EP1516190A1 - Verfahren zur identifizierung von agonisten oder antagonisten für den g protein gekoppelten rezeptor "mas like 1" - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von agonisten oder antagonisten für den g protein gekoppelten rezeptor "mas like 1"

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Publication number
EP1516190A1
EP1516190A1 EP03735480A EP03735480A EP1516190A1 EP 1516190 A1 EP1516190 A1 EP 1516190A1 EP 03735480 A EP03735480 A EP 03735480A EP 03735480 A EP03735480 A EP 03735480A EP 1516190 A1 EP1516190 A1 EP 1516190A1
Authority
EP
European Patent Office
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receptor
chemical compound
mas
cells
substance
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03735480A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Evi Kostenis
Johann Gassenhuber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a compound which changes the activity of the G protein-coupled receptor mas like 1.
  • G protein-coupled receptors transmit extracellular signals such as from hormones, neurotransmitters, light or odorants via G proteins into the cell interior, whereby different effects can be triggered by an intracellular signal cascade.
  • G proteins usually consist of three different subunits (alpha, beta, gamma).
  • Various heterodimeric G proteins are known, which differ in receptor specificity and effect.
  • the G proteins are activated by GTP.
  • a well-known G protein is the transducin from the vision process.
  • G protein coupled receptors play an important role in a variety of physiological processes. They represent one of the largest known protein families. It is currently estimated that around 1000 genes of the human genome code for this class of receptors. GPCR are membrane proteins with 7 transmembrane ⁇ helices. A large number of medicinal products work via GPCRs.
  • GPCRs are particularly involved in signal processing and control of the organism and therefore play a major role in maintaining the function of the intact organism.
  • the binding of an extracellular ligand leads to a change in the conformation of the GPCR in question.
  • the change in conformation creates the prerequisite for interaction with the associated G protein.
  • the G protein in turn triggers an intracellular signal cascade that is characteristic of the corresponding cell type.
  • the so-called "second messengers" are characteristic of the intracellular signal cascades. These include low-molecular compounds such as, for example, cAMP (cyclic adenosine monophosphate), cGMP (cyclic guanozine monophosphate) or Ca 2+ .
  • the intracellular signaling is controlled by changes in the concentration of the second messengers.
  • the G proteins or their subunits interact with proteins such as adenylate cyclase, phospholipase C or ion channels.
  • proteins such as adenylate cyclase, phospholipase C or ion channels.
  • the change in the concentration of the "second messenger” brings about activation or deactivation of other proteins, in particular kinases and phosphatases.
  • the signal finally ends in a response that is typical for the respective cell assembly, for example the expression of a protein.
  • the heterotrimeric G proteins are located on the inside of the pias membrane.
  • An activated receptor contacts the G protein heterotimer, which then dissociates a ⁇ subunit and the? ⁇ complex. Both the activated ⁇ subunit and the ⁇ complex can influence intracellular effector proteins.
  • the G-protein- ⁇ subunit family can be divided into different classes. For example, the gas, Gai, Gaq and Ga12 classes are known. GPCRs are classified according to the activated G proteins.
  • Gs-class GPCRs mediate the stimulation of adenylacyclase and increase the intracellular concentration of cAMP by activating gas.
  • GPCRs of the Gi class inhibit adenylate cyclase by activating G ⁇ i and lower the intracellular cAMP.
  • Gq-class GPCRs stimulate various PLCß isoforms by activating G ⁇ q and lead to diacylglycerol and insositol triphosphate (IP3) via the hydrolysis of membrane-bound phosphatidyl-inositol-4,5-biphosphate. IP3 releases Ca 2+ from intracellular stores.
  • G proteins with changed receptor specificity and different connections to a signal transduction path can be constructed by joining together components from different G proteins to hybrid G proteins using the methods of molecular biology and biochemistry.
  • Hybrid G proteins are fusion constructs that combine sequences of different G ⁇ subunits within one protein. So z. B. by the fusion of the receptor recognition region of G ⁇ i with the effector activation region of G ⁇ q, a G ⁇ q / i hybrid can be produced which receives signals from Gi-coupled receptors but which activates the G ⁇ q-PLCß signal transduction pathway.
  • This "coupling" of receptors has the advantage that the end point of the assay (increase in the intracellular Ca 2+ concentration compared to the inhibition of the adenylate cyclase) is more easily accessible by measuring techniques and can be used in high throughput screening.
  • Substance P is a neurotransmitter that is released by both central and peripheral nerve endings of primary afferent neurons.
  • NK1 preferentially binds substance P
  • NK2 preferentially binds neurokinin A
  • NK3 preferentially neurokinin B.
  • the endogenous tachykinins are not particularly selective for the respective receptor subtypes and in principle substance P, NKA and NKB activate all three NK receptor subtypes.
  • another subtype, the NK4 receptor is proposed.
  • Substance P is associated with a variety of diseases in which chronic inflammation and pain play a role, such as asthma, chronic bronchitis, inflammatory gastrointestinal diseases, cystitis, but also migraines, depression, vomiting and epileptic diseases. Not least in the cardiovascular area, substance P plays an important role. Substance P is a very powerful vasodilator. Vasodilation and lowering of blood pressure come about through the release of NO from the endothelium of large vessels (mediated via NK1 receptors).
  • Substance P - acting via neurokinin receptors - is also an important mediator of neurogenic plasma extravasation: Activation of NK1 receptors in endothelial cells of postcapillary venules makes the tight junctions (cell-cell contact) permeable and thus allows the plasma proteins to exit the vascular lumen into the interstitial space. While the role of tachykinins (substance P, neurokinin A and neurokinin B) has been studied fairly well, little is known about the physiological and pathophysiological effects of substance P breakdown products. Substance P is metabolized to N-terminal fragments (1-9,1-7,1-4) and to C-terminal fragments (2-11, 3-11).
  • a ligand is to be understood as a molecule which binds reversibly to a G protein-coupled receptor and exerts an effect on the receptor (stabilization, inactivation, stimulation) via this binding. This effect generally affects a downstream intracellular signal cascade and can be demonstrated using the effects from the signal cascade.
  • a ligand is natural when it is made by a biological system.
  • the nucleotide and amino acid sequence of the G protein-coupled receptor mas like 1 is known and is available to the public (Genbank: AC 027026).
  • nucleotide sequence of mas like 1 is shown in SEQ ID No. 1 and the amino acid sequence of mas like 1 is shown in SEQ ID No. 2.
  • the object of the present invention is accordingly to provide a method for identifying a compound which acts agonistically or antagonistically on the mas like 1 receptor.
  • the invention relates to a method for identifying a chemical compound that specifically binds to the G protein-coupled receptor mas like 1, wherein
  • a] at least one cell is provided which expresses the receptor mas like 1 on its surface
  • b] at least one chemical compound is provided
  • the cells from a] are brought into contact with the chemical compound from b] under conditions which enable binding to the receptor
  • d] the binding of the chemical compound to the mas like 1 receptor is determined.
  • the temperature or the pH value is of particular importance for the production of conditions which enable a chemical compound to bind to the receptor.
  • the temperature is preferably a range from room temperature to 40 ° C., particularly preferably a range from 36 ° C. to 38 ° C. and very particularly preferably 37 ° C.
  • the pH is preferably in the range from 6 to 8 and particularly preferably at pH 7.0.
  • the invention further relates to a method for identifying a chemical compound which specifically binds to the G protein-coupled receptor mas like 1, wherein
  • Express surface in which this receptor is contained, b] at least one chemical compound is provided, c] the cells from a] are brought into contact with the chemical compound from b] under conditions which enable binding to the receptor,
  • the preparation from the cells contains the membrane fraction of a cell extract.
  • the invention also relates to a method for identifying a chemical compound which binds to the receptor mas like 1 coupled to the G protein in a specific and competitive manner with respect to a first chemical compound, wherein
  • a] at least one cell is provided which expresses said mas like 1 receptor on its surface
  • b] at least one first chemical compound is provided which binds to the mas like 1 receptor
  • c] at least one second chemical compound is provided which differs from the first chemical compound
  • the cells from a] are brought into contact with the first chemical compound from b] and the second chemical compound from c] either simultaneously or in succession under conditions which enable binding to the receptor
  • e] the binding of the first chemical compound to the receptor or the binding of the second chemical compound to the receptor or the binding of the first and second chemical compounds to the receptor is determined.
  • the first chemical compound consists of substance P or a cleavage product of substance P or the neuropeptide FF.
  • the creation of a calibration curve may be necessary.
  • the invention further relates to a method for identifying a chemical compound which binds to the receptor mas like 1 coupled to the G protein in a specific and competitive manner with respect to a first chemical compound, wherein
  • a] a preparation from cells which express the receptor mas like 1 on its surface is provided, in which this receptor is contained, b] at least one first chemical compound is provided which binds to the receptor mas like 1, c] at least a second chemical compound is provided which differs from the first chemical compound, d] the cells from a] are brought into contact with the first chemical compound from b] and the second chemical compound from c] either simultaneously or in succession under conditions, which enable binding to the receptor, e] the binding of the first chemical compound to the receptor or the binding of the second chemical compound to the receptor or the binding of the first and second chemical compounds to the receptor is determined.
  • the preparation from cells contains the membrane fraction of a cell extract.
  • the first chemical compound consists of
  • Substance P or a cleavage product of substance P or the neuropeptide FF is obtained by reacting with substance P or the neuropeptide FF.
  • the invention also relates to a method for identifying a chemical compound which specifically binds to the G protein-coupled receptor mas like 1 and activates it, whereby a] at least one cell is provided which expresses the receptor mas like 1 on its surface and in which a "second messenger" signal cascade can be triggered by means of the receptor mas like 1, b] at least one chemical compound is provided,
  • the cells from a] are brought into contact with the chemical compound from b] under conditions which enable binding to and activation of the receptor, d] the change in the concentration of the "second messenger" in the cell in the presence and Absence of the chemical compound is determined, a change in the presence of the chemical compound indicates activation of the receptor.
  • the invention further relates to a method for identifying a chemical compound which specifically binds to the G protein-coupled receptor mas like 1 and activates it, wherein
  • a] a preparation from cells which express the mas like 1 receptor on their surface is provided, a “second messenger” signal cascade being able to be triggered in this preparation, b] at least one chemical compound is provided, c] the preparation from cells from a] is brought into contact with the chemical compound from b] under conditions which enable binding to the receptor and activation thereof, d] the change in the concentration of the “second messenger” in the preparation from the cell in the presence and absence of the chemical compound is determined, a change in the presence of the chemical compound indicating activation of the mas like 1 receptor.
  • the preparation from the cells contains the membrane fraction of a cell extract.
  • the invention also relates to a method for identifying a chemical compound which specifically binds to the G protein-coupled receptor mas like 1 and inhibits it, wherein
  • a] at least one cell which expresses the receptor mas like 1 on its surface and in which a "second messenger" signal cascade can be triggered by means of the receptor mas like 1, b] at least one chemical compound is provided, c] the cells from a] are brought into contact with the chemical compound from b] under conditions which bind to the receptor and
  • the invention relates to a method for identifying a chemical compound which specifically binds to the G protein-coupled receptor mas like 1 and inhibits it, wherein
  • a "second messenger” signal cascade can be triggered in this preparation
  • b] at least one chemical compound is provided
  • d] the change in the concentration of the "second messenger" in the preparation is determined from the cell in the presence and absence of the chemical compound, a change in the presence of the chemical compound Deactivation of the receptor mas like 1 indicates.
  • the preparation from the cells contains the membrane fraction of a cell extract.
  • the invention also relates to a pharmaceutical preparation containing a compound which has been identified by one of the methods described above, and furthermore auxiliaries for the formulation of a pharmaceutical.
  • the pharmaceutical preparation contains substance P or a cleavage product of substance P.
  • the invention comprises the use of substance P or a cleavage product of substance P or the neuropeptide FF for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease caused by a malfunction of the Receptor mas like 1 is conditional.
  • the invention further relates to the use of a compound which has been identified by a method according to the invention for the production of a complex of the mas like 1 receptor with this compound.
  • Suitable compounds for the production of such a complex are, for example, substance P, a cleavage product of substance P or neuropeptide FF.
  • the invention also relates to a complex of the receptor mas like 1 and substance P, a cleavage product of substance P or neuropeptide FF.
  • a complex is to be understood here as a composite of one or more proteins of the receptor in at least specific binding with substance P, a cleavage product of substance P or neuropeptides FF and possibly membrane components or detergents for stabilizing the receptor or receptor / ligand complex. The binding is specific if the binding constant is less than or equal to 100 ⁇ M.
  • the natural ligand can already be present in the biological material or the preparation made of biological material. However, such a ligand can also be added from the outside. For this purpose, the ligand should be present in an amount, concentration and degree of purity such that it binds to the receptor and triggers the receptor signal.
  • the natural ligand is added after the biological material or a preparation of the biological material, which each contain the G protein-coupled receptor mas like 1, is available in a suitable manner (preparation / amount).
  • Such a natural ligand is preferably substance P, a cleavage product of substance P or neuropeptides FF.
  • the natural ligands and in particular also substance P, a cleavage product of substance P or neuropeptides FF can contain a label which can be detected by a suitable detection method for use in the method according to the invention.
  • a label is, for example, a radioactive label or a fluorometrically detectable label.
  • the method according to the invention is preferably used in such a way that the identified compounds act agonistically or antagonistically to the natural ligand.
  • the invention also relates to a compound that modifies the activity of the G protein coupled receptor mas like 1, the compound being identified by a method as described above.
  • Such a compound is characterized in that its mass is preferably between 0.1 to 50 kDa, or particularly preferably between 0.1 to 5 kDa or very particularly preferably between 0.1 to 3 kDa.
  • Such a compound which has been identified by a method according to the invention can be a protein, an amino acid, a polysaccharide, a sugar, a polynucleotide, a nucleotide, a fatty acid-containing compound, a fat, a fatty acid, a fatty acid derivative or an aromatic hydrocarbon compound.
  • the invention further relates to a medicament which contains a compound which has been identified by a method according to the invention, and furthermore Formulation aids for a drug and / or other additives.
  • This medicine is particularly suitable for the treatment of cardiovascular disease.
  • a compound that has been identified by a method according to the invention can be used to produce a medicament for the treatment of cardiovascular disease.
  • the G protein-coupled receptor mas like 1 for carrying out the method according to the invention can be produced by expressing an exogenous DNA sequence in a prokaryote or eukaryote.
  • any prokaryotic or eukaryotic plasmid vector, bacteriophage vector or yeast plasmid vector is suitable for producing the protein. Examples of such vectors are pBR322, pUC18,19, pBlueScript, pcDNA3.1 and others. Expression can be transient or permanent.
  • a base vector is to be understood as a vector in which a polynucleotide sequence of a polynucleotide by means of the methods of
  • the base vector can consist, for example, of a plasmid with an antibiotic resistance marker, an "origin of replication" suitable for multiplication of the plasmid in bacteria or cell cultures, and a promoter suitable for expression of a protein.
  • the base vector can also consist of a phage vector, a phagemid vector, for example Phasmid vector, a cosmid vector, a virus vector, a YAC vector or other type of vector. Examples of basic vectors are pUC 18, pUC19, pBLuescript, pKS, pSK and others.
  • the polynucleotide to be incorporated is incorporated via suitable restriction interfaces using the appropriate restriction enzymes, which are commercially available from companies such as BioLabs, Röche Diagnostics, Stratagene and others.
  • restriction sites can be, for example, the recognition sites of the restriction enzymes BamHI, EcoRI, Sall, EcoRV and others.
  • the recombinant vector construction consists of an expression vector which can be used in eukaryotes and / or prokaryotes.
  • An expression vector contains a promoter which can be functionally linked to a polynucleotide sequence so that a protein encoded by this polynucleotide sequence is synthesized in a biological organism, for example a bacterium, fungus or the cell of a eukaryotic cell line.
  • the promoter can be inducible, for example by means of
  • expression vectors are pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 or others.
  • Biomaterial is any material that contains genetic information that can reproduce itself or can be reproduced in a biological system.
  • Biological material is, for example, cells from human or animal tissues or organs such as in particular the brain, adipose tissue, lungs, heart, liver, kidney, spleen, muscle and others.
  • Biological material is also, for example, bacteria or fungi such as Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae.
  • Biological material also includes cells from cell cultures.
  • biological material can be obtained by biopsy, surgical removal, removal by means of syringes or catheters or comparable techniques.
  • the cells removed in this way can be frozen, processed or taken in cell culture.
  • Bacteria and yeast cells are propagated and processed using common microbiology techniques. Appropriate instructions for this can be found in “Current Protocols in Molecular Biology; ed .: FM Ansubel et al., constantly renewed, edition 2001, publisher John Wiley & Sons ".
  • Biological material can also consist of the cells of an animal cell culture. Such cells are, for example, mouse cells, rat cells or hamster cells.
  • the cell culture cells can be primary cell types or established cell lines. Examples of established cell lines are mouse 3T3 cells, CHO cells, HEK cells or Heia cells. Maintaining, cultivating and multiplying cell lines is described in standard textbooks, such as, for example, in “Basic Cell Culture; ed .: J.M. Davis IRL Press, Oxford (1996).
  • a preparation of a biological material is produced, for example, by digestion of the biological material and subsequent cleaning steps.
  • Methods for disintegrating the biological material can in particular be repeated freezing and thawing, treatment with ultrasound, the use of a French press, the addition of detergents and enzymes or the like.
  • Subsequent purification steps consist, for example, of differential centrifugation, precipitation with ammonium sulfate or organic solvents, the use of chromatographic techniques and others. Chromatographic techniques are, for example
  • the biological material or the preparation made of biological material can be brought into contact with a chemical compound in conventional laboratory vessels such as Eppendorf tubes, centrifuge tubes or glass flasks.
  • the underlying aqueous medium contains, for example, buffer substances, nutrient medium components, monovalent or divalent ions such as Na + , K ⁇ Ca 2+ , CI " , SO 4 2" , PO 3 2 " or others, furthermore proteins, glycerol or others.
  • the volume or other factors can be advantageous, for example by contacting in incubators at constant temperature, in the presence of a buffer or with the precisely weighed amounts of ions or proteins in particular also contain a certain proportion of an organic solvent such as dimethyl sulfoxide, methanol or ethanol, but the content of such a solvent is preferably not more than 10% by volume of the batch.
  • an organic solvent such as dimethyl sulfoxide, methanol or ethanol
  • a chemical compound is provided, for example, by chemical synthesis.
  • the standard synthetic methods are familiar to the person skilled in the art.
  • the chemical compound can be part of a collection of chemical compounds, such as arise from the storage and cataloging of chemical compounds from completed synthesis programs (so-called "chemical libraries").
  • the compound can be from a microorganism, in particular a bacterium, but also from a fungus or a plant (natural product).
  • Suitable pharmaceutical compounds can be administered as pharmaceuticals in oral, oral, topical, parenteral or rectal form.
  • the most suitable route of administration depends in each individual case on the type and severity of the condition to be treated and on the type of the compound used in each case.
  • a suitable active ingredient concentration is approximately 1% to 35%, preferably approximately 3% to 15%.
  • the sequence of the human GPCR mas like 1 is stored in databases that are open to the public.
  • Genbank is AC 027026.
  • SEQ ID No. 1 contains the nucleotide sequence of the mas like 1 receptor.
  • the corresponding amino acid sequence can be found in SEQ ID No. 2.
  • the human gene contains no introns.
  • the receptor was therefore replicated from genomic DNA using a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the human genomic DNA came from the company Clontech, Palo Alto.
  • human genomic DNA from another company or from our own production is also suitable for carrying out the PCR.
  • the PCR reaction conditions were chosen as follows: first incubation at 94 ° C for
  • RNA samples from the following tissues and organs were available: 5 adrenal gland, fetal brain, fetal liver, small intestine, heart, kidney, liver, lung, pancreas, placenta, prostate, skeletal muscle, spleen, testicles, thymus, bone marrow, salivary gland, Thymus, trachea and uterus.
  • RNA samples were first subjected to DNAase 0 digestion under standard reaction conditions. Approximately 2 ⁇ g of the RNA treated with RNA was used to produce cDNA using a reverse transcriptase from MMLV Moloney Murine Leukemia Virus. The reaction mixture for this was adjusted to a pH of 7.0 and contained 25 mM / MgCI 2 each 10 mM dNTPs, 50 ⁇ M random hexamer primer, 50 ⁇ M oligo (dT) ⁇ 6 and 20 U / ⁇ l RNase inhibitor. The reaction was carried out in a volume of 100 ⁇ l, incubating first for 10 minutes at 25 ° C., then for 60 minutes at 42 ° C., then inactivating for 5 minutes at 95 ° C. and finally cooling in ice 5 has been.
  • the subsequent PCR reaction was carried out using a TaqMan Universal PCR Master Mix from Applera from Rothstadt, Germany. With regard to buffers, enzyme equipment and other reagents, this corresponds to the usual laboratory protocols known to those skilled in the art.
  • the incubation conditions for the PCR were chosen as follows: 2 min. 20 50 ° C., then 10 min. 95 ° C., then 40 cycles for each cycle, 15 seconds 95 ° C. and 1 min. 60 ° C.
  • the primers were used in a concentration of 50 ⁇ M each. Ribosomal 18 S RNA was used as a control.
  • a Taqman sample consists of a single-stranded oligonucleotide, which is labeled with two different fluorophores at the ends.
  • the fluorophore of the 3 'end, the so-called acceptor functions with a weakening effect (“quencher") of the 30 fluorophore from the 5' end, the so-called donor.
  • the 5 'end donor is released by the 5' exonuclease activity of Taq DNA polymerase in the course of the chain extension reaction. Since the donor in free form is no longer quenched, its amount can be determined using a fluorimeter. Since the amount of donor formed and the accumulated PCR product behave proportionally, the amplified DNA can be quantified. It is important to ensure that the melting temperature of the Taqman sample is higher than that of the primers for the amplification.
  • the Taqman sample used had the following nucleotide sequence:
  • CHO-K1 cells were cultured in basal Iscove medium, which was supplemented with 10% fetal bovine serum 10,000 U / ml - 10,000 ⁇ g / ml penicillin-streptomycin, gentamycin and 2 mM glutamine.
  • Iscove-Medium is commercially available from, among others, the company Biochrom, Berlin.
  • the composition of Iscove medium is described in "Iscove, NN, Melchers, F., Journal of Experimental Medicine 147, 923-933 (1978)".
  • the CHO-K1 cells were used in an amount of 2 ⁇ 10 for the transient transfection 5 cells were placed on a 35 mm culture dish after approximately 24 hours of incubation or at a confluence of 50-80% with 2 ⁇ g DNA using Lipofectamine reagent, which is commercially available from Invitrogen Life Technologies, Düsseldorf, among others. transfected.
  • HBSSC Human's buffered Saline Solution
  • PBS phosphate buffered saline
  • the receptor was transiently expressed in CHO-K1 cells.
  • neuropeptide FF neuropeptide FF
  • neuropeptide AF neuropeptide AF
  • neuropeptide SF angiotensin
  • bradykinin bombesin
  • adrenomedullin substance P
  • substance P1-9 substance P2-11.
  • the substance P, the substance P2-11 and the neuropeptide FF could be identified as natural ligands for the G protein-coupled receptor called mas like 1.
  • a test system constructed according to the detection method for finding agonists or antagonists with regard to the activity of mas like 1 additionally contained substance P, substance P2-11 or neuropeptide FF.
  • Neuropeptide FF has the following amino acid sequence:
  • Substance P2-11 has the following amino acid sequence:

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Description

Beschreibung
Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten für den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 verändert.
G Protein gekoppelte Rezeptoren vermitteln extrazelluläre Signale wie beispielsweise von Hormonen, Neurotransmittern, Licht oder Geruchsstoffen über G Proteine ins Zellinnere, wobei über eine intrazelluläre Signalkaskade unterschiedliche Effekte ausgelöst werden können. G Proteine bestehen normalerweise aus drei verschiedenen Untereinheiten (alpha, beta, gamma). Man kennt verschiedene heterodimere G-Proteine, die sich in Rezeptorspezifität und Wirkung unterscheiden. Die G Proteine werden durch GTP aktiviert. Ein bekanntes G Protein ist das Transducin aus dem Sehprozess.
G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen. Sie stellen eine der größten bekannten Proteinfamilien dar. Zur Zeit wird geschätzt, daß etwa 1000 Gene des menschlichen Genoms für diese Rezeptorklasse kodieren. GPCR sind Membranproteine mit 7 transmembranen σ-Helices. Eine Vielzahl von Arzneimitteln entfaltet ihre Wirkung über GPCRs.
GPCRs sind insbesondere bei der Signalverarbeitung und Steuerung des Organismus beteiligt und spielen deshalb eine übergeordnete Rolle bei der Aufrechterhaltung der Funktion des intakten Organismus.
Die Bindung eines extrazellulären Liganden führt zu einer Konformationsänderung des betreffenden GPCR. Die Konformationsänderung schafft die Voraussetzung für die Interaktion mit dem jeweils zugeordneten G-Protein. Das G-Protein wiederum löst eine für den entsprechenden Zelltyp charakteristische intrazelluläre Signalkaskade aus. Kennzeichnend für die intrazellulären Signalkaskaden sind die sogenannten „second messengers". Darunter sind niedermolekulare Verbindungen wie beispielsweise cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat), cGMP (cyclisches Guanozinmonophosphat) oder Ca2+ zu verstehen. Das intrazelluläre Signaling wird über Änderungen der Konzentration der second messengers gesteuert. Die G-Proteine bzw. deren Untereinheiten wechselwirken hierzu mit Proteinen wie der Adenylat-Zyklase, der Phospholipase C oder lonenkanälen. Die Änderung der Konzentration der „second messenger" wiederum bewirkt eine Aktivierung oder Deaktivierung von anderen Proteinen insbesondere von Kinasen und Phosphatasen. Das Signal endet schließlich in einer für den jeweiligen Zellverband typischen Antwort beispielsweise der Expression eines Proteins.
Die heterotrimeren G-Proteine liegen an der Innenseite der Piasmembran. Ein aktivierter Rezeptor nimmt Kontakt auf mit dem G-Protein-Heterotimer, welches daraufhin eine σ-Untereinheit und den ?γ-Komplex dissoziiert. Sowohl die aktivierte α- Untereinheit als auch der ßγ-Komplex können intrazelluläre Effektorproteine beeinflussen. Die G-Protein-α-Untereinheit Familie kann in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Bekannt sind beispielsweise die Gas-, Gai-, Gaq- und Ga12-Klasse. GPCRs werden entsprechend der aktivierten G-Proteine klassifiziert.
GPCRs der Gs-Klasse vermitteln über Aktivierung von Gas die Stimulation der Adenylacyclase und erhöhen die intrazelluläre cAMP-Konzentration. GPCRs der Gi- Klasse bewirken über Aktivierung von Gαi eine Hemmung der Adenylatcyclase und erniedrigen das intrazelluläre cAMP. GPCRs der Gq-Klasse wiederum erreichen über Aktivierung von Gαq eine Stimulation verschiedener PLCß-lsoformen und führen über die Hydrolyse von membranständigem Phosphatidyl-inositol-4,5-biphosphat zu Diacylglycerol und Insositoltriphosphat (IP3). IP3 setzt aus intrazellulären Speichern Ca2+ frei. Die meisten GPCRs können nur mit einer G-Protein-ß-Untereinheit Familie Kontakt aufnehmen, d.h., sie besitzen Selektivität für einen bestimmten Signaltransduktionsweg. G-Proteine mit geänderter Rezeptorspezifität und unterschiedlicher Anbindung an einen Signaltransduktionsweg können durch Aneinanderfügen von Bestandteilen aus verschiedenen G-Proteinen zu Hybrid-G-Proteinen mittels der Methoden der Molekularbiologie und Biochemie konstruiert werden. Hybrid-G-Proteine sind Fusionskonstrukte, die innerhalb eines Proteins Sequenzen verschiedener Gα-Untereinheiten vereinigen. So kann z. B. durch die Fusion der Rezeptorerkennungsregion von Gαi mit der Effektor-Aktivierungsregion von Gαq ein Gαq/i-Hybrid hergestellt werden, das Signale von Gi-gekoppelten Rezeptoren empfängt, aber den Gαq-PLCß-Signaltransduktionsweg anschaltet. Ein derartiges Hybrid, bei welchem die C-terminalen 5-Aminosäuren von Gαq durch die entsprechende Gαi-Sequenz ersetzt worden ist (Gαiq5) wurde von Conklin et al. Nature 363, 274-276 (1993) erstmalig beschrieben.
Diese „Umkopplung" von Rezeptoren hat den Vorteil, daß der Assayendpunkt (Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration im Vergleich zur Hemmung der Adenylatzyklase) einfacher durch meßtechnische Verfahren zugänglich ist und im High-Troughput-Screening verwendet werden kann.
Substanz P ist ein Neurotransmitter, der sowohl von zentralen als auch von peripheren Nervenendigungen primärer afferenter Neuronen freigesetzt wird. Die biologischen Wirkungen von Substanz P werden vermittelt durch Tachykininrezeptoren (= Neurokininrezeptoren), welche zur Gruppe der G Protein gekoppelten Rezeptoren zählen. Bisher sind drei Tachykininrezeptoren bekannt: NK1 , NK2 und NK3. NK1 bindet bevorzugt Substanz P, NK2 bindet bevorzugt Neurokinin A und NK3 bevorzugt Neurokinin B. Die endogenen Tachykinine sind jedoch nicht besonders selektiv für die jeweiligen Rezeptorsubtypen und prinzipiell aktivieren Substanz P, NKA und NKB alle drei NK Rezeptorsubtypen. Zusätzlich zu den bekannten Neurokininrezeptorsubtypen wird ein weiterer Subtyp, der NK4 Rezeptor postuliert.
Substanz P wird mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht, bei welchen chronische Entzündung und Schmerzen eine Rolle spielen, wie z.B. Asthma, chronische Bronchitis, entzündliche Magen-Darmerkrankungen, Blasenentzündungen, aber auch Migräne, Depressionen, Erbrechen und epileptische Erkrankungen. Nicht zuletzt im cardiovaskulären Bereich spielt Substanz P eine wichtige Rolle. Substanz P ist ein sehr starker Vasodilator. Vasodilatation und Blutdrucksenkung kommen zustande über die Freisetzung von NO aus dem Endothel großer Gefäße (vermittelt über NK1 Rezeptoren).
Substanz P - agierend über Neurokininrezeptoren - ist außerdem ein wichtiger Mediator der neurogenen Plasmaextravasation: Aktivierung von NK1 Rezeptoren in Endothelzellen postkapillärer Venolen macht die tight junctions (Zell-Zell-Kontake) permeabel und erlaubt so den Plasmaproteinen den Austritt aus dem Gefäßlumen in den Interstitialraum. Während die Rolle der Tachykinine (Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B) recht gut untersucht sind, ist wenig bekannt über die physiologischen und pathophysiologischen Wirkungen der Substanz P Abbauprodukte. Substanz P wird metabolisiert zu N-terminalen Fragmenten (1-9,1-7,1-4) sowie zu C-terminalen Fragmenten (2-11 , 3-11 ). Während die Effekte der Substanz P Spaltprodukte auf die bekannten Neurokininrezeptoren z.T. schon beschrieben wurde, ist bisher nicht bekannt, ob diese Spaltprodukte auch selbst an Rezeptoren binden und eine Signalwirkung auslösen können, also als natürliche Liganden wirken. Als Ligand soll ein Molekül verstanden werden, welches reversibel an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor bindet und über diese Bindung eine Wirkung auf den Rezeptor (Stabilisierung, Inaktivierung, Stimulierung) ausübt. Diese Wirkung betrifft im allgemeinen eine nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskade und kann über die Effekte aus der Signalkaskade nachgewiesen werden. Ein Ligand ist natürlich, wenn er von einem biologischen System hergestellt wird.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 ist bekannt und der Öffentlichkeit zugänglich (Genbank: AC 027026).
Die Nukleotidsequenz von mas like 1 ist in SEQ ID Nr. 1 und die Aminosäuresequenz von mas like 1 ist in SEQ ID Nr. 2 wiedergegeben.
Bislang war kein natürlicher Ligand für den Rezeptor mas like 1 bekannt. Das hatte den Nachteil, daß keine Agonisten oder Antagonisten für diesen Rezeptor identifiziert werden konnten. Agonisten und Antagonisten sind sehr nützliche Hilfsmittel, um die Funktion eines Rezeptors hinsichtlich seiner normalen Aktivität oder pathologisch veränderten Aktivität zu studieren. Agonisten und Antagonisten sind weiterhin von Vorteil bei der Wiederherstellung krankhaft veränderter Rezeptoraktivitäten, die sich unter anderem in unnormal verminderter oder gesteigerter Aktivität äußern können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist demnach die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer Verbindung, welche agonistisch oder antagonistisch auf den Rezeptor mas like 1 wirkt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen, d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
Zur Herstellung von Bedingungen, die eine Bindung einer chemischen Verbindung an den Rezeptor ermöglichen, ist insbesondere die Temperatur oder der pH-Wert von Bedeutung. Als Temperatur wird bevorzugt ein Bereich von Raumtemperatur bis 40°C, besonders bevorzugt ein Bereich von 36°C bis 38°C und ganz besonders bevorzugt 37°C ausgewählt. Der pH-Wert liegt bevorzugt im Bereich der Werte 6 bis 8 und besonders bevorzugt bei pH 7,0.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer
Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Präparation aus den Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den besagten Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert, b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet, c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet, d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen, e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform hierin besteht die erste chemische Verbindung aus der Substanz P oder einem Spaltprodukt der Substanz P oder dem Neuropeptid FF. Zur Bestimmung der Bindung der ersten chemischen Verbindung und/oder der Bindung der zweiten chemischen Verbindung in dem vorstehend beschriebenen Verfahren und den weiteren Verfahren dieser Erfindung kann die Erstellung einer Eichkurve erforderlich sein. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist, b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet, c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet, d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen, e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform hierbei enthält die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die erste chemische Verbindung aus
Substanz P oder einem Spaltprodukt der Substanz P oder dem Neuropeptid FF.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors anzeigt.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Präparation aus Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der Präparation aus der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform hierbei enthält die Präparation aus den Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine
Inaktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Inaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer
Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Präparation der Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der Präparation aus der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Deaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform hierin enthält die Präparation aus den Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Arzneimittelzubereitung enthaltend eine Verbindung, welche durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wurde sowie weiterhin Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Arzneimittelzubereitung die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P. Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung der Substanz P oder eines Spaltprodukts der Substanz P oder des Neuropeptides FF zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Verbindung, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde zur Herstellung eines Komplexes des Rezeptors mas like 1 mit dieser Verbindung. Geeignete Verbindungen zur Herstellung eines solchen Komplexes sind beispielsweise die Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptid FF. Die Erfindung betrifft auch einen Komplex aus dem Rezeptor mas like 1 sowie Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptid FF. Als Komplex soll hier ein Verbund aus einem oder mehreren Proteinen des Rezeptors in mindestens spezifischer Bindung mit Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptide FF sowie evtl. Membranbestandteilen oder Detergentien zur Stabilisierung des Rezeptors bzw. Rezeptor/Ligand-Komplexes verstanden werden. Die Bindung ist spezifisch, wenn die Bindekonstante kleiner oder gleich 100 μM beträgt.
Der natürliche Ligand kann in dem biologischen Material oder der Präparation aus biologischem Material bereits vorhanden sein. Man kann einem solchen Liganden aber auch von außen zugeben. Hierzu sollte der Ligand in einer Menge, Konzentration und einem Reinheitsgrad vorliegen, daß dessen Bindung an den Rezeptor sowie die Auslösung des Rezeptorsignals bewirkt wird. Die Zugabe des natürlichen Liganden erfolgt, nachdem das biologische Material oder eine Präparation des biologischen Materials, welche jeweils den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 enthalten, in geeigneter Weise (Zubereitung/Menge) zur Verfügung steht.
Bei solch einem natürlichen Liganden handelt es sich bevorzugt um Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptide FF . Die natürlichen Liganden und insbesondere auch Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptide FF können zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren eine durch eine geeignete Detektionsmethode nachweisbare Markierung enthalten. Eine solche Markierung ist beispielsweise eine radioaktive Markierung oder eine fluorometrisch nachweisbare Markierung.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so verwendet, daß die identifizierten Verbindungen agonistisch oder antagonistisch zum natürlichen Liganden wirken.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Verbindung, welche die Aktivität des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 modifiziert, wobei die Verbindung durch ein Verfahren wie vorstehend beschrieben identifiziert wurde.
Eine solche Verbindung zeichnet sich dadurch aus, daß deren Masse bevorzugt zwischen 0,1 bis 50 kDa liegt, oder besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 5 kDa liegt oder ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 3 kDa liegt.
Eine solche Verbindung, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde, kann ein Protein, eine Aminosäure, ein Polysaccharid, ein Zucker, ein Polynukleotid, ein Nukleotid, eine fettsäurehaltige Verbindung, ein Fett, eine Fettsäure, ein Fettsäurederivat oder eine aromatische Kohlenwasserstoffverbindung sein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel, welche eine Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde, enthält, sowie weiterhin Formulierungshilfsstoffe für ein Arzneimittel und/oder weitere Zusatzstoffe. Dieses Arzneimittel eignet sich insbesondere zur Behandlung einer Herz-Kreislauferkrankung.
Eine Verbindung, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde, kann zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Herz- Kreislauferkrankung verwendet werden.
Der G Protein gekoppelte Rezeptor mas like 1 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch Expression einer exogenen DNA Sequenz in einem Prokaryonten oder Eukaryonten hergestellt werden. Grundsätzlich eignet sich zur Herstellung des Proteins jeder prokaryotische oder eukaryotische Plasmidvektor, Bakteriophagenvektor oder Hefeplasmidvektor. Beispiele für solche Vektoren sind pBR322, pUC18,19, pBlueScript, pcDNA3.1 und andere. Die Expression kann transiert oder permanent erfolgen.
Rekombinante Vektorkonstruktionen können unter Zuhilfenahme des einschlägigen Fachwissens, wie dargestellt beispielsweise in „F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (ISBN 0-471 -50338-X)" oder om „J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Mamiatis, Molekular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press" (ISBN 0-87969-309-6), hergestellt werden. Dabei wird ein Polynukleotid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß einer der beschriebenen Sequenzinformationen (SEQ ID NO. 1 ) oder eine Polynukleotidsequenz gemäß einer der beschriebenen Sequenzinformationen (SEQ ID NO. 2) in einen Basisvektor eingebaut. Als Basisvektor soll ein Vektor verstanden werden, in welchen eine Polynukleotidsequenz eines Polynukleotids mittels der Methoden der
Molekularbiologie eingebaut und in einem Mikroorganismus beispielsweise einem Bakterium, Pilz oder der Zelle einer Zellkultur kloniert werden kann. Der Basisvektor kann beispielsweise aus einem Plasmid mit einem Antibiotikumresistenzmarker, einem „origin of replication" geeignet zur Vermehrung des Plasmids in Bakterien oder Zellkulturen, sowie einem Promotor geeignet zur Expression eines Proteins bestehen. Der Basisvektor kann beispielsweise auch aus einem Phagenvektor, einem Phagemidvektor, einem Phasmidvektor, einem Cosmidvektor, einem Virusvektor, einem YAC-Vektor oder anderen Vektortyp bestehen. Beispiele für Basisvektoren sind pUC 18, pUC19, pBLuescript, pKS, pSK und andere. Der Einbau des einzubauenden Polynukleotids erfolgt über geeignete Restriktionsschnittstellen mittels der entsprechenden Restriktionsenzyme, welche kommerziell von Firmen wie BioLabs, Röche Diagnostics, Stratagene und anderen angeboten werden. Solche Restriktionsschnittstellen können beispielsweise die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme BamHI, EcoRI, Sall, EcoRV und andere sein.
Die rekombinante Vektorkonstruktion besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus einem in Eukaryonten und/oder Prokaryonten verwendbaren Expressionsvektor. Ein Expressionsvektor enthält einen Promotor, der funktioneil mit einer Polynukleotidsequenz verbunden werden kann, so daß ein von dieser Polynukleotidsequenz kodiertes Protein in einem biologischen Organismus beispielsweise einem Bakterium, Pilz oder der Zelle einer eukaryotischen Zelllinie synthetisiert wird. Der Promotor kann induzierbar sein beispielsweise mittels
Tryptophan oder er kann konstitutiv aktiv sein. Beispiele für Expressionsvektoren sind pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 oder andere.
Biologisches Material ist jedes Material, das genetische Informationen enthält und sich selbst reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Biologisches Material sind beispielsweise Zellen aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Organen wie insbesondere Gehirn, Fettgewebe, Lunge, Herz, Leber, Niere, Milz, Muskel und andere. Biologisches Material sind beispielsweise auch Bakterien oder Pilze wie beispielsweise Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae. Weiterhin umfaßt biologisches Material Zellen aus Zellkulturen.
Die Gewinnung von biologischem Material kann im Falle von Zellen aus tierischen oder menschlichen Geweben durch Biopsie, operative Entnahme, Entnahme mittels Spritzen oder Kathetern oder vergleichbaren Techniken erfolgen. Die so entnommenen Zellen können tiefgefroren, aufgearbeitet oder in Zellkultur genommen werden. Bakterien und Hefezellen werden mittels gebräuchlicher Techniken der Mikrobiologie vermehrt und aufgearbeitet. Entsprechende Anleitungen hierfür findet der Fachmann in „Current Protocols in Molecular Biology; ed.: F. M. Ansubel et al., laufend erneuert, Ausgabe 2001 , Verlag John Wiley & Sons".
Biologisches Material kann auch aus den Zellen einer tierischen Zellkultur bestehen. Solche Zellen sind beispielsweise Mauszellen, Rattenzellen oder Hamsterzellen. Die Zellkulturzellen können primäre Zelltypen oder etablierte Zelllinien sein. Beispiele für etablierte Zelllinien sind Maus 3T3-Zellen, CHO-Zellen, HEK-Zellen oder Heia-Zellen. Haltung, Anzucht und Vermehrung von Zelllinien ist in Standardlehrbüchern beschrieben, wie beispielsweise in „Basic Cell Culture; ed.: J. M. Davis IRL Press, Oxford (1996).
Eine Präparation eines biologischen Materials wird beispielsweise durch Aufschluß des biologischen Materials und sich daran anschließende Reinigungsschritte hergestellt. Methoden zum Aufschluß des biologischen Materials können insbesondere wiederholtes Einfrieren und Auftauen, die Behandlung mit Ultraschall, die Verwendung einer French-Press, die Zugabe von Detergentien und Enzymen oder vergleichbares sein. Sich anschließende Reinigungsschritte bestehen beispielsweise aus differentieller Zentrifugation, der Fällung mit Ammonsulfat oder organischen Lösungsmitteln, der Anwendung von chromatographischen Techniken und anderen. Chromatographische Techniken sind beispielsweise die
Polyacrylamidgelektrophorese, Hochdruckflüssigkeitschromatographie, lonenaustauschchromatograhie, Affinitätschromatographie, Gaschromatograhie, Massenspektrometrie und anderes. Hierfür und insbesondere auch für detaillierte Anweisungen zur Reindarstellung von Proteinen stehen dem Fachmann detaillierte Anweisungen in Lehrbüchern zur Verfügung wie insbesondere in „Current Protocols in Protein Science, ed.: J.E. Coligan et al., Ausgabe 2001 , Verlag John Wiley & Sons.
Das Inkontaktbringen des biologischen Materials oder der Präparation aus biologischem Material mit einer chemischen Verbindung kann in gewöhnlichen Laborgefäßen wie beispielsweise Eppendorf-Gefäßen, Zentrifugen-Röhrchen oder Glaskolben erfolgen. Das zugrundeliegende wäßrige Medium enthält beispielsweise Puffersubstanzen, Nährmediumbestandteile, einwertige oder zweiwertige Ionen wie Na+, K\ Ca2+, CI", SO4 2", PO3 2" oder andere, weiterhin Proteine, Glycerin oder anderes. Für das Inkontaktbringen können bestimmte konstante Bedingungen wie insbesondere die Temperatur, der pH-Wert, die lonenbedingungen, die Konzentration eines Proteins, des Volumens oder andere Faktoren vorteilhaft sein. Dies wird erreicht, in dem beispielsweise das Inkontaktbringen in konstant temperierten Inkubationsvorrichtungen, in Gegenwart eines Puffers oder mit den zuvor genau eingewogenen Mengen der Ionen oder Proteine durchgeführt wird. Das wäßrige Lösungsmittel kann insbesondere auch einen bestimmten Anteil eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylsulfoxid, Methanol oder Ethanol enthalten. Der Gehalt eines solchen Lösungsmittels beträgt aber vorzugsweise nicht mehr als 10 Vol. % des Ansatzes.
Die Bereitstellung einer chemischen Verbindung erfolgt beispielsweise durch chemische Synthese. Dem Fachmann sind die Standardsynthesemethoden geläufig. Die chemische Verbindung kann Teil einer Sammlung chemischer Verbindungen sein, wie sie durch Lagerung und Katalogisierung der chemischen Verbindungen aus abgeschlossenen Syntheseprogrammen entstehen (sogenannte „chemical libraries"). Die Verbindung kann in anderen Fällen von einem Mikroorganismus insbesondere einem Bakterium, aber auch von einem Pilz oder einer Pflanze gebildet worden sein (Naturstoff).
Geeignete pharmazeutische Verbindungen können als Arzneimittel in oraler, peroraler, topischer, parenteraler oder rektaler Form verabreicht werden. Die am besten geeignete Verabreichungsweise ist in jedem Einzelfall von der Art und Schwere des zu behandelnden Zustande und von der Art der jeweils verwendeten Verbindung abhängig. Eine geeignete Wirkstoffkonzentration beträgt ca. 1 % bis 35 %, vorzugsweise ca. 3 % bis 15 %.
Beispiele
Klonierung des humanen mas like 1 1 Rezeptors
Die Sequenz des humanen GPCR mas like 1 ist in Datenbanken, die für die Öffentlichkeit zugänglich sind, hinterlegt. Die entsprechende Zugangsnummer von Genbank lautet AC 027026. Die SEQ ID Nr. 1 enthält die Nukleotidsequenz des mas like 1 Rezeptors. In der SEQ ID Nr. 2 findet sich die entsprechende Aminosäuresequenz. Das humane Gen enthält keine Introns. Der Rezeptor wurde deshalb ausgehend von genomischer DNA mittels einer 5 Polymerasekettenverlängerungsreaktion (Polymerase Chain Reaction; PCR) vervielfältigt. Die humane genomische DNA stammte im vorliegenden Fall von der Firma Clontech, Palo Alto. Grundsätzlich eignet sich auch humane genomische DNA einer anderen Firma oder aus eigener Herstellung zur Durchführung der PCR. Die PCR Reaktionsbedingungen wurden wie folgt gewählt: zuerst Inkubation bei 94°C für
10 10 Min., anschließend 35 Zyklen pro Zyklus Inkubation bei 94 °C für 1 Min., dann bei 60°C für 1 Min. und schließlich bei 72°C für 2 Min. Die Reaktion wurde mittels des GC- Melt Kit der Firma Clontech durchgeführt. Zur Ausführung der PCR insbesondere hinsichtlich Pufferbedingungen und Enzym eignet sich aber auch ein anderes in den Lehrbüchern verwendetes Protokoll. Die verwendeten Primer gemäß SEQ ID Nr. 3 und
15 4 wurden so konstruiert, daß eine Hindlll-Stelle (SEQ ID Nr. 3) bzw. eine EcoRI- Schnittstelle (SEQ ID Nr. 4) vorhanden war. Das gebildete PCR-Produkt hatte eine Länge von 1260 Basenpaaren. Es wurde mittels der Hindi II- und EcoRI-Schnittstellen in den Expressionsvektor pcDNA3.1 eingebaut. Dieser Vektor ist kommerziell erhältlich unter anderem von der Firma Invitrogen, Carlsbad in Kalifornien, USA. 0
Quantitative RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) in Echtzeit mittels Taqman
Kommerziell erhältliche RNA Proben aus folgenden Geweben und Organen standen 5 zur Verfügung: Nebennierendrüse, fötales Gehirn, fötale Leber, Dünndarm, Herz, Niere, Leber, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Plazenta, Prostata, Skelettmuskel, Milz, Hoden, Thymus, Knochenmark, Speicheldrüse, Thymusdrüse, Luftröhre und Uterus.
Die RNA Proben wurden zuerst unter Standardreaktionsbedingungen einem DNAase- 0 Verdau unterworfen. Aus ca. 2 μg der Dnase behandelten RNA wurde mit Hilfe einer reversen Transkriptase des MMLV Moloney Murine Leukemia Virus cDNA hergestellt. Der Reaktionsansatz hierfür wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und enthielt 25 mM/MgCI2 je 10 mM dNTPs, 50 μM Random-Hexamer-Primer, 50 μM Oligo(dT)ι6 und 20 U/μl Rnase Inhibitor. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 100 μl durchgeführt, wobei zuerst für 10 Min. bei 25°C, anschließend für 60 Min. bei 42°C inkubiert wurde, dann für 5 Min. bei 95°C inaktiviert und schließlich in Eis abgekühlt 5 wurde.
Die anschließende PCR-Reaktion wurde mittels eines TaqMan Universal PCR Master Mix der Firma Applera aus Weiterstadt, Deutschland durchgeführt. Dieser entspricht hinsichtlich Puffer, Enzymausstattung und anderer Reagenzien den üblichen und dem 10 Fachmann bekannten Laborprotokollen.
Als Primer wurden die folgenden Sequenzen verwendet: 5'-TGC TTT GTG GCA AGG AGA CC-3' (SEQ ID Nr. 5; „vorwärts"-Primer) 15
5'-TTC CTA CCA GCC CGA CCA G-3' (SEQ ID Nr. 6; „rückwärts"-Primer).
Die Inkubationsbedingungen für die PCR wurden folgendermaßen gewählt: 2 Min. 20 50°C, dann 10 Min. 95°C, anschließend 40 Zyklen für jeden Zyklus 15 Sekunden 95°C und 1 Min. 60°C. Die Primer wurden in einer Konzentration von je 50 μM eingesetzt. Als Kontrolle verwendete man ribosomale 18 S RNA.
Die quantitative Analyse erfolgte mittels eines Fluoreszenz Resonanz Energietransfers 25 (FRET). Der Fachmann kennt die quantitative Bestimmung dieser Art auch unter der Bezeichnung Taqman-PCR. Eine Taqman-Probe setzt sich aus einem einzelsträngigen Oligonukleotid zusammen, welches an den Enden mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert ist. Das Fluorophor des 3'-Endes, der sogenannte Acceptor, funktioniert dabei mit abschwächendem Effekt („quencher") des 30 Fluorophors vom 5'-Ende, dem sogenannten Donor.
Der Donor am 5'-Ende wird durch die 5'-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA Polymerase im Verlauf der Kettenverlängerungsreaktion freigesetzt. Da der Donor in freier Form nicht mehr gequenscht wird, kann dessen Menge mittels eines Fluorimeters bestimmt werden. Da sich gebildete Donormenge und akkumuliertes PCR-Produkt proportional verhalten, kann die amplifizierte DNA quantifiziert werden. Grundsätzlich ist darauf zu achten, daß die Schmelztemperatur der Taqman-Probe höher liegt als diejenige der Primer für die Amplifizierung.
Als Fluorophore verwendete man FAM (6-Carboxyfluorescein) als Donor und TAMRA (5-Carboxy-tetramethylrhodamin) als Acceptor (= quencher). Die verwendete Taqman-Probe hatte die folgende Nukleotidsequenz:
3'-TGA TCC CGG TCT TCC TGA TCC TTT TCA-5' (SEQ ID. Nr. 7).
Zellkultur und Transfektion für den FLIPR-Assay
CHO-K1 Zellen wurden in basalem Iscove-Medium, welches ergänzt wurde mit 10 % fötalem Rinderserum 10 000 U/ml - 10 000 μg/ml Penicillin-Streptomycin, Gentamycin und 2 mM Glutamin, kultiviert.
Iscove-Medium ist kommerziell erhältlich unter anderem von der Firma Biochrom, Berlin. Die Zusammensetzung von Iscove-Medium ist beschrieben in „Iscove, N.N., Melchers, F., Journal of Experimental Medicine 147, 923-933 (1978)". Die CHO-K1 Zellen wurden für die transiente Transfektion in einer Menge von 2 x 105 Zellen auf eine 35 mm Kulturschale ausgebracht. Die Zellen wurden nach ca. 24 Stunden Inkubation oder bei einer Konfluenz von 50 -80 % mit 2 μg DNA mittels Lipofectamine Reagenz, welches unter anderem von Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe kommerziell zur Verfügung gestellt wird, transfiziert.
Etwa 16 bis 18 Stunden nach der Transfektion überführte man die Zellen auf 96 well Mikrotiterplatten mit einer Dichte von etwa 80 000 Zellen pro well. Anschließend wurde für weitere 18 bis 24 Stunden inkubiert. Danach gab man 95 μl HBSSC (Hank's buffered Saline Solution), welche 20 mM HEPES, 2,5 mM Probeneeid, 4 μM Fluo4 und 1 % fötales Rinderserum enthielt und inkubierte für 1 Stunde bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2. Fluo4 ist ein Farbstoff, welcher in Anwesenheit von Ca2+ fluoresziert. Fluo4 wird unter anderem von Molecular Probes Europe BV, Leiden kommerziell vertrieben. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS (Phosphate buffered saline), welche 1 mM MgCI2, 1 mM EDTA und 2,5 mM Probeneeid enthielt, gewaschen.
5 Nach dem letzten Waschschritt wurden in jeder Vertiefung etwa 100 μl der Lösung auf den Zellen belassen. Die zu testenden Peptide wurden in Wasser oder DMSO (Dimethylsulfoxid) in einer Konzentration von 2 mM gelöst. Von einer solchen Stammlösung ausgehend wurden die entsprechenden Verdünnungen der Endkonzentration (20 mM) hergestellt. Die Fluoreszenz wurde mittels eines FLIPR
10 (Fluorometric Imaging Plate Reader; Molecular Devices GmbH, Ismaning) insgesamt für 3 Minuten in 1 Sekundenintervallen während der ersten Minute und in 3 Sekundenintervallen während der zweiten und dritten Minute gemessen. Zur Bestimmung der agonistischen Wirkung wurden die Meßwerte zwischen 18 Sekunden und 37 Sekunden verwendet.
15
Identifizierung von Liganden des Rezeptors mas like 1
Verschiedene Peptide wurden hinsichtlich ihrer stimulierenden Eigenschaft auf den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 getestet. Der Test wurde mittels FLIPR
20 Technologie durchgeführt. Der Rezeptor wurde hierzu in CHO-K1 Zellen transient zur Expression gebracht.
Getestet wurden die folgenden Peptide: Neuropeptid FF, Neuropeptid AF, Neuropeptid SF, Angiotensin, Bradykinin, Bombesin, Adrenomedullin, Substanz P, Substanz P1-9, Substanz P2-11.
25 Fluoreszenzbildung in den Zellen konnte nachgewiesen werden bei Anwesenheit von Substanz P (ca. 500 Fluorescence intensity units), Substanz P2-11 (ca. 2500 Fluorescence intensity units) und Neuropeptid FF (ca. 2000 Fluorescence intensity units). Der Nullwert lag jeweils bei ca. 20 Fluorescence intensity units. Die Aktivierung des Rezeptors zeigte im Bereich der Konzentration von 5 x 10"6 bis 1 x
30 10"5M von Substanz P und Substanz P2-11 eine lineare Abhängigkeit. Der EC5o- ert für Substanz P betrug 10,37 μM. Die Substanz P2-11 setzte in den transient transfizierten CHO-K1 Zellen Arachidonsäure frei.
Damit konnten für den G Protein gekoppelten Rezeptor mit der Bezeichnung mas like 1 die Substanz P, die Substanz P2-11 und das Neuropeptid FF als natürliche Liganden identifiziert werden.
Ein entsprechend dem Nachweisverfahren aufgebautes Testsystem zum Auffinden von Agonisten bzw. Antagonisten hinsichtlich der Aktivität von mas like 1 enthielt zusätzlich Substanz P, Substanz P2-11 oder Neuropeptid FF. Agonistisch wirkten unter anderem weitere Fragmente der Substanz P wie beispielsweise Substanz P4-11 oder Substanz P1-9.
Neuropeptide FF hat folgende Aminosäuresequenz:
H-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Pro-NH2. (SEQ ID Nr. 8)
Substanz P2-11 hat folgende Aminosäuresequenz:
H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2. (SEQ ID Nr. 9).

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen, d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
2. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen, d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
4. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den besagten Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert, b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet, c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet, d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen, e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erste chemische Verbindung die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P oder das Neuropeptid FF ist.
6. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist, b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet, c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet, d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine
Bindung an den Rezeptor ermöglichen, e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die erste chemische Verbindung die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P oder das Neuropeptid FF ist.
9. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der Zelle in
Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
10. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Präparation aus Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der
Präparation aus der Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
12. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Inaktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Inaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
13. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine „second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann, b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c] die Präparation der Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen, d] die Änderung der Konzentration des „second messenger" in der
Präparation aus der Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Deaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 1 , 4, 5, 9, 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine CHO, CHO-K1 oder eine HEK-Zelle ist.
16. Arzneimittelzubereitung enthaltend eine Verbindung, welche durch ein
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 identifiziert wurde, sowie Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
5 17. Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 15 enthaltend Substanz P oder ein Spaltprodukt von Substanz P oder Neuropeptide FF.
18. Verwendung von Substanz P zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Fehlfunktion des Rezeptors mas
10 like 1 bedingt ist.
19. Verwendung eines Spaltprodukts von Substanz P zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
15
20. Verwendung von Neuropeptide FF zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
20 21. Verwendung von Substanz P oder eines Spaltproduktes der Substanz P oder des Neuropeptids FF zur Herstellung eines Komplexes des Rezeptors mas like 1 mit dieser Verbindung.
22. Protein enthaltend den Rezeptor mas like 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die 25 Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P oder das Neuropeptide FF spezifisch an den Rezeptor mas like 1 gebunden ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000020590A2 (en) * 1998-10-06 2000-04-13 Incyte Pharmaceuticals, Inc. G-protein coupled receptor proteins
WO2001016159A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Smithkline Beecham Corporation Gpcr, theant
CA2390547A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
EP1268795A2 (de) * 2000-03-24 2003-01-02 Bayer Aktiengesellschaft Regulation des humanen mas-oncogenischen g-protein-gekoppelten rezeptors
WO2001083555A2 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 California Institute Of Technology Pain signaling molecules
CA2413435A1 (en) * 2000-06-20 2001-12-27 Euroscreen S.A. A recombinant cell line expressing gpcrx11 as a functional receptor validated by angiopeptin and useful for screening of agonists and antagonists
US6902902B2 (en) * 2001-11-27 2005-06-07 Arena Pharmaceuticals, Inc. Human G protein-coupled receptors and modulators thereof for the treatment of metabolic-related disorders
US20030171293A1 (en) * 2002-02-27 2003-09-11 Pfizer Inc. Neuropeptide receptor and uses thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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