EP1427738A1 - Preparation de composes organiques triphosphoryles eventuellement marques au phosphore 32 ou au phosphore 33 - Google Patents

Preparation de composes organiques triphosphoryles eventuellement marques au phosphore 32 ou au phosphore 33

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EP1427738A1
EP1427738A1 EP02779046A EP02779046A EP1427738A1 EP 1427738 A1 EP1427738 A1 EP 1427738A1 EP 02779046 A EP02779046 A EP 02779046A EP 02779046 A EP02779046 A EP 02779046A EP 1427738 A1 EP1427738 A1 EP 1427738A1
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EP
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pyridine
organic compound
compound
dmso
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EP02779046A
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Lucien Bettendorff
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Universite de Liege
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Universite de Liege
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    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of triphosphorylated organic compounds from mono- or di-phosphorylated compounds, optionally labeled with phosphorus 32 or phosphorus 33, in particular in the terminal situation.
  • NTP Ribonucleoside triphosphates
  • dNTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • dATP dGTP
  • dCTP dCTP
  • dTTP dTTP
  • these compounds are synthesized by enzymatic methods from the corresponding dNMP. These methods involve the use of a phosphate donor (the very expensive phosphoenolpyruvate) and two enzymes (pyruvate kinase and myokinase).
  • [Gamma- 32 P] ATP is also used for the study of protein phosphorylation mechanisms and in molecular biology ("DNA end labeling").
  • [Gamma- 32 P] ATP can be synthesized by enzymatic methods [12, 13] or by chemical methods [7, 8, 9, 15]. The latter are more universal insofar as they can be applied to the synthesis of other nucleoside triphosphates, but they often have disadvantages (for example lower yield, need to work with anhydrous solvents).
  • ThTP thiamine diphosphate
  • ThTP Like adenosine triphosphate (ATP), ThTP has three phosphate groups linked by anhydride bonds and could therefore be a phosphate donor in kinase-type reactions.
  • ATP adenosine triphosphate
  • ThTP is a phosphate donor in phosphorylation reactions of proteins [11].
  • ATP was, according to the prior art, the only known molecule capable of fulfilling this role in eukaryotes.
  • the discovery of this new phosphate donor proves to be of considerable importance in neurochemistry and neuropharmacology and justifies a renewed interest in ThTP.
  • Grandfils has developed a method for the chemical synthesis of [gamma- 32 P] ThTP from ThDP and 32 P [6].
  • this method has several disadvantages:
  • the reagent is 1 ethyl chloroformate (ClC0 2 Et) which also reacts with the amino function of the pyrimidine ring;
  • carbodiimides soluble in water eg 1- (3-dimethylamino propyl) - 3-ethyl - carbodiimide methiodide chloride or 1- (3-dimethylamino propyl) -3-ethyl-carbodiimide chloride) has been unsuccessful [14 ].
  • the present invention provides a chemical method which allows the synthesis of these ribo- and deoxyribonucleoside triphosphates from their precursor monophosphates (NMP, ribonucleoside monophosphate; dNMP, deoxyribonucleoside monophosphate) or diphosphates (NDP, nucleoside diphosphate; dNMPosulfide; dNMPosulfide;
  • a process for the preparation of a triphosphoryl organic compound from a compound mono- or diphosphorylated in the presence of phosphate ions and using a carbodiimide such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or equivalent agent, as an activating agent for condensation is characterized in that the reaction mixture comprises at least 30%, preferably at least 50%, by volume of a polar solvent, in particular DMSO (dimethyl sulfoxide) and / or DMF (dimethylfor amide) and / or TMS (tetramethylene sulfone).
  • a polar solvent in particular DMSO (dimethyl sulfoxide) and / or DMF (dimethylfor amide) and / or TMS (tetramethylene sulfone).
  • pyridine is added to the reaction medium.
  • pyridine is also present because it commonly serves as a solvent for carbodiimide.
  • a tertiary amine e.g. tributylamine
  • tributylamine can also be advantageously added, and seems to contribute to the maintenance of a homogeneous reaction medium, and possibly to the neutralization of the phosphoric acid used as source of phosphate ions.
  • the triphosphoryl organic compound produced by the process of the invention is partially hydrolyzed to produce a diphosphorylated compound.
  • the phosphate ions comprise radioactive phosphate P 32 or P 33 .
  • the method can thus be applied to the specific labeling, for example of NTP, dNTP, ThTP with P 32 or P 33 in the gamma position (for example [gamma- 32 P] NTP, or [gam a- 33 P] NTP).
  • the process can be applied for obtaining polyphosphorylated compounds marked in the alpha position.
  • [Alpha- 32 P] dNTPs are in fact used in molecular biology and in particular for the sequencing of deoxyribonucleic acids. They synthesized in two stages: first the chemical labeling of the deoxyribonucleoside with P 32 or P 33 and then the phosphorylation of [alpha- 32 ( 33. P j dNMp in [ a ⁇ p ha- 32 (33) P dNTP This second step, like the synthesis of unlabeled dNTPs, is carried out by an expensive enzymatic method The process according to the invention makes it possible to replace this step with a much less costly route.
  • the H 3 32 P0 4 (25 mCi in a volume of 100 ⁇ l H 2 0, ICN Cat No. 64014) is quantitatively transferred into a thick glass tube (1 cm in diameter) with a conical bottom and thread allowing it to be sealed using a screw cap.
  • the water is evaporated under nitrogen in the presence of 500 ⁇ l of pyridine.
  • 500 ⁇ l of dimethylsulfoxide (DMSO) 500 ⁇ l of dimethylsulfoxide (DMSO), 445 ⁇ l of pyridine and 400 ⁇ mol of DCC (50 ⁇ l of a solution of 900 mg of DCC in 300 ⁇ l of pyridine).
  • the reaction medium is analyzed by HPLC [2]. After 3 hours, the reaction is complete and the ThDP has been converted to 98% ThTP. The nature of the product was verified by HPLC, and by hydrolysis using a specific thiamine triphosphatase isolated from calf brain [10].
  • the ThTP formed is precipitated by adding 3 ml of diethyl ether to the medium. It is then sedimented by centrifugation (5 min at 1000 g). The supernatant is decanted and the pellet is dissolved in 1 ml of H2O. The DCC and DMSO are then extracted with 3 x 3 ml of diethyl ether with vigorous stirring (hence the need to use a tube which can be hermetically closed).
  • ThTP can then be purified on a column filled with an AG 50W-X8 form H +) resin (Bio-Rad).
  • the purification of ThTP on a DOWEX 50 W-X8 resin (H + form) has been described previously [2; 6], but it has been found that the AG 50W-X8 resin gives more reproducible results.
  • the total yield (synthesis + purification) is 1.7 ⁇ mol of ThTP synthesized for 3.0 ⁇ mol of starting ThDP and the specific radioactivity obtained is 10 Ci / mmol.
  • Figure 1 shows an analysis of the reaction medium by HPLC.
  • A Before adding DCC the only peak is that corresponding to the TDP.
  • B After 3 h of incubation in the presence of DCC, 98% of the TDP was phosphorylated in TTP.
  • C TTP is hydrolyzed to TDP by hydrolysis with a specific thiamine triphosphatase isolated from calf brain.
  • Figure 2 illustrates the effect of the solvent on the synthesis of ThDP.
  • concentration of each solvent is 50% in pyridine except for pyridine (100%) (DMSO, dimethylsulfoxide; DMF, dimethylformamide; TMS, tetramethylene sulfone).
  • FIG. 3 illustrates the increase in the yield of the reaction as a function of the amount of tributylamine used, probably by ensuring better solubilization of the ThDP.
  • Example 2 The procedure is as for Example 1 except that there is no labeled phosphoric acid. DMSO, DCC and pyridine are added directly to the initial mixture. The following quantities were used: H 3 PO_ ⁇ : 1.25 mmol Tributylamine: 4.5 mmol ThDP: 1.1 mmol (500 mg) H 2 0: 775 ⁇ l
  • This synthesis can be adapted for the production in large quantity of (gamma- 32 P) ATP used in protein phosphorylation studies or for the "end labeling" of nucleic acids.
  • Example 2 The procedure is as in Example 1, except that the ThDP is replaced by ADP and no radioactive phosphoric acid is added.
  • Example 2 The procedure is as for Example 1, except that the ThDP is replaced by AMP and the phosphoric acid is not radioactive.
  • AMP is a more advantageous precursor because it is inexpensive.
  • ADP is produced industrially by hydrolysis of ATP, which explains why it is more expensive than ATP.
  • Figure 4 illustrates in (A) the synthesis of ATP (bottom) from ADP (top) and in (B) the synthesis of ATP (right) from AMP (left).
  • the reaction medium is analyzed by HPLC after 3 h (A) and 24 h (B). The figure indicates the retention time (minutes) of each compound in HPLC.
  • dNTP Deoxynucleoside triphosphates
  • Example 2 The procedure is as for Example 1, replacing the ThDP with a corresponding dNMP.
  • Figure 5 illustrates the synthesis of dGTP from dGMP.
  • A Starting medium with dGMP (2.75 min).
  • B Medium after 8 p.m.
  • C Addition of commercial dGTP to the preparation of synthesized dGTP. The figure indicates the retention time (min) of each compound in HPLC.
  • Example 7
  • Table I Influence of the solvent on the synthesis of dGTP from dGMP.
  • the deoxynucleoside triphosphates obtained according to the process of the invention were characterized by mass spectrometry.
  • Buffer B 1M ammonium acetate with 10% acetonitrile Flow rate: 2.5 ml / min
  • fractions concerned were desalted by HPLC chromatography (high performance liquid chromatography) in reverse phase and using water.
  • the deoxynucleoside triphosphates obtained according to the process of the invention have in fact been further characterized by successfully using them as substrates for various polymerase chain reaction (PCR), more particularly by using Taq polymerase (500 bp ⁇ PCR ). They have proven to be as effective as commercial dNTPs.
  • PCR polymerase chain reaction

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Abstract

Préparation de composés organiques triphosphoryles éventuellement marqués au phosphore 32 ou au phosphore 33. L'invention concerne un procédé de préparation d'un composé organique triphosphoryle à partir d'un composés mono- ou diphosphoryle en présence d'ions phosphate et en utilisant de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) comme agent activateur de condensation. Le mélange réactionnel comprend au moins 30% en volume de DMSO et/ou DMF et/ou TMS. Le composé organique peut être une thiamine mono- ou diphosphate, une adenosine mono- ou diphosphate ou un nucleoside ou desoxynucleoside mono- ou diphosphate. Le mélange réactionnel comprend avantageusement de la pyridine. Selon des modes de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, les dérivés triphosphoryles sont marqués au P<32> OU P<33> en position gamma ou alpha.

Description

Préparation de composés organiques triphosphoryles éventuellement marqués au phosphore 32 ou au phosphore 33
La présente invention concerne un procédé de préparation de composés organiques triphosphoryles à partir de composés mono- ou di- phosphorylés, éventuellement marqués au phosphore 32 ou au phosphore 33, en particulier en situation terminale.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les documents suivants représentent l'état de la technique auquel on se référera dans l'exposé de l'invention qui suit, en utilisant les références numériques indiquées.
1. Bettendorff, L. (1994) Thiamine in excitable tissues: reflections on a non-cofactor rôle. Metab. Brain Dis. 9: 183-209.
2. Bettendorff, L., Peeters, M., Jouan, C . , Wins, P., and Schoffeniels, E. (1991) Détermination of thiamin and its phosphate esters in cultured neurons and astrocytes using an ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatographic method. J. Chromatogr. A 198: 52-9.
3. Bettendorff, L. and Wins P. (1999) Thiamine derivatives in excitable tissues: metabolism, deficiency and neurodegenerative diseases. Récent Res. Develop. Neurochem. 2: 37-62. 4. Chambers R.W. and Khorana H. G. (1957) Nucleoside polyphosphates V. Synthesis of guanosine 5'-di-and triphosphate. J. Am. Chem. Soc. 79, 3752-3755. 5. Cooper, J. R. and Pincus, J. H. (1979) The rôle of thiamine in nervous tissue. Neurochem. Res. 79 4: 223-39.
6. Grandfils, C, Bettendorff, L., de Ryc er, C, and Schoffeniels, E. (1988) Synthesis of [gamma- 32P] thiaminetriphosphate. , Anal. Biochem. 88 169: 274-8.
7. Hecht S.M and Kozarich J.W. (1973) A chemical synthesis of adenosine 5 ' -gamma- [32P] triphosphate . Biochim. Biophys. Acta 331, 307-309.
8. Janecka A, Panusz H., Pankowsky J. and Koziolkiewicz W. (1980) Chemical synthesis of nucleoside-gamma-
[32P] triphosphates of high spécifie activity. Preparative Biochemistry 10(1), 27-35.
9. Koziolkiewicz W., Pankowski J. and Janecka A. (1978) A method of the rapid prepraration of adenosine 5'-gamma- [32P] triphosphate by chemical synthesis. Preparative Biochemistry 8(6), 471-478.
10. Makarchikov, A. F. and Chernikevich, I. P. (1992) Purification and characterization of thiamine triphosphatase from bovine brain. Eur. J. Biochem. 1117, 326-32.
11. Nghiem, H. Bettendorff, L., and Changeux, J. P. (2000) Spécifie phosphorylation of torpédo 43K rapsyn by endogenous kinase(s) with thiamine triphosphate as the phosphate donor. FASEB J. 14, 543-54. 12. Penefsky H. S. (1967) Synthesis of gamma-32P-ATP. Meth. Enzymol. 10, 702-703.
13. Post R.L. and Sen A.K. (1967) 32P-labeling of a (Na+ + K+)-ATPase inter ediate . Meth. Enzymol. 10, 702-703.
14. Smith M., and Khorana H. G. (1958) Nucleoside polyphosphates. VI. An improved and gênerai method for the synthesis of ribo- and deoxyribonucleoside 5'- triphosphates. J. Am. Chem. Soc. 80, 1141-1145. 15. Wehrli W.E., Verheyden D.L.M. and Moffatt J.G. (1965) Dismutation reactions of nucleoside polyphosphates. II. Spécifie chemical synthesis of alpha-, bêta-, and gamma-P32- nucleoside 5 ' -triphosphates. J. Am. Chem. Soc 87, 2265- 2279.
Les ribonucléoside triphosphates (NTP) et les désoxyribonucléoside triphosphates (dNTP) , non marqués ou marqués au P32 ou au P33, sont largement utilisés en biologie moléculaire dans des applications telles que la PCR ("polymerase chain reaction") et les séquençages d'ADN, de gènes et de génomes.
C'est le cas en particulier du dATP, dGTP, dCTP et dTTP. A la connaissance du demandeur, ces composés sont synthétisés par des méthodes enzymatiques à partir du dNMP correspondant. Ces méthodes impliquent l'utilisation d'un donneur de phosphate (le phosphoénolpyruvate très cher) et de deux enzymes (la pyruvate kinase et la myokinase) .
Le [gamma-32P] ATP est utilisé parailleurs pour l'étude des mécanismes de phosphorylation des protéines et en biologie moléculaire ("DNA end labeling") .
Le [gamma-32P] ATP peut être synthétisé par des méthodes enzymatiques [12, 13] ou par des méthodes chimiques [7, 8, 9, 15] . Ces dernières sont plus universelles dans la mesure où elles peuvent être appliquées à la synthèse d'autres nucleoside triphosphates, mais elles présentent souvent des désavantages (par exemple rendement plus faible, nécessité de travailler avec des solvants anhydres) . Le triphosphate de thiamine (ThTP) de formule
est le dérivé triphosphorylé de la vitamine Bl. La thiamine, dont la déficience alimentaire entraîne le béribéri, est le précurseur du diphosphate de thiamine (ThDP) , un cofacteur indispensable au métabolisme oxydatif des cellules [3] . Le ThTP existe en faible quantité dans la plupart des tissus, mais semble plus abondant dans les tissus excitables (organes électriques de poissons, muscles squelettiques, neurones) . Sa voie de synthèse in vivo reste mal connue [1] . Différents travaux datant des années 1960 et 1970 ont suggéré un rôle du ThTP dans l'excitabilité nerveuse [5], mais dans la mesure où aucun rôle précis n'a pu être démontré, l'intérêt pour ce composé a rapidement diminué .
A l'instar de l' adenosine triphosphate (ATP), le ThTP comporte trois groupements phosphate liés par des liaisons anhydride et pourrait donc être un donneur de phosphate dans des réactions de type kinasique.
En effet, le demandeur a montré récemment, en collaboration avec l'Institut Pasteur à Paris, que le ThTP est un donneur de phosphate dans des réactions de phosphorylation de protéines [11] . Ces résultats suggèrent que le ThTP peut être un nouveau donneur de phosphate pour les protéines.
L'ATP était, selon l'art antérieur, la seule molécule connue capable de remplir ce rôle chez les eucaryotes. La découverte de ce nouveau donneur de phosphate s'avère d'une importance considérable en neurochimie et en neuropharmacologie et justifie un regain d'intérêt vis à vis du ThTP.
La mise en évidence de ce type de phosphorylation nécessite la préparation d'un donneur de phosphate marqué au P32 (ou au P33, qui a une demi-vie plus longue) . Le [gamma-32P] ATP de formule
est généralement produit par des méthodes enzymatiques
(brevet N° US 1992-891593 détenu par ICN Biomedicals; DD 212391, [12, 13]), mais il n'y avait pas de méthode décrite pour le [gamma-32P]ThTP (Figure 2).
En se basant sur une méthode décrite dans la littérature pour le [gamma-32P] ATP ([8] et Patent N° PL 124747),
Grandfils a mis au point une méthode de synthèse chimique de [gamma-32P]ThTP à partir de ThDP et de 32P [6]. Cette méthode présente cependant plusieurs désavantages:
- le réactif est 1 ' éthylchloroformiate (ClC02Et) qui réagit également avec la fonction aminé du cycle pyrimidine;
- plusieurs étapes sont nécessaires;
- on doit prévoir le séchage des solvants afin d'éliminer, toute trace d'eau du milieu réactionnel;
- le rendement est au maximum de 25 %, et donc les 3/4 du 32P, le éactif le plus coûteux, sont perdus.
Smith et Khorana [14] ont décrit une méthode pour phosphoryler des nucléosides monophosphates en di- et triphosphates. Celle-ci est basée sur l'utilisation de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans de la pyridine comme solvant en tant qu ' activateur des nucléosides monophosphates .
L'inconvénient de cette méthode est que le réactif (le nucleoside phosphate à phosphoryler) est soluble dans l'eau mais très peu dans la pyridine, alors que pour le DCC c'est l'inverse. Les auteurs ajoutent des sels d'aminés tertiaires qui augmentent la solubilité du nucleoside, mais le rendement reste insuffisant. Cette méthode qui démarre à partir d'un nucleoside monophosphate n'est de toute façon pas applicable au marquage sélectif en position gamma (à la fois les atomes de phosphore en position Bêta et gamma seraient marqués). L'utilisation de carbodiimides solubles dans l'eau (p.e. le chlorure de 1- (3-diméthylamino propyl)- 3-éthyl - carbodiimide methiodide ou le chlorure de 1- (3-diméthylamino propyl) -3-éthyl- carbodiimide) est restée sans succès [14] .
La solution apportée par Chambers et Khorana [4] est basée sur l'utilisation d'un système biphasique (eau/pyridine) sous constante agitation, mais le rendement reste également faible.
Il subsiste donc un besoin pour obtenir une méthode chimique simple (si possible en une seule étape) de phosphorylation , produisant de bons rendements, économique et apte à être généralisée à différentes molécules d'intérêt biologique.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention propose une méthode chimique qui permet la synthèse de ces ribo- et désoxyribonucléosides triphosphates à partir de leur précurseur monophosphates (NMP, ribonucléoside monophosphate; dNMP, désoxyribonucléoside monophosphate ) ou diphosphates (NDP, nucleoside diphosphate; dNMP, désoxyribonucléoside diphosphate) .
Cette méthode est valable pour la synthèse d'autres molécules organiques triphosphorylées comme le triphosphate de thiamine susmentionné.
Selon l'invention, on propose un procédé de préparation d'un composé organique triphosphoryle à partir d'un composé mono- ou diphosphorylé en présence d'ions phosphates et en utilisant une carbodiimide telle que la dicyclohexylcarbodiimide (DCC), ou agent équivalent, comme agent activateur de condensation. Le procédé est caractérisé en ce que le mélange réactionnel comprend au moins 30%, de préférence au moins 50%, en volume d'un solvant polaire, en particulier la DMSO (diméthylsulfoxyde) et/ou de DMF (diméthylfor amide) et/ou TMS (tétraméthylène- sulfone) .
Dans la présente description, il est bien entendu que ce qui s'applique aux désoxyribonucléosides peut être transposé aux ribonucléosides et vice versa.
EXPOSE DETAILLE DE L'INVENTION
La méthode susmentionnée utilisant le DMSO et/ou la DMF et/ou la TMS avec la dicyclohexylcarbodiimide est particulièrement avantageuse lorsque le composé organique à phosphoryler n'est pas soluble dans la pyridine.
Selon un mode de réalisation de l'invention on ajoute de la pyridine dans le milieu réactionnel. En général, de la pyridine est présente également parce qu'elle sert couramment de solvant pour la carbodiimide. Une aminé tertiaire (p.e. la tributylamine) peut être également avantageusement ajoutée, et semble contribuer au maintien d'un milieu réactionnel homogène, et éventuellement à la neutralisation de l'acide phosphorique utilisé comme source d'ions phosphate.
Selon un autre aspect de l'invention, le composé organique triphosphoryle produit par le procédé de l'invention est partiellement hydrolyse pour produire un composé diphosphorylé.
Selon un aspect de l'invention particulièrement avantageux, les ions phosphate comprennent du phosphate radioactif P32 ou P33.
La méthode peut ainsi être appliquée au marquage spécifique par exemple de NTP, dNTP, ThTP par du P32 ou du P33 en position gamma (par exemple [gamma-32P] NTP, ou [gam a- 33P]NTP) .
Selon un autre aspect de l'invention, on peut appliquer le procédé pour l'obtention de composés polyphosphorylés marqués en position alpha.
Les [alpha-32P] dNTP sont en effet utilisés en biologie moléculaire et en particulier pour le séquençage des acides désoxyribonucléiques . Ils ont synthétisés en deux étapes : d'abord le marquage chimique du deoxyribonucleoside par du P32 ou du P33 et ensuite la phosphorylation du[alpha- 32 ( 33.pjdNMp en [aιpha-32(33)P]dNTP. Cette deuxième étape, comme la synthèse des dNTP non marqués, est réalisée par une méthode enzymatique onéreuse. Le procédé selon l'invention permet de remplacer cette étape par une voie beaucoup moins coûteuse.
Des résultats similaires sont obtenus pour la synthèse d'ATP à partir d'AMP. Il semble également que le DMSOempêche la formation de produits secondaires, observation également mentionnée par Wehrli et al. [15], mais leur système plus compliqué que celui utilisé dans la présente invention, nécessite des solvants déshydratés. Chambers et Khorana [4] décrivent la synthèse de GTP à partir de GMPdans du DMF fraîchement distillé, mais ils forment surtout des tétraphosphates et leur rendement en GTP reste faible (< 30 %) .
Les exemples suivants illustrent l'invention de manière non-limitative en se référant aux figures en annexe.
Exemple 1
Synthèse de [gamma-32P]ThTP - Procédure générale
On prépare un mélange de H3P04, tributylamine et ThDP dans les proportions suivantes:
0,8 m ol H3P04 (53 μl d'une solution stock à 85 % ou 14,83 M)
- 2,9 mmol de tributylamine = 99 % (0,7 ml) - 0,7 mmol ThDP (322 mg)
- 500 μl H20.
Après quelques minutes d'agitation, le mélange forme une solution homogène, légèrement visqueuse.
Le H3 32P04 (25 mCi dans un volume de 100 μl H20, ICN N°Cat 64014) est transféré quantitativement dans un tube en verre épais (1 cm de diamètre) à fond conique et filetage permettant de le fermer hermétiquement à l'aide d'un bouchon à visser. L'eau est évaporé sous azote en présence de 500 μl de pyridine. Lorsque tout le liquide est évaporé (30 min), on ajoute 5 μl du mélange susmentionné, 500 μl de diméthylsulfoxide (DMSO) , 445 μl de pyridine et 400 μmol de DCC (50 μl d'une solution de 900 mg de DCC dans 300 μl de pyridine) .
Le milieu réactionnel est analysé par HPLC [2]. Après 3 heures, la réaction est complète et le ThDP a été transformé en ThTP à 98 %. La nature du produit a été vérifiée par HPLC, et par hydrolyse à l'aide d'une thiamine triphosphatase spécifique isolée à partir de cerveau de veau [10] .
Le ThTP formé est précipité par ajout de 3 ml de diéthyléther au milieu. Il est ensuite sédimenté par centrifugation (5 min à 1000 g) . Le surnageant est décanté et le culot est dissous dans 1 ml de H20. Le DCC et le DMSO sont ensuite extraits avec 3 x 3 ml de diéthyléther sous forte agitation (d'où nécessité d'utiliser un tube pouvant être hermétiquement fermé) .
Le ThTP peut ensuite être purifié sur une colonne remplie d'une résine AG 50W-X8 forme H+) (Bio-Rad) . La purification du ThTP sur une résine DOWEX 50 W-X8 (forme H+) a été décrite précédemment [2; 6], mais on a constaté que la résine AG 50W-X8 donne des résultats plus reproductibles.
Le rendement total (synthèse + purification) est de 1,7 μmol de ThTP synthétisé pour 3,0 μmol de ThDP de départ et la radioactivité spécifique obtenue est de 10 Ci/mmol.
La Figure 1 reprend une analyse du milieu réactionnel par HPLC. (A) Avant ajout de DCC le seul pic est celui correspondant au TDP. (B) Après 3 h d'incubation en présence de DCC, 98 % du TDP a été phosphorylé en TTP. (C)Le TTP est hydrolyse en TDP par hydrolyse avec une thiamine triphosphatase spécifique isolée à partir de cerveau de veau.
D'autres solvants ont été testés (pyridine 100%, méthanol, diméthylformamide, tétraméthylène sulfone) . Le DMSO s'est avéré de loin le meilleur et le seul à solubiliser le ThDP à la concentration utilisée. La concentration optimale est de 50 %.
La Figure 2 illustre l'effet du solvant sur la synthèse du ThDP. On montre la superposition de chromatogrammes obtenus pour la synthèse de ThTP en présence de différents solvants. La concentration de chaque solvant est de 50% dans de la pyridine sauf pour la pyridine (100 %) (DMSO, diméthylsulfoxide; DMF, diméthylformamide; TMS, tétraméthylène sulfone) .
La Figure 3 illustre l'augmentation du rendement de la réaction en fonction de la quantité de tributylamine utilisée, probablement en assurant une meilleure solubilisation du ThDP.
Dans cette méthode, un léger excès de H3P04 par rapport au ThDP a été utilisé. L'inversion des proportions permet de faire réagir tout le H3P04 marqué (plus coûteux que le ThDP) et d'augmenter la radioactivité spécifique. La radioactivité spécifique peut être augmentée davantage en augmentant la quantité de 32P utilisée. Cette méthode peut donc facilement être adaptée à une utilisation industrielle pour la synthèse de [gamma-32P] ThTP et de nucleoside triphosphates marquées en position gamma.
Exemple 2
Synthèse de ThTP à partir de ThDP
On procède comme pour l'exemple 1 sauf qu'il n'y a pas d'acide phosphorique marqué. On ajoute directement au mélange initial le DMSO, le DCC et la pyridine. Les quantités suivantes ont été utilisées : H3PO_ι : 1, 25 mmol Tributylamine : 4,5 mmol ThDP : 1,1 mmol (500 mg) H20: 775 μl
Après homogénéisation de ce mélange initial, on ajoute 200 ml de DMSO, 176 ml de pyridine, et 20 ml de DCC (18g + 7 ml pyridine) . Après 3 heures, on a obtenu 1,1 mmol de ThTP (rendement 100%). Après précipitation à l'éther (600 ml) et purification sur une résine AG 50W-X8, on a isolé 0,63 mmol (rendement total de 57%).
Cet exemple à plus grande échelle suggère que le procédé de l'invention peut être appliqué à une échelle industrielle en augmentant simplement le volume de tous les réactifs et solvants .
Exemple 3
Synthèse de [gamma-32P]ATP à partir d'ADP On procède comme pour l'exemple 1, sauf que le ThDP est remplacé par l'ADP.
Cette synthèse peut être adaptée pour la production en grande quantité de (gamma-32P) ATP utilisé dans les études de phosphorylation de protéines ou pour le "end labeling" d'acides nucléiques.
Exemple 4
Synthèse d'ATP à partir d'ADP
On procède comme pour l'exemple 1, sauf que le ThDP est remplacé par l'ADP et on n'ajoute pas d'acide phosphorique radioactif.
Exemple 5
Synthèse d'ATP à partir d'AMP
On procède comme pour l'exemple 1, sauf que le ThDP est remplacé par l'AMP et l'acide phosphorique n'est pas radioactif.
Pour la synthèse d'ATP non marqué, l'AMP est un précurseur plus avantageux car peu onéreux. En effet, l'ADP est produit de manière industrielle par hydrolyse de l'ATP, ce qui explique qu'il est plus cher que l'ATP.
Remarquons que la synthèse à partir de l'AMP ne produit que peu d'ADP et l'ATP est le principal composé formé. La réaction prend cependant plus de temps qu'à partir d'ADP (24 heures au lieu de 3 heures) . Cet inconvénient peut cependant facilement être résolu en augmentant la concentration en acide phosphorique dans le milieu. En effet, les concentrations quasi stoechiométriques utilisées dans les exemples 1 à 4 ne s'avèrent nécessaires que si on veut produire un produit marqué radioactivement afin d'éviter une dilution isotopique et donc une perte importante en radioactivité spécifique du composé synthétisé. Lorsqu'il s'agit d'une synthèse non radioactive, ce critère n'a plus d'importance.
La Figure 4 illustre en (A) la synthèse d'ATP (bas) à partir d'ADP (haut) et en (B) la synthèse d'ATP (droite) à partir d'AMP (gauche) . Le milieu réactionnel est analysé par HPLC après 3 h (A) et 24 h (B) . La figure indique le temps de rétention (minutes) de chaque composé en HPLC.
Exemple 6
Synthèse de désoxynucléoside triphosphates (dNTP)
On procède comme pour l'exemple 1 en remplaçant le ThDP par un dNMP correspondant.
La Figure 5 illustre la synthèse de dGTP à partir de dGMP . (A) Milieu de départ avec le dGMP (2,75 min). (B) Milieu après 20 h (dGTP après 3,64 min). (C) Ajout de dGTP commercial à la préparation de dGTP synthétisé. La figure indique le temps de rétention (min) de chaque composé en HPLC. Exemple 7
Synthèse de désoxynucléoside triphosphates marqués en position alpha : synthèse du dGTP à partir de dGMP
On procède dans des conditions similaires à celles de l'exemple 1, sans acide phosphorique marqué, mais en partant de désoxynucléoside monophosphates déjà marqués.
Exemple 8
On a analysé l'effet du système de solvant sur le rendement pour la production de dGTP.
La synthèse du dGTP dépend en effet du solvant utilisé: le meilleur rendement est obtenu pour le DMSO et le DMF, mais en pyridine 100%, le rendement reste quand même de 66% après 24 heures (Tableau I) .
Tableau I: Influence du solvant sur la synthèse du dGTP à partir de dGMP.
Rendement
Temps DMSO DMF TMS Pyridine
(heures ) ( 50 % ) (50 %) (50 %) (100 %)
3 17 50 40 46
24 92 89 87 66 Le DMSO, le DMF et le TMS sont dissous dans de la pyridine(50% : 50%). TMS = tétraméthylène sulfone
La réaction de synthèse du dGTP (ou de l'ATP) à partir du nucleoside monophosphate correspondant dépend fortement de la température. A 4°C, la réaction est quasiment nulle et semble atteindre un maximum vers 50 °C. Au delà de 20°C la formation de produits secondaires semble cependant favorisée, de sorte que la température optimale est située autour de 20 - 25°C.
Les désoxynucléoside triphosphates obtenus selon le procédé de l'invention ont été caractérisés par spectrométrie de masse.
Divers désoxynucléoside triphosphates obtenus selon le procédé de l'invention ont été davantage purifiés par chromatographie sur échangeurs d'ions (anioniques) DIONEX PNA Pac PA-100 avec le système de solvants suivant : Tampon A : eau avec 100 % acétonitrile
Tampon B : 1M acétate d'ammonium avec 10% d' acétonitrile Débit : 2,5 ml/min
Les fractions concernées ont été désalées par chromatographie HPLC (chromatographie liquide haute performance) en phase inverse et en utilisant de l'eau
(tampon A) et de 1 ' acétonitrile (tampon B) . Les composés obtenus ont été ensuite caractérisés par spectrométrie de masse. On a élue les fractions à environ 10 minutes, temps de rétention attendu sur la base d'un TTP de la firme Aldrich. Les fractions éluées ont été caractérisées par spectrométrie de masse et en les utilisant pour une opération de PCR. Enfin les désoxynucléoside triphosphates obtenus selon le procédé de l'invention ont en effet été encore davantage caractérisés en les utilisant avec succès comme substrats pour diverses réactions de la polymérase en chaîne (PCR) , plus particulièrement en utilisant la Taq polymérase (500 bp λ PCR) . Ils se sont montrés aussi performants que les dNTP commerciaux.

Claims

Revendications :
1. Procédé de préparation d'un composé organique triphosphoryle à partir d'un composés mono- ou diphosphorylé en présence d'ions phosphate et en utilisant de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC), ou un agent équivalent, comme agent activateur de condensation caractérisé en ce que le mélange réactionnel comprend au moins 30% en volume de DMSO et/ou DMF et/ou TMS.
2. Procédé selon la revendication précédente dans lequel le mélange réactionnel comprend au moins 50% de DMSO et/ou DMF et/ou TMS.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le composé organique n'est pas soluble dans la pyridine.
4. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel le composé organique est une thiamine mono- ou diphosphate, une adenosine mono- ou diphosphate ou un nucleoside ou désoxynucléoside mono- ou diphosphate.
5. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel le mélange réactionnel comprend de la pyridine.
6. Procédé selon la revendication précédente dans lequel le solvant comprend de la pyridine présente à une concentration comprise entre 30 et 70% en volume, de préférence environ 50%.
7. Procédé de préparation d'un composé organique diphosphorylé caractérisé en ce qu'un composé organique triphosphoryle produit par le procédé de la revendication 1 est partiellement hydrolyse.
8. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel les ions phosphate comprennent des ions phosphate radioactifs P32 ou P33 .
9. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes utilisé pour produire des dérivés triphosphoryles marqués au P32 ou P33 en position gamma.
10. Procédé selon n'importe laquelle des revendications 1 à 6 utilisé pour produire des dérivés triphosphoryles marqués au P32 ou P33 en position alpha.
11. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel de l'acide phosphorique est associé à de la tributylamine.
12. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel le solvant comprend de la tributylamine base.
13. Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel la température du mélange réactionnel est comprise entre 15 et 30°C, de préférence entre 20 et 25°C.
14. Procédé selon la revendication précédente dans lequel le composé organique triphosphoryle est un nucleoside triphosphate .
15. Procédé de préparation d'un composé organique triphosphoryle à partir du composé mono- ou diphosphorylé correspondant en présence d'ions phosphate et en utilisant de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) comme agent activateur de condensation caractérisé en ce que
- on prépare une solution du composé mono ou diphosphorylé dans de l'eau en présence d'acide phosphorique et d'une aminé, de préférence en quantité au moins équivalente,
- on élimine l'eau,
- on ajoute un mélange de DMSO et/ou DMF et/ou TMS avec de la DCC.
16. Procédé selon la revendication précédente dans lequel le mélange comprend aussi de la pyridine.
17. Procédé selon la revendication précédente dans lequel le mélange comprend de 5 à 70% de pyridine.
18. Utilisation de nucleoside ou désoxynucléoside triphosphates obtenus selon le procédé de l'invention pour la réplication d'un acide ribonucléique ou désoxyribonucléique .
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