g22070 WRKY family transcription factor identical to WRKY transcription factor 31 (WRKY31) Gl: 15990589 from [Arabidopsis thaliana]
At5g06390 expressed protein strong similarity to unknown protein (gb
At2g32430 galactosyltransferase family contains Pfam profile: PF01762 galactosyltransferase
At1g71240 expressed protein
At3g23980 expressed protein
At1q03060 putataive transport protein Similar to gb
At4g 34090 expressed protein
At1g55740 glycosyl hydrolase family 36 similar to seed imbibition protein GB:AAA32975 G 1 : 167100 from [Hordeum vulgare]
At1g16190 DNA repair protein RAD23, putative similar to DNA repair by nucleotide excision (NER) RAD23 protein, isoform II Gl:1914685 from [Daucus carota]
At1g12030 hypothetical protein
At1g64355 expressed protein
At1g47350 hypothetical protein similar to hypothetical protein GB:AAD22292 Gl:6598654 from [Arabidopsis thaliana]
At5g66020 hypothetical protein non-consensus AT donor splice site at exon 7, TA donor splice site at exon 10, AT acceptor splice at exon 13, strong similarity to unknown protein (emb
At2g43420 3-beta hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase family contains Pfam profile PF01073 3-beta hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase domain; similar to NAD(P)-dependent steroid dehydrogenase from Homo sapiens [SP
At3g56980 bHLH protein family NULL
At3g52200 dihydrolipoamide S-acetyltransferase (LTA3); nuclear gène encoding mitochondrial protein annotation temporarily based on supporting cDNA gi
At3g 10400 RNA récognition motif (RRM) - containing protein low similarity to splicing factor SC35 [Arabidopsis thaliana] Gl:9843653; contains InterPro entry IPR000504: RNA-binding région RNP-1 (RNA récognition motif) (RRM)
At3g25960 pyruvate kinase, putative similar to pyruvate kinase, cytosolic isozyme [Nicotiana tabacum] SWISS-PROT:Q42954
At3g07990 serine carboxypeptidase -related similar to serine carboxypeptidase II (CP-MIl) GB:CAA70815 [Hordeum vulgare]
At3g06270 protein phosphatase 2C (PP2C), putative similar to protein phosphatase-2C (PP2C) GB:AAC36699 [Mesembryanthemum crystallinum]; contains Pfam orofile: PF00481 protein phosphatase 2C
At3g05200 RING-H2 zinc finger protein ATL6 -related similar to GB:AAD33584 from [Arabidopsis thaliana]
At3g61600 POZ domain protein family contains Pfam PF00651: BTB/POZ domain; contains Interpro IPR000210/ PS50097: BTBB/POZ domain; similar to POZ/BTB containing-protein AtPOBI (Gl: 12006855) [Arabidopsis thaliana]; similar to actinfilin ((31:21667852) [Rattus norv?
At4g 10300 expressed protein predicted protein, Arabidopsis thaliana
At5g37790 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PFÇ)Q069_
At5g61850 LFY floral meristem identity control protein
At5g44040 expressed protein similar to unknown protein (gb
At5g40580 2OS proteasome beta subunit B (PBB2)
At4g33800 expressed protein
At5g41060 DHHC-type zinc finger domain-containing protein contains Pfam profile N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
PF01529: DHHC zinc finger domain
|At3g45940 glycosyl hydrolase family 31 similar to alpha-xylosidase precursor Gl :4163997 from [Arabidopsis thaliana]
| At5g66710 protein kinase, putative similar to protein kinase ATN1 GP
I At2g45900 expressed protein j At1g68280 hypothetical protein
| At4g01730 DHHC-type zinc finger domain-containing protein contains Pfam profile PF01529: DHHC zinc finqer domain
| At1g23460 polygalacturonase, putative similar to polygalacturonase GB:BAA88472 G 1:6624205 from (Cucumis sativus)
| At1g21620 pumilio-family RNA-binding protein, putative similar to hypothetical protein GB-.AAD41414 Gl:5263312 from (Arabidopsis thaliana)
| At1g16640 transcriptional factor B3 family low similarity to reproductive meristem protein 1 [Arabidopsis thaliana] Gl: 13604227; contains Pfam profile PF02362: B3 DNA binding domain
| At1g18460 lipase family similar to triacylglycerol lipase, gastric precursor (EC 3.1.1.3) {Canis familiaris} [SP
[ At1g49890 expressed protein
I At4g08680 MuDR-A transposon protein -related similar to Z. mays MuDR-A protein
At5g41490 hypothetical protein strong similarity to unknown protein (gb
I At2g02790 hypothetical protein
|At2g39870 expressed protein
At2g41040 expressed protein l At2g15050 lipid transfer protein, putative similar to SP
I At2g28250 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069
I At3g20720 expressed protein
| At3g01900 cytochrome P450 family similar to Cytochrome P450 94A1 (P450-dependent fatty acid omega-hydroxylase) (SP:O81117) {Vicia sativa}; contains Pfam profile: PF00067 cytochrome P450
| At3g62420 bZIP family transcription factor similar to common ptant regulatory factor 6 GI:9650826 from [Petroselinum crispum]
I At3g20030 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At4g33840 glycosyl hydrolase family 10 xylan endohydrolase isoenzyme X-I, Hordeum vulgare,PID:g1813595
I At4g26660 expressed protein probable kinesin - Arabidopsis thaliana, Pir2:H71402
| Àt4g25510 hypothetical protein
I At4g27980 expressed protein
| At4g37710 expressed protein predicted protein, Arabidopsis thaliana
[ At5g51210 oleosin
| At5g03180 C3HC4-type zinc finger protein family various predicted proteins, Arabidopsis thaliana ; contains Pfam profile PF00097: Zinc finger, C3HC4 type (RING finger)
I At5g59940 CHP-rich zinc finger protein, putative large number of predicted zinc finger proteins, Arabidopsis thaliana, Homo sapiens and others
| At4g11720 hypothetical protein histidine-rich glycoprotein precursor, Plasmodium lophurae, PIR1 :KGZQHL rAt3g26250 CHP-rich zinc finger protein, putative
I At2g24950 hypothetical protein contains Pfam profile PF03080: Arabidopsis proteins of unknown function
[At3g 16390 jacalin lectin family similar to myrosinase-binding protein homolog [Arabidopsis thaliana] Gl:2997767, epithiospecifier [Arabidopsis thaliana] Gl:16118845; contains Pfam profiles PF01419 jacalin-like lectin family, PF01344 Kelch motif N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
I At2g35330 expressed protein
| At2g17200 ubiquitin protein -related
| At1g47840 hexokinase -related similar to hexokinase 2 GB:AAB49911 Gl: 1899025 from [Arabidopsis thaliana]
| At1g28430 cytochrome P450, putative similar to cytochrome P450 (CYP93A1) GI:1435059 from [Glycine max]
| At1g65870 disease résistance response protein-related/ dirigent protein-related similar to dirigent protein [Forsythia x intermedia] gi .__
At1g55880 pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzyme, beta family similar to SP
| At1g17250 leucine rich repeat protein family contains leucine rich-repeat (LRR) domains Pfam:PF00560, INTERPRO:IPR001611 ; similar to Hcr2-0B [Lycopersicon esculentum] gi
At5g21070 expressed protein predicted protein - Oryza sativa - TREMBL:AP001072_3
I At2g38780 expressed protein
| At2g13840 expressed protein l At2g48100 exonuclease -related annotation temporarily based on supporting cDNA gi
I At2g37040 phenylalanine ammonia lyase (PAL1) nearly identical to SP
I At3g04460 expressed protein similar to peroxisomal biogenesis factor 12 GB:NP_000277 [Homo sapiens]
At3g 13140 hypothetical protein
| At3g43720 protease inhibitor/seed storage/iipid transfer protein (LTP) family contains Pfam protease inhibitor/seed storage/LTP family domain PF00234
I At4g39220 AtReriA
| At4g12240 hypothetical proteins
At4g07770 pseudogene, similar to L1 repeat, Tf subfamily, member 30 (LINE-element) [Mus musculus] (GB:NP_038605)
At4g 14920 PHD finger transcripti on factor, putative
I At5g46280 DNA replication licensing factor, putative similar to SP
I At5g43340 inorganic phosphate transporter identical to inorganic phosphate transporter [Arabidopsis thaliana] GI:3869190
| At5g42250 alcohol dehydrogenase (ADH), putative similar to alcohol dehydrogenase ADH GI:7705214 from [Lycopersicon esculentum]; contains Pfam zinc-binding dehydrogenase domain PF00107
At5g58540 expressed protein serine/threonine-specific protein kinase NPK15, Nicotiana tabacum, PIFfc_S52578 l At5g52510 scarecrow-like transcription factor 8 (SCL8)
I At2g43640 signal récognition particle protein 14kD, ATSRP14 -related
| At4g03870 pseudogene, putative transposon protein similar to MuDR transposon
At5g49270 expressed protein contains similarity to phytochelatin synthetase
| At5g61110 hypothetical protein
| At5g07810 SNF2 domain/helicase domain-containing protein similar to HepA-related protein HARP [Homo sapiens] Gl:6693791 ; contains Pfam profiles PF00271 : Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain, PF01844: HNH endonuclease
| At2g32920 protein disulfide isomerase family similar to SP
| At2g29920 hypothetical protein
| At1g37045 an Arabidopsis thaliana hypothetical protein, which contains similarity to retrotransposon Athila (GB:AF076275) -related temporary automated functional assignment
| At5g61700 ABC transporter family protein ABC family transporter, Entamoeba histolytica, EMBLΕH058
N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR from [Arabidopsis thaliana]
At1g65650 expressed protein similar to ubiquitin C-terminal hydrolase-like protein Gl:9759113 from [Arabidopsis thaliana]
At1g31150 expressed protein EST gb
At1g55550 kinesin-related protein Similar to Kinesin proteins; Contains kinesin motor domain protein motif and kinesin heavy chain signature motif
At2g23890 expressed protein and genefinder
At2g07030 Mutator-related transposase similar to MURA transposase of maize Mutator transposon
At2g14810 hypothetical protein
At3g46470 hypothetical protein
At3g06400 DNA-dependent ATPase, putative similar to DNA-dependent ATPase SNF2H [Mus musculus] GI:14028669; contains Pfam profiles PF00271 : Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain, PF00249: Myb-like DNA-binding domain
At3g43590 expressed protein hexamer-binding protein HEXBP - Leishmania major, PIR:A47156
At3g 16360 two-component phosphorelay mediator -related similar to two-component phosphorelay mediators (ATHP1-3) GB:BAA37110, GB:BAA37111 , GB:BAA37112 [Arabidopsis thaliana]
At4g32620 expressed protein predicted protein T1 OM 13.8, Arabidopsis thaliana
At5g56340 expressed protein similar to unknown protein (pir
At5g50100 expressed protein similar to unknown protein (pir
At5g55690 MADS-box protein
At5g09840 expressed protein similar to unknown protein (emb
At5g42130 mitochondrial carrier protein family contains Pfam profile: PF00153 mitochondrial carrier protein
At5g40220 MADS-box protein MADS-box protein, Arabidopsis thaliana, EMBLATY12776
At3g44010 4OS ribosomal protein S29 (RPS29B) ribosomal protein S29, rat, PIR:S30298
At3g45190 expressed protein hypothetical protein At2g28360 - Arabidopsis thaliana, EMBLAAD20690
At5g44410 FAD-linked oxidoreductase family similar to SP
At1g18120 pseudogene, putative myrosinase-associated protein
At5g39000 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069
At4g03970 UIpI protease family contains Pfam profile PF02902: UIpI protease family, C- terminal catalytic domain; similar to At5g28170, At1g35110, At1g44880, At3g42530, At4g19320, At5g36020, At3g43010, At2g10350
At1g56420 hypothetical protein
At1g61680 terpene synthase/cyclase family similar to 1,8-cineole synthase [GI:3309117][Salvia officinalis]; contains Pfam profile: PF01397 terpene synthase family
At1g06520 phospholipid/glycerol acyltransferase family contains Pfam profile PF01553: Acyltransferase
At1g54550 F-box protein family contains Pfam:PF00646 F-box domain; contains TIGRFAM TIGR01640 : F-box protein interaction domain
At2g01340 expressed protein
At2g44130 Kelch repeat containing F-box protein family very low similarity to SP
At2g24670 hypothetical protein
At3g23080 expressed protein C-term similar to phosphatidylcholine transfer protein GB:AAF08345 [Homo sapiens]
At3g09310 alpha-hemolysin -related similar to alpha-hemolysin GB:AAB81225 [Aeromonas N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR hydrophila]
At3g28430 expressed protein GC donor splice site at exon 16
At3g23670 phragmoplast-associated kinesin-related protein, putative similar to kinesin like protein GB:CAB10194 from [Arabidopsis thaliana]
At4g 19350 expressed protein
At4g30300 ABC transporter family protein ribonuclease L inhibitor - Mus musculus,PIR2:JC6555
At4g00760 expressed protein
At4g28180 hypothetical protein
At4g 18320 hypothetical protein
At4g 18820 expressed protein DNA polymerase III holoenzyme tau subunit, Thermus thermophilus, gb:AF025391
At5g 12970 C2 domain-containing protein contains INTERPRO:IPR000008 C2 domain
At5g66350 zinc finger protein SHI-related
At5g 13080 WRKY family transcription factor WRKY DNA binding protein - Solanum tuberosum, EMBLAJ278507
At5g22550 expressed protein strong similarity to unknown protein (emb
At5g39630 SNARE protein AtMEMB11 v-SNARE AtVTHa, Arabidopsis thaliana, EMBLAF114750
At3g51090 expressed protein hypothetical protein F16F14.4 - Arabidopsis thaliana: EMBLAC007047
At5g43270 squamosa promoter binding protein-related 2 (emb
At1g54760 MADS-box protein similar to MADS-box transcription factor Gl:4837612 from [Antirrhinum majus]
At5g 15650 reversibly glycosylated polypeptide-3
At3g 19800 expressed protein
At2g 18860 expressed protein
At2g03260 expressed protein
At3g05240 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
At1g05660 polygalacturonase, putative similar to GB:AAC23398
At1g48670 Nt-gh3 deduced protein -related similar to Nt-gh3 deduced protein GI:4887010 from [Nicotiana tabacum]
At1g31850 dehydration-induced protein, putative strong similarity to early-responsive to dehydration stress ERD3 protein [Arabidopsis thaliana] Gl: 15320410; contains Pfam profile PF03141 : Putative methyltransferase
At1g08500 plastocyanin-like domain containing protein
At1g59640 bHLH protein
At1g68500 expressed protein
At2g27240 expressed protein contains Pfam profile PF01027: Uncharacterized protein family UPF0005
At2g07240 UIpI protease family contains Pfam profile PF02902: UIpI protease family, C- terminal catalytic domain
At3g22790 expressed protein similar to centromere protein homolog GB:CAB10255 from [Arabidopsis thaliana]
At3g16010 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
At3g57540 expressed protein putative DNA binding protein - Arabidopsis thaliana, TREMBLATAC2339 3
At4g 12270 copper aminé oxidase like protein (fragmenti) copper aminé oxidase - Cicer arietinum,PID:e1335964 Nc d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At3g01710 hypothetical protein
At3g01930 expressed protein similar to nodule-specific protein NIJ70 GB:AAC39500 [Lotus japonicus]
At3g29635 transferase family similar to anthocyanin 5-aromatic acyltransferase from Gentiana triflora Gl:4185599, malonyl CoA:anthocyanin 5-O-glucoside-6'"-O- malonyltransferase from Perilla frutescens Gl: 17980232, Salvia splendens Gl: 17980234; contains Pfam pr?
At4g31980 expressed protein EREBP-4 homolog, Arabidopsis thaliana
At4g32910 expressed protein
At4g37170 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
At4g33030 UDP-sulfoquinovose synthase (sulfite:UDP-glucose sulfotransferase) (sulfolipid biosynthesis protein) (SQD1) identical to gi:2736155
At4g04330 expressed protein
At5g24500 expressed protein
At5g48020 expressed protein
At5g54660 expressed protein
At5g46160 ribosomal protein L14p family
At5g06540 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains Pfam profile PF01535: PPR repeat
At5g37200 C3HC4-type zinc finger protein family low similarity to ring-H2 finger protein RHYIa from Arabidopsis thaliana [gi:3790593], ring finger-H2 protein from Xenopus laevis [gi:13752371]; contains Pfam domain zinc finger, C3HC4 type (RING finger) PF00097
At3g 10740 glycosyl hydrolase family 51 similar to arabinoxylan arabinofuranohydrolase isoenzyme AXAH-II from Gl:13398414 [Hordeum vulgare]
At4g13170 6OS ribosomal protein L13A (RPL13aC) ribosomal protein L13a -Lupinus luteus,PID:e1237871
At3g27050 expressed protein
At1g60095 jacalin lectin family contains smnilarity to myrosinase-binding protein homolog [Arabidopsis thaliana] Gl:2997767;
At3g09410 pectinacetylesterase family similar to pectinacetylesterase precursor GB:CAA67728 [Vigna radiata]; contains Pfam profile: PF03283 pectinacetylesterase
AtI g11655 expressed protein
At1g49800 hypothetical protein
At1g77610 glucose-6-phosphate/phosphate translocator-related similar to glucose-6- phosphate/phosphate-translocators from [Mesembryanthemum crystallinum] Gl:9295277, [Solanum tuberosum] Gl:2997593, [Pisum sativum] Gl:2997591 ; contains Pfam profile PF00892: Integ?
At1g10380 expressed protein
At1g28410 expressed protein
At1g77350 expressed protein
At1g01880 hypothetical protein contains similarity to DNA repair endonuclease GB:AAD47568 Gl:5712619 from [Drosophila melanogasteri
At1g28100 expressed protein
At1g35650 UIpI protease family PF02902: UIpI protease family, C-terminal catalytic domain; similar to At1g21020, At3g26530, At1g08760, At1g08740, At2g29240
At1g28560 expressed protein
At2g 13230 retroelement pol polyprotein -related
At2g40580 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069 N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At3g62320 hypothetical protein hypothetical protein At2g36110 - Arabidopsis thaliana EMBL:AC007135
At3g05340 pentatricopeptide (PPR) repeat-containing protein contains I NTE RPRQ: I PR002885 PPR repeats
At3g02630 acyl-[acyl-carrier-protein] desaturase (stearoyl-ACP desaturase), putative similar to Acyl-[acyl-carrier protein] desaturase from Sesamum indicum Gl:575942, Cucumis sativus SP
At3g08600 expressed protein
At4g03560 two-pore calcium channel (TPC1) identical to two-pore calcium channel (TPC1) [Arabidopsis thaliana] gi
At5g 13680 expressed protein similar to unknown protein (ref
Atδg 17420 cellulose synthase, catalytic subunit (IRX3) identical to gi:5230423
At5g56850 expressed protein similar to unknown protein (pir
At5g67460 glycosyl hydrolase family 17 similar to beta-1 ,3-glucanase Gl:6714534 from [Salix gilgiana]
At5g36200 hypothetical protein similar to unknown protein (pir
At5g54150 hypothetical protein similar to unknown protein (pir
At5g48700 ubiquitin family contains INTERPRO:IP R000626 ubiquitin domain
At5g23230 isochoπ'smatase hydrolase family low similarity to SP
At5g56040 leucine rich repeat protein kinase, putative contains leucine rich repeat (LRR) domains, Pfam:PF00560; contains protein kinase domain, Pfam:PF00069
At5g22870 hypothetical protein similar to unknown protein (gb
At3g23955 pseudogene, similar to hypothetical protein GB:AAD29066
At1g31090 hypothetical protein contains similarity to gi
At1g14250 hypothetical protein
At1g74190 leucine rich repeat protein family contains leucine rich-repeat (LRR) domains Pfam:PF00560, INTERPRO:IPR00161 1 ; contains similarity to Cf-2.1 [Lycopersicon pimpinellifolium] gi
At1g51160 expressed protein
At3g26310 cytochrome P450 family contains Pfam profile: PF00067 cytochrome P450
At1g18750 MADS-box protein similar to homeodomain transcription factor (AGL30) GI:3461830 from [Arabidopsis thaliana]
Atδg 17820 peroxidase, putative identical to peroxidase ATP13a [Arabidopsis thaliana] gi
At2g39880 myb family transcription factor (MYB25) contains Pfam profile: PF00249 myb-like DNA-binding domain
At2g20240 expressed protein
At2g44210 expressed protein Pfam profile PF03080: Arabidopsis proteins of unknown function
At3g 12970 expressed protein
At3g09030 expressed protein identical to GB:AAD56319 [Arabidopsis thaliana]
At3g02250 auxin-independent growth promoter -related similar to auxin-independent growth promoter GB:A44226 [Nicotiana tabacum]
At4g23380 hypothetical protein predicted proteins, Arabidopsis thaliana
At4g23110 hypothetical protein
At4g 13990 hypothetical protein
At5g43670 protein transport protein SEC23
At5g59800 hypothetical protein
At5g 16530 auxin efflux carrier protein family contains auxin efflux carrier domain Pfam:PF03547
At4g35410 clathrin assembly protein AP19 homolog
At2g 15000 expressed protein Nc d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At3g60830 actin - like protein actin 3, Drosophila melanogaster, PlR:A03000
At2g21770 cellulose synthase, catalytic subunit, putative similar to gi:2827141 cellulose synthase catalytic subunit, Arabidopsis thaliana (Ath-A)
At1g09240 nicotianamine synthase, putative similar to nicotianamine synthase [Lycopersicon esculentum][GI:4753801], nicotianamine synthase 2 [Hordeum vulgare][Gl:4894912]
At5g26780 glycine hydroxymethyltransferase - like protein glycine hydroxymethyltransferase, Solanum tuberosum, EMBLZ25863
At1g22910 RNA récognition motif (RRM) - containing protein contains InterPro entry IPR000504: RNA-binding région RNP-1 (RNA récognition motif) (RRM); similar to GB:AAC33496
At1g42460 UIpI protease family contains Pfam profile PF02902: UIpI protease family, C- terminal catalytic domain
At3g09670 PWWP domain protein
At3g44200 protein kinase family contains protein kinase domain, Pfam:PF00069; contains serine/threonine protein kinase domain, 1NTERPRO:1PR002290
At4g09350 DnaJ protein family similar to SP
At5g39880 expressed protein
At5g67490 expressed protein
At5g58860 cytochrome P450 86A1 identical to Cytochrome P450 86A1 (CYPLXXXVI) (P450-dependent fatty acid omega-hydroxylase) (SP:P48422) [Arabidopsis thaliana]
At5g 16070 chaperonin, putative similar to SWISS-PROT:P80317 T-complex protein 1 , zêta subunit (TCP-1-zeta) [Mus musculus]; contains Pfam:PF00118 domain, TCP- 1/cpn60 chaperonin family
At3g52680 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At2g35170 expressed protein
At2g23300 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative
At5g36070 hypothetical protein strong similarity to unknown protein (emb
At5g49780 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative
At1g37150 biotin holocarboxylase synthetase -related similar to biotin holocarboxylase synthetase GI:4874309 from [Arabidopsis thaliana] contains non-consensus GG acceptor splice sites.
At1g79710 hypothetical protein similar to hypothetical protein GB:AAC12874 [Synechococcus PCC7942]
At1g16420 hypothetical protein common family similar to At5g04200, At1g79340, At1g79320, At1g79310, At1g79330; similar to latex-abundant protein [GI:4235430][Hevea brasiliensis]
At2g33310 auxin-responsive protein IAA13 (Indoleacetic acid-induced protein 13) identical to SP
At2g22100 RRM-containing RNA-binding protein
At3g62680 proline-rich protein family contains proline-rich région, INTERPRO:IPR000694
At3g22180 DHHC-type zinc finger domain-containing protein contains Pfam profile PF01529: DHHC zinc finger domain
At3g21465 adenyl cyclase -related similar to adenyl cyclase GB:AAB87670 from [Nicotiana tabacum]
At4g 16420 transcriptional adaptor like protein
At1g47705 pseudogene, putative peroxidase similar to peroxidase GB:P00434 Gl:464365 from [Brassica râpa]
At1g10870 ARF GTPase-activating domain-containing protein
At1g07250 glycosyltransferase family similar to UDP-glucose glucosyltransferase Gl;453245 N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR from [Manihot esculenta]
At1g64105 No apical meristem (NAM) protein family contains Pfam PF02365: No apical meristem (NAM) domain
At1g10660 expressed protein
At1g60800 receptor-related kinase similar to somatic embryogenesis receptor-like kinase Gl:2224910 from [Daucus carota]
At2g32140 disease résistance protein (TIR class), putative domain signature TIR exists, suggestive of a disease résistance protein.
At2g33090 hypothetical protein
At2g47280 pectinesterase family contains Pfam profile: PF01095 pectinesterase
At2g41020 expressed protein
At2g44310 calcium-binding EF-hand family protein contains INTERPRO:IPR002048 calcium-binding EF-hand domain
At2g41450 GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) family low similarity to Swift [Xenopus laevis] Gl:14164561 ; contains Pfam profiles PF00583: acetyltransferase, GNAT family, PF00533: BRCA1 C Terminus (BRCT) domain
At3g23175 expressed protein supported by RACE -based full-length cDNA validâtes this gène structure. (Brassica génome séquence alignment supported. Work by cdtown, et al.)
At3g20840 ovule development protein, putative similar to ovule development protein AINTEGUMENTA (GI:1209099)[Arabidopsis thaliana]
At4g36750 quinone reductase family similar to 1 ,4-benzoquinone reductase [Phanerochaete chrysosporium][GI:4454993]; similar to Trp repressor binding protein [Escherichia CoIi][SP
At4g29000 transcription factor -related leghemoglobin activating factor - Glycine max, PID:e1374538
At5g22420 acyl CoA reductase-related protein
At5g01370 hypothetical protein
At5g03960 calmodulin-binding protein - related
At5g52050 MATE efflux protein - related contains Pfam profile PF01554: Uncharacterized membrane protein family
At4g29430 4OS ribosomal protein S15A (RPS15aE) ribosomal protein S15a - Brassica napus,P!R2:S20945
At2g 12700 hypothetical protein similar to GB:AAD23022
At4g05520 calcium-binding EF-hand family protein similar to EH-domain containing protein 1 from {Mus musculus} SP
At3g24020 disease résistance response protein-related contains similarity to disease résistance response protein 2Q6-d [Pisum sativum] gi
At5g63690 hypothetical protein
At3g46670 glucosyltransferase-related protein UDP-glucose glucosyltransferase - Arabidopsis thaliana, EMBL.-AB016819
At4g18010 inositol polyphosphate 5-phosphatase II (IP5PH) nearly identical to inositol polyphosphate 5-phosphatase II [Arabidopsis thaliana] GI:10444263 isoform contains an AT-acceptor splice site at intron 6
At1g80480 expressed protein contains Viral RNA helicase domain
Tableau III : N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At2g40100 light-harvesting chlorophyll a/b binding protein
At5g03880 auxin-regulated protein predicted protein, Arabidopsis thaliana
At4g10510 subtilisin-like serine protease contains similarity to subtilase; SP1 Gl:9957714 from [Oryza sativa]
At2g33840 tyrosyJ-tRNA synthetase -related
At5g05670 signal récognition particle receptor beta subunit-related protein
At1g53290 galactosyltransferase family contains Pfam profile: PF01762 galactosyltransferase ;contains similarity to Avr9 elicitor response protein Gl:4138265 from [Nicotiana tabacum]
At1g32700 expressed protein similar to hypothetical protein GB:AAF25968 Gl:6714272 from [Arabidopsis thaliana]
Atδg 16770 myb DNA-binding protein(AtMYB9)
At3g59200 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At3g43380 hypothetical protein hypothetical proteins - Arabidopsis thaliana
At5g38120 4-coumarate:CoA ligase (4-coumaroyl-CoA synthase) family similar to 4CL2, Arabidopsis thaliana [gi: 12229665], 4CL1 , Nicotiana tabacum [gi: 12229631]; contains Pfam AMP-binding enzyme domain PF00501
At4g07750 transposon protein -related similar to Arabidopsis thaliana putative En/Spm transposon protein (GB:AC005396)
At4g04710 calcium-dependent protein kinase, putative (CDPK) similar to calcium-dependent protein kinase [Nicotiana tabacum] gi
At5g 13350 auxin-responsive - like protein Nt-gh3 deduced protein, Nicotiana tabacum, EMBLAF123503
At2g20410 expressed protein
At5g39730 avirulence induced gène (AIG) - like protein AIG2 PROTEIN, Arabidopsis thaliana, SWISSPROT:AIG2_ARATH
At4g29905 expressed protein
At3g07300 expressed protein similar to translation initiation factor EIF-2B beta subunit GB:Q90511 [Fugu rubripes]
At4g30230 hypothetical protein
At2g01710 DnaJ protein family simlar to AHM1 [Triticum aestivum] Gl:6691467; contains Pfam profile PF00226: DnaJ domain
At2g34780 hypothetical protein
At4g20960 expressed protein riboflavin biosynthesis protein ribG, Synechocystissp., PIR2:S74377
At2g 19750 40S ribosomal protein S30 (RPS30A)
At5g65850 F-box protein family
At5g45830 tumor-related protein-like
At2g23070 casein kinase II alpha chain, putative similar to casein kinase II, alpha chain (CK II) [Zea mays] SWISS-PROT:P28523; contains protein kinase domain, Pfam:PF00069
At1g05300 métal transporter, putative (Zl P5) identical to putative métal transporter Zl P5 [Arabidopsis thaliana] gi
At1g36180 acetyl-CoA carboxylase -related similar to Gl: 1100253 from [Arabidopsis thaliana]
At4g 12390 pectinesterase - related low similarity to pectinesterase from Arabidopsis thaliana SP
At3g52520 hypothetical protein
At5g24600 expressed protein similar to unknown protein (pir
At1g78890 expressed protein
At5g56670 4OS ribosomal protein S30 (RPS30C) N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR cox11 Gl:1244782 from [Saccharomyces cerevisiae]
At5g6455Q expressed protein strong similarity to unknown protein (emb
At4g30370 C3HC4-type zinc finger protein family contains Pfam profile: PF00097 zinc finger, C3HC4 type (RING finger)
At1g12100 protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein (LTP) family contains Pfam protease inhibitor/seed storage/LTP family domain PF00234
At4g36210 expressed protein F35D11.3, Caenorhabditis elegans, PATX:G868225
At2g24180 cytochrome P450 family
At5g56410 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At4g 15830 expressed protein
At1g62170 serpin family similar to phloem serpin-1 Gl:9937311 from [Cucurbita maxima]; contains Pfam profile PF00079: Serpin (serine protease inhibitor)
At4g20000 expressed protein
At3g 13290 transducin / WD-40 repeat protein family contains 2 WD-40 repeats (PF00400); autoantigen locus HUMAUTANT (GI:533202) [Homo sapiens] and autoantigen locus HSU17474 (Gl:596134) [Homo sapiens]
At1g07620 GTP-binding protein -related similar to GB:M24537 from [Bacillus subtilis]
At4g24690 ubiquitin-associated (UBA)/PB1 domain-containing protein contains Pfam profiles PF00627: Ubiquitin-associated (UBA)ITS-N domain, PF00569: Zinc finger ZZ type domain, PF00564: PB1 domain
At5g04750 F1F0-ATPase inhibitor - like protein F1F0-ATPase inhibitor protein, OslF1-1, Oryza sativa, EMBL:AB029059
At3g26750 hypothetical protein
At5g52610 F-box protein family contains F-box domain Pfam:PF00646
At1g20190 expansin, putative (EXP11) similar to GB:U30460 from [Cucumis sativus]; alpha- expansin gene family, PMID: 11641069
At3g01310 expressed protein similar to unknown protein GB:BAA24863 [Homo sapiens], unknown protein GB:BAA20831 [Homo sapiens], unknown protein GB:AAB42264 [Caenorhabditis elegans]
At5g46180 ornithine-oxo-acid aminotransferase (omithine aminotransferase/omithine ketoacid aminotransferase), putative similar to SP
At5g47250 disease résistance protein (CC-NBS-LRR class), putative domain signature CC- NBS-LRR exists, suggestive of a disease résistance protein.
At3g46480 oxidoreductase, 2OG-Fe(II) oxygenase family low similarity to gibberellin 20- oxidase [gi:4678370]; contains Pfam domain PF03171 , 2OG-Fe(II) oxygenase superfamily
At2g28290 SNF2 domain/helicase domain-containing protein similar to transcriptional activator HBRM [Homo sapiens] Gl:414117; contains Pfam profiles PF00271: Helicase conserved C-terminal domain, PF00176: SNF2 family N-terminal domain
At3g55660 hypothetical protein various predicted proteins, Arabidopsis thaliana
At1g71740 hypothetical protein
At1g17940 hypothetical protein
At5g51440 heat shock protein, putative similar to heat shock 22 kDa protein, mitochondrial precursor SP:Q96331 from [Arabidopsis thaliana]
At1g10660 expressed protein
At1g23720 proline-rich protein family contains proline-rich extensin domains, INTERPRO:IPR002965
At3g 12700 gxpressed protein
At2g31380 sait tolerance-like protein
At5g49160 DNA (cytosine-5)-methyltransferase (DNA methyltransferase) (DNA metase) (sp N0 d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At4g 13900 disease résistance protein family contains leucine rich-repeat domains Pfam:PF00560, INTERPRO:IPR001611 ; similar to Cf-4A protein [Lycopersicon esculentum] gi
At5g56160 sec14 cytosolic factor family (phosphoglyceride transfer protein family) similar to SEC14 cytosolic factor (SP:P45816) [Candida lipolytica]
At5g05780 26S proteasome regulatory subunit S12 (RPN8), putative contains similarity to 26s proteasome regulatory subunit s12 (proteasome subunit p40) (mov34 protein) SP:P26516 from [Mus musculus]
At4g29410 6OS ribosomal protein L28 (RPL28C) unknown protein chromosome II BAC F6F22 - Arabidopsis thaliana,PID:g3687251
At3g07440 expressed protein est hits to genscan model
At1g79350 expressed protein
At5g3518Q expressed protein
At5g08520 expressed protein contains similarity to l-box binding factor
At1g03680 thioredoxin M-type 1 , chloroplast precursor (TRX-M1) nearly identical to SP
At4g07340 contains similarity to Xenopus laevis replication protein A1 (SW:RFA1_XENLA)
At3g50440 hydrolase, alpha/beta fold family similar to ethylene-induced esterase [Citrus sinensis] Gl: 14279437, polyneuridine aldéhyde esterase [Rauvolfia serpentina] Gl:6651393; contains Pfam profile PF0Q561 : hydrolase, alpha/beta fold family
At1g54480 leucine rich repeat protein family contains leucine rich-repeat (LRR) domains Pfam:PF00560, INTERPRO:IPR001611; contains similarity to disease résistance protein Gl:3894383 from [Lycopersicon esculentum]
At3g 13222 expressed protein
At4g34570 bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase 2 (DHFR-TS) (THY-2) identical to SP
Tableau IV:
N° d'accès Description (gènes homologues identifiés dans d'autres organismes) TAIR
At2g 14630 hypothetical protein contains Pfam profile PF03004: Plant transposase (Ptta/En/Spm family)
At3gO8943 pseudogene, importin beta subunit similar to importin-betai GB:BAA34861 , importin-beta2 GB:BAA34862 [Oryza sativa]; frameshift
At2g41970 protein kinase, putative similar to Pto kinase interactor 1 (serine/threonine protein kinase) [Lycopersicon esculentum] gi
At2g04750 fimbrin -related
AtCg00040 matK : maturase
At5g06340 diadenosine 5',5'"-P1,P4-tetraphosphate hydrolase, putative similar to diadenosine 5l,5"'-P1 ,P4-tetraphosphate hydrolase from [Lupinus angustifolius] Gl: 1888557, [Hordeum vulgare subsp. vulgare] GI.-2564253; contains Pfam profile PF00293: NUDIX domai?
At1g17170 glutathione transferase, putative One of three repeated putative glutathione transferases. 72% identical to glutathione transferase [Arabidopsis thaliana] (gi
AtCg00960 rrn4.5S : 23S ribosomal RNA
At1g67150 hypothetical protein
At2g24400 auxin-induced (indole-3-acetic acid induced) protein, putative (SAUR_d) similar to SAUR-AC-like protein (small auxin up RNA) (GI:4455308) from [Arabidopsis thaliana]; auxin-induced protein TGSAUR22 (Gl: 10185820) [Tulipa gesnerian]
At1g06560 expressed protein
At2g43640 signal récognition particle protein 14kD, ATSRP14 -related
At5g61700 ABC transporter family protein ABC family transporter, Entamoeba histolytica, EMBLEH058
AtCgOI 050 ndhD : NADH dehydrogenase subunit 4
At1g78980 leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative similar to leucine- rich repeat transmembrane protein kinase 2 GI:3360291 from [Zea maysj '
At2g24640 ubiquitin carboxyl terminal hydrolase -related
At3g50170 hypothetical protein various predicted gènes, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
At3g2519O intégral membrane protein -related contains Pfam profile: PF01988 intégral membrane protein; similar to nodulin-21 GB:CAA34506 [Glycine max]
At5g41970 GAMM 1 protein-related
At5g58020 expressed protein protein x 0001 , Homo sapiens, EMBLAF 117231
At1g52080 expressed protein
At5g55050 GDSL-motif lipase/hydrolase protein similar to family II lipases EXL3 Gl: 15054386, EXL1 Gl: 15054382, EXL2 Gl: 15054384 from [Arabidopsis thaliana]; contains Pfam profile PF00657: GDSL-like Lipase/Acylhydrolase
At4g30610 serine carboxypeptidase -related probable SERINE CARBOXYPEPTIDASE II-2 PRECURSOR - HORDEUM VULGARE,PIR2:T05701
AtI g 19210 AP2 domain transcription factor, putative similar to AP2 domain transcription factor GI:4567204 from [Arabidopsis thaliana]
At2g33330 expressed protein contains Pfam PF01657: Domain of unknown function
At1g13940 expressed protein identical to hypothetical protein GB:AAD39280 GI:5080770 from [Arabidopsis thaliana]
At5g09840 expressed protein similar to unknown protein (emb
At1g11915 expressed protein
At2g41620 expressed protein
At5g56910 expressed protein similar to unknown protein (pir
At1g62200 oligopeptide transporter -related similar to oligopeptide transporter 1-1 Gl:510238 from [Arabidopsis thaliana]; contains non-consensus GA donor site at intron 4
De préférence ledit acide nucléique d'adressage a une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm d'un gène sélectionné dans le groupe constitué des gènes montrés dans le Tableau V. Les gènes montrés dans le Tableau V correspondent au gène codant le facteur eucaryote d'initiation de la traduction elF4E et à une sélection de gènes figurant dans le Tableau III ayant un différentiel d'expression en faveur du stroma versus le chloroplaste, en faveur du stroma versus les ARN totaux, et en faveur du chloroplaste versus les ARN totaux.
Tableau V
Selon un mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique d'adressage a une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm du gène codant le facteur eucaryote d'initiation de la traduction elF4E (SEQ ID No.41) et/ou ses homologues dans les autres espèces et plus particulièrement dans la tomate et le piment (brevet WO03/066900).
La séquence transcrite de l'acide nucléique d'adressage utilisé pour mettre en œuvre la méthode selon l'invention est préférentiellement celle d'un ARNm d'un gène nucléaire qui est endogène (c'est-à-dire présent naturellement dans le génome nucléaire de la cellule qui est transformée) ou qui est exogène à la cellule végétale (par exemple un gène nucléaire dont un ARNm a été détecté dans un plaste dans une cellule appartenant à une autre espèce végétale que celle de la cellule transformée). De préférence, le gène nucléaire est endogène à la cellule végétale transformée.
Par "acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage" on entend que l'acide nucléique d'intérêt et l'acide nucléique d'adressage sont génétiquement liés, c'est-à-dire qu'ils font partie d'une même construction nucléotidique (ADN, ARN ou mixte ADN/ARN). De préférence ledit acide nucléique d'intérêt est fusionné audit acide nucléique d'adressage.
L'acide nucléique d'intérêt peut être une séquence d'ADN ou d'ARN. De la même manière l'acide nucléique d'adressage peut être une séquence d'ADN ou d'ARN. L'acide nucléique d'intérêt lié à l'acide nucléique d'adressage peut être un acide nucléique mixte ADN/ARN. De préférence l'acide nucléique d'intérêt et l'acide nucléique d'adressage sont tous deux une séquence d'ADN. De préférence également, l'acide nucléique d'intérêt et l'acide nucléique d'adressage sont tous deux une séquence d'ARN.
La cellule végétale peut être transformée avec un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage de manière à obtenir une expression stable d'au moins ledit acide nucléique d'intérêt. Selon ce mode de réalisation, l'acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage peut se présenter sous la forme d'une construction comprenant une séquence d'ADN d'intérêt liée à une séquence d'ADN d'adressage, ladite construction étant intégrée dans le génome nucléaire de la cellule végétale. La transcription de cette construction dans le noyau produit un transcrit comprenant une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'ARN d'adressage, le transcrit étant alors adressé vers un plaste de la cellule transformée.
La cellule végétale peut aussi être transformée avec un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage de manière à obtenir une expression transitoire d'au moins ledit acide nucléique d'intérêt et ceci par des méthodes connues de l'homme de l'art comme par exemple l'utilisation de polyéthylène glycol (PEG), une molécule non toxique capable d'induire la déstabilisation de la membrane plasmique et qui permet le transfert de l'ADN à travers celle-ci. Les molécules d'ADN peuvent alors migrer jusqu'au noyau, où certaines d'entre elles, avec une efficacité plus ou moins grande, sont susceptibles de s'intégrer dans les chromosomes. L'ADN peut aussi être encapsulé dans des liposomes, petites vésicules artificielles de phospholipides, capables de fusionner avec des protoplastes. Enfin, il est possible de faire de l'électroporation de protoplastes ce qui consiste à soumettre un mélange de protoplastes et d'ADN à une série de chocs électriques de courte durée et de tension élevée. Ces méthodes permettent d'étudier l'expression transitoire dans des protoplastes, et d'obtenir des plantes transgéniques pour les espèces chez lesquelles on maîtrise la régénération à partir de protoplastes. L'acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage peut donc se présenter sous la forme d'une construction comprenant une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'ARN d'adressage, ladite construction étant intégrée dans le cytosol de la cellule végétale. Cette construction d'ARN est alors adressée vers un plaste de la cellule transformée.
Ledit acide nucléique d'intérêt peut être une séquence codant une protéine, en particulier une protéine hétérologue. Par "protéine hétérologue" on entend une protéine qui n'est pas exprimée par la cellule végétale non transformée. Il peut s'agir d'une protéine recombinante normalement exprimée chez un organisme eucaryote, par exemple une protéine d'origine humaine, animale, ou végétale. Il peut s'agir en particulier :
- d'une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique telle que l'insuline, la lipase gastrique, le collagène, ou un allergène ;
- de la protéine HppD ou 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase de Pseudomonas fluorescens qui permet de moduler la biosynthèse de tocophérol dans les plantes (HPPD; Garcia et al. 1997, 1999; Norris et al., 1998),
- d'une protéine conférant une résistance à un herbicide tel que le précurseur de l'acétolactate synthétase (ALS) (Lee et al., 1988), l'acétolactate synthétase mutée (Preston et Powles, 2002), ou de la 3-énolpyruvylshikimate-5-phosphate synthétase (EPSP synthétase) (Klee et al., 1987) ;
- d'une protéine conférant une capacité à fixer l'azote ou à la photosynthèse accrue, une protéine conférant une résistance accrue à la sécheresse, au sel, ou aux températures extrêmes, par exemple ;
- d'une protéine conférant une résistance à des pathogènes tels que des insectes, champignons, bactéries, virus etc, telle qu'un inhibiteur de protéase, par exemple un inhibiteur de trypsine (Hilder et al., 1987), une toxine, par exemple les toxines de Bacillus thuringiensis (Vaeck et al., 1987 ; Fischhoff et al., 1987), etc.
Ledit acide nucléique d'intérêt peut aussi être une séquence non codante, telle qu'une séquence d'ARN antisens ou une séquence d'ADN dont le transcrit est un ARN antisens, ou encore un ARN interférant (ARNi, Sharp, 2001). Pour une description générale de la technologie antisens, l'homme du métier peut se référer par exemple à l'ouvrage « Antisense DNA and RNA » (CoId Spring Harbor Laboratory, D. Melton, éd. 1988).
La construction nucléotidique comprenant les acides nucléiques d'intérêt et d'adressage peut être préparée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par synthèse in vitro.
La construction nucléotidique utilisée pour transformer la cellule végétale dans la méthode d'adressage selon l'invention fait également l'objet de la présente demande. L'invention concerne plus particulièrement une construction d'acide nucléique comprenant un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire sélectionné dans le groupe constitué par les gènes figurant dans le tableau V. Ledit gène nucléaire est donc sélectionné dans le groupe des gènes ayant pour séquence codante SEQ ID No.1 , SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID NoJ, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11 , SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21 , SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33, SEQ ID No.35, SEQ ID No.37, SEQ ID No.39 et SEQ ID No.41 identifiées chez Arabidopsis thaliana et/ou leurs séquences homologues chez d'autres espèces.
Les constructions nucléotidiques mises en œuvre dans l'invention peuvent être des cassettes d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique d'intérêt lié à une séquence d'acide nucléique d'adressage, associées à des éléments permettant l'expression de la séquence d'acide nucléique d'intérêt dans les cellules végétales, notamment un promoteur et un terminateur de transcription, ou encore un activateur. D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadénylation et dérivées peuvent également être présents. La cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites "leader". De telles séquences peuvent améliorer la traduction
De très nombreux promoteurs de transcription peuvent être utilisés pour l'expression dans des cellules végétales. Il peut s'agir d'un promoteur constitutif, tel que le promoteur Actine-lntron-actine, correspondant à la région en 5' non codante du gène de l'actine 1 du riz et son premier intron (Mc Elroy et al., 1991 ; GenBank n° S44221). La présence du premier intron actine permet d'augmenter le niveau d'expression d'un gène lorsqu'il est fusionné en 3' d'un promoteur. Il peut également s'agir d'un promoteur inductible ou tissu-spécifique, par exemple afin que l'acide nucléique d'intérêt ne soit adressé vers un plastide qu'à certains stades de développement de la plante, que dans certaines conditions environnementales, ou que dans certains tissus-cibles. Des exemples de promoteurs tissu-spécifiques incluent le promoteur du virus de la Chlorelle régulant l'expression du gène de l'adénine méthyltransférase (Mitra et Higgins, 1994) ou le promoteur du virus de la mosaïque du manioc (Verdaguer et al., 1998) qui s'expriment principalement dans les tissus verts, ou les éléments régulateurs du promoteur du gène2A11 de la tomate qui permettent une expression spécifique dans les fruits (Van Haaren et Houck, 1991).
Parmi les terminateurs, on peut notamment citer : - le terminateur 3' Nos, terminateur de la nopaline synthase qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase provenant du plasmide Ti ό'Agrobacteirum tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al., 1982), et
- le terminateur 3' CaMV1 correspondant à la région 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S (Franck et al. 1980 ; GenBank n° V00141).
L'acide nucléique d'intérêt peut être associé ou, le cas échéant, constitué d'une séquence codant pour un agent de sélection. Peuvent être notamment utilisés des gènes qui confèrent une résistance à un antibiotique tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à des herbicides tels que le glufosinate, le glyphosate ou le bromoxynil. Préférentiellement, ledit gène codant un agent de sélection est choisi parmi le gène bar (White et al. 1990 ; GenBank n° X17220) qui confère la résistance à l'herbicide Basta® (glufosinate) et le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamycine (Bevan et al., 1983).
Pour la mise en œuvre de l'invention il est ainsi fourni un vecteur, notamment un plasmide, contenant au moins une construction d'acide nucléique telle que décrite précédemment.
L'invention porte en outre sur un hôte cellulaire, notamment une bactérie telle que Agrobacterium tumefaciens, transformé par ledit vecteur. Un tel hôte cellulaire e.st utile pour transfecter des cellules de plante avec un vecteur selon l'invention.
L'invention concerne également une cellule végétale transformée avec un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant détectable dans un plaste. De préférence ledit ARNm est un ARNm d'un gène nucléaire sélectionné dans le groupe constitué par les gènes figurant dans le tableau V et le gène elF4E.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par transfert d'un vecteur dans les protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PG) en présence de cations divalents (Ca2+) selon la méthode décrite dans l'article de Krens et al. (1982).
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm et al. (1986). La transformation des cellules végétales peut encore être réalisée par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de Finer et al. (1992).
Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.
De préférence les cellules végétales sont transformées par un vecteur par le biais d'un hôte cellulaire lui-même transformé par ledit vecteur, l'hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences d'acide nucléique d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné.
Avantageusement, l'hôte cellulaire utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de Bevan (1984) et d'An et al. (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Robaglia et al, (1987).
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994).
Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium.
L'invention concerne aussi la production de plantes transgéniques susceptible d'être régénérées à partir de la cellule végétale transformée, de même que les plantes transgéniques ainsi obtenues. L'invention comprend également les cellules et tissus végétaux, ainsi que les organes ou parties de plantes, y compris feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, et/ou graines obtenues à partir de ces plantes. De préférence la cellule végétale selon l'invention est une cellule de plante sélectionnée dans le groupe constitué du maïs, du blé, de la tomate, du tabac, et du riz.
Méthode de production de protéines d'intérêt dans les plastes La méthode d'adressage vers un plaste selon l'invention permet d'obtenir la translocation d'un ARN vers un plaste et donc une expression localisée au niveau du plaste de la protéine éventuellement codée par cet ARN. La production de protéines dans les plastes de cellules végétales est avantageuse en termes de facilité d'extraction, mais aussi de stabilité, puisque certaines protéases seraient peu représentées dans les plastes, et en particulier les chloroplastes.
L'invention concerne donc une méthode de production d'au moins une protéine d'intérêt dans un plaste d'une cellule végétale comprenant les étapes consistant à : a) transformer une cellule végétale avec un acide nucléique codant une protéine d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage, la séquence transcrite dudit acide nucléique d'adressage étant celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant détectable dans un plaste d'une cellule végétale ; et b) exprimer ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt.
De manière avantageuse, ladire méthode de production contient une étape supplémentaire d'extraction des protéines du plaste par les méthodes usuelles et connues de l'homme du métier.
Le plaste peut être sélectionné dans le groupe constitué d'un chloroplaste, d'un amyloplaste, d'un chromosplaste, d'un étioplaste, d'un gérontoplaste, et d'un proplaste. Préférentiellement ledit plaste est un chloroplaste.
De préférence ledit ARNm détectable dans un plaste est caractérisé par une concentration dans un plaste supérieure à sa concentration cytoplasmique. De préférence encore la concentration dans un plaste dudit ARNm est au moins 2 fois supérieure à sa concentration cytoplasmique. La détermination des concentrations respectives de l'ARNm dans le plaste et le cytoplasme peut être effectuée conformément aux méthodes décrites dans la présente demande.
De préférence encore, ledit acide nucléique d'adressage selon l'invention a une séquence d'ADN ou d'ARN dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire sélectionné dans le groupe par les gènes figurant dans le tableau V. Ledit gène nucléaire est donc sélectionné dans le groupe des gènes ayant pour séquence codante SEQ ID No.1 , SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11 , SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21 , SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31 , SEQ ID No.33, SEQ ID No.35, SEQ ID No.37, SEQ ID No.39 ou SEQ ID No.41 identifiées chez Arabidopsis thaliana et/ou leurs séquences homologues chez d'autres espèces. Selon un mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique d'adressage a une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm du gène codant le facteur eucaryote d'initiation de la traduction elF4E.
Avantageusement ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt est fusionné audit acide nucléique d'adressage.
L'acide nucléique codant une protéine d'intérêt et l'acide nucléique d'adressage peuvent être tous deux une séquence d'ADN. L'acide nucléique codant une protéine d'intérêt et l'acide nucléique d'adressage peuvent aussi être tous deux une séquence d'ARN.
La cellule végétale peut être transformée avec ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage de manière à obtenir une expression transitoire ou stable de la protéine d'intérêt, de préférence de manière à obtenir une expression stable.
La protéine d'intérêt peut être une protéine hétérologue. Par "protéine hétérologue" on entend une protéine qui n'est pas exprimée par la cellule végétale non transformée. Il peut s'agir d'une protéine recombinante normalement exprimée chez un organisme eucaryote, par exemple une protéine d'origine bactérienne, humaine, animale, ou végétale. Il peut s'agir en particulier d'une protéine d'intérêt agronomique, telle qu'une protéine conférant à la plante une résistance à un herbicide (par exemple le Basta), une protéine (une toxine ou protéase, par exemple) conférant à la plante une résistance à des pathogènes tels que des insectes, champignons, bactéries, virus etc, une protéine conférant une capacité à fixer l'azote ou à la photosynthèse accrue, une protéine conférant une résistance accrue à la sécheresse, au sel, ou aux températures extrêmes. Il peut aussi s'agir d'une protéine d'intérêt industriel, telle qu'une enzyme utilisée dans des procédés agrochimiques. La protéine peut aussi être une protéine d'intérêt thérapeutique et/ou prophylactique, comme l'insuline par exemple. L'invention ne se limite pas à cette méthode de production et toute méthode connue par l'homme du métier peut être envisagée. En particulier, on peut envisager l'utilisation d'un opéron pour la production des protéines dans le plaste. Un opéron est une unité d'expression et de régulation des gènes bactériens comprenant des gènes structuraux et des éléments de contrôle dans l'ADN, reconnue par des produits de gènes régulateurs. L'invention comprend également le mode de mise en œuvre dans lequel l'ARN d'intérêt est sous la forme d'un ARN de type opéron, donnant plusieurs protéines, après traduction dans le plaste. Ce mode de mise en œuvre permet d'obtenir la production coordonnées de plusieurs protéines dans le plaste, en utilisant un seul construit. Un système de production de protéine dans le plaste comprenant l'opéron lactose (opéron inductible sous contrôle négatif) peut être utilisé selon un mode de réalisation de l'invention.
Méthode d'identification d'ARN capables d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste
Les inventeurs ont montré que des ARNm, transcrits de gènes nucléaires, qui ont été localisés dans des plastes, et en particulier qui sont présents dans les plastes avec une concentration supérieure à leur concentration cytoplasmique, permettent de transloquer une séquence d'ARN à laquelle ils sont liés depuis le noyau et/ou le cytosol d'une cellule végétale vers un plaste.
L'invention propose donc une méthode d'identification d'un ARN capable d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, dans laquelle on détermine la concentration d'un ARN candidat dans un plaste et dans le cytoplasme d'une cellule végétale, et où on identifie, en tant qu'ARN capable d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, un ARN dont la concentration dans le plaste est supérieure à sa concentration dans le cytoplasme.
De préférence, on identifie, en tant qu'ARN capable d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, un ARN dont la concentration dans le plaste est au moins 2 fois supérieure à sa concentration dans le cytoplasme.
Pour identifier ces ARN d'intérêt on peut utiliser une méthodologie telle que décrite dans l'exemple 1. On peut par exemple marquer une population d'ARN plastidiaux et une population d'ARN totaux, chacune avec cy3 et cy5, respectivement. Pour comparer la concentration relative d'un gène X dans ces deux populations, on peut procéder à un "dye swap", c'est-à-dire mettre respectivement à hybrider sur deux lames portant un oligonucléotide spécifique du gène X, les mélanges (population d'ARN plastidiaux)-cy3 + (population d'ARN totaux)-cy5 et (population d'ARN plastidiaux)-cy5 + (population d'ARN totaux)-cy3. Le niveau d'hybridation à l'oligonucléotide est quantifié en mesurant la moyenne des intensités de fluorescence cy3 et cy5, normalisées en soustrayant le bruit de fond local, pour une même population d'ARN (acquisition des images à l'aide de ArrayScanner Génération III, Molecular Dynamics, et numérisation des images à l'aide de ImageQuant 5.2, Amersham Biosciences). Le niveau relatif de l'ARNm du gène X dans les ARN plastidiaux par rapport aux ARN totaux est alors estimé en calculant le rapport de la moyenne d'intensité de fluorescence dans les ARN plastidiaux sur la moyenne d'intensité de fluorescence dans les ARN totaux. On peut identifier, en tant qu'ARN d'intérêt, un ARN pour lequel la moyenne géométrique des intensités moyennes de fluorescence, dans les populations d'ARN plastidiaux et totaux, est supérieure à -2, et pour lequel le rapport de la moyenne d'intensité de fluorescence, dans les ARN totaux, sur la moyenne d'intensité de fluorescence, dans les ARN plastidiaux est compris entre 0 et 0,5.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter sa portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Identification d'ARNm de gènes nucléaires ayant une localisation plastidiale
Matériels et méthodes
Purification des chloroplastes d'Arabidopsis thaliana
Les chloroplastes bruts ont été obtenus à partir de feuilles d'Arabidopsis thaliana selon une méthode dérivée du protocole décrit par Ferro et al., (Mol CeII Proteomics, 2003). Toutes les opérations ont été menées à 0-50C dans des tampons dépourvus de RNAse.
Avant le début de l'extraction, préparer 6 tubes contenant 30 ml d'une solution contenant : 50% de Percoll, sorbitol 0,4 M, Tricine-KOH 20 mM, MgCI2 5 mM et EDTA 2,5 mM. Préformer les gradients de Percoll pour la purification des chloroplastes par centrifugation à 38700 g pendant 55 min (rotor Sorvall SS-34). Stocker les tubes contenant ces gradients de Percoll préformés à 0-50C.
Les plantes (400-500 g de feuilles) sont placées dans l'obscurité à 4°C pendant la nuit précédant l'extraction, lavées à l'eau désionisée puis séchées sur papier filtre avant broyage. Le matériel (400-500 g de feuilles pour 2 litres de tampon de broyage contenant: sorbitol 0,4 M, Tricine-KOH 20 mM pH 8,4, EDTA 10 mM, NaHCO3 10 mM et 0.1 mg/mL de sérum albumine bovine (BSA) dégraissée) deux fois 2 secondes dans un Waring Blendor à faible vitesse. Le broyât est filtré rapidement à travers 4-5 couches de gaze et une épaisseur de nylon blutex. La solution filtrée est répartie équitablement dans 6 tubes à centrifugation (500 ml chacun) et centrifugée à 2070 g pendant 2 min (rotor Sorvall GS 3). Le surnageant est éliminé et les culots d'organites sont repris dans un volume final de milieu de lavage contenant: sorbitol 0,40 M, Tricine-KOH 20 mM, pH 7.6, MgCI2 5 mM, EDTA 2,5 mM. Déposer la suspension de chloroplastes (6 ml par tube) au sommet des gradients de Percoll préformés. Centrifuger les gradients à 13,300 g pendant 10 min (swinging rotor Sorvall HB-6). Récupérer les chloroplastes intacts (une bande de couleur vert foncé localisée dans la partie basse du gradient) avec une pipette. Diluer 3-4 fois la suspension de chloroplastes intacts dans 200-300 ml de milieu de lavage contenant : sorbitol 0,40 M, Tricine-KOH 20 mM, pH 7.6, MgCI25 mM, EDTA 2,5 mM. Centrifuger la suspension à 2070 g pendant 2 min (rotor Sorvall SS-34). Récupérer chaque culot, contenant les chloroplastes lavés, purifiés et intacts pour la préparation des ARNs et/ou la prépartion du stroma. A la fin de cette étape, le rendement de chloroplastes intacts est de 50 à 60 mg de protéines.
Contrôle de la pureté des organites purifiés
La pureté des chloroplastes purifiés est contrôlée à l'aide de différentes méthodes. (1) Des marqueurs enzymatiques : par exemple, la Fumarase (EC 4.2.1.2), marqueur de la contamination par des mitochondries ; Hydroxypyruvate reductase (EC 1.1.1.81), marqueur de la contamination par des peroxisomes ; (2) Des marqueurs immunologiques : par exemple, des anticorps dirigés contre la sous- unité T de la glycine-decarboxylase (marqueur de la contamination par des mitochondries); des anticorps dirigés contre l'histone H3 (marqueur de la contamination par des noyaux ). (3) des études protéomiques qui n'ont pas permis de détecter des protéines issues des noyaux, des mitochondries, ou du cytosol dans l'enveloppe des plastes d'Arabidopsis purifiés selon ce protocole. Purification du stroma des chloroplastes d'Arabidopsis thaliana Toutes les opérations ont été menées à 0-50C dans des tampons dépourvus de RNAse. Les chloroplastes intacts et purifiés à partir de feuilles d'Arabidopsis thaiiana ont été lysés dans un milieu hypotonique contenant, MOPS-NaOH 10 mM, pH 7,8, MgCI24 mM). Le stroma a été purifié à partir du lysat par centrifugation sur gradients (6 tubes, 13.2 ml, Ultraclear, Beckman) de saccharose contenant: MOPS- NaOH 10 mM, pH 7.8, MgCI2 4 mM en trois couches de 0,3 M, 0,6 M et 0,93 M saccharose. Les chloroplastes lises (ajuster à un volume final de 21 ml) sont déposés au sommet des gradients de saccharose (3,5 ml par tube). Les tubes sont centrifugés à 70000 g pendant 1 h (rotor Beckman SW41-TÎ). Après cette étape de centrifugation, le stroma, localisé au sommet du gradient est prélevé pour les extractions d'acides nucléiques. A la fin de cette étape, le rendement en stroma est d'environ 30 mg de protéines.
Contrôle de la pureté du stroma purifié
La pureté du stroma purifié est contrôlée à l'aide de différents marqueurs immunologiques : par exemple, des anticorps dirigés contre la protéine E 37 ou la protéine ceQORH (marqueurs de la contamination par l'enveloppe des chloroplastes); des anticorps dirigés contre les protéines LHCPs (marqueurs de la contamination par des thylacoïdes ). Ces études n'ont pas permis de détecter des protéines issues de l'enveloppe ou des thylacoïdes dans les fractions de stroma purifiées selon ce protocole.
Extraction de l'ARN des chloroplastes
Un culot de chloroplastes purifiés conservé à -8O0C est mis en suspension par homogénéisation au vortex dans 7 ml de tampon d'extraction (50 mM Tris-HCI pH 8, 300 mM NaCI, 2% SDS1 5 mM EDTA pH 8, 0,5 mM d'acide aurintricarboxylique, 14,3 mM β-mercaptoéthanol, 0,5% polyvinylpyrrolidone, PM 360 000) préparé extemporanément, puis placé au bain-marie à 65°C pendant 15 min en agitant toutes les 2-3 minutes.
La solution est divisée et transférée dans deux tubes, puis centrifugée à 12 500 g à température ambiante pendant 15 min. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube auquel sont ajoutés 0,35 ml de KOAc 3M, pH 4,8. La solution est homogénéisée et laissée dans la glace 30 minutes avant centrifugation à 10000 g pendant 10 min à 4°C. (1) Le surnageant est transféré dans un nouveau tube et 2 ml de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (IAA) (25:24:1) sont ajoutés. La solution est homogénéisée au vortex pendant 2 à 3 min puis centrifugée à 4 000 g pendant 15 min. L'étape (1) est répétée jusqu'à l'homogénisation puis 2 ml de chloroforme sont ajoutés à la phase aqueuse, la solution est homogénéisée au vortex pendant 2 à 3 min avant centrifugation pendant 15 min à 4000 g. Les deux surnageants sont transférés dans un seul tube contenant 100 mg de PVPP, puis incubés 20 min à 78°C en agitant doucement toutes les 2 à 3 minutes. Le tube est ensuite refroidi sur de la glace. On ajoute 2,85 ml d'eau et 10,85 ml de chloroforme/IAA (24 : 1) par 8 ml de surnageant, puis la solution est homogénéisée au vortex pendant 2 à 3 min avant centrifugation pendant 10 min à 4000 g. Le surnageant est transféré dans un tube et 4 ml de chloroforme/IAA (24 : 1) sont ajoutés, l'ensemble est homogénéiser au vortex puis centrifuger 10 min à 4000g. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube et 8ml d'isopropanol sont ajoutés. L'ensemble est mélangé et incubé à -200C pendant 12h. Après centrifugation à 5000 g pendant 45 min à 4°C, le culot est lavé avec de l'éthanol 70% avant d'être repris dans 500 μl d'eau et centrifugé à 10000 g pendant 5 min à 4°C. Le surnageant est alors transféré dans un tube Eppendorf où on ajoute 1 ml d'eau et 391 μl de LiCI 8M puis laissé 3 h à 4°C. Après centrifugation à 10000 g pendant 20 min à 40C, le culot est lavé avec de l'éthanol 70% puis repris dans 100 μl d'eau sans RNase.
Extraction d'ARN stromal
Environ 1 ml de surnageant de stroma congelé est transféré dans un tube contenant un mélange, préalablement chauffé à 8O0C, contenant 2 ml de tampon TLES (Tris pH 8 100 mM, LiCI 100 mM, EDTA pH 8 10 mM, SDS 1%, PVPP 1 %, PVP 1 %, 5 mM DTT) et 2 ml de phénol. Après homogénisation (2 min au vortex) et centrifugation (15 min 4000 g), la phase supérieure est prélevée. 1 ml de tampon TLES est ajouté à la phase phénolique résiduelle, puis le mélange est agité et centrifugé. La phase supérieure est prélevée et rassemblée avec celle préalablement mise de côté. Une solution de LiCI 8M est ajoutée de façon à obtenir une concentration LiCI 2M finale, TARN est ainsi précipité une nuit à 40C. Après centrifugation le culot est repris dans 100 μl d'eau.
L'ARN est purifié à l'aide du kit Rneasy (Qiagen). Selon le protocole du fabricant, 350 μl de tampon RLT+ 3,5 μ| de β-Mercaptoéthanol et 250 μl d'éthanol absolu sont ajoutés ; l'ensemble est homogénéisé et centrifugé 15 secondes à 10000 rpm. 500μl de tampon RPE sont ajouté sur la membrane et l'ensemble est centrifugé 15 secondes à 10000 rpm. L'éluat est éliminé et la colonne est lavée à nouveau avec 500 μl de tampon RPE l'ensemble est centrifugé 2 minutes à 10000 rpm une première fois puis une seconde pour éliminer les traces d'éthanol. L'ARN est elué en ajoutant 30 μl d'eau RNase free sur la colonne. Après 1 minute, l'ensemble est centrifugé 1 minute 10000 rpm. L'élution est renouvelée avec 30 μl d'H2O. Les 2 éluats sont rassemblés et la solution est dosée.
Extraction des ARN totaux de feuilles
1 g de matériel végétal est broyé dans de l'azote liquide. La poudre obtenue est transférée dans un flacon contenant 2 ml de phénol et 2 ml de tampon TLES préalablement chauffés à 800C ; l'ensemble est mélangé au vortex pendant 2 min avant d'ajouter 2 ml de chloroforme/lsoamyl Alcool (C/IA) (24 : 1) et de mélanger à nouveau au vortex pendant 2 min puis de centrifuger 12 min à 5000 g à 15°C. Le surnageant est récolté. 1 ml de tampon TLES est ajouté à la phase phénolique restante ; on mélange au vortex pendant 2 min et avant de centrifuger 10 min à 5000 g à' 15°C. Le surnageant est à nouveau prélevé et rassemblé avec le premier surnageant récolté. Une ou plusieurs extractions au phénol/chloroforme/acide isoamylique (25:24:1) peuvent être effectuées si une interface blanchâtre entre la phase aqueuse et la phase phénolique est visible
Un volume de chloroforme/lsoamylic alcool est ajouté à la phase aqueuse issue de l'extraction par le mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique. On mélange au vortex pendant 2 min et avant de centrifuger 10 min à 5000 g à 4°C. Le surnageant est récolté et la concentration de la solution est ajustée à 2M de LiCI avec du LiCI 8M. L'ARN précipite une nuit à 4°C. Le mélange est centrifugé 45 min à 12000 rpm à 40C puis le culot est resuspendu avec 100 μl d'H2O MiIIiQ pour Mini RNA Clean Up (Qiagen).
L'ARN est purifié à l'aide du kit Rneasy (Qiagen). 350 μl de tampon RLT+ 3,5 μl de β-Mercaptoéthanol (ajouté extemporanément) et 250 μl d'éthanol absolu sont ajoutés, l'ensemble est homogénéisé et centrifugé 15 secondes à 10000 rpm. 500μl de tampon RPE sont ajoutés sur la membrane et l'ensemble est centrifugé 15 secondes à 10000 rpm. L'éluat est éliminé et la colonne est lavée à nouveau avec 500 μl de tampon RPE ; l'ensemble est centrifugé 2 minutes à 10000 rpm une première fois puis une seconde pour éliminer les traces d'éthanol. L'ARN est elué en ajoutant 30 μl d'eau RNase free sur la colonne. Après 1 minute, l'ensemble est centrifugé 1 minute 10000 rpm. L'élution est renouvelée avec 30μl d'H2O. Les 2 éluats sont rassemblés et la solution est dosée.
Synthèse des sondes marquées Cy3 ou Cy5 à partir des ARN totaux
• Synthèse de la sonde marquée Cy3 ou Cy5
3 μg d'ARN totaux sont placés dans 8,5 μl d'H2O sans RNase. On ajoute 0,5 μl de spike 2 μl de nonamères aléatoires. Le mélange est incubé 10 minutes à 700C puis placé dans la glace pendant 1 min et centrifugé. Le mélange est ensuite incubé 10 minutes à température ambiante.
On prépare un tampon d'incubation, à ajouter à l'ARN, qui comprend pour une sonde 4 μl de tampon 5x SSII, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl d'un mélange de dNTP, 1 μl de dCTP Cy3 ou Cy5, 200 U de Superscript II (Invitrogen).
Le mélange d'incubation est ajouté à l'ARN et incubé 10 minutes à température ambiante, puis 3 heures à 42°C. 2 μl de NaOH 2,5 M sont ajoutés. Le tout est incubé alors 10 minutes à 370C, puis sont ajoutés 10 μl de tampon HEPES 2 M pH 8.
* Purification de la sonde marquée Cy3 ou Cy5
Les sondes sont purifiées à l'aide du Kit de purification QIAGEN selon le protocole du fournisseur. Brièvement, 500 μl de tampon PB sont ajoutés à la sonde. Le mélange est déposé sur colonne puis centrifugé pendant 2 min à 14000 rpm, la colonne est lavée par ajout de 500 μl de tampon de lavage PE puiscentrifugée 1 min 14000 rpm, le tube collecteur est vidé et 500 μl de tampon de lavage PE sont ajoutés l'ensemble est centrifugé 1 min à 14000 rpm ; le tube collecteur est vidé puis 500 μl de tampon de lavage PE sont ajoutés, l'ensemble est centrifugé 1 min à 14000 rpm, le tube collecteur est vidé puis centrifugé 1 min à 14000 rpm pour assécher correctement la colonne. La colonne est placée dans un nouveau tube collecteur, et 50 μl de tampon d'élution sont ajoutés sur la membrane et laissés 1 min à température ambiante. L'ensemble est centrifugé 1 min à 14000 rpm. Une seconde elution est effectuée comme précédemment à l'aide de 50 μl de tampon d'élution. Préparation des lames (spotting)
Les lames utilisées pour l'hybridation sont préalablement spottées à l'aide d'un robot (spotter Lucidea, Amersham Biosciences). Les 26000 oligonucléotides (set unigene 26K Operon), chacun correspondant à un gène du génome d'Arabidopsis, sont répartis dans des plaques format 384, en solution dénaturante, à une concentration de 2 μM. Les 130 amplicons correspondants aux gènes du génome de chloroplaste et aux transcrits mitochondriaux sont en solution dénaturante à une concentration de 50 ng/μl. L'ensemble de la matrice Arabidopsis (génome nucléaire et organites) est déposé sur des lames de verre Type 7 Star (Amersham Bioscience). Les lames sont sèchées dans l'enceinte du spotter à une hygrométrie de 50 % toute une nuit. Puis, chaque lame est exposée sous UV à 500 mJ pendant 15 secondes (cross-linking).
Hybridation sur lame
Classiquement lorsque l'on effectue une expérience microarray et que l'on compare le niveau d'expression dans un échantillon A par rapport à un échantillon B, plusieurs répétitions techniques (3) d'un « dye Swap » sont réalisées. Un « dye- swap », ou inversion de fluorochromes, est une deuxième expérience d'hybridation avec inversion des deux fluorochromes par rapport à la population. Cela correspond donc à deux hybridations sur deux lames différentes. Les données issues de l'hybridation des deux lames sont habituellement traitées ensemble.
Pour une expérience en swap classique, 6 tubes sont préparés de la façon suivante : 3 x tube A contenant 50 pmoles Population A cy3 + 50 pmoles Population B cy5, et 3 x tube B contenant 50 pmoles Population B cy3 + 50 pmoles Population A cy5. Les sondes sont évaporées au speed vack. Préhybridation des lames : les lames sont préhybridées dans une solution préparée extemporanément de composition suivante : 5X SSC, 0.1% SDS, 0.1% BSA. La solution est placée à 42°C pendant 2 heures puis les lames sont trempées dans le tampon à 420C sous agitation pendant 45 min. Les lames sont rincées dans 3 bains successifs d'eau puis séchées à l'azote.
6 lames qui se suivent dans l'ordre de spotting d'une même sessions de spotting sont associées comme suit avec les tubes de sondes :
Traitement des lamelles : les lamelles sont immergées dans une solution de SDS 1 % et incubées dans un sonicateur pendant 5 minutes. Les lamelles sont rincées 5 fois avec de l'eau milliQ puis immergées dans EtOH 70%. Les lamelles sont séchées à l'azote.
Hybridation : après évaporation, chaque sonde (tube A ou B) est reprise dans 10,5 μl H2O et 3 μl d'ADN fractionné de sperme de hareng (0,1 mg/ml, Ci 1 mg/ml), et dénaturée 2 minutes à 95°C , 30% formamide, 1X tampon d'hybridation Amersham Biosciences. Les sondes sont dénaturées 2 min à 95°C puis conservées dans la glace.
Pour l'hybridation, la sonde est déposée sur la lamelle et la lame recouvre la lamelle. L'ensemble est déposé dans une chambre d'hybridation Corning et incubé au bain-marie à 37°C durant 16 heures. Les lames sont lavées sous agitation dans les bains succesifs suivants : 2X SSC 0,1% SDS 5 min à 37°C, 2X SSC 0,1% SDS 5 min à 370C, 0,2X SSC 1 minute à température ambiante, 0,1X SSC 1 min à température ambiante puis dans l'eau. Les lames sont séchées à l'azote puis scannées.
Acquisition des images
La lecture optique des puces est réalisée à l'aide d'un scanner ArrayScanner Génération III (Molecular Dynamics) muni de deux lasers. Ces deux lasers excitent les deux molécules fluorescentes, Cy3 et Cy5 par émission des deux longueurs d'onde respectives de 550 nm et de 649 nm. Les photons émis en retour par les fluorochromes sont captés par un photomultiplicateur (PMT) réglé à 700 V et transformés en signal électrique amplifié qui est converti en deux images numériques en niveau de gris, une pour chaque longueur d'onde.
Traitement des images
Les images numérisées sont visualisées à l'aide du logiciel ImageQuant 5.2 (Amersham Biosciences) pour contrôler leur qualité globale. Ensuite, le logiciel ArrayVision 7.0 (Amersham Biosciences) permet l'analyse des images et la méthode utilisée fournit entre autres paramètres une valeur des intensités mesurées pour chaque spot ainsi que le bruit de fond avoisinant. C'est à cette étape que les spots sont annotés, le logiciel attribue à chaque spot ses coordonnées et l'identifiant du gène qui lui correspond.
Normalisation
Pour les comparaisons ARNtotaux_ARNchloro et ARNtotaux_ARNstroma, il a été choisi d'effectuer une normalisation par swap. Dans ce cas, 2 lames d'un swap sont associées et pour chaque intensité, le bruit de fond local est soustrait. La moyenne des intensités correspondant à la même population d'ARN est calculée. Le bruit de fond pouvant être parfois supérieur à la valeur de fluorescence mesurée, la poyenne des intensités mesurée pour une population peut être une valeur négative. Le rapport des 2 moyennes est déterminée (RatioAB). Lorsqu'il y a plusieurs réplicats techniques un deuxième ratio (ratioAB 2) est calculé. On calcule également un facteur A, qui est la moyenne géométrique des intensités moyennes mesurées dans chacune des deux populations d'ARN comparées (par exemple A =
~JlntARNtotαux*IntARNchloro si lntARNtotaux>0 et lntARNchloro>0, ou A =
IntARNtotαux* IntARNchloro si lntARNtotaux<0 ou lntARNchloro<0).
Pour la comparaison ARNstroma_ARNchloro, la procédure de normalisation est différente. 3 répétitions techniques ou 3 swaps (6 lames) ont été réalisées. Le bruit de fond a été soustrait des intensités et les 6 lames ont été normalisées indépendamment par la méthode Loess par bloc (Lonnstedt et Speed, 2002). Pour chaque lame, le ratio intensité stroma/intensité chloro est calculé puis converti en Iog2- La moyenne des 6 valeurs de Iog2(ratio) est calculée et correspond à M. Le RatioAB est le rapport de la moyenne des intensités correspondant à l'ARNstroma sur la moyenne des intensités correspondant à l'ARNchloroplaste. Un test statistique bayesien (Yang et al., 2002) a été appliqué pour comparer les 6 valeurs d'intensité correspondant à la population d'ARN chloro au 6 valeurs d'intensité correspondant à la population d'ARN stroma. Le ratio stroma/chloro est la moyenne des 6 ratios stroma/chloro de chaque lame. T est Ia valeur du test statistique, pvalue est la p value correspondante et B correspond à la probabilité que le ratio chloro/stroma soit différent de 0 sur la probabilité que le ratio soit égale à 1. Quand B est supérieur à 0 le gène a une probabilité plus grande d'être différentiellement exprimé que d'être invariant. Résultats
La comparaison des ARNtotaux avec les ARNstroma a permis d'identifier les 1222 gènes d'Arabidospsis listés dans le Tableau I. Les gènes sélectionnés répondaient aux critères suivants : A>-2 pour les 3 swaps, moyenne des ratios ARNtotaux_ARNstroma des swaps compris entre 0 et 0,5 et coefficient de variation <
Une comparaison des ARNchloro avec les ARNtotaux a permis d'identifier les 1315 gènes d'Arabidospsis répondant aux critères suivants : A>-2 pour les 3 swaps, moyenne des ratios ARNtotaux_ARNchloro des swaps compris entre 0 et 0,5 et coefficient de variation < 0,1. Cette liste de 1315 gènes a été croisée avec la liste des 1222 gènes précédemment sélectionnés et a conduit à la sélection de 683 gènes communs, qui sont reportés dans le Tableau II.
Une comparaison ARNstroma/ARNchloro, avec une normalisation de type Loess par bloc, a conduit à la sélection de 109 gènes (Tableau III) dont l'expression est supérieure dans le stroma par rapport au chloroplaste à et aux ARN totaux et dont l'expression est supérieure dans le chloroplaste par rapport aux ARN totaux. Ces gènes répondent aux critères : valeur du test statistique Bayesien>0 et M>0.
Une liste de 46 gènes, montrée dans le Tableau IV, a été établie en croisant deux sélections de gènes. La première sélection de 287 gènes a été effectuée à partir d'une comparaison ARNchloro/ARNtotaux sur la base des critères suivants : moyenne des ratios AB des swaps >1 ,5, variance < 0,001 ou ratio >5 s'il n'y a pas de seuil de variance. La deuxième sélection de 706 gènes a été effectuées à partir d'une comparaison ARNtotaux/ARNstroma sur la base des critères suivants : moyenne des ratios des 2 swaps <0,66, variance < 0,001 ou ratio >0,2 s'il n'y a pas de seuil de variance. Les 46 gènes identifiés sont les gènes communs à ces deux sélections.
Exemple 2: Mise en évidence d'un adressage de l'ARNm du facteur d'initiation de la transcription eucaryote 4E (elF4E) vers les chloroplastes Matériels et méthodes
Analyse par Hybridation et synthèse des sondes ARN L'hybridation in situ a été effectuée comme décrit dans Rodriguez et al. (1998) avec des antisens marqués à la digoxygénine. Les sondes ARN et les analyses par Nothern blot ont été effectuées selon les procédures standard (Sambrook et al., 1989). Les sondes d'ADNc ont été marquées par amorçage aléatoire en utilisant du 32P-dCTP et les sondes ARN ont été marquées par transcription in vitro en utilisant soit du 32P-UTPoU la digoxygénine (DIG RNA Labelling kit, Roche diagnostics).
Purification des chloroplastes et extraction d'acides nucléiques Toutes les opérations ont été menées à 0-5°C. Les chloroplastes bruts ont été obtenus à partir de feuilles (6 g de A. thaliana, 30 g de N. tabacum, 100 g de L sativa ou 4 kg de S. oleracea). Les plantes ont été placées dans le noir à 4°C pendant la nuit et les chloroplastes ont été extraits dans un tampon isoosmotique (A thaliana et N. tabacum : TRIS-HcI pH 8, 20 mM, EDTA, 0,33 M Sorbitol, 0,1% βmercaptoethanol ; L Sativa : 0,4 M sorbitol, 10 mM NaCI, 50 mM MOPS pH 7 ; S. oleracea : 0,33 M saccharose, 20 mM MOPS pH 7.8) et purifiés par centrifugation isopycnique sur gradients de Percoll préformés (Douce et Joyard, 1982). Les chloroplastes de N. tabacum ont aussi été obtenus à partir de protoplastes comme décrit dans Charbonnier et al. (1987).
Les chloroplastes intacts purifiés de S. oleracea ont été lysés dans un milieu hypotonique, et le stroma, et les membranes de thylakoïde et d'enveloppe ont été purifiés à partir du lysat par centrifugation sur gradients de saccharose, (Douce and Joyard, 1982). L'ARN ou I7ADN chloroplastique des fractions sous-chloroplastiques ont été extraits des chloroplastes intacts purifiés ou des fractions sous-plastidiales purifiées par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol. Pour les analyses par Southern blot, les acides nucléiques chloroplastiques ont été traités avec de la ARNase et digérés avec les enzymes de restriction appropriées.
Traitement des chloroplastes purifiés par ARNase et protéase
Les protoplastes intacts purifies de N. tabacum ont été incubés avec 50 μl de
ARNase One (Promega) dans le tampon d'extraction pendant 20 min sur la glace avant extraction de l'ARN.
Pour les chloroplastes de L sativa, cinquante nanogrammes de protéine recombinante cpSRP43 de A thaliana portant un tag-Histidine (ayant un site de clivage par la trypsine en aval du tag-Histidine) et 50 pg d'ARN antisens AtelF4E (correspondant au cDNA de elF4E d'A. thaliana, qui ne présente pas d'hybridation croisée avec le mRNA de elF4E de L. sativa) marqué à la digoxygénine ont été ajoutés aux chloroplastes de L sativa purifiés avant incubation avec de la trypsine (650 unités). Après 5 min d'incubation sur la glace, 10 μg d'ARNase A ont été ajoutés avant d'incuber pendant 4 min à température ambiante. Une aliquote du mélange a été mélangée avec le tampon de dénaturation de protéine pour une détection par western blot séparée à l'aide d'un anticorps anti-tag-Histidine. L'ARN a été purifié à partir du reste du mélange d'incubation et une aliquote a été utilisée pour une détection directe de l'ARN AtelF4E marqué à la digoxygénine après transfert sur membrane. Le reste de l'ARN a été utilisé pour une hybridation Northern blot avec la sonde ARN antisens LselF4E marquée à la digoxygénine.
Production de plantes transgéniques et bombardement de particules L'ADNc AtelF4E1 a été amplifié par PCR et clone en amont et dans le cadre de lecture du gène de la green fluorescent protein 4 (mGFP5) sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Von Arnim et al., 1998). La cassette de gène chimère a alors été placée dans le vecteur binaire pPZP- BASTA (un dérivé de pPZP ; Hajdukiewicz et al., 1994). La transformation d'Arabidopsis par Agrobacterium a été effectuée conformément à Bechtold et al. (1983). Le bombardement de particules à l'aide d'un canon à particules pneumatique (Bio-Rad PDS- 1000/He, pression d'hélium de 1 550 psi, disques de rupture 1 350 psi, distance de la cible 10 cm, microbilles en or de 1 μm) et l'observation par microscopie laser confocale (TCS-SP2, Leica, Deerfield, IL) ont été effectués comme décrit dans Ferro et al. (2002).
Résultats
UARNm de elFAEl est localisé dans les chloroplastes chez quatre espèces de plantes différentes
Les expériences d'hybridation in situ avec une sonde elF4E1 de A thaliana (AtelF4E1) ont montré que le signal d'hybridation est associé aux chloroplastes. Des recherches de similarités dans des banques de données ayant révélé l'absence de similarité de séquence entre i'ARNm de AtelF4E1 et l'ADN chloroplastique d'A. thaliana, les inventeurs ont cherché à caractériser davantage cette observation. Une analyse Northern blot a été effectuée sur de l'ARN extrait de chloroplastes purifiés à partir d'A thaliana. L'ARNm elF4E peut être détecté dans l'extrait d'ARN chloroplastique par la sonde ARN antisens AtelF4E1. Le faible niveau de contamination de la préparation d'ARN chloroplastique par de l'ARN cytosolique a été vérifié en utilisant une sonde ARNr 28S. L'ARNm de AtelF4E a aussi été détecté spécifiquement dans la fraction d'ARN chloroplastique par RT-PCR.
De l'ARN chloroplastique a également été purifié à partir de Nicotiana tabacum ; il a ainsi été observé qu'une sonde d'ADNc de elF4E de N. tabacum s'hybridait à l'ARN chloroplastique (NtelF4E). La contamination la préparation d'ARN chloroplastique par de TARN nucléaire ou cytosolique a été exclue en utilisant une sonde pour le petit ARN nucléaire U6 et une sonde d'ADNc du gène de la nitrite réductase (Mr)1 respectivement. Une sonde chloroplastique, PsbB, a détecté les ARNm correspondant dans tous les extraits. En outre, le traitement des chloroplastes intacts purifiés avec de l'ARNase, avant l'extraction d'ARN, ne fait pas disparaître le signal correspondant à l'ARNm de NtelF4E, ce qui suggère que PARNm est protégé de l'activité ARNase soit par des complexes protéiques à la surface du chloroplaste, soit par les membranes d'enveloppe des chloroplastes intacts.
Pour vérifier si l'ARNm de elF4E peut se lier à la membrane externe, des chloroplastes ont été purifiés à partir de Lactuca Sativa (laitue), ce qui permet d'obtenir de meilleurs rendements en chloroplastes que la purification à partir d'A thaliana et de N. tabacum. Les chloroplastes ont été traités avec une combinaison de trypsine et d'ARNase pour supprimer tout ARN qui pourrait être protégé par des complexes protéiques associés à la membrane. L'hybridation avec une sonde e\F4E de L. sativa (LselF4E) a montré que l'ARNm de LselF4E était protégé des traitements combinés par la protéase et par l'ARNase. L'efficacité de ces traitements a été évaluée par ajout, aux chloroplastes purifiés, de protéine recombinante exogène marquée par un tag-Histidine (cpSRP43) et d'ARN AtelF4E marqué à la digoxygénine. La disparition de la protéine cpSRP43 et de l'ARN AtelF4E après traitement par la protéase et l'ARNAse, alors que l'ARNm de LselF4E était détecté, a montré que l'ARNm de LselF4E est probablement localisé à l'intérieur de l'enveloppe chloroplastique. Des expériences d'hybridation contrôle ont révélé l'absence d'hybridation croisée entre la sonde elF4E de L. sativa et l'ADN chloroplastique purifié ou l'ARN mitochondrial. Spinacia oleracea (épinard) a ensuite été utilisé en tant que source de chloroplastes pour obtenir les fortes quantités de chloroplastes nécessaires à un fractionnement en fractions d'enveloppe, de thylakoïdes et de stroma séparées. L'hybridation de la sonde LselF4E démontre que l'ARNm homologue de S. oleracea elF4E (SoelF4E) était localisé dans le stroma chloroplastique, ce qui exclut la localisation de SoelF4E dans l'espace intermembranaire de l'enveloppe des chloroplastes et valide ainsi la vectorisation de TARN à travers à la fois les membranes externes et internes des enveloppes de chloroplastes.
Une fusion des ARNm de elF4E1 et de la GFP est vectorisée vers les chloroplastes
L'ARNm codant la GFP (Green Fluorescent Protein, mGFP5) a ensuite été fusionné en 3' de l'ARN m AtelF4E1 sous le contrôle du promoteur 35S de CaMV et des lignées A. thaliana transgéniques ont été produites. Une lignée exprimant l'ARNm hybride a été sélectionnée et utilisée pour préparer de l'ARN chloroplastique. L'hybridation avec une sonde GFP a montré que l'ARN m hybride est effectivement localisé dans la fraction chloroplastique, comme il avait été observé avec l'ARNm AtelF4E1.
Ces résultats démontrent donc que l'adressage de l'ARNm elF4E dans les chloroplastes se produit dans quatre espèces de plante différentes et constitue donc une caractéristique générale des cellules de plantes. De plus, ces résultats confirment les résultats observés sur puce, et démontre qu'un ARN détecté préférentiellement comme associé au chloroplaste est effectivement transloqué à l'intérieur du plaste.
C'est la première fois qu'est rapportée l'importation dans les chloroplastes d'un ARN endogène provenant d'un autre compartiment cellulaire. La protéine elF4E est un des régulateurs clé de la traduction générale et spécifique chez les eucaryotes (Gingras et al., 1999) mais il n'est pas nécessaire à la traduction des ARNm chloroplastique qui sont dépourvus de la structure en coiffe (« cap ») (Sugiura et al., 1998). Un mode de régulation fréquemment observé de l'activité traductionnelle de la cellule est là séquestration de elF4E par des protéines de liaison (Gingras et al., 1999 ; Groisman et al., 2002). Comme une grande quantité de protéines doivent être synthétisées dans le cytoplasme de manière coordonnée avec les besoins des chloroplastes, la séquestration chloroplastique de l'ARNm elF4E peut être un moyen de régulation de l'activité traductionnelle dans le cytosol en fonction du statut physiologique du chloroplaste. Les échanges d'ARN entre le cytosol et les chloroplastes peuvent constituer un nouveau niveau d'intégration cellulaire chez les plantes.
BIBLIOGRAPHIE
An G (1986). Development of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed cells. Plant Physiol 81 : 86-91
Bechtold N, Ellis J, Pelletier G (1993) In planta Agrobacterium mediated gène transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C R Acad Sci Paris, Life Sciences 316, 1194-1199.
Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acid Research, 12(22):8711-21.
Charbonnier L, Primard C, Leroy P, Chupeau Y. (1987) A Miniscale method for the simultaneous isolation of chloroplast and mitochondrial DNA from tobacco, french bean and rapeseed. Plant Mol. Biol. Rep. 4, 213-218.
Choi SB, Wang C, Muench DG, Ozawa K, Franceschi VR, Wu Y, Okita TW. (2000) Messenger RNA targeting of rice seed storage proteins to spécifie ER subdomains. Nature. 407(6805):765-7.
Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM. (1982) Nopaline synthase: transcript mapping and DNA séquence. J. Mol. Appl. Genêt, 1 , 561-573
Douce R, and Joyard J. in Methods in Chloroplast Molecular Biology (Edelman M, Hallick R, and Chua NH. eds.) Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, pp. 239-256 (1982).
Ferro M, Salvi D, Rivière-Rolland H, Vermat T, Seigneurin-Berny D, Grunwald D, Garin J, Joyard J, Rolland N. (2002) Intégral membrane proteins of the chloroplast envelope: identification and subcellular localization of new transporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 : 11487-92.
Ferro M, Salvi D, Brugière S, Miras S, Kowalski S, Louwagie M, Garin J, Joyard J & Rolland N (2003) Proteomics of the chloroplast envelope membranes from Arabidopsis thaliana. Mol. CeIl. Proteomics 2: 325-345.
Finer, J. J., Vain, P., Jones, M.W. and McMullen, M. D. (1992) Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant CeII Reports 11 :323-328.
Fischhoff DA, Bowdish KS, Perlak FJ, et. al. (1987) Insect tolérant transgenic tomato plants. Bio/Technology, 5, 807-813. Franck A, Guilley H, Jonard G, Richards K, Hirth L (1980) Nucleotide séquence of cauliflower mosaic virus DNA. CeII, 21, 285-294
Fromm ME, Taylor LP, Walbot V. (1986) Stable transformation of maize after gène transfer by electroporation. Nature, 319: 791-793
Garcia I, Rodgers M, Lenne C, Rolland A, Sailland A et Matringue M (1997) Subcelllular localization and purification of a p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from cultured carrot cells and characterization of the corresponding cDNA. Biochem. J., 325:761-769.
Garcia I, Rodgers M, Pépin R, Hsieh TF, et Matringe M (1999). Characterization and subcellular compartmentation of recombinant 4- hydroxyphenylpyruvate dixoxygenase from Arabidopsis in transgenic tobacco. Plant Physiol, 119(4):1507-16.
Gingras AC, Raught B. and Sonenberg N. (1999) elF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.. Annu. Rev. Biochem. 68, 913-63.
Groisman I, Jung MY, Sarkissian M, Cao Q, Richter JD. (2002) Translational control of the embryonic cell cycle. Cell.;109(4):473-83.
Hajdukiewicz, P., Svab, Z. & Maliga, P. (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol. Biol. 25, 989-94.
Hilder VA, Gatehouse AMR, Sheerman SE, Barker RF, Boulter D (1987) A novel mechanism of insect résistance engineered into tobacco. Nature, 300, 160- 163.
Im KH, Cosgrove DJ, Jones AM. (2000) Subcellular localization of expansin mRNA in xylem cells. Plant Physiol. 123(2):463-70.
Joyard J, Teyssier E, Miege, C, Berny-Seigneurin, D, Maréchal, et al. (1998) The biochemical machinery of plastid envelope membranes. Plant Physiol. 118, 715- 723.
Klee HJ, Muskopf YM, Gasser CS. (1987) Cloning of an Arabidopsis thaliana gène encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase: séquence analysis and manipulation to obtain glyphosate-tolerant plants. Mol. Gen. Genêt., 210, 437- 442.
Kloc M, Zearfoss NR, Etkin LD. (2002) Mechanisms of subcellular mRNA localization. CeII. 22;108(4):533-44. Krens FA, Molendijk L, Wullens GJ and Schilperoort RA (1982) In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-p!asmid DNA. Nature 296: 72-74
Lee KY, Townsend J., Tepperman J., Black M., Chui CF, Mazur B. et al., (1988) The molecular basis of sulfonylurea herbicide résistance in tobacco. EMBO J., vol. 7, No. 5, pp. 1241-1248.
Lonnstedt I. et Speed TP. (2002) Replicated Microarray Data. Statistical Sinica 12: 31-46.
Martin W and Herrmann RG. (1998) Gène transfer from organelles to the nucleus: how much, what happens, and why. Plant Physiol. 118, 9-17
McEIroy D., Blowers, A.D., Jenes, B. and Wu, R. (1991) Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5' région for use in monocot transformation. Mol. Gen. Genêt. 231, 150-160.
Mitra A, Higgins DW. (1994) The Chlorella virus adenine methyltransferase gène promoter is a strong promoter in plants. Plant Mol. Biol. 26, 85-93,
Norris SR, Shen X, DellaPenna D (1998). Complémentation of the Arabidopsis pds1 mutatin with the gène encoding p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol, 117(4): 1317-23
Petracek ME, Dickey LF, Huber SC, Thompson WF. (1997) Light-regulated changes in abundance and polyribosome association of ferredoxin mRNA are dépendent on photosynthesis. Plant CeII 9, 2291-300.
Preston C, Powles SB. (2002) Evolution of herbicide résistance in weeds: initial frequency of target site-based résistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides in Lolium rigidum. Heredity, 88(1), 8-13.
Robaglia C, Vilaine F, Pautot V, Raimond F, Amselem J, Jouanin L, Casse- Delbart F, Tepfer M. (1987) Expression vectors based on the Agrobacterium rhizogenes Ri plasmid transformation System. Biochimie. 69(3):231-7.
Rodriguez CM, Freire MA1 Camilleri C, Robaglia C. (1998) The Arabidopsis thaliana cDNAs coding for elF4E and elF(iso)4E are not functionally équivalent for yeast complémentation and are differentially expressed during plant development. Plant J. 13, 465-73.
Sambrook J, Fritsch EF. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual, 2nd éd. CoId Spring Harbor Laboratory press.
Sharp, PA (2001) RNA interférence - 2001. Gènes Dev, 15:485-490. Sugiura M, Hirose T, and Sugita M. (1998) Evolution and mechanism of translation in chloroplasts.Annu. Rev. Genêt. 32,437-59.
Surpin M, Larkin RM, Chory J. (2002) Signal transduction between the chloroplast and the nucleus. Plant CeI1 14 : 327-338.
Vaeck, M., A. Reynaerts, H. Hofte, S. Jansens, M. DeBeuckeleer, C. Dean, M. Zabeau, M. Van Montagu, and J. Leemans. (1987) Transgenic plants protected from insect attack. Nature 328: 33-37.
Van Haaren MJ, Houck CM. (1991) Strong négative and positive regulatory éléments contribute to the high-level fruit-specific expression of the tomato 2A11 gène. Plant Mol. Biol. 17,615- 630,1991. van Heerden A, Browning KS. (1994) Expression in Escheήchia coli of the two subunits of the isozyme form of wheat germ protein synthesis initiation factor 4F. Purification of the subunits and formation of an enzymatically active complex. J. Biol. Chem. 269:17454-17457.
Verdaguer B, de Kochko A, Fux Cl, Beachy RN, Fauquet C. (1998) Functional organization of the cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter. Plant Mol Biol., 37(6): 1055-67.
Von Amim, A.G., Deng, X.W.& Stacey, M. G. (1998) Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gène. 221 , 35-43.
Watson et al. (1994) Ed. De Boeck Université, pp 273-292
White J., Chang S-YP., Bibb MJ. and Bibb MJ. (1990) A cassette containing the bar gène of Streptomyces hygroscopicus: a selectable marker for plant transformation. Nuci. Acid. Res. 18, 1062.
Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., and Speed, T. P. (2002). Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Research 30(4):e15.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'adressage d'un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, ladite méthode comprenant la transformation d'une cellule végétale avec un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant détectable dans un plaste.
2. Méthode selon la revendication 1 , dans laquelle l'acide nucléique d'adressage a pour séquence transcrite celle d'un ARNm d'un gène nucléaire endogène.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit plaste est sélectionné dans le groupe constitué d'un chloroplaste, d'un amyloplaste, d'un chromosplaste et d'un proplaste.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle ledit ARNm est caractérisé par une concentration dans un plaste supérieure à sa concentration cytoplasmique.
5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle ledit ARNm est caractérisé par une concentration dans un plaste au moins 2 fois supérieure à sa concentration cytoplasmique.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit acide nucléique d'adressage a une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm d'un gène sélectionné dans le groupe constitué des gènes ayant pour séquence codante SEQ ID No.1 , SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11 , SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21 , SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31 , SEQ ID No.33, SEQ ID No.35, SEQ ID No.37, SEQ ID No.39 et SEQ ID No.41.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ledit acide nucléique d'adressage a une séquence transcrite qui est celle d'un ARNm d'un gène codant le facteur eucaryote d'initiation de la traduction elF4E.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ledit acide nucléique d'intérêt est un ADN.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ledit acide nucléique d'intérêt est un ARN.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle ledit acide nucléique d'adressage est un ADN.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 9, dans laquelle ledit acide nucléique d'adressage est un ARN.
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans laquelle ledit acide nucléique d'intérêt code une protéine hétérologue.
13. Construction d'acide nucléique comprenant un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire sélectionné dans le groupe constitué des gènes ayant pour séquence codante SEQ ID No.1 , SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11 , SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21 , SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31 , SEQ ID No.33, SEQ ID No.35, SEQ ID No.37, SEQ ID No.39 et SEQ ID No.41.
14. Cellule végétale transformée avec un acide nucléique d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage dont la séquence transcrite est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire sélectionné dans le groupe constitué des gènes ayant pour séquence codante SEQ ID No.1 , SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID NoJ, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11 , SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.17, SEQ ID No.19, SEQ ID No.21 , SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31 , SEQ ID No.33, SEQ ID No.35, SEQ ID No.37, SEQ ID No.39 et SEQ ID No.41.
15. Plante transgénique susceptible d'être régénérée à partir de la cellule végétale transformée selon la revendication 14.
16. Méthode de production d'au moins une protéine d'intérêt dans un plaste d'une cellule végétale, la méthode comprenant les étapes consistant à : a) transformer une cellule végétale avec un acide nucléique codant une protéine d'intérêt lié à un acide nucléique d'adressage, la séquence transcrite dudit acide nucléique d'adressage étant celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant détectable dans un plaste d'une cellule végétale ; et b) exprimer ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt.
17. Méthode selon la revendication 16, dans laquelle la séquence transcrite dudit acide nucléique d'adressage est celle d'un ARNm d'un gène nucléaire, ledit ARNm étant caractérisé par une concentration dans un plaste supérieure à sa concentration cytoplasmique.
18. .Méthode d'identification d'un ARN capable d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale dans laquelle on détermine la concentration d'un ARN candidat dans un plaste et dans le cytoplasme d'une cellule végétale, et où on identifie, en tant qu'ARN capable d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, un ARN dont la concentration dans le plaste est supérieure à sa concentration dans le cytoplasme.
19. Méthode selon la revendication 18, dans laquelle on identifie, en tant qu'ARN capable d'adresser un ARN d'intérêt vers un plaste d'une cellule végétale, un ARN dont la concentration dans le plaste est au moins 2 fois supérieure à sa concentration dans le cytoplasme.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009296886A (ja) * 2006-10-03 2009-12-24 Japan Science & Technology Agency 有用形質を有する植物をスクリーニングするためのツールおよびその利用
US8847011B2 (en) 2007-12-05 2014-09-30 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Genes that increase plant oil and method for using the same
JP5527654B2 (ja) * 2007-12-05 2014-06-18 トヨタ自動車株式会社 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法
JP5299886B2 (ja) * 2008-03-04 2013-09-25 トヨタ自動車株式会社 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法
GB2465749B (en) * 2008-11-25 2013-05-08 Algentech Sas Plant cell transformation method
JP5847991B2 (ja) 2009-06-04 2016-01-27 トヨタ自動車株式会社 種子における物質生産性を向上させる遺伝子及びその利用方法
JP5718554B2 (ja) 2009-06-04 2015-05-13 トヨタ自動車株式会社 植物の植物重量を増産させる遺伝子及びその利用方法
JP5519192B2 (ja) 2009-06-04 2014-06-11 トヨタ自動車株式会社 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法
GB201501941D0 (en) 2015-02-05 2015-03-25 British American Tobacco Co Method
US20210054404A1 (en) 2017-08-22 2021-02-25 Napigen, Inc. Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease
KR101933217B1 (ko) 2017-12-28 2018-12-27 (주) 에빅스젠 피부 염증 억제용 펩티드 및 이를 포함하는 피부 염증 예방 또는 치료용 조성물
CN111902547B (zh) * 2018-03-23 2024-06-14 先锋国际良种公司 鉴定、选择和产生疾病抗性作物的方法
CN112251445B (zh) * 2020-09-21 2023-03-17 陕西师范大学 调控棉花纤维伸长的基因GhZFP8及其应用
US12524719B2 (en) * 2021-06-08 2026-01-13 Schlumberger Technology Corporation Systems and methods for predicting and managing tool assets

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3850683T2 (de) * 1987-02-09 1994-10-27 Lubrizol Genetics Inc Hybrides RNS-Virus.
CA2420406C (fr) * 2000-09-29 2014-12-09 Monsanto Technology Llc Plante de ble 33391 resistante au glyphosate et compositions et procedes de detection de celle-ci
FR2835698B1 (fr) * 2002-02-08 2004-08-06 Genoplante Valor Procede de selection ou d'obtention de plantes resistantes aux potyvirus et sequences marquant ou codant cette resistance
EP1558724A4 (fr) * 2002-11-01 2006-08-02 New England Biolabs Inc Criblage organellaire d'arn et son utilisation dans l'interruption de transmission de gene dans l'environnement
US7772462B2 (en) * 2002-12-17 2010-08-10 Cornell Research Foundation, Inc. Recessive plant viral resistance results from mutations in translation initiation factor eIF4E

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICOLAI M ET AL: "Higher plant chloroplasts import the mRNA coding for the eucaryotic translation initiation factor 4E", FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 581, no. 21, 21 August 2007 (2007-08-21), pages 3921 - 3926, XP027013638, ISSN: 0014-5793, [retrieved on 20070810] *

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