EP1501920A2 - Method for the production of cells with increased development potential - Google Patents

Method for the production of cells with increased development potential

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Publication number
EP1501920A2
EP1501920A2 EP03724890A EP03724890A EP1501920A2 EP 1501920 A2 EP1501920 A2 EP 1501920A2 EP 03724890 A EP03724890 A EP 03724890A EP 03724890 A EP03724890 A EP 03724890A EP 1501920 A2 EP1501920 A2 EP 1501920A2
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EP
European Patent Office
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cells
kinase
induction
activated
hph2
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03724890A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Ulf R. Rapp
Bernd Neufeld
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RAPP, R. ULF, PROF. DR.
Original Assignee
Individual
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Definitions

  • the invention relates to a method for producing cells with increased development potential, cells obtainable with such a method and use of such cells.
  • embryonic and fetal phase an organism is formed by differentiating effector cells from stem cells. These embryonic or fetal stem cells have an increased development potential compared to somatic stem cells from adult tissues.
  • pluripotency of the embryonic or fetal stem cells since these can differentiate to all tissues, organs or cell types.
  • somatic stem cells for purposes other than in-vitro fertilization is opposed to serious ethical concerns. Therefore, a search for alternative sources for pluripotent or totipotent cells focuses on the generation of an increased development potential of somatic cells, in particular somatic stem cells from adult organisms, compared to the natural state. These research directions are encouraged by the realization that transdifferentiation of somatic stem cells is possible, for example neural ones Stem cells form blood cells, while blood stem cells can form brain and muscle cells. For this purpose, reference is made, for example, to the literature references US-6, 087, 168, US-6,093,531 and US-6,093,531.
  • Plasticity plays a particularly important role here because, with increased plasticity, those with good availability (quantity and / or easy removal), for example hematopoietic stem cells, can be used as starting cells.
  • 3pK belongs to a kinase family (MAPKAP kinases) that are activated by one or more members of the MAPK family (mitogen-activated protein kinase). 3pK is also known as MAPKAP kinase 3 (MAPK activated protein kinase 3).
  • MAPKAP kinases kinase family
  • MAPK activated protein kinase 3 MAPK activated protein kinase 3
  • the mechanisms for activating 3pK via the mitogenic kinase cascade are relatively well elucidated, for which reference is made, for example, to the literature references G. Sithanandam et al. ; Mol. Cell Biol. 16 (3), 868-876, and S. Ludwig et al. , Mol. Cell Biol. 16 (12), 6687-6697.
  • 3pK can also be via stress kinase cascades via p38 (S. Ludwig et al., Mol Cell Biol 16: 6687-6697 (1996); MM McLaughlin et al., J Biol Che 271: 8448-8492 (1996)) be activated, ie by induction of Rac (CDC42), for example by heat shock or proapoptotic substances such as TNF-alpha.
  • p38 stress kinase cascades via p38
  • p38 S. Ludwig et al., Mol Cell Biol 16: 6687-6697 (1996); MM McLaughlin et al., J Biol Che 271: 8448-8492 (1996)
  • be activated ie by induction of Rac (CDC42), for example by heat shock or proapoptotic substances such as TNF-alpha.
  • MAPKAP kinase is MK2, which is primarily activated via p38 as a cellular response to stress, for example by heat shock or cytokines such as TNF-alpha (J. Rouse et al., Cell 78: 1027-1037 (1994); K. Engel et al., J Cell Biochem 57: 321-330 (1995)).
  • 3pK and MK2 have a sequence homology of 75% at the amino acid level. Both are arranged in the non-activated state in the cell nucleus and leave it after activation or phosphorylation.
  • Other homologues are MAPKAP-Kl, RSK2, RSK3, MK4 and PRAK.
  • MAPKAP kinases such as 3pK or MK2.
  • the differential expression of homeotic genes determines the formation of different parts of the body along the longitudinal axis of an organism.
  • homeotic genes are activated in the right areas by transcription factors.
  • these factors are soon no longer active and the correct expression of homeotic genes in the course of the further development of the organism is inter alia from proteins of the so-called Polycomb-group (Pc-G) controlled.
  • Pc-G proteins keep genes that are no longer expressed after a certain developmental state suppressed. This property is also passed on to daughter cells. They form part of a cellular memory system, so they are part of an epigenetic expression control.
  • the Pc-G proteins are believed to produce a chromatin configuration that is inaccessible to transcription factors and thus inhibit the transcription of homeopathic genes.
  • the invention is based on the technical problem of specifying a method for increasing the plasticity of cells.
  • the invention teaches a method for producing cells increased development potential from cells, wherein the removed cells are cultivated in vitro and a native nuclear non-activated MAPKAP kinase of the cultivated cells is activated or an activated MAPKAP kinase is transported into the cell nucleus.
  • the term nuclear denotes a localization of the MAPKAP kinase in the cell nucleus, in particular in the chromate jelly.
  • a MAPKAP kinase can be activated if it can be phosphorylated with the result that the phosphorylated MAPKAP kinase can phosphorylate its substrates and is exported from the cell nucleus.
  • the said MAPKAP kinase can also be activated directly in vivo, the cells according to the invention then being formed directly in vivo.
  • the invention is based on the knowledge that nuclear MAPKAP kinases bind both with HPH2 and with BMI1.
  • the invention is based on the further finding that the activated, phosphorylated MAPKAP kinase in turn phosphorylates BMI1 before it is exported from the cell nucleus, which is also mobilized thereby, which ultimately makes a locus represented by the Pc-G complex accessible and transcribed.
  • This reactivates genes that are normally inactive at a certain stage of development, which leads the cells back to a status similar to that of an early embryonic stem cell, ie the plasticity of the cells used is increased.
  • the invention can in principle be used with all cell types, but is particularly suitable when using somatic stem cells. In detail, the following findings are based.
  • 3pK is a BMI1 kinase in vitro and develops a suppressive effect similar to other Pc-G proteins in an artificial repression assay. 3pK binds to putative full-length HPH2 and has the highest affinity for a 73 amino acid C-terminal fragment of HPH2, which encompasses the HDII / SEP domain. This region is part of the HPH2 dimerization domain, ie it comprises the alpha-helical HDII / SEP domain required for hetero- / homodimerization and for Bmil binding and overlaps with the domain for 3pK binding. The stronger binding to the said fragment compared to the full length can be due to a folding of full-length HPH2 over the HDII / SEP domain.
  • HPH2 The status of the phosphorylation of HPH2 is unclear and a phosphorylation of the putative full-length HPH2 by 3pK could not be observed in vitro. However, phosphorylation is not excluded either, since a mouse homolog of HPH2 (mPh.2, NCBI Accession U81491) with a long N-terminal attachment contains three potential 3pK phosphorylation sites. Since HPH1 and mouse mPhl proteins have the same length, it can be assumed that HPH2 also has the same length as mPh2.
  • 3pK is a kinase that phosphorylates BMI1. This plays an important role in that on the one hand the dissociation of Pc-G complexes and the BMI1 phosphorylation are interrelated and on the other hand hypophosphorylated BMI1 specifically in the Chromatin-associated protein fraction is kept out of the cell nucleus, while phosphorylated BMIl is not chromatin-bound. In summary, it was found that 3pK forms part of the Pc-G complex and is a BMIl kinase.
  • 3pK should therefore regulate the phosphylation-dependent Pc-G complex / chromatin interaction, namely by binding to HPH2, which provides 3pK in the Pc-G complex BMIl, with the result of its phosphorylation and release of the complex from the chromatin. Similar relationships were found in the case of MK2.
  • the invention further relates to cells obtainable by a method according to the invention and the use of cells according to the invention for the production of a pharmaceutical composition, in particular for the treatment of degenerative nerve diseases.
  • the increase in plasticity ensures colonization of the target tissue and differentiation of the introduced cells according to the invention into the desired cell type.
  • a particular aspect of the findings according to the invention of independent importance also lies in the use of a substance which promotes the expression or activation of a MAPKAP kinase, in particular 3pK, for the production of a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • the tumor cells can be brought to expression of activated 3pK by genetic engineering measures.
  • the MAPKAP kinase can be 3pK, MNK1, MNK2, MSK1, MK2, MK4 or PRAK, preferably 3pK.
  • the MAPKAP kinase is preferably a wild-type MAPKAP kinase.
  • Activated MAPKAP kinase can be induced in the cell nucleus in various ways. So it is possible that the cells are transformed to overexpress an activated MAPKAP kinase. Activation by induction of p38 is also possible, the induction of p38 again being possible by induction of Rac and / or Ras.
  • the activation of 3pK can be carried out in detail by induction of the mitogenic kinase cascade, in particular induction of Raf, MEK and / or ERK, for example by incubation with a serum growth factor or with TPA.
  • the activation can also be carried out by inducing a stress kinase cascade, for example i) by treating the cells with conditions inducing stress kinase, in particular a heat shock, osmolarity shock or UV, or ii) by incubation in a physiologically effective dose with at least one Stress kinase cascade inducing substance, in particular cytokines such as IL-1, TNF-alpha, anisomycin, arsenite and / or alkylating agents.
  • cytokines such as IL-1, TNF-alpha, anisomycin, arsenite and / or alkylating agents.
  • a preferred aspect of the invention is therefore the generation or induction and / or maintenance of B-raf in target cells whose development potential is to be increased.
  • the cells used are atic stem cells, for example hematopoietic or neural stem cells.
  • the cells used should be autologous, which avoids undesirable immune reactions when administered or reimplated.
  • Human PKRSPA-3pK which carries the gene under the control of the Rous Sarcoma Virus (RSV), pEBG-3pK, which expresses the gene as a GST fusion protein under the control of the human EFla promoter, and the mutation of the lysine in the area of the putative ATP binding region of the 3pK (3pK K73M) are known from the literature reference S. Ludwig et al (see above). Another mutation at 73 or derivatization can also be used, which renders 3pK inactive.
  • pcDNA3HA-3pk was generated by inserting an Nhel-Spel fragment of pPC97-3pK into pcDNA3HA.
  • pPCH-3pK K73M was obtained by inserting the Sall-Notl fragment of pPC97-3pK into pPCH (available from C. Hagemann, MSZ, Würzburg), which is a pPC97 derivative in which the LEU nutrient cassette is replaced by the TRP marker of pPC86 (PM Chevray et al., Proc Natl Acad Sei USA 89 (13), 1992, 5789-5793).
  • the BamHI-Ba HI insert of pGEXKG-3pK was ligated into the yeast two hybrid vector P ⁇ S2.1 (Clontech) to obtain pAS2.1-3pK K73M.
  • pMT2SM-HA-bmi (mouse), ppuro GAL4 DB-Bmil and ppuro GAL4 DB were obtained from Mv Lohuizen (Amsterdam).
  • PPuro GAL4 DB 3pK was cloned by cutting pGEXKG-3pK with EcoRI and subsequently inserting this fragment in ppuro GAL4 DB.
  • pBEVY-GU-Xb i was by ligation of the EcoRI fragment from pPC97-Xbmi (available from A. Otte, Amsterdam) into pBEVY-GU (available from Ch.A. Miller, New La).
  • pGAD10-HPH2 (137-432 aa), hereinafter referred to as pGAD10-HPH2 (C-295 aa), and pGAD10-HPH2 (432 aa) are available from A. Otte and described in MJ Gunster et al., Mol Cell Biol. 17 (4), 2326-2335.
  • the yeast two hybrid screens were carried out using a human heart MATCHMAKER cDNA library, which is cloned into the yeast two hybrid vector pGADIO (Clontech).
  • the kinase-active 3pK K73M was used in the single copy plasmid pPCH.
  • the yeast strain CG-1945 was manipulated according to the MATCHMAKER Library User Manual (PT1020-1, Clontech) using the sequential transformation protocol. Positive clones were identified by growth on SD / -TRP / -LEU / -HIS plates and activity determination of the lacZ reporter gene in filter assays.
  • GAL4 AD-HPH2 C-73 aa
  • GAL4 AD-HPH2 C-145 aa
  • GAL4 AD-HPH2 C -198 aa
  • GAL4 AD-HPH2 C-209 aa
  • GAL4 AD-HPH2 C-295 aa
  • GAL4 AD-HPH2 C-432 aa
  • pAS2.1-3pK K73M and pGAD10-HPH2 were co-expressed with a third yeast expression vector, either pBEVY-GU without insert or PbEVY-GU-Xbmil, and on SD / - TRP / -LEU / -URA plates are cultivated and then subjected to the liquid culture ⁇ -galactosidase assay.
  • the human embryonic kidney cell line HEK293 which was used for immune complex kinase assays and coimmune precipitation experiments, was added to Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), supplemented with 10% (v / v) FCS (at 56 ° C for 30 min. Heat inactivated) 37 ° C cultivated in humidified air with 6% C02.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • FCS at 56 ° C for 30 min. Heat inactivated
  • the human osteosarcoma cell line U20S GAL4-TKluc which is stably transfected with a TK-luciferase reporter plasmid with five GAL4 binding sites above the TK promoter and was used for the repression assay, was cultivated in DMEM with 10% FCS (v / v).
  • Polyclonal rabbit antiserum against bacterially expressed 3pK was obtained according to G. Sithananda (see above).
  • Anti-glutathione S-transferase (GST) antisera were obtained from rabbits which were immunized with bacterially expressed and purified GST. 1: 750 dilutions of both sera were used for immunoblots.
  • the monoclonal anti-HA tags (12CA5) were used in a concentration of 1 ⁇ g / ml for Western blots.
  • HEK293 and U-20S For the transfection of both cell lines HEK293 and U-20S, 5 x 10 A 5 cells were sown in a 10 cm dish and cultured for 24 hours in DMEM with 10% FCS before the transfection. The transfections were carried out using the calcium phosphate coprecipitation method using 5-10 ⁇ g DNA for HEK293 or 15 ⁇ g DNA for U-20S according to a modified Stratagene protocol (according to S. Ludwig et al., See above). HEK293 cells were starved 48 hours before transfection in DMEM with 0.3% FCS. To activate 3pK, HEK293 cells with 0.5 M sodium metaarsenite were used for 30 min. before the Harvest or with 20% FCS in combination with 100 ng tetradecanoylphorbol acetate (TPA) per ml 60 min. stimulated before harvest.
  • TPA tetradecanoylphorbol acetate
  • Transfected HEK293 cells were in Tritonlysis buffer (TLB, 20 mM Tris (pH 7.4), 50 mM sodium ⁇ -glycerophosphate, 20 mM sodium pyrophosphate, 137 mM NaCl, 10% (v / v) glycerol, 1% ( v / v) Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM Pefabloc, 1 mM sodium orthovanadate, 5 M benzamidine, 5 mg per ml apritinin, 5 mg per ml leupeptin) on ice for 10 min. lysed. Cell solids were removed by centrifugation at 15,000 rpm for 10 min. away.
  • TLB Tritonlysis buffer
  • 50 mM sodium ⁇ -glycerophosphate 20 mM sodium pyrophosphate
  • 137 mM NaCl 10% (v / v) glycerol
  • In-complex complex kinase assay with 3pK Separately immunoprecipitated GST-3pK and HA-BMIl were combined and twice with a high NaCl concentration (25 mM Tris (pH 8), 1 M NaCl, 10% (v / v) glycerol, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate, 1% NP40, 2 mM EDTA (pH 8), 1 mM Pefabloc, 1 mM sodium orthova nadate, 5 mM benzamidine, 5 mg per ml aproptin, 5 mg per ml leupeptin) and specific kinase buffer (10 mM MgCl2, 25 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 HEPES (pH 7.5), 5 mM benzamidine, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium vanadate).
  • specific kinase buffer 10 mM MgCl2,
  • the kinase assays were carried out in the same buffers, supplemented with 5 mCi [gamma32-P] -ATP, 0.1 mM ATP, at 30 ° C. and the reaction after 30 min. ended by adding Laemmli buffer and 3 min. at 100 ° C. After gel electrophoresis and blotting on nitrocellulose membrane, the BMIl phosphorylation was analyzed using an X-ray film (Amersham).
  • this medium was replaced by DMEM with 10% FCS and 10 ⁇ g / l puromycin, in which the cells were cultured for a further 38-62 h for removal of all non-transfected cells.
  • Cells transfected with the non-puromycin-resistant vector pKRSPA served as a control for the complete elimination.
  • the remaining cells were then cultured for 6 hours in DMEM with 10% FCS, after which the cells were examined for luciferase and ⁇ -gal activity.
  • U20S were harvested in 100 ml lysis buffer (50 mM Na-2 (N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 7.8, 50 mM Tris HC1, pH 7.8, 10 mM dithiothreitol, 2% Triton X-100).
  • the untreated cell lysates were clarified by centrifugation and 50 ml of the pre-clarified cell extract was added to 50 ml luciferase assay buffer (125 mM Na-2 (N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 7.8, 125 mM Tris HCl, pH 7.8, 25 mM magnesium acetate, 2 mg / ml ATP) added.
  • FIG. 1 shows as a result that 3pK binds in vivo in the yeast two-hybrid system to the C-terminal part, including the homology domain II (HDII), of HPH2.
  • Figure 1A is a schematic representation of the 3pK interacting HPH2 clones of different lengths. Interestingly, both the domain required for homo- or heterodimerization with HPH2 or HPH1 (104 C-terminal amino acids) and the binding domain for BMIl (295 C-terminal amino acids) overlap with the interaction domain for 3pK binding.
  • the minimal 3pK binding domain of HPH2 contains a 67 amino acid long homology domain II (called HDII, SAM or SEP), which is identical or similar to corresponding domains of other polyhomeotic proteins (eg Mph2, Mphl / Rae-28 or HPH1).
  • HDII long homology domain II
  • SAM SAM
  • SEP 67 amino acid long homology domain II
  • the strongest interaction 3pK / HPH2 was determined with the smallest HPH2 fragment, as can be seen from the X-Gal test (FIG. 1B) and the quantitative two-hybrid test with ONPG as the substrate (FIG. IC).
  • Y190 yeast was cotransformed with pAS2.1 / 3pK K73M and the specified pGAD10 / HPH2 constructs and cultivated on SD / -TRP / -Leu plates.
  • the colonies obtained were streaked on filters on SD / -TRP / -LEU / -HIS and cultured for 12-24 at 30 ° C before the ß-Gal assay was performed.
  • a liquid culture ß-galactosidase assay with ONPG as substrate was carried out to quantify the binding affinities.
  • the activity for 3pK-HPH2 (C-73 aa) was set to 100% for comparison purposes.
  • FIG. 2 shows that 3pK interacts with HPH2 in vivo, even in the case of mammalian cells.
  • 3pK should be part of the Polycomb complex, which contains HPH2.
  • Coimmune precipitation experiments were carried out to analyze whether 3pK is present in a Pc-G together with HPH2.
  • HEK293 cells were co-transfected with GST tagged HPH2 (C-73 aa) and 3pK wt.
  • polyclonal anti-GST serum was used for the immunoprecipitation and immunoblotting of GST-HPH2 (C-73 aa) (FIG. 2A, lane 5).
  • the bands at 55 kDa are the result of a cross reaction with heavy chains of the antibodies in the samples and have nothing to do with the above relationships.
  • the procedure was as follows. HEK 293 cells were transfected with the plasmids indicated. 3pK was expressed either untagged by an RSV promoter (FIG. 2A) or as an HA-tagged version by a CMV promoter (FIG. 2B). The proteins were immunoprecipitated, as indicated, with either anti-3pK (A), anti-GST (A, B) or anti-HA (12CA5) (B) antibodies, washed twice in TLB buffer, separated on SDS-PAGE gels ( 10%) and blotted in nitrocellulose filters. Immunoblots were sampled with the appropriate antiserum and detected with ECL.
  • FIG. 3 shows results that demonstrate an in vivo interaction between 3pK and BMIl.
  • the detailed procedure was as follows. The cells were transfected with HA-BMI1 or pEBG-3pK DNA. Immunoprecipitation was performed with either anti-GST or anti-HA (12CA5) antibodies, followed by two washes with TLB buffer. The proteins were then on separated on SDS-PAGE gels (10%) and blotted in nitrocellulose filters. Immunoblots were sampled with the appropriate antiserum and detected with ECL. The bands at 55 kDa have the above cause.
  • OHMI1 is specifically coprecipitated with GST-3pK (lane 1) and vice versa (lane 3). Lanes 2 and 4 show no interactions with HA-BMIl or GST alone.
  • FIG. 4 shows that 3pK BMIl phosphorylates.
  • HEK 293 cells were transfected with HA-BMIl or pEBG-3pK DNA.
  • the kinase was stimulated with arsenite or serum / TPA for 60 min. activated.
  • the substrate and kinase were immunoprecipitated with anti-HA (12CA5) or anti-GST antibodies. Immune complexes were combined, washed twice under stringent conditions with RIPA buffer containing 1 mM NaCl and subjected to an in vitro kinase reaction in the presence of [gamma32P] ATP. Lanes 2 and 3 of the upper panel show that a strong phosphorylation occurs when 3pK is activated.
  • pBEVY-GU In addition to the transformation of pAS2.1 / 3pK K73M and pGAD10 / HPH2 (C-73 aa), either pBEVY-GU or pBEVY-GU / XBMIl were co-transformed.
  • XBMI1 Xenopus BMIl
  • Xenopus BMIl is 90% identical and 95% similar to human and mouse BMIlDa since an ONPG ß-galactosidase assay is 6 orders of magnitude less sensitive than with X-Gal, only the (C-73 aa) fragment was used.
  • Each bar represents 5 parallel experiments and the data shown are representative of 5 independent assays. It can be seen that XBMI1 reduces the bond strength from 100% to 44%.
  • FIG. 6A shows a schematic representation of the stably integrated luciferase reporter construct.
  • FIG. 6B shows the fusion proteins used with the GAL4 DNA-binding domain (Gal4 DB).
  • GAL4 DB GAL4 DNA-binding domain
  • Gal4 DB-BMI1 Expression of Gal4 DB-BMI1 was used as a positive control and exactly four-fold inhibition was used, as described by Alkema et al. reported (see above) found. The same result was also found for Gal4 DB-3pK, which shows that non-activated and Pc-G associated 3pK is able to recruit Pc-G proteins such as BMIl or HPH2 to the chromatin-rearranged promoter, where an inhibitory complex is formed ,

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Abstract

The invention relates to a method for the production of cells with increased development potential from cells which are taken from an organism. The cells thus taken are cultivated in vitro and a native nuclear non-activated MAPKAP kinase of the cultivated cells is activated or an activated MAPKAP kinase is introduced into the nucleus of the cells.

Description

Verfahren zur Herstellung von Zellen mit erhöhtem Entwicklungspotential . Process for the production of cells with increased development potential.
Gebiet der Erfindung.Field of the Invention.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellen mit erhöhtem Entwicklungspotential, Zellen erhältlich mit einem solchen Verfahren sowie Verwen- düngen solcher Zellen.The invention relates to a method for producing cells with increased development potential, cells obtainable with such a method and use of such cells.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.Background of the Invention and Prior Art.
In der Embryonal- und Fetalphase wird ein Organismus durch Differenzierung von Effektorzellen aus Stammzellen gebildet. Diese embryonalen bzw. fetalen Stammzellen haben ein erhöhtes Entwicklungspotential, verglichen mit somatischen Stammzellen aus adulten Geweben. Man spricht von Pluripotenz der embryonalen bzw. feta- len Stammzellen, da diese zu allen Geweben, Organen oder Zelltypen diffenzieren können.In the embryonic and fetal phase, an organism is formed by differentiating effector cells from stem cells. These embryonic or fetal stem cells have an increased development potential compared to somatic stem cells from adult tissues. One speaks of pluripotency of the embryonic or fetal stem cells, since these can differentiate to all tissues, organs or cell types.
Der Erzeugung von embryonalen Stammzellen zu anderen Zwecken als im Rahmen der in-vitro Fertilisation ste- hen jedoch schwere ethische Bedenken entgegen. Daher konzentriert sich eine Suche nach alternativen Quellen für pluri- oder totipotenten Zellen auf die Erzeugung eines gegenüber dem natürlichen Zustand erhöhten Entwicklungspotentials somatischer Zellen, insbesondere somatischer Stammzellen aus adulten Organismen. Diese Forschungsrichtungen sind ermutigt durch die Erkenntnis, daß eine Transdifferenzierung von somatischen Stammzellen möglich ist, beispielsweise können neurale Stammzellen Blutzellen bilden, während Blutstammzellen Gehirn- und Muskelzellen bilden können. Hierzu wird beispielsweise auf die Literaturstellen US-6, 087, 168, US-6,093,531 und US- 6,093,531 verwiesen. Die Erhöhung der Plastizität der somatischen Stammzellen ist daher wünschenswert, um mittels aus einem Organismus entnommener somatischer Stammzellen, Behandlung derselben und Reimplantation verschiedenste Organreparaturen zu ermöglichen. Dabei spielt die Plastizität insbesondere deshalb eine besondere Rolle, weil mit erhöhter Plastizität als Ausgangszellen solche mit guter Verfügbarkeit (Menge und/oder einfache Entnahme) , beispielsweise hematopoetische Stammzellen, verwendet werden können.However, the production of embryonic stem cells for purposes other than in-vitro fertilization is opposed to serious ethical concerns. Therefore, a search for alternative sources for pluripotent or totipotent cells focuses on the generation of an increased development potential of somatic cells, in particular somatic stem cells from adult organisms, compared to the natural state. These research directions are encouraged by the realization that transdifferentiation of somatic stem cells is possible, for example neural ones Stem cells form blood cells, while blood stem cells can form brain and muscle cells. For this purpose, reference is made, for example, to the literature references US-6, 087, 168, US-6,093,531 and US-6,093,531. Increasing the plasticity of the somatic stem cells is therefore desirable in order to enable a wide variety of organ repairs to be carried out by means of somatic stem cells removed from an organism, treatment thereof and reimplantation. Plasticity plays a particularly important role here because, with increased plasticity, those with good availability (quantity and / or easy removal), for example hematopoietic stem cells, can be used as starting cells.
3pK gehört zu einer Kinasefamilie (MAPKAP-Kinasen) , welche durch eine oder mehrere Mitglieder der Familie MAPK (mitogen-activated protein kinase) aktiviert werden. 3pK ist auch als MAPKAP kinase 3 (MAPK activated protein kinase 3) bekannt. Relativ gut aufgeklärt sind die Mechanismen zur Aktivierung von 3pK über die mito- gene Kinasekaskade, wozu beispielhaft auf die Literaturstellen G. Sithanandam et al . ; Mol. Cell Biol. 16(3), 868-876, sowie S. Ludwig et al . , Mol. Cell Biol. 16(12), 6687-6697, verwiesen wird. 3pK kann aber auch über Streß-Kinasekaskaden via p38 (S. Ludwig et al., Mol Cell Biol 16:6687-6697 (1996); M.M. McLaug- hlin et al., J Biol Che 271:8448-8492 (1996)) aktiviert werden, i.e. durch Induktion von Rac (CDC42) , beispielsweise durch Hitzeschock oder proapoptotische Substanzen, wie TNF-alpha. Hierzu wird beispielsweise auf die Literaturstellen J.M. Kyriakis et al., Nature 369:199-211 (1994), J. Raingeaud et al . , J Biol Chem 279:7420-7426 (1995), A. Minden et al . , Cell 81:1147-1157 (1995), S. Zhang et al . , J Biol Chem 279:23934-23936, J. Han et al . , Science 265:808-811 (1994), S. Kumar et al . , Biochem Biophys Res Commun 235:533-538 (1997), G. ang et al . , Cytogenet Cell Genet 78:50-55 (1997) und C.J. Lee et al . , Nature 372:739-746 (1994) verwiesen.3pK belongs to a kinase family (MAPKAP kinases) that are activated by one or more members of the MAPK family (mitogen-activated protein kinase). 3pK is also known as MAPKAP kinase 3 (MAPK activated protein kinase 3). The mechanisms for activating 3pK via the mitogenic kinase cascade are relatively well elucidated, for which reference is made, for example, to the literature references G. Sithanandam et al. ; Mol. Cell Biol. 16 (3), 868-876, and S. Ludwig et al. , Mol. Cell Biol. 16 (12), 6687-6697. 3pK can also be via stress kinase cascades via p38 (S. Ludwig et al., Mol Cell Biol 16: 6687-6697 (1996); MM McLaughlin et al., J Biol Che 271: 8448-8492 (1996)) be activated, ie by induction of Rac (CDC42), for example by heat shock or proapoptotic substances such as TNF-alpha. For this, reference is made, for example, to the references JM Kyriakis et al., Nature 369: 199-211 (1994), J. Raingeaud et al. , J Biol Chem 279: 7420-7426 (1995), A. Minden et al. , Cell 81: 1147-1157 (1995), S. Zhang et al. , J Biol Chem 279: 23934-23936, J. Han et al. , Science 265: 808-811 (1994), S. Kumar et al. , Biochem Biophys Res Commun 235: 533-538 (1997), G. ang et al. , Cytogenet Cell Genet 78: 50-55 (1997) and CJ Lee et al. , Nature 372: 739-746 (1994).
Eine weitere MAPKAP-Kinase ist MK2, welche primär über p38 als zelluläre Antwort auf Streß, beispielsweise durch Hitzschock oder Zytokine wie TNF-alpha, aktiviert wird (J. Rouse et al . , Cell 78:1027-1037 (1994); K. Engel et al . , J Cell Biochem 57:321-330 (1995)).Another MAPKAP kinase is MK2, which is primarily activated via p38 as a cellular response to stress, for example by heat shock or cytokines such as TNF-alpha (J. Rouse et al., Cell 78: 1027-1037 (1994); K. Engel et al., J Cell Biochem 57: 321-330 (1995)).
3pK und MK2 weisen auf Aminosäureebene eine Sequenzhomologie von 75% auf. Beide sind im nicht-aktivierten Zustand in Zellkern angeordnet und verlassen diesen nach Aktivierung bzw. Phosphorylierung. Weitere Homologe sind MAPKAP-Kl, RSK2, RSK3, MK4 und PRAK.3pK and MK2 have a sequence homology of 75% at the amino acid level. Both are arranged in the non-activated state in the cell nucleus and leave it after activation or phosphorylation. Other homologues are MAPKAP-Kl, RSK2, RSK3, MK4 and PRAK.
Recht wenig ist über die physiologischen Substrate in Hinblick auf die physiologischen Funktionen von MAPKAP Kinasen, wie 3pK oder MK2 bekannt.Very little is known about the physiological substrates with regard to the physiological functions of MAPKAP kinases such as 3pK or MK2.
Die differentielle Expression von homöotischen Genen bestimmt die Ausbildung verschiedener Körperteile entlang der Längsachse eines Organismus. In der frühen embryonalen Phase werden homöotische Gene in den richtigen Bereichen durch Transskriptionsfaktoren akti- viert. Diese Faktoren sind jedoch bald darauf nicht mehr aktiv und die zutreffende Expression von homöotischen Genen in Verfolg der weiteren Entwicklung des Organismus wird u.a. von Proteinen der sogenannten Polycomb-group (Pc-G) gesteuert. Pc-G Proteine halten Gene, welche ab einem bestimmten Entwicklungszustand nicht mehr expri iert werden, unterdrückt. Diese Eigenschaft wird auch an Tochterzellen weitergegeben. Sie bilden Teil eines zellulären Gedächtnissystems, sind also Teil einer epigenetischen Expressionskontrolle. Es wird angenommen, daß die Pc-G Proteine eine Chromatinkonfiguration hervorrufen, die unzugänglich für Transkriptionsfaktoren ist und so die Transkripti- on ho öotischer Gene hemmen. Zur Funktion der Pc-G Proteine wird im Einzelnen auf den folgenden Übersichtsartikel verwiesen: J.J.L Jacobs et al . , Cell & Developmental Biology, Vol. 10, 1999, pp. 227-235. Mitglieder der Pc-G Familie sind u.a. BMI1 und HPH1 bzw. HPH2 (human polyho eotic) .The differential expression of homeotic genes determines the formation of different parts of the body along the longitudinal axis of an organism. In the early embryonic phase, homeotic genes are activated in the right areas by transcription factors. However, these factors are soon no longer active and the correct expression of homeotic genes in the course of the further development of the organism is inter alia from proteins of the so-called Polycomb-group (Pc-G) controlled. Pc-G proteins keep genes that are no longer expressed after a certain developmental state suppressed. This property is also passed on to daughter cells. They form part of a cellular memory system, so they are part of an epigenetic expression control. The Pc-G proteins are believed to produce a chromatin configuration that is inaccessible to transcription factors and thus inhibit the transcription of homeopathic genes. For the function of the Pc-G proteins, reference is made in detail to the following review article: JJL Jacobs et al. , Cell & Developmental Biology, Vol. 10, 1999, pp. 227-235. Members of the Pc-G family include BMI1 and HPH1 and HPH2 (human polyho eotic).
Generell ist zu sagen, daß bereits einige Kenntnisse über die Wirkungsmechanismen der Pc-G Proteine gewonnen werden konnten. Jedoch ist demgegenüber kaum be- kannt, wie die Pc-G Proteine selbst reguliert werden.In general it can be said that some knowledge about the mechanisms of action of the Pc-G proteins has already been gained. However, it is hardly known how the Pc-G proteins are regulated.
Technisches Problem der Erfindung.Technical problem of the invention.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, ein Verfahren zur Erhöhung der Plastizität von Zellen anzugeben.The invention is based on the technical problem of specifying a method for increasing the plasticity of cells.
Grundzüge der Erfindung.Basics of the invention.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Zellen mit erhöhtem Entwicklungspotential aus Zellen, wobei die entnommenen Zellen in vitro kultiviert werden und wobei eine native nukleare nicht-aktivierte MAPKAP Kinase der kultivierten Zellen aktiviert oder wobei eine aktivierte MAPKAP Kinase in den Zellkern transportiert wird. Der Ausdruck nuklear bezeichnet eine Lokalisierung der MAPKAP Kinase im Zellkern, insbesondere im Chromatingerüs . Eine MAPKAP Kinase ist aktivierbar, wenn sie phosphoryliert werden kann mit der Folge, daß die phosphorylierte MAPKAP Kinase ihre Substrate phos- phorylieren kann und aus dem Zellkern exportiert wird. Es kann im Rahmen der Erfindung aber auch unmittelbar in vivo eine Aktivierung der besagten MAPKAP Kinase erfolgen, wobei dann die erfindungsgemäßen Zellen un- mittelbar in vivo gebildet werden.To solve this technical problem, the invention teaches a method for producing cells increased development potential from cells, wherein the removed cells are cultivated in vitro and a native nuclear non-activated MAPKAP kinase of the cultivated cells is activated or an activated MAPKAP kinase is transported into the cell nucleus. The term nuclear denotes a localization of the MAPKAP kinase in the cell nucleus, in particular in the chromate jelly. A MAPKAP kinase can be activated if it can be phosphorylated with the result that the phosphorylated MAPKAP kinase can phosphorylate its substrates and is exported from the cell nucleus. However, within the scope of the invention, the said MAPKAP kinase can also be activated directly in vivo, the cells according to the invention then being formed directly in vivo.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß nukleare MAPKAP Kinasen sowohl mit HPH2 bzw. mit BMI1 binden. Die Erfindung beruht auf der weiteren Erkenntnis, daß die aktivierte, phosphorylierte MAPKAP Kinase noch vor dem Export aus dem Zellkern ihrerseits BMIl phosphoryliert, welches dadurch ebenfalls mobilisiert wird, wodurch letztendlich ein durch den Pc-G Komplex repri- mierter Locus zugänglich und transkribiert wird. Hier- durch werden Gene, welche normalerweise ab einem bestimmten Entwicklungsstadium inaktiv sind, reaktiviert, wodurch die Zellen auf einen einem frühen embryonalen Stammzellen ähnlichen Status zurückgeführt werden, i.e. die Plastizität der eingesetzten Zellen wird erhöht. Die Erfindung kann grundsätzlich bei allen Zelltypen eingesetzt werden, besondere Eignung liegt jedoch bei Einsatz somatischer Stammzellen vor. Im Einzelnen liegen die folgenden Erkenntnisse zu Grunde. 3pK ist in vitro eine BMI1 Kinase und entwik- kelt in einem künstlichen Repression Assay ähnlich unterdrückende Wirkung, wie andere Pc-G Proteine. 3pK bindet an mutmaßliches volllängen HPH2 und hat die höchste Affinität zu einem 73 Aminosäuren langen C- terminalen Fragment von HPH2, welches die HDII/SEP Domäne umfaßt. Diese Region ist Teil der HPH2 Dimeri- sationsdomäne, i.e. sie umfasst die für die Hetero- /Homodimerisierung sowie für die Bmil Bindung erforderliche alpha-helical HDII/SEP Domäne und überlappt mit der Domäne für 3pK Bindung. Die stärkere Bindung an das besagte Fragment gegenüber der Volllänge kann seine Ursache in einer Faltung von Volllängen HPH2 über die HDII/SEP Domäne haben. Der Status der Phos- phorylierung von HPH2 ist unklar und eine Phosphory- lierung des mutmaßlichen volllängen HPH2 durch 3pK konnte in vitro nicht beobachtet werden. Phosphorylie- rung ist allerdings auch nicht ausgeschlossen, da ein Maus-Homolog des HPH2 (mPh.2, NCBI Accession U81491) mit einen langen N-terminalen Anhang drei potentielle 3pK Phosphorylierungsstellen enthält. Da HPH1 und Maus mPhl Proteine die gleiche Länge aufweisen, ist davon auszugehen, daß auch HPH2 die gleiche Länge, wie mPh2 aufweist.The invention is based on the knowledge that nuclear MAPKAP kinases bind both with HPH2 and with BMI1. The invention is based on the further finding that the activated, phosphorylated MAPKAP kinase in turn phosphorylates BMI1 before it is exported from the cell nucleus, which is also mobilized thereby, which ultimately makes a locus represented by the Pc-G complex accessible and transcribed. This reactivates genes that are normally inactive at a certain stage of development, which leads the cells back to a status similar to that of an early embryonic stem cell, ie the plasticity of the cells used is increased. The invention can in principle be used with all cell types, but is particularly suitable when using somatic stem cells. In detail, the following findings are based. 3pK is a BMI1 kinase in vitro and develops a suppressive effect similar to other Pc-G proteins in an artificial repression assay. 3pK binds to putative full-length HPH2 and has the highest affinity for a 73 amino acid C-terminal fragment of HPH2, which encompasses the HDII / SEP domain. This region is part of the HPH2 dimerization domain, ie it comprises the alpha-helical HDII / SEP domain required for hetero- / homodimerization and for Bmil binding and overlaps with the domain for 3pK binding. The stronger binding to the said fragment compared to the full length can be due to a folding of full-length HPH2 over the HDII / SEP domain. The status of the phosphorylation of HPH2 is unclear and a phosphorylation of the putative full-length HPH2 by 3pK could not be observed in vitro. However, phosphorylation is not excluded either, since a mouse homolog of HPH2 (mPh.2, NCBI Accession U81491) with a long N-terminal attachment contains three potential 3pK phosphorylation sites. Since HPH1 and mouse mPhl proteins have the same length, it can be assumed that HPH2 also has the same length as mPh2.
Die vorstehenden Erkenntnisse werden auch dadurch gestützt, daß BMI1 mit 3pK copräzipitiert . 3pK ist eine Kinase, die BMI1 phosphoryliert . Dies spielt insofern eine wesentliche Rolle, als daß einerseits die Dissoziation von Pc-G Komplexen und die BMI1 Phophorylie- rung miteinander zusammenhängen und andererseits hypo- phosphoryliertes BMI1 spezifisch in der Chromatin-assoziierten Proteinfraktion aus dem Zellkern gehalten ist, während phosphoryliertes BMIl nicht Chromatin-gebunden ist. Zusammenfassend wurde festgestellt, daß 3pK ein Teil des Pc-G Komplexes bildet und eine BMIl Kinase ist. 3pK dürfte folglich die phospho- rylierungsabhängige Pc-G-Komplex/Chromatin Wechselwirkung regulieren, und zwar durch die Bindung an HPH2 wodurch 3pK in dem Pc-G Komplex BMIl zur Verfügung gestellt wird, mit der Folge dessen Phosphorylierung und Freisetzung des Komplexes vom Chromatin. Ähnliche Zusammenhänge wurden im Falle von MK2 gefunden.The above findings are also supported by the fact that BMI1 coprecipitates with 3pK. 3pK is a kinase that phosphorylates BMI1. This plays an important role in that on the one hand the dissociation of Pc-G complexes and the BMI1 phosphorylation are interrelated and on the other hand hypophosphorylated BMI1 specifically in the Chromatin-associated protein fraction is kept out of the cell nucleus, while phosphorylated BMIl is not chromatin-bound. In summary, it was found that 3pK forms part of the Pc-G complex and is a BMIl kinase. 3pK should therefore regulate the phosphylation-dependent Pc-G complex / chromatin interaction, namely by binding to HPH2, which provides 3pK in the Pc-G complex BMIl, with the result of its phosphorylation and release of the complex from the chromatin. Similar relationships were found in the case of MK2.
Interessanterweise scheint der Phosphorylierungsstatus der 3pK für die Bindung an HPH2 nicht relevant zu sein. Vergleichsversuche mit an bekannten Phosphory- lierungsstellen der 3pK mutierten 3pK Varianten (T313E, T313A, TT201/313EE) zeigten keine Änderungen der Bindung an HPH2. Auch copräzipitiert 3pK auch nach Behandlung der Zellen mit Arsentit (einem starken Mit- tel zur Induktion der 3pK Phosphorylierung und Aktivierung) mit PcG Komplexen. Copräzipation findet im übrigen auch bei endogenem 3pK und PcG Komplexen statt .Interestingly, the phosphorylation status of 3pK does not appear to be relevant for binding to HPH2. Comparative experiments with known phosphorylation sites of the 3pK mutated 3pK variants (T313E, T313A, TT201 / 313EE) showed no changes in the binding to HPH2. 3pK also coprecipitated after treatment of the cells with arsentite (a powerful agent to induce 3pK phosphorylation and activation) with PcG complexes. Incidentally, coprecipitation also takes place with endogenous 3pK and PcG complexes.
Die Erfindung betrifft weiterhin Zellen erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren sowie die Verwendung von erfindungsgemäßen Zellen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung insbesondere zur Behandlung degenerativer Nervenerkrankungen. Bei solchen Erkrankungen stellt die Erhöhung der Plastizität eine Besiedlung des Zielgewebes und Differenzierung der eingebrachten erfindungsgemäßen Zellen zu dem gewünschten Zelltypus sicher. Ein besonderer Aspekt der erfindungsgemäßen Erkenntnisse von selbstständiger Bedeutung liegt auch in der Verwendung einer die Expression oder Aktivierung einer MAPKAP Kinase, insbesondere 3pK, fördernden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von Krebserkrankungen. Alternativ können die Tumorzellen durch gentechnische Maßnahmen zur Expression von aktiviertem 3pK gebracht werden. Bei diesem Aspekt wird genutzt, daß BMIl onko- gene Funktionen hat und dessen Modulation somit die Proliferation von Zellen steuern kann. So ist es bekannt, daß verringerte Proliferation auf einer Überexpression der Tumorsuppressoren plβ und pl9ARF beruhen kann, welche beide durch den INK4a Tumor Suppressor Locus codiert werden (siehe J.J. Jacobs et al . , Nature 397:164-168 (1999)). Eine Freigabe dieses Locus in Tumorzellen würde folglich die besagten Tumorsuppressoren induzieren mit dem Ergebnis der Hemmung oder Reduktion der krankheitsbedingt überhöhten Proliferation. Im übrigen gelten die vorstehenden und folgenden Erläuterungen analog. Substanzen, die 3pK in Tumorzellen induzieren bzw. aktivieren sind folglich für die 'Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Krebsbehandlung geeignet. Es wird sich empfehlen, die Substanzen entweder lokal zu applizieren oder an tu- morzellenspezifische Substanzen, beispielsweise inter- aktionspartner von Tumormarkern oder Liganden tu or- zellenspezifischer Rezeptoren, zu koppeln.The invention further relates to cells obtainable by a method according to the invention and the use of cells according to the invention for the production of a pharmaceutical composition, in particular for the treatment of degenerative nerve diseases. In such diseases, the increase in plasticity ensures colonization of the target tissue and differentiation of the introduced cells according to the invention into the desired cell type. A particular aspect of the findings according to the invention of independent importance also lies in the use of a substance which promotes the expression or activation of a MAPKAP kinase, in particular 3pK, for the production of a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of cancer. Alternatively, the tumor cells can be brought to expression of activated 3pK by genetic engineering measures. This aspect makes use of the fact that BMIl has oncogenic functions and its modulation can thus control the proliferation of cells. It is known, for example, that reduced proliferation can be based on overexpression of the tumor suppressors plβ and pl9ARF, both of which are encoded by the INK4a tumor suppressor locus (see JJ Jacobs et al., Nature 397: 164-168 (1999)). A release of this locus in tumor cells would consequently induce the tumor suppressors in question, with the result of the inhibition or reduction of the proliferation, which was excessive due to the disease. Otherwise, the above and following explanations apply analogously. Substances that induce or activate 3pK in tumor cells are therefore suitable for the production of pharmaceutical compositions for cancer treatment. It is recommended to either apply the substances locally or to couple them to tumor-cell-specific substances, for example interaction partners of tumor markers or ligands for tumor-specific receptors.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Bei der MAPKAP Kinase kann es sich um 3pK, MNK1, MNK2, MSK1, MK2, MK4 oder PRAK handeln, vorzugsweise um 3pK. Im Falle der Aktivierung nativer MAPKAP Kinase handelt es sich vorzugsweise um eine wildtyp MAPKAP Kinase.Preferred embodiments of the invention. The MAPKAP kinase can be 3pK, MNK1, MNK2, MSK1, MK2, MK4 or PRAK, preferably 3pK. In the case of activation of native MAPKAP kinase, it is preferably a wild-type MAPKAP kinase.
Aktivierte MAPKAP Kinase kann auf die verschiedensten Weise im Zellkern induziert werden. So ist es möglich, daß die Zellen zur Überexpression einer aktivierten MAPKAP Kinase transformiert werden. Auch ist die Akti- vierung durch Induktion von p38 möglich, wobei die Induktion von p38 wiederum durch Induktion von Rac und/oder Ras erfolgen kann.Activated MAPKAP kinase can be induced in the cell nucleus in various ways. So it is possible that the cells are transformed to overexpress an activated MAPKAP kinase. Activation by induction of p38 is also possible, the induction of p38 again being possible by induction of Rac and / or Ras.
Die Aktivierung von 3pK kann im Einzelnen durch Induk- tion der mitogenen Kinasekaskade, insbesondere Induktion von Raf, MEK und/oder ERK, erfolgen, beispielsweise durch Inkubation mit einem Serum Wachstumsfaktor oder mit TPA. Die Aktivierung kann aber auch durch Induktion einer Streß-Kinasekaskade erfolgen, bei- spielsweise i) durch Behandlung der Zellen mit Streß- Kinasekaskade induzierenden Bedingungen, insbesondere einem Hitzeschock, Osmolaritätsschock oder UV, oder ii) durch Inkubation in physiologisch wirksamer Dosis mit zumindest einer die Streß-Kinasekaskade induzie- renden Substanz, insbesondere Zytokine, wie IL-1, TNF- alpha, Anisomycin, Arsenit und/oder alkylierenden Agenzien.The activation of 3pK can be carried out in detail by induction of the mitogenic kinase cascade, in particular induction of Raf, MEK and / or ERK, for example by incubation with a serum growth factor or with TPA. However, the activation can also be carried out by inducing a stress kinase cascade, for example i) by treating the cells with conditions inducing stress kinase, in particular a heat shock, osmolarity shock or UV, or ii) by incubation in a physiologically effective dose with at least one Stress kinase cascade inducing substance, in particular cytokines such as IL-1, TNF-alpha, anisomycin, arsenite and / or alkylating agents.
Von besonderer Bedeutung ist die Beobachtung, dass das Vorliegen von B-raf in Zellen, natürlicherweise vorhanden oder künstlich induziert, zur Erhöhung des Entwicklungspotentials wichtig ist. So wurde beobachtet, dass bei Abwesenheit von B-raf eine Bildung von bzw. einer Erhöhung der Plasitizität von neuronalen Stammzellen in der Maus nicht erfolgt. Daher ist ein bevorzugter Aspekt der Erfindung die Generierung bzw. Induktion und/oder Erhalt von B-raf in Zielzellen, deren Entwicklungspotential erhöht werden soll.Of particular importance is the observation that the presence of B-raf in cells, naturally present or artificially induced, is important for increasing the development potential. It was observed that, in the absence of B-raf, formation of or there was no increase in the plasticity of neural stem cells in the mouse. A preferred aspect of the invention is therefore the generation or induction and / or maintenance of B-raf in target cells whose development potential is to be increased.
Bevorzugt ist es, wenn die eingesetzten Zellen so ati- sche Stammzellen sind, beispielsweise hematopoetische oder neurale Stammzellen. Aus Gründen der besseren Immunverträglichkeit sollten die eingesetzten Zellen autolog sein, wodurch bei Gabe bzw. Reimplatation unerwünschte Immunreaktionen vermieden werden.It is preferred if the cells used are atic stem cells, for example hematopoietic or neural stem cells. For reasons of better immune tolerance, the cells used should be autologous, which avoids undesirable immune reactions when administered or reimplated.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Versuchen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with the aid of examples and experiments.
Methoden:methods:
Plasmid Konstruktion:Plasmid construction:
Humanes PKRSPA-3pK, welches das Gen unter der Kontrolle des Rous Sarcoma Virus (RSV) trägt, pEBG-3pK, welches das Gen als eine GST Fusionsprotein unter Kontrolle des humanen EFla Promotors exprimiert, sowie die Mutation des Lysins im Bereich der mutmaßlichen ATP Bindungsregion des 3pK (3pK K73M) sind aus der Literaturstelle S. Ludwig et al (s.o.) bekannt. Ebenso ist eine andere Mutation an 73 oder Derivatisierung einsetzbar, die 3pK inaktiv macht. pcDNA3HA-3pk wurde durch Insertion eines Nhel-Spel Fragments von pPC97-3pK in pcDNA3HA erzeugt. pPCH-3pK K73M wurde erhalten durch Insertion des Sall-Notl Fragments von pPC97-3pK in pPCH (erhältlich von C. Hagemann, MSZ, Würzburg) , welches ein pPC97 Derivat ist, worin die LEU nutrient Kassette durch den TRP Marker von pPC86 ersetzt ist (P.M. Chevray et al . , Proc Natl Acad Sei USA 89(13), 1992, 5789-5793). Das BamHI-Ba HI Insert von pGEXKG-3pK wurde in den yeast two hybrid Vektor PÄS2.1 (Clontech) ligiert, um pAS2.1-3pK K73M zu erhalten. pMT2SM-HA-bmi (Maus), ppuro GAL4 DB-Bmil und ppuro GAL4 DB wurden von M.v. Lohuizen (Amsterdam) erhalten. Durch Schneiden von pGEXKG-3pK mit EcoRI und subsequenter Insertion dieses Fragments in ppuro GAL4 DB wurde ppuro GAL4 DB 3pK geklont. pBEVY-GU-Xb i wurde durch Ligation des EcoRI Fragments von pPC97-Xbmi (erhältlich von A. Otte, Amsterdam) in pBEVY-GU (erhältlich von Ch.A. Miller, New Orleans) . pGAD10-HPH2 (137-432 aa) , welches folgend als pGAD10-HPH2 (C-295 aa) bezeichnet wird, und pGAD10-HPH2 (432 aa) sind erhältlich von A. Otte und beschrieben in M.J. Gunster et al., Mol Cell Biol. 17(4), 2326-2335.Human PKRSPA-3pK, which carries the gene under the control of the Rous Sarcoma Virus (RSV), pEBG-3pK, which expresses the gene as a GST fusion protein under the control of the human EFla promoter, and the mutation of the lysine in the area of the putative ATP binding region of the 3pK (3pK K73M) are known from the literature reference S. Ludwig et al (see above). Another mutation at 73 or derivatization can also be used, which renders 3pK inactive. pcDNA3HA-3pk was generated by inserting an Nhel-Spel fragment of pPC97-3pK into pcDNA3HA. pPCH-3pK K73M was obtained by inserting the Sall-Notl fragment of pPC97-3pK into pPCH (available from C. Hagemann, MSZ, Würzburg), which is a pPC97 derivative in which the LEU nutrient cassette is replaced by the TRP marker of pPC86 (PM Chevray et al., Proc Natl Acad Sei USA 89 (13), 1992, 5789-5793). The BamHI-Ba HI insert of pGEXKG-3pK was ligated into the yeast two hybrid vector PÄS2.1 (Clontech) to obtain pAS2.1-3pK K73M. pMT2SM-HA-bmi (mouse), ppuro GAL4 DB-Bmil and ppuro GAL4 DB were obtained from Mv Lohuizen (Amsterdam). PPuro GAL4 DB 3pK was cloned by cutting pGEXKG-3pK with EcoRI and subsequently inserting this fragment in ppuro GAL4 DB. pBEVY-GU-Xb i was by ligation of the EcoRI fragment from pPC97-Xbmi (available from A. Otte, Amsterdam) into pBEVY-GU (available from Ch.A. Miller, New Orleans). pGAD10-HPH2 (137-432 aa), hereinafter referred to as pGAD10-HPH2 (C-295 aa), and pGAD10-HPH2 (432 aa) are available from A. Otte and described in MJ Gunster et al., Mol Cell Biol. 17 (4), 2326-2335.
Yeast two hybrid System:Yeast two hybrid system:
Die yeast two hybrid Screens wurden unter Verwendung einer humanen Herz MATCHMAKER cDNA Bilbliothek, welche in den yeast two hybrid Vektor pGADIO (Clontech) klo- niert ist durchgeführt. In dem ersten Screen wurde die kinaseinaktive 3pK K73M in dem Single copy Plasmid pPCH verwendet. Der Hefestamm CG-1945 wurde gemäß dem MATCHMAKER Library User Manual (PT1020-1, Clontech) manipuliert, wobei das sequenzielle Transformationsprotokoll verwendet wurde. Positive Klone wurden durch Wachstum auf SD/-TRP/-LEU/-HIS Platten und Aktivitätsbestimmung des lacZ Reportergens in Filter Assays identifiziert. Eine DNA Sequenzanalyse zeigte, daß die beiden unabhängig isolierten cDNA Bibliotheks Plasmide die gleichen 879 bp von HPH2, codierend einen 73 aa (220bp) und einen Teil des 3UTR (659 bp) enthielten. Ein unabhängiger Screen derselben two hybrid Bilblio- theken unter Verwendung von pAS2.1-3pK K73M als Köder und dem Hefestamm Y190, welcher eine höhere lacZ Reportergenexpression aufweist, resultierte in 128 auf SD/-TRP/-LEU/-HIS/+25mM 3-AT (3-amino-l, 2, 4-triazol ) gewachsenen ß-gal positiven Klonen, wovon wiederum 17 C-terminale Fragmente von HPH2 codierten: fünf Klone enthielten das Fragment des ersten Screens, vier cDNAs codierten 145, drei 198 und fünf 209 C-terminale Aminosäuren. Direkte two hybrid Tests mit diesen Wechsel- wirkungspartnern und pAS2.1-3pK K73M wurden ebenfalls durchgeführt, entsprechend den Standardprotokollen. Das Flüssigkultur ß-Galactosidase Assay mit ONPG (o- Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid) als Substrat wurde unter Verwendung des Stammes Y190 entsprechend der MATCHMAKER Gebrauchsanweisung durchgeführt. Um die Streuung zu reduzieren, wurden fünf verschiedene Transfor anten jeder Cotransfektion untersucht. pAS2.1-3pK K73M wurde als Köder mit den folgenden sechs verschiedenen (Länge) Konstrukten cotransfor- miert: GAL4 AD-HPH2 (C-73 aa) , GAL4 AD-HPH2 (C-145 aa), GAL4 AD-HPH2 (C-198 aa) , GAL4 AD-HPH2 (C-209 aa) , GAL4 AD-HPH2 (C-295 aa) und GAL4 AD-HPH2 (C-432 aa) . In einer weiteren Reihe von Experimenten wurden pAS2.1-3pK K73M und pGAD10-HPH2 (C-73 aa) mit einem dritten Hefe Expressionsvektor coexprimiert, entweder pBEVY-GU ohne Insert oder PbEVY-GU-Xbmil, und auf SD/- TRP/-LEU/-URA Platten kultiviert und danach den Flüssigkultur ß-Galactosidase Assay unterworfen.The yeast two hybrid screens were carried out using a human heart MATCHMAKER cDNA library, which is cloned into the yeast two hybrid vector pGADIO (Clontech). In the first screen, the kinase-active 3pK K73M was used in the single copy plasmid pPCH. The yeast strain CG-1945 was manipulated according to the MATCHMAKER Library User Manual (PT1020-1, Clontech) using the sequential transformation protocol. Positive clones were identified by growth on SD / -TRP / -LEU / -HIS plates and activity determination of the lacZ reporter gene in filter assays. DNA sequence analysis showed that the two independently isolated cDNA library plasmids contained the same 879 bp of HPH2 encoding a 73 aa (220 bp) and part of the 3UTR (659 bp). An independent screen of the same two hybrid libraries using pAS2.1-3pK K73M as bait and yeast strain Y190, which has a higher lacZ reporter gene expression, resulted in 128 on SD / -TRP / -LEU / -HIS / + 25mM 3 -AT (3-amino-1,2,4,4-triazole) grown ß-gal positive clones, of which 17 encoded C-terminal fragments of HPH2: five clones contained the fragment of the first screen, four cDNAs encoded 145, three 198 and five 209 C-terminal amino acids. Direct two hybrid tests with these interaction partners and pAS2.1-3pK K73M were also carried out in accordance with the standard protocols. The liquid culture ß-galactosidase assay with ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside) as a substrate was carried out using the strain Y190 according to the MATCHMAKER instructions for use. To reduce the spread, five different transformers of each cotransfection were examined. pAS2.1-3pK K73M was co-transformed as bait with the following six different (length) constructs: GAL4 AD-HPH2 (C-73 aa), GAL4 AD-HPH2 (C-145 aa), GAL4 AD-HPH2 (C -198 aa), GAL4 AD-HPH2 (C-209 aa), GAL4 AD-HPH2 (C-295 aa) and GAL4 AD-HPH2 (C-432 aa). In a further series of experiments, pAS2.1-3pK K73M and pGAD10-HPH2 (C-73 aa) were co-expressed with a third yeast expression vector, either pBEVY-GU without insert or PbEVY-GU-Xbmil, and on SD / - TRP / -LEU / -URA plates are cultivated and then subjected to the liquid culture β-galactosidase assay.
Zellkulturen und Antikörper: Die humane embryonale Nierenzelllinie HEK293, welche für Immunkomplex Kinase Assays und Coimmunpräzipitati- onsexperimente verwendet wurden, wurden in Dulbeccos modified Eagle's Medium (DMEM), supplementiert mit 10% (v/v) FCS (bei 56 °C für 30 min. hitzeinaktiviert) bei 37 °C in befeuchteter Luft mit 6% C02 kultiviert. Die humane Osteosarkomzelllinie U20S GAL4-TKluc, welche mit einem TK-Luciferase Reporterplasmid mit fünf GAL4 Bindungstellen oberhalb des TK Promotors stabil trans- fiziert ist und für das repression Assay verwendet wurde, wurde in DMEM mit 10% FCS (v/v) kultiviert. Polyclonales Kaninchen Antiserum gegen bakterielle exprimiertes 3pK wurde erhalten gemäß G. Sithananda (s.o.). Anti-Glutathion S-transferase (GST) Antiseren wurden aus Kaninchen erhalöten, welche mit bakteriell exprimiertem und gereinigten GST immunisiert wurden. 1:750 Verdünnungen beider Seren wurden für Immunoblots verwendet. Die monoklonalen anti-HA tag (12CA5) wurden in einer Konzentration von 1 μg/ml für Western Blots verwendet.Cell cultures and antibodies: The human embryonic kidney cell line HEK293, which was used for immune complex kinase assays and coimmune precipitation experiments, was added to Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), supplemented with 10% (v / v) FCS (at 56 ° C for 30 min. Heat inactivated) 37 ° C cultivated in humidified air with 6% C02. The human osteosarcoma cell line U20S GAL4-TKluc, which is stably transfected with a TK-luciferase reporter plasmid with five GAL4 binding sites above the TK promoter and was used for the repression assay, was cultivated in DMEM with 10% FCS (v / v). Polyclonal rabbit antiserum against bacterially expressed 3pK was obtained according to G. Sithananda (see above). Anti-glutathione S-transferase (GST) antisera were obtained from rabbits which were immunized with bacterially expressed and purified GST. 1: 750 dilutions of both sera were used for immunoblots. The monoclonal anti-HA tags (12CA5) were used in a concentration of 1 μg / ml for Western blots.
Transfektion und 3pK Aktivierung:Transfection and 3pK activation:
Zur Transfektion beider Zelllinien HEK293 und U-20S wurden 5 x 10A5 Zellen in eine 10 cm Schale ausgesäht und 24 h in DMEM mit 10% FCS vor der Transfektion kultiviert. Die Transfektionen wurden mittels der Calci- umphosphate Copräzipitationsmethode unter Verwendung von 5-10 μg DNA für HEK293 oder 15 μg DNA für U-20S ausgeführt entsprechend einem modifizierten Stratagene Protokoll (gemäß S. Ludwig et al., s.o.). HEK293 Zellen wurden 48 h vor der Transfektion gehungert in DMEM mit 0,3% FCS. Zur Aktivierung von 3pK wurden HEK293 Zellen mit 0,5 M Natriummetaarsenit 30 min. vor der Ernte oder mit 20% FCS in Kombination mit 100 ng Tet- radecanoylphorbolacetat (TPA) je ml 60 min. vor der Ernte stimuliert.For the transfection of both cell lines HEK293 and U-20S, 5 x 10 A 5 cells were sown in a 10 cm dish and cultured for 24 hours in DMEM with 10% FCS before the transfection. The transfections were carried out using the calcium phosphate coprecipitation method using 5-10 μg DNA for HEK293 or 15 μg DNA for U-20S according to a modified Stratagene protocol (according to S. Ludwig et al., See above). HEK293 cells were starved 48 hours before transfection in DMEM with 0.3% FCS. To activate 3pK, HEK293 cells with 0.5 M sodium metaarsenite were used for 30 min. before the Harvest or with 20% FCS in combination with 100 ng tetradecanoylphorbol acetate (TPA) per ml 60 min. stimulated before harvest.
Im-munpräzipitation und Immunblots:Immun precipitation and immunoblotting:
Transfizierte HEK293 Zellen wurden in Tritonlysispuf- fer (TLB, 20 mM Tris (pH 7,4), 50 mM Natrium ß-Glycer- ophosphat, 20 mM Natriumpyrophosphat, 137 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerol, 1% (v/v) Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM Pefabloc, 1 mM Natriumorthovanadat, 5 M Benzami- din, 5 mg je ml Apritinin, 5 mg je ml Leupeptin) auf Eis für 10 min. lysiert. Zellfeststoffe wurden durch Zentrifugieren bei 15000 rpm für 10 min. entfernt. Überstände wurden mit verschiednen Antiseren für 2 h bei 4 °C inkubiert. Ungetaggtes 3pK wurde mit anti-3pK Antiserum immunpräzipitiert . Getaggte Varianten der Proteine wurden mit korrespondierenden anti-tag Antikörpern immungereingt . Die Immunkomplexe wurden mit 25 μl Protein A Agarose präzipoitiert und ausgiebig gewa- sehen entweder mit TLB oder RIPA (IM NaCl) für Coim- munpräzipitation oder Immunkomplex Kinase Assays. Zur Detektion der Proteine in Western Blots wurden die Immunkomplexe in Elektrophorese Probepuffer suspendiert und für 3 min. bei 100 °C erhitzt. Nach SDS PAGE wurden Gele auf Nitrozellulosemembrane (Schleicher & Schuell) elektrogeblottet und der Immundetektion unter Verwendung der entsprechenden primären Antikörper zugeführt. Proteine wurden mittels Meerrettich Peroxida- se-konjugierter Protein A Agarose (Amersham) und einer standardisierten verstärkten Chemilumineszenzreaktion (Amerscham) visualisiert .Transfected HEK293 cells were in Tritonlysis buffer (TLB, 20 mM Tris (pH 7.4), 50 mM sodium β-glycerophosphate, 20 mM sodium pyrophosphate, 137 mM NaCl, 10% (v / v) glycerol, 1% ( v / v) Triton X-100, 2 mM EDTA, 1 mM Pefabloc, 1 mM sodium orthovanadate, 5 M benzamidine, 5 mg per ml apritinin, 5 mg per ml leupeptin) on ice for 10 min. lysed. Cell solids were removed by centrifugation at 15,000 rpm for 10 min. away. Supernatants were incubated with various antisera for 2 h at 4 ° C. Untagged 3pK was immunoprecipitated with anti-3pK antiserum. Tagged variants of the proteins were immune-purified with corresponding anti-tag antibodies. The immune complexes were precipitated with 25 μl Protein A agarose and washed extensively with either TLB or RIPA (IM NaCl) for immune precipitation or immune complex kinase assays. To detect the proteins in Western blots, the immune complexes were suspended in electrophoresis sample buffer and for 3 min. heated at 100 ° C. After SDS PAGE, gels were electroblotted onto nitrocellulose membranes (Schleicher & Schuell) and subjected to immunodetection using the corresponding primary antibodies. Proteins were visualized using horseradish peroxidase-conjugated Protein A agarose (Amersham) and a standardized enhanced chemiluminescence reaction (Amerscham).
Im-munkomplex Kinase Assay mit 3pK: Getrennt immunpräzipitiertes GST-3pK und HA-BMIl wurden zusammengeführt und zweimal mit einer hohen NaCl Konzentration (25 mM Tris (pH 8), 1 M NaCl, 10% (v/v) Glycerol, 0,1% SDS, 0,5% Natriu deoxycholat, 1% NP40, 2 mM EDTA (pH 8), 1 mM Pefabloc, 1 mM Natriu orthova- nadat, 5 mM Benzamidin, 5 mg je ml Aproptin, 5 mg je ml Leupeptin) sowie spezifischem Kinasepuffer (10 mM MgCl2, 25 mM ß-Glycerophosphat, 25 HEPES (pH 7,5), 5 mM Benzamidin, 0,5 mM Dithiothreitol, 1 mM Natriumva- nadat) gewaschen. Die Kinase Assays wurden in den gleichen Puffern, supplementiert mit 5 mCi [gamma32-P]-ATP, 0,1 mM ATP, bei 30 °C ausgeführt und die Reaktion nach 30 min. beendet durch Zugabe von Laemmli Puffer und 3 min. bei 100 °C. Nach Gelelktro- phorese und Blotten auf Nitrozellulosemembrane wurde die BMIl Phosphorylierung mittel eines Röntgenfilms (Amersham) analysiert.In-complex complex kinase assay with 3pK: Separately immunoprecipitated GST-3pK and HA-BMIl were combined and twice with a high NaCl concentration (25 mM Tris (pH 8), 1 M NaCl, 10% (v / v) glycerol, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate, 1% NP40, 2 mM EDTA (pH 8), 1 mM Pefabloc, 1 mM sodium orthova nadate, 5 mM benzamidine, 5 mg per ml aproptin, 5 mg per ml leupeptin) and specific kinase buffer (10 mM MgCl2, 25 mM β-glycerophosphate, 25 HEPES (pH 7.5), 5 mM benzamidine, 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM sodium vanadate). The kinase assays were carried out in the same buffers, supplemented with 5 mCi [gamma32-P] -ATP, 0.1 mM ATP, at 30 ° C. and the reaction after 30 min. ended by adding Laemmli buffer and 3 min. at 100 ° C. After gel electrophoresis and blotting on nitrocellulose membrane, the BMIl phosphorylation was analyzed using an X-ray film (Amersham).
Repression Assay: Diese Experimente wurden im wesentlichen gemäß der Literaturstelle M.J. Alke a et al., J Mol Biol 173, 1997, 993-1003, ausgeführt. U-2 OS wurden in 10 cm Schalen bis zu 40-60% Konfluenz kultiviert und transi- ent transfiziert unter Verwendung von Calciumphosphat . Jede 10 cm Schale wurde transfiziert mit entweder 15 μg ppuro GAL4 DB, ppuro GAL4 DB-BMI1, ppuro GAL4 DB-3pK oder PKRSPA sowie 2 μg eines ß-GAL Reportergens. Nach 20-24 h wurde das Transfektionsmedium nach mehreren Waschungen mit PBS zur Entfernung von Präzi- pitaten durch DMEM mit 10% FCS ersetzt. Nach 8-10 Stunden wurde dieses Mediume ersetzt durch DMEM mit 10% FCS und 10 μg/ l Puromycin, worin die Zellen für weitere 38-62 h kultiviert wurden zwecks Entfernung aller nicht transfizierten Zellen. Zellen, welche mit den nicht puromycin resitenten Vektor pKRSPA transfiziert wurden, dienten als Kontrolle für die vollständige Eliminierung. Die verbliebenen Zellen wurden dann für 6 h in DMEM mit 10% FCS kultiviert, wonach die Zellen auf Luciferase- und ß-Gal-Aktivität untersucht wurden. U20S wurden in 100 ml Lysispuffer (50 mM Na-2 (N-morpholino) ethansulfonsäure, pH 7,8, 50 mM Tris HC1, pH 7,8, 10 mM Dithiothreitol, 2% Triton X-100) geerntet. Die unbehandelten Zelllysate wurden durch Zentrifugieren geklärt und 50 ml des vorgeklärten Zellextraktes wurden zu 50 ml Luciferaseassaypuffer (125 mM Na-2 (N-morpholino) ethansulfonsäure, pH 7,8, 125 mM Tris HCl, pH 7,8, 25 mM Magnesiumacetat, 2 mg/ml ATP) zugegeben. Unmittelbar nach Injektion von 50 ml 1 mM D-Luciferins (Applichem) zu jeder Probe wurde die Lumineszenz für 5 s in einem Luminometer (MicroLumat LB96P, EG&G Berthold) gemessen. Das ß-Ga- lactosidaseassay wurde mit 20 μl Zelllysat gemäß einem Standardprotokoll (J. Sambrook et al., Molecular Clon- ning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) . Das Verhältnis der hintergundkorrigierten Luciferasewerte und ß-Galwerte unabhängig voneinander tranfizierter Schalen wurden zur Korrektur der Transfektionseffektivität eingesetzt und auf Leervektor transfizierte Kontrollen bezogen. Alle Tranfektionen wurden zumindest doppelt durchgeführt und Standardabweichungen wurden berechnet.Repression Assay: These experiments were carried out essentially according to MJ Alke a et al., J Mol Biol 173, 1997, 993-1003. U-2 OS were cultured in 10 cm dishes up to 40-60% confluence and transiently transfected using calcium phosphate. Each 10 cm dish was transfected with either 15 μg ppuro GAL4 DB, ppuro GAL4 DB-BMI1, ppuro GAL4 DB-3pK or PKRSPA and 2 μg of a ß-GAL reporter gene. After 20-24 h, the transfection medium was replaced with DMEM with 10% FCS after several washes with PBS to remove specimens. After 8-10 hours, this medium was replaced by DMEM with 10% FCS and 10 μg / l puromycin, in which the cells were cultured for a further 38-62 h for removal of all non-transfected cells. Cells transfected with the non-puromycin-resistant vector pKRSPA served as a control for the complete elimination. The remaining cells were then cultured for 6 hours in DMEM with 10% FCS, after which the cells were examined for luciferase and β-gal activity. U20S were harvested in 100 ml lysis buffer (50 mM Na-2 (N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 7.8, 50 mM Tris HC1, pH 7.8, 10 mM dithiothreitol, 2% Triton X-100). The untreated cell lysates were clarified by centrifugation and 50 ml of the pre-clarified cell extract was added to 50 ml luciferase assay buffer (125 mM Na-2 (N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 7.8, 125 mM Tris HCl, pH 7.8, 25 mM magnesium acetate, 2 mg / ml ATP) added. Immediately after the injection of 50 ml of 1 mM D-luciferins (Applichen) for each sample, the luminescence was measured for 5 s in a luminometer (MicroLumat LB96P, EG&G Berthold). The β-galactosidase assay was performed with 20 μl cell lysate according to a standard protocol (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). The ratio of the background-corrected luciferase values and ß-gal values of dishes transfected independently of one another were used to correct the transfection effectiveness and related to empty vector transfected controls. All transfections were carried out at least twice and standard deviations were calculated.
Ergebnisse: Die Figur 1 zeigt im Ergebnis, daß 3pK in vivo in dem yeast two-hybride System an den C-terminalen Teil, einschließlich der Homologie Domäne II (HDII), von HPH2 bindet. Figur 1A ist eine schematische Darstel- lung der mit 3pK interagierenden HPH2 Klone unterschiedlicher Länge. Interessanterweise überlappen sowohl die für die Homo- oder Heterodimerisierung mit HPH2 oder HPH1 benötigte Domäne (104 C-terminale Aminosäuren) als auch die Bindungsdomäne für BMIl (295 C-terminale Aminosäuren) mit der Interaktionsdomäne für 3pK Bindung. Die minimale 3pK Bindungsdomäne von HPH2 (73 C-terminale Aminosäuren) enthält eine 67 Aminosäuren lange Homologiedomäne II (HDII, SAM oder SEP bezeichnet) , welche identisch oder ähnlich mit ent- sprechenden Domänen anderer polyhomöotischer Proteine (z.B. Mph2, Mphl/Rae-28 oder HPH1) . Die stärkste Wechselwirkung 3pK/HPH2 wurde mit dem kleinsten HPH2 Fragment festgestellt, wie aus dem X-Gal Test (Figur 1B) und dem quantitativen two-hybride Test mit ONPG als Substrat (Figur IC) ersichtlich.Results: FIG. 1 shows as a result that 3pK binds in vivo in the yeast two-hybrid system to the C-terminal part, including the homology domain II (HDII), of HPH2. Figure 1A is a schematic representation of the 3pK interacting HPH2 clones of different lengths. Interestingly, both the domain required for homo- or heterodimerization with HPH2 or HPH1 (104 C-terminal amino acids) and the binding domain for BMIl (295 C-terminal amino acids) overlap with the interaction domain for 3pK binding. The minimal 3pK binding domain of HPH2 (73 C-terminal amino acids) contains a 67 amino acid long homology domain II (called HDII, SAM or SEP), which is identical or similar to corresponding domains of other polyhomeotic proteins (eg Mph2, Mphl / Rae-28 or HPH1). The strongest interaction 3pK / HPH2 was determined with the smallest HPH2 fragment, as can be seen from the X-Gal test (FIG. 1B) and the quantitative two-hybrid test with ONPG as the substrate (FIG. IC).
In dem Versuch zur Figur 1B wurde Y190 Hefe mit pAS2.1/3pK K73M und den angegebenen pGAD10/HPH2 Kon- strukten cotransformiert und auf SD/-TRP/-Leu Platten kultiviert. Die erhaltenen Kolonien wurden auf Filter, welche auf SD/-TRP/-LEU/-HIS lagen, ausgestrichen und für 12-24 bei 30 °C kultiviert, bevor das ß-Gal Assay durchgeführt wurde. Zur Quantifizierung der Bindungsaffinitäten wurde ein Flüssigkultur ß-Galactosi- dase Assay mit ONPG als Substrat durchgeführt. Die Aktivität für 3pK-HPH2 (C-73 aa) wurde zu Vergleichszwecken auf 100% gesetzt. Die Figur 2 zeigt, daß 3pK mit HPH2 in vivo wechselwirkt, und zwar auch im Falle von Säugerzellen. 3pK dürfte Teil des Polycomb Komplexes sein, welcher HPH2 enthält. Zur Analyse, ob 3pK in einem Pc-G zusammen mit HPH2 vorliegt, wurden Coimmunpräzipitationsexperi- mente durchgeführt. In einer ersten Serie von Experimenten wurden HEK293 Zellen mit GST tagged HPH2 (C-73 aa) und 3pK wt cotransfiziert . As Positivkontrolle wurde polyklonales anti-GST Serum für die Imunpräzipi- tation und Immunblotten von GST-HPH2 (C-73 aa) verwendet (Figur 2A, Bahn 5) . 3pK wurde mit einem 3pK spezifischen Antiserum präzipitiert und coimmunpräzipi- tiertes GST-HPH2 (C-73 aa) wurde in Western Blots mit dem anti-GST Antiserum detektiert (Figur 2A) . Anhand der Bahn 1 erkennt man, daß GST-HPH2 (C-73 aa) mit 3pK präzipitiert, während keine Copräzipitation im Falle der Kontrollproben mit GST allein, oder in Abwesenheit von 3pK oder GST-HPH2 (C-73 aa) festgestellt wird (Bahnen 2 bis 4) .In the experiment in FIG. 1B, Y190 yeast was cotransformed with pAS2.1 / 3pK K73M and the specified pGAD10 / HPH2 constructs and cultivated on SD / -TRP / -Leu plates. The colonies obtained were streaked on filters on SD / -TRP / -LEU / -HIS and cultured for 12-24 at 30 ° C before the ß-Gal assay was performed. A liquid culture ß-galactosidase assay with ONPG as substrate was carried out to quantify the binding affinities. The activity for 3pK-HPH2 (C-73 aa) was set to 100% for comparison purposes. Figure 2 shows that 3pK interacts with HPH2 in vivo, even in the case of mammalian cells. 3pK should be part of the Polycomb complex, which contains HPH2. Coimmune precipitation experiments were carried out to analyze whether 3pK is present in a Pc-G together with HPH2. In a first series of experiments, HEK293 cells were co-transfected with GST tagged HPH2 (C-73 aa) and 3pK wt. As a positive control, polyclonal anti-GST serum was used for the immunoprecipitation and immunoblotting of GST-HPH2 (C-73 aa) (FIG. 2A, lane 5). 3pK was precipitated with a 3pK-specific antiserum and coimmunoprecipitated GST-HPH2 (C-73 aa) was detected in Western blots with the anti-GST antiserum (FIG. 2A). Lane 1 shows that GST-HPH2 (C-73 aa) precipitated with 3pK, while no coprecipitation was found in the control samples with GST alone, or in the absence of 3pK or GST-HPH2 (C-73 aa) ( Lanes 2 to 4).
In den Versuchen der Figur 2B wurden GST-HPH2 Fragmente verschiedener Länge (wie angegeben) mit einer HA- tagged Variante von 3pK cotransfiziert . Immunpräzipi- tation und Immunblotten mit anti-GST Antiserum bestä- tigt die Expression der verschiedenen GST-HPH Fusionsproteine (Bahnen 1 bis 4 und 9 bis 12) . Coimmunpräzi- pitation mit HA-3pK unter Verwendung von HA mab wurde beobachtet im Falle von GST-HPH2 (C-73 aa) , Bahn 6, und GST-HPH2 (C-198 aa) , Bahn 8. (C-145 aa) und (C-295) wurden wegen vermutlich nicht ausreichender Bindungsaffinität nicht beobachtet. Dies bestätigt auch die Bindungsstärken gemäß der Figur IC. Die Banden bei 55 kDa sind das Ergebnis eine Kreuzreaktion mit heavy chains der Antikörper in den Proben und haben mit den vorstehenden Zusammenhängen nichts zu tun. Im Einzelnen wurde wie folgt verfahren. HEK 293 Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. 3pK wurde entweder ungetagged von einem RSV Promotor (Figur 2A) oder als HA-tagged Version von einem CMV Promotor (Figur 2B) exprimiert. Die Proteine wurden immunpräzipitiert, wie angegeben, entweder mit anti-3pK (A) , anti-GST (A, B) oder anti-HA (12CA5) (B) Antikörpern, zweimal in TLB Puffer gewaschen, separiert auf SDS-PAGE Gelen (10%) und in Nitrozellulose Filter geblottet. Immunoblots wurden mit dem zutreffenden Antiserum beprobt und mit ECL detektiert.In the experiments in FIG. 2B, GST-HPH2 fragments of various lengths (as indicated) were cotransfected with a HA-tagged variant of 3pK. Immunoprecipitation and immunoblotting with anti-GST antiserum confirms the expression of the various GST-HPH fusion proteins (lanes 1 to 4 and 9 to 12). Co-immunoprecipitation with HA-3pK using HA mab was observed in the case of GST-HPH2 (C-73 aa), lane 6, and GST-HPH2 (C-198 aa), lane 8. (C-145 aa) and (C-295) were not observed due to presumably insufficient binding affinity. This also confirms the bond strengths according to the figure IC. The bands at 55 kDa are the result of a cross reaction with heavy chains of the antibodies in the samples and have nothing to do with the above relationships. The procedure was as follows. HEK 293 cells were transfected with the plasmids indicated. 3pK was expressed either untagged by an RSV promoter (FIG. 2A) or as an HA-tagged version by a CMV promoter (FIG. 2B). The proteins were immunoprecipitated, as indicated, with either anti-3pK (A), anti-GST (A, B) or anti-HA (12CA5) (B) antibodies, washed twice in TLB buffer, separated on SDS-PAGE gels ( 10%) and blotted in nitrocellulose filters. Immunoblots were sampled with the appropriate antiserum and detected with ECL.
In nicht in Figuren dargestellten Versuchen wurde untersucht, ob 3pK mit Chromatin assoziiert ist. Diffe- rentielle Kernextrakte von Zellen, welche humane 3pK Konstrukte überexprimieren, zeigten, dass ein Teil nur der Wildtyp-3pK mit Chromatin assoziiert ist. Dagegen assoziierten constitutiv aktive oder Kinase-inaktive 3pK Mutanten nicht bzw. deutlich geringer mit Chromatin, in Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen, wonach solche Mutanten hauptsächlich im Zytoplasma vorliegen.Experiments not shown in the figures examined whether 3pK is associated with chromatin. Differential nuclear extracts from cells that overexpress human 3pK constructs showed that only a part of the wild-type 3pK is associated with chromatin. In contrast, constitutively active or kinase-inactive 3pK mutants did not, or significantly less, associated with chromatin, in accordance with other studies, according to which such mutants are mainly present in the cytoplasm.
In der Figur 3 sind Ergebnisse dargestellt, die eine in vivo Interaktion zwischen 3pK und BMIl belegen. Im Einzelnen wurde wie folgt vorgegangen. Die Zellen wur- den mit HA-BMI1 oder pEBG-3pK DNA transfiziert. Die Immunpräzipitation erfolgte mit entweder anti-GST oder anti-HA (12CA5) Antikörpern, gefolgt von zweifachem Waschen mit TLB Puffer. Die Proteine wurden dann auf auf SDS-PAGE Gelen (10%) separiert und in Nitrozellulose Filter geblottet. Immunoblots wurden mit dem zutreffenden Antiserum beprobt und mit ECL detektiert. Die Banden bei 55 kDa haben die vorstehende Ursache.FIG. 3 shows results that demonstrate an in vivo interaction between 3pK and BMIl. The detailed procedure was as follows. The cells were transfected with HA-BMI1 or pEBG-3pK DNA. Immunoprecipitation was performed with either anti-GST or anti-HA (12CA5) antibodies, followed by two washes with TLB buffer. The proteins were then on separated on SDS-PAGE gels (10%) and blotted in nitrocellulose filters. Immunoblots were sampled with the appropriate antiserum and detected with ECL. The bands at 55 kDa have the above cause.
Man erkennt, daß HABMI1 spezifisch copräzipitiert wird mit GST-3pK (Bahn 1) und umgekehrt (Bahn 3) . Die Bahnen 2 und 4 zeigen keine Interaktionen mit HA-BMIl oder GST allein.It can be seen that OHMI1 is specifically coprecipitated with GST-3pK (lane 1) and vice versa (lane 3). Lanes 2 and 4 show no interactions with HA-BMIl or GST alone.
Die Figur 4 zeigt, daß 3pK BMIl phosphoryliert . HEK 293 Zellen wurden mit HA-BMIl oder pEBG-3pK DNA transfiziert. Die Kinase wurde durch Stimulation der Zellen mit Arsenit oder Serum/TPA für 60 min. aktiviert. Substrat und Kinase wurden mit anti-HA (12CA5) oder anti-GST Antikörpern immunpräzipitiert . Immunkomplexe wurde zusammengeführt, zweimal unter stringenten Bedingungen mit RIPA Puffer enthaltend 1 mM NaCl gewaschen und einer in vitro Kinasereaktion in der gegen- wart von [gamma32P]ATP unterworfen. Die Bahnen 2 und 3 des oberen Panels zeigen, daß bei aktivierter 3pK eine starke Phospohorylierung eintritt. Dagegen findet keine oder kaum Phosphorylierung statt in Abwesenheit von 3pK oder bei fehlender Aktivierung (Bahnen 1 und 4) . Das untere Panel zeigt eine Positiv-Kontrollreaktion unter Einsatz von Hsp27 als Substrat für immunpräzipi- tiertes 3pK. Dies wurde in HeLa- und 293T-Zellen gefunden, aber auch in primären humanen TIG3 Fibrobla- sten, was zeigt, dass die Erfindung nicht auf bestimm- te Zelltypen beschränkt oder an spezifische zelluläre Phenotypen gebunden ist. Die Figur 5 zeigt, daß BMIl die Interaktion 3pK/HPH2 schwächt. Für die Versuche wurde ein Assay ähnlich jenem zur Figur IC durchgeführt. Zusätzlich zur Transformation von pAS2.1/3pK K73M und pGAD10/HPH2 (C-73 aa) wurden entweder pBEVY-GU oder pBEVY-GU/XBMIl cotransformiert. XBMI1 (Xenopus BMIl) ist 90% identisch und 95% ähnlich mit humanem und Maus BMIlDa ein ONPG ß-Galactosidase Assay um 6 Größenordnungen unempfindlicher als mit X-Gal ist, wurde nur das (C-73 aa) Fragment eingesetzt. Jeder Balken stellt 5 paralelle Experimente dar und die gezeigten Daten sind repräsentative für 5 unabhängige Assays. Man erkennt, daß XBMI1 die Bindungsstärke von 100% auf 44% reduziert.Figure 4 shows that 3pK BMIl phosphorylates. HEK 293 cells were transfected with HA-BMIl or pEBG-3pK DNA. The kinase was stimulated with arsenite or serum / TPA for 60 min. activated. The substrate and kinase were immunoprecipitated with anti-HA (12CA5) or anti-GST antibodies. Immune complexes were combined, washed twice under stringent conditions with RIPA buffer containing 1 mM NaCl and subjected to an in vitro kinase reaction in the presence of [gamma32P] ATP. Lanes 2 and 3 of the upper panel show that a strong phosphorylation occurs when 3pK is activated. In contrast, no or hardly any phosphorylation takes place in the absence of 3pK or in the absence of activation (lanes 1 and 4). The lower panel shows a positive control reaction using Hsp27 as a substrate for immunoprecipitated 3pK. This was found in HeLa and 293T cells, but also in primary human TIG3 fibroblasts, which shows that the invention is not restricted to certain cell types or is bound to specific cellular phenotypes. FIG. 5 shows that BMI1 weakens the interaction 3pK / HPH2. An assay similar to that of Figure IC was performed for the experiments. In addition to the transformation of pAS2.1 / 3pK K73M and pGAD10 / HPH2 (C-73 aa), either pBEVY-GU or pBEVY-GU / XBMIl were co-transformed. XBMI1 (Xenopus BMIl) is 90% identical and 95% similar to human and mouse BMIlDa since an ONPG ß-galactosidase assay is 6 orders of magnitude less sensitive than with X-Gal, only the (C-73 aa) fragment was used. Each bar represents 5 parallel experiments and the data shown are representative of 5 independent assays. It can be seen that XBMI1 reduces the bond strength from 100% to 44%.
In der Figur 6 sind Ergebnisse eines repression assays dargestellt. Figur 6A zeigt eine schematische Darstellung des stabil integrierten Luciferase Reporter Kon- strukts. Figur 6B zeigt die verwendeten Fusionsproteine mit der GAL4 DNA bindenden Domäne (Gal4 DB) . Für die Ergebnisse der Figur 6C wurde gemäß den Angaben unter "Methoden" verfahren.The results of a repression assay are shown in FIG. FIG. 6A shows a schematic representation of the stably integrated luciferase reporter construct. FIG. 6B shows the fusion proteins used with the GAL4 DNA-binding domain (Gal4 DB). For the results in FIG. 6C, the procedure was as described under "Methods".
Als Positivkontrolle wurde die Expression von Gal4 DB-BMI1 verwendet und es wurde exakt die vierfache Hemmung, wie von Alkema et al. berichtet (s.o.) gefunden. Dasselbe Ergebnis wurde aber auch für Gal4 DB-3pK gefunden, was belegt, daß nicht-äktiviertes und Pc-G assoziiertes 3pK in der Lage ist, Pc-G Proteine, wie BMIl oder HPH2 zum chromatinumlagerten Promoter zu rekrutieren, wo ein Hemmkomplex gebildet wird. Expression of Gal4 DB-BMI1 was used as a positive control and exactly four-fold inhibition was used, as described by Alkema et al. reported (see above) found. The same result was also found for Gal4 DB-3pK, which shows that non-activated and Pc-G associated 3pK is able to recruit Pc-G proteins such as BMIl or HPH2 to the chromatin-rearranged promoter, where an inhibitory complex is formed ,

Claims

Patentansprüche : Claims:
1. Verfahren zur in vitro Herstellung von Zellen mit erhöhtem Entwicklungspotential aus Zellen, welche einem Organismus entnommenen sind, wobei die entnommenen Zellen in vitro kultiviert werden und wobei eine native nukleare nicht aktivierte MAPKAP Kinase der kultivierten Zellen aktiviert oder eine aktivierte MAPKAP Kinase dem Zellkern der Zellen zugeführt wird.1. Method for the in vitro production of cells with increased development potential from cells which have been removed from an organism, the removed cells being cultivated in vitro and wherein a native nuclear non-activated MAPKAP kinase of the cultivated cells is activated or an activated MAPKAP kinase is the nucleus of the cell Cells is supplied.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die MAPKAP Kinase 3pK, MNK1, MNK2, MSK1, MK2, MK4 oder PRÄK, und vorzugsweise eine wildtyp MAPKAP Kinase ist.2. The method of claim 1, wherein the MAPKAP kinase is 3pK, MNK1, MNK2, MSK1, MK2, MK4 or PRÄK, and is preferably a wild-type MAPKAP kinase.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen zur Überexpression einer aktivierten MAPKAP Kinase transformiert werden.3. The method according to claim 1 or 2, wherein the cells are transformed to overexpress an activated MAPKAP kinase.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aktivierung durch Induktion von p38 erfolgt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the activation takes place by induction of p38.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Induktion von p38 durch Induktion von Rac und/oder Ras erfolgt.5. The method according to claim 4, wherein the induction of p38 takes place by induction of Rac and / or Ras.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aktivierung von 3pK durch Induktion der mitogenen Kinasekaskade, insbesondere Induktion von Raf, MEK und/oder ERK, erfolgt.6. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the activation of 3pK by induction of the mitogenic kinase cascade, in particular induction of Raf, MEK and / or ERK.
5 7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zellen mit einem Serum Wachstumsfaktor oder mit TPA inkubiert werden.7. The method of claim 6, wherein the cells are incubated with a serum growth factor or with TPA.
10 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aktivierung durch Induktion einer Streß-Kinasekaskade erfolgt.10. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the activation takes place by induction of a stress kinase cascade.
15 9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Aktivierung i) durch Behandlung der Zellen mit Streß-Kinasekaskade induzierenden Bedingungen, insbesondere einem Hitzeschock, Osmolaritätsschock oder UV, oder ii) durch Inkubation in physiologisch wirksamer Dosis9. The method of claim 8, wherein the activation i) by treating the cells with stress kinase cascade-inducing conditions, in particular a heat shock, osmolarity shock or UV, or ii) by incubation in a physiologically effective dose
20 mit zumindest einer die Streß-Kinasekaskade induzierenden Substanz, insbesondere Zytokine, wie IL-1, TNF-alpha, Anisomycin, Arsenit und/oder alky- lierenden Agenzien, erfolgt.20 with at least one substance inducing the stress kinase cascade, in particular cytokines such as IL-1, TNF-alpha, anisomycin, arsenite and / or alkylating agents.
2525
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zellen so atische Stammzellen sind.10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the cells are atic stem cells.
30 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zellen einem nicht-embryonalen menschlichen Organismus entnommen sind. 11. The method according to claim 1, wherein the cells are taken from a non-embryonic human organism.
12. Zellen erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.12. Cells obtainable by a method according to one of claims 1 to 11.
13. Verwendung von Zellen nach Anspruch 12 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung insbesondere zur Behandlung degenerativer Nervenerkrankungen.13. Use of cells according to claim 12 for the production of a pharmaceutical composition, in particular for the treatment of degenerative nerve diseases.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zellen autolog sind.14. Use according to claim 13, wherein the cells are autologous.
15. Verfahren zur Behandlung degenerativer Nervenerkrankungen, wobei einem erkrankten Organismus Zellen nach Anspruch 12 in geeigneter galenischer Herrichtung verabreicht werden oder wobei einem erkrnakten Organismus eine eine MAPKAP Kinase aktivierende Substanz in geeigneter galenischer Herrichtung verabreicht wird.15. A method for the treatment of degenerative nerve diseases, wherein a diseased organism cells according to claim 12 are administered in a suitable galenic preparation or wherein a diseased organism is administered a MAPKAP kinase activating substance in a suitable galenical preparation.
16. Verwendung einer eine MAPKAP Kinase aktivierenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung degenerativer Nervenerkrankungen. 16. Use of a substance activating a MAPKAP kinase for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of degenerative nerve diseases.
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