EP1597387A1 - Procede de criblage de composes inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'arn d'un virus vih-1 et moyens de mise en oeuvre du procede - Google Patents

Procede de criblage de composes inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'arn d'un virus vih-1 et moyens de mise en oeuvre du procede

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Publication number
EP1597387A1
EP1597387A1 EP04712595A EP04712595A EP1597387A1 EP 1597387 A1 EP1597387 A1 EP 1597387A1 EP 04712595 A EP04712595 A EP 04712595A EP 04712595 A EP04712595 A EP 04712595A EP 1597387 A1 EP1597387 A1 EP 1597387A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
rna
sequence
primer
complex
template
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04712595A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabienne Brule
Catherine Isel
Roland Marquet
Mickäel RIGOURD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Strasbourg filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1597387A1 publication Critical patent/EP1597387A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Definitions

  • the present invention relates to the field of preventive or curative treatment with regard to pathologies caused by human infection with the HIV-1 virus.
  • It relates to methods making it possible to select compounds capable of inhibiting the course of an early stage of the infection of the organism by the HIV-1 virus, namely the stage of initiation of the transcription of the genome. viral, prior to the integration of viral sequences into the cell genome of the infected host organism.
  • AIDS has become the most devastating disease worldwide, with an estimated 42 million people infected with HIV viruses to date. In 2002 alone, more than 3 million people contracted the virus, while 3 million died from the disease. Since the discovery, in 1983, of the main agent responsible for AIDS, the HIV-1 virus, considerable efforts have been made to understand the mechanisms of action of the virus and to develop preventive means and seek curative means against the disease. .
  • the anti-HIV compounds used in therapy mainly target two enzymes playing a key role in the replicative cycle of the virus, the viral protease and retrotranscriptase respectively.
  • seven protease inhibitor compounds are commonly used in therapy and other molecules directed against the protease are undergoing clinical trials.
  • ten viral retrotranscriptase inhibitor compounds are currently used in therapy today, respectively seven nucleoside inhibitors and three non-nucleoside inhibitors, other inhibitors of retrotranscriptase being currently in clinical trials.
  • Preliminary trials have also been performed with inhibitors active at different stages of HIV infection, including inhibitors of virus-cell fusion, zinc finger inhibitors of the nucleocapsid protein and inhibitors of integrase.
  • multi-therapies for “Highly Active Antiretroviral Therapy”.
  • HAART for “Highly Active Antiretroviral Therapy”.
  • multi-therapies one generally combines a protease inhibitor and two retrotranscriptase inhibitors. These inhibitor cocktails significantly delay the progression of the disease and improve the lives of patients over a long period of time.
  • the anti-AIDS therapeutic efficacy of preventive or curative pharmaceutical compositions could be increased by the use of active compounds against other targets than the only HIV protease and retrotranscriptase.
  • the invention provides methods for screening for compounds useful in anti-AIDS therapy, and more specifically for active compounds for inhibiting or blocking an early stage of infection of a host organism by the HIV- 1, the retrotranscription step.
  • the invention relates to methods for screening for compounds capable of inhibiting the first step of setting up the retrotranscription of the viral genomic RNA, namely the step of initiating the retrotranscription.
  • the invention provides the means for implementing such screening methods in the form of RNA / RNA complexes between a primer RNA and a template RNA, in which the primer RNA does not comprise any post-transcriptional modification of the bases which up.
  • the invention also relates to kits or kits for screening for compounds that inhibit the initiation of the retrotranscription of the RNA of an HIV-1 virus comprising a primer RNA / template RNA complex as defined above.
  • Figure 1 Secondary structure model of the tRNA Met / ARMv r ⁇ et-ACl complex.
  • Figure 1A Sequences corresponding to nucleotides 131 to 205 of the isolate Hxb2 from the genomic RNA of wild-type and adapted HIV-1.
  • the adapted vRNA [Met-AC] has a PBS sequence complementary to the 18 nucleotides of the 3 'end of the tRNA and , a sequence upstream of the PBS complementary to the loop of the Met tRNA anticodon and additional mutations (encircled ) appeared after prolonged cell culture.
  • Figure 1 B Secondary structure of the complex.
  • the vRNA [Met-AC] is in black, the tRNA Met in white on a black background.
  • the encircled nucleotides correspond to the mutations which appear after prolonged cell culture.
  • Figure 2 Secondary structure model of the tRNA His / vRNA THis-AC-GACI complex.
  • Figure 2A Sequences corresponding to nucleotides 131 to 205 of the Hxb2 isolate from wild-type HIV-1 genomic RNA (upper line) and adapted lower line).
  • the adapted vRNA [His-AC-GAC] has a PBS sequence complementary to the 18 nucleotides of the 3 'end of the tRNA His , a CCACAA sequence upstream of the PBS complementary to the loop of the Hls tRNA anticodon and mutations additional (circled) appeared after prolonged cell culture.
  • Figure 2B secondary structure of the complex
  • the vRNA [His-AC-GAC] is in black, the tRNA His in white on a black background.
  • the interaction between the Hls tRNA anticodon loop and the complementary region of the vRNA, upstream of the PBS, corresponds to the 6C helix and that of the 3 'end of the Hls tRNA with the PBS forms the 7F propeller.
  • the nucleotides encircled correspond to the mutations which appear after prolonged culture.
  • Figure 3 S1 nuclease mapping of single-strand regions of free His tRNA (the 3 tracks on the left) or hybrid with THis-AC-GACI vRNA (the following three tracks).
  • Lanes 0 are incubation controls in the absence of S1 nuclease while tracks 7.5 and 15 correspond to incubations of 7.5 and 15 minutes respectively, in the presence of 200 U of S1 nuclease.
  • Tracks T1 and L correspond respectively to RNase T1 sequencing and to a scale obtained by alkaline hydrolysis.
  • Figure 4 Synthesis of “strong-stop” DNA (-) from natural or synthetic Hls tRNA.
  • Figure 5A Synthesis of strong-stop DNA (-) from His tRNA, in the absence or in the presence of a trap, poly (rA) / oligo (dT) i8, allowing only one polymerization cycle .
  • Two nM of template / primer complex are incubated in the presence of 20 nM of HIV-1 RT and the polymerization reaction is initiated by the addition of 50 ⁇ M of each dNTP, in the absence or in the presence of 1.66 ⁇ M of poly (rA ) / oligo (dT) ⁇ 8 .
  • the reaction is stopped at variable times between 15 seconds and 30 minutes.
  • Figure 5B Synthesis of strong-stop DNA (-) from ODNHIS, in the absence or presence of a trap, poly (rA) / oligo (dT) i8 allowing only one polymerization cycle .
  • ODNHIS has the following sequence SEQ ID No. 5: 5'-ATCCGAGTCACGGCACCA-3 'Ten nM of template / primer complex are incubated in the presence of
  • Figure 7 Synthesis of a product corresponding to the initiation of retrotranscription from the vRNA complex l ⁇ is-AC-GAC1 / tRNA biosinylated Hls .
  • nM of preformed matrix / primer complex are transferred into the wells of a “Flasplate” (NEN) microplate and incubated in the presence of dGTP, dCTP, dTTP / dTTP [ 3 H] (5 ⁇ M final each), of ddA ( 20 ⁇ M), 90 nM of HIV-1 RT, in the absence or presence of AZTTP.
  • the reaction takes place at 37 ° C for 20 minutes before being stopped in the presence of 25 mM EDTA.
  • the synthesis of a product corresponding to the addition of 6 nucleotides to the primer is detectable by the proximity scintillation technique (SPA) on a type counter
  • MicroBeta We measure a decrease in the signal in the presence of 0.1 and
  • the invention provides methods of screening for compounds that inhibit the initiation of the retrotranscription of RNA in an HIV-1 virus.
  • the development of screening methods according to the invention was made possible thanks to the preparation of new RNA / RNA complexes capable of mimicking the natural complex of initiation of retrotranscription, which is formed after the entry of the HIV-1 virus into the cell.
  • Retrotranscription is a key stage in the replicative cycle of retroviruses, including HIV, in particular HIV-1.
  • the first step in the transcription cycle is the synthesis of a strand of DNA, called strong-stop DNA (-).
  • the synthesis of the strong-stop DNA strand (-) is carried out by elongation of the iso acceptor 3 of the lysine-specific transfer RNA (tRNA3 Lys ) of cellular origin, from the matrix consisting of viral genomic RNA.
  • the eighteen nucleotides located at the 3 'end of tRNA 3 Lys are strictly complementary to the primer binding sequence (PBS) of the HIV-1 genomic RNA, located near the 5' end of the viral genome.
  • PBS primer binding sequence
  • HIV-1 reverse transcriptase uses the 3'-OH group of tRNA primer hybrid to viral genomic RNA to start the synthesis of the strong-stop DNA strand (-).
  • the viral RNA / tRNA 3 Lys ) complex for initiating the retrotranscription of HIV-1 has specific structural and functional characteristics.
  • the interaction between tRNA3 Lys and viral genomic RNA is not limited to the eighteen nucleotides of the primer binding sequence (PBS), but is accompanied by various intra- and inter-molecular structural rearrangements, allowing the formation of a very complex compact structure (ISEL et al., 1995; ISEL et al. 1996).
  • the pairing between the A-rich loop of viral RNA and the tRNA 3 Lys anticodon loop plays a key role in stabilizing the structure of the retrotranscription initiation complex. It has been shown in particular that the stabilization of the additional interactions is strongly dependent on the presence of the bases modified by post-transcriptional intracellular modification of the natural transfer RNA (Isel et al., 1996; Isel et al., 1993, Skripkin and al., 1996).
  • the structural specificity of the HIV-1 retrotranscription initiation complex corresponds to functional specificity.
  • the initiation stage of the retrotranscription is distributive; it is characterized by a low rate of incorporation of a nucleotide and a high rate of dissociation of the reverse transcriptase from the template / primer complex (viral RNA / tRNA3 Lys ) (Lanchy et al., 1996).
  • the elongation step corresponding to the addition of the subsequent nucleotides from a primer which has become a non-specific oligodeoxyribonucleotide primer, is processive; it is characterized by a high speed of incorporation of the nucleotides and a low speed of dissociation of the reverse transcriptase (Lanchy et al., 1996; Lanchy et al., 1998). Similarly, Isel et al.
  • the experimental results obtained by Lanchy et al. indicate that the post-transcriptional intracellular modifications of the transfer RNA are required for the formation of a stable and active initiation complex.
  • the results obtained show that the rates of extension of the primer obtained with purified natural 3 ys tRNA are approximately 32 to 35 times greater than the rates of extension of the primer obtained with tARN 3 Lys transcribed in in vitro, which does not include any post-transcriptional modifications and does not include therefore no basis changed.
  • the bases modified by post-transcriptional modification of the natural cell transfer RNA are involved in the formation of the initiation complex and are capable of anchoring HIV-1 reverse transcriptase to the primer tRNA / viral RNA complex.
  • matrix which explains the loss of specificity of the reverse transcriptase which is observed in the presence of a synthetic tRNA having no modified base.
  • variants of the HIV-1 virus whose PBS has been mutated in order to be compatible with Hls tRNA or tRNA Met use these tRNA stably, provided that the loop A has been mutated simultaneously so as to be complementary to the 'anticodon of these tRNAs (Kang et al., 1997. Wakefield et al. 1998).
  • Analysis of the mutants stably using the Hls tRNA showed that they contain, in addition to the mutations in PBS and the loop A (Zhang et al., 1996), three secondary mutations in U5, upstream of PBS, appeared during prolonged cultures and involved in the maintenance of Hls tRNA as a primer (Zhang et al., 1998).
  • a primer RNA / viral template RNA complex mimicking the initiation complex of retrotranscription of the HIV-1 virus could be obtained between a viral template RNA and a primer RNA containing no post-transcriptional modification.
  • the applicant was able to form a primer RNA / viral template RNA complex between a transfer RNA for histidine (hls tRNA) obtained by in vitro transcription and a viral RNA whose sequence has been adapted in order to be complementary to the Hls tRNA at the codon sequence and at the primer binding sequence (PBS) level, the ls tRNA comprising no base having a chemical modification identical to a natural post-transcriptional modification.
  • hls tRNA transfer RNA for histidine
  • PBS primer binding sequence
  • the primer RNA / viral template RNA complex above is stable and makes it possible to effectively lengthen the primer RNA (the hls tRNA without modified base), according to the initiation / elongation model defined above, as represented in FIG. even, the applicant describes a RNA primer / template RNA complex with a transfer RNA for methionine ( Met tRNA) obtained by in vitro transcription and a viral RNA whose sequence has been adapted in order to be complementary to Met tRNA of the codon sequence and at the level of the primer binding sequence (PBS).
  • Met tRNA transfer RNA for methionine
  • primer transfer RNAs obtained by simple in vitro transcription of the DNA encoding the latter, and having consequently not undergone any post-transcriptional modification of their bases, are capable of forming a primer RNA / template RNA complex with a viral template RNA whose sequence has been adapted (i) at the level of the viral RNA sequence which is complementary to the anti-codon sequence of the primer (also called “Codon sequence” in the following description) and (ii) the primer binding sequence (PBS). It is also shown that, in the presence of reverse transcriptase, the primer RNA / viral template RNA complex is biologically active and is able to mimic the stages of initiation then of extension of the retrotranscription of the viral genome of HIV-1.
  • RNA primer / RNA viral template complexes mimicking the initiation complex for retrotranscription of HIV-1.
  • the synthesis of a primer RNA comprising no post-transcriptional modification can be carried out in large quantities and at low cost, for example by simple in vitro transcription of a DNA coding said primer RNA.
  • the stable and active complexes for initiating the transcription of HIV-1 were formed, in the prior art, from a natural transfer RNA, obtained according to methods long, complex and highly expensive purification, especially from beef or chicken liver.
  • primer RNA / viral template RNA complexes comprising no post-transcriptional modification and mimicking the activity of the natural initiation complex of HIV-1 retrotranscription finally makes it possible to use of these primer RNA / viral template RNA complexes to select on a large scale compounds inhibiting the activity of the natural initiation complex of HIV-1.
  • RNA / viral template RNA complex in which the primer RNA is an in vitro transcription product comprising no post-transcriptional modification, when it is put in the presence of an HIV-1 reverse transcriptase, made it possible to detect the inhibitory activity of a candidate compound, such as AZTTP, on the initiation step of the retrotranscription of the viral genomic RNA of HIV- 1.
  • a candidate compound such as AZTTP
  • the invention makes available for the first time to a person skilled in the art a method for screening for compounds which inhibit the initiation of the retrotranscription of HIV-1.
  • the retrotranscription initiation complex therefore now constitutes, thanks to the invention, a new therapeutic target whose blocking or inhibition constitutes an additional anti-HIV-1 therapeutic strategy, which can be easily integrated in the context of multi HAART therapies.
  • the introduction of inhibitor compounds from the initiation stage of the viral retrotranscription in the context of multi-therapies is likely to considerably reduce the probability of the development of resistant HIV-1 strains.
  • RNA / RNA complexes mimicking the complex for initiating the retrotranscription of the RNA of an HIV-1 virus.
  • a primer RNA / template RNA complex mimicking the initiation complex for the retrotranscription of the RNA of an HIV-1 virus is characterized in that it comprises a template RNA / primer RNA complex formed between :
  • a primer RNA comprising, from the 5 ′ end to the 3 ′ end: - an intramolecular pairing sequence (109);
  • a template RNA comprising, from the 5 ′ end to the 3 ′ end: - an intramolecular pairing sequence (115);
  • the priming RNA consisting of:
  • FIG. 2 illustrates this difference, which however makes it possible to achieve a structure similar to the previous one and which obeys the rules of the initiation complex defined by the inventors. This is the case of the primer RNA / template RNA complex illustrated in FIG. 2B.
  • the above primer / template RNA complex is also characterized in that it mimics the step of initiating the retrotranscription of the viral genomic RNA of HIV-1, according to a kinetics which is characteristic of the initiation of the transcription of HIV-1.
  • the functional characteristics of a primer RNA / template RNA complex of the invention, with regard to the initiation of retrotranscription are described in Example 2.
  • a priming RNA as defined above, strong pauses are observed during the polymerization of the first 11 nucleotides, pauses which decrease over time.
  • the retrotranscriptase during the polymerization of these first 11 nucleotides, is not very processive and tends to detach easily after the addition of a nucleotide.
  • a trap polyrA / oligo dT
  • all of the reverse transcriptase is "trapped by the trap” and the polymerization cannot take place.
  • an oligonucleotide primer which makes it possible to mimic the elongation, the breaks are less important.
  • the transcriptase reverse is very processive and can polymerize, in this system, around 200 nucleotides, without detaching from its substrate.
  • a complex between a template RNA and a primer RNA according to the invention must also meet the following kinetic criteria: the synthesis of DNA from the primer RNA takes place in two phases: a phase of initiation, distributive, and an elongation, processive phase, the kinetics which can advantageously be measured as described by Lanchy et al.
  • the primer RNA / template RNA complex above comprises respectively: (i) a primer RNA chosen from:
  • a priming RNA produced by chemical synthesis or chemical hemi-synthesis the nucleotide sequence of which is that of a transfer RNA found naturally in human cells;
  • a template RNA consisting of an RNA derived from a genomic RNA of the HIV-1 virus, optionally adapted at least in the codon sequence (102) and in the primer binding PBS sequence (108), so that the primer binding sequence (108) is strictly complementary to the sequence (107) of the primer RNA used and the anti-codon sequence (101) is strictly complementary to the codon sequence (102 ).
  • the complementarity of the bases of the sequence (108) with the corresponding bases of the sequence (107) makes it possible to ensure the formation of a stable and functionally active primer RNA / template RNA complex to mimic the initiation of the retrotranscription d '' an HIV-1 virus, in the presence of an HIV-1 reverse transcriptase.
  • a primer RNA is preferably 8 nucleotides in length; the sequence is preferably 2 nucleotides in length; the sequence is preferably 16 nucleotides in length the sequence is preferably 4 nucleotides in length; the sequence preferably has 11 nucleotides in length the sequence preferably has 3 nucleotides in length the sequence preferably has 4 nucleotides in length the sequence preferably has 6 nucleotides in length the sequence preferably has 4 nucleotides in length and the sequence has preferably 18 nucleotides in length
  • sequence (115) preferably has 5 nucleotides of length; sequence (116) is 12 nucleotides in length sequence (106) is 5 nucleotides in length; the sequence (117) is preferably 10 nucleotides in length; sequence (104) is preferably 6 nucleotides in length; the sequence (102) has pre 'erence 13 nucleotides in length; the sequence (118) is preferably 3 nucleotides in length; the sequence (119) is preferably 3 nucleotides in length; the sequence (108) is preferably 18 nucleotides in length; the sequence (120) is preferably 13 nucleotides in length; the sequence (121) is preferably 6 nucleotides in length; and the sequence (122) is preferably 5 nucleotides in length.
  • FIGS. 1 and 2 illustrate different embodiments of a primer RNA / template RNA complex according to the invention which mimics the initiation complex of the retrotranscription of the genomic RNA of the HIV-1 virus.
  • the sequences of the template RNA more specifically the codon sequence (102) and the primer binding sequence (108), were adapted in order to optimize the base pairings with respectively the "Anti-codon sequences" (101) and primer (107) of the primer RNA, to form the helices (6C) and (7F) respectively.
  • FIG. 1 represents the primer RNA / template RNA complex which has been formed between the primer RNA of sequence SEQ ID No. 3, which is an in vitro transcript, and the template RNA of sequence SEQ ID No. 4.
  • FIG. 2 represents the primer RNA / template RNA complex which has been formed between the primer RNA of sequence SEQ ID No. 1, which is an in vitro transcript, and the template RNA of sequence SEQ ID No. 2.
  • the primer RNA which is obtained by transcription in in vitro, the DNA coding for it, and which is therefore devoid of base having undergone post-transcriptional modifications, forms a stable complex with the corresponding template RNA. It has thus been shown that the primer RNA / stable template RNA complex thus obtained mimics the structural characteristics of the initiation complex of retrotranscription which characterize the complex obtained between the natural tRNA 3 Lys and the region of viral genomic RNA corresponding to l natural primer of tARN 3 Lys . In particular, it has been shown that the primer RNA / template RNA interactions include the pairing between the codon sequence (102) and the anti-codon sequence.
  • a primer RNA / template RNA complex as defined above constitutes an object of the invention.
  • a first complex primer RNA / template RNA according to the invention is the complex formed between: - the primer RNA of sequence SEQ ID No. 1, which does not comprise any base having undergone post-transcriptional modification; and - a template RNA comprising the sequence SEQ ID No. 2.
  • a second primer RNA / template RNA complex preferred according to the invention is the complex formed between: - the RNA primer of sequence SEQ ID No. 3, which does not include any base having undergone post-transcriptional modification; and
  • a template RNA comprising the sequence SEQ ID No. 2 or the sequence SEQ ID No. 4 can have a size of up to 10,000 nucleotides in length.
  • Such a template RNA can for example be obtained according to the method comprising the following steps: a) amplification, for example by PCR, of the DNA sequence of interest of a clone containing a cDNA insert derived from the RNA genomics of the HIV1 virus, said cDNA insert containing the sequence corresponding to the 5 'end of the viral genome.
  • the amplification is advantageously carried out using a pair of nucleotide primers of appropriate sequences, respectively a first primer hybridizing with a sequence of the cDNA insert, which is located downstream (on the 3 'side) of the primer binding sequence (PBS) and a second primer hybridizing with a predetermined sequence of the cDNA insert, which is located upstream (on the 5 'side) of the primer binding sequence (PBS) ).
  • the respective sequences of the first and second primer are chosen so as to produce an amplified DNA, the sequence of which comprises at least the sequences (115) and (122) of the template RNA, which are complementary to each other and whose complementary bases are paired in pairs.
  • the cDNA insert used can be the cDNA insert contained in the infectious molecular clone pHXB2 (His-AC-AGC) described by Li et al. (1997).
  • the first nucleotide primer used comprises the sequence of a promoter which will be located, in the amplified DNA, upstream from the 5 ′ end of the DNA coding the primer RNA, said promoter being functional to allow in vitro transcription of the DNA encoding the template RNA.
  • the promoter can in particular be the T7 promoter, as described in Example 1.
  • the adaptation of the sequence of the template RNA obtained in step a) can be done, for example, by a directed mutagenesis technique, for example using primers carrying the desired mutation and used in PCR amplification.
  • a directed mutagenesis technique for example using primers carrying the desired mutation and used in PCR amplification.
  • Example 1 in vitro transcription of the DNA encoding the template RNA, for example as described in Example 1.
  • a particular embodiment of the process for obtaining a primer RNA above is illustrated in Example 1
  • the template RNA / primer RNA complex is preferably prepared from a primer RNA and a template RNA respectively, according to the technique described by Isel et al. (1993).
  • the preparation of the primer RNA / template RNA complexes as defined above has enabled the applicants to develop a method for in vitro screening of compounds which inhibit the initiation of the retrotranscription of the RNA of an HIV-1 virus. .
  • the availability, in very large quantities, of the primer RNA / template RNA complexes above, prepared using a primer RNA carrying no natural post-transcriptional modification of its bases, made possible the development of a screening process carried out entirely in vitro, which can therefore be implemented quickly, on a very large scale, at low cost, and with great simplicity, since no cell culture is required.
  • the subject of the invention is therefore a method for screening in vitro, compounds which inhibit the initiation of the retrotranscription of the RNA of an HIV-1 virus, characterized in that it comprises the following steps: a) in contact, in a sample: (i) a primer RNA / template RNA complex as described above; with
  • step b) compares the activity measured in step b) with the initiation activity of the retrotranscription measured in a control sample, for which step a) is carried out in the absence of said candidate compound.
  • the above screening method may further comprise the following step: d) selecting the candidate compound for which the retrotranscription initiation activity measured in step b) is less than that measured in the control sample ; e) calculating the inhibitory activity of the candidate compound selected in step d).
  • primer RNA / template RNA complex used in the screening method for inhibitors of the initiation of the retrotranscription of HIV-1 above is that the primer RNA of the complex does not comprise no post-transcriptional modification.
  • the primer RNA of the primer RNA / template RNA complex constitutes the product of the in vitro transcription of a nucleic acid, preferably a DNA encoding the latter.
  • the primer produced by in vitro transcription, can be synthesized from a DNA fragment encoding it, upstream of which is a promoter site for transcription, for example the T7 promoter.
  • the primer RNA of the primer RNA / template RNA complex can be obtained by in vitro transcription of a DNA insert inserted into an expression vector, for example a plasmid, said vector also comprising at least the sequence a transcription promoter under whose control the DNA insert coding for the transfer RNA is placed.
  • the primer RNA can also be obtained by chemical synthesis, according to any technique known to those skilled in the art. For example, the chemical synthesis of a primer RNA included in a primer RNA / template RNA complex according to the invention can be carried out by the techniques described by Micura et al. (2002).
  • the primer RNA can be a semi-synthetic molecule obtained by ordered coupling of several RNA fragments constituting distinct parts of the primer RNA, each RNA fragment being either a product of transcription in vitro d 'DNA encoding said fragment, the final product of a chemical synthesis.
  • the ordered coupling of the different successive RNA fragments in order to synthesize the primer RNA can be carried out by any technique known to those skilled in the art.
  • the template RNA included in the primer RNA / template RNA complex is produced by in vitro transcription of a DNA encoding it, as defined previously in the present description.
  • the DNA encoding the viral template RNA is inserted into an expression vector which also includes at least one transcription promoter sequence under the control of which this DNA is placed, as described in Example 1 .
  • the DNA encoding the template RNA can be obtained by cloning a DNA fragment obtained by amplification, for example by PCR, of the DNA of an infectious viral clone, such as the cloning PHXB2 described by L1. et al. (1997).
  • the “codon sequence” (102) and the PBS primer binding sequence (108) of the template RNA are adapted so as to be complementary respectively to the “anti-codon sequence” (101) and to the primer sequence (107) of the transfer RNA complex Primer RNA / template RNA in order to ensure the formation of the intermolecular helices (6C) and (7F) respectively of the RNA / RNA complex of the invention.
  • the adaptation of the sequence of the viral template RNA to the primer RNA used to form the primer RNA / template RNA complex can be carried out by site-directed mutagenesis, as described for example by WAKEFIELD et al. (1994).
  • the complex between the primer RNA and the template RNA is prepared according to the protocol described by ISEL et al. (1993).
  • the hybridization conditions used to form the primer RNA / template RNA complex are as follows:
  • the primer RNA for example a primer RNA carrying a ligand allowing thereafter the retention of the primer on the surface of a microplate, is incubated for 2 min at 90 ° C., 2 min in ice, then 20 min at 70 ° C, in 100 mM NaCl, in the presence of an excess of template RNA, ensuring total hybridization of the primer.
  • the formation of the primer RNA / template RNA complex can be carried out at 37 ° C. in the presence of the nucleocapsid protein NCp7 according to the technique described by BRULE
  • step a) is carried out in the presence of an appropriate mixture of deoxyribonucleotides triphosphate (dNTPs) and a dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP), which allows the synthesis of a polynucleotide which corresponds exclusively to step initiation of the retrotranscription.
  • dNTPs deoxyribonucleotides triphosphate
  • ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate
  • the appropriate mixture of dNTPs / ddNTP allows the extension of the primer sequence (107) of the primer RNA resulting in the synthesis of a sequence corresponding to the product +6 corresponding to the initiation.
  • step a) is carried out in the presence of only three of the four natural trioxy phosphate deoxyribonucleotides among A, T, G and C, the fourth nucleotide then being a dideoxyribonucleotide triphosphate which is complementary to the nucleotide located in position -6 with respect to the 3 'end of the primer binding sequence (108) on the template RNA.
  • the fourth nucleotide then being a dideoxyribonucleotide triphosphate which is complementary to the nucleotide located in position -6 with respect to the 3 'end of the primer binding sequence (108) on the template RNA.
  • step a) of the method is preferably carried out in the presence of the three deoxyribonucleotides T, G and C to which is added the dideoxyribonucleotide A, which is complementary to ribonucleotide U which is located on the sequence (118) in position - 6 with respect to the 3 'end of the PBS primer binding sequence (108) of the RNA.
  • the same dideoxyribonucleotide A will be added to the three deoxyribonucleotides T, G and C when step a) is carried out with the suitable tRNA Met / vRNA complex represented in FIG.
  • step a) an extension of the primer RNA of the primer RNA / template RNA complex corresponding specifically to the step of initiating the retrotranscription of the viral RNA of the HIV-1 virus.
  • step a) is carried out in the presence of an appropriate mixture of dNTPs and a ddNTP.
  • At least one of the natural deoxyribonucleotides or even the dideoxyribonucleotide used is labeled with a detectable molecule.
  • the detectable molecule is a radioactive molecule chosen from 3 [H], 14 [C], 32 [P] and 33 [P].
  • the above screening method is characterized in that the primer RNA / template RNA complex is immobilized on a support.
  • At least one of the RNAs of the RNA / RNA complex comprises a ligand molecule capable of bind specifically to a receptor molecule present on the surface of the support.
  • the 3 ′ end of the primer RNA of the primer RNA / template RNA complex must remain free to exercise its primer function during the initiation of the retrotranscription.
  • the ligand molecule capable of binding specifically to a receptor molecule on the test support for example the surface of the well of a microplate, can be located on the 5 ′ end of the primer RNA or also on one of the 5 'or 3' ends of the template RNA of the primer RNA / template RNA complex.
  • the primer RNA and / or the template RNA comprises the ligand molecule chemically linked to any of its bases, other than a base of the 5 ′ or 3 ′ end.
  • the ligand molecule is a biotin.
  • a biotinylated base into the primer RNA sequence of the primer RNA / template RNA complex of the invention, it is possible to transcribe the DNA coding for the primer transfer RNA with a reduced concentration. in ribonucleotide UTP and in the presence of the modified ribonucleotide biotin-16-UTP.
  • any other modification of the primer RNA, or of the template RNA constituting the primer RNA / template RNA complex of the invention can be carried out according to techniques known per se.
  • the primer RNA which comprises a ligand molecule.
  • the pairs of ligand / receptor molecules are preferably chosen from:
  • the ligand molecule is a biotin, which is capable of specifically binding to streptavidin.
  • the immobilization of the RNA / RNA-biotin complex can be carried out on a support the surface of which has been previously coated with streptavidin molecules.
  • the method for screening for inhibitors of the initiation of HIV-1 retrotranscription according to the invention is characterized in that step a) is carried out in a reaction vessel, for example the well of a test microplate, the surface of which constitutes an immobilization support for the RNAamorce / RNAmatrice complex.
  • the surface of the reaction chamber for example the well of a microplate, is covered with a receptor molecule capable of specifically binding to a ligand molecule carried by the RNA / RNA complex.
  • a receptor molecule capable of specifically binding to a ligand molecule carried by the RNA / RNA complex.
  • the initiation activity of the retrotranscription is quantified by measuring the radioactivity present in the polynucleotide which is synthesized by extension of the RNA primer hybrid to the RNA matrix within the RNA / RNA complex, in the presence of the reverse transcriptase enzyme and of the dNTPs / ddNTP mixture.
  • the measurement of radioactivity which corresponds to the detection of extension products of the primer transfer RNA, is carried out by using the principle of "proximity scintillation”. »Described in particular in US Pat. No. 4,568,649. According to this principle, only the radioactive molecules located near the surface of the test support, which also includes a product for detecting radioactivity by scintillation, generates the production of a scintillation signal.
  • the radioactive molecules inducing the scintillation signal are the deoxyribonucleotides or radioactive dideoxyribonucleotides incorporated into the primer RNA by extending the primer sequence (107) which are located near the surface of the test support, for example the surface of the microplate well.
  • radioactive deoxyribonucleotides or dideoxyribonucleotides which have not been incorporated into the transfer RNA by extension of the primer sequence (107) do not generate any detectable signal.
  • This principle of proximity scintillation on suitable test microplates has been used in particular by EARNSHAW and POPE (2001), to which a person skilled in the art can advantageously refer to the implementation of the inhibitor screening method according to the invention .
  • the RNA primer / template RNA complex comprises, respectively, the primer RNA of sequence SEQ ID No. 1, and the template RNA comprising the sequence SEQ ID No. 2.
  • the primer RNA / template RNA complex comprises the primer RNA of sequence SEQ ID No. 3 and the template RNA respectively comprising the sequence SEQ ID N ° 4.
  • a nucleoside inhibitor of retrotranscription such as AZTTP is capable of inhibiting the initiation of retrotranscription of the HIV-1 virus, with increased efficiency for increasing concentrations of this inhibitor compound.
  • the results of the examples show that the values of inhibition of the step of initiating the retrotranscription obtained are in accordance with the expected theoretical values and that the screening method as defined above makes it possible to detect the synthesis of a primer RNA extension product corresponding to the initiation of HIV-1 retrotranscription and also makes it possible to measure the inhibition of l initiation of HIV-1 retrotranscription.
  • the method for screening for inhibitors of HIV-1 retrotranscription as defined above is implemented with increasing concentrations of a candidate compound to be tested.
  • the comparison of the level of activity of initiation of the retrotranscription measured in step b) with the level of activity of initiation of the retrotranscription measured in the absence of the inhibiting candidate compound is carried out by the introduction , in the same test, of a control sample comprising the primer RNA / template RNA complex, the reverse transcriptase enzyme and a mixture of dNTPs and a ddNTP which is identical to that used for the other samples of the test.
  • the comparison carried out in step c) of the method is carried out with respect to a known value of the activity level of the initiation of the retrotranscription in a control sample in the absence of the candidate compound to be tested.
  • the screening method according to the invention also comprises positive control samples in which known final concentrations of a known inhibitor, such as AZTTP, have been added to the combination of the primer RNA / template RNA complex of invention and reverse transcriptase.
  • a candidate compound which has been selected as an inhibitor compound according to the screening method above has an exclusive and selective inhibitory activity of the only step of initiating the retrotranscription of the HIV-1 virus.
  • said the process can also comprise the following steps: f) bringing into contact, in a sample:
  • nucleotide primer for mimicking the elongation step which is complementary to a sequence of viral RNA, preferably complementary to the PBS sequence of viral RNA.
  • a reverse transcriptase of VI H-1 a reverse transcriptase of VI H-1;
  • step a) (iii) the dNTPs / ddNTP mixture used in step a) in the presence of the candidate compound tested in step a); g) measuring the elongation activity of the nucleotide primer; h) comparing the activity measured in step g) with the elongation activity measured in a control sample, for which step f) is carried out in the absence of the candidate compound; i) determining the inhibitory activity of the candidate compound from the activity comparison carried out in step h); j) compare the inhibitory activity of the same candidate compound determined in step e) with the inhibitory activity of the same compound determined in step i).
  • step i) If, in step i), the comparison shows that the inhibitory activities of the candidate compound, respectively in step e) and in step i) are of the same order of magnitude, said candidate compound can be classified as a compound inhibitor of the initiation step of retrotranscription of the HIV-1 virus, but not specific to this initiation step. If, in step i), the comparison shows that the inhibiting activity of the candidate compound in step e) is greater than the inhibiting activity measured in step i) or alternatively that the candidate compound does not have d inhibitory activity in step i), said candidate compound can be classified as a specific inhibitor compound in the step of initiating the retrotranscription of the HIV-1 virus.
  • a subject of the invention is also the use of a primer RNA / template RNA complex as defined above in a method for screening for compounds that inhibit the initiation of the retrotranscription of the RNA of an HIV virus.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the screening of compounds which inhibit the initiation of the retrotranscription of the RNA of an HIV-1 virus, characterized in that it comprises a primer RNA / template RNA complex as defined above.
  • the above screening kit or kit is characterized in that it comprises a reverse transcriptase enzyme, preferably an HIV-1 reverse transcriptase enzyme.
  • the above screening kit or kit is characterized in that it comprises an appropriate mixture of dNTPs and a ddNTP allowing the synthesis of a polynucleotide produced by lengthening of the priming RNA during the retrotranscription initiation step.
  • At least one of the deoxyribonucleotides contained in the screening kit or kit of the invention is labeled with a detectable molecule, preferably a radioactive molecule chosen from 3 [H], 14 [C ], 32 [P] and 33 [P].
  • a detectable molecule preferably a radioactive molecule chosen from 3 [H], 14 [C ], 32 [P] and 33 [P].
  • Example 1 Formation of a primer RNA / matrix RNA complex mimicking, in vitro, and structure of the initiation complex for retrotranscription of HIV-1.
  • a primer RNA / template RNA complex mimicking the HIV-1 retrotranscription initiation complex can be formed in vitro from a transcript of Hls tRNA hybridized to its “adapted” vRNA (vRNA [His-AC-GAC] ).
  • the plasmid comprising the sequence coding for the Hls tRNA, pltRNA Hls , was obtained by insertion, into the EcoRI and Xmal sites of Puc18, of a DNA fragment corresponding to the sequence of the Hls tRNA and having, upstream, the promoter site for phage T7 RNA polymerase. This fragment was created by hybridization and ligation of suitable oligodeoxyribonucleotides.
  • the Hls tRNA transcript was obtained by in vitro transcription of the vector pItRNAHis previously digested with the restriction enzyme Nsil.
  • the primer tRNA produced by in vitro transcription can carry a modification allowing, during the retrotranscription test, the retention of the template / primer complex extended on a support carrying a ligand of this modification.
  • the modification may be a biotin or any other ligand or reagent allowing covalent or non-covalent anchoring for attachment of the complex to a solid support.
  • a variety of methods can be considered for the modification of RNA (see for example (Hermanson, 1996)).
  • biotinilated Hls tRNA primer the biotinilation being carried out during transcription in the presence of 40 mM Tris HCI, pH8 (37 ° C), 15 mM MgCI 2 , 50 mM NaCI, 1.6 mM spermidine, 50 U RNAsin, 5 mM DTE, 4 mM ATP, 4mM CTP, 4 mM GTP, 2.5 mM UTP, 0.4 mM biotin-16-UTP, 22.5 U of T7 RNA Polymerase.
  • biotin-16-UTP is omitted and the concentration of UTP is reduced to 4 mM.
  • the plasmid DNA is digested in the presence of DNAse I and the transcripts are purified on HPLC columns.
  • the adapted vRNA [His-AC-GAC] used in our tests corresponds to the first 295 nucleotides of the 5 'end of the HxB2 isolate of HIV-1 and contains mutations making it possible to form the characteristic structure of initiation.
  • retrotranscription (Fig. 1): the PBS site is mutated to be complementary to the 18 nucleotides of the 3 'end of the Hls tRNA; the nucleotides of the A-rich region upstream of the PBS site are mutated so as to be complementary to the loop of the Hls tRNA anticodon ; other nucleotides around the PBS are mutated, thus increasing the complementarity with the Hls tRNA (Zhang et al., 1998).
  • the plasmid plHis-AC-AGC comprising the sequences coding for the adapted vRNA [His-AC-AGC] was constructed by insertion, in the EcoRI and Xmal sites of the vector Puc18, of a DNA fragment obtained by PCR at from the infectious molecular clone pHXB2 (His-AC-AGC) (Li et al., 1997), supplied by Dr C. Morrow (Birmimgham, USA), and comprising, before the transcription start site, the promoter T7.
  • the PCR primers were designed to amplify the region corresponding to the 732 nucleotides of the 5 'end of the vRNA [His-AC-AGC].
  • the first 295 nucleotides of the vRNA [His-AC-AGC] were obtained by in vitro transcription of the vector plHis-AC-AGC, previously digested with Rsal, according to the protocol previously described. and (Marquet et al., 1991). The RNA was purified as previously described.
  • the Hls tRNA is labeled at its 5 ′ end.
  • the Hls tRNA (15 ⁇ g) is incubated for 30 minutes at 37 ° C. in the CIP buffer (Calf Intestinal Phosphatase), in the presence of 15 U of CIP. After phenolic extraction and precipitation, the tRNA is purified on a denaturing polyacrylamide gel. The tRNA is then labeled at its 5 ′ end by transfer of the radioactive phosphate from [ ⁇ ⁇ ATP. The tRNA (3 ⁇ g) is incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the template / primer complex is prepared as described below and according to previously published protocols (Isel et al, 1993).
  • the formation of the complex can be done at 37 ° C., in the presence of the nucleocapsid protein, NCp7 (Brûlé et al., 2002).
  • [His-AC-AGC] with the aid of nuclease S1 is carried out according to the following protocol: 100,000 cpm of Hls tRNA labeled at its 5 ′ end with [f 2 P] are incubated in the absence or in the presence of 12 pmoles of vRNA [His-AC-AGC] for 2 min at 90 ° C, then 2 min in ice.
  • RNAs are then incubated for 20 min at 70 ° C in 50 mM Sodium Cacodylate (pH 7.5), 300 mM KCI, then the complex is brought to room temperature for 5 minutes, in 50 mM Sodium Cacodylate (pH 7.5), 300 mM KCI, 5 mM MgCI 2 , 1 mM ZnCI 2 .
  • the Hls tRNA, free and supplemented with 1 ⁇ g of tRNAtotal, or hybridized with the RNA [His-AC-AGC] is then incubated in the absence or in the presence of 200U of nuclease S1, for 7.5 or 15 minutes at 37 ° vs. The reaction is stopped by digestion of nuclease S1 with 20 ⁇ g of proteinase K, for 30 76689
  • RNAs are precipitated with ethanol, centrifuged and separated by electrophoresis on 15% denaturing polyacrylamide gel.
  • the tRNA Hls transcript devoid of modified bases, allows the formation of a stable complex which mimics the structural specificities of the initiation complex of the retrotranscription obtained with the natural tARN3 Lys and its complementary vRNA .
  • the loop of the Hls tRNA transcript anticodon reactive to nuclease S1 in the absence of a template, is protected in the presence of the vRNA [His-AC-GAC], suggesting an interaction with the CCACAA loop of this RNA (Fig. 1 and 3).
  • the protection of the anticodon zone of the primer at nuclease S1 constitutes one of the signatures of the initiation complex and represents one of the essential controls indicating that the matrix / primer interactions are not limited to the PBS region.
  • the template / primer complex formed in vitro, and where the anticodon region of the primer interacts with a region of template RNA upstream of the PBS site, must be tested for its ability to meet the criteria of the initiation reaction. / extension of the retrotranscription as defined by the authors (Isel et al., 1996, Lanchy et al., 1996, Lanchy et al., 1998).
  • Example 2 A lvis vRNA matrix-AC-GACI / Hls tRNA primer complex has the functional characteristics of a retrotranscription initiation complex
  • the primers tRNA Hls and ODNH B must be radioactively labeled.
  • the Hls tRNA is labeled according to the protocol described above.
  • the ODNms is labeled by transfer of the radioactive phosphate from [- 32 ] ATP according to the following protocol: 0.1 nmole of ODNms are incubated for 1 hour at 37 ° C. in the kinase buffer, in the presence of 100 ⁇ Ci of [- 32 ] ATP and 15 U of phage T4 polynucleotide kinase before being purified on denaturing polyacrylamide gel.
  • the retrotranscription reaction is initiated by the addition of 50 ⁇ M of each dNTP and stopped at different times, from 15 seconds to 30 minutes, in the presence of 90 mM Tris-Borate pH 8.3, 25 mM EDTA.
  • the reaction products are separated by electrophoresis on an 8% denaturing polyacrylamide gel.
  • the functional study of the initiation complex by comparing the DNA synthesis profiles of strong-stop (-) DNA obtained in the presence of a tRNA primer or an oligodeoxyribonucleotide primer constitutes the functional control which makes it possible to validate a complex.
  • matrix / primer as mime of the natural retrotranscription complex.
  • Example 3 Initiation as a Target in a High-Flow Screening Test
  • the matrix / primer complexes described above and mimicking the specific retrotranscription initiation complex can be used in a high-flow screening test for inhibitors of the retrotranscription, specifically targeting this initiation step.
  • AC-GAC] / primer HRNA H s biotinilized is pre-formed according to the protocol described above and (Isel et al., 1993). Alternatively, the formation of the complex can be done at 37 ° C., in the presence of the nucleocapsid protein, NCp7 (Brûle et al., 2002).
  • the complex in an appropriate retrotranscription buffer (Tris-HCI 50 mM pH 7.5; KCI 50 mM; MgCI 2 6 mM; DTE 1 mM and (Isel et al., 1996)), is then transferred to the wells. a microplate (for example “Flashpiate”, NEN).
  • 10 nM of template / primer complex are lengthened by the RT of HIV-1, wild or mutated in its RNase H site, in the presence of 5 ⁇ M of each dNTP (dGTP, dCTP, dATP and dTTP / dTTP [ 3 H] (Specific activity: 121 Ci / mmol; Amersham)), in the absence or in the presence of retrotranscription inhibitors (AZTTP or d4TTP in the examples of Fig. 6 ), for 5, 15 and 30 minutes at 37 ° C.
  • dNTP dGTP, dCTP, dATP and dTTP / dTTP [ 3 H]
  • retrotranscription inhibitors AZTTP or d4TTP in the examples of Fig. 6
  • Table I Comparison between the expected theoretical signals and the experimental signals during the synthesis of a product corresponding to the initiation of retrotranscription.
  • the expected theoretical signal is calculated as a function of the ratio of the concentrations of AZTTP and dTTP present in the reaction medium and of the selectivity of incorporation of AZTTP with respect to dTTP (measured in initiation and in elongation (Rigourd et al., 2000)).
  • KANG KANG, SM, ZJ ZHANG, and CD. MORROW 1997. Identification of a sequence within U5 required for human immunodeficiency virus type 1 to stably maintain a primer binding site complementary to tRNA Met J. Virol.
  • SKRIPKIN E et al. 1996, Nucleic acids Research, vol. 24: 509-514.
  • Nucleotide sequences within the U5 region of the viral RNA genome are the major determinants for an human immunodeficiency virus type 1 to maintain a primer binding site complementary to tRNA (His) Virology, 226: 306-317.

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Abstract

L'invention concerne des procédés permettant de sélectionner des composés capables d'inhiber le déroulement d'une étape précoce de l'infection de l'organisme par le virus VIH-1, à savoir l'étape d'initiation de la rétrotranscription du génome viral, préalable à l'intégration des séquences virales dans le génome cellulaire de l'organisme hôte infecté.

Description

PROCEDE DE CRIBLAGE DE COMPOSES INHIBITEURS DE L'INITIATION DE LA RETROTRANSCRIPTION DE L'ARN D'UN VIRUS VlH-1 ET MOYENS DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine du traitement préventif ou curatif à l'égard des pathologies provoquées par une infection de l'homme par le virus VIH-1.
Elle a trait à des procédés permettant de sélectionner des composés capables d'inhiber le déroulement d'une étape précoce de l'infection de l'organisme par le virus VIH-1 , à savoir l'étape d'initiation de la retrotranscription du génome viral, préalable à l'intégration des séquences virales dans le génome cellulaire de l'organisme hôte infecté.
ART ANTERIEUR
Vingt ans après les premiers diagnostics du syndrome de l'immunodéficiβnce humaine acquise, le SIDA est devenu la maladie la plus dévastatrice au niveau mondial, puisqu'on estime à environ 42 millions le nombre de personnes infectées par les virus VIH à ce jour. Durant la seule année 2002, plus de 3 millions de personnes ont contracté le virus, tandis que 3 millions sont décédés de la maladie. Depuis la découverte, en 1983, du principal agent responsable du SIDA, le virus VIH-1 , des efforts considérables ont été déployés pour comprendre les mécanismes d'action du virus et développer des moyens préventifs et rechercher des moyens curatifs à encontre de la maladie.
Aujourd'hui, les composés anti-VIH utilisés en thérapie ciblent principalement deux enzymes jouant un rôle clé dans le cycle réplicatif du virus, respectivement la protéase et la rétrotranscriptase virales. A ce jour, sept composés inhibiteurs de protéase sont couramment utilisés en thérapie et d'autres molécules dirigées contre la protéase sont en cours d'essais cliniques. De même, dix composés inhibiteurs de la rétrotranscriptase virale sont aujourd'hui utilisés couramment en thérapie, respectivement sept inhibiteurs nucléosidiques et trois inhibiteurs non nucléosidiques, d'autres inhibiteurs de la rétrotranscriptase étant actuellement en cours d'essais cliniques. Des essais préliminaires ont aussi été réalisés avec des inhibiteurs actifs à différents stades de l'infection par le VIH, notamment avec des inhibiteurs de la fusion virus-cellule, des inhibiteurs des doigts de zinc de la protéine de nucléocapside et des inhibiteurs de l'intégrase. Le traitement d'infections par le virus VIH-1 est réalisé aujourd'hui sous la forme de multi-thérapies ou HAART (pour « Highly Active Anti- retroviral Therapy » ). Dans les multi-thérapies, on combine en général un inhibiteur de protéase et deux inhibiteurs de rétrotranscriptase. Ces cocktails d'inhibiteurs retardent considérablement la progression de la maladie et améliorent la vie des malades sur une longue période de temps .
Toutefois, les multi-thérapies actuelles ne permettent pas une éradication totale du virus de l'organisme des personnes infectées. Une des difficultés majeures rencontrée est l'émergence rapide de souches de virus résistants qui accumulent des mutations de résistance dans les gènes codant pour la protéase et/ou la rétrotranscriptase. La résistance aux inhibiteurs de protéase s'exprime essentiellement par l'apparition de mutations dans le site actif de l'enzyme. La résistance aux inhibiteurs analogues non nucléosidiques de la rétrotranscriptase est due à l'apparition de mutations dans la poche hydrophobe qui fixe ces inhibiteurs. La résistance aux inhibiteurs nucléosidiques de la rétrotranscriptase est due à l'apparition de mutations localisées dans les doigts et la paume de l'enzyme.
Il existe donc un besoin dans l'état de la technique d'améliorer l'efficacité des traitements anti-SIDA actuels. En particulier, il serait hautement important de compléter l'arsenal actuel de composés antiviraux afin de mettre au point de nouvelles compositions utilisables notamment dans des multi-thérapies, capables de conserver une bonne efficacité anti-virale lors de l'apparition de souches virales mutantes résistantes à un ou plusieurs des composés anti-viraux déjà utilisés.
Notamment, l'efficacité thérapeutique anti-SIDA de compositions pharmaceutiques préventives ou curatives pourrait être accrue par la mise en œuvre de composés actifs à encontre d'autres cibles que les seules protéase et rétrotranscriptase du VIH. SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention fournit des procédés pour le criblage de composés utiles dans le cadre d'une thérapie anti-SIDA, et plus spécifiquement de composés actifs pour inhiber ou bloquer une étape précoce de l'infection d'un organisme hôte par le virus VIH-1 , l'étape de retrotranscription .
Plus spécifiquement, l'invention est relative à des procédés de criblage de composés capables d'inhiber la première étape de mise en place de la retrotranscription de l'ARN génomique viral, à savoir l'étape d'initiation de la retrotranscription.
L'invention fournit les moyens de mise en œuvre de tels procédés de criblage sous la forme de complexes ARN/ARN entre un ARN amorce et un ARN matrice, dans lequel l'ARN amorce ne comprend pas de modification post-transcriptionnelle des bases qui le constituent. L'invention est également relative à des trousses ou kits de criblage de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1 comprenant un complexe ARN amorce/ARN matrice tel que défini ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Mo èle de structure secondaire du complexe tARNMet/ARMv rϋet-ACl.
Figure 1A : Séquences correspondant aux nucléotides 131 à 205 de l'isolât Hxb2 de l'ARN génomique du VIH-1 sauvage et adapté. L'ARNv adapté [Met-AC] possède une séquence PBS complémentaire aux 18 nucléotides de l'extrémité 3' du tARN et, une séquence en amont du PBS complémentaire à la boucle de l'anticodon du tARNMet et des mutations supplémentaires (encerclées) apparues après culture cellulaire prolongée.
Figure 1 B : Structure secondaire du complexe.
L'ARNv [Met-AC] est en noir, le tARNMet en blanc sur fond noir.
L'interaction entre la boucle de l'anticodon du tARNMet et la région complémentaire de l'ARNv, en amont du PBS, correspond à l'hélice 6C et celle de l'extrémité 3' du tARNMet avec le PBS forme l'hélice 7F. Les autres interactions intermoléculaires correspondent aux hélices 3E et 5D. Les nucléotides encerclés correspondent aux mutations apparues après culture cellulaire prolongée.
Figure 2 : Modèle de structure secondaire du complexe tARNHis/ARNv THis-AC-GACI.
Figure 2A : Séquences correspondant aux nucléotides 131 à 205 de l'isolât Hxb2 de l'ARN génomique du VIH-1 sauvage (ligne supérieure) et adapté ligne inférieure). L'ARNv adapté [His-AC-GAC] possède une séquence PBS complémentaire aux 18 nucléotides de l'extrémité 3' du tARNHis, une séquence CCACAA en amont du PBS complémentaire à la boucle de l'anticodon du tARNHls et des mutations supplémentaires (encerclées) apparues après culture cellulaire prolongée.
Figure 2B : structure secondaire du complexe L'ARNv [His-AC-GAC] est en noir, le tARNHis en blanc sur fond noir. L'interaction entre la boucle de l'anticodon du tARNHls et la région complémentaire de l'ARNv, en amont du PBS, correspond à l'hélice 6C et celle de l'extrémité 3' du tARNHls avec le PBS forme l'hélice 7F. Les nucléotides encerclés correspondent aux mutations apparues après culture prolongée.
Figure 3 : Cartographie à la nucléase S1 des régions simple brin du tARNHis libre ( les 3 pistes à gauche) ou hybride à l'ARNv THis-AC- GACI (les trois pistes suivantes).
Les pistes 0 sont des contrôles d'incubation en absence de nucléase S1 tandis que les pistes 7.5 et 15 correspondent à des incubations de 7.5 et 15 minutes respectivement, en présence de 200 U de nucléase S1.
Les pistes T1 et L (à l'extrême droite de la Figure) correspondent respectivement à un séquençage à la RNase T1 et à une échelle obtenue par hydrolyse alcaline. Figure 4 : Synthèse d'ADN « strong-stop » (-) à partir du tARNHls naturel ou synthétique.
Dix nM de complexe matrice/amorce sont incubés en présence de 27 n de rétrotranscriptase (RT) du VIH-1. La réaction est initiée par l'ajout de 1 μl de [ -32P] dCTP (3000 Ci/mmole), 15 μM de dCTP et 150 μM de chacun des trois autres dNTP. Les temps de réaction sont de 5,
10, 15, 20, 25 et 30 min.
Figure 5 : Cinétigues d'extension des amorces tARNHls et ODNHJS en présence de l'ARNv [Ηis-AC-GACI.
Figure 5A : Synthèse de l'ADN strong-stop (-) à partir du tARNHis, en absence ou en présence d'un piège, poly(rA)/oligo(dT)i8, ne permettant qu'un seul cycle de polymérisation. Deux nM de complexe matrice/amorce sont incubés en présence de 20 nM de RT du VIH-1 et la réaction de polymérisation est initiée par l'addition de 50 μM de chaque dNTP, en absence ou en présence de 1.66 μM de poly(rA)/oligo(dT)ι8 . La réaction est arrêtée à des temps variables entre 15 secondes et 30 minutes. Figure 5B : Synthèse de l'ADN strong-stop (-) à partir de I'ODNHIS, en absence ou en présence d'un piège, poly(rA)/oligo(dT)i8 ne permettant qu'un seul cycle de polymérisation.
L'ODNHIS a la séquence SEQ ID n°5 suivante : 5'-ATCCGAGTCACGGCACCA-3' Dix nM de complexe matrice/amorce sont incubés en présence de
30 nM de RT du VIH-1 et la réaction de polymérisation est initiée par l'addition de 50 μM de chaque dNTP, en absence ou en présence de 1.66 μM de poly(rA)/oligo(dT)ι8. La réaction est arrêtée à des temps variables entre 15 secondes et 30 minutes. Figure 6 : Synthèse d'ADN strong-stop (-) à partir du complexe ARNv [His-AC-GAC]/tARNHis biotinilé, en présence de concentrations croissantes en AZTTP (de 0.1 à 5 μM) (Figure 6A) et en d4TTP (de 0.1 à 5 μM) (Figure 6B).
Dix nM de complexe ARNv [His-AC-GAC]/tARNHis préformé sont transférés dans les puits d'une microplaque de type « Flashpiate » (NEN) et incubés en présence de 5 μM de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP /dTTP[3H]), de 30 nM de RT du VIH-1 et en absence ou en présence d'inhibiteurs nucléosidiques. La réaction a lieu à 37°C pendant 5, 15 ou 30 minutes avant d'être arrêtée en présence de 25 mM d'EDTA. La radioactivité liée à la surface de chaque puits d'une microplaque est comptée dans un compteur MicroBeta (Wallac-Perkin-Elmer) selon la technique de scintillation de proximité (SPA).
En abscisses, les concentrations d'AZTTP, exprimées en μMoles par litre ; en ordonnées, le signal de scintillation, exprimé en cpm .
Figure 7 : Synthèse d'un produit correspondant à l'initiation de la retrotranscription à partir du complexe ARNv lΗis-AC-GAC1/tARNHls biotinylé.
Trente nM de complexe matrice/amorce préformé sont transférés dans les puits d'une microplaque de type « Flasplate » (NEN) et incubés en présence de dGTP, dCTP, dTTP/dTTP[3H] (5μM final chacun), de ddA (20 μM), de 90 nM de RT du VIH-1, en absence ou en présence d'AZTTP. La réaction a lieu à 37°C pendant 20 minutes avant d'être arrêtée en présence de 25 mM d'EDTA. La synthèse d'un produit correspondant à l'addition de 6 nucléotides à l'amorce est détectable par la technique de scintillation de proximité (SPA) sur un compteur de type
MicroBeta. On mesure une diminution du signal en présence de 0.1 et
2.5 μM d'AZTTP. Les chiffres en gras et en italique au-dessus des histogrammes correspondent au pourcentage de signal résiduel par rapport au contrôle sans inhibiteur.
En abscisses, les concentrations d'AZTTP, exprimées en μMoles par litre ; en ordonnées, le signal de scintillation, exprimé en cpm
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention fournit des procédés de criblage de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1. La mise au point des procédés de criblage selon l'invention a été rendue possible grâce à la préparation de nouveaux complexes ARN/ARN capables de mimer le complexe naturel d'initiation de la retrotranscription, qui est formé après l'entrée du virus VIH-1 dans la cellule.
La retrotranscription est une étape clé du cycle réplicatif des rétrovirus, y compris les VIH, en particulier les VIH-1. La première étape dans le cycle de retrotranscription est la synthèse d'un brin d'ADN, appelé ADN strong-stop (-).
La synthèse du brin d'ADN strong-stop (-) est réalisée par l'élongation de l'isoaccepteur 3 de l'ARN de transfert spécifique de la lysine (tARN3Lys) d'origine cellulaire, à partir de la matrice constituée de l'ARN génomique viral. Les dix-huit nucléotides localisés à l'extrémité 3' du tARN3 Lys sont strictement complémentaires de la séquence de liaison à l'amorce (PBS) de l'ARN génomique du VIH-1 , localisée à proximité de l'extrémité 5' du génome viral. A partir du complexe ARN/ARN d'initiation de la retrotranscription formé entre le tARN3 Lys et l'ARN génomique viral, la transcriptase inverse du VIH-1 utilise le groupement 3'-OH du tARN amorce hybride à l'ARN génomique viral pour débuter la synthèse du brin (-) d'ADN strong-stop.
Dans l'état de la technique, on a montré que le complexe ARN viral/tARN3 Lys) d'initiation de la retrotranscription du VIH-1 possède des caractéristiques structurales et fonctionnelles spécifiques. Par cartographie chimique et enzymatique en solution, on a montré que l'interaction entre le tARN3Lys et l'ARN génomique viral ne se limite pas aux dix huit nucléotides de la séquence de liaison à l'amorce (PBS), mais s'accompagne de divers réarrangements structuraux intra- et inter- moléculaires, permettant la formation d'une structure compacte très complexe (ISEL et al., 1995 ; ISEL et al. 1996).
Parmi les interactions intermoléculaires, l'appariement entre la boucle riche en A de l'ARN viral et la boucle de l'anticodon du tARN3 Lys joue un rôle primordial dans la stabilisation de la structure du complexe d'initiation de la retrotranscription. Il a été montré notamment que la stabilisation des interactions additionnelles est fortement dépendante de la présence des bases modifiées par modification post-transcriptionnelle intracellulaire de l'ARN de transfert naturel (Isel et al., 1996 ; Isel et al., 1993, Skripkin et al., 1996). A la spécificité structurale du complexe d'initiation de la retrotranscription du VIH-1 correspond une spécificité fonctionnelle . Des études cinétiques ont montré que la synthèse du brin (-) d'ADN strong- stop comprend deux étapes : 1) une étape d'initiation, spécifique au tARN3 Lys, qui correspond à l'addition des six premiers nucléotides à l'extrémité 3' de l'amorce naturelle, cette étape d'initiation étant suivie (2) d'une étape d'élongation non spécifique, qui peut être mimée par une amorce ADN de 18 nucléotides strictement complémentaire au PBS. (Isel et al., 1996 ; Lanchy et al., 1996). On a aussi montré que l'étape d'initiation de la retrotranscription est distributive ; elle est caractérisée par une vitesse faible d'incorporation d'un nucléotide et une vitesse haute de dissociation de la transcriptase inverse du complexe matrice/amorce (ARN viral/tARN3Lys) (Lanchy et al., 1996). A l'inverse, l'étape d'élongation, correspondant à l'addition des nucléotides subséquents à partir d'une amorce devenue une amorce oligodésoxyribonucléotidique non spécifique, est processive ; elle est caractérisée par une haute vitesse d'incorporation des nucléotides et une vitesse basse de dissociation de la transcriptase inverse (Lanchy et al., 1996 ; Lanchy et al., 1998). De même, Isel et al. (1996) constatent que les nucléosides modifiés par modifications post-transcriptionnelles intracellulaires de l'ARN de transfert naturel sont requis pour la mise en place d'une étape d'initiation de la retrotranscription efficace en augmentant l'affinité de la rétrotranscriptase du VIH-1 pour le complexe binaire tARN3 Lys/ARN (Isel et al., 1996 ; Lanchy et al., 1996 ; Isel et al., 1993 ; Isel et al., 1999). Il a également été montré que les interactions additionnelles matrice/amorce facilitent la transition de l'étape d'initiation vers l'étape d'élongation.
De même, les résultats expérimentaux obtenus par Lanchy et al. (1996) indiquent que les modifications intracellulaires post- transcriptionnelles de l'ARN de transfert sont requises pour la formation d'un complexe d'initiation stable et actif. Les résultats obtenus montrent que les vitesses d'extension de l'amorce obtenue avec le tARN3 ys naturel purifié sont d'environ 32 à 35 fois plus grande que la vitesse d'extension de l'amorce obtenue avec le tARN3 Lys transcrit in vitro, lequel ne comprend aucune modification post-transcriptionnelle et ne comprend en conséquence aucune base modifiée. Ces auteurs concluent que l'ARN de transfert qui ne comprend pas de base modifiée n'est pas reconnu spécifiquement comme une amorce par la transcriptase inverse du VIH-1. Selon ces auteurs, les bases modifiées par modification post- transcriptionnelle de l'ARN de transfert cellulaire naturel sont impliquées dans la formation du complexe d'initiation et sont susceptibles d'ancrer la transcriptase inverse du HIV-1 au complexe ARNt amorce/ARN viral matrice, ce qui explique la perte de spécificité de la transcriptase inverse qui est observée en présence d'un ARNt synthétique ne comportant aucune base modifiée.
Ainsi, il a été reconnu que les modifications post- transcriptionnelles de l'ARN de transfert pour la lysine stabilisent les interactions amorce/matrice au sein du complexe d'initiation de la retrotranscription (Isel et al., 1993). L'utilisation d'un ARN de transfert 1ARN3 Lys ne comportant pas les bases modifiées par modifications post- transcriptionnelles ne permet pas l'obtention d'un complexe amorce/matrice stable. Les auteurs soulignent l'importance d'utiliser un ARN de transfert naturel purifié afin de former un complexe d'initiation de la retrotranscription stable et actif. De même, Isel et al. (1996) constatent que les nucléosides modifiés par modifications posl-transcriptionnelles intracellulaires de l'ARN de transfert naturel sont requis pour la mise en place d'une étape d'initiation de la retrotranscription efficace, et pour une bonne transition de l'étape d'initiation vers l'étape d'élongation. L'importance fonctionnelle de l'interaction entre la boucle de l'anticodon du tARN3 Lys et la bouche riche en A a été démontrée in vivo . En effet, des virus mutés, ne possédant plus cette complémentarité, présentent des défauts de réplication et restaurent progressivement la boucle des A en culture prlongée (Huang, et al., 1996. Liang et al. 1997). Enfin, des variants du virus HIV-1 dont le PBS a été mute afin d'être compatible aux tARNHls ou tARNMet utilisent de façon stable ces tARN, à condition que la boucle A ait été mutée simultanément de façon à être complémentaire à l'anticodon de ces tARN (Kang et al., 1997. Wakefield et al. 1998). L'analyse des mutants utilisant de façon stable le tARNHls a montré qu'ils contiennent, en plus des mutations dans le PBS et la boucle A (Zhang et al., 1996), trois mutations secondaires dans U5, en amont du PBS, apparues lors de cultures prolongées et impliquées dans le maintien du tARNHls comme amorce (Zhang et al., 1998).
Or, de manière surprenante, on a montré selon l'invention, qu'un complexe ARN amorce/ARN matrice virale mimant le complexe d'initiation de la retrotranscription du virus VIH-1 pouvait être obtenu entre un ARN matrice viral et un ARN amorce ne comportant aucune modification post-transcriptionnelle.
Ainsi, le demandeur a pu former un complexe ARN amorce/ARN matrice viral entre un ARN de transfert pour l'histidine (ARNthls) obtenu par transcription in vitro et un ARN viral dont la séquence a été adaptée afin d'être complémentaire de l'ARNthls au niveau de la séquence codon et au niveau de la séquence de liaison à l'amorce (PBS), l'ARNt ls ne comportant aucune base possédant une modification chimique identique à une modification post-transcriptionnelle naturelle.
Le complexe ARN amorce/ARN matrice virale ci-dessus est stable et permet d'allonger efficacement l'ARN amorce (l'ARNthls sans base modifiée), selon le modèle initiation/élongation défini précédemment, comme représenté sur la figure 4. De même, le demandeur décrit un complexe ARNamorce/ARN matrice avec un ARN de transfert pour la méthionine (ARNtMet) obtenu par transcription in vitro et un ARN viral dont la séquence a été adaptée afin d'être complémentaire de l'ARNtMet au niveau de la séquence codon et au niveau de la séquence de liaison à l'amorce (PBS). Les résultats expérimentaux présentés dans les exemples montrent que, de manière surprenante, certains ARNs de transfert amorce obtenus par simple transcription in vitro de l'ADN codant ce dernier, et n'ayant en conséquence subi aucune modification post- transcriptionnelle de leurs bases, sont capables de former un complexe ARN amorce/ARN matrice avec un ARN matrice viral dont la séquence a été adaptée (i) au niveau de la séquence de l'ARN viral qui est complémentaire à la séquence anti-codon de l'amorce (aussi appelée « séquence codon » dans la suite de la description) et (ii) de la séquence de liaison à l'amorce (PBS). Il est aussi montré que, en présence d'une transcriptase inverse, le complexe ARN amorce/ARN matrice viral est biologiquement actif et est capable de mimer les étapes d'initiation puis d'élongation de la retrotranscription du génome viral de VIH-1.
Grâce à l'invention, il est désormais possible de produire en grandes quantités des complexes ARN amorce/ARN matrice viral mimant le complexe d'initiation de la retrotranscription du VIH-1. En effet, la synthèse d'un ARN amorce ne comportant pas de modification post- transcriptionnelle peut être réalisée en grandes quantités et à moindre coût, par exemple par simple transcription in vitro d'un ADN codant ledit ARN amorce. En effet, comme déjà indiqué ci-dessus, les complexes stables et actifs d'initiation de la transcription du VIH-1 étaient formés, dans l'état de la technique, à partir d'un ARN de transfert naturel, obtenu selon des procédés de purification longs, complexes et hautement onéreux, notamment à partir de foie de bœuf ou de poulet.
L'accessibilité, grâce à l'invention, de grandes quantités de complexes ARN amorce/ARN matrice viral ne comportant aucune modification post-transcriptionnelle et mimant l'activité du complexe d'initiation naturel de la retrotranscription du VIH-1 rend enfin possible l'utilisation de ces complexes ARN amorce/ARN matrice viral pour sélectionner à grande échelle des composés inhibant l'activité du complexe d'initiation naturel du VIH-1.
On a en effet montré selon l'invention que l'utilisation d'un complexe ARN amorce/ARN matrice viral, dans lequel l'ARN amorce est un produit de transcription in vitro ne comprenant aucune modification post-transcriptionnelle, lorsqu'il est mis en présence d'une transcriptase inverse de VIH-1 , permettait de détecter l'activité inhibitrice d'un composé candidat, tel que l'AZTTP, sur l'étape d'initiation de la retrotranscription de l'ARN génomique viral de VIH-1.
Ainsi, l'invention rend pour la première fois accessible à l'homme du métier un procédé de criblage de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription du VIH-1. Le complexe d'initiation de la retrotranscription constitue donc désormais, grâce à l'invention, une nouvelle cible thérapeutique dont le blocage ou l'inhibition constitue une stratégie thérapeutique supplémentaire anti-VIH-1 , qui peut être facilement intégrée dans le cadre des multi-thérapies HAART. En effet, l'introduction de composés inhibiteurs de l'étape d'initiation de la retrotranscription virale dans le cadre de multi-thérapies est de nature à réduire considérablement la probabilité de développement de souches de VIH-1 résistantes. L'utilisation de composés sélectionnés selon un procédé de criblage de l'invention, et capables d'inhiber l'étape d'initiation de la retrotranscription du VIH-1 , est d'autant plus susceptible de réduire la probabilité d'émergence de souches virales variantes résistantes que l'un des composants de la cible intra-cellulaire visée, à savoir l'ARN de transfert naturel, ne peut pas subir de mutation sans simultanément provoquer une altération grave, voire un blocage complet, de la synthèse de protéines dans la cellule, ce qui constitue aussi, indirectement, une très forte pression de sélection limitant les possibilités de variation ou de mutation de l'extrémité 5' de l'ARN génomique viral, qui doit être complémentaire, en de nombreuses régions, de la séquence de l'ARN de transfert amorce.
Complexes ARN/ARN selon l'invention, mimant le complexe d'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1.
Un complexe ARN amorce/ARN matrice mimant le complexe d'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1 , selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend un complexe ARN matrice/ARN amorce formé entre :
(i) un ARN amorce comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' : - une séquence d'appariement intramoléculaire (109) ;
- une séquence simple brin (111) ;
- une séquence (112) formant une tige-boucle ;
- une séquence simple brin (113) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (101 ) appelée séquence anti-codon ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (103)
- une séquence d'appariement intermoléculaire (105)
- une séquence d'appariement intramoléculaire (110)
- une séquence simple brin (114) ; - une séquence d'appariement intermoléculaire, servant d'amorce (107) ; et
(ii) un ARN matrice, comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' : - une séquence d'appariement intramoléculaire (115) ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (116) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (106) ;
- une séquence (117) formant une tige boucle intramoléculaire ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (104) ; - une séquence d'appariement intramoléculaire (102) appelée séquence codon ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (118) ;
- une séquence simple brin (119) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (108) ; - une séquence (120) formant la tige-boucle intramoléculaire (8) ;
- une séquence simple brin (121) ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (122) ; l'ARN amorce consistant en :
(a) soit le produit de la transcription in vitro d'un acide nucléique codant ledit ARN amorce, en amont duquel est localisé un site promoteur de la transcription, tel que le promoteur T7.
(b) soit le produit d'une synthèse chimique ou d'une hémi-synthèse chimique dudit ARN amorce ; étant spécifié que : - les séquences (101 ) et (102) appariées forment une hélice (6C) ;
- les séquences (107) et (108) appariées forment une hélice (7F) ;
- les séquences (109) et (110) appariées forment une hélice (A) ;
- les séquences (107) et (108) appariées forment une hélice (7F) ;
- la séquence (112) forme une tige-boucle (B) ; - les séquences (115) et (122) appariées forment une hélice (1) ;
- les séquences (116) et (118) appariées forment une hélice (2) ;
- la séquence (117) forme une tige-boucle (4) ;
- la séquence (120) forme une tige-boucle (8) ;
De plus, pour une première famille de complexes ARN amorce/ARN matrice de l'invention, (i) les séquences (103) et (104) appariées forment une hélice (5D) et (ii) les séquences (105) et (106) appariées forment une hélice (3 E). C'est le cas du complexe ARN amorce/ARN matrice illustré sur la figure 1 B.
En outre, pour une seconde famille de complexes ARN amorce/ARN matrice obéissant à la définition du complexe d'initiation de la retrotranscription ci-dessus, la structure diffère de celle décrite pour la première feuille ci-dessus, au niveau des hélices 3E et 5D et de la tige boucle 4. Par exemple, la figure 2 illustre cette différence, qui permet cependant d'aboutir à une structure similaire à la précédente et qui obéit aux règles du complexe d'initiation définies par les inventeurs. C'est le cas du complexe ARN amorce/ARN matrice illustré sur la figure 2B.
Le complexe ARN amorce/ARN matrice ci-dessus est aussi caractérisé en ce qu'il mime l'étape d'initiation de la retrotranscription de l'ARN génomique viral de VIH-1 , selon une cinétique qui est caractéristique de l'initiation de la retrotranscription de VIH-1. Les caractéristiques fonctionnelles d'un complexe ARN amorce/ARN matrice de l'invention, au regard de l'initiation de la retrotranscription sont décrites dans l'exemple 2.
Ces caractéristiques incluent une incorporation distributive des 6 premiers nucléotides à l'extrémité 3' de l'ARN amorce.
Selon l'invention, on montre qu'avec un ARN amorce tel que défini ci-dessus, on observe de fortes pauses lors de la polymérisation des 1 1 premiers nucléotides, pauses qui diminuent au cours du temps. Ceci signifie que la rétrotranscriptase, lors de la polymérisation de ces 11 premiers nucléotides, est peu processive et a tendance à se détacher facilement après l'addition d'un nucléotide. Ceci est encore mieux explicité par le fait qu'en présence d'un piège (polyrA/oligo dT), toute la transcriptase inverse est « piégée par le piège » et la polymérisation ne peut avoir lieu. En revanche, en présence d'une amorce oligonucléotidique, qui permet de mimer l'élongation, les pauses sont moins importantes.
Il faut souligner qu'en présence du piège, la polymérisation en élongation a lieu quand même et que l'on détecte une quantité non négligeable de produit final, ce qui signifie bien que la transcriptase inverse est très processive et peut polymériser, dans ce système, environ 200 nucléotides, sans se détacher de son substrat.
Selon une autre caractéristique avantageuse, un complexe entre un ARN matrice et un ARN amorce selon l'invention doit également répondre aux critères cinétiques suivants : la synthèse d'ADN à partir de l'ARN amorce se fait en deux phases : une phase d'initiation, distributive, et une phase d'élongation, processive, les cinétiques pouvant avantageusement être mesurées comme décrit par Lanchy et al.
(EMBO ; 1996). La distribution entre les deux cinétiques, respectivement distributive et processive, peut être montrée en présence d'un piège polyrA/oligodT, comme décrit à l'exemple 2.
Selon un mode de réalisation préféré, le complexe ARN amorce/ARN matrice ci-dessus comprend respectivement : (i) un ARN amorce choisi parmi :
(a) le produit de transcription in vitro d'un acide nucléique, ADN ou ARN, codant un ARN de transfert ;
(b) Un ARN amorce produit par synthèse chimique ou hémi- synthèse chimique, dont la séquence nucléotidique est celle d'un ARN de transfert retrouvé naturellement dans les cellules humaines ; et
(ii) un ARN matrice consistant en un ARN dérivé d'un ARN génomique du virus VIH-1 , le cas échéant adapté au moins dans la séquence codon (102) et dans la séquence PBS (108) de liaison à l'amorce, de manière à ce que la séquence de liaison à l'amorce (108) soit strictement complémentaire de la séquence (107) de l'ARN amorce utilisé et que la séquence anti-codon (101 ) soit strictement complémentaire à la séquence codon (102). La complémentarité des bases de la séquence (108) avec les bases correspondantes de la séquence (107) permet de s'assurer de la formation d'un complexe ARN amorce/ARN matrice stable et fonctionnellement actif pour mimer l'initiation de la retrotranscription d'un virus VIH-1 , en présence d'une transcriptase inverse de VIH-1. D'autres caractéristiques avantageuses d'un ARN amorce selon l'invention sont les suivantes : la séquence a de préférence 8 nucléotides de longueur ; la séquence a de préférence 2 nucléotides de longueur ; la séquence a de préférence 16 nucléotides de longueur la séquence a de préférence 4 nucléotides de longueur ; la séquence a de préférence 11 nucléotides de longueur la séquence a de préférence 3 nucléotides de longueur la séquence a de préférence 4 nucléotides de longueur la séquence a de préférence 6 nucléotides de longueur la séquence a de préférence 4 nucléotides de longueur et la séquence a de préférence 18 nucléotides de longueur
D'autres caractéristiques avantageuses d'un ARN matrice selon l'invention sont les suivantes : la séquence (115) a de pré érence 5 nucléotides de ongueur ; la séquence (116) a de pré érence 12 nucléotides de longueur la séquence (106) a de pré érence 5 nucléotides de ongueur ; la séquence (117) a de pré érence 10 nucléotides de longueur ; la séquence (104) a de pré- érence 6 nucléotides de ongueur ; la séquence (102) a de pré' érence 13 nucléotides de longueur ; la séquence (118) a de pré érence 3 nucléotides de longueur ; la séquence (119) a de pré érence 3 nucléotides de longueur ; la séquence (108) a de pré érence 18 nucléotides de longueur ; la séquence (120) a de pré érence 13 nucléotides de longueur ; la séquence (121) a de pré érence 6 nucléotides de longueur ; et la séquence (122) a de pré érence 5 nucléotides de longueur.
Les figures 1 et 2 illustrent différents modes de réalisation d'un complexe ARN amorce/ARN matrice selon l'invention qui mime le complexe d'initiation de la retrotranscription de l'ARN génomique du virus VIH-1. Pour chacun des modes de réalisation ainsi illustrés, les séquences de l'ARN matrice, plus spécifiquement la séquence codon (102) et la séquence de liaison à l'amorce (108), ont été adaptées afin d'optimiser les appariements de base avec respectivement les « séquences anti-codon » (101) et amorce (107) de l'ARN amorce, pour former respectivement les hélices (6C) et (7F).
La figure 1 représente le complexe ARN amorce/ARN matrice qui a été formé entre l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°3, qui est un produit de transcription in vitro, et l'ARN matrice de séquence SEQ ID N°4.
La figure 2 représente le complexe ARN amorce/ARN matrice qui a été formé entre l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°1 , qui est un produit de transcription in vitro, et l'ARN matrice de séquence SEQ ID N°2.
Pour les complexes ARN amorce/ARN matrice définis ci-dessus, on a montré selon l'invention, par des expériences de cartographie après action de la nucléase S1 , que, de manière surprenante, l'ARN amorce, qui est obtenu par transcription in vitro de l'ADN codant celui-ci, et qui est donc dépourvu de base ayant subi des modifications post- transcriptionnelles, forme un complexe stable avec l'ARN matrice correspondant. On a ainsi montré que le complexe ARN amorce/ARN matrice stable ainsi obtenu mime les caractéristiques structurales du complexe d'initiation de la retrotranscription qui caractérisent le complexe obtenu entre le tARN3 Lys naturel et la région de l'ARN génomique viral correspondant à l'amorce naturelle du tARN3 Lys. En particulier, on a montré que les interactions ARN amorce/ARN matrice englobent l'appariement entre la séquence codon (102) et la séquence anti-codon
(101 ), et non seulement l'interaction entre la séquence amorce (107) et la séquence de liaison à l'amorce (108).
Un complexe ARN amorce/ARN matrice tel que défini ci-dessus constitue un objet de l'invention.
Un premier complexe ARN amorce/ARN matrice préféré selon l'invention est le complexe formé entre : - l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°1, qui ne comprend aucune base ayant subi de modification post-transcriptionnelle ; et - un ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°2.
Un second complexe ARN amorce/ARN matrice préféré selon l'invention est le complexe formé entre : - l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°3, qui ne comprend aucune base ayant subi de modification post-transcriptionnelle ; et
- un ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°4.
Un ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°2 ou la séquence SEQ ID N°4 peut avoir une taille allant jusqu'à 10000 nucléotides de longueur. Un tel ARN matrice peut par exemple être obtenu selon le procédé comprenant les étapes suivantes : a) amplification, par exemple par PCR, de la séquence d'ADN d'intérêt d'un clone contenant un insert d'ADNc dérivé de l'ARN génomique du virus VIH1 , ledit insert d'ADNc contenant la séquence correspondant à l'extrémité 5' du génome viral. L'amplification est avantageusement réalisée à l'aide d'un couple d'amorces nucléotidiques de séquences appropriées, respectivement une première amorce hybridant avec une séquence de l'insert d'ADNc, qui est localisée en aval (du côté 3') de la séquence de liaison à l'amorce (PBS) et une seconde amorce hybridant avec une séquence prédéterminée de l'insert d'ADNc, qui est localisée en amont (du côté 5') de la séquence de liaison à l'amorce (PBS). De manière tout à fait préférée, les séquences respectives de la première et de la seconde amorce sont choisies de telle manière à produire un ADN amplifié dont la séquence comprend au moins les séquences (115) et (122) de l'ARN matrice, qui sont complémentaires l'une de l'autre et dont les bases complémentaires s'apparient deux à deux. A titre illustratif, l'insert d'ADNc utilisé peut être l'insert d'ADNc contenu dans le clone moléculaire infectieux pHXB2(His-AC-AGC) décrit par Li et al. (1997). Selon un mode de réalisation préféré de l'étape a) du procédé, la première amorce nucléotidique utilisée comprend la séquence d'un promoteur qui sera localisée, dans l'ADN amplifié, en amont de l'extrémité 5' de l'ADN codant l'ARN amorce, ledit promoteur étant fonctionnel pour permettre la transcription in vitro de l'ADN codant l'ARN matrice. Le promoteur peut être notamment le promoteur T7, comme cela est décrit dans l'exemple 1. b) si nécessaire, l'adaptation de la séquence de l'ARN matrice obtenu à l'étape a) peut se faire par exemple par une technique de mutagenèse dirigée, par exemple à l'aide d'amorces portant la mutation désirée et utilisées dans une amplification par PCR. Ceci permet l'obtention d'un ARN matrice dont la séquence est adaptée de manière à assurer sa parfaite complémentarité en bases avec la séquence de l'ARN amorce utilisée, dans les régions nucléotidiques d'appariement définies précédemment entre les deux séquences dans le complexe ARN amorce/ARN matrice.
c) transcription in vitro de l'ADN codant l'ARN matrice, par exemple comme décrit dans l'exemple 1. Un mode de réalisation particulier du procédé d'obtention d'un ARN amorce ci-dessus est illustré à l'exemple 1. Le complexe ARN matrice/ARN amorce est de préférence préparé à partir respectivement d'un ARN amorce et d'un ARN matrice , selon la technique décrite par Isel et al. (1993).
Procédé de criblage in vitro de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de VIH-1.
La préparation des complexes ARN amorce/ARN matrice tels que définis ci-dessus a permis aux demandeurs de mettre au point un procédé de criblage in vitro de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1. La disponibilité, en très grandes quantités, des complexes ARN amorce/ARN matrice ci-dessus, préparés en utilisant un ARN amorce ne portant aucune modification post-transcriptionnelle naturelle de ses bases, a rendu possible la mise au point d'un procédé de criblage réalisé entièrement in vitro, qui peut en conséquence être mis en oeuvre rapidement, à très grande échelle, à moindre coût, et avec une grande simplicité, du fait qu'aucune culture de cellules n'est requise.
L'invention a donc pour objet un procédé de criblage in vitro, de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact, dans un échantillon : (i) un complexe ARN amorce/ARN matrice tel que décrit ci-dessus ; avec
(ii) une enzyme transcriptase inverse de VIH1 ; et (iii) un mélange dNTPs/ddNTP approprié ; (iv) en présence d'un composé candidat à tester ; b) Mesurer l'activité d'initiation de la retrotranscription dans ledit échantillon; c) Comparer l'activité mesurée à l'étape b) avec l'activité d'initiation de la retrotranscription mesurée dans un échantillon témoin, pour lequel l'étape a) est réalisée en l'absence dudit composé candidat.
Le procédé de criblage ci-dessus peut en outre comprendre l'étape suivante : d) sélectionner le composé candidat pour lequel l'activité d'initiation de la retrotranscription mesurée à l'étape b) est inférieure à celle mesurée dans l'échantillon témoin ; e) calculer l'activité inhibitrice du composé candidat sélectionné à l'étape d).
Comme indiqué précédemment, l'une des caractéristiques essentielles du complexe ARN amorce/ARN matrice utilisé dans le procédé de criblage d'inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription du VIH-1 ci-dessus est que l'ARN amorce du complexe ne comprend aucune modification post-transcriptionnelle.
Selon un premier aspect, l'ARN amorce du complexe ARN amorce/ARN matrice constitue le produit de la transcription in vitro d'un acide nucléique, préférentiellement un ADN codant celui-ci.
Selon ce premier aspect, l'amorce, produite par transcription in vitro, peut être synthétisée à partir d'un fragment d'ADN codant celle-ci, en amont duquel se trouve un site promoteur pour la transcription, par exemple le promoteur T7. Selon un second aspect l'ARN amorce du complexe ARN amorce/ARN matrice peut être obtenu par transcription in vitro d'un insert d'ADN inséré dans un vecteur d'expression, par exemple un plasmide, ledit vecteur comprenant également au moins la séquence d'un promoteur de la transcription sous le contrôle duquel est placé l'insert d'ADN codant l'ARN de transfert. L'ARN amorce peut également être obtenu par synthèse chimique, selon toute technique connue de l'homme du métier. Par exemple, la synthèse chimique d'un ARN amorce inclus dans un complexe ARN amorce/ARN matrice selon l'invention peut être réalisée par les techniques décrites par Micura et al. (2002).
Selon un autre aspect, l'ARN amorce peut être une molécule hémi-synthétique obtenue par couplage ordonné de plusieurs fragments d'ARN constituant des parties distinctes de l'ARN amorce, chaque fragment d'ARN étant soit un produit de transcription in vitro d'un ADN codant ledit fragment , soit le produit final d'une synthèse chimique. Le couplage ordonné des différents fragments d'ARN successifs afin de synthétiser l'ARN amorce peut être réalisé par toute technique connue de l'homme du métier. Notamment, pour effectuer un tel couplage entre les fragments d'ARN, l'homme du métier se référera avantageusement aux techniques décrites par Zimmerman et al., et les références incluses dans ce document (Incorporation of Modified Nucléotides into RNA for studies on RN A Structure, Function and termolecular Interactions (1998) Zimmermann, R. Gait, MJ and Moore MJ, Modification and Editing of RNAs ASM Press, Washington DC, 59-84). Avantageusement, l'ARN matrice inclus dans le complexe ARN amorce/ARN matrice est produit par transcription in vitro d'un ADN codant celui-ci, comme défini précédemment dans la présente description.
De préférence, l'ADN codant l'ARN matrice viral est inséré dans un vecteur d'expression qui inclut également au moins une séquence promoteur de la transcription sous le contrôle de laquelle cet ADN est placé, comme cela est décrit à l'exemple 1.
Avantageusement, l'ADN codant l'ARN matrice peut être obtenu par clonage d'un fragment d'ADN obtenu par amplification, par exemple par PCR, de l'ADN d'un clone viral infectieux , tel que le clonage PHXB2 décrit par Ll ét al. (1997).
Avantageusement, la « séquence codon » (102) et la séquence de liaison à l'amorce PBS (108) de l'ARN matrice sont adaptées de manière à être complémentaires respectivement de la « séquence anti-codon » (101) et de la séquence amorce (107) de l'ARN de transfert du complexe ARN amorce/ARN matrice afin d'assurer la formation respectivement des hélices intermoléculaires (6C) et (7F) du complexe ARN/ARN de l'invention.
L'adaptation de la séquence de l'ARN matrice viral à l'ARN amorce utilisé pour former le complexe ARN amorce/ARN matrice peut être réalisée par mutagénèse dirigée, comme décrit par exemple par WAKEFIELD et al. (1994).
Avantageusement, le complexe entre l'ARN amorce et l'ARN matrice est préparé selon le protocole décrit par ISEL et al. (1993). De manière préférée, les conditions d'hybridation utilisées pour former le complexe ARN amorce/ARN matrice sont les suivantes :
L'ARN amorce, par exemple un ARN amorce portant un ligand permettant par la suite la rétention de l'amorce sur la surface d'une microplaque, est incubé pendant 2 min à 90°C, 2 min dans la glace, puis 20 min à 70°C, dans 100 mM NaCI, en présence d'un excès d'ARN matrice, assurant une hybridation totale de l'amorce.
Selon un autre aspect, la formation du complexe ARN amorce/ARN matrice peut être réalisée à 37°C en présence de la protéine de nucléocapside NCp7 selon la technique décrite par BRULE
Le complexe ARN matrice/ARN amorce de l'invention est mis en présence de l'enzyme transcriptase inverse, préférentiellement la transcriptase inverse du VIH-1 , et d'une concentration finale connue du composé candidat inhibiteur à tester. Selon le procédé, l'étape a) est réalisée en présence d'un mélange approprié de désoxyribonucléotides triphosphate (dNTPs) et d'un didésoxyribonucléotide triphosphate (ddNTP), ce qui permet la synthèse d'un polynucléotide qui correspond exclusivement à l'étape d'initiation de la retrotranscription. Le mélange approprié dNTPs/ddNTP permet l'allongement de la séquence amorce (107) de l'ARN amorce aboutissant à la synthèse d'une séquence correspondant au produit +6 correspondant à l'initiation.
Par exemple, l'étape a) est réalisée en présence de trois seulement des quatre désoxyribonucléotides triphosphates naturels parmi A, T, G et C, le quatrième nucléotide étant alors un didéoxyribonucléotide triphosphate qui est complémentaire du nucléotide localisé en position -6 par rapport à l'extrémité 3' de la séquence de liaison à l'amorce (108) sur l'ARN matrice. Par exemple, dans le cas du complexe ARNtHls His[AC-ACG] représenté sur la figure 1 , l'étape a) du procédé est préférentiellement réalisée en présence des trois déoxyribonucléotides T, G et C auxquels est ajouté le didéoxyribonucléotide A, qui est complémentaire du ribonucléotide U qui est localisé sur la séquence (118) en position - 6 par rapport à l'extrémité 3' de la séquence de liaison à l'amorce PBS (108) de l'ARN. Le même didéoxyribonucléotide A sera ajouté aux trois désoxyribonucléotides T, G et C lorsque l'étape a) est réalisée avec le complexe ARNtMet/ARNv adapté représenté sur la figure 2, puisque le nucléotide localisé en position -6 par rapport à l'extrémité 3' de la séquence de liaison à l'amorce PBS (108) est également la base Uridine. Dans le mode de réalisation ci-dessus, il est réalisé à l'étape a) un allongement de l'ARN amorce du complexe ARN amorce/ARN matrice correspondant spécifiquement à l'étape d'initiation de la retrotranscription de l'ARN viral du virus VIH-1.
Ainsi, le procédé de criblage d'inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription du VIH-1 ci-dessus est caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée en présence d'un mélange approprié de dNTPs et d'un ddNTP.
Avantageusement, l'un au moins des désoxyribonucléotides naturels ou encore le didésoxyribonucléotide utilisé est marqué par une molécule détectable.
De préférence, la molécule détectable est une molécule radioactive choisie parmi le 3[H], le 14[C], le 32[P] et le 33[P].
Préférentiellement, le procédé de criblage ci -dessus est caractérisé en ce que le complexe ARN amorce/ARN matrice est immobilisé sur un support.
Afin de permettre l'immobilisation du complexe ARN amorce/ARN matrice sur un support, par exemple la surface d'un puits d'une microplaque de test, l'un au moins des ARNs du complexe ARN/ARN comprend une molécule ligand capable de se lier spécifiquement à une molécule récepteur présente à la surface du support. Dans tous les cas, l'extrémité 3' de l'ARN amorce du complexe ARN amorce/ARN matrice doit rester libre pour exercer sa fonction d'amorce lors de l'initiation de la retrotranscription. La molécule ligand capable de se lier spécifiquement à une molécule récepteur sur le support de test, par exemple la surface du puits d'une microplaque, peut être localisée sur l'extrémité 5' de l'ARN amorce ou encore sur l'une des extrémités 5' ou 3' de l'ARN matrice du complexe ARN amorce/ARN matrice.
Selon un autre aspect avantageux, l'ARN amorce et/ou l'ARN matrice comprend la molécule ligand liée chimiquement à l'une quelconque de ses bases, autre qu'une base de l'extrémité 5' ou 3'.
Selon un mode préféré de réalisation du complexe ARN amorce/ARN matrice de l'invention, la molécule ligand est une biotine. Pour l'introduction d'une base biotinylée dans la séquence de l'ARN amorce du complexe ARN amorce/ARN matrice de l'invention, on pourra procéder à la transcription de l'ADN codant l'ARN de transfert amorce avec une concentration réduite en ribonucléotide UTP et en présence du ribonucléotide modifié biotine-16-UTP.
Toute autre modification de l'ARN amorce, ou de l'ARN matrice constitutive du complexe ARN amorce/ ARN matrice de l'invention peut être réalisée selon des techniques connues en soi.
L'homme du métier pourra notamment avantageusement se référer à l'ouvrage de HERMANSON publié en 1996.
De manière tout à fait préférée, c'est l'ARN amorce qui comprend une molécule ligand.
Les couples de molécules ligand/récepteur sont préférentiellement choisis parmi :
- Biotine/streptavidine
- Biotine/avidine - Bioti ne/a pta mère ARN qui reconnaît la biotine
- Fucose/avidine
- ARN-His-tag/NiNTA
- Aptamère en 5' de l'amorce qui recon aît la streptavidine sur un support - CoA, ou NAD ou FAD en 5' de l'ARN/récepteur de ces molécules (Efficient incorporation of CoA, NAD and FAD into RNA by in vitro transcription, Huang, F., 2003).
Avantageusement, la molécule ligand est une biotine, qui est capable de se lier spécifiquement à la streptavidine. Dans ce cas, l'immobilisation du complexe ARN/ARN-biotine peut être réalisée sur un support dont la surface a été préalablement recouverte de molécules de streptavidine. Selon ce mode de réalisation particulier, le procédé de criblage d'inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription du VIH-1 selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée dans une enceinte réactionnelle, par exemple le puits d'une microplaque de test, dont la surface constitue un support d'immobilisation du complexe ARNamorce/ARNmatrice.
Préférentiellement, la surface de l'enceinte réactionnelle, par exemple le puits d'une microplaque, est recouverte d'une molécule récepteur susceptible de se lier spécifiquement à une molécule ligand portée par le complexe ARN/ARN. Une illustration en est donnée dans les exemples par la fixation du complexe ARN/ARN biotinylé sur la surface des puits d'une microplaque préalablement recouvert de streptavidine.
Préférentiellement, pour la mise en œuvre du procédé de criblage ci-dessus, l'activité d'initiation de la retrotranscription est quantifiée par mesure de la radioactivité présente dans le polynucléotide qui est synthétisé par allongement de l'ARN amorce hybride à l'ARN matrice au sein du complexe ARN/ARN, en présence de l'enzyme transcriptase inverse et du mélange dNTPs/ddNTP.
Selon un aspect avantageux du procédé de criblage ci -dessus, la mesure de la radioactivité, qui correspond à la détection des produits d'extension de l'ARN de transfert amorce, est réalisée grâce à l'utilisation du principe de « scintillation de proximité » décrit notamment dans le brevet américain N°US 4,568,649. Selon ce principe, seules les molécules radioactives situées à proximité de la surface du support de test, qui comprend également un produit de détection de la radioactivité par scintillation, engendre la production d'un signal en scintillation. Les molécules radioactives induisant le signal de scintillation sont les désoxyribonucléotides ou les didésoxyribonucléotides radioactifs incorporés à l'ARN amorce par allongement de la séquence amorce (107) qui sont situés à proximité de la surface du support de test, par exemple la surface du puits de la microplaque. En revanche, les désoxyribonucléotides ou les didésoxyribonucléotides radioactifs qui n'ont pas été incorporés à l'ARN de transfert par allongement de la séquence amorce (107) n'engendrent aucun signal détectable. Ce principe de scintillation de proximité sur des microplaques de tests adaptés a été notamment utilisé par EARNSHAW et POPE (2001 ), auquel l'homme du métier peut avantageusement faire référence pour la mise en œuvre du procédé de criblage d'inhibiteurs selon l'invention.
Selon un premier aspect préféré de mise en œuvre du procédé de criblage d'inhibiteurs de la retrotranscription du virus VIH-1 selon l'invention, le complexe ARN amorce/ARN matrice comprend respectivement l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°1 , et l'ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°2.
Selon un second aspect préféré de mise en œuvre du procédé de criblage d'inhibiteurs de la retrotranscription du virus VIH-1 , le complexe ARN amorce/ARN matrice comprend respectivement l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°3 et l'ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°4.
Les résultats présentés dans les exemples montrent qu'un inhibiteur nucléosidique de la retrotranscription, comme l'AZTTP est capable d'inhiber l'initiation de la retrotranscription du virus VIH-1 , avec une efficacité accrue pour des concentrations croissantes de ce composé inhibiteur.
A partir de la valeur de sélectivité théorique d'incorporation de l'AZTTP par rapport au dNTTP, les résultats des exemples montrent que les valeurs d'inhibition de l'étape d'initiation de la retrotranscription obtenues sont conformes aux valeurs théoriques attendues et que le procédé de criblage tel que défini ci-dessus permet bien de détecter la synthèse d'un produit d'allongement de l'ARN amorce correspondant à l'initiation de la retrotranscription du VIH-1 et permet également de mesurer l'inhibition de l'initiation de la retrotranscription du VIH-1. De préférence, le procédé de criblage d'inhibiteurs de la retrotranscription du VIH-1 tel que défini ci-dessus est mis en œuvre avec des concentrations croissantes d'un composé candidat à tester.
De préférence, la comparaison du niveau d'activité d'initiation de la retrotranscription mesurée à l'étape b) avec le niveau d'activité d'initiation de la retrotranscription mesurée en l'absence du composé candidat inhibiteur est réalisée par l'introduction, dans le même test, d'un échantillon témoin comprenant le complexe ARN amorce/ARN matrice, l'enzyme transcriptase inverse et un mélange de dNTPs et d'un ddNTP qui est identique à celui utilisé pour les autres échantillons du test.
Selon une alternative, la comparaison réalisée à l'étape c) du procédé est effectuée par rapport à une valeur connue du niveau d'activité de l'initiation de la retrotranscription dans un échantillon témoin en l'absence du composé candidat à tester. Avantageusement, le procédé de criblage selon l'invention comprend également des échantillons témoins positifs dans lesquels des concentrations finales connues d'un inhibiteur connu, tel que l'AZTTP, ont été ajoutées à la combinaison du complexe ARN amorce/ARN matrice de l'invention et de la transcriptase inverse. En outre, afin de vérifier qu'un composé candidat qui a été sélectionné comme composé inhibiteur selon le procédé de criblage ci- dessus a une activité inhibitrice exclusive et sélective de la seule étape d'initiation de la retrotranscription du virus VIH-1 , ledit procédé peut comprendre en outre les étapes suivantes : f) mettre en contact, dans un échantillon :
(i) une amorce nucléotidique permettant de mimer l'étape d'élongation, qui est complémentaire à une séquence de l'ARN viral, de préférence complémentaire à la séquence PBS de l'ARN viral. (ii) une transcriptase inverse du VI H- 1 ;
(iii) le mélange dNTPs/ddNTP utilisé à l'étape a) en présence du composé candidat testé à l'étape a) ; g) mesurer l'activité d'élongation de l'amorce nucléotidique ; h) comparer l'activité mesurée à l'étape g) avec l'activité d'élongation mesurée dans un échantillon témoin, pour lequel l'étape f) est réalisée en l'absence du composé candidat ; i) déterminer l'activité inhibitrice du composé candidat à partir de la comparaison d'activité réalisée à l'étape h) ; j) comparer l'activité inhibitrice du même composé candidat déterminée à l'étape e) avec l'activité inhibitrice du même composé déterminée à l'étape i).
Si, à l'étape i), la comparaison montre que les activités inhibitrices du composé candidat, respectivement à l'étape e) et à l'étape i) sont du même ordre de grandeur, ledit composé candidat peut être classé comme un composé inhibiteur de l'étape d'initiation de la retrotranscription du virus VIH-1 , mais non spécifique de cette étape d'initiation. Si, à l'étape i), la comparaison montre que l'activité inhibitrice du composé candidat à l'étape e) est supérieure à l'activité inhibitrice mesurée à l'étape i) ou alternativement que le composé candidat ne possède pas d'activité inhibitrice à l'étape i), ledit composé candidat peut être classé comme un composé inhibiteur spécifique de l'étape d'initiation de la retrotranscription du virus VIH-1.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe ARN amorce/ARN matrice tel que défini ci-dessus dans un procédé de criblage de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1. L'invention a également pour objet une trousse ou kit pour le criblage de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1 , caractérisé en ce qu'il comprend un complexe ARN amorce/ARN matrice tel que défini ci-dessus.
Selon un premier aspect, la trousse ou kit de criblage ci -dessus est caractérisé en ce qu'il comprend une enzyme transcriptase inverse, préférentiellement une enzyme transcriptase inverse du VIH-1.
Selon un second aspect, la trousse ou kit de criblage ci -dessus est caractérisé en ce qu'il comprend un mélange approprié de dNTPs et d'un ddNTP permettant la synthèse d'un polynucléotide produit par allongement de l'ARN amorce pendant l'étape d'initiation de la retrotranscription.
De manière tout à fait préférée, l'un au moins des désoxyribonucléotides contenus dans la trousse ou kit de criblage de l'invention est marqué par une molécule détectable, de préférence une molécule radioactive choisie parmi le 3[H], le 14[C], le 32[P] et le 33[P].
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES :
Exemple 1 : Formation d'un complexe ARN amorce/ARN matrice mimant, in vitro, et structure du complexe d'initiation de la retrotranscription du VIH-1. Un complexe ARN amorce/ARN matrice mimant le complexe d'initiation de la retrotranscription du VIH-1 peut être formé in vitro à partir d'un transcrit de tARNHls hybride à son ARNv « adapté » (ARNv [His-AC-GAC]).
A. Matériel et Méthodes
A.1 Obtention de l'ARM amorce
Le plasmide comportant la séquence codant pour le tARNHls, pltRNAHls, a été obtenu par insertion, dans les sites EcoRI et Xmal de Puc18, d'un fragment d'ADN correspondant à la séquence du tARNHls et possédant, en amont, le site promoteur pour l'ARN polymérase du phage T7. Ce fragment a été créé par hybridation et ligation d'oligodéoxyribonucléotides adéquats .
Le transcrit de tARNHls a été obtenu par transcription in vitro du vecteur pItARNHis préalablement digéré par l'enzyme de restriction Nsil. Le tARN amorce produit par transcription in vitro peut porter une modification permettant, au cours de l'essai de retrotranscription, la rétention du complexe matrice/amorce allongé sur un support portant un ligand de cette modification. La modification peut être une biotine ou tout autre ligand ou réactif permettant un ancrage covalent ou non covalent pour l'attachement du complexe à un support solide. Une panoplie de méthodes peuvent être envisagées pour la modification de l'ARN (voir par exemple (Hermanson, 1996)). Notre exemple utilise une amorce tARNHls biotinilée, la biotinilation se faisant en cours de transcription en présence de 40 mM Tris HCI, pH8 (37°C),15 mM MgCI2 ,50 mM NaCI, 1.6 mM spermidine, 50 U RNAsine, 5 mM DTE, 4 mM ATP, 4mM CTP, 4 mM GTP, 2,5 mM UTP, 0.4 mM biotine-16-UTP, 22.5 U de T7 RNA Polymérase. Pour la synthèse d'un ARN non biotinilé, la biotine-16-UTP est omise et la concentration en UTP est ramenée à 4 mM. Après transcription, l'ADN plasmidique est digéré en présence de DNAse I et les transcrits sont purifiés sur colonnes HPLC.
A.2 Obtention de l'ARN matrice
L'ARNv adapté ARNv [His-AC-GAC] utilisé dans nos essais correspond aux 295 premiers nucléotides de l'extrémité 5' de l'isolât HxB2 du VIH-1 et comporte des mutations permettant de former la structure caractéristique de l'initiation de la retrotranscription (Fig. 1) : le site PBS est muté pour être complémentaire aux 18 nucléotides de l'extrémité 3' du tARNHls ; les nucléotides de la région riche en A en amont du site PBS sont mutés de façon à être complémentaires à la boucle de l'anticodon du tARNHls ; d'autres nucléotides autour du PBS sont mutés, augmentant ainsi la complémentarité avec le tARNHls (Zhang et al., 1998). Le plasmide plHis-AC-AGC comportant les séquences codant pour l'ARNv adapté [His-AC-AGC] a été construit par insertion, dans les sites EcoRI et Xmal du vecteur Puc18, d'un fragment d'ADN obtenu par PCR à partir du clone moléculaire infectieux pHXB2(His-AC- AGC) (Li et al., 1997), fourni par le Dr C. Morrow (Birmimgham, USA), et comportant, en amont du site de démarrage de la transcription, le promoteur T7. Les amorces de PCR ont été conçues de manière à amplifier la région correspondant aux 732 nucléotides de l'extrémité 5' de l'ARNv [His-AC-AGC].
Les 295 premiers nucléotides de l'ARNv [His-AC-AGC] ont été obtenus par transcription in vitro du vecteur plHis-AC-AGC, préalablement digéré par Rsal, selon le protocole précédemment décrit et (Marquet et al., 1991). L'ARN a été purifié comme décrit précédemment.
A.3 Obtention de la RT du VIH-1 Les plasmides utilisés pour la production de la RT du VIH-1 ainsi que le protocole de purification nous ont été fournis par le Dr T. Unge.
A.4 Cartographie de l'amorce ARN à la nucléase S1
En vue d'expériences de cartographie enzymatique en solution de l'amorce, libre ou hybridée à la matrice, le tARNHls est marqué à son extrémité 5'. Le tARNHls (15 μg) est incubé pendant 30 minutes à 37°C dans le tampon CIP (Calf Intestinal Phosphatase), en présence de 15 U de CIP. Après extraction phénolique et précipitation, le tARN est purifié sur gel de polyacrylamide dénaturant. Le tARN est ensuite marqué à son extrémité 5' par transfert du phosphate radioactif du [γ^ATP. Le tARN (3 μg) est incubé 1 heure à 37°C dans 15 μl de tampon kinase en présence de 100 μCi de [-32]ATP et de 15 U de polynucléotide kinase du phage T4, avant d'être purifié sur gel de polyacrylamide dénaturant.
Le complexe matrice/amorce est préparé comme décrit ci-dessous et selon des protocoles publiés précédemment (Isel et al, 1993).
Alternativement, la formation du complexe peut se faire à 37°C, en présence de la proté ine de nucléocapside, NCp7 (Brûlé et al., 2002).
La cartograph lie du tARNHls en absence ou en présence d'ARNv
[His-AC-AGC] à l'a ιide de la nucléase S1 se fait selon le protocole suivant : 100 000 cpm de tARNHls marqué à son extrémité 5' au [f2P] sont incubés en absence ou en présence de 12 pmoles d'ARNv [His- AC-AGC] pendant 2 min à 90°C, puis 2 min dans la glace. Les ARN sont ensuite incubés pendant 20 min à 70°C dans 50 mM Cacodylate de sodium (pH 7.5), 300 mM KCI, puis le complexe est ramené à température ambiante pendant 5 minutes, dans 50 mM Cacodylate de sodium (pH 7.5), 300 mM KCI, 5 mM MgCI2, 1 mM ZnCI2. Le tARNHls, libre et additionné d'1 μg de tARNtotal, ou hybride à l'ARN [His-AC- AGC], est ensuite incubé en absence ou en présence de 200U de nucléase S1 , pendant 7.5 ou 15 minutes à 37°C. La réaction est arrêtée par digestion de la nucléase S1 par 20 μg de protéinase K, pendant 30 76689
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minutes à 37°C. Après extraction phénolique, les ARN sont précipités à l'éthanol, centrifugés et séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant 15%.
B. Résultats
Ces expériences montrent que, de manière inattendue, le transcrit tARNHls, dépourvu de bases modifiées, permet la formation d'un complexe stable qui mime les spécificités structurales du complexe d'initiation de la retrotranscription obtenues avec le tARN3Lys naturel et son ARNv complémentaire. En particulier, la boucle de l'anticodon du transcrit tARNHls, réactive à la nucléase S1 en absence de matrice, est protégée en présence de l'ARNv [His-AC-GAC], suggérant une interaction avec la boucle CCACAA de cet ARN (Fig. 1 et 3). La protection de la zone anticodon de l'amorce à la nucléase S1 constitue l'une des signatures du complexe d'initiation et représente un des contrôles essentiels indiquant que les interactions matrice/amorce ne se limitent pas à la région PBS.
Le complexe matrice/amorce, constitué in vitro, et où la région anticodon de l'amorce interagit avec une région de l'ARN matrice en amont du site PBS, doit être testé pour sa capacité à répondre aux critères de la réaction d'initiation/élongation de la retrotranscription tels que les auteurs les ont définis (Isel et al., 1996, Lanchy et al., 1996, Lanchy et al., 1998).
Exemple 2 : Un complexe matrice ARNv lΗis-AC-GACI/amorce tARNHls possède les caractéristiques fonctionnelles d'un complexe d'initiation de la retrotranscription
Des essais de retrotranscription in vitro, selon des protocoles précédemment décrits (Isel et al., 1996), ont montré que le complexe ARNv [His-AC-GAC]/tARNH's transcπt possède également les caractéristiques cinétiques du complexe d'initiation du VIH-1 , à savoir une étape d'initiation spécifique, suivie d'une étape d'élongation non spécifique. A. Matériel et Méthodes
En vue de tests de retrotranscription in vitro, les amorces tARNHls et ODNHB doivent être marquées radioactivement. Le tARNHls est marqué selon le protocole décrit précédemment. L'ODNms est marqué par transfert du phosphate radioactif du [ -32]ATP selon le protocole suivant : 0.1 nmole d'ODNms sont incubée pendant 1 heure à 37°C dans le tampon kinase, en présence de 100 μCi de [ -32]ATP et de 15 U de polynucléotide kinase du phage T4 avant d'être purifiée sur gel de polyacrylamide dénaturant. Deux nM de complexe matrice d'ARNv [His-AC-GAC]/amorce tARNHls (marqué au [ -32]P, hybride à un excès de 2.5x d'ARNv [His- AC-GAC] selon le protocole décrit ci-dessus, dans 100 mM NaCI) ou 10 nM de complexe ARNv [His-AC-GAC]/ODNHιs (marqué au [γ-32]P, hybride à un excès de 2.5x d'ARNv [His-AC-GAC] selon le protocole décrit ci- dessus, dans 100 mM NaCI) sont pré-incubés pendant 4 minutes en présence de 20 nM ou 30 nm final de RT du VIH-1 respectivement, dans 50 mM Tris-HCI pH7.5, 50 mM KCI, 6 mM MgCI2 et 1 mM DTE. La réaction de retrotranscription est initiée par l'ajout de 50 μM de chaque dNTP et arrêtée à différents temps, de 15 secondes à 30 minutes, en présence de Tris-Borate 90 mM pH 8.3, EDTA 25 mM. Les produits de la réaction sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant 8%.
B. Résultats En présence du tARNHιε amorce, la synthèse du brin (-) d'ADN strong-stop se fait en deux étapes (Fig.5) : l'addition des 7 premiers nucléotides à l'amorce tARNHls se fait de manière peu processive, comme en témoignent les produits intermédiaires qui s'accumulent entre les positions +1 et + 7 (Fig. 5), mais disparaissent au cours du temps. Cette étape correspond à la phase d'initiation définie précédemment pour le système naturel (Isel et al, 1996, Lanchy et al, 1996, Lanchy et al, 1998). Elle est suivie d'une phase d'élongation, plus processive, où les pauses sont diminuées. Comme dans le cas du système naturel, la phase d'élongation peut être mimée par une amorce oligodésoxyribonucléotidique complémentaire du PBS (ODNms), qui 6689
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permet une retrotranscription processive, comme en témoigne l'absence de pauses (Fig. 5).
La faible processivité de la RT en initiation, en présence de l'amorce tARNHls, est confirmée par l'absence de synthèse d'ADN en présence d'un piège poly(rA)/(dT)ι8 (Fig. 5). Ce résultat est similaire à celui qui avait été obtenu dans le cas de l'amorce naturelle tARN3Lys. En revanche, lorsque l'amorce ODNHiS est utilisée, la synthèse de l'ADN strong-stop (-) reste détectable en présence de poly(rA)/(dT)ι8, indiquant que, de manière comparable à la situation naturelle, la RT est hautement processive en élongation.
L'étude fonctionnelle du complexe d'initiation, par comparaison des profils de synthèse de l'ADN strong-stop (-) obtenus en présence d'une amorce tARN ou d'une amorce oligodésoxyribonucléotidique constitue le contrôle fonctionnel qui permet de valider un complexe matrice/amorce comme mime du complexe naturel de retrotranscription.
Exemple 3 : L'initiation comme cible dans un test de criblage à haut flux Les complexes matrice/amorce décrits précédemment et mimant le complexe spécifique d'initiation de la retrotranscription peuvent être utilisés dans un test de criblage à haut flux d'inhibiteurs de la retrotranscription, ciblant spécifiquement cette étape d'initiation.
A. Matériel et Méthodes Dans le cadre du test de criblage, le complexe matrice ARNv [His-
AC-GAC]/amorce tARNH,s biotinilé est pré-formé selon le protocole décrit ci-dessus et (Isel et al., 1993). Alternativement, la formation du complexe peut se faire à 37°C, en présence de la protéine de nucléocapside, NCp7 (Brûle et al., 2002). Le complexe, dans un tampon de retrotranscription approprié (Tris-HCI 50 mM pH7.5 ; KCI 50 mM ; MgCI2 6 mM ; DTE 1 mM et (Isel et al., 1996)), est ensuite transféré dans les puits d'une microplaque (par exemple « Flashpiate », NEN).
Afin de détecter la synthèse d'ADN strong-stop (-), 10 nM de complexe matrice/amorce sont allongés par la RT du VIH-1, sauvage ou mutée dans son site RNase H, en présence de 5 μM de chaque dNTP (dGTP, dCTP, dATP et dTTP/dTTP[3H] (Activité spécifique : 121 Ci/mmole ; Amersham)), en absence ou en présence d'inhibiteurs de la retrotranscription (AZTTP ou d4TTP dans les exemples de la Fig. 6), pendant 5, 15 et 30 minutes à 37°C. Les réactions sont arrêtées en présence d'EDTA 25 mM et la détection des produits d'extension se fait grâce à l'utilisation du principe de « scintillation de proximité » ou SPA, couvert par un brevet déposé par Amersham (US Patent N° 4568649). Dans ce système, un radioélément non lié, c'est à dire non incorporé à l'amorce, n'est pas détecté, et seul le radioélément lié à la cible produira un signal en scintillation . Le signal est proportionnel à la quantité de produits d'extension. Le principe de scintillation de proximité sur « flashpiate » a été largement utilisé dans ce type d'application (Earnshaw & Pope, 2001 ). La radioactivité liée à la surface de chaque puits d'une microplaque est comptée dans un compteur MicroBeta (Wallac-Perkin-Elmer)
Ces expériences montrent qu'il est possible de détecter, dans ce formalisme, la synthèse de l'ADN strong-stop (-) ainsi que son inhibition par l'AZTTP et le d4TTP (Fig. 6). L'inhibition de la synthèse d'ADN strong-stop (-) est comparable à celle obtenue en solution, dans des systèmes expérimentaux différents. En présence de 5 μM d'AZTTP, le taux d'inhibition est proche de 90% après 30 minutes de réaction. Enfin, conformément à des résultats déjà publiés (Arts et al., 1996a; Isel et al., 2001 ), le taux d'inhibition en présence de la même concentration de d4TTP est inférieur (80%). Afin de détecter la synthèse d'un produit correspondant à l'initiation de la retrotranscription, c'est à dire à l'addition des 6 premiers nucléotides à l'amorce tARNHls biotinilée, 30 nM de complexe matrice/amorce sont allongés en présence de 90 nM de RT du VIH-1 , sauvage ou mutée dans son site RNase H, en présence de dGTP, dCTP, dTTP/dTTP[3H] (Activité spécifique : 121 Ci/mmole ; Amersham) (5μM final chacun) et de ddATP (20 μM), complémentaire au 6lème nucléotide en amont du site PBS, en absence ou en présence de 0.1 ou 2.5 μM d'AZTTP (Fig. 7) (ou de molécules issues de banques dans l'application future de ce test), pendant 20 minutes à 37°C. Les réactions sont arrêtées en présence d'EDTA 25 mM et la détection des produits d'extension se fait comme décrit ci-dessus.
B. Résultats Ces expériences montrent que la synthèse d'un produit correspondant à l'initiation de la retrotranscription est détectable, mais de manière plus cruciale encore, que la diminution du signal en présence d'AZTTP est significative. A une concentration de 0.1 μM en AZTTP, en présence d'un excès de 50 fois en dTTP, le signal expérimental représente 92.3 % (moyenne sur 3 expériences) (Tableau I) du signal obtenu en absence d'inhibiteur. En présence de 2.5 μM d'AZTTP et d'un excès de 2 fois en dTTP, le signal représente 61% (moyenne sur 7 expériences) (Tableau I) du signal obtenu en absence d'inhibiteur.
A partir de la sélectivité théorique d'incorporation de l'AZTTP par rapport au dTTP, il est possible de calculer le signal théorique attendu à un rapport donné d'AZTTP et de dTTP et de le comparer au signal expérimental. Pour un rapport AZTTP/dTTP=1/2, les signaux théoriques attendus pour des sélectivités de 0.6 et 0.7 (sélectivité mesurée en initiation et en élongation (Rigourd et al., 2000)) sont de 60,7% et 56,7% respectivement. Une moyenne sur 7 expériences réalisées dans ces conditions (AZTTP/dTTP=1/2) conduit à un signal expérimental de 61 ±6%, en bon accord avec le signal théorique.
L'accord entre les signaux théoriques (Tableau I) et les signaux expérimentaux (Fig. 7), même à faible concentration en AZT, est satisfaisant, et valide ainsi l'utilisation de ce système pour cribler l'initiation.
Tableau I : Comparaison entre les signaux théoriques attendus et les signaux expérimentaux lors de la synthèse d'un produit correspondant à l'initiation de la retrotranscription. Le signal théorique attendu est calculé en fonction du rapport des concentrations en AZTTP et dTTP présents dans le milieu réactionnel et de la sélectivité d'incorporation de l'AZTTP vis à vis du dTTP (mesurée en initiation et en élongation (Rigourd et al., 2000)).
REFERENCES :
BRULE F ét al., 2002, RNA, vol.8 (1 ) :8-15.
EARNSHAW D et POPE A, 2001, J. Biomo Screen , vol.6:39-46. HERMANSON G, 1996, Bioconjuguate Techniques, Académie Press Inc.
SAN DIEGO, ETATS-UNIS.
HUANG F., 2003, Nucleic Acids Res., vol. 31 , DOI: 10.1093/nar/gng008.
HUANG, Y., A SHALOM, Z. ϋ, J. WANG, J.Mak, M.A. WAINBERG, and
L. KLEIMAN 1996. Effects of modifying the tRNA3 Lys anticodon on the initiation of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription J.
Virol. 70:4700-4706.
ISEL C et al. , 1993, The Journal of Biological Chemistry, vol.268(34):
25.269-25.272
ISEL C et al., 1995, J. Mol. Biol. vol.247 : 236-250. KANG S-M et al., 1996, Virology, vol. 222: 401 -414.
KANG, S.M., Z.J. ZHANG, and CD. MORROW 1997. Identification of a séquence within U5 required for human immunodeficiency virus type 1 to stably maintain a primer binding site complementary to tRNAMet J. Virol.
71 :207-217; WAKEFIELD, J.K. S.M. KANG, and CD. MOROW 1996. Construction of a type 1 human immunodeficiency virus thaï maintains a primer binding site complementary to 1RNAH|S J. Virol. 70:966-975).
LANCHY J M et al., 1996, The Embo Journal, vol.15, (24) : 7178-7187.
LANCHY J M et al., 1998, J. Biol. Chem., vol.273:24.425-24.432. Ll Y et al., 1997, J. Virol. vol.71 : 6315-6322.
LIANG, C, X. Ll, L. RONG, P.INOUYE, Y. Quan, L.KLEIMAN, and M.A.
WAINBERG 1997. The importance of the A-rich loop in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription and infectivity j; Virol.
71 :5750-5757. MARQUET R et al., 1991, Nucleic Acids Research, vol.19 (9) :2349-
2357.
MICURA et al. 2002, Angew Chem. Int. Ed. Engl., vol.41 (13): 2265-
2269.
SKRIPKIN E et al., 1996, Nucleic acids Research, vol. 24 : 509-514. ZHANG, Z., S.M. KANG, A. LEBLANC, S.L Hajduk, and CD. Morrow 1996. Nucléotide séquences within the U5 région of the viral RNA génome are the major déterminants for an human immunodeficiency virus type 1 to maintain a primer binding site complementary to tRNA(His) Virology, 226:306-317.
ZHANG, Z. J. S.M. KANG, Y. Li, and CD. Morrow 1998. Genetic analysis of the U5-PBS of a novel HIV-1 reveals multiple interactions between the tRNA and RNA génome required for initiation of reverse transcription RNA. 4:394-406. ZIMMERMAN et al., Incorporation of Modified Nucléotides into RNA for studies on RNA Structure, Function and in termolecular Interactions (1998).
ZIMMERMANN, R. GAIT, MJ AND MOORE MJ, Modification and Editing of RNAs ASM Press, Washington DC, 59-84. WAKEFIELD J K et al., 1994, J. Virol., vol.68:1605-1614.

Claims

Revendications
1. Procédé de criblage in vitro, de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact, dans un échantillon :
(i) un complexe ARN amorce/ARN matrice formé entre :
(1) un ARN amorce comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité
3' :
- une séquence d'appariement intramoléculaire (109) ;
- une séquence simple brin (111 ) ;
- une séquence (112) formant une tige-boucle ;
- une séquence simple brin (113) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (101 ) appelée séquence anti-codon ;
- une séquence d'appari ement intermoléculaire (103)
- une séquence d'appari ement intermoléculaire (105)
- une séquence d'appari ement intramoléculaire (110)
- une séquence simple brin (114) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire, servant d'amorce (107) ; et
(2) un ARN matrice, comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité
3' :
- une séquence d'appariement intramoléculaire (115)
- une séquence d'appariement intramoléculaire (116)
- une séquence d'appariement intermoléculaire (106)
- une séquence (117) formant une tige boucle intramoléculaire ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (104) ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (102) appelée séquence codon ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (118) ;
- une séquence simple brin (119) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (108) ;
- une séquence (120) formant la tige-boucle intramoléculaire (8) ; - une séquence simple brin (121 ) ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (122) ; l'ARN amorce consistant en :
(a) soit le produit de la transcription in vitro d'un acide nucléique codant ledit ARN amorce,
(b) soit le produit d'une synthèse chimique ou d'une hémi-synthèse chimique dudit ARN amorce ; étant spécifié que :
- les séquences (101 ) et (102) appariées forment une hélice (6C) ;
- les séquences (107) et (108) appariées forment une hélice (7F) ;
- les séquences (109) et (110) appariées forment une hélice (A) ;
- les séquences (107) et (108) appariées forment une hélice (7F) ;
- la séquence (112) forme une tige-boucle (B) ;
- les séquences (115) et (122) appariées forment une hélice (1 ) ;
- les séquences (116) et (118) appariées forment une hélice (2) ;
- la séquence (117) forme une tige-boucle (4) ;
- la séquence (120) forme une tige-boucle (8) ;
avec
(ii) une enzyme transcriptase inverse de VIH 1 ; et
(iii) un mélange dNTPs/ddNTP approprié ;
(iv) en présence d'un composé candidat à tester ; b) Mesurer l'activité d'initiation de la retrotranscription dans ledit échantillon; c) Comparer l'activité mesurée à l'étape b) avec l'activité d'initiation de la retrotranscription mesurée dans un échantillon témoin, pour lequel l'étape a) est réalisée en l'absence dudit composé candidat.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'ARN amorce constitue le produit de la transcription in vitro d'un acide nucléique codant celui-ci.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ARN amorce est obtenu par synthèse chimique.
4. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'ARN amorce est une molécule hemi-synthétique obtenue par couplage ordonné de plusieurs fragments d'ARN constituant des parties distinctes de l'ARN amorce, chaque fragment d'ARN étant soit un produit de la transcription in vitro d'un ADN codant ledit fragment, soit le produit final d'une synthèse chimique.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : d) sélectionner le composé candidat pour lequel l'activité d'initiation de la retrotranscription mesurée à l'étape b) est inférieure à celle mesurée dans l'échantillon témoin ; e) calculer l'activité inhibitrice du composé candidat sélectionné à l'étape d).
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le mélange dNTPs/ddNTP approprié comprend trois des quatre désoxyribonucléotides triphosphate naturels parmi A, T, G et C, le quatrième nucléotide consistant en un didéoxyribonucléotide triphosphate qui est complémentaire du nucléotide localisé en position -6 par rapport à l'extrémité 3' de la séquence de liaison à l'amorce (108) sur l'ARN matrice.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en au moins l'un des désoxyribonucléotides ou le didésoxyribonucléotides est marqué par une molécule détectable.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la molécule détectable est une molécule radioactive choisie parmi le 3[H], le 14[C], le
32[P] et le 33[P].
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le complexe ARN/ARN est immobilisé sur un support.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'un au moins des ARNs du complexe ARN amorce/ARN matrice comprend une molécule ligand capable de se lier spécifiquement à une molécule récepteur présente à la surface d'un support.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la molécule ligand est une biotine.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11 , caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée dans une enceinte réactionnelle dont la surface constitue le support d'immobilisation du complexe ARN/ARN.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la surface de l'enceinte réactionnelle est recouverte d'une molécule récepteur susceptible de se lier spécifiquement à une molécule ligand portée par le complexe ARN amorce/ARN matrice.
14. Procédé selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que l'activité d'initiation de la retrotranscription est quantifiée par mesure de la radioactivité présente dans le polynucléotide qui est synthétisé par allongement de l'ARN amorce hybride à l'ARN matrice au sein du complexe ARN/ARN.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le complexe ARN amorce/ARN matrice comprend respectivement l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°1 et l'ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°2.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le complexe ARN amorce/ARN matrice comprend respectivement l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°3 et l'ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°4.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : f) mettre en contact, dans un échantillon :
(i) une amorce nucléotidique permettant de mimer l'étape d'élongation ;
(ii) une transcriptase inverse du VI H- 1 ; (iii) le mélange dNTPs/ddNTP utilisé à l'étape a) en présence du composé candidat testé à l'étape a) ; g) mesurer l'activité d'élongation de l'amorce nucléotidique ; h) comparer l'activité mesurée à l'étape g) avec l'activité d'élongation mesurée dans un échantillon témoin, pour lequel l'étape f) est réalisée en l'absence du composé candidat ; i) déterminer l'activité inhibitrice du composé candidat à partir de la comparaison d'activité réalisée à l'étape h) ; j) comparer l'activité inhibitrice du même composé candidat déterminée à l'étape e) avec l'activité inhibitrice du même composé déterminée à l'étape i).
18. Complexe ARN matrice/ARN amorce formé entre :
(i) un ARN amorce comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' : - une séquence d'appariement intramoléculaire (109) ;
- une séquence simple brin (111 ) ;
- une séquence (112) formant une tige-boucle ;
- une séquence simple brin (113) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (101) appelée anti- codon ;
- une séquence d'appar ïiement ntermoléculaire (103)
- une séquence d'appar iiement ntermoléculaire (105)
- une séquence d'appar iiement ntramoléculaire (110)
- une séquence simple brin (114) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire, servant d'amorce (107) ; et
(ii) un ARN matrice, comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité
3' :
- une séquence d'appariement intramoléculaire (115) ; - une séquence d'appariement intramoléculaire (116) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (106) ;
- une séquence (117) formant une tige boucle intramoléculaire ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (104) ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (102) appelée codon ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (118) ;
- une séquence simple brin (119) ;
- une séquence d'appariement intermoléculaire (108) ;
- une séquence (120) formant la tige-boucle intramoléculaire (8) ;
- une séquence simple brin (121 ) ;
- une séquence d'appariement intramoléculaire (122) ; l'ARN amorce consistant en :
(a) soit le produit de la transcription in vitro d'un acide nucléique codant ledit ARN amorce,
(b) soit le produit d'une synthèse ou d'une hémi-synthèse chimique dudit ARN amorce; étant spécifié que :
- les séquences (101 ) et (102) appariées forment une hélice (6C) ;
- les séquences (107) et (108) appariées forment une hélice (7F) ;
- les séquences (109) et (110) appariées forment une hélice (A) ;
- les séquences (107) et (108) appariées forment une hélice (7F) ;
- la séquence (112) forme une tige-boucle (B) ; - les séquences (115) et (122) appariées forment une hélice (1 ) ;
- les séquences (1 16) et (1 18) appariées forment une hélice (2) ;
- la séquence (117) forme une tige-boucle (4) ;
- la séquence (120) forme une tige-boucle (8) ;
19. Complexe ARN amorce/ARN matrice selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'un au moins des ARNs du complexe ARN/ARN comprend une molécule ligand capable de se lier spécifiquement à une molécule récepteur.
20. Complexe ARN amorce/ARN matrice selon la revendication 19, caractérisé en ce que la molécule ligand est une biotine.
21. Complexe ARN amorce/ARN matrice selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend respectivement l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°1 et l'ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°2.
22. Complexe ARN amorce/ARN matrice selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend respectivement l'ARN amorce de séquence SEQ ID N°3 et l'ARN matrice comprenant la séquence SEQ ID N°4.
23. Utilisation d'un complexe ARN amorce/ARN matrice selon l'une des revendications 18 à 22 dans un procédé de criblage de composés inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1.
24. Trousse ou kit de criblage de composé inhibiteurs de l'initiation de la retrotranscription de l'ARN d'un virus VIH-1 , caractérisé en ce qu'il comprend un complexe ARN amorce/ARN matrice selon l'une des revendications 18 à 22.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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