EP1601973A2 - Utilisation des genes leprotl1 et ob-rgrp pour le criblage de composes actifs sur la prise ou la perte de poids ou le diabete d un sujet humain ou animal - Google Patents

Utilisation des genes leprotl1 et ob-rgrp pour le criblage de composes actifs sur la prise ou la perte de poids ou le diabete d un sujet humain ou animal

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EP1601973A2
EP1601973A2 EP04718992A EP04718992A EP1601973A2 EP 1601973 A2 EP1601973 A2 EP 1601973A2 EP 04718992 A EP04718992 A EP 04718992A EP 04718992 A EP04718992 A EP 04718992A EP 1601973 A2 EP1601973 A2 EP 1601973A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
rgrp
genes
leprotl1
compound
fragments
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04718992A
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German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Bailleul
Yves Rouille
Karin Seron
Sandrine Belouzard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnosis, prevention and treatment of obesity for weight loss, associated or not with hormonal disorders and also with diabetes in humans or animals.
  • the invention aims more particularly to offer a new method of screening for compounds useful for treating or preventing obesity or weight loss, or diabetes in a human or animal subject, based on the use of the genes LEPROTLl and OB- RGRP and the trafficking of proteins encoded by these genes, respectively endospanine and OB-RGRP.
  • OB-RGRP leptin receptor gene related protein
  • the subject of the present invention is therefore a method of identifying compounds active on weight gain or loss or diabetes in a human or animal subject, consisting in measuring the effect of these compounds on (a) the expression of at least one of the LEPROTL1 and OB-RGRP genes or part thereof and / or (b) intracellular transport to the cell membrane and / or (c) the presence at the cell membrane of proteins and / or (d) the internalization from the membrane of proteins encoded by at least one of said genes or part of them.
  • the method of the invention comprises (i) bringing a test compound into contact with cells expressing at least one of the LEPROTL1 and OB-RGRP genes or fragments thereof, then (ii) measuring the quantity of proteins encoded by at least one of said genes or part of these present at the membrane of said cells and / or their internalization.
  • endospanine and / or OB-RGRP or part of these are marked so as to be able to be detected and thus carry out the measurement of the method of the invention.
  • Any type of labeling can be envisaged in the context of the method of the invention, but labeling of the peptide tag type is preferred.
  • the method of the invention can be implemented in vitro on a model of cells in culture or in vivo in an animal model.
  • the method of the invention can also include measuring the expression and / or transport advantageously to the surface of the membrane of the OB-R cells, or even in the case of an animal model, measuring circulating leptin.
  • the cellular or animal models used in the context of the method of the invention may be of the type either expressing LEPROTL1 and / or OB-RGRP or fragments thereof endogenously or genetically modified to express said LEPROTL1 and / or OB-RGRP or fragments thereof in the form of recombinant proteins.
  • a human model such as Hela, 293 or HepG2 or murine such as 3T3 may be mentioned, primary cultures could also be used. Any type of cell can be used because most lines and tissues express endospanine and OB-RGRP.
  • Examples of animal models naturally expressing LEPROTL1 and / or OB-RGRP include the mouse, the rat and the rabbit. However, an implementation of the invention is preferred on cells transformed to express all or part of one or less of the genes, LEPROTL1 and / or OB-RGRP. They are advantageously cells in culture, but the invention can also be implemented on animals obtained by transgenesis according to techniques described in the literature from LEPROTL1 and / or OB-RGRP or fragments thereof.
  • Preferred for the implementation of the invention are cells in culture which have been genetically modified to express at least one of LEPROTL 1 and / or OB-RGRP or fragments thereof.
  • sequences of the cDNA of human LEPROTL1 and of human and mouse endospanin are given in the sequence list in the appendix respectively under the numbers SEQ ID N0.1, SEQ ID NO.2 and SEQ ID NO.3.
  • sequences of the human OB-RGRP cDNA and of the human and murine protein are given in the sequence list in the appendix respectively under the numbers SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO.6.
  • SEQ ID NO.4 The sequences of the human OB-RGRP cDNA and of the human and murine protein are given in the sequence list in the appendix respectively under the numbers SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO.6.
  • These genetically modified cells are prepared by techniques well known to a person skilled in the art using expression vectors.
  • They can also be fragments or sequences modified by the addition, deletion or change of one or more nucleotides, of these genes when the protein encoded by its fragments or modified sequences can be transported to the cell membrane and advantageously be then internalized.
  • a preferred form of the invention is to express a modified form of LEPROTL1, OB-RGRP or fragments thereof so as to produce labeled proteins.
  • the labeling advantageously consists of a peptide tag.
  • modified form of these genes is also understood to mean genes coding for truncated proteins, that is to say having a deletion of one or more amino acids, useful in particular for peptide labeling.
  • endospanin and / or OB-RGRP comprise four transmembrane domains.
  • a fragment and a modified form of LEPROTL1 or OB-RGRP codes for a modified protein comprising at least two of the four transmembrane domains and a peptide marker in the form of fusion proteins.
  • endospanine and / or OB-RGRP marker or fragments thereof may be the same or different.
  • peptide markers generally used, there may be mentioned:
  • HA of sequence YPYDVPDYA (SEQ ID NO. 7) c-myc: sequence EQKLISEEDL (SEQ ID NO. 8) VSV-G t sequence YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO. 9) His 6 ⁇ sequence HHHHHH (SEQ ID NO. 10) FLAG s sequence DYKDDDDK (SEQ ID 10. 11)
  • the insertion of a peptide marker into the complete protein can be carried out at any level of the protein or fragment thereof as long as it does not modify the expression of the protein at the cell membrane and advantageously also its internalization.
  • the reading frame must be integrated into an expression vector of the type, plasmid (pCI / pCIneo, Promega, pcDNA3, Invitrogen) or virus (adeno, retro, vaccinia) for expressions either transient or stable.
  • plasmid pCI / pCIneo, Promega, pcDNA3, Invitrogen
  • virus adeno, retro, vaccinia
  • endospanine and / or OB-RGRP or part of these can be labeled and labeling of the peptide tag type is preferred.
  • the measurement can then be carried out using an antibody directed against the peptide marker, integrated for example in one of the two lumenal / extracellular loops of endospanine, OB-RGRP or fragments thereof or in extension of these loops in the truncated forms of proteins, by bringing the antibody into contact with the cells.
  • the method of the invention can also be implemented on unlabelled endospanin and / or OB-RGRP.
  • Antibodies directed against one of the two lumen / extracellular loops of endospanine or of OB-RGRP make it possible to detect the endogenous protein by contacting the cells.
  • the position of the polypeptides for obtaining these specific antibodies, preferably monoclonals, to identify endogenous endospanine and OB-RGRP at the membrane level are located between the amino acids in positions 25 to 35 and the amino acids in positions 82 to 100 of SEQ ID NO. 2 and SEQ ID NO.5.
  • the measurement can then include the implementation of a secondary antibody according to techniques well known to one skilled in the art.
  • - ELISA secondary coupled to peroxidase, alkaline phosphatase or another enzyme, quantifiable and automatable colored reaction, - Western Blot,
  • Immunofluorescence fluorescent secondary antibody useful for measuring morphology.
  • the effect of the compound to be tested according to the method of the invention can be achieved by comparing measurements on cells with and without contacting said compound. This effect can be measured after or during a determined time of bringing the cells into contact with said compound.
  • the specificity of the compound to be tested with respect to a) the expression of at least one of the LEPROTL1 and OB-RGRP genes and / or (b) intracellular transport to the cell membrane e / or (c ) the presence at the cellular membrane of proteins and / or (d) internalization from the membrane, proteins encoded by at least one of said genes or part of these can be determined by measuring the effect of the treatment on other genes or proteins.
  • the effect of the compound to be tested on the intracellular trafficking of endospanine and / or OB-RGRP is also measured using an antibody directed against any membrane protein surface, a part or a marker thereof.
  • transferin receptor As a preferred example, mention may be made of the transferin receptor.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of weight gain or loss or of diabetes comprising at least one compound capable of modifying the expression of at least one of the LEPROTL1 and OB-RGRP genes or part of these, and / or (b) intracellular transport to the cell membrane, e / or (c) the presence at the level of the cell membrane, e / or (d) internalization from the membrane, proteins encoded by at least one of said genes or part thereof.
  • a compound is advantageously an antagonist or an agonist of at least one of the proteins endospanine and OB-RGRP.
  • the invention also relates to the diagnosis of weight gain or loss or of diabetes in a human or animal subject consisting in measuring and advantageously in comparing with at least one control, the expression of at least one of the LEPROTL1 and OB genes -RGRP or part thereof, and / or (b) intracellular transport to the cell membrane, e / or (c) presence at the level of the cell membrane, and / or (d) internalization from the membrane, proteins encoded by at least one of said genes or part thereof.
  • FIG. 1 represents the cDNA sequence of the LEPROTL1 gene where the reading frame is underlined.
  • FIG. 2 represents the alignment of the sequences of endospanine and of human and murine OB-RGRP. The four transmembrane domains of these proteins are indicated in line 1.
  • FIG. 3 represents HeLa cells, in double labeling in indirect immunofluorescence, expressing 1 endospanine-HA-B1, incubated in the presence of anti-HA mouse antibodies. Green fluorescence reveals internalized anti-HA antibodies (A and C). The red fluorescence reveals the endospanine, -HA-B1 and endogenous, in these cells (B and C).
  • FIG. 4 represents the quantity of leptin receptor on the surface relative to the total quantity of cellular leptin receptor and normalized to 100% for control, of HeLa cells co-infected with two recombinant adenoviruses in order to express a constant quantity of OBRa and increasing amounts of endospanin (multiplicity of infection from 0 to 80).
  • FIG. 5 represents the expression of the mRNA of OB-RGRP (left) and LEPROTL1 (right) in the MCF7 line under treatment with estradiol and progesterone by real-time PCR.
  • Figure 6 shows the distribution and intensity of expression of mRNAs, OB-RGRP (left) and LEPROTL1 (right) in the brain and fetus of mice.
  • FIG. 7 shows that the overexpression of the protein OB-RGRP induces a dose-dependent decrease in the expression on the surface of the leptin receptor.
  • Example 1 Transport of a labeled version of endospanin from the membrane to the cytoplasm
  • HA epitope (or 'tag') (9 amino acids t PYDVPDYAY) was introduced by site-directed mutagenesis in the first extracellular loop (B1) of endospanine, between residues Y30 and N31 ( Figure 1 and 2). Binding residues have been included on each side of the tag (GAS and GA, respectively).
  • HeLa cells previously cultivated on glass slides were transfected with a plasmid allowing the expression of the protein thus labeled; endospanin- HA-B1. Twenty-four hours after transfection, the cells were incubated for two hours in culture medium containing an anti-HA monoclonal antibody. The cells were then rinsed and then incubated in culture medium devoid of antibodies.
  • the cells were fixed in a 3% paraformaldehyde solution.
  • the internalized anti-HA antibody was revealed using an anti-mouse IgG antibody labeled with alexa-488, after prior permeabilization of the cells by incubation in a solution containing triton X-100 at 0 , 1%.
  • Endospanin was revealed using an anti-endospanin rabbit antiserum against the C-terminal dodecapeptide and by an anti-rabbit IgG antibody labeled with aexa-594. The preparations were observed on an immunofluorescence microscope.
  • Example 2 Modulation of expression of the leptin receptor on the surface of cells by endospanine. 1) Methods.
  • OB-Ra short isoform of murine OB-R
  • human endospanin were constructed by homologous recombination.
  • OB-R expressed by this viral vector has an HA epitope at its N-terminal end.
  • HeLa cells were co-infected with the receptor expressing virus and increasing doses of endospanin expressing virus. After 24 hours of expression, the surface proteins were biotinylated at 4 ° C. The cells were then lysed and the cell lysates clarified by centrifugation.
  • the relative levels of biotinylated receptors were quantified by immunoblot from the material purified by streptavidin-agarose beads and revelation by immunoblot after separation of the proteins by electrophoresis in polyacrylamide gel.
  • the total receptors (surface + internal) were quantified in parallel by the same method from a tenth of each cell lysate.
  • OB-Ra was revealed with an anti-HA antibody.
  • the same immunoblots were then revealed thanks to an antibody directed against the transferrin receptor.
  • the quantities of surface receptors were expressed by the ratio of the quantity of receptor in the biotinylated fraction to the quantity of receptor present in the total cell lysates.
  • OB-R Surface expression of OB-R is affected by overexpression of endospanine.
  • the overexpression of endospanine induces a dose-dependent decrease in the surface expression of OB-R (FIG. 4) without any impact on the surface expression of the transferrin receptor.
  • G ⁇ PDH was studied by quantitative real-time PCR on the LightCycler device (Roche) in the human breast cancer line MCF7 whether or not subjected to treatment with either progesterone or estradiol.
  • the total RNAs were prepared using the kits: QIAGEN, RNeasy®.
  • the cDNA (2 ⁇ g of RNA in a volume of 25 ⁇ L), are obtained using the Reverse Transcriptase
  • the oligonucleotides for real-time PCR are as follows.
  • Example 4 Expression of LEPROTL1 and OB-RGRP in the brain and fetus of mice.
  • LEPROTL1 mRNA
  • MRNA OB-RGRP
  • ACGAATTCACCGCCATGGCAGGCATC (SEQ ID NO. 20) and ACTCTAGACCACTGCTGCCAGCTGAAG (SEQ ID NO. 21).
  • the two probes were hybridized on 20 ⁇ m adjacent coronal sections of the mouse brain at the level of the hypothalamus (A; bregma 0.82mm B; bregma 1.46mm) or 13.5-day-old fetus p.c. with the placenta (C).
  • the auto-radiographic signals generated by in situ hybridization with the LEPROTL 1 probe are more intense than those observed with the OB-RGRP probe, at the same level of radioactivity and the same specific radioactivity.
  • the expression of LEPROTL1 is similar in distribution and in abundance relative to the expression of OB-RGRP ( Figure 6).
  • the two, OB-RGRP and LEPROTLl antisense probes hybridize with a defined number of structures, with a weak signal, widely distributed.
  • the sense probe shows a weak and uniform signal (data not shown). Both mRNAs are widely expressed in the hippocampus, including the dentate gyrus (DG).
  • DG dentate gyrus
  • CP choroid plexus
  • PVN paraventricular
  • ARC arched
  • VMH ventromedial
  • LH lateral hypothalamus
  • LEPROTL1 and OB-RGRP probes show a similar hybridization profile in the fetus and placenta sections. In embryonic tissues, LEPROTL1 is most strongly expressed in the developing brain and lungs, where signal enrichment is observed for the OB-RGRP probe.
  • Example 5 Modulation of the expression of the leptin receptor on the surface of cells by the protein OB-RGRP.
  • adenoviruses expressing a short isoform (oB-Ra) of the murine leptin receptor, on the one hand, and the human OB-RGRP protein were constructed by homologous recombination.
  • the leptin receptor expressed by this viral vector has an HA epitope at its end N-terminal.
  • HeLa cells were co-infected with the virus expressing the receptor and increasing doses of virus expressing the protein OB-RGRP.
  • the surface expression of the leptin receptor was quantified by biotinylation of the surface proteins, lysis of the cells, precipitation of the biotinylated material by streptavidin-agarose beads and revelation by immunoblot after separation of the proteins by electrophoresis in polyacrylamide gel.
  • the leptin receptor was revealed with an anti-HA antibody.
  • a portion of the cell lysate was also subjected to the same analysis in order to determine the total quantity of receptors (surface + internal).
  • the amounts of surface receptor were expressed by the ratio of the amount of protein in the biotinylated fraction to the amount of protein present in the total cell lysates.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode d'identification de composés actifs sur la perte ou la prise de poids ou le diabète chez un sujet humain ou animal, caractérisé en ce que l'on mesure l'effet dudit composé sur (a) l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB­ RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.

Description

UTILISATION DES GENES LEPROTLl ET OB-RGRP POUR LE CRIBLAGE DE COMPOSES ACTIFS SUR LA PRISE OU LA PERTE DE POIDS OU LE DIABETE D'UN SUJET HUMAIN OU ANIMAL.
La présente invention concerne le domaine du diagnostic, de la prévention et du traitement de 1 'obésité de la perte de poids , associé ou non à des désordres hormonaux et également au diabète chez l'homme ou l'animal. L'invention vise plus particulièrement à offrir une nouvelle méthode de criblage de composés utiles pour traiter ou prévenir l'obésité ou la perte de poids , ou le diabète chez un sujet humain ou animal, basée sur l'utilisation des gènes LEPROTLl et OB-RGRP et le trafic des protéines codées par ces gènes, respectivement l'endospanine et OB-RGRP. On a décrit dans l'art antérieur une famille de petites protéines hydrophobes dont les représentants humain et murin appelés OB-RGRP (leptin receptor gène related protein) proviennent d'un épissage alternatif au niveau du locus du récepteur de la leptine (OB-R), mais qui ne présentent pas de similarité de séquence avec les isoformes d'OB-R et dont la fonction n'a pas été élucidée (Bailleul, B. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25, 2752-2758). Il a également été rapporté l'existence d'une protéine, nommée l' endospanine, très homologue à OB-RGRP, codée par le gène LEPROTLl (leptin receptor overlapping transcript-like 1) (Huang, Y. et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta, 1517, 327- 331). Au niveau cellulaire, ces protéines à quatre domaines transmembranaires sont localisées dans des domaines membranaires riches en cholestérol et glyco-sphingolipides (les rafts) (Séron, K et al.j poster de congrès). Ces protéines sont exprimées dans un grand nombre de tissus et notamment dans la plupart des tissus périphériques.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de suggérer le rôle d'OB-RGRP et de 1' endospanine sur l'expression d'OB-R à la surface des cellules. Ainsi, l'étude de l'expression des gènes codant ces protéines montre une co-expression de ces deux gènes, en particulier dans les cellules d'organes exprimant OB-R (Mercer J. et al., 2000, J. Neuroendocrinol » , 12y 649-655)» Il a en outre maintenant été mis en évidence que le gène codant 1 'endospanine participe au trafic intracellulaire d'OB-R et ainsi régule le taux d'OB-R au niveau de la membrane externe de la cellule. Ces gènes jouent donc probablement un rôle sur la sensibilité de la cellule à la leptine et leur régulation permet de définir une nouvelle stratégie pharmacologique pour intervenir sur la sensibilité à la leptine par l'augmentation ou la réduction de l'expression d'OB-R au niveau de la membrane des cellules et de traiter ou prévenir la perte ou prise de poids par les individus humains ou animaux.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention permettent également maintenant d'expliquer le dimorphisme sexuel, au niveau du taux de masse graisseuse et du taux de leptine circulante. Il a en outre maintenant été mis en évidence que LEPROTLl et OB-RGRP sont régulés par certaines hormones sexuelles. Plus particulièrement, une régulation hormonale de ces deux gènes permet de rendre compte du polymorphisme sexuel et des variations durant la vie de la femme, du taux de leptine circulant et donc de la répartition et de la prise de masse adipeuse.
La présente invention a donc pour objet une méthode d'identification de composés actifs sur la prise ou perte de poids ou le diabète chez un sujet humain ou animal consistant à mesurer l'effet de ces composés sur (a) l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou partie de ceux-ci et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire des protéines et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.
En effet, l'étude du trafic intracellulaire de l' endospanine, a permis de montrer que cette protéine passe à la surface cellulaire et est ensuite endocytosée puis dégradée dans les lysoso es. Il est probable que OB-RGRP participe au même trafic intracellulaire.
Plus particulièrement la méthode de l'invention comprend (i) la mise en contact d'un composé à tester avec des cellules exprimant l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou fragments de ceux-ci, puis (ii) la mesure de la- quantité de protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci présente au niveau de la membrane desdites cellules et/ou leur internalisation. Avantageusement, l'endospanine et/ou OB-RGRP ou partie de celles-ci sont marquées de façon à pouvoir être détectées et ainsi réaliser la mesure de la méthode de l'invention. Tout type de marquage peut être envisagé dans le cadre de la méthode de l'invention, mais on préfère un marquage de type tag peptidique.
La méthode de 1 ' invention peut être mise en œuvre in vitro sur un modèle de cellules en culture ou in vivo dans un modèle animal.
La méthode de l'invention peut comprendre également la mesure de l'expression et/ou du transport avantageusement jusqu'à la surface de la membrane des cellules d'OB-R, ou encore dans le cas d'un modèle animal, la mesure de la leptine circulante.
Les modèles cellulaires ou animaux mis en œuvre dans le cadre de la méthode de l'invention peuvent être du type soit exprimant LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux- ci de façon endogène soit génétiquement modifié pour exprimer lesdits LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sous la forme de protéines recombinantes . A titre d'exemple de modèles cellulaires exprimant naturellement LEPROTLl et/ou OB-RGRP on peut citer un modèle humain comme Hela, 293 ou HepG2 ou murin comme 3T3, des cultures primaires pourraient également être utilisées . Tout type de cellules peut être utilisé car la plupart des lignées et tissus expriment 1 ' endospanine et OB-RGRP.
A titre d'exemple de modèles animaux exprimant naturellement LEPROTLl et/ou OB-RGRP on peut citer la souris, le rat et le lapin. On préfère toutefois, une mise en œuvre de l'invention sur des cellules transformées pour exprimer tout ou partie de l'un ou moins des gènes, LEPROTLl et/ou OB-RGRP. Il s'agit avantageusement de cellules en culture, mais l'invention peut être aussi mise en œuvre sur des animaux obtenus par transgénèse selon des techniques décrites dans la littérature à partir de LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci.
On préfère pour la mise en œuvre de l'invention des cellules en culture qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer l'un au moins de LEPROTL l et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci.
Les séquences de l'ADNc de LEPROTLl humain et de 1 'endospanine humaine et de souris sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID N0.1, SEQ ID NO.2 et SEQ ID NO.3.
Les séquences de l'ADNc d ' OB-RGRP humain et de la protéine humaine et murine sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO.6. Ces cellules génétiquement modifiées sont préparées par des techniques bien connues de l'homme du métier mettant en œuvre des vecteurs d'expression.
Il peut, bien entendu, s'agir des formes humaines, murines, ou de toutes autres espèces dès lors que ceux-ci présentent avantageusement au moins 80% d'homologie avec LEPROTLl et OB-RGRP humains.
Il peut aussi s'agir de fragments ou de séquences modifiées par l'addition, la délétion ou le changement d'un ou plusieurs nucleotides, de ces gènes dès lors que la protéine codée par ses fragments ou séquences modifiées peut être transportée jusqu'à la membrane de la cellule et avantageusement être ensuite internalisée.
Une forme préférée de l'invention consiste à exprimer une forme modifiée de LEPROTLl , OB-RGRP ou fragments de ceux-ci de façon à produire des protéines marquées. Le marquage consiste avantageusement en un tag peptidique. On entend aussi par forme modifiée de ces gènes, des gènes codant pour des protéines tronquées, c'est-à-dire présentant une délétion d'un ou plusieurs acides aminés, utile notamment pour le marquage peptidique.
Comme indiqué précédemment 1 'endospanine et/ou OB- RGRP comprennent quatre domaines transmembranaires. Ainsi, à titre d'exemple préféré, un fragment et une forme modifiée de LEPROTLl ou OB-RGRP code pour une protéine modifiée comprenant au moins deux des quatre domaines transmembranaires et un marqueur peptidique sous la forme de protéines de fusion.
Le marqueur de 1 ' endospanine et/ou d' OB-RGRP ou fragments de celles-ci peut être identique ou différent. A titre d'exemple de marqueurs peptidiques généralement utilisés , on peut citer :
HA de séquence YPYDVPDYA (SEQ ID NO. 7) c-myc : séquence EQKLISEEDL (SEQ ID NO. 8) VSV-G t séquence YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO. 9) His6 ∑ séquence HHHHHH (SEQ ID NO. 10) FLAG s séquence DYKDDDDK (SEQ ID 10. 11) L'insertion d'un marqueur peptidique dans la protéine complète peut s'effectuer à tout niveau de la protéine ou fragment de celle-ci dès lors qu'il ne modifie pas l'expression de la protéine à la membrane de la cellule et avantageusement également son internalisation.
Ainsi dans le cas de l' ndospanine et d' OB-RGRP, on peut citer les sites entre les acides aminés des positions 25 à 35 et des positions 82 à 100 de SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO. 5, c'est-à-dire les deux boucles extracellulaires. L'extension en N ou C terminal par un marqueur peptidique sur une protéine tronquée est également possible en s 'assurant que la délétion positionne l'extrémité terminale et le marqueur en position lumenale/extracellulaire.
Le cadre de lecture devra être intégré dans un vecteur d'expression de type, plasmide (pCI/pCIneo, Promega, pcDNA3, Invitrogen) ou virus (adéno, rétro, vaccine) pour des expressions soit transitoire ou stable.
Comme indiqué précédemment, l' endospanine et/ou OB- RGRP ou partie de celles-ci peuvent être marquées et l'on préfère un marquage de type tag peptidique. La mesure peut s'effectuer alors à l'aide d'un anticorps dirigé contre le marqueur peptidique, intégré par exemple dans l'une des deux boucles lumenales/extracellulaires de l' endospanine, OB-RGRP ou fragments de celles-ci ou en prolongation de ces boucles dans les formes tronquées des protéines, par mise en contact de l'anticorps avec les cellules.
La méthode de 1 ' invention peut également être mise en œuvre sur de l' endospanine et/ou OB-RGRP non marquées. Des anticorps dirigés contre l'une des deux boucles lumenale/extracellulaire de 1 'endospanine ou d' OB-RGRP permettent de détecter la protéine endogène par mise en contact avec les cellules.
A titre d'exemple, la position des polypeptides pour l'obtention de ces anticorps spécifiques, de préférence monoclonaux, pour identifier l' endospanine et OB-RGRP endogènes au niveau membranaire se situent entre les acides aminés en positions 25 à 35 et les acides aminés en positions 82 à 100 de SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO.5. La mesure peut alors comprendre la mise en œuvre d'un anticorps secondaire selon des techniques bien connues de 1 ' omme du métier.
On peut citer plusieurs techniques de l'art antérieur pour quantifier les protéines susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention t
- ELISA : secondaire couplé à la peroxydase, à la phosphatase alcaline ou à une autre enzyme, réaction colorée quantifiable et automatisable, - le Western Blot,
- le comptage radioactif (Iode),
1 ' immunofluorescence : anticorps secondaire fluorescent utile pour une mesure de la morphologie.
D'autres techniques de mesures peuvent être mises en œuvre, comme par exemple :
- biotinylation de surface et streptavidine,
- iodination de surface et immuno-précipitation
L'effet du composé à tester selon la méthode de l'invention peut être réalisé par comparaison des mesures sur des cellules avec et sans la mise en contact avec ledit composé. Cet effet peut être mesuré après ou pendant un temps déterminé de mise en contact des cellules avec ledit composé. La spécificité du composé à tester vis-à-vis de a) l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire e /ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire des protéines et/ou (d) l' internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci peut être déterminé en mesurant l'effet du traitement sur d'autres gènes ou protéines.
Ainsi, selon la méthode de l'invention Méthode, l'effet du composé à tester sur le trafic intracellulaire de 1' endospanine et/ou OB-RGRP est aussi mesuré à l'aide d'un anticorps dirigé contre une quelconque protéine membranaire de surface, une partie ou un marqueur de celles-ci.
On peut citer à titre d'exemple préféré le récepteur à la transferine.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de la prise ou perte de poids ou du diabète comprenant au moins un composé capable de modifier l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, e /ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, e /ou (d) l' internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci. Un tel composé est avantageusement un antagoniste ou un agoniste de l'une au moins des protéines endospanine et OB-RGRP.
L'invention concerne aussi le diagnostic de la prise ou perte de poids ou du diabète chez un sujet humain ou animal consistant à mesurer et avantageusement à comparer avec au moins un témoins, l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, e /ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) 1 ' internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent, où il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente la séquence de l'ADNc du gène LEPROTLl où le cadre de lecture est souligné.
La figure 2 représente l'alignement des séquences de 1 ' endospanine et d'OB-RGRP humaine et murine. Les quatre domaines transmembranaires de ces protéines sont indiqués en ligne 1. La figure 3 représente des cellules HeLa, en double marquage en immunofluorescence indirecte, exprimant 1 'endospanine-HA-Bl, incubées en présence d'anticorps de souris anti-HA. La fluorescence verte révèle les anticorps anti-HA internalisés (A et C) . La fluorescence rouge révèle 1' endospanine, -HA-B1 et endogène, dans ces cellules (B et C).
La figure 4 représente la quantité de récepteur de la leptine en surface rapportée à la quantité totale de récepteur de la leptine cellulaire et normalisée à 100% pour le contrôle, de cellules HeLa co-infectées avec deux adénovirus recombinants afin d'exprimer une quantité constante de OBRa et des quantités croissantes d' endospanine (multiplicité d'infection de 0 à 80).
La figure 5 représente l'expression de l'ARNm de OB- RGRP (gauche) et de LEPROTLl (droit) dans la lignée MCF7 sous traitement à l'œstradiol et à la progestérone par PCR en temps réel.
La figure 6 représente la distribution et l'intensité d'expression des ARNm, d' OB-RGRP (gauche) et de LEPROTLl (droit) dans cerveau et fétus de souris.
La figure 7 montre que la surexpression de la protéine OB-RGRP induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface du récepteur de la leptine. Exemple 1 : Transport d'une version marquée de 1'endospanine de la membrane au cytoplasme
1) Méthodes .
Un épitope (ou 'tag') HA (9 amino-acids t PYDVPDYAY) a été introduit par mutagénèse dirigée dans la première boucle (Bl) extracellulaire de l'endospanine, entre les résidus Y30 et N31 (figure 1 et 2). Des résidus de liaison ont été inclus de chaque côté du tag (respectivement GAS et GA, ) . Des cellules HeLa préalablement cultivées sur lamelles de verre ont été transfectées avec un plasmide permettant l'expression de la protéine ainsi marquée ; l'endospanine- HA-B1. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été incubées pendant deux heures dans du milieu de culture contenant un anticorps monoclonal anti-HA. Les cellules ont été ensuite rincées puis incubées dans du milieu de culture dépourvu d'anticorps. Les cellules ont été fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 3%. L'anticorps anti-HA internalisé a été révélé à l'aide d'un anticorps anti-IgG de souris marqué à l'alexa-488, après perméabilisation préalable des cellules par une incubation dans une solution contenant du triton X-100 à 0,1%. L'endospanine a été révélé, à l'aide d'un antiserum de lapin anti-endospanine contre le dodecapeptide de la partie C- terminale et par un anticorps anti-IgG de lapin marqué à l'alexa-594. Les préparations ont été observées sur un microscope à immunofluorescence.
2) Résultats.
Un signal cytoplasmique ponctué a été observé, indiquant que des anticorps anti-HA avaient été internalisés depuis la membrane plasmique vers des compartiments endosomaux intra-cytoplasmiques (figure 3A et C) . Pour montrer que ce marquage correspondait bien à des protéines internalisées, un marquage total a été réalisé sur les mêmes cellules, après fixation, à l'aide d'un anticorps dirigé contre la partie C-terminale de l'endospanine. Le pattern de ce marquage total diffère considérablement de celui correspondant à la protéine internalisee, d'une part, et reproduit le pattern de l' endospanine endogène (figure 3B et C) . Ceci démontre que le marquage à l'anticorps anti-HA résulte bien d'une internalisation de la protéine de surface et indique que l'adressage en surface cellulaire de la protéine marquée d'un épitope HA ne résulte pas d'un artefact de surexpression, et qu'elle se comporte donc probablement comme la protéine endogène.
Comme contrôle, la même expérience a été effectuée en parallèle avec l' endospanine porteuse du même épitope HA dans sa boucle cytosolique (entre les résidus M62 et S63). Cette boucle n'est pas exposée vers l'extérieur de la cellule. Elle est par conséquent inaccessible aux anticorps anti-HA présents dans le milieu de culture. Comme prévu, cette construction n'a pas permis d'observer d' internalisation de l'anticorps anti-HA.
Ces résultats démontrent que 1 ' endospanine dans laquelle un épitope HA a été inséré (dans sa première boucle extracellulaire) est adressée vers la membrane plasmique de la cellule, puis internalisee dans des endosomes. Quatre à cinq heures après internalisation, le signal correspondant à l'anticorps anti-HA ne pouvait plus être détecté. Cette perte du marquage montre que l'endospanine a été transportée vers des compartiments intracellulaires, probablement des lysosomes, où les anticorps internalisés ont été dégradés.
Exemple 2 ; Modulation de l'expression du récepteur de la leptine à la surface des cellules par l'endospanine. 1 ) Méthodes .
Des adénovirus recombinants exprimant une isoforme courte (OB-Ra) d'OB-R murin, d'une part, et 1 'endospanine humaine ont été construits par recombinaison homologue. OB-R exprimé par ce vecteur viral comporte un épitope HA à son extrémité N-terminale. Des cellules HeLa ont été co- infectées avec le virus exprimant le récepteur et des doses croissantes de virus exprimant l' endospanine. Après 24 heures d'expression, les protéines de surface ont été biotinylées à 4°C. Les cellules ont ensuite été lysées puis les lysats cellulaires clarifiés par centrifugation. Les niveaux relatifs de récepteurs biotinylés (surface) ont été quantifiés par immunoblot à partir du matériel purifié par billes de streptavidine-agarose et révélation par immunoblot après séparation des protéines par electrophorese en gel de polyacrylamide. Les récepteurs totaux (surface + interne) ont été quantifiés en parallèle par la même méthode à partir d'un dixième de chaque lysat cellulaire. OB-Ra a été révélé avec un anticorps anti-HA. Les mêmes immunoblots ont ensuite été révélés grâce à un anticorps dirigé contre le récepteur de la transferrine. Les quantités de récepteurs de surface ont été exprimées par le rapport de la quantité de récepteur dans la fraction biotinylée sur la quantité de récepteur présente dans les lysats cellulaires totaux.
2) Résultats et conclusions.
L'expression en surface d'OB-R est affectée par la surexpression de 1 'endospanine. La surexpression de 1 'endospanine induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface d'OB-R (figure 4) sans aucun impact sur l'expression en surface du récepteur de la transferrine. Ces résultats démontrent la spécificité des effets observés sur l'expression en surface d'OB-R et suggèrent que 1 ' endospanine participe à la régulation de l ' expression en surface de ce récepteur .
Exemple 3 . Régulation hormonale de LEPROTLl et OB- RGRP.
1 ) Méthodes .
L'expression des gènes LEPROTLl , OB-RGRP f β-Αctine et
GΑPDH a été étudié par PCR quantitatif en temps réel sur l'appareil LightCycler (Roche) dans la lignée humaine de cancer du sein MCF7 soumis ou non au traitement soit par la progestérone, soit par l'estradiol. Les cellules MCF7 cultivées dans un milieu DMEM sans rouge de phénol, à 37°C sous 5% de C02/ sont privées de sérum pendant une nuit, puis traitées ( lμM de progestérone ou d'estradiol) pendant 6 heures. Les ARN totaux ont été préparés en utilisant les kits : QIAGEN, RNeasy®. Les cDNA (2μg d'ARN dans un volume de 25μL), sont obtenus à l'aide de la Reverse Transcriptase
(M-MLV, Promega) et d'oligonucléotides Random p(dN6) (Roche) comme amorces et par la méthode recommandée par le fournisseur.
Nous avons utilisé le kit et les matériels de la société Roche ; (LightCycler—FastStart DNA Master SYBR Green
I, LightCycler Capillaries ) . Les quantifications ont été effectuées avec des ADNc correspondant à lOOng d'ARN par la méthode recommandée par le fournisseur.
Les oligonucléotides pour les PCR en temps réel sont les suivants.
LEPROTLl :
5 'CAAATACTGGCCCCTCTTTGTTCATT3 ' (SEQ ID NO. 12) 5'TCAGTAATTTCTTTTCACCACTGCTGC3' (SEQ ID NO. 13)
OB-RGRP s
5 ΑGCAGCCGCGGCCCCAGTTC3 ' ( SEQ ID NO . 14 )
5 ' AAGGCCGCAGGCTCCCCATTT3 ' ( SEQ ID NO . 15 ) β-Actine : 5 'CACACTGTGCCCATCTACGAG3 ' (SEQ ID NO. 16) 5'CGTGGTGGTGAAGCTGTAGCC3' (SEQ ID NO. 17) GAPDH : 5 'GTGAAGGTCGGAGTCAACG3 ' (SEQ ID NO. 18) 5 'CATGGGTGGAATCATATTGGA3 ' (SEQ ID NO. 19)
2 ) Résultats
Les valeurs d'expression d r OB-RGRP ( ARNm) et de LEPROTLl (ARNm) , (normalisées par les ARNm de β-Actine et GAPDH ) pour le traitement solvant seul et les deux traitements hormonal, incluant l'intervalle de confiance à 95% sont représentées dans la figure 5.
Les réductions d'expression d ' OB-RGRP(ARNm) par les deux hormones et l'augmentation d'expression de LEPROTLl (ARNm) par la progestérone sont significatives (p<0,05 pour N=46 pour OB-RGRP /β-Actine ou OB-RGRP /GAPDH, N=24 pour LEPROTLl /β-Actine ou LEPROTLl /GAPDH) . Une réduction d'expression d'OB-i?(ARNm) par ces mêmes hormones a été décrite (Duggal, P. S. et al., 2002, Reproduction 123(6), 899-905, Kitawaki, et al., 2000, J Clin Endocrinol Metab 85(5), 1946-50, Koshiba, et al., 2001, Mol Hum Reprod 7(6): 567-72. Ceci suggère que ce soit probablement le promoteur commun à OB-RGRP et OB-R qui est régulé par ces hormones . La régulation de ces gènes par les hormones et leur rôle dans le trafic intracellulaire de la leptine pourraient rendre compte du dimorphisme sexuel humain dans le taux de masse graisseuse et le taux de leptine circulant (Hickey, M. S. et al., 1996, Biochem Mol Med 59(1): 1-6.)
Exemple 4 : Expression de LEPROTLl et OB-RGRP dans cerveau et fétus de souris . L ' expression de LEPROTLl ( ARNm) par Northern blots (Huang, Y . et al . , 2001 , Biochim. Biophys . Acta, 1517 , 327- 331 ) observée dans de nombreux tissus est analogue à l ' expression d ' OB-RGRP (ARNm) ( Bailleul , B . et al . , 1997 , Nucleic Acids Res » , 25 , 2752-2758 ) . Nous avons analysé par hybridation in situ l ' expression des ARNm de LEPROTLl et OB- RGRP, dans cerveau et fétus de souris .
1 ) Méthodes La distribution de LEPROTLl (ARNm) et OB-RGRP(KRE ) sur des coupes de cerveau et de fétus a été étudiée par hybridation in situ par une technique décrite en détail précédemment, en utilisant des sondes marquées au 35S d'ARN antisens reconnaissant les exons 3 et 4 d ' OB-RGRP, (Mercer, J. et al., 2000, J. Neuroendocrinol. , 12, 649-655) ou les 415 paires de bases de LEPR OTL1 (ADNc) de souris, générées par PCR utilisant les primers suivants :
ACGAATTCACCGCCATGGCAGGCATC, (SEQ ID NO. 20) et ACTCTAGACCACTGCTGCCAGCTGAAG(SEQ ID NO. 21). Les deux sondes ont été hybridées sur des 20μm coronales adjacentes sections du cerveau de souris au niveau de l'hypothalamus (A; bregma 0.82mm B; bregma 1.46mm) ou de fétus de 13.5 jours p.c. avec le placenta (C).
2) Résultats
Les signaux auto-radiographiques générés par hybridation in situ avec la sonde LEPROTL l sont plus intenses que ceux observés avec la sonde OB-RGRP, à un même taux de radioactivité et une identique radioactivité spécifique. L'expression de LEPROTLl est similaire en distribution et en abondance relative à l'expression d ' OB- RGRP (Figure 6). Dans les coronales sections à travers l'hypothalamus, les deux, OB-RGRP et LEPROTLl anti-sens sondes hybrident avec un nombre de structures définies, avec un signal d'intensité plus faible, largement distribué. La sonde sens montre un faible et uniforme signal (donnée non montrée). Les deux ARNm sont largement exprimés dans l'hippocampe, incluant le gyrus denté (DG). D'autres structures /tissus avec des signaux ARNm distincts incluant le plexus choroïde (CP), le cortex piriforme, les noyaux paraventriculaire (PVN), arqué (ARC), ventromédian (VMH) et l'hypothalamus latéral (LH) (figure 6). Dans les aires du système nerveux central décrit ci-dessus, la localisation au microscope des grains d'argent de l'épreuve est identique aux neurones colorées au bleu de toluidine.
Les sondes de LEPROTLl et d ' OB-RGRP montrent un profil similaire d'hybridation dans les coupes de fétus et de placenta. Dans les tissus embryonnaires, LEPROTLl est plus fortement exprimé dans le cerveau en développement et les poumons, où un enrichissement de signal est observé pour la sonde OB-RGRP.
Ces données suggèrent que, comme décrit pour OB-RGRP, l'expression de LEPROTLl est répartie d'une manière étendue dans le cerveau et le fétus avec des régions de plus forte expression dans quelques régions incluant les noyaux hypothalamiques et les régions du cerveau qui expriment l'ARNm et la protéine d ' OB-R.
Exemple 5 : Modulation de l'expression du récepteur de la leptine à la surface des cellules par la protéine OB- RGRP.
1) Méthodes Des adenovirus recombinants exprimant une isoforme courte (oB-Ra) du récepteur de la leptine murin, d'une part, et la protéine OB-RGRP humaine ont été construits par recombinaison homologue. Le récepteur de la leptine exprimé par ce vecteur viral comporte un épitope HA à son extrémité N-terminale. Des cellules HeLa ont été co-infectées avec le virus exprimant le récepteur et des doses croissantes de virus exprimant la protéine OB-RGRP. L'expression en surface du récepteur de la leptine a été quantifiée par biotinylation des protéines de surface, lyse des cellules, précipitation du matériel biotinylé par des billes de streptavidine-agarose et révélation par immunoblot après séparation des protéines par electrophorese en gel de polyacrylamide. Le récepteur de la leptine a été révélé avec un anticorps anti-HA. Une portion du lysat cellulaire a également été soumise à la même analyse afin de déterminer la quantité totale de récepteurs (surface + interne). Les quantités de récepteur de surface ont été exprimées par le rapport de la quantité de protéine dans la fraction biotinylée sur la quantité de protéine présente dans les lysats cellulaires totaux.
2) Résultats
L'expression en surface du récepteur de la leptine est affectée par la surexpression de la protéine OB-RGRP. La surexpression de la protéine OB-RGRP induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface du récepteur de la leptine (Figure 7). La quantité totale de récepteur de la leptine (surface + interne) n'est pas affectée par la surexpression de la protéine OB-RGRP. Ces résultats démontrent la spécificité des effets observés sur l'expression en surface du récepteur de la leptine et suggèrent que la protéine OB-RGRP participe à la régulation de l'expression en surface du récepteur de la leptine.

Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode d'identification de composés actifs sur la perte ou la prise de poids ou le diabète chez un sujet humain ou animal, caractérisé en ce que l'on mesure l'effet dudit composé sur (a) l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) 1 ' internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.
2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la mise en contact d'un composé à tester avec des cellules exprimant l'un au moins des gènes LEPROTLl et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, puis (ii) la mesure de l'effet dudit composé sur la quantité de protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou fragments de ceux- ci présente au niveau de la membrane desdites cellules et/ou leur internalisation.
3) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l' endospanine et/ou OB-RGRP ou partie de celles-ci codées par l'un au moins desdits gènes ou fragments de ceux-ci sont marqués.
4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est mise en œuvre in vitro sur un modèle de cellules en culture ou in vivo dans un modèle animal.
5) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mesure de l'expression et/ou du transport avantageusement jusqu'à la surface de la membrane des cellules d'OB-R, ou encore dans le cas d'un modèle animal, la mesure de la leptine circulante.
6) Méthode selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée le modèle cellulaire ou animal est du type soit exprimant les gènes LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci de façon endogène soit génétiquement modifié pour exprimer lesdits gènes LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sous la forme de protéines recombinantes .
7) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes LEPROTLl et/ou
OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont des gènes humains, ou de toutes autres espèces dès lors qu'ils présentent avantageusement au moins 80% d'homologie avec les gènes humains .
8) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont modifiés dès lors qu'ils codent pour des protéines qui peuvent être transportées jusqu'à la membrane de la cellule et avantageusement être ensuite internalisee.
9) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les gènes LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont sous une forme modifiée de façon à produire des protéines marquées .
10) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que le marquage consiste en un marqueur peptidique. 11) Méthode selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que les gènes LEPROTLl et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sont modifiés et en ce qu'ils codent pour au moins deux des quatre domaines transmembranaires desdites protéines et un marqueur peptidique sous la forme de protéines de fusion.
12) Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisée en ce que le marqueur peptidique est inséré dans 1 'endospanine au niveau de l'une des deux boucles extracellulaires.
13) Méthode selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisée en ce que le marqueur peptidique est inséré , au niveau de son l'extrémité N ou C terminal de l' endospanine tronquée par une délétion et en ce que ladite délétion positionne l'extrémité terminale et le marqueur en position lumenale/extracellulaire .
14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'effet du composé à tester est mesuré à l'aide d'un anticorps dirigé contre l' endospanine et OB-RGRP, une partie ou un marqueur de celles-ci.
15) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que l'effet du composé à tester est réalisé par comparaison des mesures sur des cellules avec et sans la mise en contact avec ledit composé.
16) Méthode selon l'une quelconque des revendications
1 à 15, caractérisée en ce que l'effet du composé à tester est mesuré après ou pendant un temps déterminé de mise en contact des cellules avec ledit composé.
17) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'effet du composé à tester sur le trafic intracellulaire de l' endospanine et/ou OB-RGRP est aussi mesuré à l'aide d'un anticorps dirigé contre une quelconque protéine membranaire de surface, une partie ou un marqueur de celles-ci.
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