EP1427853A2 - Structure bicouche supportee de presentation d'un acide nucleique associe a une proteine - Google Patents

Structure bicouche supportee de presentation d'un acide nucleique associe a une proteine

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EP1427853A2
EP1427853A2 EP02759812A EP02759812A EP1427853A2 EP 1427853 A2 EP1427853 A2 EP 1427853A2 EP 02759812 A EP02759812 A EP 02759812A EP 02759812 A EP02759812 A EP 02759812A EP 1427853 A2 EP1427853 A2 EP 1427853A2
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EP
European Patent Office
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protein
nucleic acid
cell according
linked
layer
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Withdrawn
Application number
EP02759812A
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German (de)
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Inventor
Denis Pompon
Wilfrid Boireau
Marie-Agnès SARI
Sophie Bombard
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication date
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to new biostructures which can in particular serve as biosensors, in particular a support making it possible to present nucleic acids and to detect both the presence of nucleic acids in a sample, but also the interaction between proteins and said proteins. nucleic acids, as well as the binding between a ligand and a protein linked to a nucleic acid.
  • DNA biosensors also called DNA chips
  • DNA chips DNA biosensors
  • the impact of such biosensors has mainly focused on sequencing, gene expression mapping, diagnostics (detection, damage, mutation %) and analysis of DNA-ligand interactions (hybridization %) .
  • Most of the sensors used use techniques for immobilizing single-stranded nucleic acid molecules or ssDNA, the analysis being carried out using optical, electrochemical or piezoacoustic transduction systems.
  • the analytical methods applied to the analysis of DNA-DNA biomolecular interactions are essentially based on the fixation of a single stranded DNA (ssDNA) within an area delimited on a substrate.
  • the main techniques for producing DNA covalently attached to the substrate are the in situ synthesis of ssDNA on the support, the assembly of chemically modified ssDNA to allow grafting on the support or microdeposition on an adsorbent matrix (Boncheva et al ., 1999, Berney et al., 2000, Wittung-Stafshede P. et al., 2000).
  • One of the characteristics of the present invention is to propose a new mode of presentation of nucleic acids on the surface of a substrate.
  • the mode of presentation of the nucleic acids according to the invention has the originality of allowing mobility of the nucleic acids, and thus of being able to detect any change in the state of said nucleic acids by detecting a transition between two states having levels separate organizations.
  • the subject of the present invention is a cell for the presentation of a nucleic acid comprising: a support which is substantially planar on the atomic scale, a protein III having a unique three-dimensional structure (stable and defined spatial organization), an IN nucleic acid linked to said protein III, the nucleic acid-protein assembly being mobile laterally with respect to said support, so that the hybridization of a target nucleic acid to said IN nucleic acid or the change in conformation of said IN nucleic acid is detectable or detected by the geometric reorganization of the nucleic acid - protein set.
  • said protein III is chosen from the group consisting of proteins having a redox center and proteins having an anisotropic optical absorption property. Protein III will be described in more detail below.
  • cell is meant a subset delimited laterally from the surface characterized by structural homogeneity and which can be reproduced in numerous identical or variant copies on the inorganic support.
  • a cell can in particular be used for the detection of a specific type of nucleic acid (as will be seen below), different from the nucleic acid detected by the use of another cell.
  • the present invention also relates to a support, having a plurality of cells according to the present invention.
  • the term "Float” may be used to designate the assembly consisting of the protein mobile relative to the support, linked to the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide linked to the Float may be called “Primer” in the present application.
  • DMPC Dimyristoyl phosphatidyl choline
  • DOGS 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 [( ⁇ (5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]
  • DOPC Dioleoyl phosphatidyl choline
  • DPPC Dipalmitoyl phosphatidyl choline
  • DsDNA double stranded DNA
  • DTT Di thiothreitol
  • Hb5 (His) 4 human cytochrome b5-histidine 4 fusion protein
  • Hb5 (His) 4mut24 cysteine mutant (position 24) of Hb5 (His) 4
  • oligonucleotide is not directly in contact with the support, which allows improved presentation to target nucleic acids or other elements interacting and modifying the conformation of the primer.
  • the protein-nucleic acid assembly is mobile relative to the support, since the protein is itself mobile in a lipid layer itself fixed on the support.
  • a lipid bilayer is used.
  • this assembly consists of a lipid membrane reconstituted on a flat surface of an inorganic nature. We then speak of a supported lipid membrane.
  • Such a model has properties similar to biological membranes in terms of compactness of the elements constituting it, compartmentalization, fluidity of the constituent elements of these models as well as most of the molecules incorporated or in interaction with this model (Heyse et al., 1998, Marchai et al., 1998).
  • This property of membrane dynamics is at the origin of the lateral mobility of the proposed structures and of the reorganization allowing the formation of domain and signal transduction.
  • the present invention relates to a cell for the presentation of a nucleic acid comprising:
  • a monolayer II comprising phospholipids, a bridging molecule having a hydrophobic end capable of interacting with the monolayer II, and an end chemically functionalized so as to form a stable bond with a protein III,
  • the protein is mobile in layer II (lipid sheet) ensures lateral dynamics, i.e. a possibility for the float assembly
  • the supramolecular assembly thus produced is characterized by a high degree of modularity: each stage of production or destructuring of this assembly can be carried out in a reversible manner by controlled action of the solutes present in an aqueous phase or of the action of thermal conditions or electrostatic environment.
  • the grafting of single-stranded nucleic acid onto the protein was carried out. In this way, the oligonucleotides are grafted onto blocks of protein nature floating on the upper lipid monolayer of the membrane model.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which may be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of natural or synthetic nucleotides, defining a fragment or a region of a nucleic acid and which can correspond as well to a DNA or a single, double or triple stranded RNA.
  • the nucleic acid sequences according to the invention also include PNA (Peptid Nucleic Acid), or the like.
  • the bonds between the different bases can be conventional phosphodiester bonds, or modified bonds, such as phosphorothioates, methylphosphonates.
  • the oligonucleotides can also be chimeric, that is to say having different bonds and / or bases. The term thus encompasses any variant of a nucleic acid sequence exhibiting a recognition property by hybridization.
  • the nucleic acid linked to the protein in the cell according to the invention is a single-stranded nucleic acid. Its size is not a determining parameter according to the present invention, and can be easily chosen using the general knowledge of a person skilled in the art.
  • the nucleic acid is linked to said protein by a reversible bond. This reversible bond can also be covalent.
  • the reversible connection can, in this particular case, be considered as a connection that can be easily broken.
  • the nucleic acid is linked to said protein by a covalent bond.
  • a covalent bond is known to a person skilled in the art and can in particular be produced using modified bases in the oligonucleotide allowing coupling to a functionalized chemical arm in order to be able to be specifically coupled to the protein of the float.
  • the nature of the grafting can be of two kinds: one can carry out a related grafting so as to intimately attach the nucleic acid molecule to the protein or a grafting via a spacer molecular arm so as to offer greater conformational freedom of DNA vis-à-vis the float.
  • a spacer arm is then preferably used which is unequivocally attached to said protein.
  • the geometry of the float is perfectly defined.
  • the spacer arm is connected to the protein at a precise site thereof.
  • said spacer arm can then be a metal complex such as cis-platinum, trans-platinum, europium or another transition metal involving ligands originating from the very structure of the nucleic acid and one or more ligands originating from the very structure of protein III of the float.
  • a metal complex such as cis-platinum, trans-platinum, europium or another transition metal involving ligands originating from the very structure of the nucleic acid and one or more ligands originating from the very structure of protein III of the float.
  • a spacer arm connecting a thiol- or amino- function introduced onto the nucleic acid in particular via a base.
  • the choice of the base being able to be any, that is to say that one can choose a base in 3 ', in 5' or inside the oligonucleotide, this alternative being able to present certain advantages, in particular to offer a greater degree of freedom than the oligonucleotide
  • this second function is also a thiol function, carried for example by a cysteine.
  • the IN nucleic acid is linked to said TJI protein via a compound chosen from:
  • a metal complex such as cis-platinum, trans-platinum, europium, a complex of nickel, copper, or ruthenium coordinated on the one hand with a residue or a group of amino residues of said protein III and d on the other hand to one or more natural or modified bases of the nucleic acid IN,
  • the protein in the cell according to the present invention has a unequivocally detectable geometry, that is to say a stable and defined spatial organization.
  • This also means that bringing the cell into contact with external nucleic acids capable of interacting with the primers in a univocal manner will lead to a highly repetitive organization at the spatial level of the floats within the cell.
  • external nucleic acids can lead to the association of floats in organized groups and these groups of floats can, thanks to their lateral mobility, interact with each other in a non-covalent manner so as to form within each cell a highly organized network of floats.
  • the properties (physical, electrical, optical, quantum) of this highly organized network will then differ from the dynamic properties of disorganized floats within the cell in the absence of interaction with the external nucleic acid.
  • the protein of the float will be chosen so that the variations in the spatial organization of the floats with respect to each other lead to a signal detectable by any process in particular electrical, optical or resonance. Proteins having this property will preferably be chosen from the group consisting of proteins having a redox center and / or an anisotropic optical absorption and / or intrinsic fluorescence property.
  • cytochromes and more preferably human cytochrome b5, of yeast, or of any other origin, flavodoxins, ferridoxins, azurines and other proteins with blue copper, multihemic proteins of the class of bacterial cytochrome c which have both a redox center and anisotropic optical absorption properties.
  • fluorescent proteins mention will preferably be made of green fluorescent protein (GFP) and its analogues obtained by mutagenesis or directed evolution.
  • GFP green fluorescent protein
  • said protein is water-soluble. It may also have undergone modifications, some of which are indicated below, provided that these modifications lead to a protein of stable and defined three-dimensional structure meeting the criteria as defined according to the present invention.
  • said protein has undergone a modification which has allowed the introduction of a single site, in said protein, to effect said binding with said nucleic acid.
  • a unique site is introduced into the protein according to the invention for the grafting of the nucleic acid thus makes it possible to strongly promote the uniqueness, the specificity and the unambiguous definition of the protein-nucleic acid bond.
  • said modification consists of a mutation of said protein so as to leave only a single predetermined amino acid remaining or introducing it.
  • the mutation can be introduced by mutation of the nucleic acid coding for the protein, it is the simplest method which will be favored by those skilled in the art.
  • the unique nucleic acid grafting site will then be this unique predetermined amino acid.
  • it is indeed within the reach of the skilled person to determine the amino acids to be modified, in order to leave none subsist only one, or introduce one that is not present in the native protein.
  • the protein which is used is a cytochrome b5
  • the modification in the protein is such that it facilitates the grafting of the nucleic acid, that is to say, that the acid amine used for said grafting is located at the periphery (on the surface) of said protein. It is within the reach of those skilled in the art, depending on the protein chosen, to determine the best location for the introduction of the modification into the protein. In cytochrome b5, the introduction of cysteine was thus exemplified by mutation of serine 24. However, alternative locations could easily have been chosen.
  • a mammalian cytochrome b5 other than a human eg rat or bovine
  • the amino acids to be modified so as to introduce only one cysteine into the protein sequence.
  • the three-dimensional representation will make it possible to target the most peripheral amino acids of the protein, that is to say those promoting better reactivity with the modified nucleic acid.
  • protein III is mobile with respect to layer II of the cell according to the invention. This also ensures the mobility of the IN nucleic acid linked to protein III in the cell, relative to the support according to the invention.
  • the mobility of the protein in layer II can be obtained in various ways, in particular when said protein has a hydrophobic tail allowing it to be anchored in the IL layer.
  • the sequences of the hydrophobic tails are known in the literature, and it is at scope of the skilled person to choose such a sequence and to modify the protein chosen by genetic engineering in order to introduce such an anchoring sequence. It is then advantageous to choose a hydrophobic tail which is short, so that it anchors only in the layer IL without penetrating into the layer I. This makes it possible in particular to improve the mobility of the protein in layer II, by reducing the phenomena of "friction" which can be observed if the hydrophobic tail is too large. The optimization of these elements remains within the reach of the skilled person.
  • said protein is linked to a phospholipid of layer II, and in a particular case to an artificial phospholipid preferably introduced in small proportion (that is to say in proportion less than 10%, of preferably less than 5%, more preferably about 2%).
  • the mobility of the protein relative to layer II is then similar to the mobility of phospholipids in said layer. Such mobility is generally greater than when the protein has a hydrophobic tail. This improves the performance of the cell according to the invention, as will be seen.
  • a person skilled in the art has several methods at his disposal for achieving a protein-phospholipid bond. Mention may in particular be made, among the covalent bonds, of acylation, farnesylation, the use of a GPI anchor sequence
  • glycosylphosphatidylinositol or the incorporation of a phospholipid or fatty acid into a specific residue of protein III by any artificial process.
  • a reversible bond that is to say which can be broken in the presence of reagents or under special conditions, but stable under the conditions or in the presence of the usual working reagents (hybridization of nucleic acids, link study between biological elements ).
  • a person skilled in the art can use all known methods making it possible to link a protein to a liposome, for example, insofar as the liposomes generally consist of phospholipids.
  • an arm capable of binding a metal chelate on one side and an amino acid on the other by using, in layer II, a modified phospholipid, said phospholipid having a zone for fixing a chelate .
  • a preferred phospholipid according to the invention is DOGS or 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 (N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl)].
  • This phospholipid is a synthetic phospholipid having an iminodiacetate residue complexing a divalent nickel cation.
  • the phospholipids of said layer II are chosen so that they have hydrophobic tails chosen so that said layer is not in the crystalline state, but in the fluid state at operating temperature.
  • This operating temperature obviously depends on the use that one wishes to make of the sensor. Thus, when looking for hybridization, the temperature of use may be different from that used when studying the binding of a protein to a nucleic acid.
  • the transition between fluid and gel states can be strategic in the context of a detection technique based on imagery of superstructures such as atomic force microscopy (AFM).
  • AFM atomic force microscopy
  • the fluidity of layer II is sought. ambient temperature.
  • phospholipids having hydrophobic tails having a chain length greater than or equal to 14 carbon atoms are preferably chosen, said chain possibly having unsaturations, such that said layer II is in the fluid state at temperature d 'use.
  • C14 elements are generally fluid at a temperature above 23 ° C, while Cl 6 are only at 37 ° C, and Cl 8 above 50-55 ° C.
  • Cl 8 tails, but having unsaturations makes it possible to reduce the phase transition temperature (crystalline state - fluid state).
  • it may be preferred that the layer II is not fluid at ambient temperature but only at higher temperatures.
  • this mode will be preferred if one wishes to "memorize" the state of organization of the floats, by using the lowering of temperature to freeze the structure after a higher temperature organization phase. This will be particularly the case if the detection technique (near field microscopy for example), or the analysis conditions (dehydration for example) may alter the structure.
  • the unmodified phospholipids of layer II do not have any particular characteristics apart from the mobility properties already described, however, it is preferable that they have polar heads, chosen from the group consisting of neutral polar heads not carrying charges, globally neutral with opposite charges (zwitterionic), or with a negative overall charge.
  • the choice of the charge carried by the phospholipids may prove to be interesting, in particular to reduce the phenomena of non-specific absorption of the test nucleic acids on the layer, which are reduced when the charge of the phospholipid heads is negative.
  • the use of neutral heads (either uncharged or carrying several opposite charges) is also envisaged.
  • Layer II is assembled on layer I, in a conventional manner, by the interactions existing between two hydrophobic elements in an aqueous medium. We can therefore speak of a self-assembled layer.
  • a suitable catalyst called a fusogenic agent will be used to facilitate this fusion.
  • a fusogenic agent such agents as the Ca 1 "4" cations, the ethylene glycol polymer (PEG) and the detergents will be used according to protocols known to those skilled in the art.
  • Layer I for its part, comprises hydrophobic elements, having a chain length of approximately 2 to 2.5 nm, for example between 12 and 20 carbon atoms, preferably between 14 and 18 carbon atoms.
  • the length of the chains of the elements of layer I is preferably long enough for the union of the two layers I and II to form a true bilayer.
  • the elements of layer I are linear or branched and optionally bear unsaturations. It is important that this layer I is homogeneous, insofar as it serves as a support for the deposition of the layer IL
  • Layer I is connected to the support of the cell according to the invention in a covalent manner, or by strong non-covalent bonds. This mode of connection to the support is not of great importance for the implementation of the invention.
  • said layer I comprises phospholipids linked to said support via their polar heads.
  • said layer I comprises hydrophobic elements linked to said support via a covalent bond, for example an alkyl-thiol bond or an alkyl-siloxane bond, depending on the nature of the support.
  • a support link - layer I which is covalent, in order to allow easier reuse of the cell according to the invention.
  • the nucleic acid is linked to the protein, and the protein is linked to layer II by reversible bonds, one can easily regenerate the cell by action of the elements (or conditions) allowing the rupture of the nucleic acid bonds.
  • - protein and protein - layer II and remove layer II by the action of an appropriate detergent. It is therefore easy to imagine that a non-reversible covalent bond between layer I and the support makes it possible to reconstruct a cell. It is obvious that if the layer I is linked to the support by a reversible bond, we can start again to prepare the cell, but with an additional step.
  • the reuse of the support can prove to be very interesting, insofar as it must have an almost flatness at the atomic level, and moreover can include all or part of the system for detecting the state of the cells, which can pose certain manufacturing constraints and increase the production costs of the cell according to the invention.
  • the flatness of said support is such that the difference in height between two distant zones of less than 100 nm is less than or equal to 10 nm, preferably less than or equal to 3 nm, more preferably less than or equal to 2 nm.
  • Different materials can be chosen to make the base of the cell according to the invention, in particular a material chosen from the group consisting of glass covered with a layer of gold, cleaved mica, silicon or any other monocrystalline material.
  • Monocrystalline silicon is a very interesting material, insofar as it is effectively plane on the atomic scale, and that it can easily undergo microgravures, and various chemical modifications, which makes it possible to manufacture a support having a plurality of cells according to the invention. Furthermore, silicon has conductive or optical properties which can prove to be very advantageous as regards the detection of biological events taking place on the cell according to the invention.
  • the cell according to the invention can comprise several identical or different proteins, linked to identical or different nucleic acids.
  • a target nucleic acid complementary to two primers will be able to bind the two corresponding floats, which will accentuate its interaction with the support and initiate a change in the spatial organization of the floats within the cell.
  • nucleic acid IN - protein III and protein III - layer II links are reversible, it is possible, by means of agents competing in the Float-Support interaction (Histidine, Imidazole, EDTA), to easily differentiate degrees of hybridization.
  • Histidine, Imidazole, EDTA agents competing in the Float-Support interaction
  • the aspect of two-dimensional reorganization of the Float and Primer nano-objects on the flat membrane surface, obtained by the fluidity of layer II, is in the field of the self-organization of biological molecules and physical phenomena. -chemicals that arise from these collective movements.
  • this organization is extremely sensitive to the geometric conformation of the nucleic acid and therefore to any factor (mismatch, protein binding, chemical agent) capable of interacting with the conformation or structure of the nucleic acid.
  • any factor mis, protein binding, chemical agent
  • studying the binding of any protein or ligand to a nucleic acid (single strand or double strand) linked to the protein anchored in layer II, or when studying the binding of an effector molecule on a protein (of the transcription factor type) linked to a nucleic acid, on a cell according to the invention we then observe (due to the arrival of these elements), a modification of the structure (by curvature of the nucleic acid) and of the balance of the system which can then be easily observed by various methods capable of detecting the change in the organization of the cell, and in particular by means of an optical system (absorbance, fluorescence), electrical, electronic, surface plasmon resonance, energy transfer, radiolabelling, diffraction (optical, electronic, X-ray, neutron)
  • the principle of the invention is therefore the mobility of the protein anchored in layer II, allowing a reorganization of the system and the fact that the protein-nucleic acid unit is unique and not random, which makes it possible to detect said reorganization.
  • nucleic acid a single target nucleic acid molecule in the test sample will allow reorganization which can then be detected.
  • An example of carrying out such a method would be to pre-organize the cell with a nucleic acid of the same nature as that to be detected but having on the one hand a lower affinity for the primer than the nucleic acid to be tested (mod base, mismatch), on the other hand whose geometry (size, curvature) would different from the nucleic acid to be tested.
  • the exchange of a single nucleic acid (external competitive molecule) within a pre-organized cell will then lead to a local structural defect.
  • the hybridization as such is not detected, but rather the changes induced in the cell according to the invention.
  • the cell according to the invention or the support having a plurality of cells
  • the cell according to the invention can be used for the detection of a target in a sample, without it being necessary to mark or manipulate excessively said sample .
  • This is another important advantage, since it is thus possible to detect the presence of mRNA without having to transform it first into cDNA.
  • ssDNA and dsDNA are so different that it results in very distinct physicochemical properties.
  • this effect can be detected in particular by a change in the electronic conductivity of the cell according to the invention. This is particularly easy when the protein according to the invention also has a redox center.
  • Hybridization can also be detected by surface plasmon resonance, or by an optical method, which is facilitated by the presence of a protein with anisotropic optical absorption.
  • the invention therefore also relates to a support having a plurality of cells according to the invention.
  • the different cells can be separated from each other by microgravure on the support, or by the presence between two cells of a hydrophobic layer made up of elements having a chain length different (preferably less) than the chain length of the elements of layer I, for example less than or equal to 5 carbon atoms (“differential patterning” Cheng et al., 2000). These elements having a low carbon chain can be deposited on the support using the masking techniques common in microelectronics.
  • the support according to the invention is advantageously supplemented by the installation of a system allowing the measurement of the current, the impedance or the potential, allowing the detection of the events happening on each of the cells.
  • the support has a surface alternating conductive and reflective areas and non-conductive and transparent areas.
  • Such a network comprising transparent zones of size clearly less than the wavelength of visible light has been described as having a light transmission function as a function of the wavelength in the form of a "comb" (Ebbesen et al, 1998).
  • the optical transmission properties of such a structure must be altered by the state of the neighboring cells, which provides a possible means of reading.
  • the support according to the invention comprises between each cell an integrated optical device (laser-photodiode pair for example) capable of measuring the absorbance of a cell in two crossed directions and of deducing its state of organization (anisotropy) or disorganization (isotropy).
  • an integrated optical device laser-photodiode pair for example
  • a reading of the state of organization of each cell by a sensitive laser optical scanning device.
  • a sensitive laser optical scanning device capable of reading cells of submicron size is commonly used at the general public level in mini-disc readers and rewritable CD-ROM readers.
  • the variation in polarization of the reflected light normally provided in magneto-optical discs by a reorganization of the crystal lattice of a rare earth salt (europium, and other compounds of the same transition series from the Mendeléeiv table ) by a magnetic field and laser heating would be in the system described in the invention by the variation of spatial organization in the cell of the protein and or its cofactor which are optically active objects in terms of polarization, d ellipticity (differential absorption of polarized light) and optical absorption.
  • the invention also relates to a method for identifying the presence of a test nucleic acid in a sample, comprising the steps of: a) bringing said sample into contact with a cell according to the invention, under conditions allowing hybridization from said test nucleic acid to a nucleic acid linked to a protein of said cell, b) detecting the hybridization of said test nucleic acid to said nucleic acid linked to said protein. Detection can be carried out by any of the means mentioned above. If the test sample has been marked, the detection can be carried out according to said marking. However, it may be preferred to detect the presence of the target nucleic acid by changing the conformation of the system. Thus, the cell according to the invention allows detection without the need to mark the test sample.
  • the invention also relates to a method for identifying the binding of a protein to a nucleic acid and / or its activity on the conformation of said nucleic acid, comprising the steps of: a) bringing said protein into contact with a nucleic acid linked to a protein, in a cell according to the invention, b) detecting the binding of said protein to said nucleic acid and / or its activity on the conformation of said nucleic acid.
  • Said nucleic acid can be single strand, double strand or triplex, when a nucleic acid has already been attached to one of the nucleic acids (primers) of the cell. It is clear that the choice of certain bases for the primer can lead to the formation of a triplex nucleic acid, said formation then being considered, within the meaning of the invention as a hybridization.
  • Detection can also be carried out in several ways, and in particular by changing the conformation of the system.
  • the invention also relates to a method of identifying the binding of a ligand to a protein attached to a nucleic acid attached to a protein in a cell according to the invention, comprising the steps of: a) bringing said ligand into contact with said protein, b) detecting the binding of said ligand to said protein.
  • the binding can be direct or indirect, and involve for example the binding of the ligand to a receptor which will then bind to a protein or a protein complex already associated with the DNA of the cell.
  • the binding of the ligand to the protein can be observed in particular by a change in the conformation of the system.
  • the invention relates to a method for identifying the binding of a compound to a nucleic acid and / or its activity on the conformation of said nucleic acid, comprising the steps of: a) contacting said compound with a nucleic acid linked to a protein, in a cell according to the invention, b) detecting the binding of the compound to said nucleic acid and / or its activity on the conformation of said nucleic acid.
  • said nucleic acid can be single strand, double strand or triplex, when a nucleic acid has already been fixed on one of the nucleic acids of the cell.
  • connection is detected in particular by change of conformation of the system, as has been explained above.
  • the detection of the geometry or of the disturbance of the geometry of the Float-Primer-Target assemblies can be advantageously carried out thanks to the contribution of atomic force microscopy technologies in a liquid environment.
  • the potential applications of this type of characterization relate to the study of the impact of the interaction of all molecules or macromolecules with nucleic acids (regulation, transcription factors, drugs, drugs, especially for chemotherapy ...) .
  • the device according to the invention offers molecular and supramolecular contiguity involving a lipid membrane, redox proteins and nucleic acids.
  • This assembly of electro- and opto-active biomolecules within microsystems originating from microelectronics can prove to be potentially of strong impact in the fields of electronic transductions (conductors, semiconductors, biomolecular circuits) and non-linear optics (anisotropy).
  • double-stranded DNA unlike ssDNA, has electron transfer properties according to an electronic conduction process by covering the Pi orbitals.
  • hybridization reaction between two molecules of ssDNA specific.
  • the cell according to the invention has an original biomolecular architecture which is positioned in the field of nano-bioengineering, that is to say the development of new types of nanostructures having properties of:
  • DNA has the properties of molecular and mechanical recognition to be integrated into microcircuits.
  • the intrinsic electronic properties of this macromolecule seem insufficient to be used directly (Braun et al., 1998).
  • One of the most promising lines of research in the use of potential for transporting electrical charges along the DNA duplex is represented by the use of electrocatalytic processes (Boon et al., 2000).
  • Such a signal transduction device can completely be integrated into the device according to the invention thanks to the use of additional redox molecules.
  • the presence of the floats composed of redox proteins having electroactive groups and / or different and modular redox potentials makes it possible to ensure a dense electronic environment in terms of recovery of the electronic orbitals.
  • redox macromolecules considered then as relay centers
  • such a structure could be at the origin, of an electronic doping of DNA, to jumps of electrons between proteins or energy transfer processes.
  • a cell according to the invention can have other modes of use than the simple detection methods which have been mentioned above.
  • the invention also relates to a method for preparing a cell according to the invention comprising the step of: - placing, on a support which is substantially planar on the atomic scale, of a protein III having a unique three-dimensional structure ( stable and defined spatial organization), linked to an IV nucleic acid, so that the nucleic acid - protein assembly is movable laterally with respect to said support, so that the hybridization of a target nucleic acid to said IV nucleic acid or the change in conformation of said nucleic acid IV is detectable by the geometric reorganization of the nucleic acid - protein assembly.
  • the invention also relates to a method for preparing a cell according to the invention comprising the steps of:
  • a protein III having a unique three-dimensional structure
  • said protein III being movable laterally in said layer II, by means of a bridging molecule having a hydrophobic end capable of interacting with monolayer II, and one end chemically functionalized so as to form a stable bond with a protein III, said protein III being unequivocally linked to an IN nucleic acid, preferably by a molecular arm.
  • Figure 1 Construction of the hybrid bilayer and characterization by resonance surface plasmon analysis.
  • A the recorded signal corresponds to the baseline of the metal support covered with a dense monolayer of OM in the environment of the working buffer (conventionally phosphate buffer, 50mM, pH7.5).
  • B The signal variation corresponds to the injection into the fluid circuit of a mixed DMPC-DOGS vesicular solution made in water.
  • the increase in signal corresponds to the kinetics of fusion of the vesicles on the support so as to obtain a compact lipid monolayer.
  • This value corresponds to that of a lipid hemimembrane.
  • C A procedure for treating the membrane with a sodium hydroxide solution
  • 50 RU is a surface covering rate of 7pmole.cm " .
  • Figure 3 Diagram of the membrane biosensor, construction / regeneration of the supramolecular assembly Construction:
  • An inorganic surface (ex: gold) is functionalized by a dense monolayer of octadecyl mercaptan. This surface is conducive to the fusion of lipid vesicles (liposomes) until a dense monolayer of phospholipids is obtained above the support.
  • the presence of 10% (mol / mol) of modified phospholipids allows the anchoring of b5 cytochromes so as to obtain a dense monolayer of proteins.
  • Figure 4 Characterization of the b5-cis-Pt-DNAb complex, Polyacrylamide SDS gel (15%) of Hb5 (His) 4 platinized and coupled with an oligonucleotide of sequence CTATCATTTGCTTACTATTC (SEQ ID N ° 13)
  • FIG. 4.A Autoradiogram of a gel into which Hb5 (His) 4-cisPt was injected (well 1); the oligonucleotide radiolabelled with P (well 2) and the b5-cis-Pt-ssDNA complex (well 3) makes it possible to demonstrate the appearance of an additional radioactivity signal in well 3 compared to well 2.
  • FIG . 4.B Use of a polyacrylamide gel (15%) under denaturing conditions (SDS).
  • Cross characterization of the b5-cis-Pt-ssDNA complex said complex injected on lane 3 has a band which makes it possible to confirm the existence of a population whose molecular weight is close to 20000 Dalton, ie the theoretical molecular weight.
  • FIG. 5 Spectral characterization of the Hb5 (His) complex 4- CTATCATTTGCTTACTATTC via a ponta e s-Pt [(NH 3 ) 2 (H 2 O) 2 ] 2+
  • Two reconstitution procedures of the Hb5 (his) complex 4-cisPt- SsDNAs are characterized by spectrophotometry in a 240-600nm window. Cytochrome b5 has a maximum absorption at 412nm while ssDNA has a maximum at 260nm.
  • the spectral profile of two samples as well as the relative quantification of each species thanks to the molar extinction coefficients makes it possible to highlight:
  • Figure 6 Determination of the melting temperature of 20-mer DNA and 20-mer DNA bridged with platinized Hb5 (His) 4.
  • the determinations of the melting temperatures were carried out by spectral measurements of hyperchromicity after melting of the complementary strand at high temperature (80 ° C.). A decrease in steps of 1 ° C makes it possible to spectrally follow the evolution of dsDNA. • The absorption results as a function of temperature for the free ssDNA makes it possible to obtain a curve whose inflection point corresponds to the melting temperature. The Tm for the ssDNA is evaluated at 45 ° C.
  • Cytochrome b5 has a maximum absorption at 412nm while the
  • SsDNA has a maximum at 260nm.
  • the NaCI gradient allows the gradual elution of all populations:
  • Figure 8 Elution profile and supramolecular composition of cytochrome b5-ssDNA complexes
  • the molar quantification of the isolated species after separation on DEAE is represented in the form of a histogram: • populations 1 and 2 of Hb5 (His) 4mut24 characterized in FIG. 7 do not present any ssDNA component measured at 260nm. These two populations correspond to the monomeric form (which did not react during the incubation) and to the dimeric form (resulting from a cystine bridge between two proteins).
  • Figure 9 Detection by surface plasmon resonance of the association kinetics of a ssDNA complementary to the ssDNA primer in interaction with the biosensor
  • FigurelO Diagram of the assembly as a DNA biosensor ⁇
  • the arrow represents the flow of biomolecules from the test sample.
  • Figure 11 Diagram of the assembly as nanostructures with dynamic and conformational properties
  • a set of different floating blocks can be presented on the surface of the biosensor, the injection of a potentially hybridizing oligonucleotide on part of the floating blocks must allow inter-block bridging.
  • the character of lateral mobility of the elements must favor this process until obtaining phenomena of supramolecular reorganization on the surface of the cell.
  • the solid support used consists of a glass plate coated with a gold film marketed by the company BIAcore ® as Jl chip name.
  • Such supports have also been manufactured by the inventors. They consist of the use of planed glass strips (thickness 0.4mm, 22 * 10mm, Prolabo) undergoing successively a vaporization of 2.6nm of chromium then a vaporization of 48nm of gold under a vacuum of 2.10 mm of Hg.
  • the metal interface is covered by self-assembly of octadecyl mercaptan or OM molecules from Aldrich.
  • the OM solution is used at ImM in a 4/1 (v / v) ethanol / water mixture. After two hours of incubation, the slides are washed with chloroform, methanol and then with water and are dried under a stream of nitrogen.
  • the method used to prepare the liposomes is based on a double sonication / extrusion procedure.
  • the dimyristoyl and / or dipalmitoyl phosphatidyl choline phospholipids from Sigma, main constituents of the vesicles, are dissolved in an organic solution of chloroform.
  • a lipid film is then deposited in scintillation glass tubes by evaporation of the chloroform under a stream of nitrogen. This film is re-suspended in an aqueous solution (ultra pure or buffered water) to a final concentration of ImM. This mixture is then sonicated:
  • the last manufacturing step consists of extrusion through a polycarbonate membrane (Avestin, 19mm diameter and pore diameter 50nm or 100nm) in a Liposofast ® basic device, Avestin, Inc.
  • a second procedure is used in the case of the use of molecules sensitive to ultrasonic disturbances such as the hydrocarbon chains of certain phospholipids having polyunsaturations (ex: 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 [(N (5-amino -l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] or DOGS from Aventi Polar Lipids, Dioleoyl phosphatidyl choline or DOPC from Sigma).
  • This step is followed by a stage of extrusion through a polycarbonate membrane with 50 nm pore diameter in a LiposoFast apparatus ® home AVESTIN.
  • the hydrophobic support serving as a matrix to generate the lipid monolayer undergoes a treatment procedure as follows: in order to improve the wettability of the structure, an ethanol / water solution (1/1 vol) is injected onto the support and is followed by rinsing steps with water and buffered solution. In order to clean the interface, the injection of a detergent solution, octyl glucopyranoside from Sigma, 40mM concentration. Immediately after, the made-up lipid vesicles are injected into contact with the functionalized metal surface. Spontaneously, according to a liposome fusion process established by Kalb et al. (1992), the vesicles fuse in contact with the hydrophobic monolayer of OM. After 30 to 60 minutes, this process leads to the formation of a lipid monolayer completely covering the OM monolayer.
  • the molecular assembly thus obtained has a metallic substrate covalently covered with a first alkylated sheet on which is assembled a fluid and dynamic sheet of amphiphilic molecules.
  • Characterization experiments use BIAcore ® technology using BIAcore 1000 and BIAcore X devices.
  • Liposome fusion results are obtained in the form of a sensorgram ( Figure 1).
  • a phase of association with the support is observed leading to a plateau after 20-30 of contact time.
  • a first quantity of lipid material is evaluated.
  • a surface cleaning procedure with 20mM sodium hydroxide makes it possible to remove all the vesicles imperfectly fused to the surface of the biosensor.
  • the signal obtained is between 1400 and 2000 RU, which is consistent with the results available in the literature and the calibration methods supplied by the manufacturer.
  • An injection of soluble proteins in the vicinity of this supported membrane makes it possible to validate the absence of defect in the upper lipid monolayer.
  • the introduction into the liposomes of synthetic phospholipids DOGS at a rate of 10% mol / mol gives this monolayer complexing properties of protein-TagHis sensor.
  • Example 2 Construction, expression and purification of fusion proteins 2.1) Water-soluble proteins with a histidine tag
  • the initial protein used in the context of this example is a membrane hemoprotein: human or yeast cytochrome b5. It is a bitopic protein with a large globular water-soluble domain containing heme and a small hydrophobic domain allowing anchoring to microsomal membranes. All the nucleotide and amino acid sequences are grouped in the sequence list.
  • the first work to modify the sequences of cytochrome b5 consisted in the ablation of the carboxy terminal side of the amino acids involved in membrane insertion to replace them with four histidines.
  • This chimeric or fusion protein is obtained by cloning the nucleotide sequence by polymerase chain reaction (PCR).
  • the cloning kit used is the TOPO TA cloning® from Invitrogen.
  • the coding DNA sequence for the chimeric protein is inserted into a vector pCR ® 2.1-TOPO ®.
  • the assembly was amplified in cells Niai of One Shot ® .
  • the DNA coding sequence was then transferred into the vector PUHE25-2 expression (SphI cloning ATG and Bam HI to the stop).
  • Membrane Hb5 nucleotide sequence (SEQ ID N ° 3)
  • the chimeric protein obtained previously is then mutated in order to make a thiol group appear at the periphery of the protein via a cysteine residue.
  • This modification is carried out by means of a mutagenesis directed on serine No. 24 of Hb5 (His) 4.
  • the mutagenesis kit used is the QuikChange ® site-directed Mutagenesis Kit from Stratagene.
  • the action of DNA pfu polymerase makes it possible to reconstitute the expression vector and the sequence to be mutated.
  • Supercompetent roundedcurian ® XLl-blue bacteria are transformed by this plasmid.
  • HbS-Ofis ⁇ mut24 nucleotide sequence (SEQ ID N ° 6)
  • AACCACTGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT 121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT
  • the bacterial expression strain is XLl-blue.
  • LB Luria-Bertami
  • the culture is placed at room temperature with stirring for 48 h then the protein overexpression is induced by addition of Isopropyl ⁇ -D-ThioGalacto Pyranoside (IPTG) at a rate of 0.5 mM final.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-ThioGalacto Pyranoside
  • the bacteria are centrifuged after 24-48 hours of induction and are frozen. A freeze / thaw cycle is followed by a lysis / fractionation step (lysozyme, cholic acid and ultrasonic disintegrator).
  • IMAC metal ion chromatography
  • An agarose gel functionalized with iminodiacetic acid (Sigma) is previously loaded (flow 1 ml / min) with Nickel by loading with a 50mM Nickel Chloride solution solubilized in an acetate buffer, pH5.4. the column is washed with this same buffer at the same flow and then we replace the acetate with a sodium phosphate buffer, 50 mM, pH 7.
  • the cell fractionation is directly injected onto an agarose gel column at 5 ml / min. Specifically, the chimeric proteins are retained on the column according to the IMAC technique.
  • the column undergoes a washing phase with a phosphate buffer of increasing concentration 50 to 250 mM, pH7 until the passing solution no longer has an absorption spectrum in the ultraviolet (240-300nm).
  • the protein sample is eluted by taking histines in solution of concentration 1 mg / ml in 50 mM phosphate buffer, pH 7. Similar experiments were carried out on the yeast form of cytochrome b5.
  • cytochrome b5 Similar experiments were carried out on the yeast form of cytochrome b5.
  • the hybrid bilayer structure presented in paragraph 1.3 was functionalized in order to give the model properties of affinities by metal ions.
  • a synthetic phospholipid having an iminodiacetate residue complexing a divalent nickel cation was chosen. It is DOGS or 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3 (N (5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl)] from Avanti polar Lipid, Inc.
  • One method for addressing stable and specific soluble proteins to membrane supports is to use the coupling between a divalent metal chelating cation present on the surface of the membrane and histidine residues. It has been shown that cytochrome b5 whose membrane domain has been delisted in favor of a Tag Histidine segment retains an affinity for biological membranes having divalent chelating cations.
  • a histidine solution at 1 mg / ml injected at the surface of the biosensor causes a sharp decrease in the signal, that is to say the amount of cytochrome b5 fixed on the membrane (FIG. 2b). In this way one can compete with the specific interaction and return to the baseline of the signal.
  • Platinum complexes in particular cis-diamminedichloroplatin (cis- [PtCl 2 (NH 3 )] are agents which bind covalently to DNA.
  • cis- [PtCl 2 (NH 3 )] are agents which bind covalently to DNA.
  • these molecules by substitution of their labile chloro ligand, can bridge d on the one hand a base of DNA and on the other hand a nucleophilic residue of an amino acid of a protein.
  • [Pt (NH3) 2 (H2 ⁇ ) 2 + are prepared by dissolving a suspension of cis- [Pt (N ⁇ 3) 2 (NH3) 2] and tr ⁇ ra , - [Pt (N03) 2 (NH3) 2] in the water, respectively formed by the reactino of ezs- [PtCl2 (NH3) 2] and tr ⁇ m? - [PtCl2 (NH3) 2] with silver nitrate.
  • the DNA-20mer, its complementary strand and its complementary biotynilized strand come from Eurogentec.
  • 5'CTATCATTTGCTTACTATTC 3 '(SEQ ID N ° 13) is chosen so as to have only one guanine because nitrogen N7 is the main site of DNA platination (Lepros et al., 1990).
  • the platination reactions are carried out firstly on DNA or on cytochrome b5 (Rb5 (is) 4 and Ht> 5 (His) 4mut24) but the DNA-5 bridging yield is higher when cytochrome b5 is first platinized.
  • the platination site is determined after treatment of the modified oligonucleotide with piperidine-DMS under "Maxam-Gilbert" sequencing conditions followed by treatment with NaCN.
  • the lack of reactivity of guanine N7-platinum with dimethylsulfate (DMS) makes it possible to conclude that the latter is protected from DMS and therefore from its effective platinization (Comess et al., 1990).
  • Cytochrome hS (100-200 ⁇ M) is incubated in the presence of 5 equivalents of platinum complexes in unbuffered water (pH5) for 5 hours at 25 ° C.
  • Cytochrome b5 is then incubated (90 ⁇ M) with 1.5 equivalent of DNA in unbuffered water (pH5) for 50 hours at 25 ° C.
  • the t-DNA complexes> 5 are separated from the uncomplexed DNA molecules using an agarose gel functionalized with Ni 2+ / iminodiacetic acid (Sigma) groups. The elution of the protein is by injection of immidazole (IM). Excess DNA is not retained ue on the column.
  • IM immidazole
  • the platinum-coupled DNA-b5 complexes are also purified from non-reactive forms of DNA using magnetic spheres coated with Promega streptavidin according to a modification of the procedure described by Promega: 0.5 nmol of total DNA.
  • Platinum complexes and trans- [Pt (NH3) 2 (H2 ⁇ ) 2] 2 + are able to couple cytochrome> 5 with ssDNA-20mer.
  • the platinization site on the DNA oligonucleotide occurs at the N7 level of a single guanine.
  • the "DNA-b5" macromolecular complexes are characterized by gel analyzes of electrophoresis under denaturing conditions, spectrophotometric quantification and determination of melting temperature with a complementary free ssDNA.
  • the radioactivity of the ssDNA * is associated with the migration band of Hb5 [His] 4 (revealed by staining with coomassie blue) demonstrating that a covalent bond has been formed between the ssDNA-20mer and the cytochrome b5 ( Figure 4).
  • the “DNA-pt-b5” complex was characterized by spectral analysis in order to determine the stoichiometry of the reaction between cytochrome b5 and ssDNA-20mer.
  • the experimental conditions allowed the formation of an equimolecular complex as indicated by the respective absorbance of cytochrome b5 at 413nm and of ssDNA-20mer at 260 nm ( Figure 5).
  • the platinization reactions do not occur on the label 4 histidines in the carboxy terminal position, in which case the complex thus formed would not be capable of being purified on an agarose-iminodiacetate column or of interacting strongly. with the cell.
  • Mass characterization experiments electrospray, Maldi-TOF of the various complexes are in progress.
  • Example 5 Grafting of Protein-ssDNA by Spacer Arm 5.1) Functionalization of ssDNA by DPDPB
  • a second alternative was explored concerning the grafting of a nucleic acid with cytochrome b5.
  • the inventors chose not to use direct coupling but preferably complexation by through a spacer arm.
  • the molecule ensuring intermolecular bridging is 1,4-Di- [3 '- (2'-pyridyldithio) propionamido] butane or DPDPB. This molecule allows a covalent bond between two molecules having thiol functions and ensures an intermolecular space of 1.6 nm.
  • a thiol function was created both on an oligonucleotide and on cytochrome b5.
  • the modified oligonucleotides are of HPLC quality and are produced by Eurogentec.
  • the different modified oligonucleotides are as follows:
  • Oligonucleotide no W1 (SEQ ID No 8) 5 'GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C-SH 3'
  • the thiol modification is carried out at the 3 'end of the 22mer.
  • Oligonucleotide no W2 (SEQ ID No 9) 5 'GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C 3'
  • the thiol modification is carried out in-chain on a thymine placed in position l 1 of the 22mer.
  • the different unmodified oligonucleotides involved in the exemplification are the following:
  • Oligonucleotide No. W3 (SEQ ID No. 10) 5 '-GGT-AGA-GAT-CTA-TGC-AGC-TAG-G-3' W3 is the complementary 22mer of W1.
  • W4 has a sequence complementary to the first 9 bases of Wl (5 'side) and the first 11 bases of Wl (3' side). In this way W4 has the particularity of being able to bridge two oligonucleotides W1.
  • the DPDPB-W1 coupling procedure is as follows: in order to prevent any dimerization of the WIs by disulfide bond, the oligonucleotides are treated with a reducing agent of DiThioThreitol (DTT) at the rate of a 1/5 molar fraction. The mixture is incubated at 30 ° C for 15 min. The mother solution of DPDPB is dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at the rate of 10 mg / ml. Addition of DPDPB in an amount of 1 mole of W1 for 500 to 5000 moles of DPDPB is carried out in the presence of the residual DTT during an incubation time of 2 to 4 hours at 30 ° C.
  • DTT DiThioThreitol
  • the sample W1 is then specifically fixed on a DEAE ion exchange column, the reagents are eliminated and the oligonucleotide is eluted by addition of a 1.5M NaCl solution.
  • the rate of modification can be calculated by DTT assay of the cross-linking agent. This reduction causes the departure of the second thiopyridine group of the bridging agent, the quantification of which can be obtained spectrally at 341nm. The describe procedure achieves 100% complex.
  • the excess oligonucleotide is eliminated by retention of the proteins on an iminodiacetate-Ni 2+ gel.
  • the elution of the proteins is obtained by using a histidine lmg / ml solution, as indicated during the step of purification of the HisTag proteins.
  • Spectral analysis on a [240-500] nm window makes it possible to demonstrate the effective coupling of Hb5 (His) 4 mut24 with W1 (FIG. 7).
  • the complexation rates vary from 35 to 65%.
  • the b5-Wl population is isolated and can be confronted with the hybrid membrane.
  • the grafting of the different complexes on the hybrid bilayer was characterized by surface plasmon resonance.
  • BIAcore device Experiments based on radioactivity and fluorescence labeling are being developed in the laboratory.
  • the coupling experiments of the molecular assembly on the lipid model using the nickel chelating complex by surface plasmon resonance have shown the formation of a stable complex.
  • the compactness levels obtained with the assembly appear to be lower than those obtained with the protein not modified by the oligonucleotide.
  • the increase in negative charges brought by Wl can be at the origin of repulsions between supramolecular blocks and thus lead to a less recovery.
  • the recovery values were evaluated between 200 and 250RU.
  • Example 7 Potential of the Biosensor and Hybridization Detection In order to evaluate the potential of the membrane biosensor in terms of specificity and sensitivity, various tests were carried out.
  • W4 represents a random sequence starting from the constitutive bases of Wl, the study of the evolution of the signal made it possible to show that W4 does not interact on the surface of the biosensor ie the lipid structure and the supramolecular assembly b5-Wl; and this whatever the bridging means (cis-Pt or DPDPB)
  • the hybridization results demonstrate the possibility of detecting hybridization states between two ssDNAs on the surface of the biosensor.
  • the hybridization results show a threshold value of approximately 30 to 35RU.
  • the expected value for a complete hybridization from a b5-Wl block signal of 250RU is 70RU.
  • the measurements of Tm carried out on W1 clearly show a phase transition temperature close to ambient temperature, that is to say the measurement temperature within the BIAcore device. At this temperature only 50% of hybridization is expected. The value measured with our device is therefore close to optimal hybridization proof of a very favorable accessibility of the target molecules presented by the biosensor.
  • the membrane biosensor allows molecular hybridization o of approximately 10 molecules.
  • biosensor presented requires only the capture of a complementary ssDNA without the use of a labeled probe being necessary.

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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux biocapteurs, notamment un support permettant de présenter des acides nucléiques et de détecter à la fois la présence d'acides nucléiques dans un échantillon, mais aussi la liaison entre protéines et acides nucléiques, ainsi que la liaison entre un ligand et une protéine liée à un acide nucléique.

Description

STRUCTURE BICOUCHE SUPPORTEE DE PRESENTATION D'UN ACIDE NUCLEIQUE ASSOCIE A UNE PROTEINE
La présente invention se rapporte à de nouvelles biostructures pouvant en particulier servir de biocapteurs, notamment un support permettant de présenter des acides nucléiques et de détecter à la fois la présence d'acides nucléiques dans un échantillon, mais aussi l'interaction entre protéines et lesdits acides nucléiques, ainsi que la liaison entre un ligand et une protéine liée à un acide nucléique.
Le développement des biocapteurs à ADN, encore appelé puces à ADN, s'est accru de manière considérable au cours des dernières années. L'impact de tels biocapteurs s'est principalement orienté dans le séquençage, la cartographie d'expression de gènes, le diagnostique (détection, dommage, mutation...) et l'analyse des interactions ADN-ligand (hybridation...). L'essentiel des capteurs employés utilise des techniques d'immobilisation de molécules d'acide nucléique simple brin ou ADNsb, l'analyse étant réalisée grâce à des systèmes de transduction optique, électrochimique ou piezzo-acoustique.
L'extrême importance physiologique des membranes biologiques comme siège de nombreuses réactions chimiques et métaboliques fut à l'origine d'un engouement pour le développement de modèles lipidiques sur des surfaces inorganiques. Le design de telles structures bio-compatibles et bio-fonctionnelles sur des substrats solides a permis le développement de modèles concernant des domaines interdisciplinaires qui ont conduit à l'essor de nombreux axes de recherche scientifiques ainsi que d'applications pratiques. Les principales applications ont ainsi concerné :
- la fabrication de matrice pour l'immobilisation d'enzymes, de récepteurs cellulaires ou d'hormones dans des environnements non dénaturants,
- le design d'interface permettant de capter des cellules afin d'étudier les effets de molécules pharmaceutiques sur le devenir cellulaire,
- Pauto-assemblage de membranes très résistantes pour le développement de biocapteurs. Les méthodes analytiques appliquées à l'analyse des interactions biomoléculaires ADN- ADN, telles qu'elles sont représentées au cœur des dispositifs puce à ADN, sont essentiellement basées sur la fixation d'un ADN simple brin (ADNsb) au sein d'une aire délimitée sur un substrat. Les principales techniques pour produire des ADN fixés de manière covalente sur le substrat sont la synthèse in situ de ADNsb sur le support, l'assemblage de ADNsb modifiés chimiquement pour permettre le greffage sur le support ou la microdéposition sur une matrice adsorbante (Boncheva et al., 1999, Berney et al., 2000, Wittung- Stafshede P. et al., 2000). Or dans le développement de biocapteurs, la disposition de biomolécules aux interfaces joue un rôle crucial. Pour obtenir des surfaces hautement sensibles, il est important de présenter des molécules réceptrices de façon à ce que le ligand correspondant puisse interagir sans restrictions stériques. Cependant, dans ces différentes approches, les moyens mis en œuvre pour réaliser ces matrices d'ADN génèrent des artefacts (erreurs de synthèses in situ ou de fonctionnalisation des oligonucléotides) à l'origine d'adsorptions non spécifiques, ainsi une partie des travaux actuels porte sur les moyens de circonvenir à ces différentes limitations (Steel et al., 2000).
Une autre limitation de ces systèmes est inhérente au mode de présentation des ADNsb. Le fort compactage des molécules sur la surface conduit à l 'apparition de contraintes stériques qui affectent l'efficacité d'hybridation de la puce. Si l'immobilisation de ADNsb sur une surface est l'alternative jusqu'alors la plus communément employée, elle constitue également celle qui contraint la géométrie du dispositif se traduisant par une perte totale de flexibilité et de modularité de l'assemblage.
L'une des caractéristiques de la présente invention est de proposer un nouveau mode de présentation d'acides nucléiques à la surface d'un substrat. Le mode de présentation des acides nucléiques selon l'invention présente l'originalité de permettre une mobilité des acides nucléiques, et ainsi de pouvoir détecter tout changement dans l'état desdits acides nucléiques par la détection d'une transition entre deux états présentant des niveaux d'organisation distincts. Ainsi, la présente invention a pour objet une cellule pour la présentation d'un acide nucléique comprenant : un support substantiellement plan à l'échelle atomique, une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque (organisation spatiale stable et définie), un acide nucléique IN lié à ladite protéine III, l'ensemble acide nucléique - protéine étant mobile latéralement par rapport audit support, de telle sorte que l'hybridation d'un acide nucléique cible audit acide nucléique IN ou le changement de conformation dudit acide nucléique IN soit détectable ou détectée par la réorganisation géométrique de l'ensemble acide nucléique - protéine.
Dans un cas préféré de la présente invention, ladite protéine III est choisie dans le groupe constitué des protéines ayant un centre rédox et des protéines présentant une propriété d'absorption optique anisotrope. La protéme III sera décrite plus en détail plus bas.
Par « cellule », on entend un sous-ensemble délimité latéralement de la surface se caractérisant par une homogénéité structurale et pouvant être reproduit en de nombreux exemplaires identiques ou variants sur le support inorganique.
Une cellule peut en particulier être utilisée pour la détection d'un type spécifique d'acide nucléique (comme cela sera vu plus loin), différent de l'acide nucléique détecté par l'utilisation d'une autre cellule.
Il est entendu que la présente invention se rapporte également à un support, présentant une pluralité de cellules selon la présente invention.
Dans la présente demande, on pourra utiliser le terme « Flotteur » pour désigner l'ensemble constitué de la protéine mobile par rapport au support, reliée à l'oligonucléotide.
L'oligonucléotide lié au Flotteur pourra être appelé « Amorce » dans la présente demande.
On pourra aussi utiliser les abréviations suivantes dans la présente demande :
DMPC : Dimyristoyl phosphatidyl choline
DOGS : 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3[(Ν(5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl ] DOPC : Dioleoyl phosphatidyl choline
DPDPB : l,4-Di-[3'-(2'-pyridyldithio)propionamido]butane
DPPC : Dipalmitoyl phosphatidyl choline
ADNdb : ADN double brin DTT : Di thiothreitol
Hb5(His)4 : protéine de fusion cytochrome b5 humain-histidine 4
Hb5(His)4mut24 : mutant cystéine (position 24) de Hb5(His)4
IMAC : Chromatographie d'affinité par ion métallique
OG : octyl glucopyranoside OM : octadecyl mercaptan
RPS : résonance de plasmon de surface
RU : unité de réponse
SAM : monocouche auto-assemblée (Self assemblage monolayer)
ADNsb : ADN simple brin
II est intéressant que l'oligonucléotide ne soit pas directement en contact avec le support, ce qui permet une présentation améliorée aux acides nucléiques cibles ou autres éléments interagissant et modifiant la conformation de l'amorce.
Dans un cas particulier, l'ensemble protéine — acide nucléique est mobile par rapport au support, du fait que la protéine soit elle-même mobile dans une couche lipidique elle-même fixée sur le support. On utilise de préférence une bicouche lipidique.
En bref, cet assemblage est constitué d'une membrane lipidique reconstituée sur une surface plane de nature inorganique. On parle alors de membrane lipidique supportée.
Un tel modèle possède des propriétés voisines des membranes biologiques en terme de compacité des éléments la constituant, de compartimentation, de fluidité des éléments constitutifs de ces modèles ainsi que de la plupart des molécules incorporées ou en interaction avec ce modèle (Heyse et al., 1998, Marchai et al., 1998).
Cette propriété de dynamique membranaire est à l'origine de la mobilité latérale des structures proposées et de la réorganisation permettant la formation de domaine et de transduction de signal. De plus, on peut moduler à façon la composition moléculaire de cet édifice lipidique afin de modifier ses propriétés intrinsèques ou d'introduire de nouvelles potentialités.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une cellule pour la présentation d'un acide nucléique comprenant :
- un support substantiellement plan à l'échelle atomique, sur lequel est fixé
- une monocouche hydrophobe I , sur laquelle est présente
- une monocouche II comprenant des phospholipides, - une molécule de pontage présentant une extrémité hydrophobe de nature à interagir avec la monocouche II, et une extrémité chimiquement fonctionnalisée de façon à former une liaison stable avec une protéine III,
- une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque, ladite protéine III étant mobile latéralement dans ladite couche II,
- un acide nucléique IN relié de manière univoque à ladite protéine III, de préférence par un bras moléculaire.
Le fait que la protéine soit mobile dans la couche II (feuillet lipidique) assure une dynamique latérale c'est à dire une la possibilité pour l'ensemble flotteur
+ amorce de diffuser librement en deux dimensions en absence de contrainte géométrique supplémentaire qui serait imposée par l'interaction de l'amorce avec d'autres acides nucléiques. La fluidité membranaire permet la réorganisation et le contact de molécules indispensable pour l' auto-assemblage en superstructures. De surcroît, dans certains modes de réalisation, l'assemblage supramoléculaire ainsi réalisé est caractérisé par une forte modularité : chaque étape de réalisation ou de déstructuration de cet ensemble peut être réalisée de façon réversible par action contrôlée des solutés présents dans une phase aqueuse ou de l'action de conditions thermiques ou d'environnement électrostatique.. De façon à utiliser les propriétés très particulières de ces biostructures, le greffage d'acide nucléique simple brin sur la protéine a été effectué. De cette façon, les oligonucléotides sont greffés sur des blocs de nature protéique flottants sur la monocouche lipidique supérieure du modèle membranaire. Cette disposition offre les avantages suivant :
- Mobilité latérale de l'ancre protéique flottante et par conséquent du ADNsb greffé.
Suppression des interactions non spécifiques des ADNsb sur le support plan du fait d'un recouvrement lipidique approprié.
- Contrôle de la densité des ADNsb présents à la surface du biocapteur (grande modularité)
- Dans certains modes de réalisation, réversibilité des différentes interactions supramoléculaires par procédures de traitements aqueux (permettant la régénération du biocapteur).
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui pourront être employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides naturels ou synthétiques, définissant un fragment ou une région d'un acide nucléique et pouvant correspondre aussi bien à un ADN ou un ARN simple, double ou triple brins. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues. Les liaisons entre les différentes bases peuvent être des liaisons phosphodiester classiques, ou des liaisons modifiées, telles les phosphorothioates, méthylphosphonates. Les oligonucléotides peuvent également être chimériques, c'est-à-dire présentant des liaisons et/ou bases différentes. Le terme englobe ainsi tout variant d'une séquence d'acide nucléique présentant une propriété de reconnaissance par hybridation.
De préférence, l'acide nucléique lié à la protéine dans la cellule selon l'invention est un acide nucléique simple brin. Sa taille n'est pas un paramètre déterminant selon la présente invention, et peut être choisie aisément en utilisant les connaissances générales de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison réversible. Cette liaison réversible peut d'ailleurs être covalente. Ainsi, il est possible de relier l'acide nucléique à la protéine de telle sorte que des liaisons disulfures soient impliquées, qui peuvent toutefois être réversées en présence d'agents appropriés, ou dans des conditions particulières. Ainsi, la liaison réversible peut-elle, dans ce cas particulier, être considérée comme un liaison pouvant être cassée facilement.
Dans un mode de réalisation, l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison covalente. Une telle liaison est connue de l'homme du métier et peut notamment être réalisée en utilisant des bases modifiées dans l'oligonuclétide permettant le couplage à un bras chimique fonctionnalisé pour pouvoir être couplé à spécifiquement à la protéine du flotteur.
Par ailleurs, la nature du greffage peut être de deux sortes : on peut effectuer un greffage connexe de façon à accoler intimement la molécule d'acide nucléique à la protéine ou un greffage par l'intermédiaire d'un bras moléculaire espaceur de façon à offrir une plus grande liberté conformationnelle de l'ADN vis à vis du flotteur. On utilise alors de façon préférée un bras espaceur attaché de manière univoque dans ladite protéine. En effet, ainsi qu'il sera développé plus loin, il est intéressant que la géométrie du flotteur soit parfaitement définie. Ainsi, il est préférable que le bras espaceur soit relié à la protéine à un site précis de celle-ci.
Dans le mode de réalisation dans lequel on accole l'acide nucléique à la protéine, ledit bras espaceur peut alors être complexe métallique tel le cis-platine, le trans-platine, l'europium ou un autre métal de transition impliquant des ligands provenant de la structure même de l'acide nucléique et un ou des ligands provenant de la structure même de la protéine III du flotteur.
Lorsque le bras espaceur est plus long, permettant une plus grande flexibilité de l'acide nucléique, on choisit de préférence un bras espaceur reliant une fonction thiol- ou amino- introduite sur l'acide nucléique, notamment par l'intermédiaire d'une base modifiée (le choix de la base pouvant être quelconque, c'est-à-dire que l'on peut choisir une base en 3', en 5' ou à l'intérieur de l'oligonucléotide, cette alternative pouvant présenter certains avantages, notamment d'offrir un degré de liberté supérieur à l'oligonucléotide), à une autre fonctionnalité présente, de préférence de manière unique, sur la protéine. De préférence, cette seconde fonction est également une fonction thiol, portée par exemple par une cystéine.
Il existe toutefois d'autres types de greffages d'un acide nucléique à une protéine. On peut notamment le greffer sur une arginine dans la protéine. Il est toutefois préférable, pour respecter un principe de l'invention, que le couplage de l'acide nucléique à la protéine soit spécifique, parfaitement défini et univoque au niveau moléculaire. Ainsi, on exclut en général tout type de greffage aléatoire de l'acide nucléique sur la protéme pouvant faire naître une ambiguïté ou une hétérogénéité dans la structure des flotteurs selon la présente invention. Ainsi, de façon préférée, l'acide nucléique IN est relié à ladite protéine TJI par l'intermédiaire d'un composé choisi parmi :
- un bras espaceur reliant deux résidus identiques ou différents chimiquement réactifs de l'acide nucléique IN et de la protéine III, choisis dans le groupe constitué des thiols, des aminés, des amides et des arginines.
- un complexe métallique tel le cis-platine, le trans-platine, l'europium, un complexe de nickel, de cuivre, ou de ruthénium coordonné d'une part à un résidu ou un groupe de résidus aminés de ladite protéine III et d'autre part à une ou plusieurs bases naturelles ou modifiées de l'acide nucléique IN,
- un complexe protéique covalent ou non covalent impliquant l'acide nucléque IN.
La protéine dans la cellule selon la présent invention présente une géométrie détectable de façon univoque, c'est à dire une organisation spatiale stable et définie. Ceci signifie notamment que sa conformation dans la cellule selon la présente invention est identique quelle que soit la protéine observée, lorsque la cellule selon l'invention présente plusieurs flotteurs identiques. Ceci signifie également que la mise en présence de la cellule et d'acides nucléiques extérieurs capables d' interagir avec les amorces de façon univoque conduira à une organisation hautement répétitive au niveau spatial des flotteurs au sein de la cellule. En particulier les acides nucléiques externes pourront conduire à l'association de flotteurs en groupes organisés et ces groupes de flotteurs pourront grâce à leur mobilité latérale interagir entre eux de manière non covalente de façon à former au sein de chaque cellule un réseau de flotteurs hautement organisé au niveau bidimensionnel. Les propriétés (physique, électrique, optique, quantique) de ce réseau hautement organisé différeront alors des propriétés dynamiques de flotteurs désorganisés au sein de la cellule en absence d'interaction avec l'acide nucléique externe. De préférence, la protéine du flotteur sera choisie de façon à ce que les variations de l'organisation spatiale des flotteurs les uns par rapport aux autres conduise à un signal détectable par un procédé quelconque en particulier électrique, optique ou de résonance. Des protéines présentant cette propriété seront choisies préférentiellement dans le groupe constitué des protéines ayant un centre redox et / ou une propriété d'absorption optique anisotrope et /ou de fluorescence intrinsèque.
On cite notamment les cytochromes et de façon plus préférée le cytochrome b5 humain, de levure, ou de toute autre origine, les flavodoxines, les ferridoxines, les azurines et autres protéines à cuivre bleu, les protéines multihémiques de la classe des cytochrome c bactériens qui possèdent à la fois un centre rédox et les propriété d'absorption optique anisotrope. Parmi les protéines fluorescentes on citera préférentiellement la protéine fluorescente verte (GFP) et ses analogues obtenus par mutagenèse ou évolution dirigée. Dans un cas préféré de mise en œuvre, ladite protéine est hydrosoluble. Elle peut également avoir subi des modifications, dont certaines sont indiquées ci-après, pour autant que ces modifications conduisent à une protéine de structure tridimensionnelle stable et définie répondant aux critères tels que définis selon la présente invention. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, ladite protéine a subi une modification ayant permis l'introduction d'un site unique, dans ladite protéine, pour effectuer ladite liaison avec ledit acide nucléique. Le fait qu'un site unique soit introduit dans la protéine selon l'invention pour le greffage de l'acide nucléique permet ainsi de favoriser fortement l'unicité, la spécificité et la définition univoque de la liaison protéine - acide nucléique.
Dans un cas particulier, ladite modification consiste en une mutation de ladite protéine pour ne laisser subsister ou n'introduire qu'un unique acide aminé prédéterminé. La mutation peut être introduite par mutation de l'acide nucléique codant pour la protéine, c'est la méthode la plus simple qui sera favorisée par l'homme du métier. Le site unique de greffage de l'acide nucléique sera alors cet unique acide aminé prédéterminé. En fonction de la séquence de la protéine que l'on a choisie pour mettre en œuvre l'invention, il est en effet à la portée de l'homme du métier de déterminer les acides aminés à modifier, afin de n'en laisser subsister qu'un seul, ou d'en introduire un qui n'est pas présent dans la protéine native. Ainsi, et pour illustrer ce fait, lorsque la protéine que l'on utilise est un cytochrome b5, il est possible d'introduire une cystéine dans la protéine, dans la mesure où cet acide aminé est absent de la protéine native. II est d'ailleurs toujours très intéressant de modifier la protéine de telle sorte qu'elle ne présente qu'une seule cystéine, ou pour le moins qu'elle présente une unique cystéine libre (non impliquée dans une liaison disulfure avec une autre cystéine).
Il est également préférable, pour la bonne mise en œuvre du procédé selon l'invention que la modification dans la protéine soit de telle sorte que cela facilite le greffage de l'acide nucléique, c'est-à-dire, que l'acide aminé utilisé pour ledit greffage soit situé à la périphérie (en surface) de ladite protéine. Il est à la portée de l'homme du métier, en fonction de la protéine choisie, de déterminer le meilleur emplacement pour l'introduction de la modification dans la protéine. Dans le cytochrome b5, on a ainsi exemplifié l'introduction de la cystéine par mutation de la serine 24. Toutefois, des emplacements alternatifs auraient pu aisément être choisis.
Ainsi d'après la structure tridimentionnelle d'un cytochrome b5 de mammifère autre que humain (ex. rat ou bovin), il est tout à fait possible de sélectionner les acides aminés à modifier de façon à n'introduire qu'une seule cystéine dans la séquence de la protéine. Par exemple, la représentation en trois dimensions permettra de cibler les acides aminés les plus périphériques de la protéine, c'est à dire ceux favorisant une meilleure réactivité avec l'acide nucléique modifié. De plus, il pourrait être d'un intérêt crucial de lier le ADNsb au voisinage du centre redox de la protéine : une mutation de la glycine 47 permettrait d'obtenir une telle connexion.
Une des caractéristiques importantes de la présente invention est que la protéine III est mobile par rapport à la couche II de la cellule selon l'invention. Ceci assure aussi la mobilité de l'acide nucléique IN relié à la protéine III dans la cellule, par rapport au support selon l'invention. La mobilité de la protéine dans la couche II peut être obtenue de différentes façons, notamment lorsque ladite protéine présente une queue hydrophobe lui permettant d'être ancrée dans la couche IL Les séquences des queues hydrophobes sont connues dans la littérature, et il est à la portée de l'homme du métier de choisir une telle séquence et de modifier la protéine choisie par génie génétique afin d'introduire une telle séquence d'ancrage. Il est alors avantageux de choisir une queue hydrophobe qui soit courte, afin qu'elle s'ancre uniquement dans la couche IL sans pénétrer dans la couche I. Ceci permet notamment d'améliorer la mobilité de la protéine dans la couche II, en réduisant les phénomènes de « frottement » pouvant être observés si la queue hydrophobe est trop importante. L'optimisation de ces éléments reste à la portée de l'homme du métier.
Dans un cas préféré, toutefois, ladite protéine est reliée à un phospholipide de la couche II, et dans un cas particulier à un phospholipide artificiel introduit de préférence en faible proportion (c'est-à-dire en proportion inférieure à 10 %, de préférence inférieure à 5 %, de façon plus préférée environ 2 %). En effet, la mobilité de la protéine par rapport à la couche II est alors similaire à la mobilité des phospholipides dans ladite couche. Une telle mobilité est en général plus importante que lorsque la protéine présente une queue hydrophobe. Ceci permet d'améliorer les performances de la cellule selon l'invention, ainsi qu'il sera vu.
L'homme du métier a plusieurs méthodes à sa disposition, pour réaliser une liaison protéine - phospholipide. On peut notamment citer, parmi les liaisons covalentes, l'acylation, la farnésylation, l'utilisation d'une séquence d'ancrage GPI
(glycosylphosphatidylinositol) ou l'incorporation d'un phospholipide ou d'un acide gras à un résidu spécifique de la protéine III par un procédé artificiel quelconque.
II peut toutefois être préférable d'avoir une liaison réversible, c'est à dire pouvant être rompue en présence de réactifs ou dans des conditions particulières, mais stable dans les conditions ou en présence des réactifs usuels de travail (hybridation d'acides nucléiques, étude de liaison entre éléments biologiques...). De façon générale, l'homme du métier peut utiliser toutes les méthodes connues permettant de relier une protéine à un liposome par exemple, dans la mesure où les liposomes sont généralement constitués de phospholipides.
Ainsi, on peut notamment utiliser un bras capable de lier un chélate métallique d'un côté et un acide aminé de l'autre, en utilisant, dans la couche II, un phospholipide modifié, ledit phospholipide présentant une zone de fixation d'un chélate.
Ainsi, un phospholipide préféré selon l'invention est le DOGS ou 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3( N (5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl)]. Ce phospholipide est un phospholipide synthétique possédant un résidu iminodiacétate complexant un cation divalent nickel.
Afin de favoriser la mobilité de la protéine dans la couche II, il est intéressant de choisir les phospholipides de ladite couche II afin qu'ils présentent des queues hydrophobes choisies de telle sorte que ladite couche n'est pas à l'état cristallin, mais à l'état fluide à température d'utilisation.
Ces propriétés de fluidité d'une couche de phospholipides sont connues de l'homme du métier, et il existe notamment des diagrammes permettant de choisir la longueur de chaîne et l' insaturation pour obtenir la fluidité à la température d'utilisation (Gulik-Krzywicki et al. , 1967).
Cette température d'utilisation dépend évidemment de l'usage que l'on désire faire du capteur. Ainsi, lorsque l'on recherche une hybridation, la température d'utilisation peut être différente de celle utilisée lorsque l'on étudie la liaison d'une protéine à un acide nucléique. D'autre part, la transition entre des états fluide et gel peut être stratégique dans le cadre d'une technique de détection basée sur l'imagerie des superstructures comme la microscopie à force atomique (AFM).
En fonction de la température d'utilisation, l'homme du métier recherchera les phospholipides les plus adaptés pour la couche IL En règle générale, et afin de simplifier et d'améliorer les potentialités du biocapteur, on recherche la fluidité de la couche II à température ambiante.
Ainsi, on choisit de façon préférée des phospholipides présentant des queues hydrophobes ayant une longueur de chaîne supérieure ou égale à 14 atomes de carbone, ladite chaîne présentant éventuellement des insaturations, de telle sorte que ladite couche II est à l'état fluide à température d'utilisation. II est intéressant de noter, par exemple, que des éléments en C14 sont généralement fluides à une température supérieure à 23 °C, alors que les Cl 6 ne le sont qu'à partir de 37°C, et les Cl 8 au dessus de 50-55°C. Toutefois, l'utilisation de queues en Cl 8, mais présentant des insaturations, permet de diminuer la température de transition de phase (état cristallin - état fluide). Néanmoins, pour certaines applications ou modes de détection, il pourra être préféré que la couche II ne soit pas fluide à température ambiante mais seulement à des températures plus élevées. En particulier ce mode sera préféré si l'on désire « mémoriser » l'état d'organisation des flotteurs, en utilisant l'abaissement de température pour figer la structure après une phase d'organisation à plus haute température. Ceci sera en particulier le cas si la technique de détection (microscopie de champs proche par exemple), ou les conditions d'analyse (déshydratation par exemple) risque d'altérer la structure. Les phospholipides non modifiés de la couche II ne présentent pas de caractéristiques particulières outre les propriétés de mobilité déjà décrites, toutefois, il est préférable qu'ils présentent des têtes polaires, choisies dans le groupe constitué des têtes polaires neutres ne portant pas de charges, neutres globalement portant des charges opposées (zwitterioniques), ou portant une charge globale négative.
Le choix de la charge portée par les phospholipides peut s'avérer intéressant, notamment pour réduire les phénomènes d'absorption non spécifique des acides nucléiques tests sur la couche, qui sont diminués lorsque la charge des têtes de phospholipides est négative. L'utilisation de têtes neutres (soit non chargées soit portant plusieurs charges opposées) est aussi envisagée.
La couche II est assemblée sur la couche I, de façon classique, par les interactions existant entre deux éléments hydrophobes dans un milieu aqueux. On peut donc parler de couche auto-assemblée.
Néanmoins, dans certain cas un catalyseur adapté appelé agent fusogène sera utilisé pour faciliter cette fusion. Ainsi de tels agents comme les cations Ca1"4", le polymère d'éthylène glycol (PEG), les détergents seront utilisés selon des protocoles connus de l'homme du métier.
La couche I, quant à elle, comprend des éléments hydrophobes, présentant une longueur de chaîne d'environ 2 à 2,5 nm, par exemple comprise entre 12 et 20 atomes de carbone, de préférence entre 14 et 18 atomes de carbones.
Il convient en effet de disposer d'une couche I qui soit particulièrement homogène. Par ailleurs, la longueur des chaînes des éléments de la couche I est préférentiellement suffisamment longue pour que la réunion des deux couches I et II forment une véritable bicouche. Les éléments de la couche I sont linéaires ou ramifiés et portent de façon optionnelle des insaturations. Il est important que cette couche I soit homogène, dans la mesure où elle sert de support pour le dépôt de la couche IL La couche I est reliée au support de la cellule selon l'invention de façon covalente, ou par des liaisons non-covalentes fortes. Ce mode de liaison au support ne présente pas une grande importance pour la mise en œuvre de l'invention. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite couche I comprend des phospholipides liés audit support par l'intermédiaire de leurs têtes polaires. Dans un autre mode de réalisation, ladite couche I comprend des éléments hydrophobes liés audit support par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par exemple une liaison alkyl-thiol ou une liaison alkyl-siloxanne, en fonction de la nature du support.
II peut être avantageux de disposer d'une liaison support - couche I qui soit covalente, afin de permettre une réutilisation facilitée de la cellule selon l'invention. En effet, lorsque l'acide nucléique est lié à la protéine, et la protéine est liée à la couche II par des liaisons réversibles, on peut facilement régénérer la cellule par action des éléments (ou des conditions) permettant la ruptures des liaisons acide nucléique — protéine et protéine - couche II, et supprimer la couche II par action d'un détergent approprié. On conçoit ainsi aisément qu'une liaison covalente non réversible entre la couche I et le support permette de reconstruire une cellule. Il est évident que si la couche I est liée au support par une liaison réversible, on peut recommencer à préparer la cellule, mais avec une étape supplémentaire.
La réutilisation du support peut s'avérer très intéressante, dans la mesure où celui-ci doit posséder une quasi planéité au niveau atomique, et par ailleurs peut inclure tout ou partie du système de détection de l'état des cellules, ce qui peut poser certaines contraintes de fabrication et augmenter les coûts de production de la cellule selon l'invention.
Ainsi, dans un mode de réalisation préférée, la planéité dudit support est telle que la différence de hauteur entre deux zones distantes de moins de 100 nm est inférieure ou égale à 10 nm, de préférence inférieure ou égale à 3 nm, de façon plus préférée inférieure ou égale à 2 nm.
On peut choisir différents matériaux pour fabriquer la base de la cellule selon l'invention, notamment un matériau choisi dans le groupe constitué du verre recouvert d'une couche d'or, du mica clivé, du silicium ou de tout autre matériau monocristallin.
Le silicium monocristallin est un matériau très intéressant, dans la mesure où il est effectivement plan à l'échelle atomique, et qu'il peut aisément subir des microgravures, et des modifications chimiques variées, ce qui permet de fabriquer un support présentant une pluralité de cellules selon l'invention. Par ailleurs, le silicium présente des propriétés conductrices ou optiques qui peuvent s'avérer très intéressantes pour ce qui est de la détection des événements biologiques ayant lieu sur la cellule selon l'invention.
Ainsi qu'il sera développé, la cellule selon l'invention peut comprendre plusieurs protéines identiques ou différentes, liées à des acides nucléiques identiques ou différents. Lorsque l'on utilise des amorces différentes, un acide nucléique cible complémentaire de deux Amorces, sera capable de lier les deux Flotteurs correspondants ce qui accentuera son interaction avec le support et amorcera un changement d'organisation spatiale des flotteurs au sein de la cellule.
Ainsi, lorsque les liaisons acide nucléique IN — protéine III et protéine III — couche II sont réversibles, il est possible, par l'intermédiaire d'agents compétiteurs de l'interaction Flotteur-Support (Histidine, Imidazole, EDTA), de facilement différencier des degrés d'hybridation.
Par ailleurs, l'aspect de réorganisation bidimentionnelles des nano-objets Flotteur et Amorce sur la surface plane membranaire, obtenu par la fluidité de la couche II, s'inscrit dans le domaine de l' auto-organisation de molécules biologiques et des phénomènes physico-chimiques qui découlent de ces mouvements collectifs.
Ainsi à partir d'une répartition aléatoire des blocs proteine-acide nucléique, il est clair que l'action d'un effecteur (ex : molécule cible) engendrera une restructuration radicale en deux dimensions. Lorsque l'on utilise en particulier une cellule dans laquelle sont présentes deux (ou plus) amorces différentes, la présence dans l'échantillon cible d'un acide nucléique pouvant s'hybrider à ces différentes amorces et permettant le pontage desdits blocs doit conduire à un processus d'élongation (organisation mono- dimensionnelle)à la surface de la cellule. On passe donc, et c'est un des intérêts majeurs de l'invention, d'un système plus ou moins désordonné (aléatoire, ou avec un équilibre instable) à un système hautement ordonné, sous l'effet de la présence de l'acide nucléique cible dans l'échantillon testé. Par ailleurs cette organisation est extrêmement sensible à la conformation géométrique de l'acide nucléique et donc à tout facteur (mésappariement, fixation de protéines, agent chimiques) susceptible d'interagir avec la conformation ou la structure de l'acide nucléique. De même, lorsque l'on étudie la liaison d'une protéine ou d'un ligand quelconque à un acide nucléique (simple brin ou double brin) lié à la protéine ancrée dans la couche II, ou lorsque l'on étudie la liaison d'une molécule effectrice sur une protéine (du type facteur de transcription) liée à un acide nucléique, sur une cellule selon l'invention, on observe alors (du fait de l'arrivée de ces éléments), une modification de la structure (par exemple courbure de l'acide nucléique) et de l'équilibre du système qui peuvent alors être aisément observés par diverses méthodes capables de détecter le changement d'organisation de la cellule, et notamment par l'intermédiaire d'un système optique (absorbance, fluorescence), électrique, électronique, à résonance de plasmon de surface, de transfert d'énergie, de radiomarquage, de diffraction (optique, électronique, de rayons X, de neutron) ou de microscopie (optique directe ou fluorescence, électronique, champ proche, force atomique).
Ce changement de phase désordre - ordre observé lorsqu'un événement se produit à l'échelle atomique ne peut être aisément détecté que lorsque la protéine sur la cellule selon l'invention possède ce qui a été nommé « une géométrie détectable de façon univoque », et que l'acide nucléique y est attaché de manière univoque.
Le principe de l'invention est donc la mobilité de la protéine ancrée dans la couche II, permettant une réorganisation du système et le fait que l'unité protéine - acide nucléique soit univoque et non aléatoire, ce qui permet de détecter ladite réorganisation.
Il est également envisagé que la présence d'une seule molécule d'acide nucléique cible dans l'échantillon testé permettra d'induire une réorganisation qui pourra alors être détectée. Un exemple de la réalisation d'un tel procédé serait de pré-organiser la cellule par un acide nucléique de même nature que celui à détecter mais présentant d'une part une plus faible affinité pour l'amorce que l'acide nucléique à tester (base modifiée, mésappariement), d'autre part dont la géométrie (taille, courbure) serait différente de l'acide nucléique à tester. L'échange d'un seul acide nucléique (molécule compétitrice externe) au sein d'une cellule pré-organisée conduira alors à un défaut structural local.
Il est connu de l'homme du métier qu'un défaut unique au sein d'un réseau « cristallin » déstabilise l'ensemble du réseau. Si la taille de cellule est choisie de manière adaptée, il est raisonnable d'espérer que cet événement unique changera la stabilité de l'organisation de la cellule. Un tel changement de stabilité peut être testé en appliquant progressivement un facteur extérieur (chimique, température, potentiel électrique...) déstabilisateur jusqu'à désorganisation de la cellule. Ce principe ouvre la possibilité de détecter des événements moléculaires uniques et correspond à la sensibilité maximum théorique d'un détecteur.
Cette sensibilité est un énorme avantage par rapport aux autres systèmes existant et largement répandus, qui demandent la présence d'un nombre important de molécules d'acides nucléiques dans l'échantillon pour être détectées. Par ailleurs un tel détecteur associé à une protéine réceptrice choisie de manière adéquate pour voir son interaction avec l'ADN modulée peut être à l'origine de détecteur moléculaire pour une variété infinie de molécules d'intérêt (notamment protéines, médicament, polluants).
II est également important de noter que l'on ne détecte pas l'hybridation en tant que telle, mais plutôt les changements induits dans la cellule selon l'invention. Ainsi, ceci implique que la cellule selon l'invention (ou le support présentant une pluralité de cellules) peut être utilisé pour la détection d'une cible dans un échantillon, sans qu'il soit nécessaire de marquer ou de manipuler outre mesure ledit échantillon. Ceci est encore un avantage important, puisque l'on peut ainsi détecter la présence d'ARNm sans avoir à le transformer d'abord en ADNc.
Il faut noter que la conformation géométrique des ADNsb et ADNdb est si différente qu'elle se traduit par des propriétés physico-chimiques très distinctes. Ainsi, après hybridation, on peut détecter notamment cet effet par un changement dans la conductivité électronique de la cellule selon l'invention. Ceci est particulièrement facile lorsque la protéine selon l'invention possède également un centre rédox. On peut également détecter l'hybridation par résonance de plasmon de surface, ou par une méthode optique, qui est facilitée par la présence d'une protéine présentant une absorption optique anisotrope.
Afin d'effectuer la détection simultanée de plusieurs cibles, l'invention concerne donc également un support présentant une pluralité de cellules selon l'invention.
Les différentes cellules peuvent être séparées les une des autres par microgravure sur le support, ou par la présence entre deux cellules d'une couche hydrophobe constituée d'éléments ayant une longueur de chaîne différente (de préférence inférieure) de la longueur de chaînes des éléments de la couche I, par exemple inférieure ou égale à 5 atomes de carbone (« differential patterning » Cheng et al. , 2000). Ces éléments possédant une chaîne à bas nombre de carbones peuvent être déposés sur le support en utilisant les techniques de masquage communes en micro-électronique.
Le support selon l'invention est avantageusement complété par la mise en place d'un système permettant la mesure du courant, de l'impédance ou du potentiel, permettant la détection des événements se passant sur chacune des cellules. Une autre alternative favorisée est que le support comporte une surface alternant des zones conductrices et réfléchissantes et des zones non conductrices et transparentes. Un tel réseau comportant des zones transparentes de taille nettement inférieure à la longueur d'onde de la lumière visible a été décrit comme ayant une fonction de transmission lumineuse en fonction de la longueur d'onde en forme de « peigne » (Ebbesen et al, 1998). Les propriétés de transmission optique d'une telle structure doivent être altéré par l'état des cellules voisines, ce qui fourni un moyen de lecture possible.
On peut aussi envisager que le support selon l'invention comporte entre chaque cellule un dispositif optique intégré (couple laser-photodiode par exemple) capable de mesurer l'absorbance d'une cellule dans deux directions croisées et d'en déduire son état d'organisation (anisotropie) ou de désorganisation (isotropie).
On peut envisager aussi préférentiellement une lecture de l'état d'organisation de chaque cellule par un dispositif de balayage optique laser sensible au changement de polarisation de la lumière. Un tel dispositif capable de lire des cellules de taille submicronique est couramment utilisé au niveau grand public dans les lecteurs de minidisque et les lecteurs de CDRom réinscriptibles. Dans un tel cas la variation de polarisation de la lumière réfléchie normalement assurée dans les disques magnéto-optiques par une réorganisation du réseau cristallin d'un sel de Terres Rares (europium, et autres composés de la même série de transition de la table de Mendeléeiv) par un champ magnétique et un chauffage laser, le serait dans le système décrit dans l'invention par la variation d'organisation spatiale dans la cellule de la protéine et ou de son cofacteur qui sont des objets optiquement actifs en terme de polarisation, d'ellipticité (absorption différentielle de lumière polarisée) et d'absorption optique.
L'invention concerne aussi un procédé d'identification de la présence d'un acide nucléique test dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre ledit échantillon en contact avec une cellule selon l'invention, dans des conditions permettant l'hybridation dudit acide nucléique test à un acide nucléique relié à une protéine de ladite cellule, b) détecter l'hybridation dudit acide nucléique test audit acide nucléique relié à ladite protéine. La détection peut être effectuée par tout moyen cité ci-dessus. Si l'on a marqué l'échantillon test, la détection peut être effectuée en fonction dudit marquage. Toutefois, il peut être préféré de détecter la présence de l'acide nucléique cible par changement de conformation du système. Ainsi, la cellule selon l'invention permet la détection sans qu'il ait été besoin de marquer l'échantillon test.
L'invention concerne aussi un procédé d'identification de la liaison d'une protéine à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ladite protéine avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'invention, b) détecter la liaison de ladite protéine audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique. Ledit acide nucléique peut être simple brin, double brin ou triplex, lorsque l'on a déjà fixé un acide nucléique sur un des acides nucléiques (amorces) de la cellule. Il est clair que le choix de certaines bases pour l'amorce peut mener à la formation d'un acide nucléique triplex, ladite formation étant alors considérée, au sens de l'invention comme une hybridation.
La détection peut encore être effectuée de plusieurs manière, et notamment par changement de conformation du système.
L'invention concerne également un procédé d'identification de la liaison d'un ligand à une protéine attachée à un acide nucléique fixé à une protéine dans une cellule selon l'invention, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit ligand avec ladite protéine, b) détecter la liaison dudit ligand à ladite protéine.
Parmi les ligands et protéines envisagées, on effectue notamment les études pour identifier des molécules effectrices se liant sur des récepteurs nucléaires ou des facteurs de transcription. La liaison peut être directe ou indirecte, et impliquer par exemple la liaison du ligand à un récepteur qui va alors se fixer à une protéme ou un complexe protéique déjà associé à l'ADN de la cellule.
La liaison du ligand à la protéine peut être observée notamment par changement de conformation du système.
De façon générale, l'invention se rapporte à un procédé d'identification de la liaison d'un composé à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit composé avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'invention, b) détecter la liaison dudir composé audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique. De même que précédemment, ledit acide nucléique peut être simple brin, double brin ou triplex, lorsque l'on a déjà fixé un acide nucléique sur un des acides nucléiques de la cellule.
La liaison est détectée notamment par changement de conformation du système, ainsi qu'il a été expliqué plus haut. La détection de la géométrie ou de la perturbation de la géométrie des ensembles Flotteur-Amorce-Cible peut être avantageusement effectuée grâce à l'apport de technologies de microscopies de force atomique en environnement liquide. Ainsi, les applications potentielles de ce type de caractérisation portent sur l'étude de l'impact de l'interaction de toutes molécules ou macromolécules avec les acides nucléiques (régulation, facteurs de transcription, drogues, médicaments, notamment pour chimiothérapie...).
Dans un cas particulier, le dispositif selon l'invention offre une contiguïté moléculaire et supramoléculaire impliquant une membrane lipidique, des protéines rédox et des acides nucléiques. Cet assemblage de biomolécules électro- et opto- actives au sein de microsystèmes issu de la microélectronique peut s'avérer potentiellement de fort impact dans des domaines de transductions électroniques (conducteurs, semi-conducteurs, circuits biomoléculaires) et optiques non linéaires (anisotropie).
De fait, l'ADN double brin, à la différence du ADNsb, possède des propriétés de transfert d'électron selon un processus de conduction électronique par recouvrement des orbitales Pi. De plus, la réaction d'hybridation entre deux molécules de ADNsb est très spécifique. Les systèmes actuels développés dans le cadre des composants électroniques à l 'échelle du nanomètre se heurtent à différents problèmes dont :
• l'interconnexion des nano-objets entre eux
• la connexion des nanostructures à des électrodes macroscopiques. L'utilisation de processus de reconnaissance moléculaire et d'auto- assemblages de molécules au sein de structures supramoléculaires, tels qu'envisagés au sein de la cellule selon la présente invention, pourraient permettre de circonvenir à ces difficultés.
En effet, la cellule selon l'invention présente une architecture biomoléculaire originale qui se positionne dans le domaine des nano-bioingénieries, c'est à dire du développement de nouveaux types de nanostructures possédant des propriétés de :
- forte modularité,
- haut degré d'organisation à l'échelle moléculaire,
- transferts électroniques vectoriels, couplage avec des messagers chimiques.
L'ADN possède les propriétés de reconnaissance moléculaire, mécanique pour être intégré dans des microcircuits. Cependant les propriétés électroniques intrinsèques de cette macromolécule semblent insuffisantes pour être utilisé directement (Braun et al., 1998). Un des axes de recherche les plus prometteurs dans l'utilisation de potentiel de transport de charges électriques le long du duplex d'ADN est représenté par l'utilisation de processus électrocatalytiques (Boon et al., 2000). Un tel dispositif de transduction du signal peut tout à fait être intégré dans le dispositif selon l'invention grâce à l'utilisation de molécules rédox additionnelles.
Cependant, dans un dispositif préféré selon l'invention, la présence des Flotteurs composés de protéines rédox possédant des groupes électroactifs et/ou des potentiels d'oxydoréduction différents et modulables permet d'assurer un environnement électronique dense en terme de recouvrement des orbitales électroniques. En fonction de la périodicité et de l'organisation bidimentionnelle de ces macromolécules rédox (considérées alors comme des centres relais), une telle structure pourrait être à l'origine, d'un dopage électronique des ADN, à des sauts d'électrons entre protéines ou à des processus de transfert d'énergie. Ainsi, une cellule selon l'invention peut avoir d'autres modes d'utilisation que les simples procédés de détection qui ont été cités ci-dessus.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention comprenant l'étape de : - mise en place, sur un support substantiellement plan à l'échelle atomique, d'une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque (organisation spatiale stable et définie), liée à un acide nucléique IV, de telle sorte que l'ensemble acide nucléique - protéine soit mobile latéralement par rapport audit support, afin que l'hybridation d'un acide nucléique cible audit acide nucléique IV ou le changement de conformation dudit acide nucléique IV soit détectable par la réorganisation géométrique de l'ensemble acide nucléique - protéine. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une cellule selon l'invention comprenant les étapes de :
- fixation d'une monocouche hydrophobe I sur un support substantiellement plan à l'échelle atomique,
- assemblage sur ladite monocouche I d'une monocouche II comprenant des phospholipides,
- mise en place d'une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque, ladite protéine III étant mobile latéralement dans ladite couche II, par l'intermédiaire d'une molécule de pontage présentant une extrémité hydrophobe de nature à interagir avec la monocouche II, et une extrémité chimiquement fonctionnalisée de façon à former une liaison stable avec une protéine III, ladite protéine III étant reliée de manière univoque à un acide nucléique IN, de préférence par un bras moléculaire.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Construction de la bicouche hybride et caractérisation par analyse résonance de plasmon de surface. A : le signal enregistré correspond à la ligne de base du support métallique recouvert d'une monocouche dense d'OM dans l'environnement du tampon de travail (classiquement tampon phosphate, 50mM, pH7.5).
B : La variation de signal correspond à l'injection dans le circuit fluidique d'une solution vésiculaire mixte DMPC-DOGS fabriquée dans l'eau. L'augmentation du signal correspond à une cinétique de fusion des vésicules sur le support de façon à obtenir une monocouche lipidique compacte. Ainsi, après 20- 40min d'injection, le retour au tampon de travail permet d'estimer la quantité de lipides assemblés à 1700 +/- 300RU. Cette valeur, selon les différents modes de calibrage proposé par BIAcore, correspond à celui d'une hémimembrane lipidique. C : Une procédure de traitement de la membrane par une solution de soude
20mM permet d'éliminer l'excédant de lipides adsorbés sur la structure.
D : Contrôle de l'homogénéité de la membrane lipidique par injection de protéine hydrosoluble (ex. Cytochrome c, BSA...). Figure 2 : Mise en évidence d 'une association spécifique de Hb5 (His)4 sur la bicouche hybride fonctionnalisée par des cations nickel chélateur Caractérisation par RPS A : Trois injections successives (représentées par des flèches) de la forme cytochrome b5 poly-histidines sont effectuées au voisinage de la bicouche lipidique fonctionnalisée. Classiquement la solution protéique, de concentration égale à 1 μM dans du tampon phosphate 50mM, pH7, est injectée sous un flux de lOμl/min pendant 180 secondes. Les différentes injections conduisent à une saturation progressive de la surface. Le maximum de recouvrement est de l'ordre de 650 +/-
-2
50 RU soit un taux de recouvrement surfacique de 7pmole.cm" .
B : Afin de montrer la grande spécificité de l'interaction, des injections d'une solution d'histidine lmg/ml dans du tampon phosphate 50mM sont effectuées (ex : Quatre injections symbolisées par les flèches). L'injection d'un agent compétiteur de la chélation entre le segment poly histidine de Hb5 (His)4 et la membrane. Chaque injection (flux lOμl/min pendant 120 secondes) est accompagnée d'une baisse de signal c'est à dire de la quantité de protéines en interaction avec la membrane. Ainsi la régénération complète de la structure est obtenue après quelques minutes de temps de contact.
Figure 3 : Schéma du biocapteur membranaire, construction / régénération de l 'assemblage supramoléculaire Construction : Une surface inorganique (ex : or) est fonctionnalisée par une monocouche dense d'octadecyl mercaptan. Cette surface est propice à la fusion de vésicules lipidiques (liposomes) jusqu'à l'obtention d'une monocouche dense de phospholipides au dessus du support. La présence de 10% (mol/mol) de phospholipides modifiés permet l'ancrage de cytochromes b5 de façon à l'obtention d'une monocouche dense de protéines. Régénération :
Des injections d'agents compétiteurs de l'affinité par ions métalliques comme une solution d'histidine (lmg/ml) permettent le décrochage de l'intégralité de Hb5(His)4 interagissant de façon spécifique avec le support. De la même manière l'hémimembrane lipidique reconstituée sur le support inorganique fonctionnalisé peut être régénéré grâce à l'utilisation d'une solution de détergent comme l'octyl glucoside ou OG (40mM dans H2O).
Ainsi l'intégralité des phases de construction et de déstructuration peut être réalisée de façon contrôlée par l'emploi de solution aqueuse préservant l'intégrité des molécules biologiques.
Figure 4 : Caractérisation du complexe b5-cis-Pt-ADNsb, Gel SDS de Polyacrylamide (15%) de Hb5(His)4 platiné et couplé avec un oligonucléotide de séquence CTATCATTTGCTTACTATTC (SEQ ID N° 13)
Fig. 4.A : Autoradiogramme d'un gel dans lequel a été injecté le Hb5(His)4- cisPt (puits 1) ; l'oligonucléotide radiomarqué au P (puits 2) et le complexe b5- cis-Pt- ADNsb (puits 3) permet de mettre en évidence l'apparition d'un signal de radioactivité supplémentaire dans le puits 3 par rapport au puits 2. Fig. 4.B : Utilisation d'un gel de polyacrylamide (15%) en conditions dénaturantes (SDS). Caractérisation croisée du complexe b5-cis-Pt-ADNsb : ledit complexe injecté en piste 3 présente une bande qui permet de confirmer l'existence d'une population dont le poids moléculaire est proche de 20000 Dalton soit le poids moléculaire théorique. Puits (1): b5 platiné avec çw-Pt[(NH3)2(H2O)2]2+. Puits (2) : ADN 20 mère radiomarqué (ADN*). Puits (3) : b5 platiné lié à l'ADN* 20-mère
Figure 5 : Caractérisation spectrale du complexe Hb5(His)4- CTATCATTTGCTTACTATTC via un ponta e s-Pt[(NH3)2(H2O)2]2+ Deux procédures de reconstitutions du complexe Hb5 (his)4-cisPt-ADNsb sont caractérisés par spectrophotomètrie dans une fenêtre 240-600nm. Le cytochrome b5 possède un maximum d'absorption à 412nm alors que le ADNsb a un maximum à 260nm. Le profil spectral de deux échantillons ainsi que la quantification relative de chaque espèce grâce aux coefficients d'extinction molaire permet de mettre en évidence :
• spectre rouge : une fraction molaire Hb5(His)4/ADNsb=3/l
• spectre bleu : une fraction molaire Hb5(His)4/ADNsb:=l/l La procédure permettant la caractérisation représentée par le spectre d'absorption bleu permet d'obtenir un couplage équimolaire.
Figure 6 : Détermination des température de fusion du 20-mer ADN et du 20- mer ADN ponté avec Hb5(His)4 platiné.
Les déterminations des températures de fusion ont été effectuées par mesures spectrales d'hyperchromicité après fusion du brin complémentaire à haute température (80°C). Une décroissance par pallier de 1°C permet de suivre spectralement l'évolution du ADNdb. • Les résultats d'absorption en fonction de la température pour le ADNsb libre permet d'obtenir une courbe dont le point d'inflexion correspond à la température de fusion. La Tm pour le ADNsb est évaluée à 45°C.
• La même caractérisation sur le ADNsb couplé à Hb5(His)4 donne un profil modifié dont la Tm a été estimée à 23°C
Figure 7 : Séparation des espèces protéiques et du complexe cytochrome b5-
ADNsb via un pont DPDPB par chromatographie. Caractérisation par spectrophotomètrie 240-450nm
Les différentes populations issues de l'incubation (4H à 30°C) de ADNsb- DPDPB avec Hb5(His)4mut24 sont chargées sur colonne DEAE. Les différentes espèces sont ensuite éluées par l'intermédiaire d'une solution de tampon phosphate
25mM et d'un gradient croissant de NaCl.
Le cytochrome b5 possède un maximum d'absorption à 412nm alors que le
ADNsb a un maximum à 260nm. Le gradient de NaCI permet l'élution graduelle de toutes les populations :
• [NaCl]<0.15M : population 1 de Hb5(His)4mut24
• 0.15<[NaCl]<0.25M : population 2 de Hb5(His)4mut24
• [NaCl]=0.5M : population 3 de Hb5(His)4mut24
Figure 8 : Profil d'élution et composition supramoléculaire des complexes cytochrome b5-ADNsb
La quantification molaire des espèces isolée après séparation sur DEAE est représentée sous la forme d'histogramme : • les populations 1 et 2 de Hb5(His)4mut24 caractérisées en figure 7 ne présentent aucune composante ADNsb mesurée à 260nm. Ces deux populations correspondent à la forme monomèrique (n'ayant pas réagit au cours de l'incubation) et à la forme dimérique (résultant d'un pont cystine entre deux protéines).
• La population 3 présente un complexe équimolaire Hb5(his)4mut24- ADNsb.
Figure 9 : Détection par résonance de plasmon de surface de la cinétique d'association d'un ADNsb complémentaire du ADNsb amorce en interaction avec le biocapteur
A partir d'un signal « b5-Wl » voisin de 250RU, différentes injections de ADNsb ont été effectuées, à une densité de b5-ADNsb égale à 1 pmol.cm"2:
Ainsi le brin ADNsb complémentaire de Wl a été injecté au voisinage du biocapteur ( 1 μl/min pendant 10min) pour deux concentrations en NaCl.
A une concentration de NaCl 150mM, un signal d'hybridation est observée dans une gamme de complexation correspondant à 100% des assemblages « b5- ADNsb » en interaction avec la membrane.
Le même oligonucléotide injecté à faible concentration en NaCl (25mM) montre une hybridation très restreinte vis à vis du biocapteur.
FigurelO: Schéma de l 'assemblage comme biocapteur à ADN~
La flèche représente le flux de biomolécules de l'échantillon test.
Figure 11 : Schéma de l 'assemblage comme nanostructures douées de propriétés dynamiques et conformationnelles
Un jeu de différents blocs Flottant peut être présenté à la surface du biocapteur, l'injection d'un oligonucléotide potentiellement s'hybridant sur une partie des blocs Flottant doit permettre un pontage inter-bloc. Le caractère de mobilité latérale des éléments doit favoriser ce processus jusqu'à l'obtention de phénomènes de réorganisation supramoléculaires à la surface de la cellule. Les exemples qui suivent se rapportent à un cas particulier de l'invention, mais ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention.
EXEMPLES Exemple 1 : Réalisation de la bicouche hybride
1.1) Fonctionnalisation du support
Le support solide utilisé est constitué d'une lame de verre recouverte d'un film d'or commercialisé par la société BIAcore® sous le nom de puce Jl.
De tels supports ont été également fabriqués par les inventeurs. Ils consistent en l'utilisation de lamelles de verre planées (épaisseur 0.4mm, 22* 10mm, Prolabo) subissant successivement une vaporisation de 2.6nm de chrome puis une vaporisation de 48nm d'or sous un vide de 2.10 mm de Hg.
On procède ensuite à un recouvrement de l'interface métallique par autoassemblage de molécules d'octadecyl mercaptan ou OM de chez Aldrich. La solution d'OM est utilisée à ImM dans un mélange éthanol/eau 4/1 (v/v). Après deux heures d'incubation, les lames sont lavées au chloroforme, au méthanol puis à l'eau et sont séchées sous flux d'azote.
Le résultat est la reconstitution sur l'or d'une monocouche dense hautement organisée conférant au support de très fortes propriétés hydrophobes. Ce premier assemblage a été caractérisé de nombreuses fois dans la littérature. Des mesures d'angle de contact permettent de vérifier en routine la compacité de la monocouche ainsi reconstituée.
1.2) Fabrication des vésicules lipidiques 1.2.1) Méthode sonication/extrusion
La méthode utilisée pour préparer les liposomes est basée sur une double procédure sonication/extrusion.
Les phospholipides dimyristoyl et/ou dipalmitoyl phosphatidyl choline de chez Sigma constituants principaux des vésicules sont solubilisés dans une solution organique de chloroforme. Un film lipidique est ensuite déposé dans des tubes en verre à scintillation par évaporation du chloroforme sous flux d'azote. Ce film est re-suspendu dans une solution aqueuse (d'eau ultra pure ou tamponnée) à une concentration finale de ImM. Cette mixture est ensuite soniquée :
- dans un bain à ultrason (Transsonic 310 de chez Fisher-Scientific) à puissance maximale pendant 20min, puis par un désintégrateur ultrasonique (Vibra-Cell de chez Bioblock) par puises de 2min, avec 50% de cycle actif pour une puissance de sortie de 4. La procédure est stoppée lorsque la solution est devenue translucide, c'est à dire classiquement après 6 à 10 min de temps cumulés de sonication.
La dernière étape de fabrication consiste en l'extrusion à travers une membrane de polycarbonate ( Avestin, diamètre de 19mm et de diamètre de pore 50nm ou lOOnm) dans un appareil Liposofast®basic, Avestin, Inc.
1.2.2) Méthode vortex/extrusion
Une seconde procédure est utilisée dans le cas de l'utilisation de molécules sensibles aux perturbations ultrasoniques comme les chaînes hydrocarbonées de certains phospholipides présentant des poly-insaturations (ex : 1,2 dioleoyl-sn- glycero-3[(N(5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] ou DOGS de chez Aventi Polar Lipids, Dioleoyl phosphatidyl choline ou DOPC de chez Sigma).
Dans ce cas, une procédure identique à 1.2.1 de solubilisation dans CHC13 puis de construction d'un film lipidique sur verre est appliquée. La procédure diffère ensuite par resuspension des phospholipides en solution aqueuse à ImM par une étape de vortex, 5min à la vitesse maximale.
Cette étape est suivie d'une phase d'extrusion à travers une membrane de polycarbonate de diamètre de pore 50nm dans un appareil Liposofast® de chez AVESTIN.
1.3) Reconstitution de la monocouche lipidique
Le support hydrophobe servant de matrice pour générer la monocouche lipidique, subit une procédure de traitement comme suit : afin d'améliorer la mouillabilité de la structure, une solution d'éthanol / eau (1/1 vol) est injectée sur le support et est suivie d'étapes de rinçage à l'eau et à des solution tamponnées. Afin de nettoyer l'interface, l'injection d'une solution de détergent, l'octyl glucopyranoside de chez Sigma, de concentration 40mM. Immédiatement après, les vésicules lipidiques confectionnées sont injectées au contact de la surface métallique fonctionnalisée. Spontanément, selon un processus de fusion de liposomes établi par Kalb et al. (1992), les vésicules fusionnent au contact de la monocouche hydrophobe d'OM. Après 30 à 60min, ce processus conduit à la formation d'une monocouche lipidique recouvrant totalement la monocouche d'OM.
L'assemblage moléculaire ainsi obtenu présente un substrat de nature métallique recouvert de façon covalente d'un premier feuillet alkylé sur lequel est assemblé un feuillet fluide et dynamique de molécules amphiphiles. Les expériences de caractérisation utilisent la technologie BIAcore® par l'intermédiaire des appareils BIAcore 1000 et BIAcore X.
Les résultats de fusion de liposomes sont obtenus sous la forme d'un sensorgramme (figure 1). A l'injection des vésicules, une phase d'association avec le support est observée conduisant à un plateau après 20-30 de temps de contact. A l'arrêt de l'injection et donc au retour du tampon de travail, une première quantité de matériel lipidique est évaluée. Une procédure de nettoyage de la surface à l'hydroxyde de sodium 20mM permet d'éliminer toutes les vésicules imparfaitement fusionnées à la surface du biocapteur. Classiquement le signal obtenu est compris entre 1400 et 2000 RU, ce qui est conforme avec les résultats disponibles dans la littérature et les mode de calibrage fournis par le fabriquant. Une injection de protéines solubles au voisinage de cette membrane supportée permet de valider l'absence de défaut de la monocouche lipidique supérieure. L'introduction dans les liposomes de phospholipides synthétiques DOGS à raison de 10% mol/mol confère à cette monocouche des propriétés de complexation de capteur de protéines- TagHis.
Exemple 2 : Construction, expression et purification des protéines de fusion 2.1) Les protéines hydrosolubles avec un Tag histidine
La protéine initiale utilisée dans le cadre de cet exemple est une hémoprotéine membranaire : le cytochrome b5 humain ou de levure. C'est une protéine bitopique possédant un grand domaine hydrosoluble globulaire contenant l'hème et un petit domaine hydrophobe permettant l'ancrage aux membranes microsomales. Toutes les séquences nucléotidiques et en acides aminés sont regroupées dans la liste de séquences.
La séquence en acides aminés des formes humaine et de levure sont dénommées comme suit :
Séquence en acides aminés du cytochrome b5 humain membranaire (SEQ ID N° 1)
1 MLAEQSDEAV KYYTLEEIQK HNHSKSTW I LHHKVYDLTK FLEEHPGGEE V REQAGGDA 61 TENFEDVGHS TDAREMSKTF IIGELHPDDR PKLNKPPETL ITTIDSSSS WTNWVIPAIS 121 AVAVAMYR YMAED
Séquence en acides aminés du cytochrome b5 de levure membranaire (SEQ ID N°
2}
1 MPKVYSYQEV AEHNGPQNFW IIIDDKVYDV SQFKDEHPGG DEIIMDLGGQ DATESFVDIG 61 HSDEALRL K GLYIGDVDKT SERVSVE VS TSENQSKGSG T WILAILM LGVAYYLLNE
Le premier travail de modification des séquences du cytochrome b5 a consisté en l'ablation du coté carboxy terminal des acides aminés impliqués dans l'insertion membranaire pour les remplacer par quatre histidines.
Cette protéine chimère ou fusion est obtenue par clonage de la séquence nucléotidique par polymerase chain reaction (PCR).
Le kit de clonage utilisé est le TOPO TA cloning® de chez Invitrogen. La séquence ADN codante pour la protéine chimère est introduite dans un vecteur pCR®2.1-TOPO®. L'ensemble a été amplifié dans les cellules Niai of One Shot®.La séquence ADN codante a ensuite été transférée dans le vecteur d'expression PUHE25-2 (clonage SphI pour l'ATG et Bam HI pour le stop).
La modification en base pour Hb5 est donc la suivante :
Séquence nucléotidique de Hb5 membranaire (SEQ ID N° 3)
1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC 61 AACCACAGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT
121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT
181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAA AACATTCATC
241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC
301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTTGGTGG ACCAACTGGG TGATCCCTGC CATCTCTGCA 361 GTGGCCGTCG CCTTGATGTA TCGCCTATAC ATGGCAGAGG ACTGA Séquence nucléotidique de Hb5 soluble tag histidine [Hb5-(His l (SEQ ID N° 4
1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC
61 AACCACAGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT
121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT 181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAG AACATTCATC
241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC
301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTAACGGA CATCACCACC ATTAA
Séquence en acides aminés de ["Hb5-(His)4] (SEQ ID N° 5) 1 MLAEQSDEAV KYYTLEEIQK HNHSKSTWLI LHHKVYD TK FLEEHPGGEE VLREQAGGDA 61 TENFEDVGHS TDAREMSRTF IIGELHPDDR P LNKPPETL ITTIDSSSSN GHHHH
2.2) La protéine hydrosoluble Tag histidine mutée Ser24^>Cys
La protéine chimère obtenue précédemment est ensuite mutée afin de faire apparaître à la périphérie de la protéine un groupement thiol par l'intermédiaire d'un résidu cystéine. Cette modification est réalisée grâce à une mutagenèse dirigée sur la serine n°24 de Hb5(His)4.
Le kit de mutagenèse utilisé est le QuikChange® site-directed Mutagenesis Kit de chez Stratagene. L'action de la ADN pfu polymérase permet de reconstituer le vecteur d'expression et la séquence à muter. Des bactéries épicurian® XLl-blue supercompétentes sont transformées par ce plasmide.
Plusieurs localisations différentes de la mutation ont été essayées et il est exemplifié en particulier la position 24 soit une modification du résidu serine en cystéine. La mutation a été vérifiée par séquençage au laboratoire (ABI séquenceur) :
Séquence nucléotidique de HbS-Ofis^ mut24 (SEQ ID N° 6)
1 ATGGCAGAGC AGTCGGACGA GGCCGTGAAG TACTACACCC TAGAGGAGAT TCAGAAGCAC
61 AACCACTGCA AGAGCACCTG GCTGATCCTG CACCACAAGG TGTACGATTT GACCAAATTT 121 CTGGAAGAGC ATCCTGGTGG GGAAGAAGTT TTAAGGGAAC AAGCTGGAGG TGACGCTACT
181 GAGAACTTTG AGGATGTCGG GCACTCTACA GATGCCAGGG AAATGTCCAG AACATTCATC
241 ATTGGGGAGC TCCATCCAGA TGACAGACCA AAGTTAAACA AGCCTCCGGA AACTCTTATC
301 ACTACTATTG ATTCTAGTTC CAGTAACGGA CATCACCACC ATTAA
Séquence en acides aminés de Hb5-(His)* mut24 (SEQ ID N° 7)
1 MLAEQSDEAV KYYTLEEIQK HNHCKSTWLI LHHKVYDLTK FLEEHPGGEE VLREQAGGDA 61 TENFEDVGHS TDAREMSRTF IIGELHPDDR PKLNKPPETL ITTIDSSSSN GHHHH 2.3) Expression des protéines chez Escherichia Coli
La souche d'expression bactérienne est XLl-blue.
Une préculture (6h à 37°C dans 50ml de milieu) d'un clone dans un milieu Luria-Bertami (LB) en présence d'un marqueur de sélection, l'ampicilline, a permis d'ensemencer à raison de l/100eme un litre de milieu Terrifie Broth supplémenté avec 100mg/l d'ampicilline.
La culture est placée à température ambiante sous agitation pendant 48h puis la surexpression de protéine est induite par ajout d'Isopropyl β-D-ThioGalacto Pyranoside (IPTG) à raison de 0.5mM final.
2.4) Purification des protéines
Les bactéries sont centrifugées après 24-48h d'induction et sont congelées. Un cycle congélation/décongélation est suivi d'une étape de lyse/fractionnement (lysozyme, acide cholique et desintégrateur ultrasonique).
La procédure de purification par chromatographie par ion métallique (IMAC) est définie comme suit :
Un gel d'agarose fonctionnalisé par de l'acide iminodiacétique (Sigma) est préalablement chargé (flux 1 ml/min) en Nickel par chargement d'une solution de Chlorure de Nickel 50mM solubilisé dans un tampon acétate, pH5.4. la colonne est lavée par ce même tampon au même flux puis nous procédons à un remplacement de l'acétate par un tampon phosphate sodium, 50mM, pH 7.
Le fractionnement cellulaire est directement injecté sur colonne de gel d'agarose à 5ml/min. Spécifiquement les protéines chimères sont retenues sur la colonne selon la technique IMAC. La colonne subit une phase de lavage au tampon phosphate de concentration croissante 50 à 250mM, pH7 jusqu'à ce que la solution passante ne présente plus de spectre d'absorption dans l'ultraviolet (240-300nm). L'échantillon protéique est élue lors de puises d'histines en solution de concentration lmg/ml dans le tampon phosphate 50mM, pH 7. Des expériences similaires ont été réalisées sur la forme levure du cytochrome b5. Ainsi il est possible d'obtenir plusieurs protéines chimères mutantes humaines et levure de fort degré de pureté et à raison de plusieurs milligrammes de protéine. Exemple 3 : Réalisation de l'ancrage protéique flottant
La structure de bicouche hybride présentée paragraphe 1.3 a été fonctionnalisée dans le but de conférer au modèle des propriétés d'affinités par ions métalliques. Pour ce faire, un phospholipide synthétique possédant un résidu iminodiacétate complexant un cation divalent nickel a été choisi. Il s'agit du DOGS ou 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3(N(5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl)] de chez Avanti polar Lipid, Inc.
Il a été démontré qu'une telle molécule permet l'interaction de protéines possédant un domaine poly-histidine dans leur séquence primaire. Dans le but d'introduire ces phospholipides synthétiques dans le modèle membranaire, nous avons fabriqué des vésicules lipidiques composées d'une mixture de lipides à hauteur de 10% (mol/mol) de lipide modifié. Ces liposomes mixtes ont le même comportement vis à vis du support hydrophobe que ceux composés d'une seule espèce de phospholipides. Les résultats de fusion par RPS conduisent à des valeurs comparables en terme de cinétique de fusion et de recouvrement (résultats non présentés).
Une méthode pour adresser des protéines solubles de manière stable et spécifique à des supports membranaires est d'utiliser le couplage entre un cation divalent métallique chélateur présent à la surface de la membrane et des résidus histidines. Il a été démontré que le cytochrome b5 dont le domaine membranaire a été délaité au profit d'un segment Tag Histidine conserve une affinité pour les membranes biologiques présentant des cations divalents chélateurs.
Différentes formes de cytochrome b5 avec un domaine TagHis ont été produites (paragraphe 2.1).
L'immobilisation des cytochromes b5 sur la bicouche hybride par approche IMAC a été caractérisée par RPS (Figure 2). Pour évaluer la capacité de fixation de la membrane, de multiples injections protéiques ont été effectuées dans son environnement. Les concentrations protéiques sont comprises classiquement entre 0.5 et 2μM et conduisent à une cinétique de saturation du biocapteur. Pour la forme Hb5(His)4, un signal de chargement maximal de 650RU, qui correspond à environ 75% de recouvrement optimal sur un tel modèle membranaire (figure la), a été obtenu. Pour démontrer l'interaction spécifique de ces protéines avec le biocapteur, on a procédé à de multiples injections d'un agent compétiteur des coordinations histidine-Ni2+. Une solution d'histidine à lmg/ml injectée à la surface du biocapteur entraîne une forte décroissance du signal, c'est à dire de la quantité de cytochrome b5 fixé sur la membrane (figure 2b). De cette façon on peut compétiter l'interaction spécifique et revenir à la ligne de base du signal.
Cette procédure, utilisant une solution aqueuse non dénaturante pour les biomolécules, permet ainsi une régénération complète de la surface de la monocouche lipidique. Les résultats présentés en figure 2 confirme le fort potentiel du biocapteur en terme de capture protéique avec un haut niveau de compacité. Ils permettent de souligner l'extrême contrôle des auteurs sur les différentes phases de construction de cet assemblage supramoléculaire car, en modulant les puises d'injections protéiques ou d'agent compétiteurs, il est possible de fixer précisément la quantité de protéine à la surface.
Cette grande modularité peut être synthétisée par la figure 3.
Exemple 4 : Greffage Protéine-ADNsb par complexe Cis-Pt
Les complexes de platine, en particulier les cis-diamminedichloroplatine (cis-[PtCl2(NH3) ] sont des agents qui se fixent covalemment sur l'ADN. De plus ces molécules, par substitution de leur ligand labile chloro, peuvent ponter d'une part une base d'un ADN et d'autre part un résidu nucléophile d'un acide aminé d'une protéine.
4.1) Matériels
Le Cw-[PtCl2(NH3)2] et le trα/M-[PtCl2(NH3)2] sont fournis par Johnson
Matthey (Londres, Royaume Unis). w-[Pt(NH3)2(H2θ)2]^+ et trans-
[Pt(NH3)2(H2θ)2 + sont préparés en dissolvant une suspension de cis- [Pt(Nθ3)2(NH3)2] et de trαra,-[Pt(N03)2(NH3)2] dans l'eau, respectivement formé par la réactino du ezs-[PtCl2(NH3)2] et du tr<m?-[PtCl2(NH3)2] avec du nitrate d'argent. L'ADN-20mer, son brin complémentaire et son brin complémentaire biotynilé proviennent de chez Eurogentec. La séquence de l'ADN-20mer,
5'CTATCATTTGCTTACTATTC 3' (SEQ ID N° 13) est choisi de sorte à ne posséder qu'une seule guanine car l'azote N7 est le principal site de platination des ADN (Lèpre et al., 1990).
4.2) Formation du pontage ADN-b5 via un pontage platine
Les réactions de platination sont réalisées premièrement sur l'ADN ou sur le cytochrome b5 (Rb5( is)4 and Ht>5(His)4mut24) mais le rendement de pontage ADN-Ô5 est supérieur lorsque le cytochrome b5 est platiné le premier. La platination du ADNsb ( 500 μM) par un équivalent de complexe de platine dans
70mM NaClO4 conduit à la formation du cis- or trα ,-[Pt(NH3)2(H2θ)]2+ mono- adduit lié à la guanine.
Le site de platination est déterminé après traitement de l'oligonucléotide modifié avec de la piperidine-DMS dans des conditions de séquençage « Maxam- Gilbert" suivies d'un traitement par le NaCN. L'absence de réactivité de la guanine N7-platinée avec le dimethylsulfate (DMS) permet de conclure à la protection de cette dernière vis à vis du DMS et donc de sa platination effective (Comess et al., 1990). Le Cytochrome hS (100-200 μM) est incubé en présence de 5 équivalents of complexes de platine dans de l'eau non tamponnée (pH5) pendant 5 heures à 25°C. Le cytochrome b5 est ensuite incubé (90 μM) avec 1.5 équivalent d'ADN dans de l'eau non tamponnée (pH5) pendant 50 heures à 25°C. Les complexes ADN-t>5 sont séparés des molécules d'ADN non complexées en utilisant un gel d'agarose fonctionnalisé par des groupements Ni2+ /acide iminodiacetique (Sigma). L'élution de la protéine est effectuée par injection d'immidazole (IM). L'excès d'ADN n'est pas retenue sur la colonne. Les complexes ADN-b5 couplé par pont platine sont également purifiés des formes non réactives d'ADN en utilisant des sphères magnétiques recouvertes de streptavidine de Promega selon une modification de la procédure décrite par Promega: 0.5 nmole d'ADN total (complexé ou non) de la mixture de complexation est chauffée à 45°C pendant 10 min dans l'eau puis est confronté à son brin complémentaire biotinylé dans 0.075M NaCl, 0.0075M citrate pH7.2 à 2.5°C. La mixture (500 μl) est ajoutée à 0.6mg sphères magnétiques complexées à de la streptavidine, lavées préalablement et équilibrées dans le même tampon à 2.5°C. Le complexe de platine ADNsb-b5 ne sont pas retenus sur les sphères et le ADNsb non complexé est élue entre 30-40°C dans 0.015M NaCl and 0.0015M citrate pH7.2. Ces étapes de purification sont suivies d'une part d'une détection de radioactivité du ADNsb marqué au P32 en position 5' (auparavant radiomarqué par action de la polynucléotide kinase grâce au [γ32p]ATP) et d'autre part, d'une étude spectral sur une fenêtre d'absorbance comprenant 413nm pour le b5 (e ≈ 100 OOOM^.cm"1) et 260nm pour le ADNsb (e = 180 500 M"1.cm"1). Ce dernier est corrigé de la composante d'absorbance de Hb5 à cette longueur d'onde (soit 1/5 de son absorbance à 413 nm). Cependant, on précise que ces deux dernières procédures ne permettent pas la séparation du complexe de platine " ADNsb-b5 » du cytochrome b5 non complexé.
Les complexes de platine and trans- [Pt(NH3)2(H2θ)2]2+ sont capables de coupler le cytochrome >5 avec le ADNsb- 20mer. Le site de platination sur l'oligonucléotide ADN se produit au niveau de N7 d'une guanine unique. Les complexes macromoléculaires "ADN-b5" sont caractérisés par des analyses de gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes, de quantification spectrophotmètriques et détermination de température de fusion avec un ADNsb libre complémentaire. L'étude électrophorètique sur 15%) PAGE-SDS de la mixture composée du ADNsb radiomarqué en 5', de Hb5[His]4 et du cis ou trans-[Pt(NH3)2(H2θ)2]2+ a été réalisée.
Après migration des échantillons, la radioactivité du ADNsb* est associée à la bande de migration de Hb5[His]4 (révélée par une coloration au bleu de coomassie) démontrant qu'une liaison covalente a été formée entre le ADNsb- 20mer et le cytochrome b5 (Figure 4). Le complexe « ADN-pt-b5 » a été caractérisé par analyse spectrale dans le but de déterminer la stœchiométrie de la réaction entre le cytochrome b5 et le ADNsb-20mer. Les conditions expérimentales ont permis la formation d'un complexe equimoléculaire comme l'indique l'absorbance respective du cytochrome b5 à 413nm et du ADNsb-20mer à 260 nm (Figure 5). 4.3) Détermination de la température de fusion
Les températures de fusion du ADNsb-20 mer et du ADNsb-20mer couplé au t 5 par un pont czj,-[Pt(NH3)2(H2θ)2]2+ ont été déterminées dans 0.1 M NaClO pH4 avec leur ADNsb complémentaires. Les températures de fusion ont été mesurées sur un spectrophotomètre
Uvikon 941 (Kontron). 0.2 nmole de ADNsb-20mer (ou complexe "ADNsb-b5- Pt ») ont été incubées avec un ADNsb ayant une séquence complémentaire à une concentration finale de 0.5μM dans 0.025M NaClO4 pH4.4. L'échantillon de duplex est chauffée à 80°C (ADN-20mer) ou 65°C (« ADN-Pt-b5 »), la température subit une décroissance de l°C/min jusqu'à 2.5°C et l'absorbance est mesurée à 260nm. Les échantillons sont chauffés de 2.5°C à 60°C à l°C/min et leur absorbance est suivie à 260nm, dans le but de vérifier que les courbes obtenues lors du refroidissement et du chauffage sont superposables (profils réversibles). Les Tm ont été déterminées en utilisant un logiciel Kontron. La température de fusion du duplex contenant le ADNsb-20mer décroît de 22°C (de 45°C à 23°C) lorsqu'il est couplé avec le cytochrome b5 (figure 6).
Aucune différence n'a été observée entre le complexe comportant Hb5(His)4 et le mutant cystéine: la cystéine en position 24 ne semble pas être, pour le complexe cis Pt, plus réactive que les autres sites nucléophiles présents à la périphérie du cytochrome b5.
Quoiqu'il en soit les réactions de platination ne se produisent pas sur l'étiquette 4 histidines en position carboxy terminal, auquel cas le complexe ainsi formé ne serait pas capable d'être purifié sur colonne d'agarose-iminodiacetate ou d'interagir fortement avec la cellule. Des expérience de caractérisation en masse (électrospray, Maldi-TOF) des différents complexes sont en cours de réalisation.
Exemple 5 : Greffage Protéine-ADNsb par bras espaceur 5.1) Fonctionnalisation de ADNsb par DPDPB Une seconde alternative a été explorée concernant le greffage d'un acide nucléique avec le cytochrome b5. Dans l'optique d'une présentation optimale de l'ADN couplé à la surface du biocapteur membranaire, les inventeurs ont choisi d'utiliser non pas un couplage direct mais préférentiellement une complexation par l'intermédiaire d'un bras espaceur. La molécule assurant le pontage intermoléculaire est le l,4-Di-[3'-(2'-pyridyldithio) propionamido] butane ou DPDPB. Cette molécule permet une liaison de type covalente entre deux molécules possédant des fonctions thiols et assure un espace intermoléculaire de 1,6 nm. Pour réaliser un tel assemblage supramoléculaire, une fonction thiol a été créée à la fois sur un oligonucléotide et sur le cytochrome b5. Les oligonucléotides modifiés sont de qualité HPLC et sont produits par Eurogentec. Les différents oligonucléotides modifiés sont les suivants :
Oligonucléotide n°Wl (SEQ ID N° 8) 5' GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C-SH 3'
La modification thiol est réalisée à l'extrémité 3' du 22mer.
Oligonucléotide n°W2 (SEQ ID N° 9) 5' GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C 3' La modification thiol est réalisée en intra chaîne sur une thymine placée en position l l du 22mer.
Les différents oligonucléotides non modifiés impliqués dans l'exemplification sont les suivants :
Oligonucléotide n°W3 (SEQ ID N° 10) 5 '-GGT-AGA-GAT-CTA-TGC-AGC-TAG-G-3 ' W3 est le 22mer complémentaire de Wl .
Oligonucléotide n°W4 (SEQ ID N° 11)
5 '-GCA-GCT-AGC-GGT-AGA-GAT-CT-3 '
W4 possède une séquence complémentaire des 9 premières bases de Wl (coté 5') et des 11 premières bases de Wl (coté 3'). De cette façon W4 possède la particularité de pouvoir ponter deux oligonucléotides Wl .
Oligonucléotide n°W5 (SEQ ID N° 12)
5 '-GCT-AGC-TGC-ATA-GAT-CTC-TAC-C-3 ' W5 correspond à la séquence aléatoire en base de Wl .
La procédure de couplage DPDPB-W1 est la suivante : afin de prévenir toute dimérisation des Wl par liaison disulfide, les oligonucléotides sont traités par un agent réducteur de DiThioThréitol (DTT) à raison d'une fraction molaire 1/5. La mixture est incubée à 30°C pendant 15min. La solution mère de DPDPB est solubilisée dans le Diméthyl sulfoxyde (DMSO) à raison de lOmg/ml. Un ajout de DPDPB à raison de 1 mole de Wl pour 500 à 5000 moles de DPDPB est effectué en présence du DTT résiduel pendant un temps d'incubation de 2 à 4 heures à 30°C. L'échantillon Wl est ensuite fixé spécifiquement sur colonne DEAE échangeuse d'ions, les réactifs sont éliminés et l'oligonucléotide est élue par addition d'une solution de NaCl 1.5M. Le taux de modification peut être calculé par dosage au DTT de l'agent de cross-linking (réticulation). Cette réduction entraîne le départ du second groupe thiopyridine de l'agent de pontage dont la quantification peut être obtenue spectralement à 341nm. La procédure décrire permet d'atteindre 100% de complexe.
5.2) Greffage cytochrome b5-Wl via le bras espaceur
Afin de réaliser un greffage contrôlé et réversible sur le cytochrome b5, les inventeurs ont procédé à une mutagenèse dirigée de Hb5(His)4 comme décrit au paragraphe 2.2 conduisant à la protéine Hb5(His)4 mutant24. La mutation serine-^ cystéine permet d'introduire spécifiquement un groupement thiol en périphérie de la protéine. Afin de prévenir une dimérisation des protéines, la solution est traitée au DTT (X ol b5/DTT=l/5) pendant 30 min à 30°C. L'échantillon est ensuite chargée sur colonne de chromatographie de gel d'exclusion (G25) de façon à éliminer le DTT et est immédiatement injecté à la solution d'oligonucléotides modifiés (Xmol b5/Wl=l/2) pendant 4H à 30°C. L'excès d'oligonucléotide est éliminé par rétention des protéines sur un gel iminodiacétate-Ni2+. L'élution des protéines est obtenue par des puises d'une solution histidine lmg/ml, comme indiqué lors de l'étape de purification des protéines HisTag,. L'analyse spectrale sur une fenêtre [240-500] nm permet de mettre en évidence le couplage effectif de Hb5(His)4 mut24 avec Wl (figure 7). Au regard des coefficients d'absorption molaire des deux macromolécules, les taux de complexation varie de 35 à 65%.
Afin de n'utiliser ultérieurement qu'une population équimoléculaire Hb5/Wl, une étape supplémentaire de purification est réalisée sur DEAE. Une élution effectuée sous un gradient de concentration de NaCl permet d'isoler les différentes espèces reconstituées au cours du couplage (Hb5 monomèrique et dimérique, Hb5-espaceur-Wl). Ainsi à partir de la population initiale, l'intégralité des espèce sont séparées par gradient croissant de NaCl (figure 7) : Spectre a) monomère de Hb5(His)4 mut 24 Spectre b) dimère de Hb5(His)4 mut 24 Spectre c) Complexe équimolaire b5-Wl .
Selon cette procédure, la population b5-Wl est isolée et peut être confrontée à la membrane hybride.
Exemple 6 : Réalisation de l'assemblage supramoléculaire « b5-cis Pt- ADNsb » et « b5-DPDPB-ADNsb »
Le greffage des différents complexes sur la bicouche hybride a été caractérisé par résonance plasmon de surface. Au sein d'un appareil BIAcore. Des expériences à base de radioactivité et de marquage de fluorescence sont en cours de développement au laboratoire. Les expériences de couplage de l'assemblage moléculaire sur le modèle lipidique grâce au complexe chélateur nickel par résonance de plasmon de surface ont permis de montrer la formation d'un complexe stable.
Les niveaux de compacité obtenus avec l'assemblage semblent en revanche inférieurs à ceux obtenus avec la protéine non modifiée par l'oligonucléotide. L'augmentation des charges négatives apportées par Wl peut être à l'origine de répulsions entre blocs supramoléculaires et ainsi conduire à un recouvrement moindre. Les valeurs de recouvrement ont été évaluées entre 200 et 250RU.
On a vérifié à l'instar de Hb5(His)4, que les structures sont en interactions spécifiques avec le support et que l'action d'agents compétiteur de la chélation comme une solution d'histidine lmg/ml permet une régénération complète de la structure, (données non montrées mais présentant le même comportement que celles faisant l'objet de la figure 2).
Exemple 7 : Potentiel du biocapteur et détection d'hybridation Afin d'évaluer le potentiel du biocapteur membranaire en terme de spécificité et de sensibilité, différents tests ont été effectués.
Dans un premier temps, il a été indispensable de vérifier l'absence d'interactions non spécifiques d' oligonucléotides avec le biocapteur. Pour ce faire différentes injections de W4 ont été effectuées. W4 représente une séquence aléatoire à partir des bases constitutives de Wl, l'étude de l'évolution du signal à permis de montrer que W4 n'interagit pas à la surface du biocapteur c'est à dire la structure lipidique et l'assemblage supramoléculaire b5-Wl ; et ceci quel que soit le moyen de pontage (cis-Pt ou DPDPB)
Dans un second temps, différentes injections de W3 ont été effectuées à différentes concentrations salines. Ainsi on a clairement démontré que les injections de W3, la séquence complémentaire de Wl, en présence d'une forte concentration de NaCl étaient accompagnées d'une cinétique d'association ou hybridation. En revanche, pour des concentrations en NaCl inférieur ou égale à 20mM, le même oligonucléotide n'interagit pas ou peu avec le biocapteur.
Ces résultats démontrent la possibilité de détecter des états d'hybridation entre deux ADNsb à la surface du biocapteur. Les résultats d'hybridation montrent une valeur seuil d'environ 30 à 35RU. Or d'après les différents modes de calibrage, la valeur attendue pour une hybridation complète à partir d'un signal de bloc b5-Wl de 250RU, est de 70RU. Cependant les mesures de Tm effectuées sur Wl montrent clairement une température de transition de phase proche de la température ambiante, c'est à dire la température de mesure au sein de l'appareil BIAcore. A cette température seulement 50% de l'hybridation est attendue. La valeur mesurée avec notre dispositif est donc proche d'une hybridation optimale preuve d'une très favorable accessibilité des molécules cibles présentées par les biocapteur.
Les dimensions de la cellule de travail au sein du dispositif BIAcore sont de l'ordre du 1mm2 . Cependant la surface réellement sondée par l'onde évanescente ne représente que 0.224mm . Considérant le calibrage 1000RU<— 0.224ng / 0.224mm2, 250 RU d'assemblage moléculaire correspondent à O.lng soit 5fmole =
3.10 molécules. Le biocapteur membranaire permet une hybridation moléculaire o d'environ 10 molécules.
De plus, Le biocapteur présenté ne requiert que la capture d'un ADNsb complémentaire sans que l'utilisation d'une sonde marquée ne soit nécessaire. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

Revendications
1. Cellule pour la présentation d'un acide nucléique comprenant :
- un support substantiellement plan à l'échelle atomique, - une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque,
- un acide nucléique IN lié à ladite protéine III, l'ensemble acide nucléique - protéine étant mobile latéralement par rapport audit support, de telle sorte que l'hybridation d'un acide nucléique cible audit acide nucléique IN ou le changement de conformation dudit acide nucléique IN est détectable par la réorganisation géométrique de l'ensemble acide nucléique — protéine.
2. Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine III est choisie dans le groupe constitué des protéines ayant un centre rédox et des protéines présentant une propriété d'absorption optique anisotrope.
3. Cellule selon l'une des revendications 1 ou 2, comprenant :
- un support substantiellement plan à l'échelle atomique, sur lequel est fixé - une monocouche hydrophobe I , sur laquelle est présente
- une monocouche II comprenant des phospholipides,
- une molécule de pontage présentant une extrémité hydrophobe de nature à interagir avec la monocouche II, et une extrémité chimiquement fonctionnalisée de façon à former une liaison stable avec une protéine III, une protéine III présentant une structure tridimensionnelle univoque, ladite protéine III étant mobile latéralement dans ladite couche II,
- un acide nucléique IN relié de manière univoque à ladite protéine III, de préférence par un bras moléculaire.
4. Cellule selon l'une des revendication 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison covalente.
5. Cellule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique est relié à ladite protéine par une liaison réversible.
6. Cellule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique IN est relié à ladite protéine III par l'intermédiaire d'un composé choisi parmi :
- un bras espaceur reliant deux résidus identiques ou différents chimiquement réactifs de l'acide nucléique IN et de la protéine III, choisis dans le groupe constitué des thiols, des aminés, des amides et des arginines.
- un complexe métallique tel le cis-platine, le trans-platine, l'europium, un complexe de nickel, de cuivre, ou de ruthénium coordonné d'une part à un résidu ou un groupe de résidus aminés de ladite protéine III et d'autre part à une ou plusieurs bases naturelles ou modifiées de l'acide nucléique IV,
- un complexe protéique covalent ou non covalent impliquant l'acide nucléque IV.
7. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine III a subi une modification introduisant un site unique permettant d'effectuer ladite liaison ledit acide nucléique IV de manière univoque.
8. Cellule selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite modification consiste en une mutation de ladite protéme pour ne laisser subsister ou n'introduire qu'un unique acide aminé prédéterminé.
9. Cellule selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit acide aminé prédéterminée est une cystéine.
10. Cellule selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisée en ce que ladite protéine est reliée à un phospholipide de la couche II.
11. Cellule selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite liaison est une liaison covalente, par exemple par acylation, faraesylation, par une séquence d'ancrage GPI (glycosylphosphatidylinositol) ou par l'accrochage d'un phospholipide à un résidu spécifique de la protéine III par un procédé artificiel quelconque.
12. Cellule selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que ladite liaison est une liaison réversible, par exemple par l'intermédiaire d'un bras capable de lier un chélate métallique d'un côté et un acide aminé ou un groupe d'acides aminés de l'autre.
13. Cellule selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que ladite protéine est liée à un phospholipide modifié de la couche II, ledit phospholipide présentant une zone de fixation d'un chélate.
14. Cellule selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisée en ce que ladite protéine présente une queue hydrophobe lui permettant d'être ancrée dans la couche IL
15. Cellule selon l'une des revendications 3 à 14, caractérisée en ce que les phospholipides de la couche II présentent des queues hydrophobes choisies de telle sorte que ladite couche n'est pas à l'état cristallin, mais à l'état fluide à température d'utilisation.
16. Cellule selon la revendication 15, caractérisée en ce que lesdites queues hydrophobes présentent une longueur de chaîne supérieure ou égale à 14 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant présenter des insaturations, de telle sorte que ladite couche II est à l'état fluide à température d'utilisation.
17. Cellule selon l'une des revendications 3 à 16, caractérisée en ce que lesdits phospholipides de la couche II présentent des têtes polaires, choisies dans le groupe constitué des têtes polaires neutres ne portant pas de charges, neutres globalement portant des charges opposées (zwitterioniques), ou portant une charge globale négative.
18. Cellule selon l'une des revendications 3 à 17, caractérisée en ce que ladite couche I comprend des éléments hydrophobes, présentant une longueur de chaîne d'environ 2 à 2,5 nm, par exemple comprise entre 12 et 20 atomes de carbone, de préférence entre 14 et 18 atomes de carbones.
19. Cellule selon l'une des revendications 3 à 18, caractérisée en ce que ladite couche I comprend des phospholipides liés audit support par l'intermédiaire de leurs têtes polaires.
20. Cellule selon l'une des revendications 3 à 18, caractérisée en ce que ladite couche I comprend des éléments hydrophobes liés audit support par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par exemple une liaison alkyl-thiol ou une liaison alkyl-siloxanne.
21. Cellule selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que la planéité dudit support est telle que la différence de hauteur entre deux zones distantes de moins de 100 nm est inférieure ou égale à 10 nm, de préférence inférieure ou égale à 3 nm, de façon plus préférée inférieure ou égale à 2 nm.
22. Cellule selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que ledit support est constituée d'un matériau choisi dans le groupe constitué du verre recouvert d'une couche d'or, du mica clivé, du silicium ou de tout autre matériau monocristallin.
23. Cellule selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs protéines identiques ou différentes, liées à des acides nucléiques identiques ou différents.
24. Support pour la détection d'acides nucléiques présentant une pluralité de cellules selon l'une des revendications 1 à 23.
25. Support selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comporte un système permettant la mesure de courant, d'impédance ou de potentiel.
26. Support selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comporte entre chaque cellule un dispositif optique intégré capable de mesurer l'absorbance d'une cellule dans deux directions croisées et d'en déduire son état d'organisation (anisotropie) ou de désorganisation (isotropie).
27. Support selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comporte une surface alternant des zones conductrices et réfléchissantes et des zones non conductrices et transparentes.
28. Procédé d'identification de la présence d'un acide nucléique test dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre ledit échantillon en contact avec une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, dans des conditions permettant l'hybridation dudit acide nucléique test à un acide nucléique relié à une protéine de ladite cellule, b) détecter l'hybridation dudit acide nucléique test audit acide nucléique relié à ladite protéine.
29. Procédé d'identification de la liaison d'une protéine à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ladite protéine avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, b) détecter la liaison de ladite protéine audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique.
30. Procédé d'identification de la liaison d'un ligand à une protéine attaché à un acide nucléique fixé à une protéine dans une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit ligand avec ladite protéine, b) détecter la liaison dudit ligand à ladite protéine.
31. Procédé d'identification de la liaison d'un composé à un acide nucléique et/ou de son activité sur la conformation dudit acide nucléique, comprenant les étapes de : a) mettre en contact ledit composé avec un acide nucléique relié à une protéine, dans une cellule selon l'une des revendications 1 à 23, b) détecter la liaison dudit composé audit acide nucléique et/ou son activité sur la conformation dudit acide nucléique.
32. Procédé d'identification selon l'une des revendications 28 à 31, caractérisé en ce que la détection s'effectue par l'intermédiaire d'un système optique (absorbance, fluorescence), électrique, électronique, à résonance de plasmon de surface, de transfert d'énergie, de radiomarquage, de diffraction (optique, électronique, de rayons X, de neutron) ou de microscopie (optique directe ou fluorescence, électronique, champ proche, force atomique).
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