EP1511549A1 - Procede de separation par impaction, de particules viables et reviviscentes d un gaz ou d'un melange de gaz en contenant, dis positif et banc d essai mis en oeuvre - Google Patents

Procede de separation par impaction, de particules viables et reviviscentes d un gaz ou d'un melange de gaz en contenant, dis positif et banc d essai mis en oeuvre

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Publication number
EP1511549A1
EP1511549A1 EP03755175A EP03755175A EP1511549A1 EP 1511549 A1 EP1511549 A1 EP 1511549A1 EP 03755175 A EP03755175 A EP 03755175A EP 03755175 A EP03755175 A EP 03755175A EP 1511549 A1 EP1511549 A1 EP 1511549A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gas
particles
flow
volume
nebulizer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP03755175A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
André Monnot
Paul Giroir
Valérie SCHREIBER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Air Liquide Sante International SA
LAir Liquide SA pour lEtude et lExploitation des Procedes Georges Claude
Original Assignee
Air Liquide SA
Air Liquide Sante International SA
LAir Liquide SA a Directoire et Conseil de Surveillance pour lEtude et lExploitation des Procedes Georges Claude
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Air Liquide SA, Air Liquide Sante International SA, LAir Liquide SA a Directoire et Conseil de Surveillance pour lEtude et lExploitation des Procedes Georges Claude filed Critical Air Liquide SA
Priority to EP07106374A priority Critical patent/EP1813340A2/fr
Publication of EP1511549A1 publication Critical patent/EP1511549A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
    • G01N1/2202—Devices for withdrawing samples in the gaseous state involving separation of sample components during sampling
    • G01N1/2208—Devices for withdrawing samples in the gaseous state involving separation of sample components during sampling with impactors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D45/00—Separating dispersed particles from gases or vapours by gravity, inertia, or centrifugal forces
    • B01D45/04—Separating dispersed particles from gases or vapours by gravity, inertia, or centrifugal forces by utilising inertia
    • B01D45/08—Separating dispersed particles from gases or vapours by gravity, inertia, or centrifugal forces by utilising inertia by impingement against baffle separators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
    • G01N1/2202—Devices for withdrawing samples in the gaseous state involving separation of sample components during sampling
    • G01N2001/222—Other features
    • G01N2001/2223—Other features aerosol sampling devices

Definitions

  • the invention belongs to the field of production, applications and analysis of gases.
  • the filtration method consists in passing a gas through a filter holder fitted with a filter with a porosity of between approximately 0.22 ⁇ m and 0.45 ⁇ m. The microorganisms carried by the gas flow, and whose size is larger than that of the pores, are retained by the filter.
  • the filter is then collected under aseptic conditions, and it is either washed to recover the microorganisms, or placed directly in culture on a petri dish. After a determined incubation period in the oven, the number of colony forming units (CFU) is counted, the germs present are identified and a number of colony forming units per volume of gas withdrawn expressed in CFU is deduced therefrom. / m 3 .
  • CFU colony forming units
  • a water-soluble gelatin-based filter is used, which after adding water makes it possible to count and identify the microorganisms contained in the liquid using molecular biology tools.
  • the impaction method consists in strongly accelerating the flow of a gas and directing it towards a target coated with agar. Particles and microorganisms with sufficient momentum leave the air flow and are projected onto the surface of this target. There are two variations of this method:
  • bio-impactors operating according to this same method, to control the quality of compressed gases and designed to work at the pressure of the network to which it is connected, with a constant gas flow rate of the order of 28 liters / minute.
  • bio-impactors operating according to this same method, to control the quality of compressed gases and designed to work at the pressure of the network to which it is connected, with a constant gas flow rate of the order of 28 liters / minute.
  • the results obtained are not very reproducible because they depend on a large number of factors, such as the size of the viable particles to be analyzed, the type and sensitivity of the microorganisms, the level of contamination, the surrounding conditions, the precision and the efficiency of the operator's sample, the type and height of agar covering the target, the impaction speed of the particles and the volume of gas sampled by its ability to more or less dry the agar.
  • the Applicant has therefore sought to develop a method for separating particles from a gas or from a mixture of gases. This is why the subject of the invention is a process for the separation by impaction, of viable and reviviscent particles of a gas or a mixture of gases containing it, flowing at a non-zero speed v 0 , characterized in that that he understands
  • step (a) of acceleration in one stage and along an axis (x), of the gas flow or of the gas mixture in a confined volume (V), to reach an axial speed v x greater than v 0 , subsonic, sonic or supersonic,
  • step (b) of abrupt deceleration of said flow from step (a) in said volume, along substantially the same axis (x), at atmospheric pressure,
  • step (c) of changing the direction of the gas flow or of the gas mixture at the outlet of the volume (V), which becomes radial on average,
  • step (d) of trapping the particles, separated from the flow during step (c), on a target
  • step (e) exhausting the gas flow or the gas mixture from volume (V) so that there is no contact between the surrounding atmosphere and the target used in step (d).
  • a gas or a mixture of gases is designated at a total pressure greater than 1 atmosphere (approximately 10 5 Pa ), generally at a total pressure less than or equal to 200 atmospheres, and more particularly at a total pressure less than or equal to 10 atmospheres.
  • a deceleration which makes it possible to reduce the speed of a gas flow, to a zero axial speed on the target.
  • confined volume (V) in which the stages (a) and (b) take place and at the end of which the stage (c) takes place, is meant in the present description, a finished volume delimited by a lateral surface finite, which is preferably a surface of revolution around the axis (x).
  • the gas flow rate for which it is desired to determine the microbiological quality varies according to the source and / or the use which is made of said gas. It is often between 50 liters per minute and 1000 liters per minute and more particularly between 100 liters per minute (subsonic jet mode) and 300 liters per minute (sonic jet mode for most gases).
  • the process which is the subject of the present invention can be carried out with any gas or mixture of gases.
  • a gas or gas mixture there are, for example, air, oxygen (0 2 ), nitrogen (N 2 ), argon (Ar), carbon dioxide (CO 2 ), l helium (He), nitrous oxide (N 2 0), nitric oxide (NO), mixtures of nitrous oxide and oxygen, carbon dioxide and oxygen, nitrogen and nitrogen or helium monoxide and oxygen, and more particularly mixtures (50% by volume (v / v) N 2 0 + 50% v / v O U ), (5% v / v C0 2 + 95% v / v 0 2 ), (200 ppm to 800 ppm NO in N 2 ), (78% v / v He + 22% v / v 0 2 ), (65% He +35% 0 2 ) and (80% v / v He + 20% v / v 0 2 ), used in medicine or even mixtures of nitrogen and carbon dioxide (N 2 + C0 2 ) used in the food industry.
  • the confined volume (V) consists of a first volume fraction (V a ) in which step (a) is implemented, delimited by two bases (Bi) and (B 2 ), of surfaces (Si) and (S 2 ), with (Si) greater than or equal to (S 2 ) and a second volume fraction (Vb) contiguous to (V a ), in which step (b) is implemented bounded by (B 2 ) and a base (B 3 ) with a surface (S 3 ) greater than or equal to (S 2 ).
  • (Si) and (S 2 ) are equal, (Si) is less than the section of the gas flow circulating upstream of the volume (V).
  • step (d) of trapping the particles is implemented on a target surface capable of fixing them.
  • viable and reviviscent particles microorganisms of all kinds, capable of multiplying under conditions of appropriate pressure, humidity and temperature.
  • the target surface is that of a nutritive medium allowing the development and multiplication of the trapped microorganisms.
  • a nutritive medium such as a medium comprising agar.
  • said medium will either be specific that the growth of one or more species of microorganisms is non-specific.
  • solid nutritive medium used to trap the particles there are:
  • TCS TM medium (AES laboratory reference: AEB 522 859), which is a selective medium for bacteria comprising 15 g / l (gram per liter) of pastone, 5 g / l of papain peptone from soy , 5 g / l of sodium chloride and 15 g / l of Agar. This medium requires a 24 to 48 hour incubation at 37 ° C.
  • the R2A TM medium (AES laboratory, reference AEB 523 480), which is a non-selective medium generally used for the enumeration of so-called "stressed" microorganisms, present in treated water poor in nutrients; it comprises 1.0 g / l of a mixture of peptones (proteose peptone), 0.5 g / l of casein acid hydrolyzate, 0.5 g / l of dextrose, 0.5 g / l of starch soluble, 0.3 g / l of dipotassium phosphate (K 2 HP0), 0.024 g / l of magnesium sulphate, 0.3 g / l of sodium pyruvate and 15 g / l of Agar.
  • peptones proteose peptone
  • K 2 HP0 dipotassium phosphate
  • K 2 HP0 dipotassium phosphate
  • - MOSSEL TM medium (AES laboratory, reference AEB 521 740), which is a medium specific for the growth of Bacillus cereus and Bacillus spp. ; in general it includes 10 g / l of meat peptone, 1 g / l of meat extract, 10 g / l of sodium chloride, 10 g / l of mannitol, 0.025 g / l of phenol red and 15 g / l of Agar.
  • the Schaedler TM medium with sheep blood (%) (Biomérieux, reference 43273), which is particularly suitable for the culture of anaerobic bacteria and allows the growth of demanding species; it includes 5.7 g / l of casein peptone, 1 g / l of soy peptone, 5 g / l of casein and meat peptone, 5 g / l of yeast extract, 5.83 g / l glucose, 1.7 g / l sodium chloride, 3 g / l bipotassium phosphate, 0.01 g / l Tris (hydroxymethyl) amino methane, 0.01 g / l hemin, 0.4 g / l cysteine, 0.0005 g / l L-cystine, 13.5 g / l Agar and 50 ml / l sheep's blood.
  • the hardness at impaction of these media can be modified by changing the concentration of Agar or Agar-agar.
  • the invention also relates to a variant of the method as defined above, further comprising a step (f) of counting the particles trapped during step (d).
  • Step (f) preferably consists of a step (fi) of cultivating viable and reviving particles trapped at the end of step (d), followed by a step (fg) of counting the colony forming units.
  • the culture step consists, for example, in maintaining the nutrient medium containing the trapped particles, at a temperature allowing the multiplication of microorganisms for a time determined by the culture medium used (24 to 48 hours at 37 ° C. for the medium TCS TM, 5 to 15 days at 25 ° C for R2A TM or R3A TM media, 24 hours at 37 ° C for Mossel TM media or 5 days at 37 ° C for Schaedler TM sheep blood medium).
  • the method as defined above makes it possible to effectively separate microorganisms having dimensions between 0.05 ⁇ m and 25 ⁇ m and more particularly between 0.2 ⁇ m and 12 ⁇ m.
  • microorganisms which have been shown to be present in a compressed or liquefied gas after isolation from a nutrient medium, by the variant of the process as described above, there are molds and yeasts such as, Mucor indicus, Graphium spp, Penicillium spp .
  • Gram positive bacteria such as Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus aureus, Bacillus brevis; Gram negative bacteria such as Pantoea spp.
  • the subject of the invention is also a process for determining the microbiological quality of a gas or a mixture of gases under pressure, by implementing the variant of the separation process as described above.
  • the method and its variant allow the collection, on solid nutritive medium, of the germs present in a gas, compressed or liquefied, under pressure.
  • the gas analyzed can come from cylinders, frames, storage tanks, primary or secondary, from a gas supply network, primary or secondary, and more in particular, either a medical gas supply network as found in healthcare establishments, such as hospitals, dispensaries or clinics, or a gas distribution network as there is a in drug production factories or in factories in the food industry.
  • the gas does not need to be expanded to atmospheric pressure to be analyzed by the method described above.
  • a device (D) suitable for the implementation of the method and its variant as defined above.
  • the device (D) comprises:
  • the element (Di) of the device (D) is a hollow solid, comprising an inlet orifice, an outlet orifice, a lower lateral surface SL, defining a confined volume (V) having orthogonal, polygonal, elliptical or cylindrical, in which the steps (a) and (b) of the process as defined above take place, at the outlet orifice of which the step (c) takes place.
  • the surface SL is more particularly, either a surface of revolution around an axis (x) or a lateral surface of a regular polyhedron of axis of symmetry (x), or a set of one or more surfaces of revolution and / or one or more surfaces of regular polyhedra, with the same axis of symmetry (x), defining the volume (V).
  • the two orifices are preferably co-axial with respect to the axis (x).
  • the element (Di) can be of any material, be it a plastic, a metal or a metal alloy. It is preferably made of a material which can be sterilized by dry heat (3 hours at 180 ° C) or by wet heat (20 minutes at 130 ° C).
  • the element (Di) of the device (D) more particularly comprises an internal lateral surface SL defining a first volume fraction (V a ) of frustoconical or cylindrical shape, in which step (a) is implemented, and a second volume fraction (V b ) contiguous to (V a ), of frustoconical shape, in which step (b) is implemented.
  • the element (D) of the device (D) has very particularly a shape defining a first fraction of cylindrical shape of height h and diameter w, in which step (a) is implemented, and a second fraction of shape frustoconical with height H of small base of diameter w and of large base of diameter W, in which step (b) is implemented.
  • the inlet orifice is in this case of circular section of diameter w and the outlet orifice is of circular section and of diameter W.
  • the h / w ratio is generally between 10/1 and 1/10. It is more particularly between 10/2 and 2/10.
  • the W / w ratio is generally between 50/1 and 5/1. It is more particularly between 25/1 and 10/1.
  • the H / w ratio is generally between 5/1 and 50/1. It is more particularly between 10/1 and 40/1.
  • H is generally between 10 mm and 200 mm, more particularly between 30 mm and 120 mm and very particularly between 40 mm and 100 mm.
  • the value of w is preferably between 2 and 5 mm approximately and it is more particularly equal to approximately 4 mm
  • the element (D 2 ) of the device (D) is preferably of cylindrical shape and of diameter Wi greater than or equal to W. In general, Wi is less than or equal 90 mm. W is generally comprised between 50 mm and 90 mm. It is preferably a Petri dish. Element (D 2 ) contains a nutritive medium for microorganisms and more particularly a gelicic medium.
  • the element (D 3 ) of the device (D) is a hollow solid comprising an inlet orifice, an outlet orifice, a lower lateral surface S 3.
  • the surface S 3 is more particularly, that is a surface of revolution around of the axis (x), i.e. a lateral surface of a regular polyhedron with axis of symmetry (x).
  • the element (D 3 ) more particularly has the same axis of symmetry as the element (Di). This element D3 can of course be made up of one or more parts.
  • the element (D 3 ) defines with the element (Di), a volume through which the gas released from the particles trapped on the element (D 2 ) flows towards the outlet orifices of the device (D) to a sufficient speed so that the microorganisms present in the ambient atmosphere do not reach the internal surface of said element D 2 .
  • the element (D 3 ) can be of any material, be it a plastic, a metal or a metal alloy. It is preferably made of a material which can be sterilized by dry heat (3 hours at 180 ° C) or by wet heat (20 minutes at 121 ° C).
  • the element (D 3 ) of the device (D) also makes it possible to maintain the element D 2 at a distance d from the large base of (D 1 ), sufficient to allow the entire flow of the gas or the mixture of gas at the outlet of the element (D 1 ), radially on average at the axis (x).
  • the H / d ratio is generally between 2/1 and 20/1. It is more particularly between 3/1 and 15/1.
  • the opening system of the element (D 3 ) preferably allows the release of the elements (D 2 ) and (D ⁇ , in order to more easily carry out the culture of the viable and reviviscent particles.
  • the device (D) as defined above may further comprise a connection element (D 0 ), such as for example a notched plug capable of adapting to a medical gas outlet, a small diameter tube capable of adapt to the outlet of a pressure regulator and more generally any connection capable of adapting to any device for delivering compressed or liquefied gas.
  • a connection element such as for example a notched plug capable of adapting to a medical gas outlet, a small diameter tube capable of adapt to the outlet of a pressure regulator and more generally any connection capable of adapting to any device for delivering compressed or liquefied gas.
  • the device (D) as defined above may further comprise a pressure regulator placed between the connection element (Do) and the element (D 1 ).
  • the device (D) as defined above can be connected to the supply of gas to be analyzed, sojt by being connected to a wall outlet, sojt by being connected to the supply line for the gas to be analyzed, preferably downstream of '' a 1/4 turn valve.
  • the method and the device, objects of the present invention are used to determine the microbiological quality of gases or gas mixtures contained in bottles, whether medical bottles or industrial bottles, such as those intended to the manufacturing industry of electronic components, to the food industry or to the pharmaceutical industry.
  • the method and the device, objects of the present invention are also implemented for determining the microbiological quality of gas or mixtures of gases supplied by supply networks, such as hospital supply networks allowing in particular the delivery of gases in operating rooms or operating theaters, supply networks for frozen food manufacturing chains, very high purity gas supply networks for the manufacture of electronic components or gas supply networks necessary for the manufacture and / or packaging of pharmaceutical products and formulations.
  • supply networks such as hospital supply networks allowing in particular the delivery of gases in operating rooms or operating theaters, supply networks for frozen food manufacturing chains, very high purity gas supply networks for the manufacture of electronic components or gas supply networks necessary for the manufacture and / or packaging of pharmaceutical products and formulations.
  • the method and the device, objects of the present invention are also implemented for determining the microbiological quality of gases or gas mixtures at the outlet of a unit for producing the gas or the gas mixture, such as for example, a compressor, a cryogenic distillation column, a gas separation column by adsorption, whether it is a PSA column (pressure swing adsorption), a column VSA (modulated volume adsorption; in English: Volume Swing Adsorption) or a TSA column (modulated pressure adsorption; in English: Temperature Swing Adsorption) or a gas separation unit by permeation through membranes polymers such as for example a FLOXAL TM unit.
  • a unit for producing the gas or the gas mixture such as for example, a compressor, a cryogenic distillation column, a gas separation column by adsorption, whether it is a PSA column (pressure swing adsorption), a column VSA (modulated volume adsorption; in English: Volume Swing Adsorption) or a TSA column (modulated
  • the method and the device, objects of the present invention are also implemented for determining the microbiological quality of the ambient air in premises, and more particularly in the clean rooms of drug manufacturing sites or manufacturing sites of electronic components or in document storage sites.
  • its subject is a method for determining the ability of a device capable of trapping viable and reviviscent particles, to determine the microbiological quality of a gas or of a mixture of gas under pressure with respect to a reference device as defined above, comprising the injection of a determined quantity of one or more known microorganisms into the flow upstream of the device to be qualified and the quantification of the microorganisms trapped by the latter device.
  • a calibration bench comprising:
  • a nebulizer operating on the venturi principle comprising:
  • a spray head connected to said chamber, of frustoconical shape with an axis of symmetry (y), comprising at its small base, a spray orifice and (iii) a cylindrical capillary tube (y), of diameter less than diameter of said spray orifice, one end of which is inserted into said orifice coaxially with the spray head,
  • a casing completely enveloping said nebulizer to which are connected a line for supplying carrier gas and a line for distributing the gas flow from the nebulizer-casing assembly, containing the microorganisms to the device for which it is desired to determine its ability to trap them, in which the nebulizer adapts coaxially to said distribution line.
  • the nebulizer is non-removable. According to another particular and preferred aspect of the nebulizer as described above, the nebulizer is removable in that at least the spray head, the cylindrical chamber and the capillary tube can be separated from each other.
  • the invention relates to a nebulizer as well as a set, nebulizer-casing, capable of being implemented in the method described above.
  • Figure 1A shows a diagram of a device according to the invention. It consists of a neck (cylindrical fraction of the element (Di)), a diffuser (frustoconical fraction of the element Di) and a Petri dish (element (D 2 )).
  • w represents the inside diameter of the neck and is equal to 4 mm
  • h represents the length of the neck and is equal to 10 mm
  • H represents the height of the diffuser and is equal to 80 mm
  • W represents the diameter of the large base of the diffuser and is equal to 75 mm
  • Wi represents the diameter of the Petri dish and is equal to 90 mm
  • d represents the distance between the large base of the diffuser and the external surface of the agar of the Petri dish and is equal to 13 mm;
  • the device operates so that the speed of the jet continues to increase, as long as its pressure has not reached atmospheric pressure.
  • the total supply pressure is between approximately 2.10 5 Pa and 10 6 Pa.
  • the fluid accelerates until it leaves the cervix. Then there are areas of low pressure / expansion where the flow is alternately accelerated and slowed down.
  • the calibration bench for compressed or liquefied gas presented in the photo in FIG. 2 is used, fitted with the device according to the invention, in order to qualify its biological efficiency and to compare it with that of existing biocollectors.
  • the carrier gas in this case medical air from a cylinder sold by the plaintiffs and connected to a pressure regulator, single expansion Air Liquide referenced: AHL 16-25, circulates in line d 'supply of the crankcase-nebulizer assembly, at a pressure P' of between approximately 10 5 and 5.10 5 Pa relative and the nebulizer gas, in this case medical air from a bottle sold by the applicants and connected to an Air Liquide pressure reducer, simple expansion referenced: HBS 300/8, circulates in the supply line of the crankcase - nebulizer assembly, at a pressure P greater than> P 'between 4.10 5 Pa and 6.10 5 Pa relative.
  • the complexity of such a device resides in the nebulization under pressure of microorganisms, the nebulizers of the state of the art operating only rarely under pressure.
  • TR50-1C1 TM nebulizer marketed by the company ANALAB, capable of nebulizing microorganisms under pressure (between 10 5 Pa and 4.10 5 Pa) without destroying them, was carried out with the calibration bench and was found to be unsatisfactory due, on the one hand, to the fragility of the nebulizer and, on the other hand, to significant losses during nebulization.
  • the nebulizer comprises a tube allowing it to be supplied with microbiological inoculum and a tube for supplying nebulizer gas at the pressure P 'greater than the pressure P, to obtain gas flows at the neck of 100 to 300 liters per minute (l / min).
  • nebulizer gas at the pressure P 'greater than the pressure P, to obtain gas flows at the neck of 100 to 300 liters per minute (l / min).
  • two plastic three-way valves connected together by a flexible hose and located upstream, on the two nebulizer supply tubes, allow the circulation of nebulizer gas in the Pinoculum injection tube. . This avoids stagnation of droplets of inoculum in the nebulizer.
  • the casing, the straight pipe and the device (D) composed of the elements (Di) and (D 3 ) are sterilized by humid heat in an autoclave for 20 minutes at 120 ° C.
  • the nebulizer is disinfected with 70 ° alcohol before mounting on the housing.
  • the system for injecting microorganisms into the nebulizer (the 2 plastic 3-way valves, the pipes connecting them and the syringe) is a sterile device for single use.
  • Method of injecting a microbiological inoculum of known concentration It includes the following steps:
  • a known volume of a suspension of microorganisms in determined quantity is nebulized while a defined volume of gas is injected into the calibration bench. At the outlet of the bench, there is therefore a known volume of gas containing a perfectly determined number of microorganisms in suspension in this volume.
  • Device D can be used independently at a gas flow rate below 300 l / min (subsonic gas speed) or at a gas flow rate above 300 l / min (supersonic speed), while providing a constant recovery rate and reproducible by around 40% for Bacillus subtilis spores. The only limit is the eventual destruction of the agar at supersonic speed.
  • the device (D) as defined above can be connected to the supply of gas to be analyzed, either by being connected to a wall outlet, or by being connected to the supply line for the gas to be analyzed, preferably downstream a 1/4 turn valve.
  • Figure 6 schematically illustrates a bench and nebulizer structure according to the invention and therefore allows a better understanding of their operation.

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Abstract

Procédé de séparation par impaction, de particules viables et reviviscentes d'un gaz en contenant, comprenant une étape (a) d'accélération en un étage et selon un axe (x), du flux de gaz dans un volume confiné (V), pour atteindre une vitesse axiale vX supérieure à vo, subsonique, sonique ou supersonique, une étape (b) de décélération brutale dudit flux issu de l'étape (a) dans ledit volume, selon substan­tiellement le même axe (x), à pression atmosphérique, une étape (c), de change­ment de direction de l'écoulement du gaz à la sortie du volume (V), qui devient ra­dial en moyenne, une étape (d), de piégeage des particules, séparées de l'écou­lement lors de l'étape (c), sur une cible, et une étape (e), d'échappement du flux de gaz ou du mélange de gaz du volume (V) de façon à ce qu'il n'y ait aucun contact entre l'atmosphère environnante et la cible mise en oeuvre à l'étape (c). Variante du procédé comprenant en outre une étape (f) de comptage des particu­les piégées lors de l'étape (d). Dispositif (D), apte à la mise en oeuvre du procédé et de sa variante. Procédé de détermination de l'aptitude d'un dispositif capable de piéger des particules viables et reviviscentes, à déterminer la qualité microbio­logique d'un gaz sous pression par rapport à un dispositif de référence avec un banc d'étalonnage comprenant un nébuliseur fonctionnant selon le principe du venturi enveloppé par un carter. Nébuliseur apte à être mis en oeuvre.

Description

Procédé de séparation par impaction, de particules viables et reviviscentes d'un gaz ou d'un mélange de gaz en contenant, dispositif et banc d'essai mis en œuvre
L'invention appartient au domaine de la production, des applications et de l'analyse des gaz.
La qualité bactériologique des gaz, et de l'air en particulier, devient une nécessité. Il existe des appareils commerciaux, qui permettent de contrôler la qualité microbiologique de l'air ambiant. Ces appareils sont utilisés dans les hôpitaux, les laboratoires pharmaceutiques, dans l'industrie agroalimentaire et dans toute activité devant être effectuée dans des "salles blanches", comme la fabrication des composants électroniques. Ces appareils fonctionnent selon deux méthodes : la méthode de filtration (appareils MILLIPORE™ et appareils SARTORIUS™) et la méthode d'impaction. La méthode de filtration consiste à faire traverser un gaz à travers un porte- filtre équipé d'un filtre de porosité comprise entre environ 0,22 μm et 0,45 μm. Les microorganismes véhiculés par le flux gazeux, et dont la taille est supérieure à celle des pores, sont retenus par le filtre. Le filtre est ensuite recueilli en conditions aseptiques, et il est soit lavé pour récupérer les microorganismes, soit mis directement en culture sur boîte de Pétri. Après une période déterminée d'incubation à l'étuve, on compte le nombre d'unités formant colonies (UFC), on identifie les germes présents et on en déduit ainsi un nombre d'unités formant colonie par volume de gaz prélevé exprimé en UFC / m3. Selon une variante de cette méthode, on utilise un filtre hydrosoluble à base de gélatine, ce qui permet après ad- dition d'eau de dénombrer et d'identifier les microorganismes contenus dans le liquide à l'aide d'outils de biologie moléculaire.
La méthode d'impaction consiste à accélérer fortement le flux d'un gaz et à le diriger vers une cible enduite de gélose. Les particules et microorganismes ayant une quantité de mouvement suffisante quittent le flux d'air et sont projetés sur la surface de cette cible. Il existe deux variantes de cette méthode :
- "l'impaction par crible", selon laquelle le gaz passe à travers une plaque percée de trous, chaque trou induisant la formation d'un jet de gaz qui impacte la cible (appareil AIR TEST™ OMEGA) et - "l'impaction par centrifugation" ou par "rotation du flux", selon laquelle les particules sont séparées du flux gazeux et projetées par centrifugation sur une bandelette de gélose (appareils RCS High Flow™ de Biotest ou BIAP™ d'ECOMESURE). Dans le cas du contrôle microbiologique de l'air ambiant, la plupart des appareils fonctionnent selon la méthode par impaction. Cependant, ces appareils ne permettent pas de déterminer de façon complète la contamination de l'air.
Il existe aussi des appareils commercialement disponibles dits « bio- impacteurs » fonctionnant selon cette même méthode, pour contrôler la qualité des gaz comprimés et conçus pour travailler à la pression du réseau sur lequel il est connecté, avec un débit de gaz constant de l'ordre de 28 litres / minute. Cependant, les résultats obtenus sont peu reproductibles car ils dépendent d'un grand nombre de facteurs, comme la taille des particules viables à analyser, le type et la sensibilité des microorganismes, le niveau de la contamination, les conditions environnantes, la précision et l'efficacité du prélèvement de l'opérateur, le type et la hauteur de gélose recouvrant la cible, la vitesse d'impaction des particules et le volume de gaz prélevé par sa capacité à sécher plus ou moins la gélose. C'est pourquoi les résultats varient pour un même gaz d'un appareil à l'autre, qu'ils soient identiques ou différents. De plus, bien que les pompes et les systèmes d'aspiration de ces appareils soient étalonnés et contrôlés de manière à prélever un volume précis de gaz en un temps donné avec une vitesse constante, il n'existe pas de rapport d'étalonnage permettant de déterminer de façon précise le taux récupération des microorganismes vivants, réellement présents dans l'échantillon. Bien que cer- tains fournisseurs de ces appareils aient défini les taux de récupération en fonction de la taille des particules, l'efficacité biologique, qui représente la capacité du collecteur à maintenir la viabilité des microorganismes collectés durant toute la procédure de prélèvement, n'a été que peu ou pas validée.
Enfin, il n'existe aujourd'hui aucune norme définissant un nombre maximum de microorganismes à ne pas dépasser par mètre cube d'air ambiant ou par mètre cube de gaz analysé, que ce soit dans l'industrie agroalimentaire, dans l'industrie pharmaceutique ou même dans le milieu médical. N'ayant pas de normes spécifiques à l'aérobiocontamination (à l'exception des salles blanches), il est né- cessaire d'en établir une cartographie. Les seules normes existantes sont relatives à l'empoussièrement.
La demanderesse a donc cherché à développer un procédé de séparation de particules d'un gaz ou d'un mélange de gaz. C'est pourquoi l'invention a pour objet un procédé de séparation par impaction, de particules viables et reviviscentes d'un gaz ou d'un mélange de gaz en contenant, s'écoulant à une vitesse v0 non nulle, caractérisé en ce qu'il comprend
- Une étape (a), d'accélération en un étage et selon un axe (x), du flux de gaz ou du mélange de gaz dans un volume confiné (V), pour atteindre une vitesse axiale vx supérieure à v0, subsonique, sonique ou supersonique,
- Une étape (b), de décélération brutale dudit flux issu de l'étape (a) dans ledit volume, selon substantiellement le même axe (x), à pression atmosphérique,
- Une étape (c), de changement de direction de l'écoulement du gaz ou du mélange de gaz à la sortie du volume (V), qui devient radial en moyenne,
- Une étape (d), de piégeage des particules, séparées de l'écoulement lors de l'étape (c), sur une cible, et
- Une étape (e), d'échappement du flux de gaz ou du mélange de gaz du volume (V) de façon à ce qu'il n'y ait aucun contact entre l'atmosphère environ- nante et la cible mise en œuvre à l'étape (d).
Dans le cadre de la présente invention, par gaz ou mélange de gaz en contenant, s'écoulant à une vitesse v0 non nulle, on désigne un gaz ou un mélange de gaz à une pression totale supérieure à 1 atmosphère (environ 105 Pa), généralement à une pression totale inférieure ou égale à 200 atmosphères, et plus particulièrement à une pression totale inférieure ou égale à 10 atmosphères. Par brutale, on entend dans la présente demande de brevet, une décélération qui permet de réduire la vitesse d'un écoulement gazeux, à une vitesse axiale nulle sur la cible.
Par volume confiné (V), dans lequel se déroulent les étapes (a) et (b) et à l'extrémité duquel se déroule l'étape (c), on désigne dans le présent exposé, un volume fini délimité par une surface latérale finie, qui est de préférence une surface de révolution autour de l'axe (x). Le débit de gaz dont on souhaite déterminer la qualité microbiologique, varie selon la provenance et /ou l'utilisation qui est faite dudit gaz. Il est souvent compris entre 50 litres par minute et 1000 litres par minute et plus particulièrement entre 100 litres par minute (mode jet subsonique) et 300 litres par minute (mode jet sonique pour la plupart des gaz).
Le procédé objet de la présente invention peut être mis en œuvre avec n'importe quel gaz ou mélange de gaz.
Comme gaz ou mélange de gaz, il y a par exemple, l'air, l'oxygène (02), l'azote (N2), l'argon (Ar), le dioxyde de carbone (CO2), l'hélium (He), le protoxyde d'azote (N20), le monoxyde d'azote (NO), les mélanges de protoxyde d'azote et d'oxygène, de dioxyde de carbone et d'oxygène, d'azote et de monoxyde d'azote ou d'hélium et d'oxygène, et plus particulièrement les mélanges (50 % en volume (v/v) N20 + 50 % v/v OU), (5 % v/v C02 + 95 % v/v 02), (200 ppm à 800 ppm NO dans N2), (78 % v/v He + 22 % v/v 02), (65 % He +35 % 02) et (80 % v/v He + 20 %v/v 02), utilisés en médecine ou encore les mélanges d'azote et de dioxyde de carbone (N2 + C02) utilisés dans l'industrie alimentaire.
Selon un premier aspect particulier, le volume confiné (V) consiste en une première fraction de volume (Va) dans laquelle est mise en œuvre l'étape (a), délimitée par deux bases (B-i) et (B2), de surfaces (Si) et (S2), avec (Si) supérieure ou égale à (S2) et une deuxième fraction de volume (Vb) contiguë à (Va), dans laquelle est mise en œuvre l'étape (b) délimitée par (B2) et une base (B3) de surface (S3) supérieure ou égale à (S2). Lorsque (S-i) et (S2) sont égales, (Si) est inférieure à la section du flux de gaz circulant en amont du volume (V).
Selon un aspect particulier du procédé tel que défini précédemment, l'étape (d) de piegeage des particules est mise en œuvre sur une surface-cible capable de les fixer.
Par particules viables et reviviscentes, on désigne des microorganismes de tous ordres, capables de se multiplier dans des conditions de pression, d'humidité et de température appropriées. De préférence la surface - cible est celle d'un milieu nutritif permettant le développement et la multiplication des microorganismes piégés. Il peut s'agir d'un milieu solide comme un milieu comprenant de la gélose. Selon le type de microorganismes dont on cherche à déterminer la présence, ledit milieu sera soit spécifi- que à la croissance d'une ou plusieurs espèces de microorganismes, soit non spécifique. Comme exemples de milieu solide nutritif mis en œuvre pour piéger les particules, il y a :
- Le milieu Trypto-Caséine-Soja ou TCS™ (laboratoire AES référence : AEB 522 859), qui est un milieu sélectif des bactéries comprenant 15 g/l (gramme par litre) de pastone, 5 g/l de peptone papaïnique de soja, 5 g/l de chlorure de sodium et 15 g/l d'Agar. Ce milieu nécessite une incubation de 24 à 48 heures à 37°C.
- Le milieu R2A™ (laboratoire AES, référence AEB 523 480), qui est un mi- lieu non sélectif généralement utilisé pour le dénombrement des microorganismes dits "stressés", présents dans des eaux traitées pauvres en nutriments ; il comprend 1 ,0 g/l d'un mélange de peptones (protéose peptone), 0,5 g/l d'hydrolysât acide de caséine, 0,5 g/l de dextrose, 0,5 g/l d'amidon soluble, 0,3 g/l de phosphate dipotassique (K2HP0 ), 0,024 g/l de sulfate de magnésium, 0,3 g/l de pyru- vate de sodium et 15 g/l d'Agar.
- Le milieu R3A™ décrit dans : "A new médium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water" (D.J. Reasoner and E. E. Geldreich, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 49, N°1 , 1985, p.1-7), qui est un milieu non sélectif adapté comme le milieu R2A™ aux microorganismes dits "stres- ses" ; il comprend 1 ,0 g/l d'un mélange de peptones (protéose peptone), 1 ,0 g/l d'extrait de levure, 1 ,0 g/l d'hydrolysât acide de caséine, 1 ,0 g/l de dextrose, 1,0 g/l d'amidon soluble, 0,6 g/l de phosphate dipotassique (K2HP04), 0,1 g/l de sulfate de magnésium, 0,10 g/l de pyruvate de sodium et 30 g/l d'Agar.
- Le milieu MOSSEL™ (laboratoire AES, référence AEB 521 740), qui est un milieu spécifique à la croissance de Bacillus cereus et des Bacillus spp. ; en général, il comprend 10 g/l de peptone de viande, 1 g/l d'extrait de viande, 10 g/l de chlorure de sodium, 10 g/l de mannitol, 0,025 g/l de rouge de phénol et 15 g/l d'Agar.
- Le milieu Schaedler™ au sang de mouton (5%) (Biomérieux, référence 43273), qui est particulièrement adapté à la culture des bactéries anaérobies et permet la croissance d'espèces exigeantes ; il comprend 5,7 g/l de peptone de caséine, 1 g/l de peptone de soja, 5 g/l de peptone de caséine et de viande, 5 g/l d'extrait de levure, 5,83 g/l de glucose, 1 ,7 g/l de chlorure de sodium, 3 g/l de phosphate bipotassique, 0,01 g/l de Tris(hydroxyméthyl) amino méthane, 0,01 g/l d'hémine, 0,4 g/l de cystéine, 0,0005 g/l de L-cystine, 13,5 g/l d'Agar et 50 ml/l de sang de mouton.
La dureté à l'impaction de ces milieux peut être modifiée en changeant la concentration en Agar ou Agar-agar.
L'invention a aussi pour objet une variante du procédé tel que défini précédemment, comprenant en outre une étape (f , de comptage des particules piégées lors de l'étape (d).
L'étape (f) consiste, de préférence, en une étape (fi) de cultures des parti- cules viables et reviviscentes piégées à l'issue de l'étape (d), suivie d'une étape (fg) de comptage des unités formant colonies.
L'étape de culture consiste, par exemple, au maintien du milieu nutritif contenant les particules piégées, à une température permettant la multiplication des microorganismes pendant un temps déterminé par le milieu de culture utilisé (24 à 48 heures à 37°C pour le milieu TCS™, 5 à 15 jours à 25°C pour les milieux R2A™ ou R3A™, 24 heures à 37°C pour le milieu Mossel™ ou 5 jours à 37°C pour le milieu Schaedler™ au sang de mouton).
Le procédé tel que défini précédemment, permet de séparer efficacement des microorganismes ayant des dimensions comprises entre 0,05 μm et 25 μm et plus particulièrement entre 0,2 μm et 12 μm.
Comme exemples de microorganismes dont on a montré la présence dans un gaz comprimé ou liquéfié après isolement sur milieu nutritif, par la variante du procédé tel que décrit précédemment, il y a les moisissures et levures telles que, Mucor indicus, Graphium spp, Pénicillium spp.; les bactéries Gram positives telles que Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus aureus, Bacillus brevis ; les bactéries Gram négatives telles que Pantoea spp.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détermination de la qualité microbiologique d'un gaz ou d'un mélange de gaz sous pression, par mise en œuvre de la variante du procédé de séparation telle que décrite précédemment. Le procédé et sa variante permettent la collecte sur milieu nutritif solide des germes présents dans un gaz, comprimé ou liquéfié, sous pression. Le gaz analysé peut provenir de bouteilles, de cadres, de réservoirs de stockage, primaires ou secondaires, d'un réseau d'alimentation en gaz, primaire ou secondaire, et plus particulièrement, soit d'un réseau d'alimentation en gaz médicaux tels qu'ils se trouvent dans les établissements de soins, comme les hôpitaux, les dispensaires ou les cliniques, soit d'un réseau de distribution de gaz tel qu'il y en a dans les usines de production de médicaments ou dans les usines de l'industrie agroali- mentaire.
Le gaz n'a pas besoin d'être détendu à la pression atmosphérique pour être analysé par le procédé décrit précédemment.
Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci a pour objet un dispositif (D), apte à la mise en œuvre du procédé et de sa variante tels que définis précédemment.
Le dispositif (D) comprend :
- Un élément (Di) dans lequel le flux de gaz subit successivement les étapes (a) et (b),
- Un élément (D2) constituant la cible sur laquelle les particules viables ou reviviscentes sont piégées selon l'étape (d) et,
- Un élément (D3), enveloppant en tout ou partie l'élément (D ), permettant de canaliser l'écoulement du gaz ou du mélange de gaz en sortie de l'élément (Di) vers un ou plusieurs orifices de sortie du dispositif (D), de façon à ce qu'il n'y ait aucun contact entre l'atmosphère environnante et la cible. L'élément (Di) du dispositif (D) est un solide creux, comprenant un orifice d'entrée, un orifice de sortie, une surface latérale inférieure SL, définissant un volume confiné (V) ayant des sections orthogonales, polygonales, elliptiques ou cylindriques, dans lequel se déroulent les étapes (a) et (b) du procédé tel que défini précédemment, à l'orifice de sortie duquel se déroule l'étape (c). La surface SL est plus particulièrement, soit une surface de révolution autour d'un axe (x) soit une surface latérale d'un polyèdre régulier d'axe de symétrique (x), soit un ensemble d'une ou plusieurs surfaces de révolution et / ou une ou plusieurs surfaces de polyèdres réguliers, de même axe de symétrie (x), définissant le volume (V). Les deux orifices sont de préférence co-axiaux par rapport à l'axe (x). L'élément (Di) peut être en tout matériau, que ce soit un plastique un métal ou un alliage de métaux. Il est de préférence en un matériau pouvant être stérilisé par chaleur sèche (3 heures à 180°C) ou par chaleur humide (20 minutes à 130 °C). L'élément (Di) du dispositif (D) comprend plus particulièrement une surface latérale interne SL définissant une première fraction de volume (Va) de forme tronconique ou cylindrique, dans laquelle est mise en œuvre l'étape (a), et une deuxième fraction de volume (Vb) contiguë à (Va), de forme tronconique, dans la- quelle est mise en œuvre l'étape (b).
L'élément (D ) du dispositif (D) a tout particulièrement une forme définissant une première fraction de forme cylindrique de hauteur h et de diamètre w, dans laquelle est mise en œuvre l'étape (a), et une deuxième fraction de forme tronconique de hauteur H de petite base de diamètre w et de grande base de diamètre W, dans laquelle est mise en œuvre l'étape (b). L'orifice d'entrée est dans ce cas de section circulaire de diamètre w et l'orifice de sortie est de section circulaire et de diamètre W.
Le rapport h/w est en général compris entre 10/1 et 1/10. Il est plus particulièrement compris entre 10/2 et 2/10. Le rapport W/w est en général compris entre 50/1 et 5/1. Il est plus particulièrement compris entre 25/1 et 10/1.
Le rapport H/w est en général compris entre 5/1 et 50/1. Il est plus particulièrement compris entre 10/1 et 40/1.
H est en général compris entre 10 mm et 200 mm, plus particulièrement entre 30 mm et 120 mm et tout particulièrement entre 40 mm et 100 mm.
Lorsque la pression totale du gaz devant entrer dans l'élément (D^ du dispositif (D) utilisé pour mettre en œuvre le procédé tel que défini précédemment, est inférieure à 5 atmosphères, la valeur de w est, préférentiellement, comprise entre 2 et 5 mm environ et elle est plus particulièrement égale à environ 4 mm. L'élément (D2) du dispositif (D) est de préférence de forme cylindrique et de diamètre Wi supérieur ou égal à W. En général, Wi est inférieur ou égal 90 mm. W est, en général, compris en 50 mm et 90 mm. Il s'agit de préférence d'une boite de Pétri. L'élément (D2) contient un milieu nutritif pour les microorganismes et plus particulièrement un milieu gélosique. L'élément (D3) du dispositif (D) est un solide creux comprenant un orifice d'entrée, un orifice de sortie, une surface latérale inférieure S3. La surface S3 est plus particulièrement, soit une surface de révolution autour de l'axe (x), soit une surface latérale d'un polyèdre régulier d'axe de symétrique (x). L'élément (D3) présente plus particulièrement le même axe de symétrie que l'élément (Di). Cet élément D3 peut bien entendu être constitué d'une ou plusieurs parties.
L'élément (D3) définit avec l'élément (Di), un volume par lequel s'écoule le gaz délesté des particules piégées sur l'élément (D2) vers le ou les orifices de sortie du dispositif (D) à une vitesse suffisante pour que les microorganismes présents dans l'atmosphère ambiante n'atteignent pas la surface interne dudit élément D2.
L'élément (D3) peut être en tout matériau, que ce soit un plastique un métal ou un alliage de métaux. Il est de préférence en un matériau pouvant être stérilisé par chaleur sèche (3 heures à 180°C) ou par chaleur humide (20 minutes à 121 °C).
L'élément (D3) du dispositif (D) permet aussi de maintenir l'élément D2 à une distance d de la grande base de (D1), suffisante pour permettre l'entier écou- lement du gaz ou du mélange de gaz à la sortie de l'élément (D1), de façon radiale en moyenne à l'axe (x).
Le rapport H/d est, en général, compris entre 2/1 et 20/1. Il est plus particulièrement compris entre 3/1 et 15/1.
Le système d'ouverture de l'élément (D3) permet de préférence la libération des éléments (D2) et (D^, afin d'effectuer plus facilement la culture des particules viables et reviviscentes.
Le dispositif (D) tel que défini précédemment peut comprendre, en outre, un élément (D0) de connexion, tel que par exemple une prise crantée capable de s'adapter à une prise de gaz médical, un tube de petit diamètre capable de s'adapter à la sortie d'un manodétendeur et plus généralement tout raccord capable de s'adapter à tout dispositif de délivrance de gaz comprimé ou liquéfié.
Le dispositif (D) tel que défini précédemment peut comprendre en outre un manodétendeur placé entre l'élément de connexion (Do) et l'élément (D1).
Le dispositif (D) tel que défini précédemment peut être relié à l'alimentation en gaz à analyser, sojt en étant connecté sur une prise murale, sojt en étant connecté à la canalisation d'alimentation du gaz à analyser, de préférence en aval d'une vanne 1/4 de tour. Le procédé et le dispositif, objets de la présente invention, sont mis en œuvre pour déterminer la qualité microbiologique de gaz ou de mélanges de gaz contenus dans des bouteilles, qu'il s'agisse de bouteilles médicales ou de bouteilles industrielles, comme celles destinée à l'industrie de fabrications des compo- sants électroniques, à l'industrie alimentaire ou à l'industrie pharmaceutique.
Le procédé et le dispositif, objets de la présente invention, sont aussi mis en œuvre pour déterminer la qualité microbiologique de gaz ou de mélanges de gaz délivrés par des réseaux d'alimentation, tels que les réseaux d'alimentation hospitaliers permettant notamment la délivrance de gaz dans les chambres ou les blocs opératoires, les réseaux d'alimentation des chaînes fabrication d'aliments surgelés, les réseaux d'alimentation en gaz de très haute pureté pour la fabrication de composants électroniques ou les réseaux d'alimentation en gaz nécessaires à la fabrication et/ou au conditionnement des produits et formulations pharmaceutiques. Le procédé et le dispositif, objets de la présente invention, sont aussi mis en œuvre pour déterminer la qualité microbiologique de gaz ou de mélanges de gaz en sortie d'une unité de production du gaz ou du mélange de gaz, telle que par exemple, un compresseur, une colonne de distillation cryogénique, une colonne de séparation des gaz par adsorption, qu'il s'agisse d'une colonne PSA (ad- sorption à pression modulée ; en langue anglaise : Pressure Swing Adsorption), d'une colonne VSA (adsorption à volume modulé ; en langue anglaise : Volume Swing Adsorption) ou d'une colonne TSA (adsorption à pression modulée ; en langue anglaise : Température Swing Adsorption) ou d'une unité de séparation des gaz par perméation à travers des membranes polymères telles que par exemple une unité FLOXAL™.
Le procédé et le dispositif, objets de la présente invention, sont aussi mis en œuvre pour déterminer la qualité microbiologique de l'air ambiant dans des locaux, et plus particulièrement dans les salles blanches des sites de fabrication de médicaments ou des sites de fabrications de composants électroniques ou encore dans les sites de conservation de documents.
Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci a pour objet un procédé de détermination de l'aptitude d'un dispositif capable de piéger des particules viables et reviviscentes, à déterminer la qualité microbiologique d'un gaz ou d'un mélange de gaz sous pression par rapport à un dispositif de référence tel que défini précédemment, comprenant l'injection d'une quantité déterminée d'un ou plusieurs microorganismes connus dans le flux en amont du dispositif à qualifier et la quantification des microorganismes piégés par ce dernier dispositif. Selon un aspect particulier du procédé tel que défini ci-dessus, celui-ci est mis en œuvre au moyen d'un banc d'étalonnage comprenant :
(1) un nébuliseur fonctionnant selon le principe du venturi, comprenant :
(i) une chambre cylindrique d'axe de symétrie (y), à laquelle sont connectés une ligne d'alimentation en gaz nébuliseur et une ligne d'alimentation en solution contenant la quantité prédéterminée de microorganismes dans un gaz nébuliseur ;
(ii) une tête de pulvérisation connectée à ladite chambre, de forme tronconique d'axe de symétrie (y), comportant en sa petite base, un orifice de pulvérisation et (iii) un tube capillaire cylindrique (y), de diamètre inférieur au diamètre dudit orifice de pulvérisation, dont l'une des extrémités est insérée dans ledit orifice de façon coaxiale à la tête de pulvérisation,
(2) un carter enveloppant complètement ledit nébuliseur, auquel sont connectés une ligne d'alimentation en gaz vecteur et une ligne de distribution du flux de gaz issu de l'ensemble nébuliseur-carter, contenant les microorganismes vers le dispositif dont on souhaite déterminer son aptitude à les piéger, dans lequel le nébuliseur s'adapte de façon coaxiale à ladite ligne de distribution.
Selon un aspect particulier du nébuliseur tel que décrit ci-dessus, le nébuliseur est indémontable. Selon un autre aspect particulier et préféré du nébuliseur tel que décrit ci- dessus, le nébuliseur est démontable en ce qu'au moins la tête de pulvérisation, la chambre cylindrique et le tube capillaire peuvent être désolidarisés les uns des autres.
Selon un dernier aspect, l'invention a pour objet un nébuliseur ainsi qu'un ensemble, nébuliseur-carter, apte à être mis en œuvre dans le procédé décrit ci- dessus.
L'exposé expérimental suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. Dispositif selon l'invention
La Figure 1A représente un schéma d'un dispositif selon l'invention. Il est constitué d'un col (fraction cylindrique de l'élément (Di)), d'un diffuseur (fraction tronconique de l'élément Di) et d'une boite de Pétri (élément (D2)). Les mesures indiquées sur cette figure sont les suivantes : w représente le diamètre intérieur du col et est égal à 4 mm ; h représente la longueur du col et est égale à 10 mm ; H représente la hauteur du diffuseur et est égale à 80 mm ; W représente le diamètre de la grande base du diffuseur et est égal à 75 mm ; Wi représente le diamètre de la boite de Pétri et est égale à 90 mm ; d représente la distance entre la grande base du diffuseur et la surface externe de la gélose de la boite de Pétri et est égale à 13 mm ;
Le dispositif fonctionne de façon à ce que la vitesse du jet continue d'augmenter, tant que sa pression n'a pas atteint la pression atmosphérique. La pression totale d'alimentation est comprise entre environ 2.105 Pa et 106 Pa.
Un dispositif pour lequel H est égal 80 mm est présenté sur la photo de la Figure 1B.
Dans le col, le fluide accélère jusqu'à la sortie du col. Ensuite, il y a des zones de pression/détente faible où l'écoulement est alternativement accéléré et ra- lenti.
Pour préserver l'intégrité de la gélose utilisée dans cette application particulière, on cherche à avoir une pression totale sur sa surface inférieure à 7500 Pa, ce qui, pour le dispositif de la Figure 1B, implique une hauteur H = 80 mm.
On utilise le banc d'étalonnage pour gaz comprimé ou liquéfié présenté sur la photo de la Figure 2, muni du dispositif selon l'invention, afin d'en qualifier l'efficacité biologique et de la comparer à celle de biocollecteurs existants.
Dans les conditions de fonctionnement, le gaz vecteur, dans le cas présent de l'air médical issu d'une bouteille commercialisée par les demanderesses et connectée à un manodétendeur, simple détente Air Liquide référencé : AHL 16- 25, circule dans la ligne d'alimentation de l'ensemble carter - nébuliseur, à une pression P' comprise entre environ 105 et 5.105 Pa relatifs et le gaz nébuliseur, dans le cas présent de l'air médical issu d'une bouteille commercialisée par les demanderesses et connectée à un manodétendeur, simple détente Air Liquide ré- férencé : HBS 300/8, circule dans la ligne d'alimentation de l'ensemble carter - nébuliseur, à une pression P supérieure à >P' comprise entre 4.105 Pa et 6.105 Pa relatifs.
La complexité d'un tel dispositif réside dans la nébulisation sous pression de microorganismes, les nébuliseurs de l'état de la technique ne fonctionnant que rarement sous pression.
Un premier essai mettant en œuvre un nébuliseur TR50-1C1™ , commercialisé par la société ANALAB, capable de nebuliser des microorganismes sous pression (entre 105 Pa et 4.105 Pa) sans les détruire, a été fait avec le banc d'étalonnage et s'est révélé insatisfaisant à cause, d'une part, de la fragilité du nébuliseur et, d'autre part, de pertes importantes lors de la nébulisation.
C'est pourquoi un nébuliseur métallique, fonctionnant sur le principe du Venturi, a été mis au point. Il est muni d'un capillaire de 0,2 mm de diamètre et il est inséré dans un carter métallique (Figure 3A). Deux modèles de nébuliseurs ont été élaborés, l'un entièrement soudé (Figure 4A) et le second démontable (Figure 4B), permettant de changer facilement le capillaire si celui-ci venait à s'obstruer.
Le nébuliseur comprend un tube permettant son alimentation en inoculum microbiologique et un tube d'alimentation en gaz nébuliseur à la pression P' supé- rieure à la pression P, pour obtenir des débits gazeux au col de 100 à 300 litres par minute (l/mn). Pour optimiser le rendement de nébulisation, deux vannes trois voies en plastique, reliées entre elles par un tuyau souple et situées en amont, sur les deux tubes d'alimentation du nébuliseur, permettent la circulation de gaz nébuliseur dans le tube d'injection de Pinoculum. On évite ainsi la stagnation de goutte- lettes d'inoculum dans le nébuliseur.
Désinfection et stérilisation du dispositif
Le carter, la canalisation droite et le dispositif (D) composé des éléments (Di) et (D3) sont stérilisés par chaleur humide à l'autoclave durant 20 minutes à 120°C.
Le nébuliseur est désinfecté à l'alcool 70° avant son montage sur le carter. Le système d'injection des microorganismes dans le nébuliseur (les 2 vannes 3 voies en plastique, les canalisations les reliant et la seringue), est un dispositif stérile à usage unique.
Méthode d'injection d'un inoculum microbioloqique de concentration connue Elle comprend les étapes suivantes :
- régler la pression du gaz vecteur au manodétendeur à 3,5.105 Pa relatifs et celle du gaz nébuliseur à 4.105 Pa relatifs pour un débit gazeux au col de 200 l/mn ; - brancher le dispositif à tester muni d'une boite de Pétri sur le banc d'étalonnage ;
- fermer la vanne ΛA de tour ;
- vérifier l'étanchéité du dispositif ;
- ouvrir la vanne ! de tour ; - ouvrir la vanne d'arrivée du gaz vecteur, puis celle du gaz nébuliseur ;
- injecter lentement 0,5 ml d'inoculum microbiologique de concentration connue comprise entre 50 UFC/ml à 900 UFC/ml en actionnant plusieurs fois sur le piston de la seringue pendant 15 secondes (Figure 5A) ;
- modifier l'orientation des vannes (Figure 5B) pendant 15 secondes sup- plémentaires ;
- fermer la vanne d'arrivée du gaz vecteur, puis celle du gaz nébuliseur.
Un volume connu d'une suspension de microorganismes en quantité déterminée est nébulisé pendant qu'un volume de gaz défini est injecté dans le banc d'étalonnage. En sortie du banc, on dispose donc d'un volume connu de gaz contenant un nombre parfaitement déterminé de microorganismes en suspension dans ce volume. On récupère à la sortie de la canalisation, les microorganismes par le dispositif selon l'invention. Connaissant la quantité de microorganismes injectée et la quantité recueillie par le collecteur, on peut en déduire le taux T de récupération du dispositif selon la formule suivante : T = (nombre d'UFC dénombrées sur milieu gélose / nombre de microorganismes injectés) x 100
Nous avons fait varier différents paramètres de ce banc d'étalonnage ou de sa méthodologie de mise en oeuvre afin d'optimiser ses performances et conser- ver un taux de récupération de spores de Bacillus subtilis d'environ 40% avec le dispositif D (H=80 mm et w=4 mm).
Un tel taux de récupération est atteint pour :
(i) une longueur de canalisation de 76 cm et de diamètre 8/10 mm ou 16/18 mm en inox 18/10 ou en laiton,
(ii) la connexion du dispositif (D) sur une vanne VA de tour ou sur une prise murale (type standard prise hospitalière),
(iii) la dilution de l'inoculum dans un bouillon Trypto-Caséine-Soja, dans de l'eau peptonée ou non peptonée. Nous avons aussi étudié l'influence des valeurs H et de w du dispositif D sur le taux T de récupération des microorganismes. Les résultats sont consignés dans les tableaux suivants :
Tableau 1 : Influence de H sur le taux T de récupération par le dispositif (D) des spores de Bacillus subtilis injectés avec w = 4 mm.
Tableau 2 : Influence de w sur le taux T de récupération par le dispositif (D) des spores de Bacillus subtilis injectés avec H = 80 mm.
C'est donc un cône de 80 mm de longueur (H) avec un orifice de 4 mm de diamè- tre (w) qui donne le meilleur taux de récupération.
Une série de 35 injections consécutives est effectuée avec un inoculum microbiologique de 400 UFC/ml. Le taux de récupération est de 40%. La plupart des points (88%) se situent entre + 1 écart type et - 1 écart type. Ces résultats mettent en lumière les avantages du dispositif selon l'invention : (i) il annule l'entraînement de l'air ambiant qui pollue le gaz, (ii) il permet d'obtenir une décélération très brutale du flux de gaz et (iii) il limite la pression totale sur la gélose à une valeur de l'ordre de 7500 Pa. On obtient des taux de récupération centrés autour de 40% et reproductibles ; ceci constitue un résultat nettement supérieur aux résultats décrits dans l'état de la technique, qui dépassent rarement 5% et de façon non reproductible.
Nous avons aussi étudié l'influence du débit de gaz à analyser sur le taux de récupération de spores de Bacillus subtilis avec un dispositif (D) de diamètre d'entrée w = 4 mm, et de longueur H = 80 mm, connecté à un tube d'alimentation en gaz de 6 / 1 mm. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant :
Tableau 3 : Influence du débit de gaz appliqué, sur le taux T de récupération par le dispositif (D) des spores de Bacillus subtilis injectés (H = 80 mm ; w = 4 mm ; temps de prélèvement 30 s).
Le dispositif D peut être utilisé indépendamment à un débit de gaz inférieur à 300 l/min (vitesse de gaz subsonique) ou à un débit de gaz supérieur à 300 l/min (vitesse supersonique), tout en fournissant un taux de récupération constant et reproductible d'environ 40% pour des spores de Bacillus subtilis. La seule limite est la destruction éventuelle de la gélose à une vitesse supersonique.
Le dispositif (D) tel que défini précédemment, peut être relié à l'alimentation en gaz à analyser, sojt en étant connecté sur une prise murale, soit en étant connecté à la canalisation d'alimentation du gaz à analyser, de préférence en aval d'une vanne 1/4 de tour. La figure 6 illustre de façon schématique une structure de banc et de nébuliseur conformes à l'invention et permet en conséquence de mieux comprendre leur fonctionnement.

Claims

Revendications
1. Procédé de séparation par impaction, de particules viables et reviviscen- tes d'un gaz ou d'un mélange de gaz en contenant, s'écoulant à une vitesse v0 non nulle, caractérisé en ce qu'il comprend
- Une étape (a., d'accélération en un étage et selon un axe (x), du flux de gaz ou du mélange de gaz dans un volume confiné (V), pour atteindre une vitesse axiale vx supérieure à v0, subsonique, sonique ou supersonique, - Une étape (b), de décélération brutale dudit flux issu de l'étape (a) dans ledit volume, selon substantiellement le même axe (x), à pression atmosphérique,
- Une étape (c), de changement de direction de l'écoulement du gaz ou du mélange de gaz à la sortie du volume (V), qui devient radial en moyenne,
- Une étape (d), de piegeage des particules, séparées de l'écoulement lors de l'étape (c), sur une cible, et
- Une étape (e), d'échappement du flux de gaz ou du mélange de gaz du volume (V) de façon à ce qu'il n'y ait aucun contact entre l'atmosphère environnante et la cible mise en œuvre à l'étape (c).
2. Procédé tel que défini à la revendication 1 , dans lequel le volume confiné (V) consiste en une première fraction de volume (Va) dans laquelle est mise en œuvre l'étape (a), délimitée par deux bases (Bi) et ,(B2), de surfaces (Si) et (S2), avec (S-i) supérieure ou égale à (S2) et une deuxième fraction de volume (Vb) contiguë à (Va), dans laquelle est mise en œuvre l'étape (b) délimitée par (B2) et une base (B3) de surface (S3) supérieure ou égale à (S2). Lorsque (Si) et (S2) sont égales, (Si) est inférieure à la section du flux de gaz circulant en amont du volume
(V).
3. Procédé tel que défini à l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la vitesse axiale selon l'axe (x) du flux du gaz ou du mélange de gaz à l'issue de l'étape (b), tend vers zéro.
4. Procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 3, dans lequel l'étape (d) de piegeage des particules est mise en œuvre sur une surface-cible capable de les fixer.
5. Variante du procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 4, comprenant en outre une étape (f) de comptage des particules piégées lors de l'étape (d).
6. Variante telle que définie à la revendication 5, dans laquelle l'étape (f) consiste en une étape (fi) de cultures des particules viables et reviviscentes piégées à l'issue de l'étape (d), suivie d'une étape (fg. de comptage des unités formant colonies.
7. Procédé de détermination de la qualité microbiologique d'un gaz ou d'un mélange de gaz sous pression, par mise en œuvre de la variante du procédé de séparation, telle que décrite à l'une des revendications 5 ou 6.
8. Application du procédé et sa variante telle que définie à l'une des revendications 1 à 7, pour analyser un gaz, comprimé ou liquéfié, sous pression.
9. Application telle que définie à la revendication 8, dans laquelle le gaz analysé provient de bouteilles, de cadres, de réservoirs de stockage, primaires ou secondaires, d'un réseau d'alimentation en gaz, primaire ou secondaire, et plus particulièrement, soit d'un réseau d'alimentation en gaz médicaux tels qu'ils se trouvent dans les établissements de soins, comme les hôpitaux, les dispensaires ou les cliniques, soit d'un réseau de distribution de gaz tel qu'il y en a dans les usines de production de médicaments ou dans les usines de l'industrie agroali- mentaire.
10. Dispositif (D), apte à la mise en œuvre du procédé et de sa variante tels que définis à l'une des revendications 1 6, comprenant :
- Un élément (D^ dans lequel le flux de gaz subit successivement les étapes (a) et (b), - Un élément (D2) constituant la cible sur laquelle les particules viables ou reviviscentes sont piégées selon l'étape (d) et,
- Un élément (D3), enveloppant en tout ou partie l'élément (Di), permettant de canaliser l'écoulement du gaz ou du mélange de gaz en sortie de l'élément (Di) vers un ou plusieurs orifices de sortie du dispositif (D), de façon à ce qu'il n'y ait aucun contact entre l'atmosphère environnante et la cible.
11. Dispositif (D) tel que défini à la revendication 10, comprenant en outre un élément (D0) de connexion, capable de s'adapter à tout dispositif de délivrance de gaz comprimé ou liquéfié.
12. Dispositif (D) tel que défini à la revendication 11 , comprenant en outre un manodétendeur placé entre l'élément de connexion (Do) et l'élément (Di).
13. Procédé de détermination de l'aptitude d'un dispositif capable de piéger des particules viables et reviviscentes, à déterminer la qualité microbiologique d'un gaz ou d'un mélange de gaz sous pression par rapport à un dispositif de référence tel que défini à l'une des revendications 10 à 12, comprenant l'injection d'une quantité déterminée d'un ou plusieurs microorganismes connus dans le flux en amont du dispositif à qualifier et la quantification des microorganismes piégés par ce dernier dispositif.
14. Procédé tel que défini à la revendication 13 mis en œuvre au moyen d'un banc d'étalonnage comprenant :
(1) un nébuliseur fonctionnant selon le principe du venturi, comprenant :
(i) une chambre cylindrique d'axe de symétrie (y), à laquelle sont connectés une ligne d'alimentation en gaz nébuliseur et une ligne d'alimentation en solution contenant la quantité prédéterminée de microorganismes dans un gaz nébuliseur ;
(ii) une tête de pulvérisation connectée à ladite chambre, de forme tronconique d'axe de symétrie (y), comportant en sa petite base, un orifice de pulvérisation et (iii) un tube cylindrique (y), de diamètre inférieur au diamètre dudit orifice de pulvérisation, dont l'une des extrémités est insérée dans ledit orifice, de façon coaxiale à la tête de pulvérisation ;
(2) un carter enveloppant complètement ledit nébuliseur, auquel sont connectés une ligne d'alimentation en gaz vecteur et une ligne de distribution du flux de gaz issu de l'ensemble nébuliseur-carter, contenant les microorganismes vers le dispositif dont on souhaite déterminer son aptitude à les piéger, dans lequel le nébuliseur s'adapte de façon coaxiale à ladite ligne de distribution.
15. Nébuliseur apte à être mis en œuvre dans le procédé tel que défini à l'une des revendications 13 ou 14 : (i) une chambre cylindrique d'axe de symétrie (y), à laquelle sont connectés, une ligne d'alimentation en gaz nébuliseur et une ligne d'alimentation en solution contenant la quantité prédéterminée de microorganismes dans un gaz nébuliseur ; (ii) une tête de pulvérisation connectée à ladite chambre, de forme tronconique d'axe de symétrie (y), comportant en sa petite base, un orifice de pulvérisation et
(iii) un tube capillaire cylindrique (y), de diamètre inférieur au diamètre dudit orifice de pulvérisation, dont l'une des extrémités est insérée dans ledit orifice de façon coaxiale à la tête de pulvérisation.
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