EP1805503A1 - Multifunctional reference system for use in analyte detection by fluorescence - Google Patents

Multifunctional reference system for use in analyte detection by fluorescence

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Publication number
EP1805503A1
EP1805503A1 EP05798048A EP05798048A EP1805503A1 EP 1805503 A1 EP1805503 A1 EP 1805503A1 EP 05798048 A EP05798048 A EP 05798048A EP 05798048 A EP05798048 A EP 05798048A EP 1805503 A1 EP1805503 A1 EP 1805503A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
analyte
substance
reference substance
sample
luminescence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05798048A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Carina Horn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG, Roche Diagnostics GmbH filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of EP1805503A1 publication Critical patent/EP1805503A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to a system for the detection of luminescence of an analyte in a liquid sample, the system comprising a carrier on which an analyte-specific substance and a reference substance are located. Furthermore, the invention relates to a method for detecting an analyte in a liquid sample, wherein said system is used. In addition to the detection of an analyte, the system according to the invention is suitable for determining the amount of sample, determining the amount of the analyte and / or determining the functional readiness of the carrier for a detection.
  • the system and method according to the invention for detecting an analyte is based on luminescence detection, in particular fluorescence detection.
  • luminescence detection in particular fluorescence detection.
  • fluorescence detection Such detection systems have long been known in the art.
  • the photometric evaluation of analytical test elements is one of the most common methods for rapid detection or rapid determination of the concentration of analytes in samples.
  • test elements that are evaluated photometrically have a high priority.
  • the intensity of the emission of fluoreszenziemden substances depends directly proportional to the intensity of the excitation.
  • the intensity of the excitation can be influenced by many factors, for example the behavior of the light source over time or changes in the light paths.
  • changes in the light paths can cause different excitation intensities. Therefore, it is very difficult to perform absolute fluorescence measurements reproducibly.
  • fluorophore-based detection system that emits a second fluorophore that emits at a different wavelength than the analyte-specific fluorophore.
  • This second fluorophore can thus be used as a reference. It can then be distinguished by two different filters (and two detectors) between the two fluorophores, wherein a fluorophore undergoes no chemical reaction and can serve as a reference.
  • This detection system is described, for example, in the following reference: Principles of Fluorescence Spectroscopy, J.R. Lackowicz, Klüver Academic / Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, Moscow 1999, 2nd ed.
  • Another approach is to use time-resolved and phase-modulated referencing in which a very long-lived fluorophore that has a longer lifetime than a short-lived fluorophore specific for the analyte is used as the reference substance. While the long-lived luminescence is not influenced by the analyte in its parameters, the intensity of the analyte-specific, short-lived phosphor varies depending on the respective analyte concentration. Then, by time-resolved measurement, analyte fluorophore can first be measured and then the decay of the reference recorded.
  • WO 99/06821 discloses such a system.
  • at least two different phosphors are used co-immobilized on a carrier, the first of which responds to the parameter of the analyte to be determined at least in the luminescence intensity, and the second of which does not respond to the parameter to be measured at least in the luminescence intensity and the decay time.
  • the phosphors have different cooldowns. The time or phase behavior of the resulting luminescence response can thus be used to form a reference variable for the determination of the analyte parameter to be measured.
  • WO 02/056023 discloses an optical sensor for determining at least one parameter in a sample, wherein here too a parameter indicator with a short cut-off time which responds to the parameter and a reference material with a long cooldown which does not respond to the parameter are used.
  • the indicator material and the reference material are immobilized on a common carrier and covered on the sample side with an opaque layer.
  • the referencing via a second fluorophore which is measured at a different wavelength, however, requires a higher expenditure on equipment. For example, two filters are needed instead of just a single filter to block the excitation light, and two detectors are usually needed. In addition, one of the two paths can be faulty due to the separation of the optical paths after the excitation in different detectors, which would then lead to a false referencing.
  • FIG. 1 shows the measuring range of the analyte signal with and without reference. Without the reference fluorophore, the measuring range can be optimally adapted to the dynamic range to be spanned. With reference fluorophore, part of the measuring range is claimed by the reference.
  • the reference substances or reference phosphors used in the above-mentioned prior art methods can only be used as a reference substance for comparison with the analyte, but they can not fulfill other functions.
  • WO 83/00931 discloses an apparatus and a method for detecting a liquid sample, wherein it is determined whether a sufficient amount of sample liquid has been applied. This is achieved by emitting from a drop detector comprising a light source radiation onto the sample which is within the absorption band of water. First, the sample carrier is irradiated in the dry and then in the wetted state and thus the moisture is measured. Due to the difference of the detected signals, the moisture content of the sample is then calculated.
  • U.S. Patent 5,114,350 discloses a method and apparatus for determining the concentration of an analyte in a body fluid sample. The degree of wetting of the reaction carrier is measured by measuring the amount of reflected light which decreases with increasing wetting.
  • DE 10248555 A1 discloses a method for detecting and compensating the underdosing of test strips. This document describes a test element which comprises an analyte-specific reagent which interacts with an analyte in a sample and a control substance which interacts with a sample matrix of the sample. The analyte-specific reagent interacts with the analyte as a function of the analyte concentration in a detection wavelength range.
  • the control sequence interacts with irradiation of the test field with the sample matrix as a function of the amount of sample applied to the test field.
  • the control substance can also react with the water contained in the sample matrix.
  • An example which is mentioned in DE 10248555, uses chlorophenol red as an analyte-independent color former for determining the amount of sample and 2,18-phosphomolybdic acid as analyte-specific reagent for the determination of the glucose concentration in a sample, eg. B. a blood sample.
  • two wavelength ranges must therefore be detected, which makes this test system expensive in terms of apparatus.
  • the object underlying the invention was to provide a system and method for detecting an analyte in a liquid sample, which can be carried out with a reference substance and an analyte-specific substance, without compromising the high equipment complexity described in the prior art to have to take.
  • the object according to the invention is achieved by a system for the luminescence detection of an analyte in a liquid sample, comprising a carrier comprising an analyte-specific substance which is capable of emitting a first luminescence signal upon contact with the analyte, and a reference substance which is capable of emitting a second luminescent signal due to contact with the liquid Sample is substantially quenched.
  • detection methods known from the prior art can be simplified according to the invention by using a reference substance which, in the absence of the sample, emits a luminescence signal which can be used as a reference signal.
  • this luminescent signal is abruptly substantially quenched, i. it essentially provides no signal, or at least a very much reduced signal.
  • excitation and emission are at approximately the same wavelengths as for the analyte-specific substance. This means that a single detector can then be used for the detection of the luminescence signals.
  • the reference substance Due to the property of the reference substance to emit a luminescence signal in the absence of the sample, which is then quenched when it is brought into contact with the sample, the reference substance can be used not only to detect the analyte, but also to determine the amount of sample, to determine the amount of the analyte and / or the operational readiness of the carrier.
  • the reference substance can be chosen so that its luminescence signal is quenched on wetting. Then the functional readiness of the test system can be made visible. Thus, if the carrier comprising the assay system has become wet or stored in storage or other substances have come into contact with it, this luminescent signal of the reference substance will be quenched, and it can be seen that this assay system is not functional is.
  • the quenching is preferably reversible, ie if the sample or, in particular, the wetting is removed or reversed, then the luminescence signal can also be restored.
  • a wetting detection and / or a filling control can be achieved with the system according to the invention. If, for example, a test field is provided on the support and it is not completely wetted by the sample, a residual luminescence signal remains. It is then possible to make a computational correction with respect to the analyte signal via this residual luminescence.
  • such a reference substance can also be used as a moisture indicator.
  • the moisture indicator then provides information about the storage conditions of the test system and its operational readiness.
  • man can also use the reference substance as an indicator for an expiration date of the test system to be selected.
  • Luminescent substances in particular fluorophores, which have such properties are scarcely known in the prior art. Most fluorophores experience a fluorescence increase and no quenching in a humid environment.
  • the system of the invention is a pH sensor, i. a system wherein the analyte-specific substance is selected from substances whose luminescent signal depends on the pH.
  • the reference substance is preferably not a substance whose luminescent signal is substantially quenched upon a pH change.
  • Preferred analyte-specific substance is LysoSensor Blue DND-167 or a derivative thereof, e.g. For determining the pH in the range of about 3.5 to about 7.0, or about 4.5 to about 6.0.
  • the carrier of the pH sensor according to the invention preferably has a pH at which the analyte-specific Substance shows essentially no luminescence.
  • this may be a pH selected from the range of about 7 to about 10, or from about 8 to about 9.
  • the buffering power of the carrier can be predetermined so that the carrier is substantially completely rebuffered to the pH of the sample.
  • the person skilled in the art knows how to set such a buffering force of the carrier.
  • the reference substance is preferably selected from the class of chalcones of formula I.
  • R 2 , R 3 and R 5 are preferably selected from NR 11 R 12 and SO 3 Na.
  • the remaining substituents R 1, R 4 , R 6 , R 7 , Re, R 9 and R 10 can be any desired substituents, preferably hydrogen or halogen, in particular F, Cl, Br and I.
  • R 1 and R 12 are preferably selected from hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl and butyl, where dC 4 -alkyl with -OH, -SH, phosphate, -COOH, -NH 2 , -SO 3 Na, -NO 2 , halogen, in particular F, Cl, Br and I, may be substituted.
  • a preferred substituted alkyl radical is CH 2 CH 2 -SO 3 Na.
  • Particularly preferred substances which are suitable as reference substance according to the invention are amino chlorones and chloro-chlorones, in particular according to the general formulas II, III and IV.
  • Chloroqualcone was prepared according to a method of Krasovitskii (B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH Vsesoyuznogo Obscchestva, D.I. Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965)).
  • Aminochalcone in which Rn and Ri 2 are methyl, is commercially available and has been used for orientation studies.
  • the aminochalcone of general formula V wherein R 11 and R 12 are both CH 2 CH 2 -SO 3 Na, was prepared via a multi-step synthesis.
  • Another preferred substance is thus that of the formula V.
  • the quenching reaction can also be caused by metal ions.
  • such compounds are also suitable as reference substances according to the invention, the luminescence signal of which is essentially quenched on contact with metal ions.
  • FuraRED available from Molprobes.
  • FuraRED has the following structure:
  • a third reference substance suitable according to the invention is one which responds to a pH change. These are substances whose luminescence signal is essentially quenched by a pH change.
  • Blood has a very high buffering power and is therefore able to transfer a previously set pH in the test system. For example, if the test system is set at a lower pH (for example, pH 5), then the test system is rebuffered to pH 7 when a blood sample is applied.
  • a lower pH for example, pH 5
  • LysoSensor Blue DND-167 from Molprobes (catalog no. L7533, ABS / EM 1 (nm): 373/425, PKA: 5.1, suitable pH range: 4.5-6.0 ).
  • LysoSensor Blue DND-167 which have a better water solubility than LysoSensor Blue DND-167 can be used for the system or the method according to the invention. Due to the increased water solubility, the io
  • Reaction rate can be increased with the sample containing the analyte.
  • one or more hydrogen atoms are independently substituted by substituents, wherein one carbon atom may carry more than one substituent.
  • Particularly suitable substituents are polar substituents which can carry at least one positive and / or negative charge.
  • LysoSensor Blue DND-167 derivatives of the invention carry exactly one, two, three or four substituents.
  • Preferred substituents include -OH, -SH, phosphate, -COORn, -NR11R12, -SO 3 Na, -NO 2, halogen, in particular F, Cl, Br and I, a. Rn and
  • R 12 are preferably selected from hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl and butyl, where C 1 -C 4 -alkyl is -OH,
  • a preferred substituted alkyl radical is -CH 2 CH 2 -SO 3 Na.
  • a derivative of LysoSensor Blue DND-167 is a compound of Formula VII: (VII)
  • the system according to the invention is a system for the determination of glucose, in particular of the blood glucose.
  • analyte-specific substance can, for. B. NAD or NADP be used, which in the presence of a suitable enzyme, for.
  • a glucose dehydrogenase NADH or NADPH forms, which shows a luminescence.
  • the luminescence signal is substantially quenched at a pH change, z. LysoSensor Blue DND-167 or a derivative thereof.
  • Another object of the present invention is also a method for detecting an analyte in a liquid sample by luminescence, comprising
  • a reference substance and an analyte-specific substance that are excited and emitted in substantially the same wavelength range.
  • the luminescence signal of the reference substance is measured in the absence of the sample, then the liquid sample is applied and the luminescence signal which is produced by the sample is measured.
  • This can preferably be done by using a single detector.
  • different detectors may also be used, especially if the wavelength ranges of the reference substance and the analyte-specific substance differ.
  • FIG. 1 shows the measurement range for the measurement for the luminescence signal of an analyte with or without a reference substance according to the prior art method.
  • Figure 2 shows the kinetics of quenching of dimethylaminochalcone upon wetting.
  • FIG. 3 shows a test system using a 0.05% solids chalcone.
  • the samples were 4 solutions, each containing 0 mg / dl,
  • the intensity of the luminescence was measured and compared with the quenched signal derived from the control sample with 0 mg / dl glucose.
  • Difference counts are maximum when sufficient sample has been applied. They get smaller and smaller the less sample is applied.
  • FIG. 4 shows the number of counts per volume in the same test format as described in FIG. From about 1 ⁇ l, a plateau is reached, below whose reliable measurement is impossible.
  • Figure 5 shows the absorption and emission spectrum of FuraRED.
  • FIG. 6 and FIG. 7 show the fluorescence emission of LysoSensor Blue DND-167 as a function of the pH.
  • the intensity of the luminescence was measured for 24 seconds after application of the sample.
  • the intensity of the luminescence was measured for 24 seconds after application of the sample.
  • the results with the sample containing 0 mg / dl glucose correspond to the result from FIG. 8.
  • the decrease in the time-dependent luminescence decreases (90 mg / dl) or the luminescence rises above the initial value (300 mg / dl). dl and 700 mg / dl glucose).
  • the different time courses of the Lysosensor Blue DND167 and NADH-dependent luminescence can be distinguished from each other. Examples
  • the chalcone was dissolved in MeOH and spiked with the transpafill. Propofan was added to this mixture and the slurry homogonized. Subsequently, the mixture was knife-dried on a Pokalon foil and dried at 50 0 C for 5 minutes.
  • the dye Lysosensor Blue DND167 was dissolved in various buffers of different pH and this solution was applied to a test strip containing only a blank foil as a dropping area. These were measured on the measuring device.
  • Excitation wavelength 375 nm (UV LED from Roithner), detection from 420 nm with the aid of a fluorescence filter, Langpass, KV 418 from Schott, detector BPW34.
  • a layer was made containing glucose dehydrogenase, NAD and a buffer.
  • the pH of the layer was 5.
  • FIG. 8 shows the decrease in the fluorescence when the buffer solution pH 7 drops on.
  • the pH of the layer was re-buffered from pH 5 to pH 7. During the buffering, the fluorescence decreased.

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Abstract

The invention relates to a system for luminescence detection of an analyte in a sample, said system comprising a carrier on which an analyte-specific substance and a reference substance are present. The invention also relates to a method for detecting an analyte in a sample using said system. The inventive system, in addition to detecting the analyte, is adapted to determine the sample quantity, the quantity of the analyte and/or the operational readiness of the support for detection.

Description

Multifunktionales Referenzsystem bei Analytbestimmungen durch Multifunctional reference system for analyte determinations
Fluoreszenzfluorescence
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System für den Lumineszenz- Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das System einen Träger umfasst, auf dem sich eine Analyt-spezifische Substanz und eine Referenzsubstanz befinden. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das genannte System verwendet wird. Das erfindungsgemäße System eignet sich zusätzlich zum Nachweis eines Analyten dazu, die Probenmenge zu bestimmen, die Menge des Analyten zu bestimmen und/oder die Funktionsbereitschaft des Trägers für einen Nachweis festzustellen.The present invention relates to a system for the detection of luminescence of an analyte in a liquid sample, the system comprising a carrier on which an analyte-specific substance and a reference substance are located. Furthermore, the invention relates to a method for detecting an analyte in a liquid sample, wherein said system is used. In addition to the detection of an analyte, the system according to the invention is suitable for determining the amount of sample, determining the amount of the analyte and / or determining the functional readiness of the carrier for a detection.
Das erfindungsgemäße System und Verfahren zum Nachweis eines Analyten beruht auf einem Lumineszenz-Nachweis, insbesondere einem Fluoreszenz-Nachweis. Solche Nachweissysteme sind im Stand der Technik bereits seit langem bekannt. Bei den heutigen Analysemethoden stellt die photometrische Auswertung von analytischen Testelementen eines der gebräuchlichsten Verfahren zum schnellen Nachweis bzw. zur schnellen Bestimmung der Konzentration von Analyten in Proben dar. Allgemein werden photometrische Auswertungen im Bereich der Analytik, der Umweltanalytik und vor allem im Bereich der medizinischen Diagnostik eingesetzt. Insbesondere im Bereich der Blutglucosediagnostik aus Kapillarblut besitzen Testelemente, die photometrisch ausgewertet werden, einen großen Stellenwert.The system and method according to the invention for detecting an analyte is based on luminescence detection, in particular fluorescence detection. Such detection systems have long been known in the art. In today's analytical methods, the photometric evaluation of analytical test elements is one of the most common methods for rapid detection or rapid determination of the concentration of analytes in samples. Generally, photometric evaluations in the field of analysis, environmental analysis and especially in the field of medical diagnostics used. Particularly in the field of blood glucose diagnostics of capillary blood, test elements that are evaluated photometrically have a high priority.
Bei fluoreszenzspektrometrischen Nachweissystemen hängt die Intensität der Emission der fluoreszenziemden Substanzen direkt proportional von der Intensität der Anregung ab. Dabei kann die Intensität der Anregung durch viele Faktoren beeinflusst werden, zum Beispiel durch das Verhalten der Lichtquelle über die Zeit oder Veränderungen der Lichtwege. Gerade in einem Kleingerät, welches nicht feststehend in einem Labor zur Messung benutzt wird, können Veränderungen der Lichtwege unterschiedliche Anregungsintensitäten hervorrufen. Daher ist es sehr schwierig, absolute Fluoreszenzmessungen reproduzierbar durchzuführen.In fluorescence spectrometric detection systems, the intensity of the emission of fluoreszenziemden substances depends directly proportional to the intensity of the excitation. The intensity of the excitation can be influenced by many factors, for example the behavior of the light source over time or changes in the light paths. Currently at a small device, which is not used fixedly in a laboratory for measurement, changes in the light paths can cause different excitation intensities. Therefore, it is very difficult to perform absolute fluorescence measurements reproducibly.
Aus diesem Grunde verwenden die heute gängigen Fluoreszenz- Testsysteme eine Referenzsubstanz, auf die bezogen werden kann. Es sind verschiedene Arten von Referenzsubstanzen bekannt.For this reason, the currently used fluorescence test systems use a reference substance that can be referred to. Various types of reference substances are known.
Beispielsweise ist im Stand der Technik bekannt, in Nachweissystemen, die auf einem Fluorophor beruhen, einen zweiten Fluorophor zu verwenden, der bei einer anderen Wellenlänge emittiert als der für den Analyten spezifischen Fluorophor. Dieser zweite Fluorophor kann somit als Referenz benutzt werden. Dabei kann dann durch zwei verschiedene Filter (und zwei Detektoren) zwischen den beiden Fluorophoren unterschieden werden, wobei ein Fluorophor keine chemische Umsetzung erfährt und als Referenz dienen kann. Dieses Nachweissystem ist beispielsweise in der folgenden Literaturstelle beschrieben: Principles of Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lackowicz, Klüver Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, Moscow 1999, 2. Auflage.For example, it is known in the art to use a fluorophore-based detection system that emits a second fluorophore that emits at a different wavelength than the analyte-specific fluorophore. This second fluorophore can thus be used as a reference. It can then be distinguished by two different filters (and two detectors) between the two fluorophores, wherein a fluorophore undergoes no chemical reaction and can serve as a reference. This detection system is described, for example, in the following reference: Principles of Fluorescence Spectroscopy, J.R. Lackowicz, Klüver Academic / Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, Moscow 1999, 2nd ed.
Ein anderer Ansatz besteht in einer zeitaufgelösten und phasenmodulierten Referenzierung, bei der ein sehr langlebiger Fluorophor, der eine längere Lebensdauer als ein für den Analyten spezifischer kurzlebiger Fluorophor hat, als Referenzsubstanz verwendet wird. Während die langlebige Lumineszenz in ihren Parametern vom Analyten nicht beeinflusst wird, verändert sich die Intensität des für den Analyten spezifischen, kurzlebigen Leuchtstoffs in Abhängigkeit von der jeweiligen Analytkonzentration. Dann kann durch zeitaufgelöste Messung zuerst Analyt-Fluorophor gemessen werden und anschließend das Abklingen der Referenz aufgenommen werden. Das Verhältnis des Abklingsignals zu dem Signal des Analyten plus dem der Referenzsubstanz muss immer gleich sein, unabhängig mit welcher Intensität eingestrahlt wurde. WO 99/06821 offenbart ein solches System. Hierbei werden zumindest zwei verschiedene Leuchtstoffe co-immobilisiert auf einem Träger verwendet, deren erster zumindest in der Lumineszenzintensität auf den zu bestimmenden Parameter des Analyten anspricht, und deren zweiter zumindest in der Lumineszenzintensität und der Abklingzeit auf den zu messenden Parameter nicht anspricht. Die Leuchtstoffe weisen unterschiedliche Abklingzeiten auf. Das Zeit- oder Phasenverhalten der sich ergebenden Lumineszenzantwort kann somit zur Bildung einer Referenzgröße für die Bestimmung des zu messenden Parameters des Analyten verwendet werden.Another approach is to use time-resolved and phase-modulated referencing in which a very long-lived fluorophore that has a longer lifetime than a short-lived fluorophore specific for the analyte is used as the reference substance. While the long-lived luminescence is not influenced by the analyte in its parameters, the intensity of the analyte-specific, short-lived phosphor varies depending on the respective analyte concentration. Then, by time-resolved measurement, analyte fluorophore can first be measured and then the decay of the reference recorded. The ratio of the decay signal to the signal of the analyte plus that of the reference substance must always be the same regardless of the intensity with which it was irradiated. WO 99/06821 discloses such a system. In this case, at least two different phosphors are used co-immobilized on a carrier, the first of which responds to the parameter of the analyte to be determined at least in the luminescence intensity, and the second of which does not respond to the parameter to be measured at least in the luminescence intensity and the decay time. The phosphors have different cooldowns. The time or phase behavior of the resulting luminescence response can thus be used to form a reference variable for the determination of the analyte parameter to be measured.
WO 02/056023 offenbart einen optischen Sensor zur Bestimmung zumindest eines Parameters in einer Probe, wobei auch hier ein auf den Parameter ansprechendes Indikatormaterial mit kurzer Ablingzeit und ein auf den Parameter nicht ansprechendes Referenzmaterial mit langer Abklingzeit verwendet werden. Hierbei sind das Indikatormaterial und das Referenzmaterial auf einem gemeinsamen Träger immobilisert und auf der Probenseite mit einer lichtundurchlässigen Schicht abgedeckt.WO 02/056023 discloses an optical sensor for determining at least one parameter in a sample, wherein here too a parameter indicator with a short cut-off time which responds to the parameter and a reference material with a long cooldown which does not respond to the parameter are used. Here, the indicator material and the reference material are immobilized on a common carrier and covered on the sample side with an opaque layer.
Die Referenzierung über einen zweiten Fluorophor, der bei einer anderen Wellenlänge gemessen wird, benötigt allerdings einen höheren apparativen Aufwand. So werden zum Beispiel zwei Filter anstelle nur eines einzigen Filters benötigt, um das Anregungslicht abblocken zu können, und es werden in der Regel auch zwei Detektoren benötigt. Hinzu kommt, dass durch die Trennung der optischen Wege nach der Anregung in unterschiedliche Detektoren einer der beiden Wege fehlerhaft sein kann, was dann zu einer falschen Referenzierung führen würde.The referencing via a second fluorophore, which is measured at a different wavelength, however, requires a higher expenditure on equipment. For example, two filters are needed instead of just a single filter to block the excitation light, and two detectors are usually needed. In addition, one of the two paths can be faulty due to the separation of the optical paths after the excitation in different detectors, which would then lead to a false referencing.
Bei der zeit- oder phasenaufgelösten Referenzierung besteht der Nachteil, dass die Messungen der Analyten immer vor einem leuchtenden Hintergrund durchgeführt werden müssen. Das bedeutet, das immer ein gewisser Offset oder Signaluntergrund besteht, der den Messbereich - A -With the time- or phase-resolved referencing, there is the disadvantage that the measurements of the analytes always have to be carried out in front of a luminous background. This means that there is always a certain offset or signal background surrounding the measuring range - A -
begrenzt. Dieses Prinzip ist beispielsweise in Figur 1 dargestellt.limited. This principle is shown for example in FIG.
In Figur 1 sieht man den Messbereich des Analytsignals mit und ohne Referenz. Ohne den Referenzfluorophor kann der Messbereich optimal auf den zu umspannenden Dynamikbereich angepasst werden. Mit Referenzfluorophor wird ein Teil des Messbereichs von der Referenz beansprucht.FIG. 1 shows the measuring range of the analyte signal with and without reference. Without the reference fluorophore, the measuring range can be optimally adapted to the dynamic range to be spanned. With reference fluorophore, part of the measuring range is claimed by the reference.
Die Referenzsubstanzen bzw. Referenzleuchtstoffe, die in den oben genannten Verfahren des Standes der Technik eingesetzt werden, können nur als Referenzsubstanz für den Vergleich mit dem Analyten verwendet werden, sie können jedoch keine weiteren Funktionen erfüllen.The reference substances or reference phosphors used in the above-mentioned prior art methods can only be used as a reference substance for comparison with the analyte, but they can not fulfill other functions.
Ein wichtiges Thema bei der Bestimmung von Analyten im Diagnostik- Bereich ist jedoch auch die Benetzungserkennung und/oder eine Füllkontrolle des Testfeldes.However, an important topic in the determination of analytes in the diagnostics area is also the wetting detection and / or a filling control of the test field.
Auch in diesem Bereich gibt es im Stand der Technik Ansätze, die bestehenden Verfahren zu verbessern. WO 83/00931 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis einer flüssigen Probe, wobei bestimmt wird, ob eine ausreichende Menge an Probenflüssigkeit aufgetragen wurde. Dies wird erreicht, indem von einem Tropfendetektor, der eine Lichtquelle umfasst, Strahlung auf die Probe abgegeben wird, die innerhalb der Absorptionsbande von Wasser liegt. Es wird zunächst der Probenträger im trockenen und dann im benetzten Zustand bestrahlt und somit die Feuchtigkeit gemessen. Aufgrund des Unterschieds der detektierten Signale wird dann der Feuchtigkeitsgehalt der Probe berechnet.Also in this area there are approaches in the prior art to improve the existing methods. WO 83/00931 discloses an apparatus and a method for detecting a liquid sample, wherein it is determined whether a sufficient amount of sample liquid has been applied. This is achieved by emitting from a drop detector comprising a light source radiation onto the sample which is within the absorption band of water. First, the sample carrier is irradiated in the dry and then in the wetted state and thus the moisture is measured. Due to the difference of the detected signals, the moisture content of the sample is then calculated.
US-Patent 5,114,350 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Körperflüssigkeitsprobe. Der Grad der Benetzung des Reaktionsträgers wird dadurch gemessen, dass die Menge an reflektiertem Licht gemessen wird, die mit zunehmender Benetzung abnimmt. DE 10248555 A1 offenbart ein Verfahren zur Erkennung und Kompensation der Unterdosierung von Teststreifen. In dieser Druckschrift wird ein Testelement beschrieben, welches ein Analyt-spezifisches Reagenz umfasst, das mit einem Analyten in einer Probe wechselwirkt, sowie eine Kontrollsubstanz, die mit einer Probenmatrix der Probe wechselwirkt. Das Analyt-spezifische Reagenz wechselwirkt mit dem Analyten in Abhängigkeit von der Analytkonzentration in einem Detektionswellenlängenbereich. Die Kontrollsequenz wechselwirkt bei Bestrahlung des Testfeldes mit der Probenmatrix in Abhängigkeit von der auf das Testfeld aufgegebenen Probenmenge. Die Kontrollsubstanz kann dabei auch mit dem in der Probenmatrix enthaltenen Wasser reagieren. Ein Beispiel, das in DE 10248555 genannt ist, verwendet Chlorphenolrot als Analyt-unabhängigen Farbbildner zur Bestimmung der Probenmenge und 2,18- Phosphormolybdänsäure als Analyt-spezifisches Reagenz zur Bestimmung der Glucosekonzentration in einer Probe, z. B. einer Blutprobe. In dem genannten Beispiel dieses Dokuments müssen somit zwei Wellenlängenbereiche detektiert werden, was dieses Testsystem apparativ aufwändig macht.U.S. Patent 5,114,350 discloses a method and apparatus for determining the concentration of an analyte in a body fluid sample. The degree of wetting of the reaction carrier is measured by measuring the amount of reflected light which decreases with increasing wetting. DE 10248555 A1 discloses a method for detecting and compensating the underdosing of test strips. This document describes a test element which comprises an analyte-specific reagent which interacts with an analyte in a sample and a control substance which interacts with a sample matrix of the sample. The analyte-specific reagent interacts with the analyte as a function of the analyte concentration in a detection wavelength range. The control sequence interacts with irradiation of the test field with the sample matrix as a function of the amount of sample applied to the test field. The control substance can also react with the water contained in the sample matrix. An example, which is mentioned in DE 10248555, uses chlorophenol red as an analyte-independent color former for determining the amount of sample and 2,18-phosphomolybdic acid as analyte-specific reagent for the determination of the glucose concentration in a sample, eg. B. a blood sample. In the cited example of this document, two wavelength ranges must therefore be detected, which makes this test system expensive in terms of apparatus.
Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe bestand darin, ein System und Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe bereitzustellen, welches mit einer Referenzsubstanz und einer analyt- spezifischen Substanz durchgeführt werden kann, ohne dabei den im Stand der Technik beschriebenen hohen apparativen Aufwand in Kauf nehmen zu müssen.The object underlying the invention was to provide a system and method for detecting an analyte in a liquid sample, which can be carried out with a reference substance and an analyte-specific substance, without compromising the high equipment complexity described in the prior art to have to take.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein System für den Lumineszenz-Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend einen Träger, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und ein Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe im wesentlichen gequencht wird.The object according to the invention is achieved by a system for the luminescence detection of an analyte in a liquid sample, comprising a carrier comprising an analyte-specific substance which is capable of emitting a first luminescence signal upon contact with the analyte, and a reference substance which is capable of emitting a second luminescent signal due to contact with the liquid Sample is substantially quenched.
Überraschendeweise lassen sich aus dem Stand der Technik bekannte Nachweisverfahren dadurch erfindungsgemäß vereinfachen, dass eine Referenzsubstanz verwendet wird, welche in Abwesenheit der Probe ein Lumineszenzsignal abgibt, welches als Referenzsignal verwendet werden kann. Bei Zugabe der Probe wird dieses Lumineszenzsignal schlagartig im wesentlichen gequencht, d.h. es liefert im wesentlichen kein Signal mehr, oder zumindest ein sehr stark verringertes Signal.Surprisingly, detection methods known from the prior art can be simplified according to the invention by using a reference substance which, in the absence of the sample, emits a luminescence signal which can be used as a reference signal. Upon addition of the sample, this luminescent signal is abruptly substantially quenched, i. it essentially provides no signal, or at least a very much reduced signal.
Besonders vorteilhaft für die vorliegende Erfindung ist es, wenn Anregung und Emission bei etwa den gleichen Wellenlängen liegen wie für die analytspezifische Substanz. Dies bedeutet, dass dann für die Detektion der Lumineszenzsignale ein einziger Detektor verwendet werden kann.It is particularly advantageous for the present invention if excitation and emission are at approximately the same wavelengths as for the analyte-specific substance. This means that a single detector can then be used for the detection of the luminescence signals.
Durch die Eigenschaft der Referenzsubstanz, in Abwesenheit der Probe ein Lumineszenzsignal abzugeben, was dann bei Inkontaktbringen mit der Probe gequencht wird, kann die Referenzsubstanz nicht nur zum Nachweis des Analyten verwendet werden, sondern auch zum Bestimmen der Probenmenge, zum Bestimmen der Menge des Analyten und/oder der Funktionsbereitschaft des Trägers. Die Referenzsubstanz kann beispielsweise so gewählt werden, dass ihr Lumineszenzsignal bei Benetzung gequencht wird. Dann kann die Funktionsbereitschaft des Testsystems sichtbar gemacht werden. Falls also der Träger, der das Testsystem umfasst, in etwa bei der Lagerung feucht geworden ist oder dgl., oder andere Substanzen mit ihm in Kontakt gekommen sind, wird dieses Lumineszenzsignal der Referenzsubstanz gequencht sein, und es ist erkennbar, dass dieses Testsystem nicht funktionsbereit ist.Due to the property of the reference substance to emit a luminescence signal in the absence of the sample, which is then quenched when it is brought into contact with the sample, the reference substance can be used not only to detect the analyte, but also to determine the amount of sample, to determine the amount of the analyte and / or the operational readiness of the carrier. By way of example, the reference substance can be chosen so that its luminescence signal is quenched on wetting. Then the functional readiness of the test system can be made visible. Thus, if the carrier comprising the assay system has become wet or stored in storage or other substances have come into contact with it, this luminescent signal of the reference substance will be quenched, and it can be seen that this assay system is not functional is.
Vorzugsweise ist das Quenchen reversibel, d.h. wird die Probe oder insbesondere die Benetzung entfernt bzw. rückgängig gemacht, so kann auch das Lumineszenzsignal wieder hergestellt werden. Damit kann neben der Referenzierung eine Benetzungserkennung und/oder eine Füllkontrolle mit dem erfindungsgemäßen System erreicht werden. Wird z.B. auf dem Träger ein Testfeld vorgesehen und dieses nicht vollständig von der Probe benetzt, bleibt ein Restlumineszenzsignal bestehen. Es ist dann möglich, rechnerisch eine Korrektur im Bezug auf das Analytsignal über diese Restlumineszenz zu machen.The quenching is preferably reversible, ie if the sample or, in particular, the wetting is removed or reversed, then the luminescence signal can also be restored. Thus, in addition to the referencing a wetting detection and / or a filling control can be achieved with the system according to the invention. If, for example, a test field is provided on the support and it is not completely wetted by the sample, a residual luminescence signal remains. It is then possible to make a computational correction with respect to the analyte signal via this residual luminescence.
Wenn die Lumineszenzeigenschaften im Bezug auf die Umgebungsfeuchte reversibel sind, kann eine solche Referenzsubstanz auch als Feuchteindikator verwendet werden. Der Feuchteindikator gibt dann über die Lagerbedingungen des Testsystems und seine Funktionsbereitschaft Auskunft. Mann kann somit die Referenzsubstanz auch als Indikator für ein zu wählendes Verfallsdatum des Testsystems verwenden.If the luminescence properties are reversible with respect to the ambient humidity, such a reference substance can also be used as a moisture indicator. The moisture indicator then provides information about the storage conditions of the test system and its operational readiness. Thus, man can also use the reference substance as an indicator for an expiration date of the test system to be selected.
Lumineszenzsubstanzen, insbesondere Fluorophore, die solche Eigenschaften aufweisen, sind im Stand der Technik kaum bekannt. Die meisten Fluorophore erfahren in feuchter Umgebung eine Fluoreszenzerhöhung und kein Quenchen.Luminescent substances, in particular fluorophores, which have such properties are scarcely known in the prior art. Most fluorophores experience a fluorescence increase and no quenching in a humid environment.
Wenn die Lumineszenzeigenschaften der Analyt-spezifischen Substanz vom pH-Wert abhängen, kann die Analyt-spezifische Substanz zur Bestimmung des pH-Wertes verwendet werden. In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße System daher ein pH-Sensor, d.h. ein System, wobei die Analyt-spezifische Substanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal vom pH-Wert abhängig ist. In dieser Ausführungsform ist die Referenzsubstanz vorzugsweise keine Substanz, deren Lumineszenzsignal bei einer pH-Änderung in wesentlichen gequencht wird. Bevorzugt als Analyt-spezifische Substanz ist LysoSensor Blue DND-167 oder ein Derivat davon, z. B. zur Bestimmung des pH-Wertes im Bereich von etwa 3,5 bis etwa 7,0 oder etwa 4,5 bis etwa 6,0.If the luminescent properties of the analyte-specific substance depend on the pH, the analyte-specific substance can be used to determine the pH. In one embodiment, therefore, the system of the invention is a pH sensor, i. a system wherein the analyte-specific substance is selected from substances whose luminescent signal depends on the pH. In this embodiment, the reference substance is preferably not a substance whose luminescent signal is substantially quenched upon a pH change. Preferred analyte-specific substance is LysoSensor Blue DND-167 or a derivative thereof, e.g. For determining the pH in the range of about 3.5 to about 7.0, or about 4.5 to about 6.0.
Vor Aufbringen der Probe weist der Träger des erfindungsgemäßen pH- Sensors vorzugsweise einen pH-Wert auf, bei dem die Analyt-spezifische Substanz im wesentlichen keine Lumineszenz zeigt. Im Falle von LysoSensor Blue DND-167 kann dies ein pH ausgewählt aus dem Bereich von etwa 7 bis etwa 10 oder von etwa 8 bis etwa 9 sein.Before applying the sample, the carrier of the pH sensor according to the invention preferably has a pH at which the analyte-specific Substance shows essentially no luminescence. In the case of LysoSensor Blue DND-167, this may be a pH selected from the range of about 7 to about 10, or from about 8 to about 9.
Ferner kann die Pufferkraft des Trägers so vorbestimmt werden, dass der Träger im wesentlichen vollständig auf den pH-Wert der Probe umgepuffert wird. Dem Fachmann ist bekannt, wie eine derartige Pufferkraft des Trägers eingestellt werden muss.Further, the buffering power of the carrier can be predetermined so that the carrier is substantially completely rebuffered to the pH of the sample. The person skilled in the art knows how to set such a buffering force of the carrier.
Als Referenzsubstanz kommen prinzipiell alle Substanzen infrage, welche in der Lage sind, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der Probe im wesentlichen gequencht wird. Hierbei können alle Arten von Substanzen verwendet werden, die durch Kontakt mit irgendeinem Bestandteil der Probe in ihrem Lumineszenzsignal gequencht werden. Bestandteile in zu untersuchenden Proben, welche das Quenchen auslösen können, sind z.B. Wasser, Calcium, Magnesium oder andere Metalle oder deren Ionen, der pH-Wert sowie weitere Faktoren.In principle, all substances which are capable of emitting a luminescence signal, which is essentially quenched by contact with the sample, are considered as the reference substance. Any type of substance that is quenched by contact with any component of the sample in its luminescence signal may be used. Ingredients in samples to be tested which can trigger quenching are e.g. Water, calcium, magnesium or other metals or their ions, the pH and other factors.
Wenn Wasser der für das Quenchen auslösende Faktor ist, ist die Referenzsubstanz vorzugsweise ausgewählt aus der Klasse der Chalcone der Formel I.When water is the quenching factor, the reference substance is preferably selected from the class of chalcones of formula I.
Chalcone sind im Stand der Technik bekannt (B. M. Krasovitskii, D. G. Pereyaslova, ZH. Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965); G.E. Dobretsov, V.A. Petrov, Yu.A. Vladimirov, Studia Biophysica Berlin, 71 (3), 181-187 (1978)).Chalcone are known in the art (BM Krasovitskii, DG Pereyaslova, ZH Vsesoyuznogo Obscchestva in. DI Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965); GE Dobretsov, VA Petrov, Yu.A. Vladimirov, Studia Biophysica Berlin, 71 (3), 181-187 (1978)).
Bevorzugt sind Substanzen der allgemeinen Formel I, (I)Preference is given to substances of the general formula I, (I)
wobei einer der Reste R2, R3 und R5 vorzugsweise ausgewählt ist aus NR11R12 und SO3Na. Die übrigen Substituenten R-i, R4, R6, R7, Re, R9 und R10 können beliebige Substituenten sein, vorzugsweise Wasserstoff oder Halogen, insbesondere F, Cl, Br und I.wherein one of R 2 , R 3 and R 5 is preferably selected from NR 11 R 12 and SO 3 Na. The remaining substituents R 1, R 4 , R 6 , R 7 , Re, R 9 and R 10 can be any desired substituents, preferably hydrogen or halogen, in particular F, Cl, Br and I.
R11 und R12 sind vorzugsweise ausgewählt aus Wasserstoff, C1-C4-AIkYl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl, wobei d-C4-Alkyl mit -OH, -SH, Phosphat, -COOH, -NH2, -SO3Na, -NO2, Halogen, insbesondere F, Cl, Br und I, substituiert sein kann. Ein bevorzugter substituierter Alkylrest ist CH2CH2-SO3Na.R 1 and R 12 are preferably selected from hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl and butyl, where dC 4 -alkyl with -OH, -SH, phosphate, -COOH, -NH 2 , -SO 3 Na, -NO 2 , halogen, in particular F, Cl, Br and I, may be substituted. A preferred substituted alkyl radical is CH 2 CH 2 -SO 3 Na.
Besonders bevorzugte Substanzen, die als erfindungsgemäße Referenzsubstanz geeignet sind, sind Aminochalcone und Chlorchalcone, insbesondere gemäß den allgemeinen Formeln II, III und IV.Particularly preferred substances which are suitable as reference substance according to the invention are amino chlorones and chloro-chlorones, in particular according to the general formulas II, III and IV.
(H)(H)
(IV)(IV)
Chlorchalcon wurde gemäß einem Verfahren von Krasovitskii hergestellt (B. M. Krasovitskii, D. G. Pereyaslova, ZH. Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965)).Chloroqualcone was prepared according to a method of Krasovitskii (B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH Vsesoyuznogo Obscchestva, D.I. Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965)).
Aminochalcon, bei dem Rn und Ri2 Methyl sind, ist gewerblich erhältlich und wurde für orientierende Untersuchungen eingesetzt.Aminochalcone, in which Rn and Ri 2 are methyl, is commercially available and has been used for orientation studies.
Das Aminochalcon der allgemeinen Formel V, bei der R11 und R12 beide CH2CH2-SO3Na sind, wurde über eine mehrstufige Synthese hergestellt.The aminochalcone of general formula V, wherein R 11 and R 12 are both CH 2 CH 2 -SO 3 Na, was prepared via a multi-step synthesis.
Eine weitere bevorzugte Substanz ist somit die der Formel V. Another preferred substance is thus that of the formula V.
Die Quenchreaktion kann auch durch Metallionen hervorgerufen werden. Es sind somit auch solche Verbindungen als Referenzsubstanzen erfindungsgemäß geeignet, deren Lumineszenzsignal bei Kontakt mit Metallionen im wesentlichen gequencht wird.The quenching reaction can also be caused by metal ions. Thus, such compounds are also suitable as reference substances according to the invention, the luminescence signal of which is essentially quenched on contact with metal ions.
Insbesondere ist es möglich, Referenzsubstanzen auszuwählen, bei denen das Lumineszenzsignal durch den Kontakt mit Calcium- bzw. Magnesiumionen gequencht wird. Hierfür kommen z.B. Fluoreszenzfarbstoffe infrage, die bei einer Komplexbildung mit Ca2+ und/oder Mg2+ aufhören zu fluoreszieren bzw. sehr reduziert fluoreszieren.In particular, it is possible to select reference substances in which the luminescence signal is quenched by contact with calcium or magnesium ions. For this purpose, for example, fluorescent dyes in question, which stop in a complex formation with Ca 2+ and / or Mg 2+ to fluoresce or fluoresce very reduced.
Ein Beispiel für einen solchen Fluoreszenzfarbstoff ist FuraRED, welcher von der Firma Molprobes erhältlich ist. FuraRED hat die folgende Struktur:An example of such a fluorescent dye is FuraRED available from Molprobes. FuraRED has the following structure:
Eine dritte erfindungsgemäß geeignete Referenzsubstanz ist eine, welche auf eine pH-Änderung anspricht. Es handelt sich hierbei um Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei einer pH-Wert-Änderung im wesentlichen gequencht wird. A third reference substance suitable according to the invention is one which responds to a pH change. These are substances whose luminescence signal is essentially quenched by a pH change.
Dies ist besonders vorteilhaft für Proben, wie z.B. Blut. Blut hat eine sehr hohe Pufferkraft und ist daher in der Lage, einen vorher im Testsystem eingestellten pH-Wert zu überspielen. Ist das Testsystem beispielsweise auf einen niedrigeren pH-Wert eingestellt (beispielsweise pH 5), wird bei Auftrag einer Blutprobe das Testsystem umgepuffert auf pH 7.This is particularly advantageous for samples such as e.g. Blood. Blood has a very high buffering power and is therefore able to transfer a previously set pH in the test system. For example, if the test system is set at a lower pH (for example, pH 5), then the test system is rebuffered to pH 7 when a blood sample is applied.
Ein Beispiel für eine solche Referenzsubstanz ist LysoSensor Blue DND-167 von Molprobes (Katalog Nr. L7533, ABS/EM1 (nm): 373/425, PKA: 5,1 , geeigneter pH-Bereich: 4,5-6,0).An example of such a reference substance is LysoSensor Blue DND-167 from Molprobes (catalog no. L7533, ABS / EM 1 (nm): 373/425, PKA: 5.1, suitable pH range: 4.5-6.0 ).
LysoSensor Blue DND-167LysoSensor Blue DND-167
VIVI
Ferner können für das erfindungsgemäße System oder das erfindungsgemäße Verfahren Derivate von LysoSensor Blue DND-167 verwendet werden, die eine bessere Wasserlöslichkeit als LysoSensor Blue DND-167 aufweisen. Durch die erhöhte Wasserlöslichkeit kann die i oFurthermore, derivatives of LysoSensor Blue DND-167 which have a better water solubility than LysoSensor Blue DND-167 can be used for the system or the method according to the invention. Due to the increased water solubility, the io
Reaktionsgeschwindigkeit mit der den Analyten enthaltenden Probe erhöht werden.Reaction rate can be increased with the sample containing the analyte.
In den erfindungsgemäßen Derivaten von LysoSensor Blue DND-167 sind ein oder mehrere Wasserstoffatome unabhängig voneinander durch Substituenten ersetzt, wobei ein Kohlenstoffatom mehr als einen Substituenten tragen kann. Besonders geeignete Substituenten sind polare Substituenten, die wenigstens eine positive oder/und negative Ladung tragen können.In the derivatives of LysoSensor Blue DND-167 according to the invention, one or more hydrogen atoms are independently substituted by substituents, wherein one carbon atom may carry more than one substituent. Particularly suitable substituents are polar substituents which can carry at least one positive and / or negative charge.
Alle mit Wasserstoff besetzten Positionen des Anthracengerüstes, der beiden Morpholinylgruppen und der beiden Methylengruppen aus LysoSensor Blue DND-167 sind für eine erfindungsgemäße Substitution geeignet.All positions of the anthracene skeleton occupied by hydrogen, the two morpholinyl groups and the two methylene groups from LysoSensor Blue DND-167 are suitable for a substitution according to the invention.
Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Derivate von LysoSensor Blue DND-167 genau einen, zwei, drei oder vier Substituenten tragen.It is preferred that the LysoSensor Blue DND-167 derivatives of the invention carry exactly one, two, three or four substituents.
Bevorzugte Substituenten schließen -OH, -SH, Phosphat, -COORn, -NR11R12, -SO3Na, -NO2, Halogen, insbesondere F, Cl, Br und I, ein. Rn undPreferred substituents include -OH, -SH, phosphate, -COORn, -NR11R12, -SO 3 Na, -NO 2, halogen, in particular F, Cl, Br and I, a. Rn and
R12 sind vorzugsweise ausgewählt aus Wasserstoff, Ci-C4-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl, wobei CrC4-Alkyl mit -OH,R 12 are preferably selected from hydrogen, C 1 -C 4 -alkyl, in particular methyl, ethyl, propyl and butyl, where C 1 -C 4 -alkyl is -OH,
-SH, Phosphat, -COOH, -NH2, -SO3Na, -NO2, Halogen, insbesondere F, Cl,-SH, phosphate, -COOH, -NH 2 , -SO 3 Na, -NO 2 , halogen, in particular F, Cl,
Br und I, substituiert sein kann. Ein bevorzugter substituierter Alkylrest ist -CH2CH2-SO3Na.Br and I, may be substituted. A preferred substituted alkyl radical is -CH 2 CH 2 -SO 3 Na.
Beispielsweise ist ein Derivat von LysoSensor Blue DND-167 eine Verbindung der Formel VII: (VII)For example, a derivative of LysoSensor Blue DND-167 is a compound of Formula VII: (VII)
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße System ein System zur Bestimmung von Glukose, insbesondere der Blutglukose. Als Analyt-spezifische Substanz kann z. B. NAD oder NADP verwendet werden, welches in Anwesenheit eines geeigneten Enzymes, z. B. einer Glukosedehydrogenase, NADH oder NADPH bildet, welches eine Lumineszenz zeigt. Als Referenzsubstanz wird im erfindungsgemäßen System zur Bestimmung von Glukose z. B. eine Substanz verwendet, deren Lumineszenzsignal bei einer pH-Änderung im wesentlichen gequencht wird, z. B. LysoSensor Blue DND-167 oder ein Derivat davon.In a preferred embodiment, the system according to the invention is a system for the determination of glucose, in particular of the blood glucose. As analyte-specific substance can, for. B. NAD or NADP be used, which in the presence of a suitable enzyme, for. As a glucose dehydrogenase, NADH or NADPH forms, which shows a luminescence. As a reference substance in the system according to the invention for the determination of glucose z. As a substance used, the luminescence signal is substantially quenched at a pH change, z. LysoSensor Blue DND-167 or a derivative thereof.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe durch Lumineszenz, umfassendAnother object of the present invention is also a method for detecting an analyte in a liquid sample by luminescence, comprising
(i) Bereitstellen eines Trägers, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und umfassend eine Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe im wesentlichen gequencht wird, (ii) Inkontaktbringen des Trägers mit einer flüssigen Probe, die einen nachzuweisenden Analyten umfasst, und (iii) Messen der Lumineszenzsignale und Nachweisen des Analyten durch Vergleichen der Lumineszenzsignale.(i) providing a carrier comprising an analyte-specific substance capable of emitting a first luminescent signal upon contact with the analyte, and comprising a reference substance capable of delivering a second luminescent signal which is contacted by essentially quenching the liquid sample, (ii) contacting the carrier with a liquid sample comprising an analyte to be detected, and (iii) measuring the luminescent signals and detecting the analyte Compare the luminescence signals.
Bei diesem Verfahren ist es ebenfalls, wie oben bereits erwähnt, bevorzugt, eine Referenzsubstanz und eine Analyt-spezifische Substanz zu verwenden, die im Wesentlichen im gleichen Wellenlängenbereich angeregt werden und emittieren. Vorzugsweise wird zunächst das Lumineszenzsignal der Referenzsubstanz in Abwesenheit der Probe gemessen, anschließend wird die flüssige Probe aufgebracht, und es wird das Lumineszenzsignal gemessen, welches von der Probe hervorgerufen wird. Dies kann vorzugsweise durch Verwendung eines einzigen Detektors geschehen. Es können jedoch auch verschiedene Detektoren angewandt werden, insbesondere dann, wenn die Wellenlängebereiche der Referenzsubstanz und der Analyt-spezifischen Substanz sich unterscheiden.In this method, as mentioned above, it is also preferable to use a reference substance and an analyte-specific substance that are excited and emitted in substantially the same wavelength range. Preferably, first the luminescence signal of the reference substance is measured in the absence of the sample, then the liquid sample is applied and the luminescence signal which is produced by the sample is measured. This can preferably be done by using a single detector. However, different detectors may also be used, especially if the wavelength ranges of the reference substance and the analyte-specific substance differ.
Beschreibung der FigurenDescription of the figures
Figur 1 zeigt den Messbereich für die Messung für das Lumineszenzsignal eines Analyten mit oder ohne Referenzsubstanz gemäß Verfahren des Standes der Technik.FIG. 1 shows the measurement range for the measurement for the luminescence signal of an analyte with or without a reference substance according to the prior art method.
Figur 2 zeigt die Kinetik des Quenchens von Dimethylaminochalcon bei Benetzung.Figure 2 shows the kinetics of quenching of dimethylaminochalcone upon wetting.
Figur 3 zeigt ein Testsystem unter Verwendung eines Chalcons mit 0,05 % Feststoffgehalt. Als Proben wurden 4 Lösungen, jeweils enthaltend 0 mg/dl,FIG. 3 shows a test system using a 0.05% solids chalcone. The samples were 4 solutions, each containing 0 mg / dl,
100 mg/dl, 300 mg/dl und 700 mg/dl Glucose verwendet. Es wurde die100 mg / dl, 300 mg / dl and 700 mg / dl glucose. It became the
Intensität des Lumineszenz gemessen und mit dem gequenchten Signal, das von der Kontrollprobe mit 0 mg/dl Glucose stammte, vergleichen. DieThe intensity of the luminescence was measured and compared with the quenched signal derived from the control sample with 0 mg / dl glucose. The
Differenz-Counts sind maximal, wenn ausreichend Probe aufgetragen wurde. Sie werden immer kleiner, je weniger Probe aufgetragen wird.Difference counts are maximum when sufficient sample has been applied. They get smaller and smaller the less sample is applied.
Figur 4 zeigt die Anzahl der Counts pro Volumen im selben Testformat wie in Figur 3 beschrieben. Ab ca. 1 μl wird ein Plateau erreicht, unterhalb dessen keine zuverlässige Messung möglich ist.FIG. 4 shows the number of counts per volume in the same test format as described in FIG. From about 1 μl, a plateau is reached, below whose reliable measurement is impossible.
Figur 5 zeigt das Absorptions- und Emissionsspektrum von FuraRED.Figure 5 shows the absorption and emission spectrum of FuraRED.
Figur 6 und Figur 7 zeigen die Fluoreszenzemission von LysoSensor Blue DND-167 in Abhängigkeit des pH-Werts.FIG. 6 and FIG. 7 show the fluorescence emission of LysoSensor Blue DND-167 as a function of the pH.
Figur 8 zeigt ein Testsystem unter Verwendung von Lysosensor Blue DND167, NAD und einem Puffer pH=5. Als Proben wurden drei Lösungen mit 0 mg/dl, 1 mg/dl und 2 mg/dl Glukose und einem Puffer pH=7 verwendet. Es wurde die Intensität der Lumineszenz für 24 Sekunden nach Aufbringen der Probe gemessen. Die Probenlösung pH=7 bewirkte eine Umpufferung der Schicht, welche Lysosensor Blue DND167 enthielt. Es wurde eine zeitabhängige Abnahme der Lumineszenz beobachtet. Nach 24 Sekunden war praktisch keine Änderung der Lumineszenz mehr zu messen.FIG. 8 shows a test system using Lysosensor Blue DND167, NAD and a pH = 5 buffer. As samples three solutions with 0 mg / dl, 1 mg / dl and 2 mg / dl glucose and a buffer pH = 7 were used. The intensity of the luminescence was measured for 24 seconds after application of the sample. The sample solution pH = 7 caused a rebuffering of the layer containing Lysosensor Blue DND167. A time-dependent decrease in luminescence was observed. After 24 seconds, virtually no change in luminescence was measurable.
Figur 9 zeigt ein Testsystem unter Verwendung von Lysosensor Blue DND167, NAD und einem Puffer pH=5. Als Proben wurden vier Lösungen mit 0 mg/dl, 90 mg/dl, 300 mg/dl Glukose und 700 mg/dl und einem Puffer pH=7 verwendet. Es wurde die Intensität der Lumineszenz für 24 Sekunden nach Aufbringen der Probe gemessen. Die Probenlösung pH=7 bewirkte eine Umpufferung der Schicht, welche Lysosensor Blue DND167 enthielt. Die Ergebnisse mit der Probe, welche 0 mg/dl Glukose enthielt, entsprechen dem Ergebnis aus Figur 8. Mit ansteigender Glukosekonzentration wird die Abnahme der zeitabhängigen Lumineszenz geringer (90 mg/dl) bzw. die Lumineszenz steigt über den Ausgangswert an (300 mg/dl und 700 mg/dl Glukose). Deutlich können die unterschiedlichen Zeitverläufe der Lysosensor Blue DND167- und NADH-abhängigen Lumineszenz voneinander unterschieden werden. BeispieleFIG. 9 shows a test system using Lysosensor Blue DND167, NAD and a buffer pH = 5. As samples four solutions were used with 0 mg / dl, 90 mg / dl, 300 mg / dl glucose and 700 mg / dl and a buffer pH = 7. The intensity of the luminescence was measured for 24 seconds after application of the sample. The sample solution pH = 7 caused a rebuffering of the layer containing Lysosensor Blue DND167. The results with the sample containing 0 mg / dl glucose correspond to the result from FIG. 8. As the glucose concentration increases, the decrease in the time-dependent luminescence decreases (90 mg / dl) or the luminescence rises above the initial value (300 mg / dl). dl and 700 mg / dl glucose). Clearly, the different time courses of the Lysosensor Blue DND167 and NADH-dependent luminescence can be distinguished from each other. Examples
Beispiel 1example 1
In einer einfachen Rezeptor wurde die Funktion des Dimethylaminochalcons überprüft. Da dieses Chalcon nicht wasserlöslich ist, wurde Methanol als Wasserersatz verwendet.In a simple receptor, the function of the Dimethylaminochalcons was checked. Since this chalcone is not water soluble, methanol was used as a water substitute.
Dabei war schon visuell erkennbar, dass das unter UV-Licht in trockenem Zustand stark fluoreszierende Chalcon schlagartig keine Fluoreszenz mehr zeigt, wenn ein Tropfen MeOH aufgbracht wird.It was already visually recognizable that the highly fluorescent chalcone under UV light in the dry state suddenly no longer shows any fluorescence when a drop of MeOH is applied.
Testrezeptur I:Test recipe I:
Das Chalcon wurde in MeOH gelöst und mit dem Transpafill versetzt. Zu dieser Mischung wurde Propiofan gegeben und die Aufschlemmung homogonisiert. Anschließend wurde die Mischung auf eine Pokalonfolie aufgerakelt und bei 500C für 5 Minuten getrocknet.The chalcone was dissolved in MeOH and spiked with the transpafill. Propofan was added to this mixture and the slurry homogonized. Subsequently, the mixture was knife-dried on a Pokalon foil and dried at 50 0 C for 5 minutes.
Die in Figur 2 dargestellte Messung zeigt die Kinetik des Quenchens, wenn ein Tropfen Methanol auf die grünlich leuchtende Schicht, die auf die Pokalonfolie aufgerakelt wurde, aufgebracht wird. Hier sieht man ganz deutlich, dass ein schlagartiges Quenchen bei Aufbringen von Methanol erreicht wird, was jedoch reversibel ist, sobald das Methanol wieder von der Chalconschicht verdunstet d.h. trocknet. Beispiel 2The measurement shown in Figure 2 shows the quenching kinetics when a drop of methanol is applied to the greenish glow layer which has been doctored onto the Pokalon film. Here you can clearly see that a sudden quenching is achieved with the application of methanol, which is reversible, however, as soon as the methanol evaporates again from the chalcone layer, ie dries. Example 2
1. Abhängigkeit der Fluoreszenz vom pH-Wert1. Dependence of fluorescence on the pH
Der Farbstoff Lysosensor Blue DND167 wurde in verschiedenen Puffern mit verschiedenen pH-Werten gelöst, und diese Lösung wurde auf einen Teststreifen, der nur eine blanke Folie als Auftropffläche enthielt, aufgegeben. Diese wurden auf dem Messgerät vermessen.The dye Lysosensor Blue DND167 was dissolved in various buffers of different pH and this solution was applied to a test strip containing only a blank foil as a dropping area. These were measured on the measuring device.
Anregungswellenlänge: 375 nm (UV-LED der Firma Roithner), Detektion ab 420 nm mit Hilfe eines Fluoreszenzfilters, Langpass, KV 418 der Firma Schott, Detektor BPW34.Excitation wavelength: 375 nm (UV LED from Roithner), detection from 420 nm with the aid of a fluorescence filter, Langpass, KV 418 from Schott, detector BPW34.
Die Ergebnisse sind Figur 7 zusammengestellt (Blindwert = Lösung ohne Farbstoff). Mit steigendem pH-Wert sinkt die Fluoreszenz. Bei pH=8 ist der Blindwert nahezu erreicht.The results are shown in FIG. 7 (blank value = solution without dye). As the pH increases, the fluorescence decreases. At pH = 8, the blank value is almost reached.
2. Farbstoff Lysosensor Blue DND167 in einer Schicht bei pH52. Dye Lysosensor Blue DND167 in one layer at pH5
Es wurde eine Schicht hergestellt, die Glukosedehydrogenase, NAD und einen Puffer enthielt. Der pH-Wert der Schicht betrug 5.A layer was made containing glucose dehydrogenase, NAD and a buffer. The pH of the layer was 5.
Figur 8 zeigt die Abnahme der Fluoreszenz bei Auftropfen der Puffer-Lösung pH 7. Dabei wurde der pH-Wert der Schicht von pH 5 auf pH 7 umgepuffert. Bei der Umpufferung nahm die Fluoreszenz ab.FIG. 8 shows the decrease in the fluorescence when the buffer solution pH 7 drops on. The pH of the layer was re-buffered from pH 5 to pH 7. During the buffering, the fluorescence decreased.
In einem weiteren Versuch wurde die Schicht mit gepufferter Glukoselösung betropft. Man konnte eine überlagerte Reaktion erkennen; einerseits nahm die Fluoreszenz durch die Umpufferung des Farbstoffes ab (vergleiche Figur 8), andererseits wurde durch die Glukosereaktion fluoreszierendes NADH gebildet, welches der Glukosekonzentration entspricht. Die Ergebnisse sind in Figur 9 dargestellt. In another experiment, the layer was dripped with buffered glucose solution. One could see a superimposed reaction; On the one hand, the fluorescence decreased as a result of the rebuffering of the dye (compare FIG. 8), on the other hand, fluorescent glucose NADH, which corresponds to the glucose concentration, was formed by the glucose reaction. The results are shown in FIG.

Claims

Ansprüche claims
1. System für den Lumineszenz-Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend einen Träger, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit "dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und eine Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe im wesentlichen gequencht wird.1. System for the luminescent detection of an analyte in a liquid sample, comprising a support comprising an analyte-specific substance that is able to deliver a first luminescence on contact with "the analyte, and a reference substance in the It is capable of emitting a second luminescent signal which is substantially quenched by contact with the liquid sample.
2. System nach Anspruch 1, weiterhin umfassend mindestens einen Detektor zum Messen der Lumineszenzsignale der Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz.The system of claim 1, further comprising at least one detector for measuring the luminescence signals of the analyte-specific substance and the reference substance.
3. System nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend eine Auswertungseinheit zum Bestimmen der Probenmenge, der Menge des Analyten und/oder der Funktionsbereitschaft des Trägers.3. System according to claim 1 or 2, further comprising an evaluation unit for determining the amount of sample, the amount of the analyte and / or the operational readiness of the carrier.
4. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyt- spezifische Substanz und die Referenz Fluorophoren sind.4. System according to any one of the preceding claims, wherein the analyte-specific substance and the reference are fluorophores.
5. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Referenzsubstanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei Kontakt mit Wasser im wesentlichen gequencht wird.5. System according to any one of the preceding claims, wherein the reference substance is selected from substances whose luminescence signal is substantially quenched when in contact with water.
6. System nach Anspruch 5, wobei die Referenzsubstanz eine Verbindung der Formel I ist. 6. System according to claim 5, wherein the reference substance is a compound of formula I.
7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Referenzsubstanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei Kontakt mit Metallionen im wesentlichen gequencht wird.7. System according to any one of claims 1 to 4, wherein the reference substance is selected from substances whose luminescence signal is substantially quenched upon contact with metal ions.
8. System nach Anspruch 7, wobei die Referenzsubstanz FuraRed ist.The system of claim 7, wherein the reference substance is FuraRed.
9. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Referenzsubstanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei einer pH- Wert-Änderung im wesentlichen gequencht wird.9. System according to any one of claims 1 to 4, wherein the reference substance is selected from substances whose luminescence signal is substantially quenched at a pH change.
10. System nach Anspruch 9, wobei die Referenzsubstanz LysoSensor Blue DND-167 oder ein Derivat davon ist.The system of claim 9, wherein the reference substance is LysoSensor Blue DND-167 or a derivative thereof.
11. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Analyt-spezifische Substanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal vom pH-Wert abhängig ist.11. The system according to any one of claims 1 to 4, wherein the analyte-specific substance is selected from substances whose luminescence signal is dependent on the pH.
12. System nach Anspruch 12, wobei die Analyt-spezifische Substanz LysoSensor Blue DND-167 oder ein Derivat davon ist.The system of claim 12, wherein the analyte-specific substance is LysoSensor Blue DND-167 or a derivative thereof.
13. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyt- spezifische Substanz und die Referenzsubstanz in einem im wesentlichen gleichen Wellenlängenbereich angeregt werden und emittieren.13. System according to any one of the preceding claims, wherein the analyte-specific substance and the reference substance are excited and emit in a substantially same wavelength range.
14. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein einziger Detektor zum Messen der Lumineszenzsignale der Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird. 14. System according to any one of the preceding claims, wherein a single detector for measuring the luminescence signals of the analyte-specific substance and the reference substance is used.
15. Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit im wesentlichen gequencht wird, als Referenzsubstanz in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten.Use of a substance capable of emitting a luminescent signal which is substantially quenched upon contact with a liquid as a reference substance in a method of detecting an analyte.
16. Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit im wesentlichen gequencht wird, als Referenzsubstanz zur Bestimmung der Probenmenge.16. Use of a substance capable of emitting a luminescence signal which is substantially quenched upon contact with a liquid as a reference substance for determining the amount of sample.
17. Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit im wesentlichen gequencht wird, als Referenzsubstanz zur Feststellung der Funktionsbereitschaft eines Systems zum Nachweis eines Analyten.17. Use of a substance capable of emitting a luminescent signal, which is substantially quenched upon contact with a liquid, as a reference substance for determining the operational readiness of a system for detecting an analyte.
18. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe durch Lumineszenz, umfassend18. A method for detecting an analyte in a liquid sample by luminescence, comprising
(i) Bereitstellen eines Trägers, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und umfassend eine(i) providing a carrier comprising an analyte-specific substance capable of emitting a first luminescent signal upon contact with the analyte, and comprising
Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe im wesentlichen gequencht wird, (ii) Inkontaktbringen des Trägers mit einer flüssigen Probe, die einen nachzuweisenden Analyten umfasst, undA reference substance capable of delivering a second luminescent signal which is substantially quenched by contact with the liquid sample, (ii) contacting the carrier with a liquid sample comprising an analyte to be detected, and
(iii) Messen der Lumineszenzsignale und Nachweisen des Analyten durch Vergleichen der Lumineszenzsignale.(iii) measuring the luminescent signals and detecting the analyte by comparing the luminescent signals.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Lumineszenzsignal der Referenzsubstanz vor dem in Kontaktbringen des Trägers mit der flüssigen Probe gemessen wird. 19. The method of claim 18, wherein the luminescent signal of the reference substance is measured prior to contacting the carrier with the liquid sample.
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