EP1552006A2 - Procede et moyens pour l'analyse quantitative des molecules codees par des genes differents dans les cellules - Google Patents

Procede et moyens pour l'analyse quantitative des molecules codees par des genes differents dans les cellules

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Publication number
EP1552006A2
EP1552006A2 EP03763939A EP03763939A EP1552006A2 EP 1552006 A2 EP1552006 A2 EP 1552006A2 EP 03763939 A EP03763939 A EP 03763939A EP 03763939 A EP03763939 A EP 03763939A EP 1552006 A2 EP1552006 A2 EP 1552006A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
primers
cells
polymerase chain
genes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03763939A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Benedita Rocha
Henrique Veiga-Fernandes
Antonio Peixoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSTITUT NECKER
Original Assignee
INSTITUT NECKER
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Filing date
Publication date
Application filed by INSTITUT NECKER filed Critical INSTITUT NECKER
Publication of EP1552006A2 publication Critical patent/EP1552006A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology. It relates more precisely to analysis and diagnosis in biology, and more particularly still to quantitative analysis of the number of nucleic acid molecules coding for different genes expressed at the level of animal or plant cells.
  • the invention finds applications in all sectors of biology and / or medicine, in which it is useful to be able to know such a number of coding nucleic acid molecules, for diagnostic as well as treatment and / or medical follow-up.
  • the invention is based on a methodological approach using a multiplex system of amplification techniques, in particular by RT-ACP (or RT-PCR in English), applied to nucleic acid molecules coding for different genes expressed at the level of cells. .
  • the invention can be practiced preferably on a very small number of cells or even on a single cell.
  • TECHNOLOGICAL BACKGROUND nowadays, it is necessary to be able to characterize an increasingly limited number of cells if we want to be able to advance diagnostic methods.
  • the separation and isolation methods known to those skilled in the art now make it possible to subdivide complex populations into subpopulations having different phenotypic characteristics, probably associated with different biological functions.
  • Certain cell populations for example precursor cells or “stem cells”
  • stem cells are usually present in proportions of less than 1% in the biological materials which contain them.
  • RT-ACP in English "RT-PCR”
  • RNA extraction techniques are not very effective. This limitation inherent in the extraction techniques used means that a relatively large number of cells (usually at least 100,000 cells) must be used to extract the lNRM. However, the efficiency of the extraction of mRNA decreases as the number of cells is reduced. Even when around 100,000 cells are used, the efficiency of mRNA extraction is low.
  • Cell differentiation phenomena also frequently involve several genes simultaneously. They can be associated with the induction or the extinction of the expression of a group of genes, or with the variation of the proportion of the expression of these same genes. The evaluation of these parameters in a cell population is therefore also misleading. It does not allow knowing the gene expression profile of each individual cell.
  • the cytotoxic function of T cells involves the simultaneous co-expression of perforin and granzymes in the same cell.
  • the cells co-expressing these two genes are efficient cells from the cytotoxic point of view.
  • the methods based on the study of cell populations do not make it possible to know whether the genes studied are expressed by the same cell or by different cells, present in the same cell population. Only studies of co-expression by single cells could allow the determination of differentiation programs which impose a particular genetic profile for each individual differentiated cell.
  • WO 00/20629 describes a method for determining the amount of a specific RNA in a tissue sample. This method aims to allow the analysis of rare transcripts, such as cytokines. It involves a specific procedure for isolating RNA, RT-PCR in a single enzymatic reaction, then detection and quantification, preferably with a standard RNA. This method can only be applied to one tissue, for a single gene. In this technique, the RNA to be quantified must be extracted from the sample, which leads to losses and prevents the claim to an absolute determination of a number of RNA molecules for a selected gene present in the sample.
  • the invention provides alternative means for carrying out amplification reactions, as well as their calibration and their quantification, with the main objective of allowing the absolute quantification of the number of nucleic acid molecules encoding for different genes expressed in cells of living organisms.
  • the present invention thus provides a method for quantitative analysis by RT-ACP or an equivalent technique in vitro and / or ex vivo of the number of nucleic acid molecules coding for different genes expressed at the level of cells of living organisms, on a small number of cells, or even on a single cell, in which: reverse transcription (or reverse transcription, abbreviated RT) is carried out with appropriate 3 ′ primers, in the presence of buffers which do not induce the inhibition of reactions of subsequent PCR and, on the products of said reverse transcription, in a separate container or advantageously in the same container, a first polymerase chain reaction of the mRNA of a small number of lysed cells is carried out, preferably from 1 to 1000 lysed cells, the various products of said first polymerase chain reaction are separated to individualize the genes, - carries out a second polymerase chain reaction on the individual genes thus separated, and the results of said second amplification reaction are evaluated, while in said method an internal calibration is carried out with serial dilutions of RNA to confirm
  • Fig. 1 represents a graph illustrating the comparative expression of mRNA of HPRT and of ⁇ lFN, among others, according to a traditional technique.
  • Fig. 2 is a graph showing the virtual identity of PCR amplification of DNA and RNA.
  • Fig. 3 represents a graph in two parts respectively concerning a first and a second PCA carried out in real time on populations of intestinal T cells expressing all the effector functions.
  • Fig. 3a was obtained with combinations of primers of first PCR
  • Fig. 3b was obtained with combinations of primers of the second PCR.
  • Fig. 4 represents a graph showing the amplifications by PCR in real time of perforin and of HPRT, in second PCR reactions within the meaning of the present invention.
  • Fig. 4a shows the results obtained after a first PCR carried out with all the primers simultaneously in accordance with the invention;
  • Fig. 4b shows the results obtained when only the primers for perforin and HPRT were present in the first PCR reaction.
  • Fig. 5 is a graph illustrating the comparative results obtained with a first amplification by PCA over a variable number of cycles
  • Fig. 6 is a schematic illustration of the succession of fundamental steps of the method according to the invention.
  • the first object of the invention is a method for quantitative analysis by RT-ACP or an equivalent technique in vitro and / or ex vivo of the number of nucleic acid molecules coding for different genes expressed at the level of cells of organisms. alive, on a small number of cells, or even on a single cell, in which: reverse transcription (RT) is carried out with appropriate 3 ′ primers, in the presence of buffers which do not induce inhibition of subsequent PCR reactions and , on the products of said reverse transcription and, in a separate container or advantageously in the same container, a first polymerase chain reaction of the mRNA of a small number of lysed cells, preferably from 1 to 1000 lysed cells, is carried out, - the various products of said first polymerase chain reaction to individualize the genes, a second polymerase chain reaction is carried out on the individual genes thus separated, and the results of said second amplification reaction are evaluated , while performing an internal calibration with serial dilutions of RNA to confirm the effectiveness of RT.
  • RT reverse
  • the first and / or the second polymerase chain reaction are carried out by means of a known technique using the RT-ACP methodology.
  • this RT-ACP may be a nested ("nested") RT-ACP.
  • the general principle which is the basis of the present invention thus consists of a multiplex RT-PCR system for such a quantitative analysis, in which at least two PCR reactions are carried out successively, the first of which is carried out on the products of '' a reverse transcription reaction (RT), advantageously itself carried out in duplicate, that is to say respectively at least one specific RT and at least one calibrated RT, then after individualization of the genes of interest from the first PCR reaction, a second PCR reaction or an equivalent reaction is carried out, the results of which are analyzed.
  • RT reverse transcription reaction
  • said first polymerase chain reaction is carried out by means of a appropriate association of 5 ′ primers and 3 ′ primers, said 3 ′ primers being advantageously chosen identical to the 3 ′ primers used in reverse transcription.
  • the cell DNA coding for the gene considered is used as a reference for calculating the number of copies of genes generated by polymerase amplification.
  • One characteristic provides for the implementation of a calibration allowing the control and the evaluation of the efficiency of reverse transcription and of PCR.
  • this control is carried out by means of a polymerase chain amplification of different concentrations of cDNA at different concentrations of one of the genes concerned in the process, in parallel with the same amplification of the same number of molecules d 'MRNA of the same gene.
  • the calculations that a person skilled in the art can then perform on the basis of his knowledge thus make it possible to determine absolute numbers of copies. To do this, we use control curves with different numbers of copies. Each cell has two copies of DNA encoding a gene.
  • a reference scale is therefore established, based on a range of cell numbers (for example 1 cell / 2 cells / 4 cells / 8 cells) containing 2/4/8/16 copies of the same gene. We can then calculate in each case the number of copies from these amplification curves, and thus determine in parallel the efficiency and reproducibility of the RT and PCR reactions used.
  • the primers used in the multiplex RT-ACP do not hybridize with one another and that the products of the polymerase chain reaction amplified by virtue of them do not hybridize with each other in such a way. such that there is competition or inhibition of amplification in said first polymerase chain reaction.
  • the primers used are stored at around -80 ° C. until they are used.
  • the concentration of the primers in the first polymerase chain reaction is reduced.
  • the technique according to the invention thus makes it possible to overcome the two limitations of the prior art, indicated above. It does not use mRNA extraction and allows the study and quantification of any number of cells, up to a single cell. It also allows the simultaneous study of several mRNAs, in practice of a number of different mRNAs up to 19, in any number of cells, including in a single cell.
  • the technique according to the invention allows in practice the reliable comparison of approximately 20, advantageously 2-19 genes, with one another. It makes it possible to determine, in any cell, the number of mRNA molecules coding for the expression of these 2 to 19 genes simultaneously.
  • This technique allows the study of any number of cells, including single cells. For the first time, it is truly quantitative, and allows the quantification of the number of mRNA molecules expressed. It allows the comparison, in absolute values, of the number of mRNA molecules coding for several genes simultaneously. All of these characteristics introduce considerable progress in diagnosis and research, in particular in humans and animals. By allowing the quantification of the number of mRNA molecules coding for several genes simultaneously at the level of a single cell, this technique allows for the first time to establish cell differentiation programs.
  • the first object of the present invention is a method for the quantitative analysis in vitro and / or ex vivo of the number of mRNA molecules coding for different genes expressed at the level of cells of living organisms, on a small number of cells, preferably on a single cell, in which: reverse transcription and a first polymerase chain reaction (by RT-ACP) of the mRNA of a small number of lysed cells are carried out, while the primers chosen are placed in different exons, to allow the recognition of the amplification of the mRNA, the various products are separated from said first polymerase chain reaction, and a second polymerase chain reaction is carried out on the individual genes thus separated. We are then able to evaluate the results of the latter.
  • the primers chosen in the above method are placed in different exons so that they cannot amplify the DNA.
  • nucleic acid fragments to be amplified in said second amplification reaction are shorter, that is to say have about 150 base pairs (bp).
  • the first polymerase chain reaction is carried out over a number of cycles such that there are then enough copies in the sample collected for introduction into the second amplification reaction in polymerase chain, in order to confer good reproducibility thereon.
  • a first amplification with approximately 10 cycles has been sufficient, while for a number of copies between 16 and 2, it has been established that approximately 20 cycles of the first reaction polymerase chain reaction were required.
  • the number of cycles in the first polymerase chain reaction must be low enough to prevent any risk of an accumulation reaching saturation levels in said first amplification reaction.
  • the experiments have shown that approximately 10 cycles in said first amplification reaction should constitute an optimum for a number of mRNA molecules between approximately 16 and 60.
  • the subject of the invention is an analysis and / or diagnostic kit intended for the quantification of the expression of genes of a single cell or of a small number of cells, said kit comprising: - means for the internal calibration of RNA and that of cDNA, the set or mixture of primers for the first PCR, specific primers for each gene to be submitted to the second
  • PCR and optionally, an internal standard and / or an internal standard based on DNA, and, optionally, also lysis, reverse transcription and / or amplification buffers, and any other conventional components desired.
  • the primers are advantageously designed and / or chosen so as not to be competitive.
  • said kit is used with or comprises a DNA intercalator, advantageously such an intercalant marketed under the name Sybr-Green (Sybr-Green Master Mix, from the company Perkin-Elmer).
  • a DNA intercalator advantageously such an intercalant marketed under the name Sybr-Green (Sybr-Green Master Mix, from the company Perkin-Elmer).
  • Sybr-Green Sybr-Green Master Mix
  • said kit further comprises instructions for the use of sense and antisense primers in RT-ACP reactions for the quantification of the number of nucleic acid molecules coding for different genes expressed at the cell level living organisms, on a small number of cells or on a single cell.
  • kit according to the invention can be implemented and / or used in different levels of sophistication.
  • the invention also relates to the use of such a kit or of the method as described above, for the quantification of individual genes, in particular for the study of gene expression in biological material, in particular for the study and / or quantitative, comparative and simultaneous evaluation, of the expression of multiple genes at the level of a single cell or of a small number of cells of biological material.
  • the invention is of major interest in the field of clinical tests on animals, including humans.
  • the invention is described in more detail below, with reference to procedures used for experiments carried out both for investigative purposes and for carrying out tests in vitro or ex vivo. More specifically, the invention is now described with reference to a multiplex system which has been developed for the ex vivo study of the differentiation of T cells in an organism.
  • This multiplex implemented in accordance with the invention made it possible to evaluate with absolute quantification the expression of the mRNA coding for at least nineteen genes simultaneously present in a cell.
  • mice Individual T cells from C57 Bl / 6 mice were sorted using FACS equipment (in particular that sold under the name FACS Vantage by the company Becton Dickinson), equipped with an automatic cell deposition unit, arranged for depositing cells directly into PCR tubes into which 5 ⁇ l of PBS-DEPC lx per tube were previously introduced. The cells were lysed by cooling them to -80 ° C. Then, immediately before implementing the method according to the invention, the cells were heated at 65 ° C for 2 minutes.
  • FACS equipment in particular that sold under the name FACS Vantage by the company Becton Dickinson
  • the first round of PCR consisted of 10 amplification cycles (initial incubation for 10 min at 95 ° C; then 45 s at 94 ° C; 1 min at 60 ° C; 1 min 30 s at 72 ° C) with buffer II lx (Perkin-Elmer), MgCl2 1.2 mM (Perkin Elmer), dNTP 0.2 ⁇ M (Perkin-Elmer), 0.035 U / ⁇ l of Taq polymerase GOLD (Perkin-Elmer) and 0.01 ⁇ M of specific primers in a volume of 85 ⁇ l.
  • the products of this first PCR (2 ⁇ l) were then distributed in order to carry out a second amplification by PCR relating to each individual gene of interest, thus previously separated.
  • the amplification according to this second PCR was then carried out for 60 cycles.
  • the initial denaturation was carried out for 5 rriin at 95 ° C, followed by 30 s at 94 ° C, 30 s at 60 ° C and 30 s at 72 ° C, in 20 ⁇ l of medium containing a mixture of DNA intercalator marketed under the name Sybr-Green Master Mix (Perkin-Elmer) and 0.25 ⁇ M of specific primers, and was amplified by PCR in real time with the use of a Taqman amplification device (PCR System 7700).
  • A denotes a primer meaning for the 1st ACP
  • B represents an antisense primer for the 1st PCR
  • an antisense primer for the 2 nd ACP (except for the HPRT gene) and an RT primer
  • C denotes a sense primer for the 2 nd ACP
  • D represents antisense primer for 2nd PCR, here to the HPRT gene (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) only.
  • nuclease-free water supplied for example by Promega
  • the target regions for amplification in the gene of interest to be amplified , should be non-repetitive; the primers were developed in different exons of the target region so that the amplification region always has at least one intron; - the GC content of each primer was approximately
  • the primers for the 2nd PCR were specific in a more inner position as compared with the combination of primers for the ACP ry; all the primers have been designed so that they do not hybridize with each other; also, all the primers had to be able to hybridize only in the specific amplification regions and not with any other amplification products of the other genes; and a freely available computer program called Amplify 1.2 has been used in practice to verify the compatibility of the primer combinations.
  • RNA molecules for any given gene we proceeded by interpolation of any sample, using an evolution line (or trend curve), which we had plotted by recording in graphic form of a series of dilutions from a sample having a determined number of RNA molecules synthesized in vitro, as a function of the Ct (cycle of threshold) of a quantitative PCR in real time of these same serial dilutions.
  • the Ct of any sample is determined by the quantitative PCR in real time in accordance with the RT-ACP method according to the invention, with recording and optional graphical plotting for the number n of RNA molecules. in each sample, which then makes it possible to determine the number of RNA molecules in any sample containing it.
  • the efficiency of reverse transcription is the ability of the enzyme concerned, reverse tianscriptase, to provide cDNA from mRNA from any given gene. This efficiency can be expressed in terms of the percentage of cDNA molecules produced compared to the total number of RNA molecules present at the start of the reaction.
  • RNA molecules are used for a gene defined in reverse transcription. After completing the reverse transcription is carried out 1st round PCR, followed by a 2nd round of PCR, in fact constituting a quantitative real-time PCR according to the method according to the invention described above. This helps determine the amount of cDNA molecules produced in reverse transcription.
  • FIG. 1 represents a graph illustrating the comparative expression of mRNA of HPRT and of IFN ⁇ (or IFNg), among others, according to a traditional technique.
  • the values plotted on the ordinate are absorbance values, expressed in absolute value of the DNA intercalator SYBR Green used (abbreviated: Abs SYBR Green).
  • FIG. 2 shows the quasi-identity of the PCR amplification of DNA and RNA, on the example of two copies of a gene.
  • the accumulation curves practically overlap.
  • the graphs in FIG. 3 relate respectively to a first and a second PCA carried out in real time on populations of intestinal T cells expressing all the effector functions.
  • Fig. 3a was obtained with combinations of primers of first PCR;
  • Fig. 3b was obtained with combinations of primers of the second PCR.
  • the efficiency of PCR amplification is determined by the slope of the curve. All of the primer combinations in the first PCR amplification and in the second PCR amplification had parallel curves for the representation of the accumulation of PCR products, indicating that they had the same efficacy.
  • FIG. 3a was obtained with combinations of primers of first PCR
  • Fig. 3b was obtained with combinations of primers of the second PCR.
  • the efficiency of PCR amplification is determined by the slope of the curve. All of the primer combinations in the first PCR
  • FIG. 4 are represented the amplifications by PCR in real time of perforin and of HPRT, each time in 2 nd PCR reactions within the meaning of the present invention.
  • FIG. 4a shows the results obtained after a first PCR carried out with all the primers simultaneously in accordance with the invention
  • FIG. 4b represents the results obtained when only the primers for perforin and HPRT were present in the 1st reaction of ACP.
  • Obtaining similar quantitative results indicates that the presence of the 38 primers and 19 PCR amplification products did not interfere with the specific reaction for perforin. Similar results were obtained with all other individual genes, provided that the 38 primers present in the first PCR reaction do not react with each other and that the 19 products of this PCR reaction do not bind to d other primers than their specific primers.
  • FIG. 5 illustrates the compared results obtained with a 1st amplification by PCA over a variable number of cycles (5, 15 and 20 respectively), as well as the incorporation of Sybr-Green in a 2nd PCR amplification, each curve corresponding to an individual cell.
  • FIG. 6 it schematically illustrates the preferred succession of the basic steps of the method according to the invention.
  • the said method was also applied to the determination of the number of RNA molecules of perforin at the level of a single cell.
  • CD8 T cells from transgenic mice were tested for the expression of perforin at the level of a single cell, by means of a multiplex RT-ACP system according to the invention.
  • a second quantitative PCR was carried out on at least one of the genes isolated from the product of the first PCR, to determine the exact number of RNA molecules for at least one gene of interest .
  • This second quantitative PCR comprised a series of dilutions starting from a standard having a known concentration of RNA molecules (in practice 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 37, 16, 8 copies). This procedure made it possible to determine the number of RNA molecules of perforin in the cells studied, by comparison of the Ct value of each cell with the Ct values of the standard dilutions.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour l'analyse quantitative in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, de préférence sur une seule cellule, dans lequel: on effectue la transcription inverse et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase (par RT-ACP) de dARNm d'un faible nombre de cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, tandis que: ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase est effectuée au moyen d'une association d'amorces 5' et d'amorces 3', lesdites amorces 3' étant identiques aux amorces 3' utilisées pour la transcription inverse, on utilise, comme référence pour le calcul du nombre de copies de gènes générées par amplification par polymérase, l'ADN cellulaire individuel codant pour le gène considéré, on contrôle l'efficacité de la transcription inverse, au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase des ADNc de l'un des gènes concernés, parallèlement à la même amplification des molécules d'ARNm du même gène, sur des échantillons cellulaires contenant le même nombre de molécules. et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification.

Description

PROCEDE ET MOYENS FOUR L'ANALYSE QUANTITATIVE DU
NOMBRE DES MOLÉCULES CODANT POUR DES GÈNES
DIFFÉRENTS DANS DES CELLULES
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne le domaine de la biologie. Elle concerne plus précisément l'analyse et le diagnostic en biologie, et plus particulièrement encore l'analyse quantitative du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau des cellules animales ou végétales. L'invention trouve des applications dans tous les secteurs de la biologie et/ ou de la médecine, dans lesquels il est utile de pouvoir connaître un tel nombre de molécules d'acides nucléiques codantes, à des fins aussi bien de diagnostic que de traitement et/ ou de suivi médical. L'invention repose sur une approche méthodologique utilisant un système multiplex de techniques d'amplification, notamment par RT-ACP (ou RT-PCR en anglais), appliqué à des molécules d'acide nucléique codant pour des gènes différents exprimés au niveau des cellules.
Bien que cela ne soit pas limitatif, l'invention peut être mise en pratique préférablement sur un très petit nombre de cellules ou même sur une cellule unique.
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE De nos jours, il est nécessaire de pouvoir caractériser un nombre de plus en plus restreint de cellules si l'on veut pouvoir faire progresser les méthodes de diagnostic. A cet effet, les méthodes de séparation et d'isolement connues de l'homme du métier permettent maintenant de subdiviser des populations complexes en des sous-populations ayant des caractéristiques phénotypiques différentes, probablement associées à des fonctions biologiques différentes. Certaines populations cellulaires (par exemple les cellules précurseurs ou "stem cells") sont habituellement présentes dans des proportions inférieures à 1% dans les matières biologiques qui les contiennent. Ainsi chez l'homme, pour lequel ces populations minoritaires sont habituellement recueillies à partir du sang périphérique, le nombre limité de cellules qui peuvent être récupérées constitue une limitation considérable pour toute approche diagnostique utilisant la technique de transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase ou RT-ACP (en anglais "RT-PCR").
Classiquement, la quantification de l'expression génique de cellules à ARN nécessite l'extraction de l'ARNm. Or, les techniques d'extraction d'ARNm ne sont pas très efficaces. Cette limitation inhérente aux techniques d'extraction mises en oeuvre oblige à utiliser un nombre relativement important de cellules (d'ordinaire au moins 100.000 cellules) pour en extraire lΑRNm. Or, l'efficacité de l'extraction de l'ARNm diminue au fur et à mesure qu'on réduit le nombre des cellules. Même quand environ 100.000 cellules sont utilisées, l'efficacité de l'extraction d'ARNm est faible. Ces données entraînent alors deux types de limitations, à savoir respectivement le nombre de cellules qui peuvent être étudiées et le nombre de fonctions/caractéristiques qui peuvent être déterminées dans chaque population de cellules étudiée.
Les techniques de RT-ACP actuelles, même celles appelées "quantitatives" ne permettent pas la quantification du nombre des cellules d'ARNm exprimées. Elles permettent tout au plus de comparer l'amplification d'un témoin interne d'ADNc avec l'ADNc exprimé par une population cellulaire. Ces techniques font l'impasse sur un paramètre important, l'efficacité de la transcription inverse, qui peut varier avec le type et/ou la concentration d'ARNm, la localisation du fragment d'ADN à amplifier, et l'enzyme utilisée pour la transcription inverse.
Par ailleurs, dans la majorité des cas où l'on amplifie actuellement des gènes différents par des techniques de RT-ACP, on peut comparer l'expression d'un même gène dans des populations différentes, mais on ne peut pas comparer l'expression relative de plusieurs gènes dans la même population. C'est ainsi qu'il n'est pas possible de déterminer si une population de cellules exprime plus d'ARNm codant pour un gène que pour un autre.
Même avec les techniques actuellement pratiquées, selon lesquelles on tente de quantifier les produits d'amplifications par RT-ACP, l'interprétation des résultats est trompeuse s'il s'agit d'une population cellulaire.
En effet, si l'on s'appuie sur la quantification au niveau d'une population de cellules, le nombre total peut provenir aussi bien de quelques cellules exprimant des taux élevés d'ARNm que de très nombreuses cellules n'exprimant chacune que de faibles quantités d'ARNm. Il est aisé de conclure que les significations de ces deux occurrences n'ont rien de comparable, et que par conséquent les prétendus résultats que l'on tire de telles méthodes sont fortement sujets à caution, comme cela sera montré plus loin.
Les phénomènes de différenciation cellulaire impliquent aussi fréquemment plusieurs gènes simultanément. Ils peuvent être associés à l'induction ou l'extinction de l'expression d'un groupe de gènes, ou à la variation de la proportion de l'expression de ces mêmes gènes. L'évaluation de ces paramètres dans une population cellulaire est donc également trompeuse. Elle ne permet pas de connaître le profil d'expression génique de chaque cellule individuelle. Par exemple, la fonction cytotoxique des lymphocytes T implique la co-expression simultanée de perforine et granzymes dans la même cellule. Or seules les cellules co-exprimant ces deux gènes sont des cellules efficaces du point de vue cytotoxique. Les méthodes reposant sur l'étude des populations cellulaires ne permettent pas de savoir si les gènes étudiés sont exprimés par la même cellule ou par des cellules différentes, présentes dans la même population cellulaire. Seules des études de co-expression par des cellules uniques pourraient permettre la détermination des programmes de différenciation qui imposent un profil génétique particulier pou chaque cellule individuelle différenciée.
Les études effectuées jusqu'à ce jour par des techniques d'amplification sur une cellule unique ont visé à améliorer cette situation et à procurer des résultats interprétables plus directement et avec plus de fiabilité. Elles n'ont cependant toujours pas permis une appréciation absolue au sens vrai, et donc ne procurent pas un outil de quantification suffisamment fiable.
Ainsi, D. Lôffert et al., dans Immunity, vol. 4, 133-144, février 1996, éd. Cell Press, décrivent l'étude de l'exclusion aUélique sur le locus ou emplacement IgH dans des cellules B de souris au moyen d'une approche par ACP sur cellule unique, pour conclure qu'une telle exclusion allélique nécessite l'expression du récepteur de cellules pré-B soit contenant une chaîne μ, soit contenant une chaîne Dμ. L'étude porte sur les rôles respectifs de la chaîne μ et de son récepteur de cellule pré-B dans cette exclusion allélique, par l'analyse du réarrangement du gène d'IgH. Le mode opératoire utilisé met en oeuvre un triage de cellules pour traitement d'une seule cellule, ainsi qu'une ACP classique pour amplification de l'ADN génomique, accompagnée d'une hybridation croisée des amorces. Cette méthode portait sur l'amplification de l'ADN et non pas de TARN. M. Correia-Neves et al., dans Immunity, vol. 14, 21-32, janvier 2001, éd. Cell Press, traitent du répertoire des cellules T et de son évolution. Ils préconisent pour cette étude d'utiliser une ACP sur cellule unique et un séquençage à haut débit. Cette étude a été faite avec de l'ARNm et de l'ADN. Dans le cas des deux dernières études susdites, même si plusieurs amorces ont été utilisées dans l'ACP, un seul fragment génique a été amplifié dans chaque cellule (soit respectivement la chaîne lourde des Ig ou la chaîne β du récepteur de cellules T (TCR)). Dans ces circonstances, ces réactions d'ACP n'avaient pas les mêmes exigences que les systèmes multiplex, dans lesquels plusieurs gènes doivent être amplifiés dans la même cellule. Elles n'imposent pas de restrictions associées à la compétition entre les amorces et les différents produits d'ACP, présents dans le même puits. De plus, les deux dernières études susdites n'étaient pas quantitatives et l'efficacité de l'amplification (dans ces deux études) et de la transcription inverse (dans les travaux de M. Correia-Neves, et al.) n'a pas été déterminée. Des études précédentes du groupe de recherche dont font partie les présents inventeurs (voir H. Veiga-Fernandes et al., dans Nature Imrnunology (irnmunol.nature.com), vol. 1, No. 1, juillet 2000) concernent l'influence des propriétés des cellules T mémoire sur l'efficacité des réponses immunes secondaires, avec comparaison de la réponse immune in vivo des mêmes nombres de cellules T naïves et des cellules T mémoire avec le même récepteur de cellules T. La méthode utilisée comporte une analyse par ACP sur cellule unique, en deux étapes, avec indication de ce que les amorces 3' de l'ACP sont les mêmes que celles utilisées pour la transcription inverse. Dans cette étude, il est précisé par les auteurs que les RT-ACP sur cellule unique ne sont pas quantitatives, et seulement quatre gènes ont ainsi pu être étudiés selon une approche uniquement comparative. La méthode utilisée permet uniquement de déterminer la présence ou non de transcrits d'un gène déterminé ; elle ne permet pas la quantification absolue de la quantité de molécules d'ARN. Dans le document WO 00/20629 est décrite une méthode pour la détermination de la quantité d'un ARN spécifique dans un échantillon de tissu. Cette méthode vise à permettre l'analyse de transcrits rares, tels que des cytokines. Elle fait intervenir une procédure particulière d'isolement d'ARN, une RT-ACP en une réaction enzymatique unique, puis la détection et une quantification, de préférence avec un ARN étalon. Cette méthode ne peut s'appliquer qu'à un tissu, pour un seul gène. Dans cette technique, l'ARN à quantifier doit être extrait de l'échantillon, ce qui entraîne des pertes et empêche de prétendre à une détermination absolue d'un nombre de molécules d'ARN pour un gène sélectionné présent dans échantillon.
U. Walter et al., dans Eur. J. Immunol. 2000, 30: 1224-1232, décrivent le suivi de l'expression génique de membres de la famille du récepteur de facteur de nécrose tumorale par une ACP multiplex sur cellule unique, avec pour résultat la mise en évidence de la contribution apoptotique de cellules β comme facteur de progression du diabète auto-imrnun. Tout comme pour les études antérieures mentionnées plus haut, les méthodes utilisées n'étaient pas quantitatives, l'expression relative des gènes n'a pas été comparée, et l'efficacité de la transcription inverse et des réactions d'ACP n'a pas été déterminée. De plus, ces auteurs font état d'une limitation importante de leur technique, à savoir l'impossibilité d'associer plus de 5 gènes dans le même multiplex, en faisant état des effets fortement inhibiteurs de cette association.
B. Rocha, dans Nature Immunology (immunol.nature.com), vol. 3, No.
3, mars 2002, décrit rinfluence sur la mémoire irnmune à long terme des signaux reçus via le CMH par les cellules concernées. Il est indiqué que l'étude de la fonction des cellules T nécessite des tests nouveaux et plus précis, et des approches plus complexes de l'analyse du fonctionnement des cellules T.
Il y avait donc un besoin pour une technique réellement fiable et quantifiant de façon absolue l'expression des gènes respectifs sur une cellule unique ou sur un très petit nombre de cellules.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION Conformément à la présente invention on a maintenant trouvé de manière inattendue que l'on peut procurer de tels résultats, notamment une quantification absolue du nombre de molécules d'ARNm codant pour des gènes différents dans des cellules contenant ceux-ci, en mettant en oeuvre des techniques d'amplification sur un très petit nombre de cellules, ou même sur une cellule unique, dans des conditions et avec des paramètres opératoires qui seront exposés plus loin. En d'autres termes, on procure selon l'invention des moyens alternatifs pour la réalisation de réactions d'amplification, ainsi que leur étalonnage et leur quantification, avec pour objectif principal de permettre la quantification absolue du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants.
La présente invention procure ainsi un procédé pour l'analyse quantitative par RT-ACP ou une technique équivalente in vitro et/ ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, ou même sur une seule cellule, dans lequel: on effectue une transcription inverse (ou réverse-transcription, en abrégé RT) avec des amorces 3' appropriées, en présence de tampons n'induisant pas rinhibition des réactions d'ACP ultérieures et, sur les produits de ladite transcription inverse, dans un récipient séparé ou avantageusement dans le même récipient, on conduit une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, de préférence de 1 à 1000 cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, - on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification, tandis que dans ledit procédé on effectue un étalonnage interne avec des dilutions sériées d'ARN pour confirmer l'efficacité de la RT.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera mieux comprise en référence aux dessins annexés, qui illustrent certains résultats ayant trait aux moyens préconisés selon l'invention et aux résultats obtenus par leur mise en oeuvre, et dans lesquels: Fig. 1 représente un graphe illustrant l'expression comparée d'ARNm de HPRT et de γlFN, entre autres, selon une technique traditionnelle. Fig. 2 est un graphe montrant la quasi-identité de l'amplification par ACP d'ADN et d'ARN. Fig. 3 représente un graphe en deux parties concernant respectivement une première et une deuxième ACP conduites en temps réel sur des populations de cellules T intestinales exprimant toutes les fonctions effectrices. Fig. 3a a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de première ACP; Fig. 3b a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de deuxième ACP.
Fig. 4 représente un graphe montrant les amplifications par ACP en temps réel de perforine et de HPRT, dans des deuxièmes réactions d'ACP au sens de la présente invention. Fig. 4a montre les résultats obtenus après une première ACP effectuée avec toutes les amorces simultanément conformément à l'invention; Fig. 4b représente les résultats obtenus lorsque seules les amorces pour la perforine et le HPRT étaient présentes dans la première réaction d'ACP.
Fig. 5 est un graphe illustrant les résultats comparés obtenus avec une première amplification par ACP sur un nombre variable de cycles
(5, 15 et 20 respectivement), ainsi que l'incorporation de Sybr-
Green dans une deuxième amplification par ACP, chaque courbe correspondant à une cellule individuelle.
Fig. 6 est une illustration schématique de la succession des étapes fondamentales du procédé selon l'invention.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'invention a pour premier objet un procédé pour l'analyse quantitative par RT-ACP ou une technique équivalente in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, ou même sur une seule cellule, dans lequel: on effectue une transcription inverse (RT) avec des amorces 3' appropriées, en présence de tampons n'induisant pas rinhibition des réactions d'ACP ultérieures et, sur les produits de ladite transcription inverse et, dans un récipient séparé ou avantageusement dans le même récipient, on conduit une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, de préférence de 1 à 1000 cellules lysées, - on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification, tandis qu'on effectue un étalonnage interne avec des dilutions sériées d'ARN pour confirmer l'efficacité de la RT.
En pratique, on préconise d'utiliser pour ledit étalonnage, au moins une référence composée d'un nombre variable de molécules d'ADNc, en parallèle avec le même nombre de molécules d'ARNm, l'amplification simultanée de ce moyen d'étalonnage permettant de vérifier l'efficacité de la RT pour des concentrations différentes de la molécule d'ARNm, en même temps que l'efficacité de l'ACP.
Dans une forme de réalisation du procédé selon l'invention, la première et/ou la deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sont mises en oeuvre au moyen d'une technique connue utilisant la méthodologie de la RT-ACP. En variante, cette RT-ACP peut être une RT- ACP nichée ("nestée").
Le principe général qui est à la base de la présente invention consiste ainsi en un système multiplex de RT-PCR pour une telle analyse quantitative, dans lequel on conduit successivement au moins deux réactions d'ACP, dont la première est effectuée sur les produits d'une réaction de transcription inverse (RT), avantageusement elle-même effectuée en double, c'est-à-dire respectivement au moins une RT spécifique et au moins une RT étalonnée, puis après individualisation des gènes d'intérêt issus de la première réaction d'ACP, on effectue une deuxième réaction d'ACP ou une réaction équivalente, dont les résultats sont analysés.
Dans ce procédé, la transcription inverse est mise en oeuvre d'une manière classique pour ce type de technique.
Selon une forme de réalisation, ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase est effectuée au moyen d'une association appropriée d'amorces 5' et d'amorces 3', lesdites amorces 3' étant avantageusement choisies identiques aux amorces 3' utilisées dans la transcription inverse.
Pour la réalisation de la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on utilise avantageusement ensemble toutes les amorces 3' et 5' appropriées pour la totalité des gènes contenus dans lesdites cellules.
Selon une forme de réalisation avantageuse, on utilise, comme référence pour le calcul du nombre de copies de gènes générées par amplification par polymérase, l'ADN cellulaire individuel codant pour le gène considéré.
Une caractéristique prévoit la mise en oeuvre d'un étalonnage permettant le contrôle et l'évaluation de l'efficacité de la transcription inverse et de l'ACP. Selon une réalisation, ce contrôle s'effectue au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase de différentes concentrations d'ADNc à différentes concentrations de l'un des gènes concernés dans le procédé, parallèlement à la même amplification du même nombre de molécules d'ARNm du même gène. Les calculs que l'homme du métier peut alors effectuer sur la base de ses connaissances permettent ainsi de déterminer des nombres de copies absolus. Pour ce faire, on utilise des courbes témoin avec différents nombres de copies. Chaque cellule possède deux copies d'ADN codant pour un gène. En parallèle avec les RT-ACP, on établit donc une échelle de référence, fondée sur une gamme de nombres de cellules (par exemple 1 cellule/2 cellules/4 cellules/8 cellules) contenant respectivement 2/4/8/16 copies du même gène. On peut ensuite calculer dans chaque cas les nombres de copies à partir de ces courbes d'amplification, et ainsi déterminer en parallèle l'efficacité et la reproductibilité des réactions de RT et d'ACP mises en oeuvre.
Dans la pratique, il convient de veiller à ce que les amorces choisies ne donnent pas lieu à une compétition entre elles. En pratique cela revient à faire en sorte que les amorces utilisées dans la RT-ACP multiplex n'hybrident pas entre elles et que les produits de la réaction d'amplification en chaîne par polymérase amplifiés grâce à elles n'hybrident pas entre eux de telle manière qu'il y ait compétition ou inhibition d'amplification dans ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase. Avantageusement les amorces utilisées sont conservées à environ -80°C jusqu'à leur utilisation.
Selon une forme de réalisation préférée, on réduit la concentration des amorces dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase. La technique selon l'invention permet ainsi de vaincre les deux limitations de la technique antérieure, indiquées plus haut. Elle n'utilise pas d'extraction de l'ARNm et permet l'étude et la quantification d'un nombre quelconque de cellules, jusqu'à une cellule unique. Elle permet en outre l'étude simultanée de plusieurs ARNm, en pratique d'un nombre d'ARNm différents allant jusqu'à 19, dans un nombre de cellules quelconque, y compris dans une seule cellule.
Elle est à notre connaissance la première à permettre la quantification du nombre absolu de molécules d'ARNm, en fournissant un étalon interne permettant l'évaluation de l'efficacité de la transcription inverse, ainsi que l'évaluation de l'efficacité de l'amplification par ACP.
La technique selon l'invention permet en pratique la comparaison fiable d'environ 20, avantageusement de 2-19 gènes, entre eux. Elle permet de déterminer, dans une cellule quelconque, le nombre de molécules d'ARNm codant pour l'expression de ces 2 à 19 gènes simultanément. Cette technique permet l'étude d'un nombre quelconque de cellules, inclusivement de cellules uniques. Elle est pour la première fois réellement quantitative, et permet la quantification du nombre des molécules d'ARNm exprimées. Elle permet la comparaison, en valeurs absolues, du nombre de molécules d'ARNm codant pour plusieurs gènes simultanément. L'ensemble de ces caractéristiques introduit un progrès considérable dans le diagnostic et la recherche, en particulier chez l'homme ou l'animal. En permettant la quantification du nombre de molécules d'ARNm codant pour plusieurs gènes simultanément au niveau d'une cellule unique, cette technique permet pour la première fois d'établir des programmes de différenciation cellulaire. Sous un autre aspect, le premier objet de la présente invention est un procédé pour l'analyse quantitative in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'ARNm codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules, de préférence sur une seule cellule, dans lequel: on effectue la transcription inverse et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase (par RT-ACP) de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, tandis que les amorces choisies sont placées dans des exons différents, pour permettre la reconnaissance de l'amplification de l'ARNm, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés. On est alors en mesure d'évaluer les résultats de cette dernière.
Selon une caractéristique préférée, les amorces choisies dans le procédé ci-dessus sont placées dans des exons différents de telle sorte qu'elles ne puissent pas amplifier l'ADN.
Il s'est avéré avantageux de sélectionner la (les) portion(s) de gène à amplifier dans cette première réaction d'amplification, en pratique par une étude préalable détaillée des gènes concernés, afin de sélectionner des portions de ceux-ci ayant une structure similaire et une sensibilité comparable à la transcription inverse et à l'amplification en chaîne par polymérase. Egalement, pour une efficacité similaire de la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on veille à ce que les fragments amplifiés aient la même taille. De plus, dans ce contexte, plus lesdits fragments sont courts, plus la réaction de RT-ACP est efficace. Ainsi, il est recommandé de sélectionner des fragments d'acide nucléique ayant environ
300 à 400 paires de bases dans ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase. De plus, il est également avantageux que les fragments d'acide nucléique à amplifier dans ladite deuxième réaction d'amplification soient plus courts, c'est-à-dire aient environ 150 paires de bases (pb).
Par ailleurs, dans le procédé selon l'invention, dans lequel plusieurs gènes différents peuvent être traités selon un mode multiplex, il s'est avéré particulièrement avantageux d'utiliser dans l'étape de transcription inverse des tampons n'induisant pas rinhibition des réactions d'ACP, tels que par exemple un tampon identique ou semblable à celui qu'on prévoit d'utiliser dans les réactions d'ACP, contrairement au cas des tampons de transcription inverse conventionnels. On préconise par conséquent pour la transcription inverse selon l'invention des tampons avantageusement choisis parmi les tampons utilisés classiquement pour les réactions d'ACP.
Cet aspect est déterminant pour permettre d'augmenter le nombre des gènes que l'on peut tester dans le système multiplex concerné. Selon une forme de réalisation, on conduit la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur un nombre de cycles tel que l'on dispose ensuite d'assez de copies dans l'échantillon recueilli pour introduction dans la deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase, afin de conférer une bonne reproductibilité à celle-ci. Avantageusement, pour 16 copies ou plus introduites dans la première ACP, une première amplification avec environ 10 cycles s'est avérée suffisante, tandis que pour un nombre de copies entre 16 et 2, on a pu établir que 20 cycles environ de la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase étaient nécessaires. Selon une autre caractéristique, on a établi que le nombre de cycles dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase devait être assez faible pour prévenir tout risque d'une accumulation atteignant des niveaux de saturation dans ladite première réaction d'amplification. Là encore, les expériences ont montré qu'environ 10 cycles dans ladite première réaction d'amplification devrait constituer un optimum pour un nombre de molécules d'ARNm entre 16 et 60 environ.
Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un kit d'analyse et/ ou de diagnostic destiné à la quantification de l'expression de gènes d'une cellule unique ou d'un petit nombre de cellules, ledit kit comportant: - des moyens pour l'étalonnage interne de l'ARN et celui de l'ADNc, l'ensemble ou mélange des amorces pour la première ACP, des amorces spécifiques pour chaque gène à soumettre à la deuxième
ACP, et en option, un étalon interne et/ou un étalon interne sur base d'ADN, et, en option, également des tampons de lyse, de transcription inverse et/ou d'amplification, et tous autres composants conventionnels souhaités.
Les amorces sont avantageusement conçues et/ou choisies de manière à ne pas être compétitives. Selon une forme de réalisation, ledit kit est utilisé avec ou comporte un intercalant de l'ADN, avantageusement un tel intercalant commercialisé sous la dénomination Sybr-Green (Sybr-Green Master Mix, de la société Perkin-Elmer). Un tel kit est avantageusement fourni avec des indications d'utilisation appropriées pour procurer des précisions sur les conditions d'utilisation du kit par l'usager.
Selon une forme de réalisation, ledit kit comporte en outre des instructions pour rutilisation des amorces sens et anti-sens dans des réactions de RT-ACP pour la quantification du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules ou sur une seule cellule.
Dans la pratique, le kit selon l'invention peut être mis en oeuvre et/ ou utilisé dans différents niveaux de sophistication.
L'invention a également pour objet rutilisation d'un tel kit ou du procédé tel que décrit plus haut, pour la quantification de gènes individuels, en particulier pour l'étude de l'expression génique dans un matériel biologique, en particulier pour l'étude et/ou l'évaluation quantitative, comparée et simultanée, de l'expression de multiples gènes au niveau d'une seule cellule ou d'un petit nombre de cellules d'un matériel biologique.
En pratique, bien que cela ne soit nullement limitatif, il est préféré de procurer dans un tel kit des moyens pour la réalisation simultanée de l'analyse quantitative, comparative et simultanée du nombre de molécules d'ARNm codant pour un maximum pratique de 19 gènes différents exprimés au niveau d'une cellule unique. Au-delà de ce nombre, on ne peut trouver aisément dans les séquences des gènes étudiés de possibilité réelle de non- compétition entre elles.
De manière plus générale, l'invention présente un intérêt majeur dans le domaine des tests cliniques sur les animaux, y compris l'homme.
L'invention est décrite plus en détail ci-après, en référence à des modes opératoires utilisés pour des expérimentations effectuées tant à des fins d'investigation que pour la réalisation d'essais in vitro ou ex vivo. Plus spécifiquement, l'invention est maintenant décrite en référence à un système multiplex qui a été développé pour l'étude ex vivo de la différenciation des cellules T dans un organisme. Ce multiplex mis en oeuvre conformément à l'invention a permis d'évaluer avec quantification absolue l'expression de l'ARNm codant pour au moins dix neuf gènes simultanément présents dans une cellule.
Mode opératoire
On a trié des cellules T individuelles de souris C57 Bl/6 au moyen d'un équipement pour FACS (en particulier celui commercialisé sous la dénomination FACS Vantage par la société Becton Dickinson), équipé d'une unité de déposition de cellules automatique, agencée pour le dépôt des cellules directement dans des tubes pour ACP dans lesquels on avait préalablement introduit 5 μl de PBS-DEPC lx par tube. On a lysé les cellules en les refroidissant à -80°C. Ensuite, immédiatement avant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on a chauffé les cellules à 65°C pendant 2 minutes.
Après refroidissement à 4°C, on a effectué une transcription inverse de l'ARN pendant 1 h à 37° avec 0,13 μM d'amorces 3' spécifiques (voir plus loin) dans un volume de 10 μl contenant également du tampon II lOx (Perkin-Elmer, Brauchburg, NJ), MgCl2 2 mM (Perkin-Elmer), dNTP 1 mM (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), un agent bloquant de RNase (2,6 U/μl) (Stratagene, La Jolla, CA) et du M-MLV (2,3 U/μl) (Perkin-Elmer). La réaction a été stoppée par incubation 3' à 95°C. Les ADNc ont été amplifiés par une réaction d'ACP nestée, en deux étapes.
Le premier round d'ACP consistait en 10 cycles d'amplification (incubation initiale pendant 10 min à 95°C; puis 45 s à 94°C; 1 min à 60°C; 1 min 30 s à 72°C) avec du tampon II lx (Perkin-Elmer), MgCl2 1,2 mM (Perkin Elmer), dNTP 0,2 μM (Perkin-Elmer), 0,035 U/μl de Taq polymérase GOLD (Perkin-Elmer) et 0,01 μM d'amorces spécifiques dans un volume de 85 μl.
Les produits de cette première ACP (2 μl) ont ensuite été répartis pour mise en oeuvre d'une deuxième amplification par ACP portant sur chaque gène individuel d'intérêt, ainsi préalablement séparé. L'amplification selon cette deuxième ACP a ensuite été conduite pendant 60 cycles. La dénaturation initiale a été opérée pendant 5 rriin à 95°C, suivie de 30 s à 94°C, 30 s à 60°C et 30 s à 72°C, dans 20 μl de milieu contenant un mélange d'intercalant d'ADN commercialisé sous la dénomination Sybr-Green Master Mix (Perkin-Elmer) et 0,25 μM d'amorces spécifiques, et on a amplifié par ACP en temps réel avec utilisation d'un appareil d'amplification Taqman (PCR System 7700).
Pour ces réactions respectivement de RT et de lere et 2eme ACP, on a élaboré les mélanges et/ou ensembles d'amorces suivants, utilisables à convenance en fonction des besoins pour chacun des gènes respectivement indiqués, à titre d'exemples: TNFbêta
A. 5'-TCAGGATCCTACCTCCTTTC-3' (SEQ ID NO.l)
B. 5'-ATCAGGAGGGAGTTGTTGCT-3' (SEQID NO.2) G 5'-TTCTCCACATGACACTGCTC-3' (SEQID NO.3) TNF alpha
A. 5'-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3' (SEQ ID NO.4)
B. 5'-AACCTGGGAGTAGACAAGGT-3' (SEQ ID NO.5) G 5'-CCTCCCTCTCATCAGTTCTA-3' • (SEQ ID NO.6) Granzyme B A. 5'-GTCAATGTGAAGCCAGGAGA-3' (SEQ ID NO.7)
B. 5'-AGGATCCGATGTTGCTTCTG-3' (SEQ ID NO.8)
C. S'-GGGAGTGTGAGTCCTACTTT-S' (SEQ ID NO.9) CDéO ligand
A. 5'-TCCTTGCTGAACTGTGAGGA-3' (SEQID NO.10) B. 5'-TGCCGCCTTGAGTAAGATTC-3' (SBQ ID NO.il)
C. 5'-ACACGTTGTAAGCGAAGCCA-3' (SEQ ID NO.Î2) IL-4
A. 5'-TGACGGCACAGAGCTATTGA-3' (SEQ ID NO.13)
B. 5'-ATGGTGGCTCAGTACTACGA-3' (SEQ ID NO.14) C. 5'-AGAGAGTGAGCTCGTCTGTA-3' (SEQID NO.15)
HPRT
A. 5'-TTCTTTGCTGACCTGCTGGA-3' (SEQID NO.16)
B. 5'-ATCCAACACTTCGAGAGGTC-3' (SEQ ID NO.17)
C. 5'-GGTGGAGATGATCTCTCAAC-3' (SEQID NO.18) D. 5'-CTGTACTGCTTAACCAGGGA-3' (SEQ ID NO.19) IFN gamma
A. 5'-GCTCTGAGACAATGAACGCT-3' (SEQIDNO.20)
B. 5'-AAAGAGATAATCTGGCTCTGC-3' (SEQIDNO.21)
C. 5'-TGTTTCTGGCTGTTACTGCC-3' (SEQIDNO.22) IL-2
A. 5'-TCAAGTCCTGCAGGCATGTA-3' (SEQIDNO.23)
B. S'-TCAATTCTGTGGCCTGCTTG-S' (SEQIDNO.24)
C. 5'-CTCTACAGCGGAAGCACAGC-3' (SEQIDNO.25) Perforine A. 5'-TCACACTGCCAGCGTAATGT-3' (SEQIDNO.26)
B. 5'-CTGTGGTAAGCATGCTCTGT-3' (SEQIDNO.27)
C. 5'-CACAGTAGAGTGTCGCATGT-3' (SEQIDNO.28) Granzyme A
A. 5'-TCAAATACCATCTGTGCTGG-3' (SEQ ID NO.29) B. 5'-AGAGGGAGCTGACTTATTGC-3' (SEQIDNO.30)
C. 5'-GGGATCTACAACTTGTACGG-3' (SEQ ID NO.31) Pas ligand
A. 5'-TTCATGGTTCTGGTGGCTCT-3' (SEQIDNO.32)
B. 5'-GAGCGGTTCCATATGTGTCT-3' (SEQIDNO.33) C. 5'-TGTATCAGCTCTTCCACCTG-3' (SEQIDNO.34)
TGFbêta
A. 5'-ACCATCCATGACATGAACCG-3' (SEQIDNO.35)
B. 5'-CAATCATGTTGGACAACTGC-3' (SEQIDNO.36)
C. 5'-GCTACCATGCCAACTTCTGT-3' (SEQID O.37) CD3 epsilon
A. 5'-ACCAGTGTAGAGTTGACGTG-3' (SEQ ID NO.38)
B. 5'-TATGGCTACTGCTGTCAGGT-3' (SEQ ID NO.39)
C. 5'-GCTACTACGTCTGCTACACA-3' (SEQIDNO.40) IL-10 A. 5'-TGGGAACTGAGGTATCAGAG-3' (SEQIDNO.41)
B. 5'-TGGAGCAGGTGAAGAGTGAT-3' (SEQIDNO.42)
C. 5'-CCAGCAGACTCAATACACAC-3' (SEQIDN0.43) TGFbêta RI
A. 5'-GTCTCAGTCACTGAGACCA-3' (SEQ ID N0.44) B. 5'-AGGTGAATGACAGTGCGGTT-3' (SEQIDN0.45)
C. 5'-TGCAATCAGGACCACTGCAA-3' (SEQIDN0.46) TGFbêt RII
A. 5'-AGATGCATCCATCCACCTAA-3' (SEQ ID NO.47)
B. 5'-TGCACTCTTCCATGTTACAG-3' (SEQ ID NO.48)
C. 5'-CGATGTGAGACTGTCCACTT-3' (SEQ ID NO.49) TG bêta EIII
A. 5'-GAGTGAACGATCCATGACAG-3' (SEQ ID NO.50)
B. 5'-TGACTGACAGGGCGATATTC-3' (SEQ ID NO.51)
C. 5'-CATTGGACAATGGCTACAGC-3' (SEQ ID NO.52) IL10R alpha A. 5'-AACAGTCAGTACTCCAACT-3' (SEQ IDNO.53)
B. 5'-CTGCTCCGTCGTGATAAGTA-3' (SEQ ID NO.54)
C. 5'-CGGCATCATCTATGGGACAA-3' (SEQ ID NO.55) UN gamma RII(bêta)
A. 5'-GGACATCACAGAGACAAAGT-3' (SEQ ID NO.56) B. 5'-CTGTATGGCTTCAGATTGCC-3' (SEQ ID NO.57)
C. 5'-CAGTAGTGGACAAGATACTG-3' (SEQ ID NO.58)
OU
A désigne une amorce sens pour la lere ACP,
B représente une amorce anti-sens pour la lere ACP, une amorce anti- sens pour la 2eme ACP (sauf pour le gène HPRT) et une amorce de RT, C désigne une amorce sens pour la 2eme ACP, et D représente une amorce antisens pour la 2eme ACP, ici pour le gène de HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase) uniquement.
Il est en outre recommandé, - d'utiliser de l'eau exempte de nucléase (fournie par exemple par Promega); de ne pas décongeler les amorces (aussi bien de RT que d'ACP) plus de deux fois et de les aliquoter et les conserver au froid; d'utiliser des espaces ou volumes séparés pour respectivement la RT, la 1ère ACP et la 2ème ACP. Elaboration et sélection des amorces
Pour l'élaboration de ces amorces, on a suivi la méthodologie suivante, dont tous les paramètres individuels et leurs combinaisons techniquement possibles font partie intégrante de la présente invention: - les régions cibles pour l'amplification, dans le gène d'intérêt à amplifier, devaient être non-répétitives; les amorces ont été élaborées dans différents exons de la région cible de telle sorte que la région d'amplification comporte toujours au moins un intron; - la teneur en GC de chaque amorce était approximativement de
50%; la taille du fragment d'amplification était la même pour chaque gène, dans la première réaction d'ACP; les amorces pour la 2eme ACP spécifique étaient dans une position plus interne, par comparaison avec la combinaison d'amorces pour la lère ACP; toutes les amorces ont été conçues pour qu'elles n'hybrident pas entre elles; également, toutes les amorces devaient pouvoir hybrider seulement dans les régions d'amplification spécifiques et pas avec tous autres produits d'amplification des autres gènes; et on a utilisé en pratique un programme d'ordinateur, dénommé Amplify 1.2, disponible librement, pour s'assurer de la compatibilité des combinaisons d'amorces.
Détermination de la quantité de molécules dARN
Pour la détermination du nombre de molécules d'ARN pour n'importe quel gène donné, on a procédé par interpolation d'un échantillon quelconque, en utilisant une droite d'évolution (ou courbe de tendance), que l'on avait tracée par enregistrement sous forme graphique d'une série de dilutions provenant d'un échantillon ayant un nombre déterminé de molécules d'ARN synthétisées in vitro, en fonction du Ct (cycle de seuil, ou en anglais Cycle of threshold) d'une ACP quantitative en temps réel de ces mêmes dilutions en série. En d'autres termes, le Ct d'un échantillon quelconque est déterminé par l'ACP quantitative en temps réel conformément au procédé de RT-ACP selon l'invention, avec enregistrement et tracé graphique optionnel pour le nombre n de molécules d'ARN dans chaque échantillon, ce qui permet alors la détermination du nombre de molécules d'ARN dans tout échantillon en contenant.
Détermination de l'efficacité de la transcription inverse
L'efficacité de la transcription inverse est la capacité de l'enzyme concernée, la tianscriptase inverse, à fournir de l'ADNc à partir d'ARNm à partir de n'importe quel gène déterminé. Cette efficacité peut être exprimée en termes de pourcentage de molécules d'ADNc produites par rapport au nombre total des molécules d'ARN présentes au début de la réaction.
Ainsi, pour la détermination de l'efficacité de la transcription inverse, on utilise différentes quantités connues de molécules d'ARN pour un gène défini dans la transcription inverse. Après avoir accompli la transcription inverse, on effectue un 1er round d'ACP, suivi d'un 2eme round d'ACP, constituant en réalité une ACP quantitative en temps réel, conformément au procédé selon l'invention, décrit plus haut. Cela permet de déterminer la quantité de molécules d'ADNc produites dans la transcription inverse.
A des fins de comparaison, on amplifie par un 1er round d'ACP, suivi par une ACP quantitative en temps réel, les mêmes quantités exactes de molécules d'ADNc que celles utilisées dans la transcription inverse, qui représentent le nombre de molécules d'ADNc présentes si l'efficacité de la transcription inverse était de 100%.
Les valeurs du coefficient Ct (Cycle de seuil) des tracés des résultats d'amplification, dans une ACP quantitative en temps réel des mêmes molécules d'ARN et molécules d'ADNc permettent alors de déterminer le pourcentage de molécules d'ADNc produites dans la transcription inverse, et d'en déduire l'efficacité de la transcription inverse.
On a ainsi mis en oeuvre l'invention sur différents gènes et dans différentes conditions. Les figures annexées représentent sous forme synthétique les résultats alors obtenus. A titre de comparaison, la figure 1 représente un graphe illustrant l'expression comparée d'ARNm de HPRT et de IFNγ (ou IFNg), entre autres, selon une technique traditionnelle.
Sur cette figure 1, ainsi que sur les figures 2-5, les valeurs portées en ordonnée sont des valeurs d'absorbance, exprimées en valeur absolue de l'intercalant d'ADN SYBR Green utilisé (en abrégé: Abs SYBR Green).
La figure 2 montre la quasi-identité de l'amplification par ACP d'ADN et d'ARN, sur l'exemple de deux copies d'un gène. Les courbes d'accumulation se recouvrent pratiquement. Les graphes de la figure 3 concernent respectivement une première et une deuxième ACP conduites en temps réel sur des populations de cellules T intestinales exprimant toutes les fonctions effectrices. Fig. 3a a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de première ACP; Fig. 3b a été obtenue avec des combinaisons d'amorces de deuxième ACP. L'efficacité de l'amplification par ACP est déterminée par la pente de la courbe. Toutes les combinaisons d'amorces dans la première amplification par ACP et dans la deuxième amplification par ACP avaient des courbes parallèles pour la représentation de l'accumulation des produits d'ACP, ce qui indique qu'elles avaient la même efficacité. Sur la figure 4 sont représentées les amplifications par ACP en temps réel de perforine et de HPRT, à chaque fois dans des 2emes réactions d'ACP au sens de la présente invention. La figure 4a montre les résultats obtenus après une première ACP effectuée avec toutes les amorces simultanément conformément à l'invention, tandis que la figure 4b représente les résultats obtenus lorsque seules les amorces pour la perforine et le HPRT étaient présentes dans la lere réaction d'ACP. L'obtention de résultats quantitatifs semblables indique que la présence des 38 amorces et des 19 produits d'amplification par ACP n'interférait pas avec la réaction spécifique pour la perforine. On a obtenu des résultats similaires avec tous les autres gènes individuels, à la condition que les 38 amorces présentes dans la première réaction d'ACP ne réagissent pas entre elles et que les 19 produits de cette réaction d'ACP ne se lient pas à d'autres amorces que leurs amorces spécifiques.
La figure 5 illustre les résultats comparés obtenus avec une lere amplification par ACP sur un nombre variable de cycles (5, 15 et 20 respectivement), ainsi que l'incorporation de Sybr-Green dans une 2eme amplification par ACP, chaque courbe correspondant à une cellule individuelle. Les indications pratiques et les conclusions que l'on peut en tirer ont été indiquées plus haut. Quant à la figure 6, elle illustre schématiquement la succession préférée des étapes fondamentales du procédé selon l'invention.
En suivant le procédé, avantageusement avec un kit approprié du type décrit plus haut, on a en outre appliqué ledit procédé à la détermination du nombre des molécules d'ARN de perforine au niveau d'une cellule unique.
Pour ce faire, des cellules T de CD8 provenant de souris transgéniques (TCR) ont été testées pour l'expression de la perforine au niveau d'une cellule unique, au moyen d'un système de RT-ACP multiplex selon l'invention.
Après détermination des cellules positives pour la perforine, on a effectué une deuxième ACP quantitative sur au moins l'un des gènes isolés du produit de la première ACP, pour déterminer le nombre exact de molécules d'ARN pour au moins un gène d'intérêt. Cette deuxième ACP quantitative comportait une série de dilutions à partir d'un étalon ayant une concentration connue de molécules d'ARN (en pratique 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 37, 16, 8 copies). Ce mode opératoire a permis de déterminer le nombre de molécules d'ARN de perforine dans les cellules étudiées, par comparaison de la valeur de Ct de chaque cellule avec les valeurs de Ct des dilutions étalon.
La valeur obtenue pour chaque cellule a ensuite été corrigée en fonction de l'efficacité de la transcription inverse (le plus souvent, 95%) pour permettre d'obtenir le nombre exact de molécules d'ARN dans la cellule concernée. Les essais effectués ont fait ressortir les résultats suivants.
Dilutions de l'étalon
Nombre de molécules d'ARN de perforine dans diverses cellules
95% d'efficacité
On a en outre pu noter que, dans cette expérience, l'efficacité de la transcription inverse et celle de l'ACP étaient pratiquement identiques pour tous les gènes étudiés.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour l'analyse quantitative in vitro et/ou ex vivo du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules ou sur une seule cellule, caractérisé en ce que: on effectue une transcription inverse ou RT avec des amorces 3' appropriées, en présence de tampons n'induisant pas rinhibition des réactions d'ACP ultérieures et, sur les produits de ladite transcription inverse et, dans un récipient séparé ou avantageusement dans le même récipient, on conduit une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, de préférence de l à 1000 cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes, on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification, tandis qu'on effectue un étalonnage interne avec des dilutions sériées d'ARN pour confirmer l'efficacité de la RT.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que: on effectue une transcription inverse ou RT et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase pour individualiser les gènes , et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés, caractérisé en ce que: ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase est effectuée au moyen d'une association d'amorces 5' et d'amorces 3', lesdites amorces 3' étant identiques aux amorces 3' utilisées pour la transcription inverse, - on utilise, comme référence pour le calcul du nombre de copies de gènes générées par amplification par polymérase, l'ADN cellulaire individuel codant pour le gène considéré, on contrôle l'efficacité de la transcription inverse, au moyen d'une amplification en chaîne par polymérase des ADNc de l'un des gènes concernés, parallèlement à la même amplification des molécules d'ARNm du même gène, sur des échantillons cellulaires contenant le même nombre de molécules, et on évalue les résultats de ladite deuxième réaction d'amplification.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite réaction de transcription inverse ou RT est effectuée en double, et comporte au moins une RT spécifique et au moins une RT étalonnée.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise pour le contrôle l'efficacité de la transcription inverse des courbes témoin avec différents nombres de copies, établies avec de l'ADN de cellules individuelles.
5. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on choisit les amorces utilisées dans la RT-ACP multiplex pour qu'elles n'hybrident pas entre elles et que les produits de la réaction d'amplification en chaîne par polymérase amplifiés grâce à elles n'hybrident pas entre eux.
6. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que: on effectue la transcription inverse et une première réaction d'amplification en chaîne par polymérase de l'ARNm d'un faible nombre de cellules lysées, tandis que les amorces choisies sont placées dans des exons différents de telle sorte qu'elles ne puissent pas amplifier l'ADN, on sépare les divers produits de ladite première réaction d'amplification en chaîne par polymérase, et on conduit une deuxième réaction d'amplification en chaîne par polymérase sur les gènes individuels ainsi séparés., et on évalue les résultats de celle-ci.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce qu'on sélectionne la(les) portion(s) de gène à amplifier dans ladite première réaction d'amplification de telle manière qu'elle(s) ai(en)t une structure similaire et une sensibilité comparable à la transcription inverse et à l'amplification en chaîne par polymérase.
8. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase des fragments d'acide nucléique ayant environ 300 à 400 paires de bases.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise des fragments d'acide nucléique à amplifier dans ladite deuxième réaction d'amplification soient plus courts.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les amorces utilisées sont conservées à environ -80°C jusqu'à leur utilisation.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce qu'on réduit la concentration des amorces dans la première réaction d'amplification en chaîne par polymérase et/ou on utilise dans l'étape de transcription inverse des tampons n'induisant pas rinhibition des réactions d'ACP.
12. Procédé l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue une première amplification en chaîne par polymérase sur environ 10 cycles pour 16 copies ou plus, et sur environ 20 cycles pour un nombre entre 16 et 2 de copies.
13. Kit d'analyse et/ ou de diagnostic destiné à la quantification de l'expression de gènes extraits d'une cellule unique ou d'un petit nombre de cellules, ledit kit comportant: des moyens pour l'étalonnage interne de l'ARN et celui de l'ADNc, l'ensemble ou mélange des amorces pour la première ACP, - des amorces spécifiques pour chaque gène à soumettre à la deuxième ACP, et en option, un étalon interne et/ ou un étalon interne sur base d'ADN, ainsi que, en option, également des tampons de lyse, de transcription inverse et/ou d'amplification, et d'éventuels autres composants classiques.
14. Kit d'analyse et/ou de diagnostic destiné à la quantification de l'expression de gènes extraits d'une cellule unique ou d'un petit nombre de cellules, caractérisé en ce qu'il comporte les composants selon la revendication 13, et des instructions pour l'utilisation des amorces sens et anti-sens dans des réactions de RT-ACP pour la quantification du nombre de molécules d'acides nucléiques codant pour des gènes différents exprimés au niveau de cellules d'organismes vivants, sur un petit nombre de cellules ou sur une seule cellule.
15. Kit selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comporte comme amorces au moins l'un des ensembles ou combinaisons d'amorces choisis parmi les suivants, pour les gènes respectifs indiqués: pour TNF bêta, SEQ ID NOS.1-3; pour TNF alpha, SEQ ID
NOS.4-6; pour Granzyme B, SEQ ID NOS.7-9; pour CD40 ligand, SEQ ID NOS.10-12; pour IL-4, SEQ ID NOS.13-15; pour HPRT, SEQ ID NOS.16-19; pour IFN gamma, SEQ ID NOS.20-22; pour IL-2, SEQ ID NOS.23-25; pour perforine, SEQ ID NOS.26-28; pour Granzyme A, SEQ ID NOS.29-31; pour Fas ligand, SEQ ID NOS.32-34; pour TGF bêta, SEQ ID NOS.35-37; pour CD3 epsilon, SEQ ID NOS.38-40; pour IL-10, SEQ ID NOS.41-43; pour TGF bêta RI, SEQ ID NOS.44-46; pour TGF bêta Rïï, SEQ ID NOS.47-49; pour TGF bêta RIII, SEQ ID NOS.50- 52; pour IL10R alpha, SEQ ID NOS.53-55; et/ ou pour IFN gamma RII (bêta), SEQ ID NOS.56-58.
16. Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte l'ensemble des amorces désignées par SEQ ID NOS.1-58.
17. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un intercalant de l'ADN.
18. Utilisation d'un kit selon l'une quelconque des revendications 13-17 ou d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1-12 pour la quantification de gènes individuels, en particulier pour l'étude de l'expression génique dans un matériel biologique, notamment pour l'étude et/ ou l'évaluation quantitative, comparée et simultanée, de l'expression de multiples gènes au niveau d'une seule cellule ou d'un petit nombre de cellules d'un matériel biologique.
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