EP1487345A1 - Vorrichtung und verfahren zur quantifizierung von körpern mittels ultraschall - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur quantifizierung von körpern mittels ultraschall

Info

Publication number
EP1487345A1
EP1487345A1 EP03745194A EP03745194A EP1487345A1 EP 1487345 A1 EP1487345 A1 EP 1487345A1 EP 03745194 A EP03745194 A EP 03745194A EP 03745194 A EP03745194 A EP 03745194A EP 1487345 A1 EP1487345 A1 EP 1487345A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bubbles
bodies
ultrasound
signals
transducer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03745194A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Reinhardt
Peter Hauff
Andreas Briel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Acusphere Inc
Original Assignee
Schering AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering AG filed Critical Schering AG
Publication of EP1487345A1 publication Critical patent/EP1487345A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B8/00—Diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/48—Diagnostic techniques
    • A61B8/481—Diagnostic techniques involving the use of contrast agents, e.g. microbubbles introduced into the bloodstream
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B8/00—Diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/48—Diagnostic techniques
    • A61B8/483—Diagnostic techniques involving the acquisition of a 3D volume of data
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6897—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies
    • A61K47/6898—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies using avidin- or biotin-conjugated antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasonic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasonic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01S—RADIO DIRECTION-FINDING; RADIO NAVIGATION; DETERMINING DISTANCE OR VELOCITY BY USE OF RADIO WAVES; LOCATING OR PRESENCE-DETECTING BY USE OF THE REFLECTION OR RERADIATION OF RADIO WAVES; ANALOGOUS ARRANGEMENTS USING OTHER WAVES
    • G01S7/00—Details of systems according to groups G01S13/00, G01S15/00, G01S17/00
    • G01S7/52—Details of systems according to groups G01S13/00, G01S15/00, G01S17/00 of systems according to group G01S15/00
    • G01S7/52017—Details of systems according to groups G01S13/00, G01S15/00, G01S17/00 of systems according to group G01S15/00 particularly adapted to short-range imaging
    • G01S7/52023—Details of receivers
    • G01S7/52036—Details of receivers using analysis of echo signal for target characterisation
    • G01S7/52038—Details of receivers using analysis of echo signal for target characterisation involving non-linear properties of the propagation medium or of the reflective target
    • G01S7/52041—Details of receivers using analysis of echo signal for target characterisation involving non-linear properties of the propagation medium or of the reflective target detecting modification of a contrast enhancer, e.g. detecting the destruction of a contrast agent by an acoustic wave, e.g. loss of correlation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B8/00—Diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/42—Details of probe positioning or probe attachment to the patient
    • A61B8/4209—Details of probe positioning or probe attachment to the patient by using holders, e.g. positioning frames
    • A61B8/4218—Details of probe positioning or probe attachment to the patient by using holders, e.g. positioning frames characterised by articulated arms

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for the quantification of bodies contained in an examination object, which can be excited to independent, characteristic signals by diagnostic ultrasound, in particular those signals which are associated with the destruction of a body, preferably of bubbles. Furthermore, the invention also relates to a use of the device for ultrasound diagnosis and / or therapy on humans or animals and a use of the device and a method for the in-vivo and ex-vivo mapping of physiologically high or low-regulable molecular markers in Organs and tissues from postembryonic ontogenesis and from pathologically high or down-adjustable molecular markers in organs and tissues during pathogenesis and for the characterization of cell cultures by in-mapping of up and down-adjustable molecular markers of cells.
  • Ultrasound diagnostics has found a permanent place in everyday clinical practice. Details can be shown better in ultrasound recordings by injection of contrast media, since stronger ultrasound signals can be generated in this way.
  • All very small bodies (micro-bodies) that deliver a detectable signal that can be distinguished from the tissue signal, in particular gas-filled very small (micro) bubbles, are suitable as contrast agents. These bodies are fed to the examination object and can be destroyed in the ultrasound field, for example in the case of bubbles, under certain conditions. These bubbles emit independent, characteristic ultrasound signals. If the bubbles are destroyed by the ultrasound field, the independent, characteristic signals are referred to as "stimulated acoustic emission (SAE)".
  • SAE stimulated acoustic emission
  • Bubbles that can emit independent characteristic signals are described, for example, in EP 0 398 935 B1, EP 0 644 777 B1, EP 0 458 745 A1 and WO 01/68150 A1.
  • SAE stimulated acoustic emission
  • FIG. 2 an ultrasound sectional image from which the size of the SAE signals can be seen
  • FIG. 3 a conventionally recorded ultrasound sectional image.
  • FIG. 1 shows a first sound wave with low amplitude 1 and a second sound wave with high amplitude 2.
  • a bladder 3 that is sonicated remains intact. A scatter signal is generated.
  • the bladder 4 is destroyed when a sound wave with high amplitude is irradiated, a SAE signal being generated.
  • SAE signals of various bubbles can be detected according to US 5,425,366 A, US 6,186,951 B1 and DE 198 13 174 A1 using color Doppler mode.
  • SAE signals can also be displayed independently of the movement of the bubbles with other ultrasound device modes, which were originally developed primarily to represent movement.
  • the spectral Doppler, power Doppler, color Doppler and harmony method (2nd, sub, wideband, pulse inversion, ultraharmonic, color Doppler, harmonic power Doppler method) are mentioned as examples.
  • the SAE signal strength is so high that even individual bubbles can be detected.
  • the individual SAE signal is shown on the monitor considerably larger (diameter approx. 0.5 - 1 mm depending on the device, transducer and settings) than it corresponds to the actual size of the undestroyed bladder ( ⁇ 10 ⁇ m). 2 shows the size of SAE signals in the sectional view.
  • the layer thickness of a single image is approximately 1 mm, depending on the device setting. This is illustrated in Figure 3.
  • the layer thickness of a conventional sectional image can be seen there.
  • a bladder concentration of approx. 2,000-3,000 blisters / ml tissue / blood leads to a complete SAE contrast in the sonographic cross-section.
  • the saturation bubble concentration is determined by the layer thickness of the ultrasound sectional image (shown by way of example in FIG. 3) and by the size of an SAE signal shown in the ultrasonic sectional image when a single bubble is destroyed (several individual bubbles are shown in FIG. 2).
  • a low saturation concentration / saturation bladder concentration can be advantageous for qualitative imaging, since in particular, even at low bladder concentrations, a complete contrast is created in the sectional image.
  • a low saturation concentration / saturation bubble concentration is disadvantageous for the quantification of bodies, since even small concentrations of bodies, in particular bubbles, lead to contrast saturation in the image and their concentrations above the saturation concentration in the image are no longer absolute determine or no longer distinguish bodies, especially bubbles.
  • the saturation concentration / saturation bladder concentration is usually exceeded because the enriching tissue or the enriching structures are so dense, that the bodies accumulate there in a concentration above the saturation concentration / saturation bubble concentration.
  • the saturation concentration / saturation bladder concentration in the target area could also be undercut here, but the enriched number of bodies, in particular bubbles, would be in an unknown ratio to the maximum saturation. Such a measurement would therefore neither be reproducible nor would it provide a value that correlates with the number of enrichment factors present there. Therefore, a method for determining the number of bodies (number of bubbles) above the saturation concentration / saturation bubble concentration is desirable.
  • Bodies in particular bladders, can accumulate non-specifically or specifically on or in cells, tissues, organs or other structures, for example.
  • This enrichment mechanism is often referred to in the literature as passive or active targeting (Lanza, G., Wickline, S .: “Targeted ultrasonic contrast agents for molecular imaging and therapy”.
  • Dayton, PA, Ferrara, KW “Targeted imaging using ultrasound”. J. Magn. Reson. Imaging, 2002, 16: 362-377).
  • phagocytosis of bodies / bladders in organs of the reticuloendothe- lial system (RES) or in other cells which e.g. disease-related, such as in tumor-associated macrophages or macrophages in atherosclerotic processes, or tumor cells themselves or cells that are stimulated to phagocytosis, e.g. Endothelial cells of the RES.
  • RES reticuloendothe- lial system
  • Liver with certain diseases of the liver b) by adhesion or by slowly rolling bodies / blisters along, for example on the vascular endothelium; c) by immigration of bodies / blisters in or by fenestrations, eg of the endothelium, in "vascular cul-de-sacs" or "blind” blood vessels; this can occur in the transition area to necrosis, in the case of severely edematous or inflammatory processes, hemorrhages, hematomas or bulges of the vascular system, such as aneurysms, vascular tumors, such as hemangiomas, or by washing into necrosis; d) by transporting phagocytized or adherent bodies / bladders, which are phagocytosed, for example, by monocytes or adhered to cells of the blood, such as leukocytes, through endothelial barriers, such as the blood-brain barrier, to pathological areas, for example.
  • a specific enrichment of bodies, in particular bubbles can be achieved by a covalent or non-covalent, including an electrostatic bond, hydrogen bond or Van der Waais bond, to physiological or pathophysiological structures.
  • the bodies, in particular bubbles carry target-specific binding molecules on their surface in these cases.
  • 3D-Echotech, Halbergmoos, Germany has also attempted to satisfy the need for the quantifiability of bubbles with an ultrasound device for the quantification of bubble signals in the blood.
  • the video image of the ultrasound device is digitized, broken down into color and gray values and optionally evaluated according to the average brightness value or the number of screen pixels within a defined measurement window (ROI).
  • ROI measurement window
  • the field of application of this measuring system is to quantify the blistering in blood vessels based on the brightness values within a definable ROI.
  • this method is also unsuitable for quantifying the bubbles above a concentration of approx. 3,000 particles or bubbles / ml. Even below this concentration, a reproducible measurement is not possible with this device.
  • a disadvantage of the known methods and devices is that it is not possible to display small structures, since the sound lobes emanating from a transducer have minimum dimensions that limit the resolution. For example, the thickness of the measuring layer detected by the sound waves is approximately 1 mm, so that finer structures can no longer be resolved.
  • the cell cultures are generally immortalized cells (which can be expanded in vitro indefinitely by special manipulation) and cannot reflect the real Vo ratios.
  • Another very common method of identifying molecular markers is by immunohistochemical examination of tissues. Tissues of special interest, for example tumors, are histologically processed after their removal and immunohistologically specifically examined for the expression of one or more molecular markers. Only after histological identification of such markers can they be imaged later in vivo by using appropriate antibodies which are coupled to corresponding signal generators.
  • the present invention is therefore based on the object of finding a method and a device for the quantification of bodies in an examination object, with which the concentration of the bodies can be determined in vivo, ex vivo and in vitro above the saturation bubble concentration is possible.
  • the drive and the device should be able to reproducibly quantify body quantities and determine their concentration.
  • the object is achieved by the device for quantifying bodies contained in an examination object according to claim 1, their use for ultrasound diagnosis and / or ultrasound therapy on humans or animals according to claim 10, their use for in-vivo and ex-v / Vo mapping of molecular markers in organs and tissues and in w ' fro mapping of cells for the characterization of cell cultures according to claim 11 and the method for quantifying bubbles contained in a test object according to claim 12 solved.
  • Preferred embodiments of the invention are specified in the subclaims.
  • Fig. 7 Multi-element transducer with defined overlapping sound fields (2D array)
  • a: SAE layer thickness 10 ⁇ m to 100 ⁇ m
  • Sectional image 15 displacement distance 100 ⁇ m
  • Fig. 10 Dependence of the MU CO rr. on the SAE layer thickness (agar phantom, example 1)
  • Fig. 11 Dependence of the SAE CO rr. on the SAE layer thickness (agar phantom, example 1)
  • Bodies in the sense of the present application are solid particles and / or bubbles with a diameter ⁇ 10 ⁇ m.
  • Solid particles contain at least one surface-active substance (e.g. surfactant), at least one carbohydrate, protein, lipid and / or natural and / or synthetic polymer.
  • Bubbles in the sense of the present application are gas-containing phases with a diameter ⁇ 10 ⁇ m, which are either free or coated.
  • the phases can be substantially spherical.
  • the envelope can contain at least one surface-active substance (eg surfactant), at least one protein, lipid and / or natural and / or synthetic polymer.
  • Bubbles according to the present application can also, for example, gas-filled microcapsules, gas-filled microparticles, gas-filled microspheres, microballoons and surfactant-stabilized microbubbles.
  • Ultrasound contrast media are agents that contain bodies, in particular bladders, for use in ultrasound diagnostics and / or therapy.
  • An independent, characteristic signal is an echo signal of a body, in particular a bladder, which is independent of the scatter signal.
  • This also includes all non-linear signals such as 2nd harmonic, subharmonic or ultra-harmonic, as well as in particular SAE signals, such as those which arise when bubbles are destroyed in the ultrasound field.
  • Bubbles preferred according to the invention can be destroyed under certain conditions when excited with ultrasound. This creates an independent signal that deviates from the transmission signal and is independent of the scattering and movement of the bubbles. This independent, characteristic signal is called stimulated acoustic emission (SAE) (synonym: Loss of Correlation (LOC)).
  • SAE stimulated acoustic emission
  • LOC Loss of Correlation
  • the saturation concentration / saturation bubble concentration is the concentration of bodies / bubbles per milliliter of object under examination, e.g. tissue or blood, above which the independent, characteristic signals, in particular the SAE signals, are superimposed within a sound field and above which one It is impossible to quantify the bubbles because the number of bodies / bubbles can no longer be inferred from the sum of the CS signals, even when using arithmetic correction formulas.
  • CS / SAE layer thickness is the concentration of bodies / bubbles per milliliter of object under examination, e.g. tissue or blood, above which the independent, characteristic signals, in particular the SAE signals, are superimposed within a sound field and above which one It is impossible to quantify the bubbles because the number of bodies / bubbles can no longer be inferred from the sum of the CS signals, even when using arithmetic correction formulas.
  • the CS / SAE layer thickness is equal to the displacement distance per ultrasound sectional image. This layer thickness is preferably significantly less than the cut layer.
  • the cut layer is created in the examination object by irradiation of a sound lobe (sound field).
  • piezo crystal elements emit sound pulses which are coupled and focused into the medium to be sonicated by suitable means.
  • a cut layer can be gradually moved away from the sound lobe and the corresponding image can be generated by the sound signals arriving at the receiver.
  • the layer thickness is defined by the feed between two images.
  • Morphometric units are a measure of the area, corresponding to a section layer, expressed in the number of screen pixels that the CS signals represented in the video image occupy.
  • the screen pixels are usually counted automatically by video densitometry. If the number of screen pixels of an individual CS signal is known, the number of bodies / number of bubbles can be concluded from the morphometric units.
  • Corrected SAE SAE CO rr.
  • corrected MU MU corr .
  • CS signals can be superimposed in the video image.
  • the probability of such a superimposition increases with increasing concentration of bodies / bubbles and layer thickness of the ultrasound sectional image, because in this case a larger number of bodies / bubbles is detected. Both parameters have a direct influence on the percentage color area of the CS signals in the video image. If the bodies / bubbles are randomly distributed in the examined volume, the value of MU can be corrected if CS signals are superimposed as long as there is no complete color saturation in the ROI:
  • FP color screen pixels that lie within the measurement window (ROI) in the area of the CS effects shown
  • MU FP within the measurement window (ROI)
  • GP Screen gray pixels that are within the measurement window (ROI) but outside the CS effects shown.
  • the corrected MU (MU cor r.) Can be converted into a the number of CS signals (SAE cor r.) are converted:
  • a 2D array consists of a one-dimensional row of piezo elements.
  • a 3D array consists of several adjacent rows of piezo elements.
  • a transducer 23 is shown schematically. The directions in relation to the transducer are defined as follows:
  • x transverse to the transducer (reference number 24: 2D array)
  • y lateral (reference number 25)
  • z axial (direction of sound propagation) (reference number 26)
  • Intra-, inter- and / or extracellular molecular structures for example receptors, ligands, enzymes or their structural components.
  • the device according to the invention and the method according to the invention serve to quantify bodies, preferably bubbles, contained in an examination object.
  • the device comprises at least one transducer for emitting an ultrasound field, which excites the bodies contained in a layer in the examination object, preferably bubbles, for emitting characteristic ultrasound signals. At least one of the transducers is also used to receive the characteristic signals.
  • at least one data processing system for determining the number of bodies, preferably bubbles is provided in the layer from the characteristic signals.
  • the ultrasound field after excitation of the bodies preferably bubbles
  • the ultrasound field after excitation of the bodies can be displaced in a first layer in the examination object such that bodies / bubbles can be excited in a second layer after the displacement, the first layer and the overlap second layer and are shifted parallel and defined against each other.
  • Ultrasound signal data records are thus obtained from different cut layers in the examination object, which contain information about the presence of bodies / bubbles in the individual cut layers, in particular about the spatial arrangement of the bubbles in the cut layers.
  • the layers are preferably shifted against one another in such a way that they overlap in the transverse direction (x direction) to the rows of piezocrystals.
  • the transducer can either be designed to emit ultrasound signals as well as to receive the signals originating from the bodies, preferably bubbles. Alternatively, the transducer can also be designed exclusively for emitting the ultrasound signals. In this case, a further receiving head is required to detect the incoming ultrasound signals from the bodies, preferably bubbles.
  • bodies / bubbles contained in a layer are excited with an ultrasound field to produce characteristic ultrasound signals.
  • the characteristic ultrasound signals emitted by the bodies / bubbles are received, and the number of bodies / bubbles is determined from the received ultrasound signals, in each case by the Displacement of the ultrasound field after excitation of bodies / bubbles in a first layer in the examination object bodies / bubbles in a second layer overlapping the first layer and excited in a defined and defined manner against this shifted layer.
  • the device according to the invention and the method according to the invention are not limited to embodiments using imaging or the video image.
  • the CS signals within a region of interest (ROI) can also already be counted on the basis of the received signals (radio frequency (RF) data), although the concentration of saturation bubbles when the CS signals are counted at the level of the received signals from the Can distinguish saturation bubble concentration when counting the CS signals in the two-dimensional ultrasound image.
  • the device according to the invention and the counting of the received signals can be integrated into an ultrasound device.
  • the device and the method according to the invention determine concentrations of bodies, preferably bubbles, which are above a limit which is in the range from 1000 to 3000 bodies (bubbles Vml:
  • the spatial resolution in the x direction or x and y direction (in a plane perpendicular to the sound lobe) when using a single-crystal ultrasound transducer with a round cross section is in the mm range in these cases.
  • the thickness of the Sound field at the narrowest point in the sound beam emitted by the transducer in the mm range is approximately 1 mm 3 . If a body, preferably a bubble, in this volume is destroyed by ultrasound, the exact spatial position of the corresponding CS signal within this volume cannot be determined exactly. Consequently, this signal is shown in the image in a size that is also in the millimeter range.
  • the present invention enables a significantly higher spatial resolution than with known methods and devices.
  • calculable volumes are used. This makes it possible for the first time to quantify bodies, preferably bubbles, in an examination volume even if the saturation concentration / saturation bubble concentration would normally be exceeded.
  • the Kretztechnik device is also unsuitable for quantification, since the overlap of the sound fields in the axial direction (z) is not uniform. In the close range, several adjacent sound fields overlap almost completely, while gaps arise with increasing distance from the transducer, which are then interpolated. As a result, the signal yield in an examined tissue also depends on the distance to the transducer. The aforementioned object is only achieved by the present invention.
  • the principle of the method according to the invention can also be used for such bodies, preferably bubbles, which can be excited with diagnostic ultrasound to form an independent and characteristic signal independent of destruction.
  • a signal can be, for example, a harmonic or subharmonic signal.
  • no independent, characteristic signals of solid particles can be detected after excitation; This can be achieved, for example, by starting the scan at a position that is free of particles, or by moving the transducer out of an area in which independent, characteristic signals of solid particles can be detected after excitation, before the scan begins. is moved to an adjacent area, in which this is not the case, b) in the subsequent images / layers, the solid particles become like this stimulated that they produce an independent, characteristic signal, c) as long as the cumulative scan distance is less than or equal to the layer thickness of the sound field, the newly added signals are determined in each image / layer.
  • the determination of the newly added signals can be determined by subtracting the respective pre-value or by simple, preferably automatic counting of the signals after sending a destruction pulse.
  • the number of signals in the overlap area can generally be determined by simple, preferably automatic, counting, as in the case of SAE signals.
  • the sectional images overlap by 99%.
  • the second sectional image only the newly added bodies, preferably bubbles, that are in the 10 ⁇ m layer are detected.
  • the distance of the shift between two images is at least 5 ⁇ m, preferably at least 10 ⁇ m and particularly preferably at least 20 ⁇ m. In a very particularly preferred embodiment, the displacement distance is at least 50 ⁇ m.
  • the shift distance is smaller than the scan thickness (approx. 1 - 2 mm).
  • the optimal distance shift depends on the highest body concentration / ml, preferably bladder concentration / ml in the scanned volume. It is advantageous to set an overlap of the volumes between 20% and 99.99%, preferably between 40% and 99.9% and particularly preferably between 70% and 99%. If the displacement distance is chosen too large or the ultrasound sectional images do not overlap at all (FIG. 5a), absolute quantification is also not possible with the method according to the invention, since there is an uncorrectable superposition of the CS signals in the ultrasonic sectional image.
  • the displacement distance can be chosen to be too large, for example, or the ultrasound sectional images may not overlap if the degree of accumulation of the body, preferably bubbles, is underestimated. In these cases, the displacement distance per ultrasound sectional image must be reduced in order to ensure absolute quantifiability.
  • 9 to 11 show the relationship between the displacement distance and the morphometric units (MU) or the number of independent, characteristic signals in the sectional image.
  • the concentration of bodies, preferably bubbles, is preferably determined at those CS / SAE layer thicknesses whose sectional images each have 20 to 80%, preferably 30 to 70%, color saturation. In favor of a reduced examination time, however, the displacement distance can be increased as long as the saturation bubble concentration is not reached in any sectional image.
  • a defined program that varies the CS / SAE layer thickness can ensure an optimal compromise between the examination time and the accuracy of the measurement.
  • the optimal displacement distance controlled by the program can be determined, for example, on the basis of a sufficiently large population of patients (examination objects).
  • the standardized scan process with a defined parallel shift of the sound fields and the higher spatial resolution of the method according to the invention enable a reproduced measurement.
  • Such a measurement can be sufficient, for example, for a comparison between different patients or for a therapy course check for the same patient. If not all bubbles are destroyed in a sectional view, you can also send one or more further destruction pulses before moving to the next position.
  • the overlap and displacement of the volumes of the cut layers can be achieved by displacing the transducer and the examination object against one another (relative to one another).
  • the defined parallel shift can be achieved by
  • the tissue or the examination object for example a patient, is shifted relative to a fixed transducer or
  • the transducer is moved relative to the fixed examination object to be examined, for example a tissue, or III.
  • a transducer is used, which is able to create overlapping and shifted sectional images one after the other, i.e. the volumes are shifted and overlapped with a transducer, which itself takes overlapping and parallel shifted ultrasound images;
  • the transducer can be controlled in such a way that overlapping and in particular transversely shifted ultrasound sectional images or sound lobes
  • Cut layer are included.
  • the examination object (patient, animal, an eccentric or isolated organ or a cell culture dish) is automatically moved past the fixed transducer (e.g. driven by a servo motor or DC motor).
  • the fixed transducer e.g. driven by a servo motor or DC motor.
  • the transducer is automatically moved over / opposite the examination object (patient, animal, an eccentric or isolated organ or a cell culture dish) with the help of a special device.
  • the device can be a frame within which the transducer is fixed in a holder and is moved by a motor drive along a parallel guide.
  • a single crystal can be shifted in the x and y directions with defined overlap areas.
  • This variant offers e.g. for culture dishes of cells on the surface of which bodies, in particular bladders, have accumulated specifically or inside which have become nonspecific, for example by phagocytosis. Here it is sufficient to state how many bodies, in particular bubbles, per area or volume have accumulated. The data does not have to be converted into pictures.
  • adjacent sound lobes can be brought to overlap within a line in the transverse direction in a defined manner with a transducer containing a 2D array.
  • the transducer can also contain a 2D array, which is moved within the transducer in parallel with a defined overlap in the transverse direction (x direction).
  • the lateral resolution can be increased within a 2D sectional image if the individual scan lines from which the sectional image is constructed also overlap in a defined manner.
  • the individual sound fields which are each generated by a group of neighboring piezo elements, are overlapped more strongly and above all by selecting small increments (down to a piezo element).
  • a sound wave in the form of a sound lobe 9 is emitted into the examination object.
  • Undestroyed bubbles 8 located within the sound lobe are destroyed and thereby emit independent, characteristic signals 9.
  • the destroyed bubbles are identified by the reference number 10.
  • a newly formed group of piezo elements of the array is excited to vibrate, which differs from the group used in the first excitation by only one piezo element by which the group is now offset (FIG. 7b). Due to the overlap of the resulting sound lobe with the previously emitted sound lobe, only the newly detected bubbles are excited into independent, characteristic signals.
  • the resolution increases by the factor in which the displacement is related to the width of the piezo element group.
  • At least one motor drive is therefore provided for displacing the examination object or the at least one transducer relative to one another.
  • the transducer If the transducer is to be moved relative to the examination object, it must be moved in a defined way.
  • a movable holder for the transducer is provided.
  • the examination object is fixed in a holding device.
  • the object is held practically motionless by the holding device.
  • a patient can be placed on a couch on which the patient rests during the examination.
  • Such holding devices can be used for holding the examination object both when it is not moved during the examination, but only the transducer, and when the examination object is moved and the transducer is not.
  • the above-mentioned holding devices can also be used for the examination object in the event that both the transducer and the examination object are moved against one another at the same time.
  • an image evaluation system for data processing and image display is provided in a preferred embodiment, with which the quantification can be carried out by video densitometry.
  • the data sets formed from the ultrasound signal sets can be reshaped in a known manner in such a way that a video image of the individual cut layers is created, each cut layer containing the information from the areas which do not overlap with a previously excited cut layer (new cut layer area (CS / SAE-layer)).
  • the bodies represented in the individual video images, in particular bubbles can then be counted manually or obtained by video-densitometric determination of the color image points (color pixels) and division of the value obtained therefrom by the average number of color pixels per bubble representation.
  • FP are the color pixels representing the body, in particular bubble signals, in a locally resolved screen representation within the overlap layer and GP are screen gray pixels in a locally resolved screen representation, which are not the pixels representing the body, in particular bubbles.
  • the device according to the invention is particularly suitable for ultrasound diagnosis and / or therapy on humans or animals. Not only in the areas of clinical diagnostics, but also in basic medical and biological research and pre-clinical research and development, new possibilities of investigation open up:
  • the bodies preferably bubbles, can be tested in vivo in animal experiments, ex vivo in harvested organs or tissues and in vitro e.g. be quantified in cell cultures in order to clarify pathological or physiological processes at the molecular level.
  • the method according to the invention can be used to test which binding systems work at all, which binding molecules are present under which conditions at which locations and in what quantity, which influencing variables determine the binding capacity and accumulation, what kinetics the body, preferably bubbles, or , in the case of ultrasound-induced active ingredient release, what amounts of an encapsulated active ingredient are released.
  • the device according to the invention and the method according to the invention can be used, for example, for the / nv / Vo mapping of physiologically high or low regulatable molecular markers in organs and tissues from postembryonic ontogenesis (ontogenesis: total development of an individual from the unfertilized / fertilized egg cell to to natural death: this comprises four phases: 1. embryonic development, 2. postembryonic development, 3. time of sexual maturity and reproduction and 4. time of aging).
  • both passively and actively accumulative bodies preferably bubbles
  • the bodies can be provided with binding molecules specific for the markers that are located on the surface (actively accumulable bodies / bubbles).
  • passively accumulative bodies can also be used, i.e. Bodies / bubbles without such specific binding molecules.
  • molecular markers can be localized in vivo on different cells in humans and animals and their influence on ontogenesis can be determined. Furthermore, a time-controlled mapping of known and newly identified molecular markers in the whole organism can be carried out in vivo. This enables a previously unknown function of the molecular marker in ontogenesis to be determined in vivo.
  • the spatially high-resolution sonography according to the invention can be used to investigate the signs of aging from which these molecular markers originate and which they can lead to, furthermore what basis these receptors represent for age-related changes or diseases of the whole organism and whether there are any findings for development be derived from medications that alleviate age-related complaints or even help to avoid them.
  • a / n-wVo mapping of pathologically high or low regulatable molecular markers in organs and tissues during pathogenesis can also be carried out using passively and actively accumulative bodies, in particular bladders ,
  • disease-associated molecular markers can be localized in vivo on different cells in humans and animals and therefore their influence on the pathogenesis of diseases in vivo can be determined.
  • a time-controlled mapping of known and newly identified disease-associated molecular markers in the whole organism can be carried out in vivo during the pathogenesis.
  • a function of the molecular markers in pathogenesis in vivo which has not yet been known can be determined.
  • new therapeutic drugs and / or treatment strategies can be derived from this knowledge by the fact that the determined surface states of cells (status of the cells with regard to the ac- tivierung / the rest state) regulated and these states are tracked with the inventive method.
  • the above methods can also be performed ex vivo on harvested organs and tissues.
  • mapping of the molecular markers in the organs and tissues from postembryonic ontogeny and during pathogenesis can of course be applied to various animal species and / or animal models, in particular in gerontology or for disease models.
  • the mapping can generally also be used for all animal species, for example agricultural livestock, domestic and domestic animals and wild animals, and for humans. Since mapping can be used in vivo, there is often no need for time-consuming and financially expensive conventional in-house processes, for example immunohistochemistry, which often have the additional disadvantage of having to identify and identify molecular markers at exactly one point in time to characterize.
  • the device according to the invention and the method according to the invention can also be used for the characterization of cell cultures by ro-mapping of molecular markers of cells of different origin that can be regulated up and down, for example under different cultivation conditions or for characterizing new cell lines or for re-characterizing existing ones Cell lines after different passages or immediately before their application, especially when implanting tumor cells in mice, rats and other animal models.
  • plant cells can also be characterized in addition to animal and human cells.
  • the bodies preferably bubbles
  • the bodies can be provided with binding molecules specific for the markers.
  • binding molecules specific for the markers.
  • a therapy progress check e.g. in chemotherapy
  • the bodies in particular bubbles, are usually contained in ultrasound contrast media and are preferably applied in the form of suspensions.
  • Bubbles with functionalized polyalkyl cyanoacrylates which are produced according to the process described in WO 01/68150 A1, are particularly preferred. The method described there is therefore expressly included in the disclosure content of the present application.
  • the polymers described in WO 01/68150 A1 are used to produce the bubbles preferred according to the invention. Therefore, these starting materials for producing the bubbles are expressly included in the disclosure content of the present application.
  • the method according to the invention can also be used for ultrasound contrast media which contain different types of body, preferably types of bubbles.
  • - type of shell of a body / bladder e.g. Material thickness, elasticity ,.
  • such bubble mixtures or their distribution patterns in the examination object can also be quantified with high spatial resolution using the method according to the invention, a) by sending different pulse shapes in succession at a position and / or receiving different characteristic signals; if the bubbles are not completely destroyed, a destruction pulse can be sent before moving to the next position; or, b) by the area to be examined being scanned several times with a correspondingly defined displacement, each scan being carried out with a different pulse shape required for the respective bubble type.
  • the bubbles differ simultaneously in the binding molecule on the surface and in their destructibility by sound, the following can be used to determine the in-vivo, ex-vivo and in-v / fro distribution of the binding sites in the examination region:
  • Bubble type A destructible with low sound pressure and with binding molecule
  • the saturation bubble concentration is increased by the factor in which the distance covered between two images or sound lobes is related to the layer thickness of the entire sound field. With a 10 ⁇ m shift and a layer thickness of 1 mm, the saturation bubble concentration increases by a factor of 100. At the same time, the layer thickness of the tissue from which the newly added bubbles originate is reduced by the same factor.
  • Histological resolution can be achieved in this way. Since this principle can also be used in vivo, one can speak of an “in wVo sono histology” or, in the case of a specific bladder accumulation, a sonographic “/ ⁇ -Vo immunohistology” with regard to the signals shown.
  • the measured MU can be evaluated for diagnosis as follows, for example:
  • Layer thickness and / or dose in a special measurement window (liver, tumor surface, vascular endothelium, etc.) based on the largest possible population.
  • the population can consist of individuals who do not differ in the distribution and the degree of enrichment of the bubbles in the measurement window, i.e. which is homogeneous or which is grouped in this regard. These dependencies generally have to be determined with various ultrasound device settings (transducer, detection mode, etc.).
  • Fig. 14 Dependence of the MU on the SAE layer thickness
  • Rat 1 (Example 2): 1 * 10 8 bubbles / ml; Ex vivo measurement, 30 min.
  • Rat 1 (Example 2): 1 * 10 8 bubbles / ml; Ex vivo measurement, 30 min.
  • Fig. 16 Dependence of the SAE CO r r on the SAE layer thickness rat 1 (example 2): 1 * 10 8 biases / ml; Ex vivo measurement, 30 min.
  • Fig. 17 Dependence of the MU on the SAE layer thickness
  • Rat 2 (Example 2): 1 * 10 7 bubbles / ml; Ex vivo measurement, 30 min.
  • Fig. 18 Dependence of the MU corr on the SAE layer thickness
  • Rat 2 (Example 2): 1 * 10 7 bubbles / ml; Ex vivo measurement, 30 min.
  • Rat 2 (Example 2): 1 * 10 7 bubbles / ml; Ex vivo measurement, 30 min.
  • Example 21 Color signals of the specific bubbles enriched in the tumor (four mice, example 3) in comparison to the isotype control (four mice, example 3).
  • Example 1 Color signals of the specific bubbles enriched in the tumor (four mice, example 3) in comparison to the isotype control (four mice, example 3).
  • Example 1 Color signals of the specific bubbles enriched in the tumor (four mice, example 3) in comparison to the isotype control (four mice, example 3).
  • the bubbles are made according to Example 4 (a).
  • the bubble concentration was adjusted to 6 * 10 8 bubbles / ml with 0.02% (m / m) Triton X 100 solution. Thereof were carefully stirred without introduction of air bubbles into the solution Agarlö- 33 ul (* 10 7 bubbles 2). The agar solution was then placed in a glass bowl
  • a transducer (L 10-5, ATL UM9, color Doppler mode, MI: 1, 1, persistence: 0, priority: maximum, size of the color box: maximum, depth of penetration: 3 cm, focus: 2 cm) was with a Tripod mounted vertically above the phantom so that it dipped into the water.
  • the pelvis was made together with the phantom 1. moved by hand in the transverse direction under the transducer at a speed of approx. 2 cm / s, which corresponded to a displacement distance of approx. 1 mm / frame, or
  • the video images were digitized at a sample rate corresponding to the frame rate given by the ultrasound device (here 5.8 frames / second) (QuantiCon).
  • a trigger delay of 172 ms 1000 ms / 5.8 was previously entered in QuantiCon.
  • FIG. 8 shows the 3D view of the scanned agar phantom as it was generated from the 3D data set in Quanticon the number of pixels of the gray values as well as the number of pixels of the segmented color values of all images in the data set were exported and further processed with MS-Excel ® (Microsoft).
  • MS-Excel ® MS-Excel ®
  • FIG. 9 The graphic of the segmented color values (MU) created in MS Excel is shown in FIG. 9 as a function of the SAE layer thickness. Each individual color value was corrected in accordance with the correction formula defined under “corrected MU”. The resulting dependence on the SAE layer thickness is shown in FIG. 10 (MU corr .).
  • the conversion factor F sae was first determined.
  • the sum of the SAE signals was first determined by counting by hand in 20 sectional images.
  • the sum of the segmented color pixels was then divided by the sum of the SAE effects counted by hand in the corresponding images.
  • An average of 44 color pixels per SAE signal was determined.
  • Table 1 The data on which FIGS. 9 to 11 are based are listed in Table 1: Table 1:
  • the curve range between 30 and 70 ⁇ m SAE layer thickness ( ⁇ 37 - 81% color saturation gung) can be described with a linear correlation function. Correlation coefficients are 0.990 for the uncorrected MU and 0.996 for the corrected MU / SAE.
  • the method according to the invention enables bubble quantification even with bubble concentrations greater than 3,000 bubbles / ml.
  • the saturation bubble concentration increases in the ratio in which the actual layer thickness of the sound field relates to the displacement distance or to the SAE layer thickness.
  • a 10 ⁇ m shift from image to image simultaneously increases the spatial resolution and the saturation bubble concentration by a factor of 100 with a layer thickness of the sound field of 1 mm.
  • rat 1 Two two rats (Wistar SCHOE, 220g, female) were examined. The rats were injected iv with various doses of the bladder suspension prepared according to a) via the tail vein. For rat 1 a dilution to 1 * 10 8 bubbles / ml, for rat 2 to 1 * 10 7 bubbles / ml in 0.9% (m / m) NaCl solution containing 0.02% (m / m ) Triton X 100.
  • Rat 1 1 * 10 8 bubbles / kg (1 * 10 8 bubbles / ml, 220 ⁇ l iv)
  • Rat 2 1 * 10 7 bubbles / kg (1 * 10 7 bubbles / ml, 220 ⁇ l iv)
  • the rats were injected i.p. Injection of 1 ml of a 1: 1 volume mixture of Rompun 2% (20 mg xylazine / ml) and Ketavet 100 mg / ml (100 mg ketamine base / ml) killed:
  • the right lobe of the liver was removed and placed in a vessel filled with 0.9% (m / m) sodium chloride solution.
  • the vessels with the liver lobes were:
  • Rat 1 (1 * 10 8 bubbles / kg): 15, 20, 30 ⁇ m / frame
  • Rat 2 (1 * 10 7 bubbles / kg): 20, 40, 80, 120 ⁇ m / frame
  • the ultrasound examination was carried out analogously to Example 1 with the same device settings.
  • the liver was moved past the transducer at a distance of 2 cm.
  • the same ROI was used for all measurements.
  • the size of the ROI (approx. 2 mm * 6 mm, measured on the scale of the ultrasound device) was chosen so that the ROI was completely in the area of the liver tissue for all evaluated images.
  • the same magnification was selected in Quanticon ® for all measurements.
  • a square ROI of 2 mm edge length (determined using the length measurement scale shown in the ultrasound image) was measured in the ultrasound image. For this purpose, the image was enlarged accordingly using the zoom function available in Quanticon ® . The pixel sum in this ROI (MU) was 225. From this, a ratio of Embedding 56.25 pixels / mm 2 (225/4) could be calculated. The bladder concentration / ml liver was then calculated from the measured volume (area of the ROI x displacement distance / frame). The following formula was used to convert the raw data (FP, GP, S) into the bladder concentration C in the tissue:
  • FP Screen pixels that lie within the measurement window (ROI) in the area of the SAE effects shown.
  • GP Screen pixels that lie within the measurement window (ROI) outside of the SAE effects shown.
  • ⁇ sae Sum of the SAE signals shown in an ultrasound image
  • F f sum of all screen pixels in mm 2 (measured using the length scale shown in the ultrasound image)
  • Tab. 2 also contains the mean values of the percentage color saturation for the respective SAE layer thickness.
  • the number of bubbles is in a linear relationship to the SAE layer thickness.
  • the method according to the invention can also be used in removed organs in which bubbles accumulate non-specifically. There is a close correlation between the number of SAE signals shown in the sectional view and the corresponding SAE layer thickness.
  • the bladder concentration in the livers of the rats examined differs significantly depending on the dose applied.
  • Example 4 (f) The specific bubbles were prepared and characterized according to Example 4 (a) to (e).
  • the antibody coupling was carried out according to Example 4 (f).
  • the isotype control bubbles were prepared and characterized according to Example 4 (a) to (e).
  • the isotype coupling was carried out according to Example 4 (g).
  • mice were given an ultrasound contrast agent, containing specific bubbles (produced and characterized according to Example 4 (a) to (e) and antibody coupling according to Example 4 (f)), in the waking state iv in a dose of 1 * 10 9 bubbles / kg body weight injected (corresponded to 200 ⁇ l of the suspension according to Example 4 (g) each 20 g mouse).
  • the specific bubbles were gas-filled microcapsules, the shell of which consisted of functionalized polybutyl cyanoacrylate and to whose surface anti-CD105 antibodies were coupled.
  • mice As a control substance, four further mice were injected in the same way with an ultrasound contrast agent containing non-specific bubbles (produced and characterized according to Example 4 (a) to (e) and isotype coupling according to Example 4 (g)).
  • the non-specific bubbles were gas-filled microcapsules, the shell of which also consisted of functionalized polybutyl cyanoacrylate, but to the surface of which IgG 2a (isotype control) was coupled.
  • the tumors of all animals were examined 60 minutes after application of the respective ultrasound contrast agent with regard to the degree of enrichment using the method according to Example 1.
  • mice were treated with a 1: 1 volume mixture of a dilution (1 + 9) of Rompun ® 2% (20 mg xylazine / ml) and a dilution (1 + 4) of Ketavet ® 100 mg / ml (100 mg Ketamine base / ml) anesthetized in physiological NaCl solution. 200 ⁇ l each of 20 g of mouse were injected ip from this anesthetic mixture.
  • the mouse was attached to a carrier that was attached to the moving part of a servo motor (Limes 150, OWIS GmbH, motor controller DC 500) with adhesive tape.
  • the servo motor was adjusted vertically with a tripod so that the carrier reached into a water basin (cut, square plastic bottle) with the mouse.
  • the pool was washed with fresh water at a temperature of 37 ° C crowded.
  • a transducer (L 10-5, ATL UM9) was provided with coupling gel and placed horizontally on the side wall of the pool with a tripod. The mouse was moved so far into the pelvis under visual and sonographic control that the tumor had not yet reached the sound field.
  • the transducer was switched on again and the animal was scanned again with the same device settings and the same SAE layer thickness a second scan was needed to identify color signals that were not caused by SAE signals and served as a control value, such signals could have been caused by flowing blood or larger air bubbles.
  • the animal's respiratory rate was generally low enough to be able to perform a scan of approx. 3 cm with the SAE layer thickness used here within one pause without movement artifacts (Fig. 20b).
  • breathing artifacts could be avoided as follows:
  • FIG. 20b A sectional image was generated in the scan direction (FIG. 20b) and this was superimposed on the same scale with the corresponding graphic of the measured values (FIG. 20a).
  • the sum of the colored screen pixels within the tumor was evaluated with Quanticon® (3D-Echotech). Only the color signals in the tumor (MUFP: 20) and not the gray signals (MUGP: 21) were taken into account for the evaluation.
  • Lines 16 and 17 drawn in FIGS. 20a / b delimit the tumor area during the first scan. The area of the second scan is shown between lines 18-19.
  • Reference number 20 color signals (MUFP), reference number 21: gray signals (MUGP), reference number 22: sum of MUFP and MU G p, or the measured tissue volume.
  • MUFP color signals
  • MUGP gray signals
  • reference number 22 sum of MUFP and MU G p, or the measured tissue volume.
  • the method according to the invention is also suitable for the quantification of specifically enriched bubbles in the living organism.
  • a significant difference can be detected even if scanning is not carried out with maximum spatial resolution and SAE saturation occurs in some areas of some sectional images.
  • the number of signals for a specific bladder accumulation can be distinguished from residual signals of the blood vessel system and / or signals of an unspecific bladder accumulation.
  • the particle size distribution of the microcapsule suspension according to Example 4 (a) was determined using a particle counter from Particle Sizing Systems, type AccuSizer 770 (measuring medium: aqueous 0.02% (m / m) Triton X100 solution).
  • the volume-weighted particle size distribution ranged from 0.8 to 10 ⁇ m with a maximum at 1.8 ⁇ m, and the microcapsule concentration was 7.2 * 10 9 ( ⁇ 1 * 10 8 ) particles per ml.
  • Example 4 2,500 g of a microcapsule suspension according to Example 4 (a) were mixed with stirring with 501 g of sodium hydroxide solution with a concentration of 8 * 10 "2 mol / l. In the reaction mixture the pH was 12. The mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. The pH was then adjusted to pH 3.5 with 1 N hydrochloric acid.
  • the particle size distribution of the microcapsule suspension according to Example 4 (c) was determined using a particle counter from Particle Sizing Systems, type AccuSizer 770 (measuring medium: aqueous 0.02% (m / m) Triton X100 solution).
  • the volume-weighted particle size distribution ranged from 0.8 to 10 ⁇ m with a maximum at 1.8 ⁇ m, and the microcapsule concentration was 6.0 * 10 9 ( ⁇ 1 * 10 8 ) particles per ml.
  • the mixture was then stirred for an hour with occasional pH control.
  • the mixture was stirred further at 4 ° C. overnight (approx. 17 h).
  • the suspension of gas-filled microbubbles according to Example 4 (a) to (d) to which streptavidin according to Example 4 (e) had been bound was treated with biotinylated anti-CD105 antibody (Rat Anti-Mouse CD105 / Endoglin, Biotin Conjugate, Southern Biotechnology Associates, Inc., Cat. No. 1860-08) in a ratio of 0.5 ⁇ g antibody to 1e6 microbubbles. After incubation, the suspension was diluted to 1e8 bubbles / ml with PBS buffer containing 0.02% (m / m) Triton x 100. The CD105 coupling and dilution was freshly made for each animal.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nonlinear Science (AREA)
  • Computer Networks & Wireless Communication (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)
  • Remote Sensing (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Radar, Positioning & Navigation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)

Abstract

Bei der Quantifizierung von Körpern, insbesondere Blasen bei der Ultraschalldiagnostik besteht das Problem, dass die Konzentration an Körpern, insbeosndere Blasen häufig so gross ist, dass die erhaltenen Bilddaten bezüglich der Darstellung gesättigt ist, so dass eine Quantifizierung unmöglich wird. Um dieses Problem zu lösen, wird vorgeschlagen, die in Schnittschichten eines Untersuchungsobjekts enthaltenen Körper mittels Ultraschall zunächst zu charakteristischen Signalen anzuregen und diese Signale aufzunehmen, aus den Signalen Datensätze zu bilden, die Datensätze in eine Abbildung der Körperanordnung im Untersuchungsobjekt umzuwandeln und daraus die Anzahl der Körper zu ermitteln, wobei mindestens zwei Ultraschallsignalsätze aus überlappenden Schnittschichten im Untersuchungsobjekt aufgenommen werden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Quantifizierung von Körpern mittels Ultraschall
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Quantifizierung von in einem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körpern, die durch diagnostischen Ultraschall zu eigenständigen, charakteristischen Signalen angeregt werden können, insbesondere solchen Signalen, die mit der Zerstörung eines Körpers, bevorzugt von Blasen einhergehen. Ferner betrifft die Erfindung auch eine Verwendung der Vorrichtung für die Ultraschalldiagnostik und/oder Therapie am Menschen oder am Tier und eine Verwendung der Vorrichtung und ein Verfahren für das in-vivo- und ex-vivo- Mapping von physiologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markem in Organen und Geweben ab der postembryonalen Ontogenese und von pathologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben während der Pathogenese und für die Charakterisierung von Zellkulturen durch in wϊro-Mapping von hoch und herunter regulierbaren molekularen Markern der Zellen.
Die Ultraschalldiagnostik hat einen festen Platz im klinischen Alltag gefunden. Details können in Ultraschallaufnahmen durch Injektion von Kontrastmitteln verbessert dargestellt werden, da hierdurch stärkere Ultraschallsignale erzeugt werden können. Als Kontrastmittel kommen alle sehr kleine Körper (Mikrokörper) in Frage, die ein detek- tierbares und vom Gewebesignal unterscheidbares Signal liefern, insbesondere gasgefüllte sehr kleine (Mikro)-Blasen. Diese Körper werden dem Untersuchungsobjekt zugeführt und können im Ultraschallfeld beispielsweise im Fall von Blasen unter bestimmten Bedingungen zerstört werden. Dabei senden diese Blasen eigenständige, charakteristische Ultraschallsignale aus. Werden die Blasen durch das Ultraschallfeld zerstört, so werden die eigenständigen, charakteristischen Signale als „stimulated acoustic emission (SAE) bezeichnet.
Blasen, die eigenständige charakteristische Signale aussenden können, werden beispielsweise beschrieben in EP 0 398 935 B1 , EP 0 644 777 B1, EP 0 458 745 A1 und WO 01/68150 A1. Das Prinzip der stimulated acoustic emission (SAE) ist schematisch in folgenden Figuren dargestellt. Es zeigen im Einzelnen:
Fig. 1: das Prinzip der „stimulated acoustic emission" anhand einer mit Ultraschall beschallten Blase,
Fig. 2: ein Ultraschallschnittbild, aus dem die Größe der SAE-Signale erkennbar ist, Fig. 3: ein konventionell aufgenommenes Ultraschallschnittbild.
In Fig. 1 sind eine erste Schallwelle mit geringer Amplitude 1 und eine zweite Schallwelle mit hoher Amplitude 2 dargestellt. Bei Einstrahlung der Schallwelle mit geringer Amplitude 1 bleibt eine davon beschallte Blase 3 intakt. Dabei wird ein Streusignal erzeugt. Im Gegensatz hierzu wird die Blase 4 bei Einstrahlung einer Schallwelle mit hoher Amplitude zerstört, wobei ein SAE-Signal entsteht.
SAE-Signale verschiedenster Blasen können gemäß US 5,425,366 A, US 6,186,951 B1 und DE 198 13 174 A1 mittels Farbdoppler-mode detektiert werden.
Aber auch mit anderen Ultraschallgerätemodes, die ursprünglich vor allem zur Dar- Stellung von Bewegung entwickelt wurden, sind SAE-Signale unabhängig von der Bewegung der Blasen darstellbar. Beispielhaft genannt werden die Spektraldoppler-, Power-Doppler-, Farbdoppler- und Harmonie-Methode (2nd-, sub-, wideband-, Pulse- Inversion-, Ultraharmonic-, Farbdoppler-, Harmonic-Powerdoppler-Methode).
Die SAE-Signalstärke ist so hoch, dass selbst einzelne Blasen detektiert werden können. Das einzelne SAE-Signal wird dabei auf dem Monitor erheblich größer dargestellt (Durchmesser ca. 0,5 - 1 mm je nach Gerät, Schallkopf und Settings), als es der tatsächlichen Größe der unzerstörten Blase (< 10 μm) entspricht. In Fig. 2 ist die Größe von SAE-Signalen im Schnittbild wiedergegeben. In vielen derzeit verfügbaren Ultraschalldiagnosegeräten liegt die Schichtdicke eines Einzelbildes je nach Geräteeinstellung bei ca. 1 mm. Dies ist in Fig. 3 veranschaulicht. Dort ist die Schichtdicke eines konventionellen Schnittbilds zu erkennen. In der Regel führt eine Blasenkonzentration von ca. 2.000-3.000 Blasen/ml Gewebe/Blut zu einem lückenlosen SAE- Kontrast im sonografischen Schnittbild. Im zweidimensionalen Ultraschallschnittbild wird die Sättigungsblasen-Konzentration bestimmt durch die Schichtdicke des Ultraschallschnittbildes (beispielhaft gezeigt in Fig. 3) und durch die Größe eines im Ultraschallschnittbild dargestellten SAE-Signals bei Zerstörung einer einzigen Blase (mehrere einzelne Blasen sind in Fig. 2 dargestellt).
Für die qualitative Bildgebung kann eine geringe Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration von Vorteil sein, da insbesondere bereits bei geringen Blasenkonzentrationen ein lückenloser Kontrast im Schnittbild entsteht.
Für die Quantifizierung von Körpern ist eine geringe Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration dagegen von Nachteil, da insbesondere bereits geringe Konzentrationen an Körpern, insbesondere Blasen zur Kontrastsättigung im Bild füh- ren und sich deren Konzentrationen oberhalb der Sättigungs-Konzentration im Bild nicht mehr absolut bestimmen bzw. Körper, insbesondere Blasen nicht mehr unterscheiden lassen.
Solange Körper, insbesondere Blasen, lediglich ungebunden im Blut verteilt sind, lässt sich deren Konzentration dort durch die Dosierung zwar so steuern, dass die Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration nicht erreicht wird. Kommt es allerdings zu einer spezifischen oder unspezifischen Anreicherung der Körper beispielsweise in Zellen, Geweben, Organen oder an anderen anreichernden Strukturen, wird die Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration in der Regel überschritten, weil das anreichernde Gewebe oder die anreichernden Strukturen derart dicht vorliegen, dass sich die Körper dort in einer Konzentration oberhalb der Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration anreichern.
Durch eine Reduktion der Dosis könnte die Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsbla- sen-Konzentration im Zielgebiet zwar auch hier unter Umständen unterschritten werden, aber die angereicherte Anzahl an Körpern, insbesondere Blasen läge in einem unbekannten Verhältnis zur maximalen Sättigung. Daher wäre eine solche Messung weder reproduzierbar, noch würde sie einen Wert liefern, der mit der Anzahl dort vorhandener Anreicherungsfaktoren korreliert. Daher ist ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl der Körper (Blasenanzahl) oberhalb der Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration wünschenswert.
Körper, insbesondere Blasen können sich beispielsweise unspezifisch oder spezifisch an oder in Zellen, Geweben, Organen oder anderen Strukturen anreichern. Dieser Anreicherungsmechanismus wird in der Literatur oftmals auch als passives oder aktives Targeting bezeichnet (Lanza, G., Wickline, S.: „Targeted ultrasonic contrast agents for molecular imaging and therapy". Prag. Cardiovasc. Dis., 2001, 44: 13-31 ; Dayton, P.A., Ferrara, K.W.: „Targeted imaging using ultrasound". J. Magn. Reson. Imaging, 2002, 16: 362-377).
Unspezifische Anreicherung von Körpern, insbesondere Blasen findet beispielsweise statt:
a) durch Phagozytose von Körpern/ Blasen in Organen des Retikuloendothe- lialen Systems (RES) oder in anderen Zellen, die z.B. erkrankungsasso- ziert vorliegen, wie z.B. in tumorassoziierten Makrophagen oder Makropha- gen in atherosklerotischen Prozessen, oder Tumorzellen selbst oder Zel- len, die zur Phagozytose stimuliert werden, wie z.B. Endothelzellen der
Leber bei bestimmten Erkrankungen der Leber; b) durch Adhäsion bzw. durch langsames Entlangrollen von Körpern/ Blasen beispielsweise am Gefässendothel; c) durch Einwandern von Körpern/ Blasen in oder durch Fenestrierungen, z.B. des Endothels, in „Gefässsackgassen" oder „blind" endenden Blutge- fässen; dies kann im Übergangsbereich zu Nekrosen, bei stark ödematö- sen oder entzündlichen Prozessen, Hämorrhagien, Hämatomen oder Ge- fässausbuchtungen, wie Aneurysmen, gefässbildenden Tumoren, wie Hä- mangiomen, oder durch Einspülen in Nekrosen auftreten; d) durch Transport von phagozytierten oder adhärierten Körpern/ Blasen, die z.B. durch Monozyten phagozytiert oder an Zellen des Blutes, wie beispielsweise Leukozyten, adhäriert sind, durch Endothelbarrieren, wie z.B. die Blut-Hirn-Schranke, zu beispielsweise pathologischen Arealen. Eine spezifische Anreicherung von Körpern, insbesondere Blasen kann durch eine kovalente oder nicht-kovalente, einschließlich einer elektrostatischen Bindung, Wasserstoffbrückenbindung oder Van der Waais-Bindung, an physiologische oder pa- thophysiologische Strukturen erreicht werden. In der Regel tragen die Körper, insbe- sondere Blasen in diesen Fällen target-spezifisch bindende Moleküle auf ihrer Oberfläche.
Zur Messung von Ultraschallkontrast gibt es die Möglichkeit, Videobilder zu digitalisieren, und die Helligkeit (Grau- oder Farbwerte) in definierbaren Bildregionen über die Zeit zu messen. Diese Art der Messung löst allerdings nicht das Problem der Kontrastsättigung bei hohen Konzentrationen an Körpern/ Blasen. Eine Quantifizierung ist, wenn überhaupt, nur bei sehr geringer Konzentration der Körper, insbesondere Blasen möglich.
Das Bedürfnis der Quantifizierbarkeit von Blasen hat auch 3D-Echotech, Halbergmoos, Deutschland, mit einem Ultraschallgerät zur Quantifizierung von Blasensignalen im Blut zu befriedigen versucht. Bei diesem Gerät wird das Videobild des Ultraschallgerätes digitalisiert, in Färb- und Grauwerte zerlegt und wahlweise nach mittlerem Helligkeitswert oder nach der Anzahl der Bildschirmpixel innerhalb eines defi- nierten Messfensters (ROI) ausgewertet. Der Anwendungsbereich dieses Messsystems ist es, die Blasenanflutung in Blutgefässen anhand der Helligkeitswerte innerhalb einer definierbaren ROI zu quantifizieren. Aber auch dieses Verfahren ist nicht geeignet, die Blasen oberhalb einer Konzentration von ca. 3.000 Partikeln bzw. Blasen/ml zu quantifizieren. Bereits unterhalb dieser Konzentration ist mit diesem Gerät keine reproduzierbare Messung möglich.
Kretztechnik, Zipf, Österreich, bietet ein 3D- (dreidimensionales) Ultraschall-Verfahren an, bei dem ein 2D-(zweidimensionales) Array (Linear-Array, Sektor-Array, Pha- sed-Array, wie in der 2D-Sonografie) innerhalb eines Schallkopfes automatisch in ei- nem bestimmten Winkel geschwenkt wird. Mit diesem Gerät können Blasen jedoch nicht reproduzierbar quantifiziert werden. Dies gilt insbesondere dann, wenn unterschiedliche Patienten untersucht werden und/oder verschiedene Untersucher die Untersuchung durchführen. Mit keinem der genannten Geräte ist es möglich, Körper, insbesondere Blasen in- vivo, ex-vivo oder in-vitro zu quantifizieren, insbesondere nicht in Konzentrationen oberhalb einer Konzentration von ca. 3.000 Blasen/ml Gewebe bzw. Blut. Unterhalb dieser Konzentration ist die räumliche Auflösung nur im Millimeter-Bereich möglich. Weitere Messverfahren zur Lösung dieses Problems sind bisher nicht bekannt.
Daher besteht ein Nachteil der bekannten Verfahren und Vorrichtungen darin, dass eine Darstellung kleiner Strukturen nicht möglich ist, da die von einem Schallkopf ausgehenden Schallkeulen Mindestausdehnungen aufweisen, die die Auflösung be- grenzen. Beispielsweise ist schon die von den Schallwellen erfasste Dicke der Messschicht etwa 1 mm groß, so dass feinere Strukturen nicht mehr aufgelöst werden können.
Aus den vorstehenden Gründen ist es nicht möglich, die Ultraschalltechnik z.B. zur Detektion molekularer Marker einzusetzen:
Biologische Schlüsseltechnologien, wie Genomics/Bioinformatics und Proteomics werden für die Identifizierung neuer molekularer Marker eingesetzt (Yao, T.: „Bioin- formatics for the genomic sciences and towards Systems biology. Japanese activities in the post-genome era". Prog. Biophys. Mol. Biol., 2002, Jul.-Aug., 80 (1-2):23-42; Wu, W., Hu, W., Kavanagh, J.J.: "Proteomics in cancer research". Int. J. Gynecol. Cancer, 2002, Sep.-Oct, 12 (5):409-423). Bei diesen Technologien werden die Sequenzen beispielsweise der menschlichen Gene mit speziellen Bioinformatik-Tools analysiert, um pharmakologisch interessanten Proteinfamilien angehörende Proteine, insbesondere Rezeptoren und Enzyme, zu identifizieren und näher zu beschreiben. Bei diesen in wϊro-Verfahren werden beispielsweise frisch isolierte (primäre) Zellen und (immortalisiert) Zellkulturen (aus erkranktem oder gesundem Gewebe) eingesetzt. Diese Zellkulturen sind jedoch nachteilig, da sich das Expressionsspektrum von molekularen Markern beispielsweise durch den Isoiierungsprozess verändern kann. Derartige untersuchte Zellkulturen spiegeln lediglich das Expressionsmuster molekularer Marker genau zu dem Zeitpunkt wieder, zu dem diese isoliert worden sind. Des Weiteren handelt es sich bei den Zellkulturen in der Regel um immortali- sierte (in vitro unbegrenzt durch spezielle Manipulation vermehrbare) Zellen, die nicht die realen in Vo-Verhältnisse wiederspiegeln können. Eine weitere sehr geläufige Methode zur Identifizierung molekularer Marker ist die immunhistochemische Untersuchung von Geweben. Hierbei werden speziell interessierende Gewebe, beispielsweise von Tumoren, nach ihrer Entnahme histologisch aufgearbeitet und immunhistologisch gezielt auf die Expression eines oder mehrerer molekularer Marker untersucht. Erst nach histologischer Identifikation solcher Marker können diese später durch Verwendung entsprechender Antikörper, die mit entsprechenden Signalgebern gekoppelt sind, auch in vivo abgebildet werden. Solche Abbildungen sind in der Regel nur qualitativ möglich und meistens auch nur dann, wenn es zu einer sehr starken Anreicherung des antikörpertragenden Signalgebers kommt (Fonsatti, E., Jekunen, A.P., Kairemo, K.J.A. et al.: „Endoglin is a suitable target for efficient imaging of solid tumors: In vivo evidence in a canine mammary carcinoma model". Clinical Cancer Research, Vol. 6, Mai 2000:2037-2043).
Derzeit werden auch viele diagnostische Verfahren zur Detektion molekularer Marker in vivo getestet. Obwohl der Nachweis von bekannten molekularen Markern mit bekannten diagnostischen Verfahren möglich ist, fehlt diesen Verfahren in der Regel eine hohe räumliche Auflösung. Dies ist beispielsweise der Fall bei PET (Positron- Emissions-Tomografie), NIRF (Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging) und Szintigrafie. In anderen Fällen werden hohe Konzentrationen an Signalgebern benötigt, beispielsweise bei MRI (Magnet-Resonanz-Imaging) und CT (Computer-Tomografie). Außerdem gibt es Literatur zur Verwendung von Ultraschallkontrastmitteln zum passiven Targeting (ohne Antikörperkonjugat, z.B. ohne spezifische Bindung an molekulare Marker) und zum aktiven Targeting (mit Antikörperkonjugat, z.B. mit spezifischer Bin- düng an molekulare Marker). Allerdings erreichen keine der bis heute beschriebenen diagnostischen Verfahren die Kriterien, wie sie unter Verwendung der aus DE 102 15 335 A bekannten Vorrichtung erzielbar sind, nämlich eine räumliche Auflösung im Mikrometer-Bereich und eine hoch sensitive Quantifizierung von Signalgebern im Targetbereich.
Der vorliegenden Erfindung liegt von daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Quantifizierung von Körpern in einem Untersuchungsobjekt zu finden, mit dem eine Bestimmung der Konzentration der Körper in-vivo, ex-vivo und in-vitro oberhalb der Sättigungsblasen-Konzentration möglich ist. Mit dem Ver- fahren und der Vorrichtung soll es möglich sein, Körpermengen reproduzierbar zu quantifizieren und deren Konzentration zu bestimmen. Außerdem soll es möglich sein, bezüglich der im Videobild dargestellten eigenständigen, charakteristischen Signale, beispielsweise der SAE-Signale, eine räumliche Auflösung vorzugsweise im histologischen Bereich zu ermöglichen, um beispielsweise auch molekulare Marker target-spezifisch identifizieren zu können.
Die Aufgabe wird durch die Vorrichtung zur Quantifizierung von in einem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körpern nach Anspruch 1 , deren Verwendung für die Ult- raschalldiagnostik und/oder Ultraschalltherapie am Menschen oder am Tier nach Anspruch 10, deren Verwendung für das in-vivo- und ex-v/Vo-Mapping von molekularen Markern in Organen und Geweben und in w'fro-Mapping von Zellen für die Charakterisierung von Zellkulturen nach Anspruch 11 und das Verfahren zur Quantifizierung von in einem Untersuchungsobjekt enthaltenen Blasen nach Anspruch 12 gelöst. Be- vorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Definitionen:
Hierzu wird ergänzend auf nachfolgend erläuterte Figuren Bezug genommen. Es zei- gen im Einzelnen:
Fig. 4: Farbgesättigtes Schnittbild
Fig. 5: Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens: a: Verschiebungsstrecke: 100 μm b: Verschiebungsstrecke: 50 μm c: Verschiebungsstrecke: 10 μm
Fig. 6: Richtungen in Relation zum Schallkopf
Fig. 7: Multielement-Schallkopf mit definiert überlappenden Schallfeldern (2D-Array) a: Bildaufbau mit geringem beam-overlap b: Bildaufbau mit starkem beam-overlap Fig. 8: 3D-Ansicht des mit unterschiedlichen Verschiebungsstrecken gescannten Agar-Phantoms aus Beispiel 1 : a: SAE-Schichtdicke = 10 μm bis 100 μm,
Schnittbild 13: Verschiebungsstrecke 10 μm b: SAE-Schichtdicke = 50 μm bis 100 μm
Schnittbild 14: Verschiebungsstrecke 50 μm c: SAE-Schichtdicke = 100 μm
Schnittbild 15: Verschiebungsstrecke 100 μm
Fig. 9: Abhängigkeit der MU von der SAE-Schichtdicke (Agar-Phantom, Beispiel 1)
Fig. 10: Abhängigkeit der MUCOrr. von der SAE-Schichtdicke (Agar-Phantom, Beispiel 1)
Fig. 11 : Abhängigkeit der SAECOrr. von der SAE-Schichtdicke (Agar-Phantom, Beispiel 1)
a) Körper:
Körper im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind solide Partikel und/oder Blasen mit einem Durchmesser < 10 μm. Solide Partikel enthalten mindestens eine oberflächenaktive Substanz (z.B. Tensid), mindestens ein Kohlenhydrat, Protein, Lipid und/oder natürliches und/oder synthetisches Polymer.
b) Blase:
Blasen im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind Gas enthaltende Phasen mit ei- nem Durchmesser < 10 μm, die entweder frei oder umhüllt sind. Die Phasen können im Wesentlichen kugelförmig sein. Im Fall umhüllter Blasen kann die Hülle mindestens eine oberflächenaktive Substanz (z.B. Tensid), mindestens ein Protein, Lipid und/oder natürliches und/oder synthetisches Polymer enthalten. Blasen gemäß der vorliegenden Anmeldung können beispielsweise auch gasgefüllte Mikrokapseln, gasgefüllte Mikropartikel, gasgefüllte Mikrosphären, Mikroballoone und mit Tensid stabilisierte Mikrobläschen sein.
c) Ultraschallkontrastmittel:
Ultraschallkontrastmittel sind Mittel, die Körper, insbesondere Blasen zur Anwendung in der Ultraschalldiagnostik und/oder -therapie enthalten.
d) Eigenständiges, charakteristisches Signal:
Ein eigenständiges, charakteristisches Signal (CS-Signal, CS-Effekt) ist ein vom Streusignal unabhängiges Echo-Signal eines Körpers, insbesondere einer Blase. Dazu gehören auch alle nicht-linearen Signale wie beispielsweise 2nd harmonic-, subharmonic- oder ultra-harmonic, sowie insbesondere SAE-Signale, wie sie bei- spielsweise bei der Zerstörung von Blasen im Ultraschallfeld entstehen.
e) Stimulated Acoustic Emission (SAE):
Erfindungsgemäß bevorzugte Blasen können unter bestimmten Bedingungen bei An- regung mit Ultraschall zerstört werden. Dabei entsteht ein eigenständiges und vom Sendesignal abweichendes Signal, das von der Streuung und der Bewegung der Blasen unabhängig ist. Dieses eigenständige, charakteristische Signal wird als stimulated acoustic emission (SAE) bezeichnet (Synonym: Loss of Correlation (LOC)).
f) Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration:
Die Sättigungs-Konzentration/ Sättigungsblasen-Konzentration ist die Konzentration an Körpern/ Blasen pro Milliliter Untersuchungsobjekt, beispielsweise Gewebe oder Blut, oberhalb der es zu einer Überlagerung der eigenständigen, charakteristischen Signale, insbesondere der SAE-Signale, innerhalb eines Schallfeldes kommt und oberhalb der eine Quantifizierung der Blasen dadurch unmöglich wird, dass aus der Summe der CS-Signale auch bei Anwendung von rechnerischen Korrekturformeln nicht mehr auf die Anzahl der Körper/ Blasen zurückgeschlossen werden kann. g) CS/SAE-Schichtdicke:
Für den Fall, dass die Blasen zerstört werden, handelt es sich hierbei um die Dicke der Schicht pro Ultraschallschnittbild (Schnittschicht), aus der die im Schnittbild dar- gestellten CS-Signale (in diesem Falle SAE-Signale) bei einem Scan mit paralleler Überlappung stammen. Für den Fall, dass die Körper/ Blasen bei der Beschallung mit den CS-Signalen nicht zerstört werden, handelt es sich um die Dicke der Schicht pro Ultraschallschnittbild, aus der die im Schnittbild dargestellten CS-Signale bei einem Scan mit paralleler Überlappung von Blasen stammen, die bei einer Verschie- bung des Ultraschallfeldes jeweils neu hinzukommen. Die CS/SAE-Schichtdicke ist gleich der Verschiebungsstrecke pro Ultraschallschnittbild. Diese Schichtdicke ist vorzugsweise wesentlich geringer als die Schnittschicht. Die Schnittschicht entsteht im Untersuchungsobjekt durch Einstrahlung einer Schallkeule (Schallfeld). Dies geschieht auf herkömmliche Weise, indem Piezokristallelemente Schallimpulse aus- senden, die durch geeignete Mittel in das zu beschallende Medium angekoppelt und fokussiert werden. Indem die in das Untersuchungsobjekt hineinragende Schallkeule beispielsweise entlang der Oberfläche des Untersuchungsobjektes verfahren wird, kann eine Schnittschicht von der Schallkeule nach und nach abgefahren und das entsprechende Bild durch die am Empfänger ankommenden Schallsignale erzeugt werden. Die Schichtdicke wird in beiden genannten Fällen durch den Vorschub zwischen zwei Bildern definiert.
h) Region of interest (ROI):
Hierbei handelt es sich um das Messfenster im Schnittbild.
i) Morphometric Units (MU):
Morphometric Units sind ein Maß für die Fläche, entsprechend einer Schnittschicht, ausgedrückt in der Bildschirmpixelanzahl, die dargestellte CS-Signale im Videobild einnehmen. Die Bildschirmpixel werden in der Regel automatisch durch Videodensi- tometrie gezählt. Ist die Anzahl der Bildschirmpixel eines einzelnen CS -Signals bekannt, kann aus den Morphometric Units auf die Körperanzahl/ Blasenanzahl geschlossen werden. j) Korrigierte SAE (SAECOrr.) bzw. korrigierte MU (MUcorr.):
Wenn die Körper/ Blasen kleiner sind als die Dicke einer Schicht für ein Ultraschall- schnittbild, kann es im Videobild zu überlagerten CS-Signalen kommen. Die Wahrscheinlichkeit für eine derartige Überlagerung steigt mit zunehmender Konzentration an Körpern/ Blasen und Schichtdicke des Ultraschallschnittbildes, weil in diesem Falle eine größere Anzahl von Körpern/ Blasen erfasst wird. Beide Parameter haben direkten Einfluss auf die prozentuale Farbfläche der CS-Signale im Videobild. Bei zufälliger Verteilung der Körper/ Blasen im untersuchten Volumen kann der Wert von MU bei Überlagerung von CS-Signalen folgendermaßen korrigiert werden, solange keine vollständige Farbsättigung in der ROI vorliegt:
∑FP
MUcorr = ∑FPx 1 + -
∑FP + ∑GP
FP: Bildschirmfarbpixel, die innerhalb des Messfensters (ROI) im Bereich der dargestellten CS-Effekte liegen, MU: FP innerhalb des Messfensters (ROI),
GP: Bildschirmgraupixel, die innerhalb des Messfensters (ROI), aber außer- halb der dargestellten CS-Effekte liegen.
Über den Quotienten aus der Summe der Farbpixel und der Summe der CS-Signale
(Fsae = innerhalb der ROI können die korrigierten MU (MUcorr.) in eine korri- gierte CS-Signalanzahl (SAEcorr. ) umgerechnet werden:
„ . „ MUcorr
SAEcorr =
Fsae
Die Anwendung dieser Korrekturformel setzt eine zufällige Verteilung der Körper/ Blasen im untersuchten Volumen voraus. k) 2D-Array:
Ein 2D-Array besteht aus einer eindimensionalen Reihe von Piezo-Elementen.
I) 3D-Array:
Ein 3D-Array besteht aus mehreren nebeneinanderliegenden Reihen von Piezo-Elementen.
m) Schallkopf (Ultraschallwandler):
Vorrichtung zur Sonografie, enthaltend Piezoelemente.
n) Richtungen in Relation zum Schallkopf:
In Fig. 6 ist ein Schallkopf 23 schematisch gezeigt. Die Richtungen in Beziehung zum Schallkopf sind wie folgt definiert:
x = Quer zum Schallkopf (Bezugszeichen 24: 2D-Array) y = lateral (Bezugzeichen 25) z = axial (Schallausbreitungsrichtung) (Bezugszeichen 26)
o) Molekulare Marker:
Intra-, inter- und/oder extrazelluläre molekulare Strukturen, beispielsweise Rezeptoren, Liganden, Enzyme oder deren Strukturbestandteile.
Um Körper, bevorzugt Blasen in einem Untersuchungsobjekt quantifizieren zu kön- nen, werden insbesondere solche Blasen eingesetzt, die zu eigenständigen, charakteristischen Signalen angeregt werden können, und vor allem Blasen, die bei der Beschallung zerstört werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren dienen zur Quantifizierung von in einem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körper, bevorzugt Blasen. Die Vorrichtung umfasst mindestens einen Schallkopf zur Aussendung eines Ultraschallfeldes, das die in einer Schicht in dem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körper, bevorzugt Blasen zur Aussendung charakteristischer Ultraschallsignale anregt. Mindestens einer der Schallköpfe dient auch zum Empfang der charakteristischen Signale. Ferner ist mindestens ein Datenverarbeitungssystem zur Ermittlung der Anzahl der Körper, bevorzugt Blasen in der Schicht aus den charakteristischen Signalen vorgesehen. Ferner sind in erfindungsgemäßer Weise Mittel vorgesehen, mit denen das Ultraschallfeld nach einer Anregung der Körper, bevorzugt Blasen in einer ersten Schicht im Untersuchungsobjekt so verschiebbar ist, dass Körper/ Blasen nach der Verschiebung in einer zweiten Schicht anregbar sind, wobei die erste Schicht und die zweite Schicht überlappen und parallel und definiert gegeneinander verschoben sind. Somit werden Ultraschallsignaldatensätze aus unterschiedlichen Schnittschichten im Untersuchungsobjekt erhalten, die Informationen über das Vorhandensein von Körper/ Blasen in den einzelnen Schnittschichten enthalten, insbesondere über die räumliche Anordnung der Blasen in den Schnittschichten. Bezogen auf einen Schallkopf mit in Reihen angeordneten Piezokristallen, werden die Schichten vorzugsweise so gegeneinander verschoben, dass sie in Querrichtung (x- Richtung) zu den Piezokristallreihen überlappen.
Der Schallkopf kann entweder sowohl zum Aussenden von Ultraschallsignalen als auch zum Empfang der von den Körpern, bevorzugt Blasen herrührenden Signale ausgebildet sein. Alternativ kann der Schallkopf auch ausschließlich zum Aussenden der Ultraschallsignale ausgebildet sein. In diesem Falle ist ein weiterer Empfangskopf zur Detektion der ankommenden Ultraschallsignale von den Körpern, bevorzugt Blasen erforderlich.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Quantifizierung von im Untersuchungsobjekt enthaltenen Körpern, bevorzugt Blasen, werden in einer Schicht enthaltene Körper/ Blasen mit einem Ultraschallfeld zu charakteristischen Ultraschallsignalen angeregt. Die von den Körpern/ Blasen ausgesendeten charakteristischen Ultraschallsignale werden empfangen, und aus den empfangenen Ultraschallsignalen wird die Anzahl der Körper/ Blasen ermittelt, wobei jeweils durch die Verschiebung des Ultraschallfeldes nach einer Anregung von Körpern/ Blasen in einer ersten Schicht im Untersuchungsobjekt Körper/ Blasen in einer zweiten mit der ersten Schicht überlappenden und parallel und definiert gegen diese verschobenen Schicht angeregt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren sind nicht auf Ausführungsformen unter Anwendung der Bildgebung oder des Videobildes limitiert. Die CS -Signale innerhalb einer Region of Interest (ROI) können auch bereits anhand der Empfangssignale (Radiofrequenz-(RF)-Daten) gezählt werden, wenn- gleich sich die Sättigungsblasen-Konzentration bei Zählung der CS-Signale auf Ebene der Empfangssignale von der Sättigungsblasen-Konzentration bei Zählung der CS-Signale im zweidimensionalen Ultraschallschnittbild unterscheiden kann. Die erfindungsgemäße Vorrichtung und die Zählung der Empfangssignale kann in ein Ultraschall-Gerät integriert werden.
Im Gegensatz zu bekannten Vorrichtungen und Verfahren ist es mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, auch Konzentrationen an Körpern, bevorzugt Blasen zu bestimmen, die oberhalb einer Grenze liegen, die im Bereich von 1000 - 3000 Körper (BlasenVml liegt:
Mit bekannten radiologischen und kardiologischen Vorrichtungen und Verfahren, die vorzugsweise im Frequenzbereich von 2,5 - 12 MHz arbeiten, ist bei einer Konzentration über etwa 1000 Körpern (Blasen)/ml bereits eine Sättigung zu beobachten, so dass eine Quantifizierung unmöglich wird. Dies liegt daran, dass die räumliche Auflö- sung in diesem Falle nicht ausreichend hoch ist: Die räumliche Auflösung von Ultraschallwandlern ist nämlich durch deren Frequenz bestimmt. Mit höherer Frequenz steigt die räumliche Auflösung. Gleichzeitig werden aber der Schalldruck und damit die Eindringtiefe der Ultraschallwelle in das untersuchte Gewebe reduziert. Für die medizinische Diagnostik, für die größere Eindringtiefen benötigt werden, werden Ul- traschallwandler im Frequenzbereich von etwa 2,5 MHz (Gewebe-Eindringtiefe von etwa 30 cm) bis 12 MHz (Gewebe-Eindringtiefe von etwa 7 cm) eingesetzt. Die räumliche Auflösung in x-Richtung oder x- und y-Richtung (in einer Ebene senkrecht zur Schallkeule) bei Verwendung eines Einzelkristall-Ultraschallwandlers mit rundem Querschnitt liegt in diesen Fällen im mm-Bereich. Daher liegt auch die Dicke des Schallfeldes an der schmälsten Stelle in der von dem Wandler ausgesendeten Schallkeule im mm-Bereich. Aus diesem Grunde beträgt das kleinste von einem solchen Ultraschallgerät auflösbare Volumen ca. 1 mm3. Wird ein Körper, bevorzugt eine Blase in diesem Volumen durch Ultraschall zerstört, so kann die exakte räumli- ehe Position des entsprechenden CS -Signals innerhalb dieses Volumens nicht genau bestimmt werden. Folglich wird dieses Signal im Bild in einer Größe dargestellt, die ebenfalls im Millimeter-Bereich liegt. Befinden sich in diesem Volumen mindestens zwei Körper, bevorzugt Blasen, so können diese von dem Ultraschallgerät mangels räumlicher Auflösung nicht mehr diskriminiert werden. Daher führen Konzentra- tionen an Körpern, bevorzugt Blasen von mehr als etwa 1000 Körper (Blasen)/ml zu einer Sättigung. Dies ist auch der Grund, warum das oben erwähnte Gerät von SD- Echotech zur Quantifizierung der Körper, insbesondere Blasen nicht geeignet ist, da die Dicke des Schallfeldes im Bereich von ca. 1 - 2 mm liegt. Ein weiterer Grund dafür, dass dieses Gerät für die Quantifizierung von Körpern, insbesondere Blasen un- geeignet ist, besteht darin, dass der Schallkopf von Hand geführt wird, so dass einige Bereiche des Untersuchungsobjekts mehrfach oder in unterschiedlichem Masse ü- berlappend, andere Bereiche gar nicht geschallt werden. Dieses Problem wird auch nicht durch die ebenfalls von 3D-Echotech entwickelte Möglichkeit der elektromagnetischen Positionsbestimmung des Schallkopfes gelöst, da diese nur etwa im Sub- Millimeter-Bereich genau ist.
Durch die vorliegende Erfindung wird erstmalig eine deutlich höhere räumliche Auflösung als mit bekannten Verfahren und Vorrichtungen ermöglicht. Gleichzeitig werden berechenbaren Volumina zugrunde gelegt. Dadurch ist erstmals eine Quantifizierung von Körpern, bevorzugt Blasen in einem Untersuchungsvolumen auch dann möglich, wenn die Sättigungskonzentration/ Sättigungsblasenkonzentration normalerweise überschritten würde.
Auch das Gerät von Kretztechnik ist für die Quantifizierung ungeeignet, da die Über- lappung der Schallfelder in axialer Richtung (z) nicht gleichmäßig ist. Im Nahbereich überlappen mehrere benachbarte Schallfelder fast vollständig, während mit zunehmender Distanz zum Schallkopf Lücken entstehen, die dann interpoliert werden. Das hat zur Folge, dass auch die Signalausbeute in einem untersuchten Gewebe von der Distanz zum Schallkopf abhängt. Erst durch die vorliegende Erfindung wird die vorgenannte Aufgabe gelöst.
Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich besonders einfach am Beispiel vollständiger Blasen-Zerstörung in jedem Ultraschallschnittbild verdeutlichen:
Mit Hilfe der Fig. 4, 5 b) und c) kann die Funktionsweise der Erfindung gezeigt werden:
a) Im ersten Bild wird ein kontrastgesättigtes Ultraschallschnittbild erhalten (Fig.
4). b) Die Blasen werden durch die Beschallung zerstört (Fig. 5a). SAE-Signale können danach nicht mehr detektiert werden. Eigenständige, charakteristische Signale aussendende Blasen sind mit 6 bezeichnet, unzerstörte Blasen in der nicht angeregten Schnittschicht mit 5. c) Nachfolgend wird das Schallfeld zwischen zwei Bildern um eine definierte Verschiebungsstrecke gegen das Gewebe so verschoben, dass die beschallten Volumina des Untersuchungsobjektes einander überschneiden, wobei die Längsachsen beider Volumina parallel zueinander liegen. Die Längsachse ist als Linie definiert, die in Richtung der Schallausbreitungsrichtung (Richtung z in Fig. 6; von oben nach unten in Fig. 5b) durch die Mitte des Schallfeldes läuft (siehe hierzu auch Fig. 7). Entsprechend ist im Sinne der vorliegenden Erfindung als parallele Verschiebung der beiden Schichten, die überlappen und aus denen Ultraschallschnittbilder erhalten werden, zu verstehen, dass die
Längsachsen der beiden Schichten parallel zueinander liegen. d) Wurden im ersten Bild alle Blasen zerstört, so können im zweiten Bild und allen nachfolgenden Bildern nur die neu hinzugekommenen detektiert werden. Bei einer Parallelverschiebung des Schallfeldes gegen das Untersuchungs- objekt von beispielsweise 10 μm bedeutet dies, dass die im zweiten Bild neu hinzu kommenden Blasen aus einem Volumen mit einer Schichtdicke von 10 μm stammen. Da die Verschiebung im vorgenannten Sinne parallel ausgeführt wird, ist die Schichtdicke des Volumens, in dem sich die noch nicht zerstörten Blasen befinden, unabhängig von der Form des Schallfeldes, durchgehend gleich, nämlich 10 μm. Diese noch nicht zerstörten Blasen sind quantifizierbar (Fig. 5 b) und c)). Zerstörte Blasen sind mit 7 bezeichnet.
Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch für solche Körper, bevor- zugt Blasen genutzt werden, die mit diagnostischem Ultraschall zu einem eigenständigen und charakteristischen Signal unabhängig von einer Zerstörung angeregt werden können. Ein derartiges Signal kann beispielsweise ein harmonisches oder subharmonisches Signal sein.
Es wird hier analog wie bei einem SAE-Signal verfahren:
Im Fall von Blasen:
a) im ersten Bild / einer ersten Schicht werden alle Blasen zerstört, b) in den nachfolgenden Bildern / Schichten werden die Blasen so angeregt, dass sie ein eigenständiges, charakteristisches Signal ergeben, c) solange die kumulative scan-distanz kleiner oder gleich der Schichtdicke des Schallfeldes ist, werden in jedem weiteren Bild /jeder Schicht werden die jeweils neu hinzukommenden Signale ermittelt, d) ist die kumulative scan-distanz größer als die Schichtdicke des Schallfeldes, oder wird die in einem Bild/ einer Schicht eine Signal-Sättigung erreicht, können die im Schallfeld befindlichen Blasen zerstört werden.
Im Fall von soliden Partikeln:
a) im ersten Bild / einer ersten Schicht sind keine eigenständigen, charakteristische Signale soliden Partikel nach Anregung detektierbar; dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der scan an einer Position begonnen wird, die frei von Partikeln ist, oder dadurch, dass vor Beginn des scans der Transducer aus einem Bereich heraus, in dem eigenständige, charakteristische Signale solider Partikel nach Anregung detektierbar sind, in einen benachbarten Bereich verschoben wird, in dem dies nicht der Fall ist, b) in den nachfolgenden Bildern / Schichten werden die soliden Partikel so angeregt, dass sie ein eigenständiges, charakteristisches Signal ergeben, c) solange die kumulative scan-distanz kleiner oder gleich der Schichtdicke des Schallfeldes ist, werden in jedem Bild / jeder Schicht werden die jeweils neu hinzukommenden Signale ermittelt.
Die Ermittlung der neu hinzukommenden Signale kann, wenn das Aussenden des Signals nicht mit der vollständigen Zerstörung der Körper, bevorzugt der Blasen einhergeht, durch Subtraktion des jeweiligen Vorwertes oder durch einfache, vorzugs- weise automatische Zählung der Signale nach Senden eines Zerstörungspulses ermittelt werden.
Gehen die eigenständigen, charakteristischen Signale mit der Zerstörung der Körper, bevorzugt der Blasen einher, kann die Signalanzahl des Überlappungsbereiches in der Regel wie bei SAE-Signalen durch einfache, vorzugsweise automatische Zählung ermittelt werden.
Bei einer parallelen Verschiebungsstrecke von 10 μm gegen das Gewebe und einer Schichtdicke des Schallfeldes von 1 mm beispielsweise überlappen sich die Schnitt- bilder (Schnittschichten) zu 99 %. Im zweiten Schnittbild werden nur die neu hinzugekommenen Körper, bevorzugt Blasen detektiert, die sich in der 10 μm-Schicht befinden.
Die Strecke der Verschiebung zwischen zwei Bildern beträgt mindestens 5 μm, vor- zugsweise mindestens 10 μm und besonders bevorzugt mindestens 20 μm. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Verschiebungsstrecke mindestens 50 μm. Die Verschiebungsstrecke ist kleiner als die Scandicke (ca. 1 - 2 mm). Die optimale Streckenverschiebung ist abhängig von der höchsten Körperkonzentration/ml, bevorzugt Blasenkonzentration/ml im gescannten Volumen. Es ist vorteilhaft, eine Überlappung der Volumina zwischen 20 % und 99,99 %, vorzugsweise zwischen 40 % und 99,9 % und insbesondere bevorzugt zwischen 70 % und 99 %, einzustellen. Wenn die Verschiebungsstrecke zu groß gewählt wird oder sich die Ultraschallschnittbilder gar nicht überlappen (Fig. 5a), ist auch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine absolute Quantifizierung nicht möglich, da es im Ultraschallschnittbild zu einer nicht korrigierbaren Überlagerung der CS-Signale kommt.
Die Verschiebungsstrecke kann beispielsweise zu groß gewählt werden, oder die Ultraschallschnittbilder können gegebenenfalls gar nicht überlappen, wenn der Anreicherungsgrad der Körper, bevorzugt Blasen unterschätzt wird. In diesen Fällen muss die Verschiebungsstrecke pro Ultraschallschnittbild reduziert werden, um die abso- lute Quantifizierbarkeit zu gewährleisten. Fig. 9 bis 11 zeigen den Zusammenhang zwischen der Verschiebungsstrecke und den Morphometric Units (MU) bzw. der Anzahl der eigenständigen, charakteristischen Signale im Schnittbild.
Die Konzentration an Körpern, bevorzugt Blasen wird bevorzugt bei solchen CS/SAE-Schichtdicken bestimmt, deren Schnittbilder jeweils 20 bis 80 %, vorzugsweise 30 bis 70 % Farbsättigung aufweisen. Zugunsten einer verringerten Untersuchungszeit kann die Verschiebungsstrecke aber erhöht werden, solange in keinem Schnittbild die Sättigungsblasen-Konzentration erreicht wird. Für einen optimalen Kompromiss zwischen Untersuchungszeit und Genauigkeit der Messung kann ein definiertes Programm, das die CS/SAE-Schichtdicke variiert, sorgen. Die durch das Programm gesteuerte optimale Verschiebungsstrecke kann beispielsweise anhand einer ausreichend großen Population an Patienten (Untersuchungsobjekten) ermittelt werden.
Kommt es dennoch zufällig zu einzelnen kontrastgesättigten Schnittbildern, ist die absolute Quantifizierbarkeit nicht mehr gegeben. Eine Quantifizierbarkeit über die nicht kontrastgesättigten Schnittbilder bleibt allerdings möglich.
Selbst wenn in bestimmten Bereichen des Untersuchungsgebietes eine Farbsätti- gung vorliegt, ist durch den standardisierten Scan-Prozeß mit definierter Parallelverschiebung der Schallfelder und durch die höhere räumliche Auflösung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine reproduzierte Messung möglich. Eine solche Messung kann z.B. für einen Vergleich zwischen verschiedenen Patienten oder für eine Therapie-Verlaufskontrolle bei demselben Patienten ausreichen. Werden in einem Schnittbild nicht alle Blasen zerstört, so kann man vor Anfahrt der nächsten Position auch einen oder mehrere weitere Zerstörungspulse senden.
Die Überlappung und Verschiebung der Volumina der Schnittschichten kann dadurch erreicht werden, dass der Schallkopf und das Untersuchungsobjekt gegeneinander (relativ zueinander) verschoben werden.
Die definiert parallele Verschiebung kann erreicht werden, indem
I. das Gewebe bzw. das Untersuchungsobjekt, beispielsweise ein Patient, gegenüber einem fixierten Schallkopf verschoben wird oder
II. der Schallkopf gegenüber dem zu untersuchenden fixierten Untersuchungsobjekt, beispielsweise einem Gewebe, verschoben wird oder III. ein Schallkopf verwendet wird, der in der Lage ist, zeitlich nacheinander sich überlappende und verschobene Schnittbilder zu erstellen, d.h. die Volumina werden mit einem Schallkopf verschoben und zur Überlappung gebracht, der selbst überlappende und parallel verschobene Ultraschallbilder aufnimmt; hierzu kann der Schallkopf so angesteuert werden, dass sich überlappende und insbesondere quer verschobene Ultraschallschnittbilder bzw. Schallkeulen einer
Schnittschicht aufgenommen werden.
Die verschiedenen Verschiebungsmöglichkeiten können auch kombiniert werden.
Beispielhaft seien folgende Varianten paralleler Verschiebung beschrieben:
I. Das Untersuchungsobjekt (Patient, Tier, ein exenteriert.es oder isoliertes Organ oder eine Zellkulturschale) wird automatisch (z.B. durch Servomotor oder DC- Motor angetrieben) am fixierten Schallkopf vorbeigefahren.
Der Schallkopf wird automatisch mit Hilfe einer speziellen Vorrichtung über dem / gegenüber dem Untersuchungsobjekt (Patient, Tier, ein exenteriertes oder i- soliertes Organ oder eine Zellkulturschale) verschoben. Die Vorrichtung kann ein Rahmen sein, innerhalb dessen der Schallkopf in einer Halterung fixiert ist und durch Motortrieb entlang einer Parailelführung bewegt wird.
Im einfachsten Fall kann ein Einzelkristall in x- und y-Richtung mit definierten Überlappungsbereichen verschoben werden. Diese Variante bietet sich z.B. für Kulturschalen von Zellen an, an deren Oberfläche sich Körper, insbesondere Blasen spezifisch oder in deren Inneren unspezifisch, beispielsweise durch Phagozytose, angereichert haben. Hier reicht die Aussage aus, wie viele Körper, insbesondere Blasen pro Fläche bzw. Volumen sich angereichert haben. Die Daten müssen nicht in Bilder umgerechnet werden.
Außerdem können mit einem Schallkopf, enthaltend ein 2D-Array, durch eine entsprechende Steuerung des Scans benachbarte Schallkeulen innerhalb einer Linie in Querrichtung definiert zur Überlappung gebracht werden.
III. Mit einem Schallkopf, enthaltend ein 3D-Array, können durch eine entsprechende Steuerung des Scans benachbarte Schallkeulen innerhalb einer Linie oder Schallkeulen benachbarter Linien in Querrichtung definiert zur Überlappung gebracht werden. Bei dieser Variante ist eine weitere Bewegung von Schallkopf oder Untersuchungsobjekt nicht mehr nötig.
Der Schallkopf kann auch ein 2D-Array enthalten, welches innerhalb des Schallkopfes parallel mit definierter Überlappung in Querrichtung (x-Richtung) bewegt wird. Die laterale Auflösung kann innerhalb eines 2D-Schnittbildes gesteigert werden, wenn sich die einzelnen Scan-Linien, aus denen das Schnitt- bild aufgebaut ist, ebenfalls definiert überlappen. Die einzelnen Schallfelder, die jeweils von einer Gruppe benachbarter Piezoelemente erzeugt werden, werden dabei im Gegensatz zur konventionellen Steuerung stärker und vor allem definiert zur Überlappung gebracht, indem kleine Schrittweiten (bis hinunter zu einem Piezo-Element) gewählt werden.
Dies ist beispielsweise in Fig. 7 gezeigt: Von einem Array von einzelnen Piezo- elementen 11 wird ein kleiner Bereich 12 von Piezoelementen, umfassend wenige Arrayelemente, zu Schwingungen angeregt (Fig. 7a). Dadurch wird eine Schallwelle in Form einer Schallkeule 9 in das Untersuchungsobjekt emittiert. Innerhalb der Schallkeule befindliche unzerstörte Blasen 8 werden zerstört und senden dadurch eigenständige, charakteristische Signale 9 aus. Die zerstörten Blasen sind mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet. Anschließend wird eine neu gebildete Gruppe von Piezoelementen des Arrays zu Schwingungen angeregt, die sich von der bei der ersten Anregung verwendeten Gruppe nur um ein Pie- zoelement unterscheidet, um das die Gruppe nunmehr versetzt ist (Fig. 7b). Durch die Überlappung der dadurch entstehenden Schallkeule mit der zuvor ausgesendeten Schallkeule werden nur noch die neu erfassten Blasen zu eigenständigen, charakteristischen Signalen angeregt.
Wie beim definiert überlappenden Scan in Querrichtung zum Schallkopf erhöht sich die Auflösung um den Faktor, in dem die Verschiebung zur Breite der Pie- zo-Elementgruppe steht.
Zur Verschiebung des Schallkopfes und/oder des Untersuchungsobjektes ist daher mindestens ein Motorantrieb für die Verschiebung des Untersuchungsobjektes bzw. des mindestens einen Schallkopfes gegeneinander vorgesehen.
Falls der Schallkopf gegenüber dem Untersuchungsobjekt verschoben werden soll, muss dieses in definierter Weise bewegt werden. Hierzu ist eine verfahrbare Halte- rung für den Schallkopf vorgesehen. Das Untersuchungsobjekt wird in einer Haltevorrichtung fixiert. Es ist selbstverständlich nicht unbedingt erforderlich, das Untersuchungsobjekt durch Einspannen, Klemmen oder eine andere ähnliche Fixierung mit der Haltevorrichtung festzuhalten. Es genügt auch, dass das Objekt praktisch bewe- gungslos von der Haltevorrichtung gehalten wird. Beispielsweise kann ein Patient auf einer Liege platziert werden, auf der dieser während der Untersuchung ruht. Derartige Haltevorrichtungen können für die Halterung des Untersuchungsobjektes sowohl dann eingesetzt werden, wenn dieses während der Untersuchung nicht bewegt wird, sondern nur der Schallkopf, als auch dann, wenn das Untersuchungsobjekt bewegt wird und der Schallkopf nicht. Auch für den Fall, dass sowohl der Schallkopf als auch das Untersuchungsobjekt gleichzeitig gegeneinander bewegt werden, können die vorgenannten Haltevorrichtungen für das Untersuchungsobjekt eingesetzt werden. Zur Quantifizierung der Körper, bevorzugt Blasen wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Bildauswertesystem zur Datenverarbeitung und Bildanzeige vorgesehen, mit dem die Quantifizierung videodensitometrisch durchführbar ist. Hierzu können die aus den Ultraschallsignalsätzen gebildeten Datensätze in bekannter Weise so umgeformt werden, dass ein Videobild der einzelnen Schnittschichten entsteht, wobei jede Schnittschicht die Information aus den Bereichen enthält, die mit einer vorausgehend angeregten Schnittschicht nicht überlappt (durch Verschiebung erreichter neuer Schnittschichtbereich (CS/SAE-Schicht)). Die in den einzelnen Videobildern dargestellten Körper, insbesondere Blasen können dann manuell ausgezählt oder durch videodensitometrische Ermittlung der Farbbildpunkte (Farbpixel) und Division des daraus erhaltenen Werts durch die mittlere Anzahl der Farbpixel pro Blasendarstellung erhalten werden.
Nachdem die Anzahl der Körper, bevorzugt Blasen nach vorstehend beschriebener Methode ermittelt worden ist, kann es zur korrigierten Ermittlung der Anzahl erforderlich sein, eine Korrektur nach folgender Formel vorzunehmen:
V FP
MUcorr = ∑FPx 1 + ∑FP
∑ + ∑
wobei
FP die die Körper-, insbesondere Blasensignale darstellenden Farbpixel in einer örtlich aufgelösten Bildschirmdarstellung innerhalb der Überlappungsschicht sind und GP Bildschirmgraupixel in einer örtlich aufgelösten Bildschirmdarstellung sind, die nicht die die Körper, insbesondere Blasen darstellenden Pixel sind.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist insbesondere für die Ultraschalldiagnostik und/oder -therapie am Menschen oder am Tier geeignet. Nicht nur in Bereichen der klinischen Diagnostik, sondern auch in der medizinischen und biologischen Grundlagenforschung und der vorklinischen Forschung und Entwicklung erschließen sich neue Untersuchungsmöglichkeiten:
Die Körper, bevorzugt Blasen können in vivo im Tierversuch, ex vivo in entnommenen Organen oder Geweben sowie in vitro z.B. in Zellkulturen quantifiziert werden, um pathologische oder physiologische Prozesse auf molekularer Ebene abzuklären.
Bei der Wirkstofffindung und Entwicklung spezifischer Bindungssysteme kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren geprüft werden, welche Bindungssysteme überhaupt funktionieren, welche Bindungsmoleküle unter welchen Bedingungen an welchen Stellen in welcher Menge vorliegen, welche Einflussgrößen die Bindungsfähigkeit und Anreicherung bestimmen, welche Kinetik die Körper, bevorzugt Blasen aufweisen oder, im Falle ultraschallinduzierter Wirkstofffreisetzung, welche Mengen ei- nes verkapselten Wirkstoffes freigesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren können beispielsweise für das /n-v/Vo-Mapping von physiologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben ab der postembryonalen Ontogenese eingesetzt werden (Ontogenese: Gesamtheit der Entwicklung eines Individuums von der unbefruchteten/befruchteten Eizelle bis zum natürlichen Tod: diese umfasst vier Phasen: 1. Embryonalentwicklung, 2. postembryonale Entwicklung, 3. Zeit der Geschlechtsreife und Fortpflanzung und 4. Zeit des Alterns).
Hierzu können sowohl passiv als auch aktiv akkumulierbare Körper, bevorzugt Blasen verwendet werden: Die Körper können zu diesem Zweck mit für die Marker spezifischen Bindungsmolekülen versehen werden, die sich an der Oberfläche befinden (aktiv akkumulierbare Körper/ Blasen). In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung können auch passiv akkumulierbare Körper eingesetzt werden, d.h. Körper/ Blasen ohne derartige spezifische Bindungsmoleküle.
Mit diesem Verfahren können molekulare Marker in vivo auf unterschiedlichen Zellen im Menschen und im Tier lokalisiert und deren Einfluss auf die Ontogenese bestimmt werden. Ferner kann ein zeitlich gesteuertes Mapping von bekannten und neu identifizierten molekularen Markern im Gesamtorganismus in vivo durchgeführt werden. Dadurch kann eine bisher noch nicht bekannte Funktion der molekularen Marker in der Onto- genese in vivo ermittelt werden.
Für die Gerontologie besonders interessant ist eine Identifizierung von molekularen Markern in der 4. Phase der Ontogenese (Zeit des Alterns) und deren Einfluss auf Alterungsprozesse. Hierzu kann mittels der erfindungsgemäßen räumlich hoch auf- gelösten Sonografie untersucht werden, aus welchen Alterserscheinungen diese molekularen Marker stammen und zu welchen diese führen können, ferner welche Basis diese Rezeptoren für altersbedingte Veränderungen oder Erkrankungen des Gesamtorganismus' darstellen und ob sich daraus Erkenntnisse für die Entwicklung von Medikamenten ableiten lassen, die altersbedingte Beschwerden lindern oder so- gar vermeiden helfen.
In einer weiteren interessanten Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein /n-wVo-Mapping von pathologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben während der Pathogenese, ebenfalls unter Verwendung von passiv und aktiv akkumulierbaren Körpern, insbesondere Blasen durchgeführt werden.
Mit diesem Verfahren können krankheitsassoziierte molekulare Marker in vivo auf unterschiedlichen Zellen im Menschen und im Tier lokalisiert und daher deren Einfluss auch auf die Pathogenese von Krankheiten in vivo bestimmt werden.
Weiterhin kann ein zeitlich gesteuertes Mapping von bekannten und neu identifizierten krankheitsassoziierten molekularen Markern im Gesamtorganismus während der Pathogenese in vivo durchgeführt werden. Dadurch kann eine bisher noch nicht be- kannte Funktion der molekularen Marker in der Pathogenese in vivo ermittelt werden.
Ferner lassen sich aus diesen Erkenntnissen neue therapeutische Medikamente und/oder Behandlungsstrategien dadurch ableiten, dass zu bestimmten Zeitpunkten die ermittelten Oberflächenzustände von Zellen (Status der Zellen bezüglich der Ak- tivierung / des Ruhezustandes) reguliert und diese Zustände mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verfolgt werden.
Schließlich ist ebenfalls eine hoch sensitive Therapieverlaufskontrolle in vivo dadurch möglich, dass die Oberflächenzustände von Zellen verfolgt werden.
Die vorstehenden Verfahren können auch ex vivo an entnommenen Organen und Geweben durchgeführt werden.
Das in v/Vo-Mapping der molekularen Marker in den Organen und Geweben ab der postembryonalen Ontogenese und während der Pathogenese kann selbstverständlich an verschiedenen Tierarten und/oder Tiermodellen, insbesondere in der Gerontologie oder für Krankheitsmodelle angewendet werden. Das Mapping kann allgemein auch für alle Tierarten, beispielsweise landwirtschaftliche Nutztiere, Haus- und Heimtiere sowie Wildtiere, und für den Menschen angewendet werden. Da das Mapping in vivo eingesetzt werden kann, erübrigen sich in vielen Fällen zeitlich und finanziell aufwendige herkömmliche in wϊro-Verfahren, beispielsweise die Immunhis- tochemie, die oftmals zusätzlich mit dem Nachteil der Notwendigkeit behaftet sind, molekulare Marker zu genau einem Zeitpunkt zu identifizieren und zu charakterisie- ren.
Weiterhin können die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Charakterisierung von Zellkulturen durch in ro-Mapping von hoch und herunter regulierbaren molekularen Markern der Zellen unterschiedlicher Herkunft eingesetzt werden, beispielsweise unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen oder zur Charakterisierung von neuen Zelllinien bzw. zur Neucharakterisierung von bestehenden Zelllinien nach verschiedenen Passagierungen bzw. unmittelbar vor deren Anwendung, insbesondere bei der Implantation von Tumorzellen in Mäusen, Ratten und anderen Tiermodellen. In diesem Fall können neben tierischen und menschlichen Zellen auch pflanzliche Zellen charakterisiert werden.
Auch in diesem Falle können die Körper, bevorzugt Blasen mit für die Marker spezifischen Bindungsmolekülen versehen werden. Zur Identifikation von molekularen Markern in den jeweiligen Anwendungsbereichen wird ausdrücklich auf folgende beispielhafte Publikationen hingewiesen, die hiermit als Referenz in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung einbezogen werden, wobei die darin beschriebenen Fragestellungen mit der Vorrichtung und mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung untersucht werden können:
1. Phelps, M.: "Positron emission tomography provides molecular imaging of biological processes". Proc. Natl. Acad. Soc, USA 2000, 97:9226-9233.
2. Weissleder, R., "Molecular imaging: exploring the next frontier". Radiology, 1999, 212:609-614.
3. Bremer, C, Tung, C.H., Weissleder, R., "In Vivo Molecular Target Assessment of Matrix Metalloproteinase Inhibition". Nat. Med., 2001 , 7:743-748.
4. Anderson, S.A., Rader, R.K., Westlin, W.F., et al., "Magnetic Resonance Con- trast Enhancement of Neovasculature with Alphavß3-Targeted Nanoparticles". Magn. Reson. Med., 2000, 44:433-439.
5. Sipkins, DA, Cheresh, DA, Kazemi, M.R., Nevin, L.M., Bednarski, M.D., Li, K.C., "Detection of Tumor Angiogenesis In Vivo by alphaVbeta3-Targeted Magnetic Resonance Imaging". Nat. Med., 1998, 4:623-626.
6. Bredow, S., Lewin, M., Hofmann, B., Marecos, E., Weissleder, R., "Imaging of tumour neovasculature by targeting the TGF-[beta] binding receptor endoglin".
Eur. J. Cancer, 2000, 36:675-681.
7. Sipkins, DA, Gijbels, K., Trapper, F.D., Bednarski, M., Li, K.C.P., Steinman, L., "ICAM-1 expression in autoimmune encephalitis visualized using magnetic resonance imaging". J. Neuroimmunol., 2000, 104:1-9. 8. Lindner, J.R., Song, J., Christiansen, J., Klibanov, A.L., Xu, F., Ley, K., "Ultrasound assessment of inflammation and renal tissue injury with microbubbles targeted to P-selectin". Circulation, 2001, 104:2107-2112.
10. Klibanov, A.L., Hughes, M.S., Marsh, J.N., et al., "Targeting of ultrasound contrast material: An in vitro feasibility study". Acta Radiol. Suppl., 1997, 38:113-120. 11. Demos, S.M., Dagar, S., Klegerman, M., Nagaraj, A., Mcpherson, D.D., Onyuksel, H., "In vitro targeting of acoustically reflective immunoliposomes to fibrin under various flow conditions". J. Drug Target, 1998, 5:507-518.
12. Villanueva, F.S., Jankowski, R.J., Klibanov, S., et al., "Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endo- thelial Cells". Circulation, 1998, 98:1-5.
Die Vorrichtung und das Verfahren zur Quantifizierbarkeit von Körpern, bevorzugt Blasen erlauben bzw. unterstützen somit beispielsweise auch:
- eine Dignitätsbestimmung von Tumoren,
- ein Staging von Tumoren,
- eine Therapieverlaufskontrolle z.B. bei der Chemotherapie,
- eine Erhöhung der Reproduzierbarkeit und damit der Vergleichbarkeit von Befunden unterschiedlicher Untersucher,
- eine Vermeidung von den Patienten belastenden Biopsien,
- eine Reduktion der Schichtdicke, aus der die im Ultraschallbild dargestellten CS-Signale stammen, wodurch sich Blasen-Anreicherungsgebiete im Millimeter-Bereich räumlich hochauflösend im Mikrometer-Bereich abbilden und be- züglich der Blasenkonzentration quantifizieren lassen.
Die Körper, insbesondere Blasen sind in der Regel in Ultraschallkontrastmitteln enthalten und werden vorzugsweise in Form von Suspensionen appliziert.
Prinzipiell können alle Körper, insbesondere (Mikro)-Blasen, die zur Anwendung als Ultraschallkontrastmittel geeignet sind, mit diagnostischem Ultraschall zu CS-Ef- fekten angeregt werden. Für das im Handel befindliche Ultraschallkontrastmittel Levovist® (Schering AG, Berlin), das Mikropartikel aus Galaktose und Palmitinsäure enthält und nach Zugabe von Wasser eine Suspension stabilisierter Gasbläschen ergibt, wurden auch CS -Effekte nach unspezifischer Anreicherung in der Leber beobachtet (Blomley, M.J. et al.: „Stimulated acoustic emission to image a late liver and spleen-specific phase of Levovist in normal volunteers and patients with and without liver disease". Ultrasound Med. Biol., 1999, Nov., 25(9):1341- Erfindungsgemäß bevorzugt sind partikuläre Ultraschallkontrastmittel, enthaltend Blasen in Form gasgefüllter Mikrokapseln bzw. gasgefüllter Mikropartikel, deren Hülle aus Polyalkylcyanacrylaten, insbesondere Polybutylcyanacrylat, besteht. Diese sind beschrieben in EP 0 644 777 B1 , insbesondere in den Beispielen: Danach wird Cya- nacrylsäurealkylester, beispielsweise Cyanacrylsäurebutylester, in saurer wässriger Lösung, die zusätzlich ein Tensid enthält, dispergiert. Die entstehenden Mikropartikel können durch Zentrifugation gewonnen werden. Besonders bevorzugt sind Blasen mit funktionalisierten Polyalkylcyanacrylaten, die gemäß dem in WO 01/68150 A1 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Daher wird das dort beschriebene Verfahren ausdrücklich in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung mit aufgenommen. Zur Herstellung der erfindungsgemäß bevorzugten Blasen werden die in WO 01/68150 A1 beschriebenen Polymere verwendet. Daher werden auch diese Ausgangsstoffe zur Herstellung der Blasen ausdrücklich in den Offenbarungs- inhalt der vorliegenden Anmeldung mit aufgenommen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für Ultraschallkontrastmittel verwendet werden, die verschiedene Körperarten, bevorzugt Blasenarten enthalten.
Die Körper können sich in mindestens einem der folgenden Merkmale unterscheiden:
- Art des soliden Materials,
- Größe,
- Bindungsmoleküle auf deren Oberfläche, - Anregbarkeit durch verschiedene Pulsformen,
- Zerstörbarkeit durch Schall,
- Art des charakteristischen Signals
- Art des Gases in dem Körper/ Blase,
- Art der Hülle eines Körpers/Blase, z.B. Materialdicke, Elastizität,.
Beispielsweise können solche Blasengemische bzw. deren Verteilungsmuster im Untersuchungsobjekt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls mit hoher räumlicher Auflösung quantifiziert werden, a) indem bei einer Position hintereinander verschiedene Pulsformen gesendet und/oder verschiedene charakteristische Signale empfangen werden; kommt es dabei nicht zur vollständigen Zerstörung der Blasen, kann ein Zerstörungspuls gesendet werden, bevor zur nächsten Position gefahren wird; oder, b) indem das zu untersuchende Gebiet mehrfach mit entsprechender definierter Verschiebung gescannt wird, wobei jeder Scan mit einer anderen für die jeweilige Blasenart notwendigen Pulsform durchgeführt wird.
Es können sowohl verschiedene Pulsformen, als auch verschiedene Schallfeldverschiebungen miteinander kombiniert werden, solange die resultierende Überschneidung der Schallfelder definiert und in Bezug auf deren räumliche Ausdehnung berechenbar erfolgt und solange die eingesetzten Blasen anhand charakteristischer Signale detektiert werden können.
Unterscheiden sich die Blasen gleichzeitig in dem Bindungsmolekül auf der Oberfläche und in ihrer Zerstörbarkeit durch Schall, kann zur Ermittlung der in-vivo-, ex vivo- und in v/fro-Verteilung der Bindungsstellen in der Untersuchungsregion folgendermaßen vorgegangen werden:
a) es werden zwei unterschiedliche Blasenarten injiziert: i. Blasenart A, mit geringem Schalldruck zerstörbar und mit Bindungsmolekül
Anti-X für in-vivo-Bindungsstelle X auf der Oberfläche, und ii. Blasenart B, mit hohem Schalldruck zerstörbar und mit Bindungsmolekül Anti-Y für in-vivo-Bindungsstelle Y auf der Oberfläche, b) Anfahrt der errechneten Position, c) Aufnehmen von einem oder mehreren Bildern mit niedrigem Schalldruck, Datenspeicherung, d) Aufnehmen von einem oder mehreren Bildern mit hohem Schalldruck, Datenspei- cherung, e) definierte Verschiebung des Schallfeldes, f) Wiederholung der Schritte c) - e) bis zum Ende des Scans, g) Auswertung der Daten für die Bindungsmoleküle X und Y, deren Anzeige auf dem Monitor und Speicherung. Bei allen genannten Varianten wird die Sättigungsblasen-Konzentration um den Faktor erhöht, in dem die jeweils zwischen zwei Bildern bzw. Schallkeulen zurückgelegte Strecke zur Schichtdicke des gesamten Schallfeldes steht. Bei einer 10 μm- Verschiebung und einer Schichtdicke von 1 mm erhöht sich die Sättigungsblasen- Konzentration um den Faktor 100. Gleichzeitig verringert sich die Schichtdicke des Gewebes, aus dem die neu hinzugekommenen Blasen stammen, um denselben Faktor.
Dadurch kann eine histologische Auflösung erreicht werden. Da dieses Prinzip auch in vivo anwendbar ist, kann man bezüglich der dargestellten Signale auch von einer „in wVo-Sono-Histologie" oder im Fall einer spezifischen Blasen-Anreicherung von einer sonografischen ,,/π- Vo-lmmunohistologie" sprechen.
Die gemessenen MU können für eine Diagnose beispielsweise folgendermaßen ausgewertet werden:
A. Vergleich der gemessenen MU bei konstant gehaltener CS/SAE-Schichtdicke und Dosis zur intraindividuellen Verlaufskontrolle einer Therapie.
B. 1) Zunächst Ermittlung der Abhängigkeit der gemessenen MU von der CS/SAE-
Schichtdicke und/oder Dosis in einem speziellen Messfenster (Leber, Tumoroberfläche, Gefäßendothel etc.) anhand einer möglichst großen Population. Die Population kann aus Individuen bestehen, die sich hinsichtlich der Ver- teilung und des Anreicherungsgrades der Blasen im Messfenster nicht unterscheiden, d.h. die homogen ist oder aber die diesbezüglich gruppiert ist. Diese Abhängigkeiten müssen in der Regel bei verschiedenen Ultraschallgerä- tesettings (Schallkopf, Detektionsmode usw.) ermittelt werden.
2) Ermittlung von linearen Korrelationsfunktionen im Bereich von 20 bis 80 %, vorzugsweise im Bereich von 30 bis 70 % Farbsättigung.
3) Ggf. Integration der linearen Korrelationsfunktionen in eine Auswertungssoftware des Ultraschallgerätes.
4) Zählung der CS-Signale im entsprechenden Messfenster eines Untersuchungsobjekts, beispielsweise eines Patienten. 5) Anhand der linearen Korrelationsfunktionen: Bestimmung der absoluten Blasenanzahl bzw. der Blasenkonzentration im speziellen Messfenster des Patienten, wenn Farbsättigung im Geltungsbereich der linearen Korrelationsfunktion liegt.
C. 1 ) Zunächst Ermittlung der Abhängigkeit der absolut gezählten CS-Signale von der CS/SAE-Schichtdicke und/oder Dosis in einem speziellen Messfenster (Leber, Tumoroberfläche, Gefäßendothel usw.) anhand einer möglichst großen Population. Die Population kann aus Individuen bestehen, die sich hin- sichtlich der Verteilung und des Anreicherungsgrades der Blasen im Messfenster nicht unterscheiden, d.h. die homogen ist oder aber die diesbezüglich gruppiert ist. Diese Abhängigkeiten müssen in der Regel bei verschiedenen Ultraschallgerätesettings (Schallkopf, Detektionsmode usw.) ermittelt werden. 2) Durchführung von Kurvenfits, Ermittlung von die jeweilige Kurve beschreibenden Korrelationsfunktionen.
3) Ggf. Integration der Korrelationsfunktionen in eine Auswertungssoftware des Ultraschallgerätes.
4) Zählung der CS-Signale im entsprechenden Messfenster eines Patienten. 5) Anhand der Korrelationsfunktionen: Bestimmung der absoluten Blasenanzahl bzw. der Blasenkonzentration im speziellen Messfenster des Patienten.
Die Erfindung soll mit folgenden Beispielen belegt werden, ohne dass der Schutzumfang der Erfindung dadurch beschränkt wird. Hierzu wird erläuternd auch auf nachfolgende Figuren Bezug genommen. Es zeigen im Einzelnen:
Fig. 12: Blasenanreicherung in der Leber, Ratte 1 (Beispiel 2): 1 * 108 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min. p.i. a: SAE-Schichtdicke =ca. 1 mm b: SAE-Schichtdicke = 20 μm
Fig. 13: Blasenanreicherung in der Leber, Ratte 2 (Beispiel 2): 1 * 107 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min. p.i. a: SAE-Schichtdicke =ca. 1 mm b: SAE-Schichtdicke = 20 μm
Fig. 14: Abhängigkeit der MU von der SAE-Schichtdicke
Ratte 1 (Beispiel 2): 1 * 108 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min.
Fig. 15: Abhängigkeit der MU co„, von der SAE-Schichtdicke
Ratte 1 (Beispiel 2): 1 * 108 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min.
Fig. 16: Abhängigkeit der SAECOrrvon der SAE-Schichtdicke Ratte 1 (Beispiel 2): 1 * 108 Biasen/ml; Messung ex vivo, 30 min.
Fig.17: Abhängigkeit der MU von der SAE-Schichtdicke
Ratte 2 (Beispiel 2): 1 * 107 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min.
Fig. 18: Abhängigkeit der MUcorr von der SAE-Schichtdicke
Ratte 2 (Beispiel 2): 1 * 107 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min.
Fig. 19: Abhängigkeit der SAE∞rr von der SAE-Schichtdicke
Ratte 2 (Beispiel 2): 1 * 107 Blasen/ml; Messung ex vivo, 30 min.
Fig. 20: Anreicherung von spezifischen Blasen, an deren Oberfläche anti-CD-105 Antikörper gekoppelt sind, im F9-Teratom einer Maus (Beispiel 3) a: Grafische Darstellung b: Sonografischer Längsschnitt des Tumors in Scan-Richtung Bereich zwischen den Linien 16 und 17: Tumor beim ersten Scan
Bereich zwischen den Linien 18 und 19: Tumor beim zweiten Scan
Fig. 21 : Farbsignale der im Tumor angereicherten spezifischen Blasen (vier Mäuse, Beispiel 3) im Vergleich zur Isotyp-Kontrolle (vier Mäuse, Beispiel 3). Beispiel 1 :
Agar-Phantom enthaltend 30.000 Blasen/ml:
(a) Herstellung der Blasen:
Die Blasen werden gemäß Beispiel 4 (a) hergestellt.
(b) Herstellung des Agar-Phantoms enthaltend 30.000 Blasen/ml:
® 665 ml Wasser (Ampuwa , Fresenius) wurden in einem Wasserkocher (Braun, Typ 3
217 WK 210) gekocht und in ein 1000 ml Becherglas überführt. Es wurden 1 ,7 g Benzoesäure (Merck) zur Konservierung und 10 g Agar (Merck) unter Rühren hinzugegeben. Die Agariösung wurde in einer Mikrowelle (Bosch HMT 702 C, 800 W) er- neut kurz aufgekocht und anschließend auf 40°C abgekühlt.
Vor Zugabe der Blasen zur Agar-Lösung wurde die Blasenkonzentration mit 0,02 %iger (m/m) Triton X 100-Lösung auf 6 * 108 Blasen/ml eingestellt. Davon wurden 33 μl (2 * 107 Blasen) vorsichtig ohne Eintrag von Luftblasen in die Agarlö- sung eingerührt. Die Agariösung wurde anschließend in eine Glasschale
(14 cm * 19 cm * 4 cm) gegossen, in der sich diese als Gel verfestigte (Agar- Phantom).
(c) Versuchsaufbau und Durchführung:
Ein ca. 4 cm breiter Streifen des Agar-Phantoms wurde in ein mit Wasser gefülltes Kunststoff becken gelegt. Ein Schallkopf (L 10-5, ATL UM9, Farbdoppler-Mode, MI: 1 ,1 , Persistenz: 0, Priorität: maximal, Größe der Color-Box: maximal, Eindringtiefe: 3 cm, Focus: 2 cm) wurde mit einem Stativ senkrecht so über dem Phantom befestigt, dass er in das Wasser eintauchte.
Das Becken wurde zusammen mit dem Phantom 1. per Hand in Querrichtung unter dem Schallkopf mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 cm/s verschoben, was einer Verschiebungsstrecke von ca. 1 mm/frame entsprach, oder
2. auf einen Servomotor (Limes 150, OWIS GmbH, Motorcontroller DC 500) ge- stellt, und automatisch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten unter dem fixierten Schallkopf vorbeigefahren. Die Geschwindigkeiten wurden dabei so gewählt, dass unter Berücksichtigung der gegebenen Bildrate des Ultraschallgerätes von 5,8 Bildern/Sekunde und kontinuierlicher Bewegung des Agar-Phantoms folgende Verschiebungsstrecken je Bild resultierten: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μm/frame. Die dazu erforderlichen Geschwindigkeiten
(μm/s) wurden wie folgt errechnet:
Geschwindigkeit [μm/s] = Verschiebestrecke/Bild [μm/frame] x Bildrate des Ultraschallgerätes [frame/s]
(d) Quantifizierung der SAE-Signale:
® Die entstehenden Videobilder wurden videodensitometrisch mit QuantiCon (Echotech 3D Imaging Systems GmbH) wie folgt ausgewertet:
Während des Scans wurden die Videobilder mit einer Sample-Rate entsprechend der vom Ultraschallgerät gegebenen Bildrate (hier 5,8 Bilder/Sekunde) digitalisiert (QuantiCon). Dazu wurde in QuantiCon zuvor ein trigger-delay von 172 ms (1000 ms/5,8) eingegeben.
Um farbige Rauschsignale von SAE-Signalen abzutrennen, wurde für die Farbwerte vor der Auswertung des 3D-Datensatzes zunächst ein Schwellwert von 40 definiert. Nur die dann oberhalb dieses Schwellwertes verbleibenden „segmentierten Farbwerte" (40 - 255) wurden zur Auswertung verwendet. In Fig. 8 ist die 3D-Ansicht des gescannten Agar-Phantoms gezeigt, wie es aus dem 3D-Datensatz in Quanticon generiert wurde. Sowohl die Pixelanzahl der Grauwerte als auch die Pixelanzahl der segmentierten Farbwerte aller Bilder des Datensatzes wurden exportiert und mit MS- Excel® (Microsoft) weiterverarbeitet. Die in MS-Excel erstellte Grafik der segmentierten Farbwerte (MU) ist in Fig. 9 in Abhängigkeit von der SAE-Schichtdicke dargestellt. Entsprechend der unter „korrigierte MU" definierten Korrekturformel wurde jeder einzelne Farbwert korrigiert. Die resultierende Abhängigkeit von der SAE-Schichtdicke ist in Fig. 10 (MUcorr.) dargestellt.
Um die Summe der segmentierten Farbwerte in einzelne SAE-Signale bzw. einzelne Blasen umzurechnen, wurde zunächst der Umrechnungsfaktor Fsae ermittelt. Dazu wurde in 20 Schnittbildern zunächst die Summe der SAE-Signale durch Zählung per Hand ermittelt. Anschließend wurde die Summe der segmentierten Farbpixel durch die Summe der in den entsprechenden Bildern per Hand gezählten SAE-Effekte dividiert. Es wurde ein Mittelwert von 44 Farbpixel pro SAE-Signal ermittelt. Die über diesen Faktor von MUcorr.. auf die Anzahl der korrigierten SAE-Signale (SAECOrr.) umge- rechnete Grafik ist in Fig. 11 dargestellt.
In Tab. 1 sind die den Fig. 9 bis 11 zugrundeliegenden Daten aufgelistet: Tab. 1:
Der Kurvenbereich zwischen 30 und 70 μm SAE-Schichtdicke (~ 37 - 81% Farbsätti- gung) lässt sich mit einer linearen Korrelationsfunktion beschreiben. Es ergeben sich Korrelationskoeffizienten von 0,990 für die unkorrigierten MU bzw. 0,996 für die korrigierten MU/SAE.
Werden auch die Punkte außerhalb dieses Bereiches bei der linearen Korrelation berücksichtigt, verschlechtern sich die Korrelationskoeffizienten bis auf 0,971 für MU, bzw. 0,981 für die korrigierten MU/SAE.
(e) Ergebnis:
(a) Alle Bilder, die beim Verschieben des Phantoms per Hand und einer Verschiebungsstrecke von ca. 1 mm/frame entstanden, sind vollständig mit SAE-Signa- len gesättigt. Die Sättigungsblasen-Konzentration ist überschritten und eine Quantifizierung unmöglich. (b) Bei der automatischen Verschiebung mit Überlappung der Schallfelder wurden bei einer Verschiebung von 10 μm/frame nur vereinzelte SAE-Signale detektiert (Fig. 8). Mit zunehmender Geschwindigkeit nahm auch die Anzahl der SAE-Signale/frame zu. Erst ab einer Verschiebung von 100 μm/frame kam es zu einer Farbsättigung im Bild.
Somit führt eine Blasenkonzentration von 30.000 Blasen/ml bei einer Schichtdicke von 100 μm zu einer SAE-Sättigung. Daraus ergibt sich für eine Schichtdicke von 1 mm eine Sättigungsblasen-Konzentration von ca. 3.000 Blasen/ml.
(f) Diskussion:
Im Gegensatz zu herkömmlichen Scanverfahren wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Blasenquantifizierung selbst bei Blasenkonzentrationen größer als 3.000 Blasen/ml möglich.
Durch die definiert überlappende Verschiebung eines Objektes gegen den Schallkopf werden in jedem Schnittbild nur die neu hinzugekommenen Blasen aus dem nicht überlappenden Volumen detektiert. So kann die SAE-Schichtdicke auf die jeweilige Verschiebungsstrecke pro Bild reduziert werden. Die Sättigungsblasen-Konzentration erhöht sich in dem Verhältnis, in dem die tatsächliche Schichtdicke des Schallfeldes zur Verschiebungsstrecke bzw. zur SAE-Schichtdicke steht. Eine 10 μm-Verschie- bung von Bild zu Bild erhöht gleichzeitig die räumliche Auflösung und die Sättigungsblasen-Konzentration um den Faktor 100 bei einer Schichtdicke des Schallfeldes von 1 mm.
Beispiel 2:
Ex vivo Quantifizierung von unspezifisch angereicherten Blasen in der Leber von Ratten
(a) Herstellung der Blasen:
Die Blasen wurden gemäß Beispiel 4 (a) hergestellt.
(b) Untersuchung:
Es wurden zwei zwei Ratten (Wistar SCHOE, 220g, weiblich) untersucht. Den Ratten wurden verschiedene Dosen der nach a) hergestellten Blasensuspension i.v. über die Schwanzvene injiziert. Für Ratte 1 wurde eine Verdünnung auf 1 * 108 Blasen/ml, für Ratte 2 auf 1 * 107 Blasen/ml in 0,9 %iger (m/m) NaCI-Lösung, enthaltend 0,02 % (m/m) Triton X 100, hergestellt.
Ratte 1 : 1 * 108 Blasen/kg (1 * 108 Blasen/ml, 220 μl i.v.) Ratte 2: 1 * 107 Blasen/kg (1 * 107 Blasen/ml, 220 μl i.v.)
30 Minuten nach Injektion wurden die Ratten durch i.p. Injektion von 1 ml einer 1 :1 Volumenmischung aus Rompun 2 % (20 mg Xylazin/ml) und Ketavet 100 mg/ml (100 mg Ketamin-Base/ml) getötet:
Der rechte Leberlappen wurde jeweils entnommen und in ein mit 0,9 %iger (m/m) Natriumchlorid-Lösung gefülltes Gefäß gelegt.
Die Gefäße mit den Leberlappen wurden:
1. per Hand in Querrichtung unter dem Schallkopf mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 cm/s verschoben, was einer Verschiebungsstrecke von ca. 1 mm/frame entsprach oder 2. auf einen Servomotor (Limes 150, OWIS GmbH, Motorcontroller DC 500) gestellt, und automatisch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten unter dem fixierten Schallkopf vorbeigefahren; die Geschwindigkeiten wurden dabei so gewählt, dass unter Berücksichtigung der gegebenen Bildrate des Ultraschallgerätes von 5,8 Bildern/Sekunde und kontinuierlicher Bewegung des Gefäßes folgende Verschiebungsstrecken je Bild resultierten:
Ratte 1 (1 * 108 Blasen/kg): 15, 20, 30 μm/frame Ratte 2 (1*107 Blasen/kg): 20, 40, 80, 120 μm/frame Die Ultraschalluntersuchung wurde analog Beispiel 1 mit den gleichen Gerätesettings durchgeführt. Die Leber wurde in einem Abstand von 2 cm am Schallkopf vorbeigefahren. Für alle Messungen wurde die gleiche ROI verwendet. Die Größe der ROI (ca. 2 mm * 6 mm, gemessen an der Skala des Ultraschallgerätes) wurde so gewählt, dass die ROI bei allen ausgewerteten Bildern vollständig im Bereich des Lebergewebes lag. Bei allen Messungen wurde die gleiche Vergrößerung in Quanticon® gewählt.
Zur Ermittlung des Verhältnisses von Bildschirmpixel zu Objekt-Länge [mm] wurde eine quadratische ROI von 2 mm Kantenlänge (ermittelt anhand der im Ultraschallbild dargestellten Längen-Messskala) im Ultraschallbild gemessen. Dazu wurde das Bild mit der in Quanticon® vorhandenen Zoom-Funktion entsprechend vergrößert. Die Pixelsumme in dieser ROI (MU) betrug 225. Daraus konnte ein Verhältnis von EINBETTEN56,25 Pixel/mm2 (225/4) errechnet werden. Über das gemessene Volumen (Fläche der ROI x Verschiebestrecke/frame) wurde anschließend die Blasenkonzentration/ml Leber errechnet. Um die Rohdaten (FP, GP, S) in die Blasenkonzentration C im Gewebe umzurechnen, wurde folgende Formel angewendet:
C: Blasenkonzentration in [Blasen/ml] bzw. [SAEcorr/ml] S: SAE-Schichtdicke, bzw. die Verschiebung zwischen zwei Bildern in [mm]
FP: Bildschirmpixel, die innerhalb des Messfensters (ROI) im Bereich der dargestellten SAE-Effekte liegen. GP: Bildschirmpixel, die innerhalb des Messfensters (ROI) außerhalb der dargestellten SAE-Effekte liegen. ∑sae: Summe der in einem Ultraschallbild dargestellten SAE-Signale
Ff : Summe aller Bildschirmpixel in einem mm2 (gemessen anhand der im Ultraschallbild angezeigten Längenscala)
(c) Ergebnis:
In Tab. 2 sind die Blasenkonzentrationen der Ratten einander gegenübergestellt. Tab. 2 enthält zusätzlich die Mittelwerte der prozentualen Farbsättigung bei der jeweiligen SAE-Schichtdicke.
Tab. 2
1. Alle Bilder, die beim Verschieben der Leber per Hand und einer Verschiebungsstrecke von ca. 1 mm/frame entstanden, waren mit SAE-Signalen vollständig gesättigt (Fig. 12a, Fig. 13a). Die Sättigungsblasen-Konzentration war überschritten und eine Quantifizierung unmöglich.
2. Bei der automatischen Verschiebung mit Überlappung der Schallfelder wurden bei Ratte 1 (Dosis: 1 * 108 Blasen/kg) bei SAE-Schichtdicken von 20 bis 120 μm/frame SAE-Signale in einer quantifizierbaren Anzahl detektiert (Fig. 12b: SAE-SchichtdPcke: 20 μm), bei Ratte 2 (Dosis: 1 * 107 Blasen/kg) bei SAE-Schichtdicken von 10 bis 30 μm/frame (Fig. 13b: SAE-Schichtdicke: 20 μm). Mit zunehmender Geschwindigkeit nahm auch die Anzahl der SAE- Signale/frame zu.
3. Bei Ratte 1 wurde ein linearer Korrelationskoeffizient von 1,000 für die Abhängigkeit der unkorrigierten MU von der SAE-Schichtdicke errechnet (Fig. 14). Der lineare Korrelationskoeffizient für die Abhängigkeit der korrigierten MU (MUcorr.) bzw. korrigierten SAE (SAEcorr.) von der SAE-Schichtdicke zwischen 15 μm und 30 μm lag jeweils bei 0,995 (Fig. 15 und 16).
4. Bei Ratte 2 wurde ein linearer Korrelationskoeffizient von 0,984 für die Abhängigkeit der unkorrigierten MU von der SAE-Schichtdicke errechnet (Fig. 7). Der lineare Korrelationskoeffizient für die Abhängigkeit der korrigierten MU (MUcorr.) bzw. korrigierten SAE (SAEcorr.) von der SAE-Schichtdicke zwischen 20 μm und 120 μm lag jeweils bei 0,995 (Fig. 18 und 19).
5. Die Blasenanzahl steht in einem linearen Verhältnis zur SAE-Schichtdicke.
(d) Diskussion:
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch in entnommenen Organen, in denen sich Blasen unspezifisch anreichern, anwendbar. Es besteht eine enge Korrelation zwischen der im Schnittbild dargestellten Anzahl von SAE-Signalen und der entsprechenden SAE-Schichtdicke. Die Blasenkonzentration in den Lebern der untersuchten Ratten unterscheidet sich deutlich in Abhängigkeit von der applizierten Dosis.
Beispiel 3:
In v/Vo-Quantifizierung von spezifisch angereicherten USKM im F9-Teratom der Maus:
Mit dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde die Anreicherung von spezifischen Blasen, an deren Oberfläche anti-CD 105-Antikörper gekoppelt waren, in Tumoren von F9-tumortragenden Mäusen (swiss-nude) nach i.v. Injektion in vivo untersucht. Als Kontrollsubstanz dienten Blasen, an deren Oberfläche lgG2a-Antikörper (Isotyp- Kontrolle) gekoppelt waren.
(a) Herstellung der spezifischen Blasen:
Die spezifischen Blasen wurden gemäß Beispiel 4 (a) bis (e) hergestellt und charakterisiert. Die Antikörper-Kopplung wurde nach Beispiel 4 (f) durchgeführt.
(b) Herstellung der Isotyp-Kontrolle:
Die Isotyp-Kontroll-Blasen wurden nach Beispiel 4 (a) bis (e) hergestellt und charakterisiert. Die Isotyp-Kopplung wurde gemäß Beispiel 4 (g) durchgeführt.
(c) Tumorinokulation:
In Kultur subkonfluent gewachsene F9-Tumorzellen wurden trypsiniert, zentrifugiert und in PBS mit Ca2+/Mg2+ resuspendiert. Nach Färbung mit Trypanblau und Berechnung der Zellkonzentration wurde die Zellsuspension auf eine Konzentration von 6 * 107 Zellen/ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde bis zum Gebrauch auf Eis gekühlt. Von dieser Zellsuspension wurden zehn weiblichen Nacktmäusen (Swiss.nude, 18 - 20g KGW) je 50 μl pro Tier subkutan (= 3 * 106 Zellen/Tier) mittels einer Hamil- tonspritze und 27G-Kanüle in die linke Flankenregion inokuliert. Das Wachstum der Tumore (Länge und Breite) wurde durch Messung mit einer Schieblehre kontrolliert, und das Volumen des Tumors nach folgender Formel näherungsweise bestimmt:
L x B2 /2
L: Länge [mm] B: Breite [mm]
Die Tiere wurden 12 bis 14 Tage nach Tumorinokulation untersucht. In der vorliegenden Untersuchung lagen die Tumorgrößen zu diesem Zeitpunkt zwischen 230 und 1600 mm3. (d) Applikation der spezifischen Blasen und der Isotyp-Kontrolle
Vier Mäusen wurde ein Ultraschallkontrastmittel, enthaltend spezifische Blasen (her- gestellt und charakterisiert nach Beispiel 4 (a) bis (e) und Antikörper-Kopplung nach Beispiel 4 (f)), im wachen Zustand i.v. in einer Dosis von 1 * 109 Blasen / kg KGW injiziert (entsprach 200 μl der Suspension nach Beispiel 4 (g) je 20 g Maus). Die spezifischen Blasen waren gasgefüllte Mikrokapseln, deren Hülle aus funktionalisiertem Polybutylcyanacrylat bestand und an deren Oberfläche anti-CD105-Antikörper ge- koppelt waren. Als Kontrollsubstanz wurde vier weiteren Mäusen auf die gleiche Weise ein Ultraschallkontrastmittel, enthaltend unspezifische Blasen (hergestellt und charakterisiert nach Beispiel 4 (a) bis (e) und Isotyp-Kopplung nach Beispiel 4 (g)), injiziert. Die unspezifischen Blasen waren gasgefüllte Mikrokapseln, deren Hülle ebenfalls aus funktionalisiertem Polybutylcyanacrylat bestand, an deren Oberfläche aber lgG2a (Isotyp-Kontrolle) gekoppelt war.
Die Tumore aller Tiere wurden 60 min nach Applikation des jeweiligen Ultraschallkontrastmittels hinsichtlich des Anreicherungsgrades mit dem Verfahren gemäß Beispiel 1 untersucht.
(e) Ultraschalluntersuchung:
Für die Untersuchung wurden die Mäuse mit einer 1 : 1 Volumenmischung aus einer Verdünnung (1 + 9) von Rompun®2 % (20 mg Xylazin/ml) und einer Verdünnung (1 + 4) von Ketavet® 100 mg/ml (100 mg Ketamin-Base/ml) in jeweils physiologischer NaCI-Lösung narkotisiert. Von dieser Narkosemischung wurden 200 μl je 20 g Maus i.p. injiziert.
Die Maus wurde auf einem Träger, der am beweglichen Teil eines Servomotors (Li- mes 150, OWIS GmbH, Motorcontroller DC 500) befestigt war, mit Klebstreifen fixiert. Der Servomotor wurde vertikal mit einem Stativ so justiert, dass der Träger mit der Maus in ein Wasserbecken (zugeschnittene, eckige Plastikflasche) reichte. Vor jedem Scan wurde das Becken mit frischem und auf 37°C temperiertem Wasser ge- füllt. Ein Schallkopf (L 10-5, ATL UM9) wurde mit Koppelgel versehen und mit einem Stativ horizontal auf die Seitenwand des Wasserbeckens aufgesetzt. Die Maus wurde unter visueller und sonografischer Kontrolle so weit in das Becken gefahren, dass der Tumor noch nicht in das Schallfeld geriet. Sollten Luftblasen auf der Haut anhaf- ten, wurden diese entfernt, indem mit einem rund gebogenen Draht, der mit Flüssigseife bestrichen worden war, vorsichtig über die Haut gestrichen wurde. Danach wurde die Maus einige Millimeter zurückgefahren. Vor dem Scan wurden die nötigen Ge- rätesettings am Ultraschallgerät eingestellt (Farbdoppler-mode, MI: 1 ,1 , Persis- tenz: 0, Priorität: maximal, Eindringtiefe: 3 cm, Focus: 2 cm). Der Scan wurde mit einer konstanten SAE-Schichtdicke von 285 μm/frame gefahren. Dabei lag der Tumor im Bereich des Fokus. Nach dem Scan wurde das Bild „eingefroren", so dass der Schallkopf kein Signal sendete. Die Maus wurde auf die Startposition zurückgefahren. Der Schallkopf wurde wieder eingeschaltet, und das Tier wurde erneut mit den gleichen Gerätesettings und der gleichen SAE-Schichtdicke gescannt. Der zweite Scan wurde benötigt, um Farbsignale zu identifizieren, die nicht durch SAE- Signale hervorgerufen wurden, und diente als Kontrollwert. Solche Signale konnten durch fließendes Blut oder größere Luftblasen hervorgerufen worden sein.
Bei der hier verwendeten Narkose war die Atemfrequenz des Tieres in der Regel tief genug, um einen Scan von ca. 3 cm bei der hier verwendeten SAE-Schichtdicke innerhalb einer Atempause ohne Bewegungsartefakte durchführen zu können (Fig. 20b). Bei längeren Untersuchungszeiten (z.B. bei geringerer SAE-Schichtdicke) oder bei höherer Atemfrequenz konnten Atmungsartefakte folgendermaßen vermieden werden:
a) Fixierung des Tieres auf einem Kunststoffträger mit einer Aussparung von mindestens der Tumorgröße, so dass der Tumor in der Aussparung lag, b) Messung der Atembewegung des Tieres (z.B. mit Dehnungsmessstreifen, Staudruck-Messverfahren usw.) und Verwendung als Triggersignal zur Steue- rung sowohl des Ultraschallgerätes, als auch des Servomotors. (f) Auswertung:
Es wurde ein Schnittbild in Scan-Richtung generiert (Fig. 20b) und dieses mit der korrespondierenden Grafik der Messwerte (Fig. 20a) im gleichen Maßstab überein- andergelegt. Die Summe der farbigen Bildschirmpixel innerhalb des Tumors wurde mit Quanticon® (3D-Echotech) ausgewertet. Zur Auswertung wurden nur die im Tumor liegenden Farbsignale (MUFP: 20) und nicht die Grausignale (MUGP: 21) berücksichtigt. Die in Fig. 20a/b eingezeichneten Linien 16 und 17 grenzen den Tumorbereich während des ersten Scans ein. Der Bereich des zweiten Scans ist zwischen den Linien 18-19 gezeigt.
Im Übrigen bedeuten im Einzelnen: Bezugsziffer 20: Farbsignale (MUFP), Bezugsziffer 21 : Grausignale (MUGP), Bezugsziffer 22: Summe aus MUFP und MUGp, bzw. das gemessene Gewebevolumen.
(g) Ergebnis:
Für die Isotyp-Kontrolle wurden im Tumor deutlich weniger Farbsignale (MU) gemessen (Fig. 21).
(h) Diskussion:
Das Ergebnis zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Quantifizierung von spezifisch angereicherten Blasen im lebenden Organismus geeignet ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist selbst dann ein signifikanter Unterschied detektierbar, wenn nicht mit maximaler räumlicher Auflösung gescannt wird und es in einigen Bereichen einiger Schnittbilder zu einer SAE-Sättigung kommt. Die Signalanzahl bei einer spezifischen Blasenanreicherung kann von Rest-Signalen des Blutgefäßsystems und/oder von Signalen einer unspezifischen Blasenanreicherung unterschieden werden. Beispiel 4: Herstellung der Ultraschallkontrastmittel:
(a) Herstellung der Mikrokapselsuspension:
In einem zylindrischen Stahlreaktor (Innenmaße: Höhe = 37 cm, Durchmesser = 29 cm) wurden 7 I einer wässrigen 1 %igen (m/m) Octoxynol-Lösung bei einem pH- Wert von 2,5 vorgelegt und mit einem Mischer (Dissolverscheibe: Durchmesser = 60 mm, Rührwelle: Länge = 30 cm, Eintauchwinkel = 10°) bei hohem Schergefälle (4000 UpM) gemischt und temperiert (Temperatur der Lösung = 32°C), so dass eine Selbstbegasung (d.h. ein durch das Dispergieren bedingter Lufteintrag ins Medium mit starker Schaumbildung) stattfand. 100 g Cyanacrylsäurebutylester wurden rasch (< 3 Minuten) zugegeben und dispergiert (direkt vor Zugabe wurde die Drehgeschwindigkeit des Mischers auf 8000 UpM erhöht). Es wurde 60 Minuten lang unter Selbstbegasung polymerisiert, wobei sich gasgefüllte Mikrokapseln (Blasen im Sinne der der Anmeldung zugrundeliegenden Definition) ausbildeten. In einem Scheidetrichter wurde das Flotat im Schwerefeld der Erde drei Tage lang separiert, der Unterstand abgelassen und das Flotat mit 3 I einer wässrigen 0,02 %igen (m/m) Octoxynol-Lösung resuspendiert. Die so erhaltene Mikrokapselsuspension hatte einen Polymergehalt von 9,46 mg/ml, eine Dichte von 0,943 g/ml und einen pH-Wert von 3,5.
(b) Partikelgröße und -konzentration der gasgefüllten Mikrokapseln:
Die Partikelgrößenverteilung der Mikrokapselsuspension gemäß Beispiel 4 (a) wurde mit einem Partikelzähler der Firma Particle Sizing Systems, Typ AccuSizer 770, be- stimmt (Messmedium: wässrige 0,02 % (m/m) Triton X100-Lösung). Die volumenge- wichtete Partikelgrößenverteilung reichte von 0,8 bis 10 μm mit einem Maximum bei 1 ,8 μm, und die Mikrokapselkonzentration betrug 7,2 * 109 (± 1 * 108) Partikel pro ml.
(c) Funktionalisierung der gasgefüllten Mikrokapseln durch partielle Seitenkettenhyd- rolyse:
2.500 g einer Mikrokapselsuspension gemäß Beispiel 4 (a) wurden unter Rühren mit 501 g Natronlauge mit der Konzentration 8 * 10"2 mol/l versetzt. Im Reaktionsansatz stellte sich ein pH-Wert von 12 ein. Es wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert mit 1 N Salzsäure auf pH 3,5 eingestellt.
(d) Partikelgröße und -konzentration der gasgefüllten Mikrokapseln:
Die Partikelgrößenverteilung der Mikrokapselsuspension gemäß Beispiel 4 (c) wurde mit einem Partikelzähler der Firma Particle Sizing Systems, Typ AccuSizer 770, bestimmt (Messmedium: wässrige 0,02 % (m/m) Triton X100-Lösung). Die volumenge- wichtete Partikelgrößenverteilung reichte von 0,8 bis 10 μm mit einem Maximum bei 1 ,8 μm, und die Mikrokapselkonzentration betrug 6,0 * 109 (± 1 * 108) Partikel pro ml.
(e) Bindung von Streptavidin an funktionalisierte gasgefüllte Mikrokapseln:
Die Mikrokapselsuspension gemäß Beispiel 4 (c) wurde durch mindestens fünfmalige Flotation gegen 0,02 %ige (m/m) Triton-X100-Lösung (pH = 4,5, eingestellt mit Salzsäure) gereinigt. 7.5 * 108 Partikel der gereinigten Suspension wurden mit 15 ml Na- triumacetat-Puffer in ein Scintillation-Vial gegeben und mittels Stickelrührer auf einem Magnetrührer gerührt. (Natriumacetat-Puffer = Lösung A: 1,36 g NaCH3COO * 3 H2O, M = 136,08 g/mol, Riedl-de Haen ad 500 ml Wasser, Lösung B: 571 μl Eisessig, M = 60,05 g/mol, ad 500 ml Wasser, 400 ml Lösung A wurden vorgelegt und mit Lösung B auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt.)
300 μg Streptavidin (Firma SIGMA) wurden in 300 μl sterilfiltriertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zur Natriumacetatpuffer-Mikrokapselsuspension gegeben. Der pH- Wert sollte 4,5 ± 0,2 betragen. Anschließend wurden zügig 750 μg EDC (1 Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carboiimid Hydrochlorid (SIGMA) in 750 μl sterilfiltriertem Wasser gelöst und in die Pufferlösung gegeben.
Danach wurde eine Stunde lang nachgerührt unter gelegentlicher pH-Wert-Kontrolle. Es wurde über Nacht (ca. 17 h) bei 4°C weiter gerührt.
Zum Abschluss wurde eine Lösung aus 188 μl 1 M Ethanolaminlösung (SIGMA) in 3,75 ml Wasser zum Ansatz gegeben. Nach Flotation (24 h) wurde der Ansatz durch Ablassen des Unterstandes bis auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Anschließend wurden 10 ml Hepes-P uff er / Triton Lösung 0,01% (m/m) (30 ml 5 M NaCI-Lösung + 10 ml 1 M Hepes-Lösung (Gibco 15630-056) ad 1000 ml Triton Lösung, 0,01 % (m/m), pH 7,4) dazugegeben, noch- mals flotiert und der Unterstand wieder bis auf ein Volumen von 1 ml abgelassen. Die auf konzentrierte Suspension wurde danach in ein silikonisiertes Eppendorf-Reak- tionsgefäß überführt und im Kühlschrank gelagert.
Der Kopplungserfolg wurde im FACS (Durchflußzytometer von der Becton Dickinson) mit FITC-Biotin geprüft. Mit Hilfe einer Sättigungsreihe wurden so 200.000 Streptavidin Moleküle pro Mikrokapsel quantifiziert.
(f) Bindung von biotinylierten anti-CD 105-Antikörpem an funktionalisierte gasgefüllte Mikroblasen:
Die Suspension gasgefüllter Mikroblasen gemäß Beispiel 4 (a) bis (d), an die Streptavidin gemäß Beispiel 4 (e) gebunden worden war, wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit biotinyliertem anti-CD105-Antikörper (Rat Anti-Mouse CD105/Endoglin, Biotin Conjugate, Southern Biotechnology Associates, Inc., Cat. Nr. 1860-08) im Verhältnis 0,5 μg Antikörper zu 1e6 Mikroblasen inkubiert. Nach Inkubation wurde die Suspension auf 1e8 Blasen/ml mit PBS-Puffer, enthaltend 0,02 % (m/m) Triton x 100, verdünnt. Die CD105-Kopplung und Verdünnung wurde für jedes Tier frisch hergestellt.
(g) Bindung von biotinylierten lgG2a an funktionalisierte gasgefüllte Mikrokapseln:
Die Suspension gasgefüllter Mikroblasen gemäß Beispiel 4 (a) bis (d), an die Streptavidin gemäß Beispiel 4 (e) gebunden worden war, wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit biotinylierter lgG2a Isotyp-Kontrolle (Rat lgG2a Isotyp-Control, Biotin Conjugate, Southern Biotechnology Associates, Inc., Cat. Nr. 0117-08) im Verhältnis 0,5 μg Antikörper zu 1e6 Mikroblasen inkubiert. Nach Inkubation wurde die Suspension auf 1e8 Blasen/ml mit PBS-Puffer, enthaltend 0,02 % (m/m) Triton x 100, verdünnt. Die Isotyp-Kopplung und Verdünnung wurde für jedes Tier frisch hergestellt.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Quantifizierung von in einem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körpern, umfassend a) mindestens einen Schallkopf zur Aussendung eines Ultraschallfeldes, mit dem die in einer Schicht in dem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körper zur Aussendung charakteristischer Ultraschallsignale anregbar sind, und zum Empfang der charakteristischen Signale, b) mindestens ein Datenverarbeitungssystem zur Ermittlung der Anzahl der Körper in der Schicht aus den charakteristischen Signalen, sowie c) Mittel, mit denen das Ultraschallfeld nach einer Anregung der Körper in ei- ner ersten Schicht im Untersuchungsobjekt so verschiebbar ist, dass Körper nach der Verschiebung in einer zweiten Schicht anregbar sind, wobei die erste Schicht und die zweite Schicht überlappen und parallel und definiert gegeneinander verschoben sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Körper Blasen darstellen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultraschallfeld um mindestens 5 μm verschiebbar ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Schallkopf ein zweidimensionales oder ein dreidimensionales Array von Piezokristallen aufweist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel vorgesehen sind, mit denen das Untersuchungsobjekt und das zweidimensionale Array gegeneinander verschiebbar sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerung für die Piezokristalle im dreidimensionalen Array vorgesehen ist, mit denen von Piezokristallen in einer Piezokristallreihe in dem Array ausgehende benachbarte Schallfelder oder von benachbarten Piezokristallreihen in dem Ar- ray ausgehende Schallfelder zur Überlappung bringbar sind.
7. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel vorgesehen sind, mit denen das Untersuchungsobjekt und mindestens ein Schallkopf gegeneinander verschiebbar sind.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Motorantrieb für eine Verschiebung des Untersuchungsobjekts und des mindestens einen Schallkopfes gegeneinander vorgesehen ist.
9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Haltevorrichtung, mit der das Untersuchungsobjekt einspannbar ist, und eine verfahrbare Halterung für den mindestens einen Schallkopf vorgesehen sind.
10. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bildauswertesystem zur Datenverarbeitung und zur Bildanzeige vorgesehen ist, mit dem die Quantifizierung der Körper videodensitometrisch durchführbar ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper eine Blase darstellt.
12. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 11 für die Ultra- schalldiagnostik und/oder Ultraschalltherapie am Menschen oder am Tier.
13. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 11 für das in- vivo- und ex-wVo-Mapping von physiologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben ab der postembryonalen On- togenese, für das in-vivo- und ex-v/Vo-Mapping von pathologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben während der Pathogenese und für die Charakterisierung von Zellkulturen durch in iz/fro-Mapping von hoch und herunter regulierbaren molekularen Markern der Zellen, wobei die Körper für die Marker spezifische Bindungsmoleküle aufweisen.
14. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Körper Blasen darstellen.
15. Verfahren zur Quantifizierung von in einem Untersuchungsobjekt enthaltenen Körpern, bei dem a) in einer Schicht im Untersuchungsobjekt enthaltene Körper mit einem Ultraschallfeld zu charakteristischen Ultraschallsignalen angeregt werden, b) die Ultraschallsignale empfangen werden, c) aus den empfangenen Ultraschallsignalen die Anzahl der Körper ermittelt wird und d) das Ultraschallfeld nach einer Anregung von Körpern in einer ersten Schicht im Untersuchungsobjekt so verschoben wird, dass Blasen nach der Verschiebung in einer zweiten Schicht angeregt werden, wobei die erste Schicht und die zweite Schicht überlappen und parallel und definiert gegeneinander verschoben werden.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Körper Bla- sen darstellen.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Blasen bei der Anregung zerstört und dabei zur Aussendung der charakteristischen Signale angeregt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 - 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultraschallfeld um mindestens 5 μm verschoben wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Untersuchungsobjekt und mindestens ein das Ultraschallfeld aussendender Schallkopf gegeneinander verschoben werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Untersuchungsobjekt gegenüber mindestens einem fixierten Schallkopf verschoben wird oder dass der mindestens eine Schallkopf gegenüber einem fixierten Untersuchungsobjekt verschoben wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 - 20 für die Ultraschalldiagnostik und/oder -therapie am Menschen oder am Tier.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 - 20 zur Durchführung eines in-vivo- und ex-wVo-Mapping von physiologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben ab der postembryonalen Ontogenese, eines in-vivo- und ex-v/Vo-Mapping von pathologisch hoch oder herunter regulierbaren molekularen Markern in Organen und Geweben während der Pathogenese und zur Charakterisierung von Zellkulturen durch in w'/ro-Mapping von hoch und herunter regulierbaren molekularen Markern der Zellen, wobei Blasen eingesetzt werden, die für die Marker spezifische Bindungsmoleküle aufweisen.
EP03745194A 2002-03-28 2003-03-27 Vorrichtung und verfahren zur quantifizierung von körpern mittels ultraschall Withdrawn EP1487345A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10215335A DE10215335A1 (de) 2002-03-28 2002-03-28 Vorrichtung und Verfahren zur Quantifizierung von Blasen
DE10215335 2002-03-28
PCT/EP2003/003227 WO2003082117A1 (de) 2002-03-28 2003-03-27 Vorrichtung und verfahren zur quantifizierung von körpern mittels ultraschall

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1487345A1 true EP1487345A1 (de) 2004-12-22

Family

ID=28051185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP03745194A Withdrawn EP1487345A1 (de) 2002-03-28 2003-03-27 Vorrichtung und verfahren zur quantifizierung von körpern mittels ultraschall

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1487345A1 (de)
JP (1) JP2005527270A (de)
AU (1) AU2003232191A1 (de)
DE (1) DE10215335A1 (de)
WO (1) WO2003082117A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2644771A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Mcgill University Ultrasound molecular sensors and uses thereof
US10585185B2 (en) 2017-02-03 2020-03-10 Rohde & Schwarz Gmbh & Co. Kg Security scanning system with walk-through-gate

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5425366A (en) * 1988-02-05 1995-06-20 Schering Aktiengesellschaft Ultrasonic contrast agents for color Doppler imaging
US5944666A (en) * 1997-08-21 1999-08-31 Acuson Corporation Ultrasonic method for imaging blood flow including disruption or activation of contrast agent
US5860931A (en) * 1997-10-10 1999-01-19 Acuson Corporation Ultrasound method and system for measuring perfusion
DE19813174A1 (de) * 1998-03-25 1999-05-27 Schering Ag Mikropartikel aus Polymeren und mindestens einer gerüstbildenden Komponente und ihre Herstellung und Verwendung in der Ultraschalldiagnostik und zur ultraschallinduzierten Wirkstofffreisetzung
US6186951B1 (en) * 1998-05-26 2001-02-13 Riverside Research Institute Ultrasonic systems and methods for fluid perfusion and flow rate measurement
US5971928A (en) * 1998-11-02 1999-10-26 Acuson Corporation Diagnostic medical ultrasonic system and method for image subtraction
US6340348B1 (en) * 1999-07-02 2002-01-22 Acuson Corporation Contrast agent imaging with destruction pulses in diagnostic medical ultrasound
US6302846B1 (en) * 1999-09-20 2001-10-16 Acuson Corporation Ultrasound method for assessing ejection fraction using ultrasound contrast agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO03082117A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005527270A (ja) 2005-09-15
AU2003232191A1 (en) 2003-10-13
DE10215335A1 (de) 2003-10-16
WO2003082117A1 (de) 2003-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6872180B2 (en) Device and process for quantifying bodies by means of ultrasound
Goertz et al. Subharmonic contrast intravascular ultrasound for vasa vasorum imaging
DE69319438T2 (de) Verbesserungen an kontrastmitteln
Demos et al. In vivo targeting of acoustically reflective liposomes for intravascular and transvascular ultrasonic enhancement
Calliada et al. Ultrasound contrast agents: basic principles
DE69729579T2 (de) Polymer-lipide mikroverkapselte gase und ihre anwendung bei bilderzeugenden mitteln
DE69635516T2 (de) Verwendung von Emulsionen enthaltend in lipide eingeschlossene flussige Fluorocarbone für gezielte diagnostische Verfahren in vivo
DE69732568T2 (de) Druckbeständige protein-mikrosphäre als ultraschallkontrastmittel
Tiemann et al. Stimulated acoustic emission: pseudo-Doppler shifts seen during the destruction of nonmoving microbubbles
KR20150099823A (ko) 시간 경과에 따른 통계 분석에 기초한 영상 진단 애플리케이션에서의 분할
JP2012523904A (ja) 高周波数における超音波造影剤の非線形撮像のための方法
EP0296189A1 (de) Ultraschall-manometrieverfahren in einer flüssigkeit mittels mikrobläschen.
EP2758130A1 (de) Nichtinvasive in-situ-strahlungsdosimetrie
Niżański et al. B-mode and Doppler ultrasonographic findings of prostate gland and testes in dogs receiving deslorelin acetate or osaterone acetate
Reinhardt et al. Ultrasound derived imaging and quantification of cell adhesion molecules in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by Sensitive Particle Acoustic Quantification (SPAQ)
Rix et al. Evaluation of high frequency ultrasound methods and contrast agents for characterising tumor response to anti-angiogenic treatment
Grishenkov et al. In vitro contrast-enhanced ultrasound measurements of capillary microcirculation: Comparison between polymer-and phospholipid-shelled microbubbles
US8192362B2 (en) Methods of monitoring cellular death using low frequency ultrasound
Casciaro et al. Effectiveness of functionalized nanosystems for multimodal molecular sensing and imaging in medicine
DE4219724A1 (de) Verwendung von Mikrokapseln als Kontrastmittel für die Farbdoppler-Sonographie
Sirlin et al. Effect of acquisition rate on liver and portal vein enhancement with microbubble contrast
EP1487345A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur quantifizierung von körpern mittels ultraschall
DE60310429T2 (de) Verfahren zur identifizierung von wächter-lymphknoten
JP7104709B2 (ja) 圧力測定のための非侵襲法
JP2022513542A (ja) 高感度分子解析のための組成及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20040826

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: ACUSPHERE, INC.

17Q First examination report despatched

Effective date: 20080617

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20090609