EP1507584A1 - Microreacteur, son procede de preparation, et procede pour realiser une reaction biochimique ou biologique - Google Patents

Microreacteur, son procede de preparation, et procede pour realiser une reaction biochimique ou biologique

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EP1507584A1
EP1507584A1 EP03752826A EP03752826A EP1507584A1 EP 1507584 A1 EP1507584 A1 EP 1507584A1 EP 03752826 A EP03752826 A EP 03752826A EP 03752826 A EP03752826 A EP 03752826A EP 1507584 A1 EP1507584 A1 EP 1507584A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microreactor
reaction
substrate
fluid
enzyme
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03752826A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Combette
Olivier Constantin
Françoise Vinet
Gilles Marchand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1507584A1 publication Critical patent/EP1507584A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0093—Microreactors, e.g. miniaturised or microfabricated reactors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G01N30/6095—Micromachined or nanomachined, e.g. micro- or nanosize

Definitions

  • MICROREACTOR PROCESS FOR PREPARING THE SAME, AND METHOD FOR PERFORMING A BIOCHEMICAL REACTION
  • the present invention relates to a microreactor.
  • the invention also relates to a process for preparing, manufacturing such a microreactor.
  • the invention finally relates to a process for carrying out a biochemical or biological reaction which implements said microreactor.
  • the field of the invention can be defined as that of miniaturized systems or microsystems which are used essentially for chemical analysis and synthesis.
  • the preferred fields of chemical microreactors are liquid and gas phase reactions including homogeneous and heterogeneous catalysis, catalytic oxidation, heterocyclic synthesis and photochemical reactions.
  • document [3] relates to the manufacture of nanocolumns for liquid chromatography by micromachining techniques.
  • microcolumns comprise “monoliths”, preferably hexagonal supporting the stationary phase, and are provided with inlet and outlet channels having a particular architecture with a network of channels which ensures that the stream of liquid entering the column is divided into two, repeatedly before it reaches the head of the column.
  • the stationary phase consists of poly (styrene sulfate) electrostatically bonded.
  • the poly (styrene sulfate) is absorbed from a solution on the surface of the channels after silylation of the walls of the channels, using (gamma-aminopropyl) -trimethoxysilane.
  • the surfaces of the monoliths can be treated to provide interactions between these surfaces and a sample which crosses the column of separation, in order to separate the constituents of the sample.
  • coatings which can be provided with the monoliths, mention may be made, for example, of antibody coatings, cationic or anionic coatings, chelating agents, organic coatings, such as complex sugars and heparin, gels and reverse phase coatings, such as C18.
  • the digestion rate can be optimized by confining the digestion reactions in smaller volumes.
  • the volumes available in integrated devices on chips allow to use very small quantities of samples and this in very small reaction zones, in order to increase the digestion rates. It has recently been shown that it is possible to digest proteins inside wells made in microdevices. As we have already seen, digestion being carried out in solution leads to self-digestion of the proteins which can interfere with an analysis by mass spectrometry. This phenomenon is all the more important when it is desired to improve the speed of digestion by increasing the concentrations of proteolytic species.
  • microreactor which, while limiting the problems of autolysis, provides high speeds and either reliable, easy work, unlike microreactors using functionalized beads.
  • the object of the present invention is therefore to provide a microreactor which meets, among other things, these needs.
  • the object of the present invention is also to provide a microreactor which does not have the drawbacks, limitations, defects and disadvantages of the microreactors of the prior art.
  • a microreactor comprising an inlet or feed channel, an inlet or feed area by a stream of fluid, an active area comprising means giving it a high surface area to volume ratio, an outlet area and an outlet or discharge channel, said areas and channels are in fluid communication, characterized in that the active area is a reaction area comprising at least one compound capable of producing a biological or biochemical reaction with at least one component of said fluid stream, said compound being fixed on the surfaces of said reaction zone.
  • said inlet zone comprises means for communicating a constant flow speed to said fluid stream, for uniformly distributing the fluid stream over the entire section of said reaction area and to increase the ratio surface / volume as the fluid current progresses towards the active zone which is a reaction zone; said at least one compound capable of producing a biological or biochemical reaction with at least one constituent of said fluid stream is fixed on the surfaces of said entry zones, active zone which is a reaction zone, and exit zone; said outlet zone comprises means for collecting the flow of fluid from the active zone which is a reaction zone comprising the products resulting from said biological or biochemical reaction, and for reducing the surface area to volume ratio as the progression of the fluid stream from the active area which is a reaction area towards said outlet channel and for discharging said fluid stream.
  • microreactor according to the invention is distinguished, first of all, fundamentally from the device described, for example, in patent US-A-6,156,273, which is, fundamentally, a separation device obeying the conventional rules of chromatography and not a device for carrying out a reaction, that is to say a reactor.
  • the zone which can be defined as an active zone makes it possible to carry out chromatography, without reaction, while in the device according to the invention the active zone is a reaction zone because it there are attached compounds capable of producing a reaction.
  • the invention relates not to a separation device, but to a reactor, which means that the compounds fixed on the surfaces of the various zones of the device, namely: of the microreactor, according to the invention, produce a reaction biological or biochemical with at least one constituent of the fluid stream, that this constituent is transformed and that new products are created, then collected.
  • a sample which circulates in the reactor will, according to the invention, interact with the compounds capable of reacting, fixed on the surfaces of the reactor and thus create products resulting from this reaction, on the contrary, again from the device according to document US-A-6,156,273, where the compounds, the coating fixed to the walls simply favor the more or less prolonged attachment of the constituents of the sample, but do not generate new products.
  • the device according to the invention is also fundamentally different from the devices described in particular in document [9], in which the reaction between the compound, capable of producing a biological or biochemical reaction, and at least one constituent of the fluid stream, occurs in liquid phase, in solution, said compound not being absolutely immobilized, fixed to the surfaces of the device, as in the microreactor, according to the invention.
  • the concentrations of the species immobilized on the surface can be greatly increased without the appearance of parasitic reactions, such as, for example, autolysis in the case of a digestion enzyme.
  • the microreactor according to the invention has the advantage of being more reliable, simpler to prepare, and of having, likewise, a reliable and simple operation.
  • the device according to the invention is qualified as a microreactor, this denomination is commonly used in this field of technology and is perfectly clear to those skilled in the art.
  • the largest dimension of the microreactor according to the invention which is, for example, its length or height, is generally from 10 mm to 30 mm.
  • the compound capable of producing a biological or biochemical reaction, can be any compound corresponding to such a definition, but it is generally chosen from enzymes.
  • it can be any compound capable of interacting with a constituent, or target molecule, present in the stream of fluid which passes through the microreactor, and of transforming said constituent by a molecular biology reaction to obtain , from this constituent, a new product.
  • It may, for example, be an enzyme / substrate type interaction and reaction, in which said compound is an enzyme and said constituent a substrate for said enzyme.
  • this compound when it is an enzyme, it can be chosen from the class of oxidoreductases, the class of transferases, the class hydrolases, the class of lyases, the class of isomerases, or the class of ligases or synthetases.
  • It may for example be an enzyme with lytic activity, such as a protease, a nuclease, a lipase, a glycolase, a kinase, etc. ; an enzyme exhibiting a modification or action activity on nucleic acids, such as DNA or RNA polymerase, primase, DNA ligase, nuclease, reverse transcriptase, kinase, phosphatase, phosphorylase, restriction endonuclease, topoisomerase, transferase, etc.
  • an enzyme with lytic activity such as a protease, a nuclease, a lipase, a glycolase, a kinase, etc.
  • proteases mention may be made, for example, of endopeptidases such as pepsin, trypsin, chymotrypsin, cathepsins A, B and C; and exopeptidases such as carbopeptidases, aminopeptidases, and dipeptidases.
  • endopeptidases such as pepsin, trypsin, chymotrypsin, cathepsins A, B and C
  • exopeptidases such as carbopeptidases, aminopeptidases, and dipeptidases.
  • the enzyme is trypsin and the substrate a peptide or a protein.
  • the micro-reactor when the compound which is capable of interacting with the constituent of the fluid is an enzyme, the micro-reactor can be called an enzyme microreactor.
  • the enzyme in the case where the enzyme is trypsin, it can be called a trypsin microreactor; or also, for example in the case where the enzyme is a polymerase, polymerase microreactor.
  • the compound capable of producing a biological or biochemical reaction is attached to said surfaces, for example, by covalent coupling, by interactions involving ligands, or by any other method for immobilizing this compound on the surface.
  • the microreactor according to the invention can have any shape, but it advantageously has a substantially elongated shape, the three zones described above being defined on a substantially planar substrate, the stream of fluid flowing substantially along the longitudinal axis. of said reactor.
  • the means of the reaction zone which give it a high surface area to volume ratio, consist of studs - or monoliths, as they are designated in the prior art - comprising a base on said support connected to a apex by a wall substantially perpendicular to the plane of said substrate, said studs being regularly spaced in a two-dimensional network and defining between their walls channels interconnected and substantially parallel to the longitudinal axis of the microreactor and axis of flow of the fluid stream.
  • Said studs can have any shape, but, advantageously, their bases and their vertices will have a shape chosen from discs, ellipses, and polygons, preferably regular, such as squares, diamonds, hexagons, etc.
  • the preferred shape for the base of the studs or monoliths is that of a regular hexagon or that of a square.
  • the size of these studs is that, for example, of their base and / or top, for example, in shape of a regular square or hexagon and it is defined by the fact that this base or vertex, preferably in the shape of a regular square or hexagon, can be inscribed in a circle with a radius of 1 to 20 ⁇ m , preferably from 2 to 10 ⁇ m, for example from 5 ⁇ m.
  • said studs are arranged in rows whose axis is substantially perpendicular to the longitudinal axis of the microreactor or axis of flow of the fluid stream, the studs belonging to two successive rows being arranged in staggered rows, that is to say say directly shifted.
  • the spacing between the axes of two successive rows is generally of. 10 to 30 ⁇ m, for example 12 ⁇ m and the spacing between the centers of the bases of two studs in the same row is 10 to 30 ⁇ m, for example 14 ⁇ m.
  • different dimensions may be required by the applications and / or the nature of the products used.
  • the means of the inlet zone for communicating a constant flow speed to the fluid stream, for uniformly distributing the fluid stream over the entire section of the reaction area and for increasing the surface to volume ratio as the flow of fluid progresses towards the reaction zone, are constituted by deflectors having a base on the support connected to a vertex by a wall substantially perpendicular to the plane of said substrate, said deflectors dividing the inlet channel into C channels, this division being repeated n times, so that the number of channels at the inlet of the reaction zone is equal to C n , n and C being whole numbers, and the total section of the channels at each division being constant and equal to the section of the input channel.
  • C 2 or 3
  • n is an integer from 2 to 10.
  • the number n is only limited by the chosen dimension of the microreactor.
  • outlet - said means being identical to the means provided in the entry zone - are constituted by deflectors comprising a base on the support connected to a top by a wall substantially perpendicular to the plane of said substrate, said deflectors bringing together the channels of the zone reaction by dividing their number by S, this division being repeated m times to form a single channel or output channel.
  • the number m has the same limits as the number n.
  • the microreactor further comprises a cover or cover covering said zones and said inlet and outlet channels.
  • the cover or cover is optionally provided with inlet and / or outlet openings.
  • the invention further relates to a set of microreactors, as described above, formed on a substrate and comprising from 2 to 50 or more microreactors depending on the size of each of these microreactors.
  • the microreactors of said assembly differ from each other by the shape of the pads and / or the size of the pads and / or their distribution (for example, spacing of the pads and of the rows) and / or their length.
  • the invention also relates to a system formed on a substrate and comprising at least one microreactor, as defined above, a fluid supply tank, connected to said inlet or supply channel and a fluid outlet tank connected said output channel.
  • the fluid supply tank is provided on the substrate on which the microreactor is formed, for example, etched in the substrate, and the inlet channel is also provided on the substrate, for example, etched in the substrate.
  • the fluid supply reservoir is placed outside the substrate on which the microreactor is formed and the inlet channel - which connects the reservoir to the microreactor - is in the form of a capillary tube. The same arrangements can be provided for the fluid outlet tank.
  • the microreactor, the system or the assembly, described above can be connected to an analysis device, such as a mass spectrometer, preferably by means of a capillary leading to an "electrospray” , or has a capillary electrophoresis device.
  • an analysis device such as a mass spectrometer, preferably by means of a capillary leading to an "electrospray” , or has a capillary electrophoresis device.
  • the invention also relates to a method for preparing a microreactor, as described above, said method comprising the following successive steps: etching of the three zones of the microreactor and, optionally, inlet and outlet channels, in a substrate substantially planar; covering, closing of the microreactor by a cover or cover; fixing of a compound capable of producing a biological or chemical reactor on the surface of the reaction zone and possibly on the other surfaces of the microreactor.
  • the etching is carried out by an isotropic or anisotropic dry etching process.
  • the substrate is made of a material chosen from silica, oxidized silicon, silicon, polymers, plastics, and resins, such as silicones, epoxy resins and elastomers.
  • said attachment is achieved by covalent coupling or by interactions involving ligands.
  • the fixing is carried out by the following steps: rehydration in basic medium to obtain silanol sites; silanization of the substrate with a reactive epoxidized silane, such as
  • the invention finally relates to a method for carrying out a biochemical or biological reaction, in which a fluid stream is circulated in the microreactor, as described above, so that at least one component of said fluid stream reacts with the compound capable of produce a biological or biochemical reaction, and a stream of fluid comprising the product (s) of said reaction is collected at the outlet of the microreactor.
  • said reaction is an enzyme / substrate type reaction
  • said compound capable of producing a biological reaction or biochemical is an enzyme
  • said constituent of said fluid stream is a substrate of the enzyme
  • the product (s) of the reaction are the product (s) resulting from the reaction of said enzyme with said substrate.
  • the enzyme can be chosen from all the enzymes, as defined above.
  • said reaction is an enzymatic digestion reaction with a protease
  • said compound capable of producing a biological or biochemical reaction is a protease
  • said constituents of the fluid stream are peptides or proteins and the products of the reaction are segments peptide.
  • the enzyme is trypsin.
  • FIG. 1 is a side view in section showing a general diagram of a microreactor according to the invention
  • FIG. 2 is a graph which gives the surface / volume ratio (S / V) (in arbitrary units) for each stage (E) of the input of a microreactor, according to the invention
  • Figure 3 is a top view of the entrance and exit of a microreactor, according to the invention, produced on a flat substrate
  • Figure 4 is a top view showing details of the inlet (and outlet) and the edge of a microreactor, according to the invention, and showing the arrangement and the drawings of studs of a microreactor, according to l invention, these studs having a base and a top in the shape of a regular hexagon
  • FIG. 5A to 5F show the manufacture of a microreactor, according to the invention, in a silicon substrate, essentially implementing a photolithography process
  • Figures 6 and 7 are photographs taken with a scanning electron microscope of a manufactured reactor according to the invention.
  • the reference mark represents 200 ⁇ m
  • the reference represents 50 ⁇ m.
  • the microreactor according to the invention comprises an inlet zone (1), a reaction zone (2) forming the "reactor" proper, and, finally, a exit area (3).
  • the microreactor shown schematically in FIG. 1, has an elongated shape: it is the preferred shape of the reactor with a length, for example, of 10 to 30 mm, while its small dimension or width or diameter, is, by example, from 0.5 mm to 1 mm, which justifies the term "microreactor". These dimensions are given by way of example and can be widely modified as required.
  • the microreactor according to the invention may have, for example, the configuration of the column of document US-A-6,156,273, cited above, but it is recalled that it is fundamentally distinguished therefrom by the fact that it comprises a compound fixed on its surfaces allowing a reaction, that they are therefore a reactor and not a separation device.
  • the entry zone (1) generally consists of a microchannel, followed by a system of baffles arranged in the longitudinal direction of the microreactor.
  • This system of baffles or deflectors - ** makes it possible to impose, for a fixed flow rate of the fluid current upstream of the microreactor, a constant flow speed throughout the network of channels through the baffles, before entering the reactor. main.
  • the network of channels also promotes a distribution, a homogeneous distribution of the fluid in order to disperse it over the entire width of the reaction zone.
  • the arrangement for example, dichotomous of the baffles or deflectors, makes it possible to increase the surface / volume ratio as the fluid current advances towards the heart of the microreactor.
  • Figure 2 shows the surface area to volume ratio (S / V) for each stage the input of a microreactor according to the invention. It can be seen that the closer we get to the start of the reaction zone (stage 8), the higher the surface / volume ratio.
  • the increase in the surface-to-volume ratio progressively improves the yield of the biological or biochemical reaction, until it reaches its optimum in the reactor core, that is to say in the zone, known as the reaction zone. .
  • the increase in surface is preferably provided by the presence of substantially vertical studs on a substrate, these studs can have various geometries and also various sizes and steps, as described below, in relation to the figure. 3.
  • the length of the microreactor is also variable.
  • the length is generally fixed, in order to be able to optimize the efficiency of the reactor, for a minimum bulk.
  • the exit area of the microreactor (3) is preferably identical in shape to the inlet, this part makes it possible, in particular, to bring together the various products resulting from the biological reaction which has taken place in the microreactor, that is to say - essentially say in the reaction zone (2) before using them later, for example, to analyze them.
  • the same substrate for example the same wafer (“wafer") to integrate several microreactors, that is to say to form a set of microreactors on the same substrate.
  • the microreactors located on the same substrate will be different, the differences relating, for example, to the geometry of the pads, making it possible to increase the surface area to volume ratio and / or the spacing between pads and / or the difference between rows and / or the length of the reactor.
  • the reactor inlet is only modified according to the size of the adopted studs.
  • Figure 3 is a top view of the input of the microreactor according to the invention, produced on a flat substrate.
  • microreactor is fed by a “microchannel” channel (31) of width, for example, 100 ⁇ m, which ends in a channel or distributor (32) of width, for example, 400 ⁇ m, then, finally, in the first stage ( 33) of the actual entry area, which has a width of, for example, 640 ⁇ m.
  • a “microchannel” channel (31) of width for example, 100 ⁇ m
  • a channel or distributor (32) of width for example, 400 ⁇ m
  • the channel forming the first stage is divided for the first time into two channels (34) and (35) whose widths are equal, namely: at 320 ⁇ m, and whose sum of widths is equal to that of the single channel (33 ).
  • each of the channels of a stage being divided into two channels of equal width and the total width of the channels of each stage being constant and always equal to the width of the channel of the first floor
  • the channels (36) are sixty-four and each have a width, for example of 10 ⁇ m.
  • the dimensions in microns of the microreactor inlet zone, illustrated in FIG. 1, have been indicated in Table I below, these dimensions are given only by way of example:
  • FIG. 3 can represent both the input and the output of a microreactor according to the invention.
  • the channel (31) then located at the bottom of the figure, represents the outlet or evacuation channel.
  • This figure shows the channels (36), already described above, which terminate in the reaction zone, proper, (41) of the microreactor according to the invention.
  • the studs have a base and a top in the shape of a regular hexagon, each of these hexagons being inscribed in a circle of radius A, which is generally from 1 to 10 ⁇ m, for example 5 ⁇ m (at example).
  • the studs of the two successive rows are staggered and form, between them, parallel channels in the direction of flow 46, which divide into channels 47, which then meet in channels 48 again parallel to the direction of flow.
  • the centers of the studs for example hexagons are spaced 10 to 30 ⁇ m apart, for example, 14 ⁇ m (B) and the axes of two rows successive are generally spaced 10 to 30 ⁇ m, for example 12 ⁇ m (C).
  • edge of the reaction zone resumes the external shape of the studs in order to maintain a constant channel section and to avoid the dispersion of the fluid flow speed between the edges and the center of the reactor.
  • the reaction zone ensures practically all the biological function of the microreactor.
  • the increase in surface area is precisely brought about by the presence of the studs which can, in addition to the hexagonal geometry shown in the figure, have other geometries, for example the studs can be in the form of a diamond, ellipse, disc, and also have a different size and pitch (difference between two studs), for example from 10 to 30 ⁇ m.
  • a section is used either hexagonal, as in FIG. 4, or square, which fits into a circle of variable diameter, for example from 2 to 20 ⁇ m, this in order to obtain a compromise between a maximum surface, defining a network of interconnected microchannels practically parallel to the longitudinal axis of the microreactor (the presence of channels perpendicular to the longitudinal axis would induce product stagnation and would decrease the efficiency of the microreactor) and minimize the complexity of the technological implementation.
  • the exit area is generally symmetrical to the entry area.
  • the microreactor according to the invention can be manufactured for any suitable process, but in the case where it is produced on, in a substantially planar substrate, the microreactor can be, for example, produced by anisotropic (or isotropic) dry etching in silicon, using, for example, a process of the type DRIE ICP (Deep Reactive Ion Etching / Inductively Coupled Plasma, in English).
  • DRIE ICP Deep Reactive Ion Etching / Inductively Coupled Plasma
  • the patterns - by pattern we mean the supply and discharge channels, the inlet, reaction, outlet zones, formed, for example, by the deflectors and studs - are then defined in silicon by a mask of etching, for example by a photosensitive resin, commonly used in microelectronics, or, for example, by silica, this mask being of sufficient thickness to allow the etching of the patterns in silicon, at the thickness chosen by the operator, for example, from 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the patterns can be defined in this etching mask, for example, by a lithography process conventionally encountered in microelectronics, followed, for example, in the case of silica, by a reactive ion etching of this material.
  • the reactors can also be, for example, produced by anisotropic dry etching in silica, the protective mask chosen then being able to be, for example, silicon.
  • the microreactor can also be produced in other materials, for example, in polymers, such as epoxy resins, elastomers, plastics.
  • microtechnologies makes it possible to manufacture, using anisotropic or isotropic etching of structures with complex geometries and having very large surface area ratios, without the drawbacks of microbead linings.
  • the reactor can then be covered, for example, by a PD S (polydimethylsiloxane) plate, with or without inlet and / or outlet orifices, after treatment of said cover and of the reactor with an oxygen plasma, such as described in the literature.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PDMS is known to have spontaneous adhesion properties on most solid supports.
  • the reactor can also, for example, be hooded by molecular sealing of a silica plate or a glass plate, with or without inlet and / or outlet orifices, after cleaning and chemical preparation of the two substrates hydroxyl
  • silanol SiOH
  • the microreactor can be, for example, covered by anodic sealing of a glass plate, with or without inlet and / or outlet orifices.
  • the microreactor can be, for example, covered by gluing of a polymer plate chosen by the user, with or without inlet and / or outlet orifices, using, for example, an adhesive deposition process by screen printing.
  • This type of bonding consists of three main stages: screen printing, which consists of applying glue only to certain areas of the substrate, bonding which consists of bringing the substrate coated locally with glue into contact with the cover, and, finally, the heating which induces the polymerization of the adhesive.
  • the polymerization can be carried out photochemically if the adhesive is polymerizable under ON.
  • microreactor can be, for example, covered by direct silicon / silicon sealing
  • the fixation of the constituent endowed with the biological or biochemical function in the microreactor can be carried out according to different methods: - by a covalent coupling connecting the molecule to be fixed to the surface of the microreactor;
  • an enzyme such as trypsin
  • its fixation on a silica substrate can be done by successive stages of rehydration, silanization, for example with a reactive epoxidized silane, hydrolysis, oxidation and, finally, immobilization, fixation of the enzyme via -NH 2 bonds, carried by the lysine groups of trypsin.
  • the following diagram 1 illustrates the steps and the operating conditions which can be used for the immobilization of an enzyme, such as trypsin.
  • trypsin carrying a biotin function (biotinylated trypsin, XI-B type SIGMA ALDRICH ®) was attached to circular surfaces, of the order of 1 mm in diameter. After a labeling step with streptavidin, carrying a fluorophore Cy 3 , and an excitation of 550 nm, a fluorescence image is obtained at 580 nm, whose intensity is 225UA.
  • the signal / noise ratio (trypsin / substrate) is between 35 and 40.
  • the current of liquid one of which is passed through a suitable device, such as a syringe pump and its associated syringe, or the like.
  • constituents can react with the compound attached to the walls of the microreactor.
  • the flow rate is a flow rate, preferably constant, ensuring a residence time inside the microreactor of 1 to 15 minutes, for example depending on the kinetics of the reaction in the microreactor.
  • the reaction products are sent to an analysis device, such as a mass spectrometer, or to another use, for example capillary electrophoresis.
  • This example illustrates the manufacture of a silicon microreactor, with reference to Figure 5 attached.
  • a layer of photosensitive resin 52 of type SHIPLEY S 1813 is deposited on a substrate (51) of four inches (10, 16 cm), type ⁇ 100> and thickness 525 ⁇ m by spin-coating (spinner) .
  • lithography is carried out using an ON beam (53) through a mask (54) provided with or n patterns defining the geometry of the microreactors; the exposure time is 10 seconds.
  • the areas not protected by the resin are etched using a deep etching device of the DRIE ICI STS MULTIPLE type.
  • the next step is to cut the resin mask by HN0 3 smoking without ultrasound for 5 minutes.
  • the sides of the engraving are then cleaned by oxidation in a tube furnace under oxygen for 50 minutes at 1000 ° C. and chemical deoxidation with HF for a few seconds.
  • a thick oxidation of the patterns is then carried out to a thickness of 3 ⁇ m (55) in a tube oven under steam at 1,00 ° C. for 18 hours and 50 minutes.
  • Each microreactor is then cut and separated from the afer.
  • a polydimethylsiloxane cover is then used to close the microreactor.
  • the cover and the microreactor are sealed after treatment with oxygen plasma of the two surfaces to be contacted (TEGAL device, plasma 0 2 , pressure 100 mTorr, activation time 30 seconds).
  • the connection of the microreactor with any device for circulating fluid is carried out via capillaries inserted in the inlet and outlet channels of the microreactor.
  • the microreactor used in the digestion example has a hexagonal stud geometry with studs with a diameter of 10 microns, separated from one another by 14 microns on an axis perpendicular to the direction of the flow of liquid and by 12 microns on a parallel axis. to the flow of liquid.
  • the depth of the microreactor, defined as the average height of the studs, is 50 microns.
  • the attachment is carried out, the immobilization of the trypsin on the surfaces of the microreactor manufactured in Example 1 to obtain a “functionalized” microreactor according to the invention. Then, the immobilization of the trypsin is checked by fluorescence.
  • the trypsin used is a type of trypsin I, bovine pancreas exit, marketed by Sigma ALORICA Company ® (ref. T 8003).
  • the reaction mechanism is composed of several stages, namely: rehydration in basic medium allowing silanol sites to be obtained, silanization of the substrate with the
  • the solution containing the enzyme to be immobilized is introduced into the microreactor at a fixed rate. Once the microreactor is filled, its ends are sealed with parafilm. The immobilization reaction is then carried out statically.
  • biotinylated trypsin (biotinylated trypsin, type XI-B of SIGMA ALDRICH ® in the form of a solution of trypsin 2.5 mg / ml, Na 2 HP0 4 to 0 , 1 M, 0.05 M NaCNBH 3 ), was immobilized on the internal surface of the microreactor having columns 10 ⁇ m in diameter, spaced 5 ⁇ m apart, and with a height equal to 50 ⁇ m, then revealed with a streptavidin solution Cy 3 .
  • the biotin / streptavidin-Cy 3 pair is revealed by fluorescence at 570 nm. Observation with an epi-fluorescence microscope makes it possible to visualize the presence of trypsin on the entire surface of the microcolumns and on the entire trypsin reactor.
  • a BSA digestion is carried out in the microreactor provided with an immobilized enzyme, according to the invention, prepared in Example 3.
  • the inlet reservoir of the microreactor is filled with a solution of “Bovine Serum Albumin (BSA)” at 2 mg / ml with 0.05% NaN 3 at an average flow rate. of the order of 5 ⁇ l / min.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the residence time in the microreactor of the protein to be digested is of the order of 5 minutes.
  • the volume infused through the microreactor is large enough to allow correct analysis by the MALDI_TOF type mass spectrometer.
  • the spectrum obtained shows peptide segments resulting from the digestion of BSA.

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Abstract

Microréacteur comprenant un canal d'entrée ou d'alimentation, une zone d'entrée (1) ou d'alimentation par un courant de fluide, une zone de réaction (2), une zone de sortie (3) et un canal de sortie ou d'évacuation, lesdites zones (1, 2, 3) et canaux (46, 48) se trouvant en communication fluidique et au moins un composé telle qu'une enzyme susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique avec au moins un constituant dudit courant de fluide étant fixé sur les surfaces desdites zones d'entrée (1), zone de réaction (2), et zone de sortie (3).

Description

MICROREACTEUR, SON PROCEDE DE PREPARATION, ET PROCEDE POUR REALISER UNE REACTION BIOCHIMIQUE
OU BIOLOGIQUE
DESCRIPTION
La présente invention a trait à un microréacteur.
L'invention concerne également un procédé pour préparer, fabriquer un tel microréacteur.
L'invention est enfin relative à un procédé pour réaliser une réaction biochimique ou biologique qui met en œuvre ledit microréacteur.
Le domaine de l'invention peut être défini comme celui des systèmes miniaturisés ou microsystèmes qui sont utilisés essentiellement pour l'analyse chimique et la synthèse.
Les domaines de prédilection des microréacteurs chimiques sont les réactions en phase liquide et gazeuse incluant la catalyse homogène et hétérogène, l'oxydation catalytique, la synthèse hêtérocyclique et les réactions photochimiques.
En particulier, ces procédés ont montré l'intérêt qu'il y a à utiliser la technologie des microréacteurs pour la chimie en solution et les bioapplications biologiques.
Des exemples de microsystèmes d'analyse ou de microréacteurs de synthèse sont plus précisément décrits dans les documents [1] a [9] . En particulier, le document [3] concerne la fabrication de nanocolonnes pour la chromatographie liquide par des techniques de microusinage.
Les microcolonnes comportent des « monolithes », de préférence hexagonaux supportant la phase stationnaire, et sont pourvues de canaux d'entrée et de sortie présentant une architecture particulière avec un réseau de canaux qui fait que le courant de liquide pénétrant dans la colonne est partagé en deux, de manière répétée avant qu'il n'atteigne la tête de la colonne .
Le nombre total de canaux (C) de la colonne chromatographique, proprement dite, qui peut être alimenté est, par exemple, de C = 2n, où n est le nombre de fois où le courant liquide est partagé.
La phase stationnaire est constituée de poly(sulfate de styrène) électrostatiquement lié.
Le poly (styrène sulfate) est absorbé à partir d'une solution sur la surface des canaux après silylation des parois des canaux, en utilisant du (gamma-aminopropyl) -trimêthoxysilane .
A l'instar du document [3], le brevet US-A-6 156 273 décrit une colonne de séparation par chromatographie, électrochromatographie et électrophorèse, qui comporte de multiple structures supports monolithiques voisines, qui définissent des canaux interconnectés .
Les surfaces des monolithes peuvent être traitées pour fournir des interactions entre ces surfaces et un échantillon qui traverse la colonne de séparation, afin d'effectuer une séparation des constituants de l'échantillon.
Parmi les revêtements dont peuvent être pourvus les monolithes, on peut citer, par exemple, les revêtements d'anticorps, les revêtements cationiques ou anioniques, les chélatants, les revêtements organiques, tels que les sucres complexes et l'héparine, les gels et les revêtements en phase inverse, tels que le C18.
Dans ce document, il ne se produit aucune réaction dans la colonne, et aucun nouveau produit provenant de la réaction du revêtement se trouvant sur les surfaces des monolithes avec les constituants de l'échantillon traité n'est généré.
On est en présence dans ce document d'un simple processus chromatographique courant avec rétention plus ou moins importante des -divers constituants de l'échantillon traversant la colonne en fonction de leur affinité pour le revêtement.
Dans le document [9], l'enzyme et le produit à traiter, à digérer réagissant en phase liquide, en solution, dans la masse du fluide, les inconvénients d'une telle manière d'opérer (par rapport à l'invention, où l'enzyme est fixée sur la paroi) sont les suivants : réactions parasites comme, par exemple, l'autolyse dans le cas d'une enzyme de digestion et, par voie de conséquence, la limitation des concentrations .
Le taux de digestion peut être optimisé en confinant les réactions de digestion dans des volumes plus petits. Les volumes disponibles dans des dispositifs intégrés sur puces permettent d'utiliser des quantités très faibles d'échantillons et ceci dans des zones de réaction très petites, afin d'augmenter les taux de digestion. Il a été récemment montré qu'il était possible de digérer des protéines à l'intérieur de puits réalisés dans des microdispositifs. Comme on l'a déjà vu, la digestion étant réalisée en solution conduit à une autodigestion des protéines qui peuvent interférer avec une analyse par spectrométrie de masse. Ce phénomène est d'autant plus important, lorsqu'on désire améliorer la vitesse de digestion en augmentant les concentrations en espèces protéolytiques.
L'utilisation de billes fonctionnalisées permet de réduire considérablement cette autolyse, augmente également la stabilité de l'enzyme, et fournit des vitesses de digestion plus élevées, puisque la quantité d'enzyme de digestion peut -être considérablement augmentée.
Cependant, l'opération de remplissage des microcanaux, à l'aide de billes fonctionnalisées, demeure une opération délicate et peu fiable.
Il ressort de ce qui précède qu'il existe un besoin pour un microreacteur qui permette de réaliser des réactions chimiques, et/ou biologiques avec un rendement très élevé, avec une quantité de réactif, tel qu'une enzyme, faible et à une vitesse également élevée .
Par exemple, dans le cas de la digestion enzymatique, il existe un besoin pour un microréacteur qui, tout en limitant les problèmes d' autolyse, fournisse des vitesses élevées et soit d'une mise en œuvre fiable, facile, au contraire des microréacteurs utilisant des billes fonctionnalisées.
Le but de la présente invention est donc de fournir un microréacteur qui réponde, entre autres, à ces besoins.
Le but de la présente invention est encore de fournir un microréacteur qui ne présente pas les inconvénients, limitations, défauts et désavantages des microréacteurs de l'art antérieur. Ce but et d'autres encore sont atteints, conformément à l'invention par un microréacteur comprenant un canal d'entrée ou d'alimentation, une zone d'entrée ou d'alimentation par un courant de fluide, une zone active comprenant des moyens lui conférant un rapport surface sur volume élevé, une zone de sortie et un canal de sortie ou d'évacuation, lesdites zones et canaux se trouvent en communication fluidique, caractérisé en ce que la zone active est une zone de réaction comportant au moins un composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique avec au moins un constituant dudit courant de fluide, ledit composé étant fixé sur les surfaces de ladite zone de réaction.
De manière avantageuse dans le microréacteur selon l'invention : ladite zone d'entrée comprend des moyens pour communiquer audit courant de fluide une vitesse d'écoulement constante, pour répartir de manière homogène le courant de fluide sur toute la section de ladite zone de réaction et pour augmenter le rapport surface/volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide vers la zone active qui est une zone de réaction ; ledit au moins un composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique avec au moins un constituant dudit courant de fluide est fixé sur les surfaces desdites zones d'entrée, zone active qui est une zone de réaction, et zone de sortie ; ladite zone de sortie comprend des moyens pour rassembler le courant de fluide issu de la zone active qui est une zone de réaction comprenant les produits issus de ladite réaction biologique ou biochimique, et pour réduire le rapport surface sur volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide depuis la zone active qui est une zone de réaction vers ledit canal de sortie et pour évacuer ledit courant de fluide .
Il est clair que le courant de fluide lors de son écoulement dans le dispositif de l'invention rencontre successivement la zone d'entrée, puis la zone active (zone de réaction) et enfin la zone de sortie, puis le canal de sortie-
Le microréacteur, selon l'invention, se distingue, tout d'abord, fondamentalement du dispositif décrit, par exemple, dans le brevet US-A-6 156 273, qui est, fondamentalement, un dispositif de séparation obéissant aux règles classiques de la chromatographie et non un dispositif visant à réaliser une réaction, c'est-à-dire un réacteur.
Dans ce document US-A-6 156 273, des composés sont fixés aux parois du dispositif, mais ils ont pour but de retenir plus ou moins les divers constituants de l'échantillon liquide qui traverse le dispositif.
On est en présence d'un phénomène de rétention typique en chromatographie, qui a pour but de prolonger plus ou moins longtemps le séjour des constituants du liquide traité dans la colonne, afin d'en assurer la sortie échelonnée et donc la séparation.
Les constituants du liquide traité ne subissent aucune transformation dans la colonne et aucun nouveau produit n'est généré à l'intérieur de la colonne. En fait, dans le dispositif de l'art antérieur la zone qui peut être définie comme une zone active permet de faire de la chromatographie, sans réaction, alors que dans le dispositif selon l'invention la zone active est une zone de réaction car il s'y trouvent fixés des composés susceptibles de produire une réaction.
Au contraire, l'invention a trait non à un dispositif de séparation, mais à un réacteur, ce qui signifie que les composés fixés sur les surfaces des diverses zones du dispositif, à savoir : du microréacteur, selon l'invention, produisent une réaction biologique ou biochimique avec au moins un constituant du courant de fluide, que ce constituant est transformé et que des produits nouveaux sont créés, puis recueillis. En d'autres termes, dans le réacteur, selon l'invention, un échantillon qui circule dans le réacteur va, selon l'invention, interagir avec les composés susceptibles de réagir, fixés sur les surfaces du réacteur et ainsi créer des produits issus de cette réaction, au contraire, de nouveau du dispositif selon le document US-A-6 156 273, où les composés, le revêtement fixés aux parois favorisent simplement l'accrochage plus ou moins prolongé des constituants de l'échantillon, mais ne génèrent pas de nouveaux produits .
Le dispositif, selon l'invention, est également fondamentalement différent des dispositifs décrits notamment dans le document [9] , dans lesquels la réaction entre le composé, susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique, et au moins un constituant du courant de fluide, se produit en phase liquide, en solution, ledit composé n'étant absolument pas immobilisé, fixé aux surfaces du dispositif, comme dans le microréacteur, selon l'invention.
Grâce à cette caractéristique essentielle du microréacteur, selon l'invention, les concentrations des espèces immobilisées sur la surface peuvent être augmentées largement sans apparition des réactions parasites, comme, par exemple, l' autolyse dans le cas d'une enzyme de digestion.
Enfin, par rapport aux microréacteurs comprenant un garnissage de microbilles, le microreacteur, selon l'invention, a l'avantage d'être plus fiable, plus simple à préparer, et d'avoir, de même, un fonctionnement fiable et simple. Le dispositif, selon l'invention, est qualifié de microréacteur, cette dénomination est couramment utilisée dans ce domaine de la technique et est parfaitement claire pour l'homme du métier. Toutefois, il pourrait être utile de préciser que la plus grande dimension du microréacteur, selon l'invention, qui est, par exemple, sa longueur ou hauteur, est généralement de 10 mm à 30 mm.
Bien entendu, des dimensions différentes peuvent être exigées par les applications et/ou la nature des produits utilisés.
Le composé, susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique, peut être tout composé répondant à une telle définition, mais il est généralement choisi parmi les enzymes.
En d'autres termes, il peut s'agir de tout composé susceptible d' interagir avec un constituant, ou molécule cible, présent dans le courant de fluide qui traverse le microréacteur, et de transformer ledit constituant par une réaction de biologie moléculaire pour obtenir, à partir de ce constituant, un nouveau produit. Il peut s'agir par exemple d'une interaction et réaction de type enzyme/substrat, où ledit composé est un enzyme et ledit constituant un substrat dudit enzyme.
L'homme du métier trouvera de nombreuses autres applications évidentes de la présente invention à partir de cette définition.
Selon l'invention, lorsque ce composé est une enzyme, il peut être choisi dans la classe des oxydoréductases, la classe des transfërases, la classe des hydrolases, la classe des lyases, la classe des isomérases, ou la classe des ligases ou synthétases.
Il peut s'agir par exemple d'une enzyme à activité lytique, telle qu'une protéase, une nucléase, une lipase, une glycolase, une kinase, etc. ; d'une enzyme présentant une activité de modification ou d'action sur des acides nucléiques, telle que l'ADN ou l'ARN polymërase, la primase, l'ADN ligase, une nucléase, une transcriptase reverse, une kinase, une phosphatase, une phosphorylase, une endonucléase de restriction, une topo-isomérase, une transférase, etc.
Parmi les protéases, on peut citer par exemple les endopeptidases telles que la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, les cathepsines A, B et C ; et les exopeptidases telles que les carbopeptidases, les aminopeptidases, et les dipeptidases .
De préférence, l'enzyme est la trypsine et le substrat un peptide ou une protéine.
Selon la présente invention, lorsque le composé qui est susceptible d' interagir avec le constituant du fluide est une enzyme, le micro-réacteur peut être appelé microréacteur à enzymes . Par exemple dans le cas où l'enzyme est la trypsine, il peut être appelé microréacteur trypsique ; ou encore, par exemple dans le cas où l'enzyme est une polymérase, microréacteur à polymérases .
Le composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique est fixé auxdites surfaces, par exemple, par couplage par covalence, par des interactions mettant en jeu des ligands, ou par toute autre méthode permettant d'immobiliser ce composé sur la surface.
Le microréacteur, selon l'invention, peut avoir une forme quelconque, mais il présente avantageusement une forme sensiblement allongée, les trois zones décrites plus haut étant définies sur un substrat sensiblement plan, le courant de fluide s' écoulant sensiblement selon l'axe longitudinal dudit réacteur. Avantageusement, les moyens de la zone de réaction, qui lui confèrent un rapport surface sur volume élevé, sont constitués par des plots - ou monolithes, tels qu'ils sont désignés dans l'art antérieur - comportant une base sur ledit support reliée à un sommet par une paroi sensiblement perpendiculaire au plan dudit substrat, lesdits plots étant régulièrement espacés selon un réseau bidimensionnel et définissant entre leurs parois des canaux reliés entre eux et sensiblement parallèles à l'axe longitudinal du microréacteur et axe d'écoulement du courant de fluide .
Lesdits plots peuvent avoir une forme quelconque, mais, de manière avantageuse, leurs bases et leurs sommets auront une forme choisie parmi les disques, ellipses, et polygones, de préférence réguliers, tels que carrés, losanges, hexagones, etc..
La forme préférée pour la base des plots ou monolithes est celle d'un hexagone régulier ou bien celle d'un carré. La taille de ces plots est celle, par exemple, de leur base et/ou sommet, par exemple, en forme de carré ou d'hexagone régulier et elle est définie par le fait que cette base ou sommet, de préférence, en forme de carré ou d'hexagone régulier, peut s'inscrire dans un cercle d'un rayon de 1 à 20 μm, de préférence de 2 à 10 μm, par exemple de 5 μm.
Bien entendu, des dimensions différentes peuvent être exigées par les applications et/ou la nature des produits utilisés.
Avantageusement, lesdits plots sont disposés en rangées dont l'axe est sensiblement perpendiculaire à l'axe longitudinal du microréacteur ou axe d'écoulement du courant de fluide, les plots appartenant à deux rangées successives étant disposés en quinconce, c'est-à-dire directement décalés. Avantageusement, l'espacement entre les axes de deux rangées successives est généralement de. 10 à 30 μm, par exemple 12 μm et d'espacement entre les centres des bases de deux plots dans une même rangée est de 10 à 30 μm, par exemple de 14 μm. Bien entendu, des dimensions différentes peuvent être exigées par les applications et/ou la nature des produits utilisés.
Avantageusement, les moyens de la zone d'entrée, définis plus haut, pour communiquer au courant de fluide une vitesse d'écoulement constante, pour répartir de manière homogène le courant de fluide sur toute la section de la zone de réaction et pour augmenter le rapport surface sur volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide vers la zone de réaction, sont constitués par des déflecteurs comportant une base sur le support reliée à un sommet par une paroi sensiblement perpendiculaire au plan dudit substrat, lesdits déflecteurs divisant le canal d'entrée en C canaux, cette division étant répétée n fois, de sorte que le nombre de canaux à l'entrée de la zone de réaction est égal à Cn, n et C étant des nombres entiers, et la section totale des canaux à chaque division étant constante et égale à la section du canal d'entrée.
De préférence, C = 2 ou 3, de préférence encore C = 2 et n est un entier de 2 à 10. Le nombre n n'a pour limite que la dimension choisie du microréacteur.
Avantageusement, les moyens de la zone de sortie pour rassembler le courant de fluide issu de la zone de réaction et pour réduire le rapport surface sur volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide depuis la zone de réaction vers ledit canal de sortie - lesdits moyens étant identiques aux moyens prévus dans la zone d'entrée - sont constitués par des déflecteurs comportant une base sur le support reliée à un sommet par une paroi sensiblement perpendiculaire au plan dudit substrat, lesdits déflecteurs rassemblant les canaux de la zone de réaction en divisant leur nombre par S, cette division étant répétée m fois pour former un seul canal ou canal de sortie. S et m sont des entiers, de préférence, S = 2 ou 3, de préférence encore S = 2 et m est un entier de 2 à 10. Le nombre m a les mêmes limites que le nombre n.
Avantageusement, le microréacteur comprend, en outre, un capot ou couvercle recouvrant lesdites zones et lesdits canaux d'entrée et de sortie. Le capot ou couvercle est éventuellement pourvu d'orifices d'entrée et/ou de sortie.
L'invention concerne, en outre, un ensemble de microrêacteurs, tels que décrits plus haut, formés sur un substrat et comprenant de 2 à 50 microréacteurs ou plus selon l'encombrement de chacun de ces microréacteurs .
De préférence, les microréacteurs dudit ensemble diffèrent les uns des autres par la forme des plots et/ou la taille des plots et/ou leur répartition (par exemple, écartement des plots et des rangées) et/ou leur longueur.
L'invention concerne également un système formé sur un substrat et comprenant au moins un microreacteur, tel que défini plus haut, un réservoir d'alimentation en fluide, relié audit canal d'entrée ou d'alimentation et un réservoir de sortie de fluide relié audit canal de sortie.
Selon une forme de réalisation, le réservoir d'alimentation en fluide est prévu sur le substrat sur lequel est formé le microréacteur, par exemple, gravé dans le substrat, et le canal d'entrée est également prévu sur le substrat, par exemple, gravé dans le substrat . Selon une autre forme de réalisation, le réservoir d'alimentation en fluide est placé à l'extérieur du substrat sur lequel est formé le microréacteur et le canal d'entrée - qui relie le réservoir au microréacteur - se présente sous la forme d'un tube capillaire. Les mêmes agencements peuvent être prévus pour le réservoir de sortie de fluide.
Avantageusement, le microréacteur, le système ou l'ensemble, décrits plus haut, peuvent être reliés à un dispositif d'analyse, tel qu'un spectromètre de masse, de préférence par l'intermédiaire d'un capillaire conduisant à un « electrospray », ou a un dispositif d' électrophorèse capillaire.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un microréacteur, tel que décrit plus haut, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes : gravure des trois zones du microréacteur et, éventuellement, des canaux d'entrée et de sortie, dans un substrat sensiblement plan ; capotage, fermeture du microreacteur par un capot ou couvercle ; fixation d'un composé susceptible de produire un réacteur biologique ou chimique sur la surface de la zone de réaction et éventuellement sur les autres surfaces du microréacteur. De préférence, la gravure est réalisée par un procédé de gravure sèche isotrope ou anisotrope.
Avantageusement, le substrat est en un matériau choisi parmi la silice, le silicium oxydé, le silicium, les polymères, matières plastiques, et résines, tels que les silicones, les résines époxy et élastomères. Avantageusement, ladite fixation est réalisée par un couplage par covalence ou par des interactions mettant en jeu des ligands.
Si le substrat est en silice ou silicium oxydé et le composé à fixer est une enzyme, alors la fixation est réalisée par la suite d'étapes suivantes : réhydratation en milieu basique pour obtenir des sites silanols ; silanisation du substrat avec un silane époxydé réactif, tel que le
5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane ; - hydrolyse de l'époxyde pour donner un diol ; oxydation du diol en aldéhyde ; - immobilisation de l'enzyme, telle que la trypsine par réaction des fonctions aminés de la lysine avec les aldéhydes ; éventuellement, réaction des liaisons imines ainsi formées avec un réducteur. L'invention concerne enfin un procédé pour réaliser une réaction biochimique ou biologique, dans lequel on fait circuler un courant de fluide dans le microreacteur, tel que décrit plus haut, afin que au moins un constituant dudit courant de fluide réagisse avec le composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique, et on recueille à la sortie du microréacteur un courant de fluide comprenant le (les) produit (s) de ladite réaction.
De préférence, ladite réaction est une réaction de type enzyme/substrat, ledit composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique est une enzyme, ledit constituant dudit courant de fluide est un substrat de l'enzyme et le (les) produit (s) de la réaction sont le (les) produit (s) issu(s) de la réaction dudit enzyme avec ledit substrat .
L'enzyme peut être choisi parmi tous les enzymes, tels qu'ils ont été définis ci-dessus.
De préférence, ladite réaction est une réaction de digestion enzymatique par une protease, ledit composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique est une protease, lesdits constituants du courant de fluide sont des peptides ou des protéines et les produits de la réaction sont des segments peptidiques. De préférence encore, l'enzyme est la trypsine .
L'invention va maintenant être décrite de manière détaillée dans la description qui va suivre, donnée à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins joints, dans lesquels : la figure 1 est une vue latérale en coupe représentant un schéma général d'un microréacteur, selon l'invention ; la figure 2 est un graphique qui donne le rapport surface/volume (S/V) (en unités arbitraires) pour chaque étage (E) de l'entrée d'un microréacteur, selon l'invention ; la figure 3 est une vue de dessus de l'entrée et de la sortie d'un microréacteur, selon l'invention, réalisé sur un substrat plan ; la figure 4 est une vue de dessus représentant des détails de l'entrée (et de la sortie) et du bord d'un microréacteur, selon l'invention, et montrant la disposition et les dessins de plots d'un microréacteur, selon l'invention, ces plots ayant une base et un sommet en forme d'hexagone régulier ; les figures 5A à 5F montrent la fabrication d'un microréacteur, selon l'invention, dans un substrat en silicium, mettant essentiellement en œuvre un procédé de photolithographie ; les figures 6 et 7 sont des photographies réalisées au microscope électronique à balayage d'un réacteur fabriqué, selon l'invention. Sur la figure 6, le repère représente 200 μm ; et sur la figure 7, le repère représente 50 μm.
Le microreacteur, selon l'invention, dont le schéma général est illustré sur la figure 1, comprend une zone d'entrée (1), une zone de réaction (2) formant le « réacteur », proprement dit, et, enfin, une zone de sortie (3) .
Le microréacteur, montré de manière schématique sur la figure 1, a une forme allongée : il s'agit de la forme préférée du réacteur avec une longueur, par exemple, de 10 à 30 mm, tandis que sa petite dimension ou largeur ou diamètre, est, par exemple, de 0,5 mm à 1 mm, ce qui justifie le terme de « microréacteur » . Ces dimensions sont données à titre d'exemple et peuvent être largement modifiées selon les besoins . II est à noter que le microréacteur, selon l'invention, peut avoir, par exemple, la configuration de la colonne du document US-A-6 156 273, cité plus haut, mais on rappelle qu'il s'en distingue fondamentalement par le fait qu'il comporte un composé fixé sur ses surfaces permettant une réaction, qu'ils s'agit donc d'un réacteur et non d'un dispositif de séparation.
La zone d'entrée (1) est généralement constituée d'un microcanal, suivi d'un système de chicanes disposées dans le sens longitudinal du microréacteur. Ce système de chicanes ou déflecteurs-** permet d'imposer pour un débit fixé du courant de fluide en amont du microréacteur, une vitesse d'écoulement constante dans tout le réseau de canaux à travers les chicanes, avant d'entrer dans le réacteur principal. Le réseau de canaux favorise également une distribution, une répartition homogène du fluide pour le disperser sur toute la largeur de la zone ' de réaction. Enfin, la disposition, par exemple, dichotomique des chicanes ou déflecteurs, permet d'augmenter le rapport surface/volume au fur et à mesure de l'avancement du courant de fluide vers le cœur du microreacteur. La figure 2, donnée à titre d'exemple, montre le rapport surface sur volume (S/V) pour chaque étage de l'entrée d'un microréacteur, selon l'invention. On constate que plus on se rapproche du début de la zone de réaction (étage 8) , plus le rapport surface/volume est élevé . L'augmentation du rapport surface sur volume améliore au fur et à mesure le rendement de la réaction biologique ou biochimique, jusqu'à atteindre son optimum dans le cœur du réacteur, c'est-à-dire dans la zone, dite zone de réaction. L'augmentation de surface est, de préférence, apportée par la présence de plots sensiblement verticaux sur un substrat, ces plots peuvent présenter des géométries diverses et également des tailles et des pas divers, comme cela est décrit plus loin, en relation avec la figure 3. La longueur du microréacteur est également variable.
La longueur est généralement fixée, afin de pouvoir optimiser le rendement du réacteur, pour un encombrement minimal . La zone de sortie du microréacteur (3) est, de préférence, de forme identique à l'entrée, cette partie permet, notamment, de rassembler les différents produits issus de la réaction biologique ayant eu lieu dans le microréacteur, c'est-à-dire essentiellement dans la zone de réaction (2) avant de les utiliser ultérieurement, par exemple, de les analyser.
Il est possible, sur un même substrat, par exemple une même plaquette (« wafer ») d'intégrer plusieurs microréacteurs, c'est-à-dire de former un ensemble de microréacteurs sur le même substrat. De préférence, les microréacteurs se trouvant sur un même substrat seront différents, les différences portant, par exemple, sur la géométrie des plots, permettant d'augmenter le rapport surface sur volume et/ou l'écartement entre plots et/ou l'écart entre rangées et/ou la longueur du réacteur. L'entrée du réacteur est uniquement modifiée en fonction de la taille des plots adoptés.
La figure 3 est une vue de dessus de l'entrée du microréacteur, selon l'invention, réalisée sur un substrat plan.
Le microréacteur est alimenté par un canal « microcanal » (31) de largeur, par exemple, 100 μm, qui aboutit dans un canal ou distributeur (32) de largeur, par exemple, 400 μm, puis, enfin, dans le premier étage (33) de la zone d'entrée proprement dite, qui a une largeur de, par exemple, 640 μm.
Le canal formant le premier étage se divise, une première fois en deux canaux (34) et (35) dont les largeurs sont égales, à savoir : à 320 μm, et dont la somme des largeurs est égale à celle du canal unique (33) .
Au total, le canal unique du premier étage est divisé six fois, chacun des canaux d'un étage étant divisé en deux canaux de largeur égale et la largeur totale des canaux de chaque étage étant constante et toujours égale à la largeur du canal du premier étage
(640 μm) . Dans le dernier étage de la zone d'entrée, les canaux (36) sont au nombre de soixante-quatre et ont chacun une largeur, par exemple de 10 μm. Les dimensions en microns de la zone d'entrée de microréacteur, illustrée sur la figure 1, ont été indiquées dans le tableau I suivant, ces dimensions sont données uniquement à titre d'exemple :
TABLEAU I
La figure 3 peut représenter aussi bien l'entrée que la sortie d'un microréacteur, selon l'invention. Il suffit pour cela de renverser la figure 3, le canal (31) situé alors en bas de la figure, représente le canal de sortie ou d'évacuation.
Sur la figure 4, on a représenté les détails de l'entrée (et de la sortie) et du bord d'un microreacteur, selon l'invention.
On retrouve sur cette figure les canaux (36) , déjà décrits plus haut, qui aboutissent dans la zone de réaction, proprement dite, (41) du microréacteur, selon 1' invention.
Dans cette zone, sont disposés en rangées parallèles (41), (42), (43), (44), etc., des plots (45), etc., l'axe de ces rangées est perpendiculaire à l'axe longitudinal du microréacteur et à l'axe d'écoulement du courant de fluide.
Sur la figure 4, les plots ont une base et un sommet en forme d'hexagone régulier, chacun de ces hexagones s 'inscrivant dans un cercle de rayon A, qui est généralement de 1 à 10 μm, par exemple de 5 μm (à titre d'exemple).
Les plots des deux rangées successives sont disposés en quinconce et forment, entre eux, des canaux parallèles du sens d'écoulement 46, qui se divisent en canaux 47, qui ensuite se rejoignent en des canaux 48 de nouveau parallèles au sens d'écoulement.
Dans une même rangée, les centres des plots, par exemple des hexagones sont espacés de 10 à 30 μm, par exemple, de 14 μm (B) et les axes de deux rangées successives sont espacés généralement de 10 à 30 μm, par exemple de 12 μm (C) .
Sur la figure 4, on note que le bord de la zone de réaction reprend la forme extérieure des plots dans le but de conserver une section de canal constante et d'éviter la dispersion de la vitesse d'écoulement du fluide entre les bords et le centre du réacteur.
La zone de réaction s'évase lentement depuis la zone d'entrée et les canaux (36) par une partie tronconique définie par les dimensions D et E, par exemple, D = 70 μm et E = 10 μm, pour aboutir dans le cœur ou centre de la zone de réaction limitée par des parois essentiellement parallèles dont l'une (50) est représentée sur la figure 4. La zone de réaction assure pratiquement toute la fonction biologique du microréacteur.
L'augmentation de surface est précisément apporté par la présence des plots qui peuvent, outre la géométrie hexagonale représentée sur la figure, présenter d'autres géométries, par exemple les plots peuvent être en forme de losange, d'ellipse, de disque, et avoir également une taille et un pas (écart entre deux plots) différents, par exemple de 10 à 30 μm.
De préférence, on utilise une section soit hexagonale, comme sur la figure 4, soit carrée, qui s'inscrit dans un cercle de diamètre variable, par exemple de 2 à 20 μm, ceci afin d'obtenir un compromis entre une surface maximale, définissant un réseau de microcanaux interconnectés pratiquement parallèles à l'axe longitudinal du microréacteur (la présence de canaux perpendiculaires à l'axe longitudinal induirait la stagnation de produit et diminuerait le rendement du microréacteur) et de minimiser la complexité de la réalisation technologique.
Comme on l'a indiqué plus haut, la zone de sortie est généralement symétrique à la zone d'entrée.
Le microréacteur, selon l'invention, peut être fabriqué pour tout procédé adéquat, mais dans le cas où il est réalisé sur, dans un substrat, essentiellement plan, le microréacteur peut être, par exemple, réalisé par gravure sèche anisotrope (ou isotrope) dans du silicium, en utilisant, par exemple, un procédé du type DRIE ICP (Deep Reactive Ion Etching/Inductively Coupled Plasma, en anglais) .
Les motifs - par motif, on entend les canaux d'alimentation et d'évacuation, les zones d'entrée, de réaction, de sortie, formés, par exemple, par les déflecteurs et plots - sont alors définis dans le silicium par un masque de gravure, par exemple par une résine photosensible, couramment utilisée en microélectronique, ou, par exemple, par de la silice, ce masque étant d'épaisseur suffisante pour permettre la gravure des motifs dans le silicium, à l'épaisseur choisie par l'opérateur, par exemple, de 50 μm à 100 μm. Les motifs peuvent être définis dans ce masque de gravure, par exemple, par un procédé de lithographie classiquement rencontré en microélectronique, suivi, par exemple, dans le cas de la silice d'une gravure ionique réactive de ce matériau. Les réacteurs peuvent aussi être, par exemple, réalisés par gravure sèche anisotrope dans de la silice, le masque de protection choisi pouvant être alors, par exemple, du silicium. Le microréacteur peut aussi être réalisé dans d'autres matériaux, par exemple, en polymères, tels que résines époxy, élastomères, plastiques.
L'utilisation des microtechnologies permet de fabriquer, à l'aide de gravure anisotrope ou isotrope des structures aux géométries complexes et présentant des rapports de surfaces sur volume très important, sans les inconvénients des garnissages de microbilles.
Le réacteur peut ensuite être capoté, par exemple, par une plaque en PD S (polydiméthylsiloxane) , comportant ou non des orifices d'entrée et/ou de sortie, après traitement dudit capot et du réacteur par un plasma d'oxygène, tel que décrit dans la littérature. Dans ce cas, le PDMS est connu pour avoir des propriétés d'adhésion spontanée sur la plupart les supports solides.
Le réacteur peut être, aussi, par exemple, capoté par scellement moléculaire d'une plaque de silice ou d'une plaque de verre, comportant ou pas des orifices d'entrée et/ou de sortie, après nettoyage et préparation chimique des deux substrats hydroxyles
(substrat Si02 sur silicium/capot verre ou silice) . La présence de sites silanols (SiOH) en surface attire spontanément les molécules d'eau et les deux pièces du microcomposant, à savoir : capot et réacteur, collent l'une à l'autre par l'intermédiaire de molécules d'eau. Par chauffage, une partie de l'eau contenue entre les deux surfaces est éliminée jusqu'à l'obtention d'environ trois couches de molécules d'eau qui rendent possible l'adhésion.
Ou bien le microreacteur peut être, par exemple, capoté par scellement anodique d'une plaque de verre, comportant ou pas des orifices d'entrée et/ou de sortie .
Ou bien le microréacteur peut être, par exemple, capoté par collage d'une plaque polymère choisie par l'utilisateur, comportant ou pas des orifices d'entrée et/ou de sortie, en utilisant, par exemple, un procédé de dépôt de colle par sérigraphie.
Ce type de collage est constitué de trois étapes principales : la sérigraphie, qui consiste à appliquer de la colle uniquement sur certaines zones du substrat, le collage qui consiste à mettre en contact le substrat enduit localement de colle et le capot, et, enfin, le chauffage qui induit la polymérisation de la colle. La polymérisation peut s'effectuer par voie photochimique si la colle est polymerisable sous ON.
Enfin, le microréacteur peut être, par exemple, capoté par scellement direct silicium/silicium
(SDB : Silicon Direct Bonding, en anglais) à une plaque de silicium, comportant ou pas des orifices d'entrée et/ou de sortie.
La fixation du constituant doté de la fonction biologique ou biochimique dans le microréacteur, qui peut être, par exemple, une enzyme de type trypsine, peut être réalisée selon différentes méthodes : - par un couplage par covalence reliant la molécule à fixer à la surface du microréacteur ;
- par des interactions mettant en jeu des ligands.
Ainsi, dans le cas d'une enzyme, telle que la trypsine, sa fixation sur un substrat en silice, peut se faire par des étapes successives de réhydratation, silanisation, par exemple avec un silane époxydé réactif, hydrolyse, oxydation et, enfin, immobilisation, fixation de l'enzyme par l'intermédiaire des liaisons -NH2, portés par les groupes lysine de la trypsine.
Le schéma 1 suivant illustre les étapes et les conditions opératoires qui peuvent être utilisées pour l'immobilisation d'une enzyme, telle que la trypsine.
SCHEMA 1
A titre indicatif, de la trypsine portant une fonction biotine (trypsine biotinylée, type XI-B de SIGMA ALDRICH®) a été fixée sur des surfaces circulaires, de l'ordre de 1 mm de diamètre. Après une étape de marquage avec de la streptavidine, portant un fluorophore Cy3, et une excitation de 550 nm, une image de fluorescence est obtenue à 580 nm, dont l'intensité est de 225UA. Le rapport signal/bruit (trypsine/substrat) est compris entre 35 et 40.
Pour réaliser une réaction à l'intérieur du microréacteur, selon l'invention, on fait passer à l'aide d'un dispositif adéquat, tel qu'un pousse-seringue et sa seringue associée, ou autre, le courant de liquide dont un des constituants peut réagir avec le composé fixé sur les parois du microreacteur. Le débit est un débit, de préférence, constant, assurant un temps de séjour à l'intérieur du microréacteur de 1 à 15 minutes, par exemple en fonction de la cinétique de la réaction dans le microréacteur. Les produits de la réaction sont envoyés vers un dispositif d'analyse, tel qu'un spectrometre de masse, ou vers une autre utilisation, par exemple une électrophorèse capillaire. L'invention va maintenant être décrite, en référence aux exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemples
Exemple 1
Cet exemple illustre la fabrication d'un microréacteur en silicium, en référence à la figure 5 jointe.
On dépose sur un substrat (51) en silicium de quatre pouces (10, 16 cm), de type <100> et d'épaisseur 525 μm, une couche de résine photosensible 52 de type SHIPLEY S 1813 par spin-coating (tournette) .
On procède ensuite à une lithographie à l'aide d'un faisceau insolateur ON (53) au travers d'un masque (54) pourvu ou de n motifs définissant la géométrie des microréacteurs ; le temps d' insolation est de 10 secondes.
Ce motif est soumis à une désoxydation des fonds - de motif à l'aide d'un appareil
RIE Νextral NE 110 dans une atmosphère de CHF3/02 à un rapport de débit de 50/10 sccm, sous une pression de
100 mT, avec une puissance de 10 , pendant 1 minute.
Ensuite, on grave les zones non protégées par la résine à l'aide d'un appareil de gravure profonde du type DRIE ICI STS MULTIPLE. L'étape suivante consiste à découper le masque de résine par HN03 fumant sans ultrasons pendant 5 minutes .
Les flancs de la gravure sont alors nettoyés par oxydation en four à tube sous oxygène pendant 50 minutes à 1 000°C et désoxydation chimique à l'aide de HF pendant quelques secondes . On réalise ensuite une oxydation épaisse des motifs sur une épaisseur de 3 μm (55) dans un four à tube sous vapeur d'eau à 1 00°C pendant 18 heures et 50 minutes . Chaque microréacteur est ensuite découpé et séparé du afer. Un capot en polydiméthylsiloxane est ensuite utilisé pour la fermeture du microréacteur. Le scellement du capot et du microréacteur est réalisé après traitement pas plasma oxygène des deux surfaces à mettre en contact (appareil TEGAL, plasma 02, pression 100 mTorr, temps d'activation 30 secondes) . La connexion du microréacteur avec tout dispositif de mise en circulation de fluide est réalisée via des capillaires insérés dans les canaux d'entrée et de sortie du microreacteur.
Le microréacteur utilisé dans l'exemple de digestion présente une géométrie de plot hexagonale avec des plots de diamètre 10 microns, séparés les uns des autres de 14 microns sur un axe perpendiculaire à la direction du flux de liquide et de 12 microns sur un axe parallèle au flux du liquide. La profondeur du microréacteur, définie comme étant la hauteur moyenne des plots est de 50 microns.
Exemple 2
Dans cet exemple, on réalise la fixation, l'immobilisation de la trypsine sur les surfaces du microréacteur fabriqué dans l'exemple 1 pour obtenir un microréacteur « fonctionnalisé », selon l'invention. Puis, on vérifie l'immobilisation de la trypsine par fluorescence.
La trypsine utilisée est une trypsine de type I, issue de pancréas de bovin, commercialisée par la Société SIGMA ALORICA® (réf. T 8003) .
Le mécanisme réactionnel est composé de plusieurs étapes, à savoir : une réhydratation en milieu basique permettant d'obtenir des sites silanols, une silanisation du substrat avec le
5,6-époxyhexy11riéthoxysi1ane cond isant à la formation de films) ; une hydrolyse pour transformer la fonction époxyde en fonction diol ; - une oxydation en fonction aldéhyde et, enfin, l'immobilisation de l'enzyme par réaction des fonctions . aminés portées par les lysines avec les fonctions aldéhydiques . Les liaisons imines, ainsi formées, sont stabilisées par réaction avec un réducteur. Le protocole précis, utilisé dans cet exemple, est décrit ci-après.
1. Réhydratâtion
NaOH Brown : NaO 4,9 g ;
EDI 14,7 ml ; EtOH 19,6 ml ; Remplissage du microréacteur à 3 μl/ , réaction 2 heures à température ambiante. Vidange du réacteur sous flux d'azote, puis lavage à l'eau désionisée (100 μl à 3 μl/mn) . Etuve 15 minutes à 80°C. Rinçage au toluène (50 μl à 3 μl/mn) .
2. Silanisatiόn
Toluène 10 ml ; DIEA 50 μl ;
5, 6-époxydexyltriéthoxysilane 25 μl ; Remplissage du microréacteur à 3 μl/mn, puis lavage à l'éthanol (100 μl à 3 μl/mn) ; Réticulation 3 heures à 110°C.
3. Hydrolyse
HCl 0,2 N. Remplissage du réacteur à 3 μl/mn.
Réaction sous flux de HCl pendant 3 heures à température ambiante. Vidange, puis lavage à l'eau désionisée (100 μl à 3 μl/mn) .
Séchage 30 minutes à 110°C.
4. Oxydation
NaI04 6,6 μg ;
Eau désionisée 3 ml. Réaction sous flux desdits réactifs (100 μl à
3 μl) pendant 1 heure à température ambiante. Vidange et séchage sous flux d'azote. 5. Immobilisation de l'enzyme
La solution contenant l'enzyme à immobiliser est introduite dans le microréacteur à un débit fixé. Une fois le microréacteur rempli, ses extrémités sont bouchées avec du parafilm. La réaction d'immobilisation est alors effectuée en statique.
En utilisant ce schéma réactionnel et le protocole associé, de la trypsine biotinylée (trypsine biotinylée, type XI-B de SIGMA ALDRICH® se présentant sous la forme d'une solution de trypsine 2,5 mg/ml, Na2HP04 à 0,1 M, NaCNBH3 0,05 M), a été immobilisée sur la surface interne du microréacteur présentant des colonnes de 10 μm de diamètre, espacées de 5 μm, et de hauteur égale à 50 μm, puis révélée avec une solution de streptavidine Cy3.
Le couple biotine/streptavidine-Cy3 est révélé par fluorescence à 570 nm. L'observation au microscope à épi-fluorescence permet de visualiser la présence de trypsine sur toute la surface des microcolonnes et sur l'ensemble du réacteur trypsique.
Exemple 4
Dans cet exemple, on réalise une digestion de BSA dans le microréacteur pourvu d'une enzyme immobilisé, selon l'invention, préparée dans l'exemple 3. Par l'intermédiaire d'un pousse-seringue, le réservoir d'entrée du microréacteur est rempli d'une solution de « Bovin Sérum Albumine (BSA) » à 2 mg/ml avec 0,05 % de NaN3 à un débit moyen de l'ordre de 5 μl/mn. Le temps de séjour, dans le microreacteur, de la protéine à digérer est de l'ordre de 5 minutes. Au bout de quelques minutes, le volume infusé à travers le microréacteur est suffisamment important pour permettre une analyse correcte au spectrometre de masse type MALDI_TOF. Le spectre obtenu montre des segments peptidiques issu de la digestion de la BSA.
REFERENCES
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[10] Chemical abstract 2000 : 811 299 CAPLUS .

Claims

REVENDICATIONS
1. Microréacteur comprenant un canal d'entrée ou d'alimentation, une zone d'entrée (1) ou d'alimentation par un courant de fluide, une zone active comprenant des moyens lui conférant un rapport surface sur volume élevé, une zone de sortie (3) et un canal de sortie ou d'évacuation, lesdites zones et canaux se trouvant en communication fluidique, caractérisé en ce que la zone active est une zone de réaction (2) comportant au moins un composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique avec au moins un constituant dudit courant de fluide, ledit composé étant fixé sur les surfaces de ladite zone de réaction (2) .
2. Microréacteur selon la revendication 1, dans lequel : ladite zone d'entrée (1) comprend des moyens pour communiquer audit courant de fluide une vitesse d'écoulement constante, pour répartir de manière homogène le courant de fluide sur toute la section de ladite zone de réaction (2) et pour augmenter le rapport surface/volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide vers la zone active qui est une zone de réaction (2) ; ledit au moins un composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique avec au moins un constituant dudit courant de fluide est fixé sur les surfaces desdites zones d'entrée (1), zone active qui est une zone de réaction (2), et zone de sortie (3) ; ladite zone de sortie (3) comprend des moyens pour rassembler le courant de fluide issu de la zone active qui est une zone de réaction (2) comprenant les produits issus de ladite réaction biologique ou biochimique, et pour réduire le rapport surface sur volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide depuis la zone active qui est une zone de réaction (2) vers ledit canal de sortie et pour évacuer ledit courant de fluide .
3. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la plus grande dimension dudit microréacteur est de 10 mm à 30 mm.
4. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit composé susceptible de produire une réaction biochimique ou biologique est une enzyme et ledit constituant dudit courant de fluide est un substrat dudit enzyme.
5. Microréacteur selon la revendication 4, dans lequel ladite enzyme est choisie dans la classe des oxydoréductases, la classe des transfêrases, la classe des hydrolases, la classe des lyases, la classe des isomérases, ou la classe des ligases ou synthétases.
6. Microréacteur selon la revendication 4 ou la revendication 5, dans lequel l'enzyme est une enzyme à activité lytique, telle qu'une protease, une nucléase, une lipase, une glycolase, une kinase, etc. ; une enzyme présentant une activité de modification ou d'action sur des acides nucléiques, telle que l'ADN ou l'ARN polymérase, la primase, l'ADN ligase, une nucléase, une transcriptase reverse, une kinase, une phosphatase, une phosphorylase, une endonucléase de restriction, une topo-isomérase, et une transférase.
7. Microréacteur selon la revendication 6, dans lequel la protease est choisie parmi les endopeptidases telles que la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, les cathepsines A, B et C ; et les exopeptidases telles que les carbopeptidases, les aminopeptidases, et les dipeptidases .
8. Microréacteur selon la revendication 4, dans lequel l'enzyme est la trypsine et le substrat de celle-ci un peptide ou une protéine.
9. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique est fixé auxdites surfaces par couplage par covalence ou par des interactions mettant en jeu des ligands .
10. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, présentant une forme sensiblement allongée et formé sur un substrat sensiblement plan, sur lequel sont définies lesdites trois zones (1, 2, 3), le courant de fluide s'écoulant sensiblement selon l'axe longitudinal dudit réacteur.
11. Microréacteur selon la revendication 10, dans lequel les moyens de la zone de réaction (2) lui conférant un rapport surface sur volume élevé sont constitués par des plots (45) comportant une base sur ledit support, reliée à un sommet par une paroi sensiblement perpendiculaire au plan dudit substrat, lesdits plots (45) étant régulièrement espacés selon un réseau bidimensionnel et définissant entre les parois des canaux (46, 48) reliés entre eux et sensiblement parallèles à l'axe longitudinal du microréacteur et axe d' écoulement.
12. Microréacteur selon la revendication 11, dans lequel la base et le sommet desdits plots (45) ont une forme choisie parmi les ellipses, disques, et polygones de préférence réguliers, tels que losanges, carrés, ou hexagones.
13. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel les plots (45) ont une base et un sommet en forme d'hexagone régulier.
14. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel les plots (45) ont une base en forme de carré .
15. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, dans lequel la base et le sommet desdits plots (45) , de préférence, en forme de carrés ou d'hexagones réguliers peuvent être inscrits dans des cercles d'un rayon (A) de 1 à 20 μm, de préférence de 2 à 10 μm, par exemple de 5 μm.
16. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, dans lequel lesdits plots (45) sont disposés en rangées (42, 43, 44) dont l'axe est sensiblement perpendiculaire à l'axe longitudinal du microréacteur ou axe d'écoulement, les plots (45) appartenant à deux rangées (43, 44) successives étant disposés en quinconce.
17. Microréacteur selon la revendication 16, dans lequel l'espacement (C) entre les axes de deux rangées (43, 44) successives est de 10 à 30 μm, par exemple 12 μm et l'espacement (B) entre les centres des bases de deux plots (45) dans une même rangée (44) est de 10 à 30 μm, par exemple 14 μm.
18. Microréacteur selon la revendication 10, dans lequel les moyens de la zone d'entrée (1) pour communiquer au courant de fluide une vitesse d'écoulement constante pour répartir de manière homogène le courant de fluide sur toute la section de la zone de réaction (2) et pour augmenter le rapport surface sur volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide vers la zone de réaction (2) , sont constitués par des déflecteurs comportant une base sur le support reliée à un sommet par une paroi sensiblement perpendiculaire au plan dudit substrat, lesdits déflecteurs divisant le canal d'entrée en C canaux, cette division étant répétée n fois, de sorte que le nombre de canaux à 1 ' entrée de la zone de réaction (2) est égal à Cn, n et C étant des nombres entiers, et la section totale des canaux à chaque division étant constante et égale à la section du canal d' entrée.
19. Microréacteur selon la revendication 18, dans lequel C = 2 ou 3 et n un entier de 2 à 10.
20. Microréacteur selon la revendication 10, dans lequel les moyens de la zone de sortie (3) pour rassembler le courant de fluide issu de la zone de réaction (2) et pour réduire le rapport surface sur volume au fur et à mesure de la progression du courant de fluide depuis la zone de réaction (2) vers ledit canal de sortie, lesdits moyens étant identiques aux moyens prévus dans la zone d'entrée, sont constitués par des déflecteurs comportant une base sur le support reliée à un sommet par une paroi sensiblement perpendiculaire au plan dudit substrat, lesdits déflecteurs rassemblant les canaux de la zone de réaction (2) en divisant leur nombre par S, cette division étant répétée m fois, pour former un seul canal ou canal de sortie.
21. Microréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, comprenant, en outre, un couvercle ou capot recouvrant lesdites zones et lesdits canaux, pourvu éventuellement d'orifices d'entrée et/ou de sortie.
22. Ensemble de microréacteurs selon l'une quelconque des revendications précédentes formés sur un substrat et comprenant de 2 à 50 microréacteurs.
23. Ensemble de microréacteurs selon la revendication 22 et la revendication 11, dans lequel lesdits microréacteurs diffèrent les uns des autres par la forme des plots (45) et/ou la taille des plots (45) et/ou leur répartition et/ou la longueur du microréacteur.
24. Système formé sur un substrat et comprenant au moins un microréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, un réservoir d'alimentation en fluide, relié audit canal d'entrée ou d'alimentation, et un réservoir de sortie de fluide relié audit canal de sortie.
25. Système selon la revendication 24, dans lequel le réservoir d'alimentation en fluide est prévu sur le substrat sur lequel est formé le microréacteur, par exemple gravé dans le substrat et le canal d'entrée est également prévu sur le substrat, par exemple gravé dans le substrat .
26. Système selon la revendication 24, dans lequel le réservoir d'alimentation en fluide est placé à 1 ' extérieur du substrat sur lequel est formé le microréacteur et le canal d'entrée se présente sous la forme d'un tube capillaire.
27. Procédé de préparation d'un microréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, ledit procédé comprenant les étapes successives suivantes :
- gravure des trois zones (1, 2, 3) du microréacteur et, éventuellement, des canaux d'entrée et de sortie, dans un substrat sensiblement plan ; capotage, fermeture du microréacteur par un capot ou couvercle ; fixation d'un composé susceptible de produire un réacteur biologique ou chimique sur les surfaces de la zone de réaction et éventuellement sur les autres surfaces du microréacteur .
28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel la gravure est réalisée par procédé de gravure sèche isotrope ou anisotrope.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 à 28, dans lequel le substrat est en un matériau . choisi parmi la silice, le silicium, le silicium oxydé, les polymères, matières plastiques et résines, tels que les silicones, résines époxy et les élastomères .
30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 à 29, dans lequel ladite fixation est réalisée par un couplage par covalence ou par des interactions mettant en jeu des ligands.
31. Procédé selon la revendication 27, dans lequel le substrat est en silice ou en silicium oxydé et le composé à fixer est une enzyme, et la fixation est réalisée par la suite d'étapes suivantes : - réhydratation en milieu basique pour obtenir des sites silanols ; silanisation du substrat avec un silane époxydé réactif, tel que le 5 , 6-époxyhexyltriéthoxysilane ; - hydrolyse de l'époxyde pour donner un diol ; oxydation du diol en aldéhyde ; immobilisation de l'enzyme, telle que la trypsine par réaction des fonctions aminés de la lysine avec les aldéhydes ; éventuellement, réaction des liaisons imines ainsi formées avec un réducteur.
32. Procédé pour réaliser une réaction biochimique ou biologique dans lequel on fait circuler un courant de fluide dans un microréacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, afin que au moins un constituant dudit courant de fluide réagisse avec le composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique, et on recueille à la sortie du microréacteur un courant de fluide comprenant le (les) produit (s), de ladite réaction.
33. Procédé selon la revendication 32, dans lequel ladite réaction est une réaction de type enzyme substrat, ledit composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique est une enzyme, ledit constituant du courant de fluide est un substrat de l'enzyme, et les produits de la réaction sont les produits issus de la réaction dudit enzyme avec ledit substrat .
34. Procédé selon la revendication 32, dans lequel ladite réaction est une réaction de digestion enzymatique par une protease, ledit composé susceptible de produire une réaction biologique ou biochimique est une protease et lesdits constituants du courant de fluide sont des peptides ou des protéines et les produits de la réaction sont des segments peptidiques.
35. Procédé selon la revendication 34, dans lequel 1 ' enzyme est la trypsine .
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