EP1824335A1

EP1824335A1 - Phytophtora resistentes pflanzgut der kartoffel

Info

Publication number: EP1824335A1
Application number: EP06724470A
Authority: EP
Inventors: Rahel Blatter; Urban Anderau; Charly Bressoud; Helge Sierotzki; Rita Stalder
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2006-04-20
Publication date: 2007-08-29
Also published as: US20080172757A1; WO2006111388A1; DE102005018862A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft verbessertes Saat- und Vermehrungsgut der Kartoffel, welches Resistenzen unterschiedlicher Ausprägung gegenüber verschiedenen Pathogenen aufweist, insbesondere aber gegenüber Pilzen aus der Gattung Phytophthora. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkreuzung der Phytophthora Resistenz in verschiedene Kulturformen der Kartoffel.

Description

PHYTOPHTORA RESISTENTAES PFLANZGUT DER KARTOFFEL

Die vorliegende Erfindung betrifft verbessertes Saat- und Vermehrungsgut der Kartoffel, welches Resistenzen bzw. Toleranzen unterschiedlicher Ausprägung gegenüber verschiedenen Pathogenen aufweist, insbesondere aber eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Pilzen aus der Gattung Phytophthora, und hier vorzugsweise gegenüber Phytophthora infestans.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkreuzung der Phytophthora- Resistenz in verschiedene Kulturformen der Kartoffel.

Die Kartoffel gehört zur Familie der Solanaceae (Nachtschattengewächse). Sie vermehrt sich vegetativ durch Ausläuferknollen oder generativ durch die Bildung von Samen. Die Kartoffeln werden in zwei Gruppen eingeteilt: Solanum tuberosum spp. tuberosum und Solanum tuberosum spp. andigena.

Die krautige Pflanze blüht weiss bis violett und kann bis zu einem Meter hoch werden. Die Blätter der Kartoffel sind unpaarig gefiedert.

Die Kartoffel besitzt 12 Chromosomen in den Ploidiegraden diploid (2n) oder tetraploid (4n).

Die domestizierten Arten sind autotetraploid und können sich, im Gegensatz zu den diploiden Wildarten, selbst befruchten. Sie zeigen eine tetrasome Vererbung.

Die Kartoffel gehört auch heute noch zu den wichtigsten Kohlehydratlieferanten des Menschen und gehört daher zu den Grundnahrungsmitteln. Im Jahre 2000 betrug die weltweite Gesamtproduktion 329 Millionen Tonnen. Die Hauptproduzenten sind China und (zusammengefasst) die Staaten der ehemaligen Sowjetunion.

Der Erfolg der Kartoffel hängt auch mit der Anspruchslosigkeit der Pflanze an ihre Umgebung zusammen. Sie kann bis in Höhen von 2000 m.ü.M, bis an den Rand von Polargebieten oder in tropischen Verhältnissen gedeihen.

Das weltweit grösste Problem im Kartoffelbau ist die Kraut- und Knollenfäule als Folge von Phytophthora infestans Infektionen. Ausserdem stellen diverse Virosen, ausgelöst durch zB den Blattrollvirus (PLRV), den Kartoffelvirus X (PVX) und den Kartoffelvirus Y (PVY) sowie Frassschäden, verursacht durch den Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) ein Problem dar.

Die Virosen der Kartoffel können durch Saatgutzertifizierungen und den Einsatz von Insektiziden gegen den Überträger der Virosen (die Blattlaus) in den Industriestaaten weitgehend kontrolliert werden. Gleiches gilt für den Kartoffelkäfer, welcher ebenfalls durch den Einsatz von Insektiziden gut bekämpft werden kann.

Wirtschaftlich das weitaus grösste Problem, weil bisher grösstenteils ungelöst, stellt aber die durch Infektion mit Phytophthora infestans verursachte Kraut- und Knollenfäule dar. Diese tritt epidemisch auf und ein früher, starker Befall kann zu einem Totalverlust der Ernte führen. In den 80er und 90er Jahren führte der Pilz allein in Nordamerika zu Verlusten in dreistelliger Millionenhöhe. Das „International Potato Center" in Lima schätzt die Ernteverluste, die auf P. infestans Infektionen zurückgehen auf etwa 15% der Weltkartoffelproduktion.

Phytophthora infestans gehört zu den Oomyceten und nutzt neben der Kartoffel noch andere Nachtschattengewächse als Wirtspflanze wie zB die Tomate. Im Verlauf einer typischen Infektion werden zunächst die unteren Blätter der Pflanze befallen, gefolgt von Blattstielen und Stängel und schliesslich auch der Knolle. Auf der Blattunterseite bildet sich der typische grau-weissliche Pilzrasen aus dem die Sporen entlassen werden. Die Sporen breiten sich von wenigen Primärherden insbesondere bei feuchter Witterung innerhalb kurzer Zeit aus und sind in der Lage weite Strecken zurückzulegen. Somit kann ein ganzes Kartoffelfeld innerhalb nur weniger Tage vollständig befallen werden.

Bisher konnte sich der Schaderreger in Europa und den USA nur asexuell vermehren. Seit der Einschleppung der sexuellen Form wird durch die vermehrten Rekombinationsmöglichkeiten die Entwicklung noch virulenterer Genotypen gefördert, was in der Folge zu Enteausfällen von erheblichem Ausmass führen kann. Entsprechend sind auch die Anpassungszeiten an Kartoffelsorten, die eine Vertikalresistenz aufweisen, um ein Vielfaches verkürzt worden.

Die Kraut- und Knollenfäule wird im konventionellen Ackerbau meist mit Hilfe von Fungiziden bekämpft. Es existieren jedoch schon seit den 80er Jahren Phytophthora-

M1218 PCT Stämme, die vermehrt Resistenzen gegenüber den gängigen Fungiziden aufweisen. Es ist daher eine dringlich Aufgabe, Alternativen zu entwickeln, die eine effektive Kontrolle der Kraut- und Knollenfäule gewährleisten.

Eine dieser möglichen Alternativen, die Resistenzzüchtung der Kartoffel gegenüber Phytophthora infestans, erweist sich als äusserst schwierig, da nur horizontale Resistenzen dauerhaft sind und der Züchtungsprozess sehr langwierig ist. Die Forschung auf diesem Gebiet wird vor allem vom „International Potato Center" vorangetrieben, wobei jedoch durchgreifende Erfolge bisher ausgeblieben sind.

Eine weitere Möglichkeit liegt in der Anwendung gentechnischer Strategien zur Erzeugung von Resistenzen. Zwar ist es im Prinzip möglich, eine vertikale Resistenz zu erzeugen, diese ist aber nicht dauerhaft und daher wenig effizient. Eine horizontale Resistenz lässt sich dagegen mit Hilfe gentechnischer Methoden bisher noch nicht verwirklichen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird nun erstmals eine Kartoffelpflanze bereitgestellt, welche eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist.

Unter Resistenz ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere eine horizontale Resistenz zu verstehen, die im üblichen Sprachgebrauch auch als generelle, unspezifische oder quantitative Resistenz bezeichnet wird, welche die

Pflanze dazu befähigt den Befall und die Besiedlung durch sämtliche bekannten

Stämme oder Rassen von Schaderregern zu verhindern oder zumindest zu begrenzen.

Unter einem begrenzten Befall bzw einer begrenzten Besiedlung ist beispielsweise ein Infektionsverlauf von Phytophthora infestans zu verstehen, der unterbrochen ist, indem die Mycelbildung an der Blattunterseite sowie eine Sporulation unterbunden wird.

Im Gegensatz zu einer vertikalen Resistenz, die lediglich Schutz gegen ganz bestimmte Rassen oder Stämme des Schaderregers bietet und relativ leicht überwunden werden kann, bietet die horizontale Resistenz einen zeitlich unbegrenzten und damit robusten Schutz gegen den Schaderreger.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist unter einer resistenten Pflanze eine Kartoffelpflanze zu verstehen, die nach erfolgter Infektion mit dem Schaderreger komplett symptomfrei bleibt.

M1218 PCT Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Kartoffelpflanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Kartoffelpflanze, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und vorzugsweise frei von Symptomen bleibt, insbesondere aber eine Resistenz gegenüber Infektionen, welche durch Pathotypen verursacht werden, die zumindest eines, insbesondere aber zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder aber insbesondere sämtliche der bekannten Virulenzgene V1-V11 in unterschiedlicher Kombination aufweisen.

In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kartoffelpflanze bereitgestellt, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und vorzugsweise frei von Symptomen bleibt, insbesondere aber eine Resistenz gegen Infektionen, die durch einen oder mehrere der nachfolgenden Pathotypen, insbesondere aber durch sämtliche der nachfolgenden Pathotypen verursacht werden, welche mindestens 2 der bekannten Virulenzgene V1-V11 in folgender Kombination aufweisen:

Pathotyp 1 : mit den Virulenzgenen 3, 4, 5, 7 und 9 Pathotyp 2: mit den Virulenzgenen 1 , 3, 4, 7, 8, 9, 10 und 11 Pathotyp 3: mit den Virulenzgenen 2 und 7 Pathotyp 4: mit den Virulenzgenen 3, 4, 5 und 11 Pathotyp 5: mit den Virulenzgenen 1 , 3, 4, 7

Besagte Pathotypen 1 - 5 lassen sich beispielsweise mit dem sog. NKL (Niederländische Kartoffel-Linien) Testsystem bestimmen, einem Testsystem bestehend aus 11 Kartoffel- Pflanzen der Sorte Bintje, wobei jede Pflanze des Systems ein zu den oben genannten V-Genen korrespondierendes R Gen besitzt.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kartoffelpflanze bereitgestellt, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und die vorzugsweise frei von Symptomen bleibt, insbesondere aber gegenüber Infektionen, welche durch ein Stamm-Gemisch bestehend aus 230 Isolaten nach I. Irzhansky und Y.

M1218 PCT Cohen, 2006 („Inheritance of resistance against Phytophthora infestans in Lycopersicon pimpenellifolium L3707", akzeptiert zur Publikation in Euphytika) verursacht werden.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine Kartoffelpflanze, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und die vorzugsweise frei von Symptomen bleibt, insbesondere aber gegenüber Infektionen, welche durch

(a) einen oder mehrere der nachfolgenden Pathotypen, insbesondere aber durch sämtliche der nachfolgenden Pathotypen verursacht werden, weiche mindestens 2 der bekannten Virulenzgene V1-V11 in folgender Kombination aufweisen:

Pathotyp 1 : mit den Virulenzgenen 3, 4, 5, 7 und 9 Pathotyp 2: mit den Virulenzgenen 1 , 3, 4, 7, 8, 9, 10 und 11 Pathotyp 3: mit den Virulenzgenen 2 und 7 Pathotyp 4: mit den Virulenzgenen 3, 4, 5 und 11 Pathotyp 5: mit den Virulenzgenen 1 , 3, 4, 7; sowie

(b) ein Stamm-Gemisch bestehend aus 230 Isolaten nach I. Irzhansky und Y. Cohen, 2006 („Inheritance of resistance against Phytophthora infestans in Lycopersicon pimpenellifolium L3707", akzeptiert zur Publikation in Euphytika).

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Kartoffelpflanze, die eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und die vorzugsweise frei von Symptomen bleibt, dadurch gekennzeichnet, dass das Merkmal der Resistenz durch Einkreuzen einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSM 17671 ) aufweist, erhältlich ist.

Die Erfindung betrifft weither hin eine Kartoffelpflanze, die eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und die vorzugsweise frei von Symptomen bleibt, eingekreuzt aus einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSM 17671) aufweist.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird eine Kartoffelpflanze bereitgestellt, die eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende

M1218 PCT Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen ausprägt und die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSM 17671 ) aufweist.

Ebenfalls umfasst ist eine Kartoffelpflanze, worin sich besagtes Merkmal der Phytophthora-Resistenz dadurch ausprägt, dass der natürliche Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, indem die Mycelbildung an der Blattunterseite sowie eine Sporulation unterbunden werden. Eine solche Merkmalsausprägung findet sich insbesondere bei Infektion mit einem hoch pathogenen Phytophthora- Stamm wie beispielsweise Stamm 90128.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz, insbesondere aber einer horizontalen und damit einer ausgeprägten und anhaltenden Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen, die vorzugsweise zu Kartoffelpflanzen führt, welche frei von Symptomen bleiben, in Kartoffelpflanzen , welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber

Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1 b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, mit einer

Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen; b) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden; c) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät; d) Pflänzchen heranzieht und diese in einem geeigneten Testsystem auf

Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet; e) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens werden die aus der Kreuzung resultierenden F1 Hybriden, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen, mit einem Elternteil, vorzugsweise aber mit dem Phytophthora sensitiven Elter, ein- bis mehrfach rückgekreuzt.

M1218 PCT Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Kartoffelpflanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen, insbesondere aber eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, das vorzugsweise zu Kartoffelpflanzen führt, welche frei von Symptomen bleiben, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1 b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze kreuzt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen; b) geeignete Massnahmen trifft, um sowohl während als auch nach dem artifiziell durchzuführenden Bestäubungsvorgang eine Mischbestäubung zu vermeiden; c) Samen der F1 Generation aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät; d) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet; e) Phytophthora resistente Pflanzen mit dem Phytophthora anfälligen Elter ein- bis mehrfach rückkreuzt; f) in jeder auf diese Weise erhaltenen Rückkreuzungsgeneration die Pflanzen auf An- oder Abwesenheit des Resistenzmerkmals hin überprüft, g) eine Pflanze heranzieht, welche das gewünschte Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen ausprägt.

Da die Kartoffel zur Selbstbefruchtung befähigt ist, bedarf es, um die Verfahren zur Kreuzungs- oder Kombinationszüchtung erfolgreich durchführen zu können, einer kontrollierten und zielgerichteten Prozessführung, welche eine Übertragung von Pollen vom väterlichen Elter auf die Mutterpflanze gewährleistet unter gleichzeitigem Ausschluss von unerwünschten Mischbestäubungen.

Dies macht die Anwendung technischer Massnahmen notwendig, wie zB das manuelle Herausschneiden der Staubbeutel aus der Blüte der Mutterpflanze sowie das gezielte

M1218 PCT Übertragen von Pollen des väterlichen Elter auf die Narbe der Mutterpflanze. Anschliessend müssen weitere Massnahmen getroffen werden um Mischbestäubungen der zuvor artifiziell bestäubten Blüte zu verhindern, wie zB durch Eintüten der bestäubten Blüte.

Alternativ kann auch ein steriler Elter als Kreuzungspartner eingesetzt werden, was eine Emaskulation überflüssig macht.

Weitere Massnahmen in Ergänzung des zuvor beschriebenen Verfahrens betreffen die gezielte Induktion der Blüte durch geeignete und in den Beispielen im einzelnen beschriebene Verfahren sowie zur Anregung der Samenkeimung.

Die Blütenbildung bei Kartoffelpflanzen lässt sich beispielsweise durch kontinuierliches Entfernen der sich bildenden Knollen von der Pflanze induzieren. Dabei werden die sich bildenden Knollen alle 3-8 Wochen, insbesondere aber alle 4-6 Wochen und ganz besonders alle 4-5 Wochen vorsichtig von der Pflanze entfernt ohne diese dabei zu verletzen, wodurch die Pflanze zu verstärkter Blütenbildung angeregt wird.

Die Samenkeimung lässt sich verbessern durch Inkubation der Samen in der erntereifen Samenkapsel nachdem diese von der Pflanze entfernt und vorzugsweise aufgeschnitten wurde für die Dauer von 8 Stunden bis 4 Tagen, insbesondere von 12 Stunden bis 3 Tagen, vorzugsweise aber von 1 bis 2 Tagen. Alternativ dazu kann die Inkubation für den angegebenen Zeitraum auch in einem aus den Samenkapseln gewonnenen Extrakt erfolgen.

Die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens erhältlichen Kartoffelpflanzen der F1 Generation können in Form von Knollen oder durch Meristemkultur erhalten und vermehrt werden.

Die Überprüfung der Nachkommenschaft auf Ausprägung des Resistenzmerkmals kann mit Hilfe von Blattsegmenten und/oder Knollenscheiben erfolgen, die in geeigneter Weise für die Tests vorbreitet werden, z.B. durch Inkubation in Petrischalen und nachfolgender Inokulation mit Sporensuspensionen der verschiedenen Teststämme bzw. Pathotypen.

Die vorliegende Erfindung stellt erstmals eine Kartoffelpflanze bereit, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber

M1218 PCT Phytophthora infestans Infektionen aufweist, insbesondere aber Infektionen verursacht durch Phytophthora Pathotypen, die zumindest eines oder aber mehrere der Virulenzgene ausgewählt aus der Gruppe der Virulenzgene 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 und 11 in unterschiedlicher Kombination enthalten.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird eine Kartoffelpflanze zur Verfügung gestellt, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Pathotpyen aufweist, die zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder aber insbesondere sämtliche Virulenzgene ausgewählt aus der Gruppe der Virulenzgene 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 und 11 enthalten in unterschiedlicher Kombination.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere eine Kartoffelpflanze, welche eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, insbesondere aber gegenüber Infektionen, die durch einen oder mehrere der nachfolgenden Pathotypen, insbesondere aber durch sämtliche der nachfolgenden Pathotypen verursacht werden, welche mindestens 2 der bekannten Virulenzgene V1- V11 in folgender Kombination aufweisen:

Pathotyp 1 : mit den Virulenzgenen 3, 4, 5, 7 und 9 Pathotyp 2: mit den Virulenzgenen 1 , 3, 4, 7, 8, 9, 10 und 11 Pathotyp 3: mit den Virulenzgenen 2 und 7 Pathotyp 4: mit den Virulenzgenen 3, 4, 5 und 11 Pathotyp 5: mit den Virulenzgenen 1 , 3, 4, 7.

Die Erfindung betrifft insbesondere eine Kartoffelpflanze welche erhältlich ist durch Einkreuzung des Merkmals der Resistenz von einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 aufweist, von der eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1 b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinter- legungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde.

Besagte SCP-02 Kartoffelpflanze ist weissschalig und im Geschmack vergleichbar mit den kommerziellen Sorten „Matilda" und „Bintje".

M1218 PCT Die Knollen treiben im Kühllager (5°C) ab Januar leicht Sprosskeime, ab März beginnt deutliches Keimlingswachstum, welches leicht stärker ausfällt als bei der Vergleichssorte "Bintje".

Die ausgepflanzten Knollen treiben in einem vergleichbaren Zeitrahmen wie die Vergleichssorte "Bintje" die ersten Sprossspitzen an die Oberfläche.

Die Entwicklungszeit bis zur Blüte ist ebenfalls mit derjenigen von "Bintje" identisch. Die Pflanzengrösse ist jedoch deutlich geringer als bei dieser Standardsorte.

SCP-02 blüht weiss, die Blüten halten gut an der Staude und entwickeln in der Folge auch problemlos Früchte.

Die Lagerfähigkeit ist ebenfalls normal (bis März). Bei Anwendung von Keimhemmitteln sind ähnliche Lagermöglichkeiten realisierbar wie mit der Vergleichssorte "Bintje".

Abweichend von der Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen sowohl des Blattes wie der Knolle zeigt die Pflanze eine mittlere bis hohe Anfälligkeit auf Viren, wie z.B. den Blattroll-Virus sowie eine mittlere Anfälligkeit gegenüber Alternaria Infektionen. Die Attraktivität der Pflanze für Blattläuse ist mittel, für Kartoffelkäfer gering.

Kartoffelpflanzen gemäss der vorliegenden Erfindung, welche erhältlich sind durch Einkreuzung des Merkmals der Resistenz von einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 aufweist, zeichnen sich somit insbesondere aus durch das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen, insbesondere aber gegenüber Infektionen, welche durch die Phytophthora Pathotypen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stamm 96; Stamm 90128, Stamm 91002, Stamm 91011 ; und Stamm 88069S ausgelöst werden, wobei besagtes Merkmal im Rahmen von Kreuzungsversuchen frei auf die Nachkommen besagter Kartoffelpflanze übertragbar ist. Die Vererbung besagten Merkmals auf die Nachkommenpflanzen folgt dabei den Gesetzmässigkeiten eines dominanten bzw semi-dominanten Erbgangs.

Unter einer resistenten Kartoffelpflanze ist im Rahmen dieser Erfindung eine Pflanze zu verstehen, die bei einer artifiziellen Inokulation von Blatt oder Knolle mit einer Sporensuspension von Phytophthora Stämmen, welche mehrheitlich die R-Gene der

NKL abdecken, wie zB Stamm 96; Stamm 91002, Stamm 91011 ; und Stamm 88069S,

M1218 PCT in einer Sporendichte von 50O00 Sporen/ml keine für eine Phytophthora Infektion typischen Symptome zeigt oder aber bei der, sofern solche Symptome doch erkennbar sind, wie z.B im Falle der Verwendung hoch pathogener Phytophthora Stämme, wie z.B Stamm 90128, zumindest kein Mycelwachstum am Blatt oder aber, im Falle einer Knolleninfektion, ein nur atypisches, ballenförmiges Mycelwachstum, in keinem Falle aber eine Sporulation des Pilzes nachweisbar ist. Somit bleiben eventuell auftretende Infektionssymptome lokal auf den Infektionsort begrenzt, ohne dass sich die Infektion jedoch über die ganze Pflanze ausbreiten oder die Infektion auf andere Pflanzen weiter tragen kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Kartoffelpflanze, worin besagtes Merkmal der Resistenz sich dadurch ausprägt, dass der natürliche Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, sodass eine Mycelbildung am Blatt der infizierten Pflanze sowie eine Sporulation unterbleibt.

Insbesondere betrifft die Erfindung Kartoffelpflanzen, welche erhältlich sind durch Einkreuzung des Merkmals der Resistenz von einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 aufweist, worin besagtes Merkmal der Resistenz sich dadurch ausprägt, dass der natürliche Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, sodass eine Mycelbildung am Blatt der infizierten Pflanze sowie eine Sporulation unterbleibt.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Einkreuzung des Merkmals der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen, welches im wesentlichen die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellung einer Kartoffelpflanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen besitzt, wie zB, eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit besagte Resistenz aufweist, von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, (b) Kreuzen dieser Pflanze mit einer anderen Kartoffelpflanze, welche anfällig ist gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans, (c) Herstellung von F1 Hybridpflanzen und (d) Selektion einer Hybridpfanze, welche eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist.

M1218 PCT Um die wünschenswerten Eigenschaften zweier Elternpflanzen miteinander zu kombinieren kann eine sog Kreuzungs- oder Kombinationszüchtung durchgeführt werden. Dabei werden die Pflanzen der Fi Generation, die alle gleich aussehen, erneut gekreuzt. Erst in der F₂ Generation erfolgt eine Aufspaltung der Merkmale, und man kann sehen, bei welchen Pflanzen die gewünschte Kombination vorliegt. Dies ist bei höchstens einem Viertel der Pflanzen der Fall. Mit diesen Pflanzen wird dann weitergezüchtet, bis nach ca. 7-8 Generationen die Aufspaltungszahlen so gering sind, dass eine neue Sorte mit der gewünschten Merkmalskombination entstanden ist. Die Kreuzungszüchtung ist nach wie vor die meistangewandte Zuchtmethode für Kartoffeln.

Wenn es Ziel des Züchtungsprogramms ist, eine ausgewähltes Merkmal, wie z.B. eine Resistenz, in eine ansonsten bereits optimierte Hochleistungssorte mit gewünschten Eigenschaften einzukreuzen, bietet sich als eine Variante dieser Kreuzungs- oder Kombinationszüchtung die sog. Rückkreuzungszüchtung an. Dabei wird die F1 Nachkommenschaft mit derjenigen Elternpflanzen ein- bis mehrmals rückgekreuzt, welche die gewünschten Eigenschaften aufweist, in der Regel also mit der Hochleistungssorte. Ziel dieser Rückkreuzung ist es, den Genotyp der Hochleistungssorte möglichst vollständig wiederherzustellen mit Ausnahme eines oder mehrerer Gene, die für die Ausprägung des ausgewählten Merkmals verantwortlich sind. Bei der Rückkreuzung handelt es sich um eine Form der Inzucht, womit automatisch sichergestellt ist, dass mit zunehmender Anzahl von Rückkreuzungsschritten die Eigenschaften der Hochleistungssorte sukzessive wiederhergestellt werden. Das einzige zur Anwendung kommende Selektionskriterium betrifft dabei das ausgewählte Merkmal, zB eine Resistenz, die sich in der Regel leicht anhand geeigneter Testverfahren nachweisen lässt. Die Anzahl der Rückkreuzungsschritte liegt in der Regel bei 1 bis 4, oder mehr, abhängig davon, wie vollständig der Genotyp der Hochleistungssorte wiederhergestellt werden soll.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann z.B. eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber

Phytophthora infestans Infektionen aufweist, von welcher eine Probe in Form einer

Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig , Mascheroder Weg 1 b, mit Datum vom 22.

April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, im Rahmen eines Rückkreuzungsprogramms zunächst mit einer Phytophthora sensitiven

Kartoffelpflanze, welche wünschenswerte Eigenschaften aufweist, wie z.B. einer

M1218 PCT Hochleistungssorte gekreuzt werden, welche dann als der wiederholt zur Rückkreuzung verwendete Elter (recurrent parent) eingesetzt wird. Bei einer solchen Kreuzung kann der resistente Elter entweder als weiblicher oder als männlicher Kreuzungspartner dienen.

Die resultierende F1 Pflanze wird dann ein bis mehrmals mit der Phytophthora sensitiven Elternpflanze, wie z.B. einer der Hochleistungssorten (recurrent parent) rückgekreuzt, um den Genomanteil der resistenten Elternpflanze weiter zu reduzieren und sukzessive durch das Genom der Phytophthora sensitiven Elternpflanze zu ersetzen. Angestrebt wird eine Pflanze zu erhalten, welche zwischen 80% und 99.5%, besser zwischen 90% und 99%, insbesondere aber zwischen 95% und 98% des Genoms der sensitiven, aber ansonsten mit wünschenswerten Eigenschaften ausgestatteten Elternpflanze (wie z.B. einer Hochleistungssorte) aufweist, darüber hinaus aber noch das Merkmal der Resistenz ausprägt. In jeder auf diese Weise erhaltenen Rückkreuzungsgeneration müssen die Pflanzen auf An- oder Abwesenheit des Resistenzmerkmals hin überprüft werden. Dies kann im Falle der Resistenz sehr einfach durch Anwendung der in den Beispielen im Einzelnen beschriebenen Testverfahren erfolgen.

Nach der letzten Rückkreuzung wird vorzugsweise eine Selbstung durchgeführt.

Dies macht die Anwendung technischer Massnahmen notwendig, wie z.B. das manuelle Herausschneiden der Staubbeutel aus der Blüte der Mutterpflanze sowie das gezielte Übertragen von Pollen des väterlichen Elter auf die Narbe der Mutterpflanze. Anschliessend müssen weitere Massnahmen getroffen werden um Mischbestäubungen der zuvor artifiziell bestäubten Blüte zu verhindern, wie z.B. durch Eintüten der bestäubten Blüte.

Da die Keimungsrate von Kartoffelsamen insbesondere im Fall von Hochleistungssorten oft nur gering ist, muss diese gegebenenfalls durch Anwendung

M1218 PCT geeigneter Massnahmen erhöht werden. Eine mögliche Massnahme besteht dabei darin, die Samen nach Aufschneiden der Frucht dort für einen Zeitraum von wenigen Stunden bis zu 4 Tagen, insbesondere aber für einen Zeitraum von 6 Stunden bis 3 Tagen, bzw. für einen Zeitraum von 12 Stunden bis 2 Tagen, insbesondere für einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen zu belassen, bevor dann die Aussaat in ein geeignetes Kulturmedium erfolgt. Alternativ kann die Inkubation der isolierten Samen in dem zuvor genannten Zeitrahmen auch in einem Pflanzenextrakt erfolgen, der aus den reifen Kartoffelfrüchten gewonnen werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit weiterhin ein Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans in Kartoffelpflanzen, welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) gegebenenfalls die als Mutterpflanze vorgesehene Kartoffelpflanze durch geeignete Massnahmen zur Blütenbildung anregt; b) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische

Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen; c) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden; d) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert, diese gegebenenfalls durch geeignete Massnahmen zur Keimung anregt und anschliessend aussät; e) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet f) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen; und diese Pflanzen gegebenenfalls durch periodisches Anlegen einer Meristemkultur erhält.

HINTERLEGUNG

Eine Probe von Solanum tuberosum SCP-02 wurde in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in

M1218 PCT 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1 b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt.

BEISPIELE

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration der vorliegenden Erfindung und sind in keiner Weise beschränkend für den Umfang der Erfindung.

A₁ Pflanzenmaterialien:

Kommerzielle Kartoffelsorten [Sortenratgeber Kartoffeln für den ökologischen

Landbau http://www.uni-giessen.de/orglandbau/moeller-sorten-beschreibung.html: Bintie:

Diese weissschalige, alte Sorte ist sowohl auf Viren, wie auch auf Phytophthora infestans extrem anfällig.

Desiree:

Sehr anfällig gegenüber Viren. Jedoch ziemlich resistent gegenüber P. infestans. Rotschalig.

Sirtema:

Sehr anfällig gegenüber Phytophthora und Viren. Weisschalig.

Fontane:

Die P. infestans Anfälligkeit von Fontane ist mittelmässig. Die Virusgesundheit ist jedoch gut. Weissschalig.

Agria:

Agria ist mittelanfällig gegenüber P. infestans. Gegen PVY und PLRV ist sie sehr resistent. Weissschalig.

Agata: Eine neue Sorte die gegen Viren ziemlich resistent, gegenüber P. infestans jedoch anfällig ist. Weissschalig.

Blue Congo:

Alte Sorte die auch Blauer Schwede genannt wird und deren Herkunft nicht bekannt ist.

Wahrscheinlich die einzige Wildsorte die im Mitteleuropa angebaut wird. Über die Krautfäule- und Virenanfälligkeit ist nichts bekannt. Die Schale und das Fruchtfleisch sind violett-blau.

M1218 PCT Im Rahmen der nachfolgenden Beispiele wurden häufig angebaute Standardsorten verwendet; die Sorte Blue Congo wird als Wildsorte miteinbezogen. Die Kartoffeln wurden nicht aufgezogen, sondern als Knollen weiterverwendet.

B. Kartoffeln aus Tests vstemen:

B. LACK et al. stellten 1953 das noch heute international anerkannte und verwendete Testsortiment vor (Tab. 1 ). Es enthält insgesamt 11 R-Gene allein und in Kombination, allerdings ist es nicht mehr samenvermehrbar (Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin-Dahlem, „Die Kraut- und Braunfäule der Kartoffel und ihr Erreger Phytophthora infestans (Mont.) De BARY", Bärbel Schöber-Butin, Heft 384, Berlin 2001 , Herausgeber: Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Berlin und Braunschweig; Parey Buchverlag Berlin).

Mit Hilfe des Testsortimentes können, wie bereits beschrieben, die Pathotypen des Pilzes bestimmt werden. Umgekehrt können aber auch die in den Kartoffeln eventuell vorhandenen Hauptgene mit Hilfe von Einzelpathotypen charakterisiert werden.

Tab. 1 Zusammensetzung des Internationalen Testsortimentes (Herkunft: Scottish Agricultural Science Agency)

Niederländische Kartoffel Linien (NKL):

Die Niederländischen Linien sind ein Testsystem von 11 Bintje- Pflanzen. Jede Pflanze des Systems besitzt eines der R-Gene der Tabelle 1. Dadurch können die Virulenzgene

M1218 PCT eines Pilzes bestimmt werden. Die Pflänzchen werden in Gewebekulturen vermehrt und bei Bedarf in Erde eingepflanzt.

C. Die SCP-02 Kartoffel:

Die SCP-02 Kartoffel konnte aus einem Versuchsfeld mit Kartoffeln der Sorte „Bintje" isoliert werden, welches mit P infestans infiziert war. Sie wurde mit Hilfe des NKL Systems auf Resistenz gegenüber den bekannten Pathotypen von Phytophthora infestans getestet. Die SCP-02 Kartoffel erwies sich dabei als resistent gegenüber P. infestans. Gegenüber den verschiedenen Kartoffelviren ist sie sehr anfällig. Sie ist gut geniessbar (ähnlich wie Matilda und Bintje) und weissschalig. Sie wird sowohl als Knolle wie als auch als Ganzpflanze für Versuche verwendet.

Agronomische Beschreibung: Die Knollen treiben im Kühllager (5°C) ab Januar leicht Sprosskeime, ab März beginnt deutliches Keimlingswachstum, welches leicht stärker ausfällt als bei der Vergleichssorte "Bintje".

Eine Vorkeimung zur Auspflanzung erfolgt während 1 Woche unter grosser Lichtintensität.

Die Entwicklungszeit bis zur Blüte ist ebenfalls mit derjenigen von "Bintje" identisch. Die Pflanzengrösse ist jedoch deutlich geringer als bei der Standardsorte "Bintje".

SCP02 blüht weiss, die Blüten halten gut an der Staude und entwickeln in der Folge auch problemlos Früchte.

Die durchgeführten Tests beschränkten sich auf Kulturzeiten, die für Speisekartoffeln typisch sind (100 - 120 Tage). Eignung als Frühkartoffel oder Industriekartoffel wurde nicht getestet.

Lagerfähigkeit: Normal (bis März). Bei Anwendung von Keimhemmmittel sind ähnliche Lagermöglichkeiten realisierbar wie mit der Vergleichssorte "Bintje".

M1218 PCT Anfälligkeit auf Virus (Blattroll-V): Mittel bis hoch Anfälligkeit auf Phytophthora Blatt: Keine Anfälligkeit auf Phytophthora Knollen: Keine Anfälligkeit auf Alternaria Mittel Attraktivität für Blattläuse Mittel Attraktivität für Kartoffelkäfer Klein

Weitere Angaben bezüglich der Speisequalität von SCP-02 im Vergleich mit den Hochleistungssorten „Bintje" und „Matilda" differenziert nach Kochtyp finden sich in der nachfolgenden Tabelle 2.

M1218 PCT Allgemeine Kriterien zur Beurteilung des Kochtyps von Kartoffeln

M1218 PCT

Tabelle 2: Beurteilung der Speisequalität von Kartoffeln nach dem Kochtyp

Kochtyp: A (überall Pos. 1 ) = feste Salatkartoffel C (überall Pos. 3) = mehlige Kartoffel B (überall Pos. 2) = ziemlich feste Kartoffel, D (überall Pos. 4) = stark mehlige Kartoffel für alle Zwecke geeignet

M1218 PCT

D. Phvtophthora- Stämme:

Im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Infektionsstudien wurden die folgenden Phytophthora Stämme verwendet:

Stamm 96:

Standardstamm mit den Virulenzgenen 3,4,5,7 und 9. [gemäss Abgleich mit den

Niederländischen Linien]

Stamm 90128

Stamm aus Ohio mit den Virulenzgenen 1 ,3,4,7,8,9,10 und 11.

Stamm 91002

Stamm aus den Niederlanden mit den Virulenzgenen 2 und 7.

Stamm 91011

Stamm aus den Niederlanden mit den Virulenzgenen 3,4,5 und 11.

Stamm 88069S Stamm aus Ohio mit den Virulenzgenen 1 ,3,4,7.

(Die oben genannten Stämme sind bei der Universität von Wageningen erhältlich, Francine Govers Laboratory of Phytopathology, Wageningen Agricultural University, Binnenhaven 9, 6709 PD Wageningen, The Netherlands; Graduate School Experimental Plant Sciences, The Netherlands)

Alternativ dazu können die verschiedenen Pathotypen von Phytophthora infestans auch mit Hilfe des Testsortiments von LACK et al. 1953 bestimmt werden (Tab. 1).

Ein Stamm-Gemisch mit 230 Isolate nach I. Irzhansky und Y. Cohen, 2006 („Inheritance of resistance against Phytophthora infestans in Lycopersicon pimpenellifolium L3707", akzeptiert zur Publikation in Euphytika) wurde verwendet um weitere Erkenntnisse zur Resistenz in F1 Nachkommen zu gewinnen. Proben besagten Stammgemisches können von den Autoren erhalten werden.

M1218 PCT AIIe Pilzstämme werden auf Roggenagar kultiviert [Beyer K. et al, Characterization of Phytophthora infestans genes regulated during the interaction with potato. Molecular Plant Pathology 2002, 3(6), 473-85.].

Beispiel 1: Verwandtschaftsbestimmung

Zur Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse von Organismen gibt es verschiedene Möglichkeiten, welche zB auf der Verwendung von Simple Sequence Repeats (SSR)₁ Random Amplified Polymorphie DNA- Polymerase- Chain- Reaction (RAPD-PCR) und Amplified- Fragment- Length- Polymorphism (AFLP) basieren. Für alle vier Methoden muss zuerst DNA extrahiert, aufgereinigt und quantifiziert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Verwandtschaftsbestimmung mittels AFLPs durchgeführt (G. Knapova and U. Gisi, Phenotypic and genotypic strueture of Phytophthora infestans populations on potato and tomato in France and Switzerland, Plant Pathology Volume 51 , Issue 5, Page 641 - October 2002).

Die AFLP- Technik basiert auf der Amplifikation der Produkte eines Restriktionsverdaus und anschliessenden selektionierenden PCR^'s. Die aus diesen Reaktionen entstehenden Produkte werden anschliessend auf ein Polyacrylamidgel geladen und 4 Stunden unter Hochspannung aufgetrennt.

Die durch die selektive PCR „farbig" markierten DNA- Fragmente durchlaufen am unteren Ende des Gels einen Sensor der ihr Ankommen aufzeichnet. Sämtliche Aufzeichnungen kombiniert ergeben dann das Bandenschema welches ausgewertet wird.

Der genetische Fingerabdruck der Phytophthora-resistenten SCP-02 Kartoffel ähnelt keinem der kommerziellen Sorten so stark, als dass sie durch eine Punktmutation aus ihr hätte entstehen können. Die SCP-02 ist also mit keiner der getesteten Sorten Mitteleuropas nahe verwandt. Bei weitem am meisten Ähnlichkeit zeigt die SCP-02 (wie in Tabelle 1 ersichtlich) mit Desiree, am wenigsten mit der Wildsorte Blue Congo (=Blauer Schwede). Die Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung der Binärauswertung nach Anzahl übereinstimmender Bandenmerkmale.

M1218 PCT Tabelle 2

Beispiel 2: Infektionsstadien

Der Infektionsverlauf wurde anhand der resistenten Kartoffel SCP-02 sowie einer „Bintje" als Kontrollpflanze untersucht. Die Knollen der beiden Kartoffelpflanzen wurden dabei zehn Wochen lang bei einer Temperatur von 4° C gelagert und unter Ausbildung von Stolonen gekeimt. Aus den Stolonen wurden dann die Pflänzchen herangezogen.

Für die Infektionsstudien wurden 2 Wochen alte Phytophthora- Stämme (Stamm 96 und Stamm 90128) verwendet um eine gute Sporulation zu gewährleisten.

Für den Vorbereitungstest werden je drei Blattsegmente der SCP-02, der Bintje und einer geselbsteten SCP-02 F1 -Hybrid Pflanze mit der Blattunterseite nach oben in Petrischalen mit feuchten Filterpapieren gelegt und mit einer Sporensuspensionen der beiden Pilz-Stämme inokuliert. Die Schalen werden einen Tag im Dunklen und anschliessend vier Tage unter Licht inkubiert. Nach fünf Tagen werden die Blätter visuell nach der Art der Resistenz (resistent, sensitiv oder vertikalresistent) ausgewertet.

Die Sporendichte beträgt 50^'0OO Sporen/ml. Für eine optimale Zoosporenfreisetzung wird die Suspension für mindestens 30 Minuten bei 4°C gekühlt. Die Sporensuspension

M1218 PCT wird nun auf die Blattunterseite gesprayt und das Blatt inkubiert. Nach einem Tag wird jeweils ein Blatt von jeder Kombination zerschnitten, in der erwärmten Färbelösung gekocht und einen Tag darin inkubiert. Am nächsten Tag wird das Blatt entfärbt und unter dem Mikroskop betrachtet. Die anderen beiden Blätter werden am dritten beziehungsweise am fünften Tag dementsprechend ausgewertet. Die Beobachtungen werden sowohl in Text- als auch in Bildform dokumentiert und verglichen.

Bei den Färbungen zeigten sich kein Anzeichen einer Infektionshyphe. Die Zoospore keimte aus, bildete einen Keimschlauch und ein Appressorium. starb dann aber sehr schnell ab. Der Pilz kann also nur oberflächlich in das Blatt eindringen, dort aber keine Infektion auslösen (keine Mycel- und Sporenbildung). Die sensitive und die vertikalresistente Pflanze zeigten den erwarteten Infektionsverlauf.

Beispiel 3: Resistenzmechanismen

Zur Differenzierung zwischen verschiedenen möglichen Resistenzmechanismen (Horizontalresistenz oder Vertikalresistenz) in der SCP-02, muss die Kartoffel mit hochvirulenten Phytophthora- Stämmen getestet werden. Um auszuschliessen, dass die Resistenz der SCP-02 mit einem R-Gen begründet werden kann, wurden zunächst Blattsegmente und Kartoffelscheiben mit Phytophthora- Stämmen inokuliert, die mehrheitlich die R-Gene der NKL abdecken. Dazu wurden Blattsegmente bzw. die gewaschenen Kartoffelscheiben in Petrischalen platziert, die mit feuchten Filterpapieren ausgelegt waren, und 10 Tröpfchen der gekühlten Sporensuspension (50^'0OO Sporen/ml) auf die Blattunterseite bzw. die Scheiben pipettiert. Anschliessend wurden die Schalen fünf Tage lang inkubiert und danach nach Symptomen ausgewertet. Derselbe Test wurde noch mit hochvirulenten Stämmen aus der Schweiz und aus Israel (Standardstamm der Bar- llan University, Israel) durchgeführt.

Während mehrjährigem Feldanbau an Orten mit natürlichem Phytophthora-Inokulum blieb SCP-02 immer frei von Infektionssymptomen sowohl an den Blättern wie auch an den Knollen. SCP-02CP-02 erwies sich auch in den hier durchgeführten Tests als resistent gegenüber allen bisher getesteten Phytopthora infestans Pathotypen. Die Pathotypen, welche die differenziellen Kartoffellinien (R1-R11 , R6 wurde noch nicht getestet) befallen konnten, haben bei SCP-02 keine Infektion auszulösen vermocht.

M1218 PCT Auch bei Inokulation mit einem Stammgemisch von mehr als 200 Isolaten blieb SCP-02 Symptom-frei.

Bei der Bestimmung des Abstoppungszeitpunktes des Pathogens während der Infektion, kann das Stadium ziemlich genau bestimmt werden. Die Abwehrreaktion scheint unmittelbar nach der Bildung des Appressoriums zu beginnen. Der Pilz penetriert nicht und unter dem Mikroskop sind keine, durch eine hypersensitive Reaktion (HR), zerstörten Zellen sichtbar. Diese Faktoren führen zum Schluss, dass die Resistenz nicht vertikal sein kann, sondern eine polygen bedingte Horizontalresistenz in der Pflanze vorliegt. Dass der Pilz die Kutikula nicht durchdringen kann, könnte an der Zusammensetzung des Kutins liegen. Ist diese leicht anders als bei üblichen Kartoffelsorten, kann sie durch die Pathogenkutinase nicht abgebaut werden. Es könnte also sein, dass eine „Non- Host" Reaktion vorliegt (der Pathogen erkennt die SCP-02 nicht als Wirtspflanze). Da die Resistenz aber polygen bedingt ist, sind noch andere solche Faktoren (z. B fehlende Rezeptoren auf der Blattoberfläche) und Mechanismen denkbar. Die Fehlerquelle bei diesem Versuch ist sehr gering, da die gefärbten Blätter unter einem gut ausgerüsteten Mikroskop sehr gut betrachtet werden können.

Inokuliert man hingegen Blattsegmente oder Kartoffelscheiben mit dem hoch pathogenen Phytophthora- Stamm 90128, ist eine abweichende Reaktion zu beobachten. Es zeigen sich die typischen Symptome einer Phytophthorainfektion. Die Blätter werden wässerig, riechen schlecht und zersetzen sich langsam, alles Symptome wie sie für eine Phytophthora- Infektion typisch sind. Im Unterschied zu einer die Kraut- und Wurzelfäule auslösenden Infektion wird jedoch im Fall der SCP-02 Kartoffel kein Myzel an der Oberfläche der Blattunterseite gebildet und der Pilz sporuliert nicht.

Ein ähnliches Bild entsteht bei einer Knolleninfektion. Auf der Knolle wird Myzel gebildet. Dieses wächst aber ballenförmig und sporuliert nicht. Der Pilz kann demnach wohl oberflächlich in die Pflanze eindringen, sich aber nicht weitervermehren und keine krankheitsverursachende Infektion auslösen.

M1218 PCT Beispiel 4: Resistenzvererbung

4.1 Blühinduktion:

Die Kartoffelpflanzen wurden mit folgender Methode zu verstärktem Blühen angeregt. s Die Saatknolle wurde auf einen mit Erde überdeckten Holzbalken gelegt und wieder mit Erde überschüttet Die Pflanze wuchs über den Balken, ebenso die Wurzeln und Knollen. Monatlich wurden die gebildeten Knollen entfernt ohne die Pflanzen allzu stark zu verletzten. Die „Balkenpflanzen" blühten stärker als die Kontrollen.

0 ±2 Selbstbestäubung

Da die Kartoffel zur Selbstbestäubung fähig ist, wurden frisch geöffnete Blüten der SCP-02 Pflanze, deren Staubbeutel noch nicht geöffnet waren und ältere Blüten einer kommerziellen Sorte (Desiree und Fontane) für die Vererbungsversuche verwendet.

5 Bei der eigentlichen Kreuzung wurden zuerst die Staubbeutel der Mutterpflanze aus der Blüte herausgeschnitten und dann mit einer Präparationsnadel Pollen der Vaterpflanze auf ihre Narbe übertragen. Die bestäubte Blüte wurde mit einem Papiersäckchen eingetütet um eine Mischbestäubung zu vermeiden. Nach etwa acht Wochen waren die gebildeten Früchte erntereif. Zusätzlich zu den gekreuzten Früchten wurden auch noch 0 selbstbestäubte Früchte geerntet um die beiden Erbgänge zu vergleichen. Die Beeren wurden aufgeschnitten und zwei Tage lang in ihrem eigenen Saft inkubiert um die Keimfähigkeit der Samen zu erhöhen. Danach wurden die Samen ausgesät und die Pflänzchen aufgezogen. Sobald die Pflänzchen genug gross sind (nach ungefähr acht Wochen), wurden sie auf ihre Resistenz gegenüber Phytophthora infestans getestet 5 (gemäss oben beschriebener Methode). Die jeweilige Anzahl Pflanzen mit den verschiedenen Resistenzmerkmalen wird als Verhältnis angegeben und danach mit bestehenden Verhältnissen verglichen.

Die F1 Pflanzen können durch Einlagerung der gebildeten Knollen bzw durch Anlage 0 von Meristemkulturen erhalten werden.

4.3 Kreuzungsanalyse

Testet man die durch Kreuzung entstandenen Nachkommen auf ihre

Resistenzeigenschaften, so zeigt sich eine Aufsplittung der Phänotypen in drei 5 Gruppen. Man erhält resistente Phänotypen, vergleichbar mit SCP-02, Phänotypen, die eine (H)ypersensitive (R)eaktion zeigen, sowie sensitive Phänotypen. Das Verhältnis

M1218 PCT dieser Phänotypen bei der Kreuzung von SCP-02 mit Fontane ergab eine Aufspaltung von 6:58:1 (resistent:HR:sensitiv). Dies lässt auf tetraploide Kreuzungspartner schliessen. Die durch Selbstbestäubung entstandenen F1 Pflanzen sind allesamt resistent gegenüber dem Stamm 96. Die Morphologie kann jedoch stark unterschiedlich ausfallen. Aufgrund des Selbstbestäubungsversuchs kann ausgeschlossen werden, dass die Resistenz rezessiv vererbt wird, sodass von einem dominaten Erbgang ausgegangen werden kann.

Bei der Kreuzung SCP-02 x Desiree ergab sich eine 2:5:0 (resistent:HR:sensitiv) Aufspaltung.

Inokulation von 12 zufällig ausgewählten Vertretern der F1 , die aber alle gegenüber Stamm 96 resistenten F1 umfassten, mit einem Stamm-Gemisch von 230 Isolaten nach I. Irzhansky und Y. Cohen, 2006 ergab eine Segregation von 4:5:3 (resistent:HR:sensitiv).

Die resistenten F1 Nachkommen aus der Kreuzung SCP-02 x Fontane und SCP-02 x Desiree wurden dann noch mit dem Stamm 90128 inokuliert. Von 2 Desiree Nachkommen blieb einer resistent und von 6 Fontane Nachkommen blieben 6 resistent, dh. sie zeigten vollkommene Immunität gegenüber sämtlichen getesteten Phytophthora Stämmen.

Die Segregation (6:58:1 ) der F1 Nachkommenschaft der Kreuzung SCP-02 x Fontane lässt auf Tetraploidie der Eltern schliessen. Da die aus Selbstbestäubung hervorgegangenen Nachkommen gegenüber dem Stamm 96 alle resistent sind, wird angenommen, dass der Hauptfaktor der Resistenz dominant vererbt wird. Der Test mit weiteren Pathogenstämmen hat aber gezeigt, dass die Resistenz weitere Faktoren über die HR hinaus besitzt, da sich die resistenten F1 Nachkommen nochmals aufspalteten. Es wirken also mit Sicherheit mehrere Resistenzmechanismen in der SCP-02. Dies ist nicht weiter verwunderlich wenn man sich die Genetik von autotetraploiden anschaut; die Pollen solcher Pflanzen können 6¹² verschiedene Allelkombinationen haben. Aufgrund der Vererbungsschemas kann jedoch gesagt werden, dass bei einer Kreuzung zwischen einer kommerziellen Sorte und der SCP-02 immer totalresistente Pflanzen entstehen. Auch das Stammgemisch aus 230 Isolaten mit allen Virulenzen und verschiedensten Aggressivitäten vermochte nicht alle F1 zu befallen, was darauf hin deutet dass die Totalresistenz stabil weitervererbt werden kann. Die Resultate bei

M1218 PCT Selbstbestäubungsversuchen zeigen, dass die Resistenzvererbung dominant verläuft (alle F1 sind resistent, im Phänotyp jedoch unterschiedlich) und die SCP-02 heterozygot ist. Das Ergebnis dieser beiden Versuche wiederum stützt auch die Annahme, dass die Resistenz polygen bedingt ist. Durch die Kreuzung entstanden sehr viele Vertikalresistenten Pflanzen, bei welchen durch die Kreuzung mindestens ein Resistenzfaktor „verloren" gegangen, also rezessiv ist.

Den gewonnen Resultaten nach ist es möglich aus der SCP-02 durch Kombinationszüchtung eine Kartoffelsorte heranzuzüchten, die sowohl dauerhaft gegen Phytophthora infestans resistent ist als auch gute Erträge bringt. Die Horizontalresistenz, die Kreuzungsfähigkeit und die dominante Resistenzvererbung sind ideale Ausgangsbedingungen dafür.

Andererseits kann SCP-02 als Donor für Resistenz gegenüber Phytophthora infestans dienen in Fällen wo Kreuzen schwierig oder unmöglich ist (innerhalb Solanum tuberosum spp. andigena aber auch zu anderen Lycopersicon Arten). Dazu müssen mit weiteren Studien die genetischen Faktoren, die zu Resistenz führen bestimmt werden.

4.4 Vermehrung und Erhaltung der F1 Generationen durch Meristemkulturen Sprossspitzen werden so von der Kartoffelpflanze abgeschnitten, dass mindestens 2 Nodien an dem Explantat verbleiben.

Die Sprossspitzen werden unter sterilen Bedingungen in einer 0.5 % igen Hypochlorat- Lösung (( NaHCIO ) = Javelwasser) oberflächensterilisiert (ca. eine halbe Minute) und danach mit einer sterilen Pinzette in sterilem Wasser gebadet. Die Explantate werden anschliessend auf sterilisiertem, mit Agar verfestigtem Murashige & Skoog Medium (Murashige Mix SIGMA 4.3 g/l; Saccharose 15 g; Agar 5 g; E- Wasser 1000 ml) kultiviert. Dabei werden die Sprossspitzen so auf dem Medium montiert, dass die zwei obersten Nodien in das Medium hineinragen und von diesem umschlossen werden.

Die so vorbereiteten Explantate werden in der Klimakammer bei einer Tagestemperatur von 22°C und einer Nachttemperatur von 20⁰C sowie einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60% und einem Tag/Nacht Rhythmus von 16h/8h kultiviert.

Nach ca. 10 Tagen werden die ersten Wurzeln sichtbar.

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Claims

Ansprüche

1. Kartoffelpflanze, welche eine horizontale und damit eine ausgeprägte und anhaltende Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist und vorzugsweise frei von Symptomen bleibt.

2. Kartoffelpflanze gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Infektion handelt, welche durch Phytophthora infestans Pathotypen verursacht wird, die zumindest eines oder aber mehrere der Virulenzgene ausgewählt aus der Gruppe der Virulenzgene 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 und 11 in unterschiedlicher Kombination enthalten.

3. Kartoffelpflanze gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Infektion handelt, welche durch Phytophthora infestans Pathotypen verursacht wird, die zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder aber insbesondere sämtliche Virulenzgene ausgewählt aus der Gruppe der Virulenzgene 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 und 11 enthalten, in unterschiedlicher Kombination.

4. Kartoffelpflanze gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Infektion handelt, die durch einen oder mehrere der nachfolgenden Phytophthora infestans Pathotypen, insbesondere aber durch sämtliche der nachfolgenden Pathotypen verursacht wird, welche mindestens 2 der bekannten Virulenzgene V1-V11 in folgender Kombination aufweisen

5. Kartoffelpflanze gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Merkmal der Resistenz durch Einkreuzen einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSM 17671) aufweist, erhältlich ist.

6. Kartoffelpflanze gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen enthält, eingekreuzt aus

M1218 PCT einer Vorgängerpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 (DSM 17671 ). aufweist.

7. Kartoffelpflanze gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich bei Infektion mit einem hoch pathogenen Phytophthora infestans Stamm sich besagtes Resistenz-Merkmal dadurch ausprägt, dass der natürliche

Infektionsverlauf von Phytophthora infestans unterbrochen ist, indem die Mycelbildung an der Blattunterseite sowie eine Sporulation unterbunden wird und die Infektionssymptome somit lokal auf den Infektionsort begrenzt bleiben.

8. Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans in Kartoffelpflanzen, welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen; b) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden; c) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät; d) Pflänzchen heranzieht und diese in einem geeigneten Testsystem auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet; e) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber

Phytophthora infestans Infektionen aufweisen.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Kreuzung resultierende F1 Hybriden, welche das Merkmal Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen, mit einem Elternteil ein- bis mehrfach rückgekreuzt werden.

10.Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Elternteil um den Phytophthora sensitiven Elter handelt.

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1 1.Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pflanze erhalten wird, welche zwischen 80% und 99.5%, besser zwischen 90% und 99%, insbesondere aber zwischen 95% und 98% des Genoms der sensitiven

Elternpflanze aufweist, darüber hinaus aber noch das Merkmal der Resistenz s ausprägt.

12.Verfahren gemäss Anspruch 10 und 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem sensitiven Elter um eine Hochleitsungssorte handelt.

13.Verfahren zur Herstellung einer Kartoffelpflanze welche eine Resistenz gegenüber 0 Phytophthora Infektionen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristemkultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und 5 Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg

1 b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze kreuzt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen; b) geeignete Massnahmen trifft, um sowohl während als auch nach dem 0 artifiziell durchzuführenden Bestäubungsvorgang eine Mischbestäubung zu vermeiden; c) Samen der F1 Generation aus den erntereifen Früchten isoliert und aussät; d) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora 5 infestans testet; e) Phytophthora resistente Pflanzen mit dem Phytophthora anfälligen ein- bis mehrfach rückkreuzt; f) in jeder auf diese Weise erhaltenen Rückkreuzungsgeneration die Pflanzen auf An- oder Abwesenheit des Resistenzmerkmals hin überprüft, 0 g) eine Pflanze heranzieht, welche das gewünschte Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora Infektionen ausprägt.

14. Verfahren zur Einkreuzung einer Resistenz gegenüber Infektionen mit Phytophthora infestans in Kartoffelpflanzen, welche eine solche Resistenz nicht aufweisen, 5 dadurch gekennzeichnet, dass man

M1218 PCT a) gegebenenfalls die als Mutterpflanze vorgesehene Kartoffelpflanze durch geeignete Massnahmen zur Blütenbildung anregt; b) eine Kreuzung einer Kartoffelpflanze, welche die genetische Ausgestaltung von SCP-02 und somit eine Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweist, einer Pflanze von welcher eine Probe in Form einer Meristem kultur bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in 38124 Braunschweig, Mascheroder Weg 1 b, mit Datum vom 22. April 2005 unter der Hinterlegungsnummer DSM 17671 hinterlegt wurde, mit einer Kartoffelpflanze durchführt, welche anfällig ist gegenüber Phytophthora infestans Infektionen; c) geeignete Massnahmen trifft, um eine Mischbestäubung zu vermeiden; d) Samen aus den erntereifen Früchten isoliert, diese gegebenenfalls durch geeignete Massnahmen zur Keimung anregt und anschliessend aussät; e) Pflänzchen heranzieht und diese auf Resistenz gegenüber Phytophthora infestans testet

f) Pflanzen selektiert, welche das Merkmal der Resistenz gegenüber Phytophthora infestans Infektionen aufweisen; und diese Pflanzen gegebenenfalls durch periodisches Anlegen einer Meristemkultur erhält.

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