EP1415000A1 - Procede et systeme de detection de desequilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (fish) sur des noyaux cellulaires en interphase - Google Patents

Procede et systeme de detection de desequilibre inter-chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (fish) sur des noyaux cellulaires en interphase

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Publication number
EP1415000A1
EP1415000A1 EP02782464A EP02782464A EP1415000A1 EP 1415000 A1 EP1415000 A1 EP 1415000A1 EP 02782464 A EP02782464 A EP 02782464A EP 02782464 A EP02782464 A EP 02782464A EP 1415000 A1 EP1415000 A1 EP 1415000A1
Authority
EP
European Patent Office
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detection
nuclei
cell population
probes
probe
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02782464A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Françoise Soussaline
Bernard Malfoy
Bernard Dutrillaux
Marie-Noelle Guilly
Khuong Truong
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut Curie
IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut Curie, IMSTAR Image et Modelisation Strategie Analyse et Realisation SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1415000A1 publication Critical patent/EP1415000A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting inter chromosomal imbalance by in situ hybridization of fluorescent probes (FISH) on interphase cell nuclei. It also relates to a system implementing this process.
  • FISH fluorescent probes
  • Trisomy 21 Down syndrome
  • Trisomy 21 is the most recurrent anomaly: approximately 1.7 children in 1000 are affected (Stoll et al, 1998).
  • FISH in situ hybridization on fluorescent probes
  • probes covering the centromeric region or regions of the long arm of chromosome 21 were used for these studies: probes covering the centromeric region or regions of the long arm of chromosome 21 (cosmids, YAC) (Soloviev et al, 1995, Van Opstad et al, 1995; Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996). Partial labeling of chromosome 21 with these probes makes it possible to evaluate the number of copies. It is therefore necessary to carry out a signal count, manual or automatic, to detect the cells having three signals corresponding to chromosome 21.
  • the interobserver variability comes from the different criteria for defining a 'spot' (i.e. the fluorescent signal), for example its size, its intensity, its texture, but also from the fact that the spots are often found in different focal planes, along the vertical axis Z in the nucleus.
  • the results can therefore differ significantly depending on these criteria, which themselves depend on the preparation of the sample in each laboratory.
  • a significant bias is constituted by the establishment of the "cut-off", that is to say the value of the "positivity threshold" from which the sample is considered abnormal (Ruangvutilert et al, 2000) . This value is difficult to establish, since the percentage of nuclei having three signals in the control cases can vary between 10 and 20% of the nuclei analyzed.
  • the object of the present invention is to provide an automated detection method which, by its very design, thus eliminates the difficulties associated with reading by a human operator, and provides a solution to the problems concerning the variability of sample preparation, which so far have affected analysis.
  • the term in situ hybridization is intended to denote a technique making it possible to identify a DNA (or RNA) sequence by means of a probe of specific sequence homologous to that studied. It is based on the complementarity of nucleotides (A / T, A / U, G / C), it can be carried out under precise physico-chemical conditions on chromosomal, cellular or tissue preparations.
  • the result of the in situ hybridization process is the formation of a hybrid between a probe and a target.
  • In situ hybridization includes a denaturation step, the actual step, of in situ hybridization of the probe on the target, and a step of detecting the hybrid or the probe.
  • the probes are labeled with a fluorophore and the hybridization is revealed by fluorescent labeling.
  • This technique allows the simultaneous visualization, on the same preparation, of several probes each revealed by a different fluorophore.
  • the measurement of two or more signals corresponding respectively to each probe is advantageously carried out by image cytometry.
  • Two probes can for example be revealed respectively by a green fluorochrome and by a red fluorochrome.
  • the present approach consists in using chromosome paints or chromosome regions for chromosome 21, on the one hand, and, for example, for chromosome 20 or chromosome 22, on the other hand; chromosomes 20 or 22 being taken as a reference because the hybridization signal obtained with a paint of chromosome 21 is comparable to that obtained with a paint of chromosome 20 or chromosome 22 which are of similar size.
  • the reference chromosome is preferably chosen from chromosomes 14 and 15.
  • the reference chromosome is preferably chosen among chromosomes 17, 19 and 20.
  • the reference chromosome is for example chosen from chromosomes 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12.
  • the reference chromosome is preferably chosen from chromosomes 19, 20, 21, 22.
  • the probes used in the in situ hybridization are chromosomal paint probes.
  • the term “chromosomal paint probe” or “chromosome paint” is intended to denote a probe or a composition of probes which is suitable for hybridizing, under hybridization conditions, with a target which comprises a predetermined chromosome of a multi- genome. chromosome. If only a fraction of such a chromosome is present in the sample undergoing such hybridization with such a composition of probes, then this fraction hybridizes and is identified.
  • a painted probe can be mixed with a second, a third, etc. to allow the simultaneous marking and detection of two, three, etc. predetermined chromosomes.
  • chromosomes or from fragments of chromosomes isolated by chromosomal sorting, by flow cytometry or by microdissection of chromosomes.
  • the probes used in the present invention are probes covering the centrometric region ( ⁇ satellite DNA), all or part of a chromosomal arm (telomeric sequences for example TTAGG Chan) or specific for specific DNA sequences repeated d '' one or more chromosomes (classic satellite DNA 1, 2 and 3).
  • the chromosomal paint probes are marked with a non-isotopic entity such as luminescent agents, dyes, and others.
  • a non-isotopic entity such as luminescent agents, dyes, and others.
  • This labeling can be done indirectly by labeling the probes with enzymes, biotin, avidin, steptavidin, digoxygenin, haptens and others which will be revealed by luminescent agents or dyes.
  • the luminescent agents according to the excitation energy source, can be classified into radio luminescent, chemiluminescent, bioluminescent and photo-luminescent (including fluorescent and phosphorescent).
  • the term "fluorescent" generally refers to the property of a substance (such as a fluorophore) to produce light when excited by an energy source such as ultra-light. purple for example. More preferably, the probes are labeled with a fluorophore.
  • the inventors propose to detect an interchromosomal imbalance in any animal or human interphase cells, preferably in fetal cells, originating from amniotic fluid or maternal blood.
  • the detection of constitutional or acquired chromosomal imbalances (cancers) can also be done for example in circulating blood cells, in skin cells, in oral cells and more generally in all cell types readily available for carrying out a diagnostic test.
  • the inventors propose to detect an interchromosomal imbalance, instead of detecting the number of copies of the chromosome analyzed:
  • each probe is revealed by a different fluorochrome (in green and in red);
  • the intensities of each probe are measured on a minimum of a few hundred (for example, 500) nuclei, after their recognition by the system, within a population control cell and a population to be tested;
  • the calculation of the ratio between the two intensity signals of each of the probes makes it possible, by comparing it to the normal reference case, to determine the presence of at least one supernumerary chromosome (chromosome 21 for example).
  • the interchromosomal imbalance is then greater than 1, and 1.5 in the case of a trisomy.
  • the calculation of the ratio between the two intensity signals of each of the probes also makes it possible, by comparing it to the normal reference case, to determine the presence of chromosomal monosomy.
  • the interchromosomal imbalance would then be 0.5.
  • the detection method according to the invention makes it possible to avoid all the drawbacks linked to cell culture, and makes it possible to obtain the result more quickly (in a few days) and on a number of which is both statistically significant and non-binding for cell-poor samples (between 500 and a few thousand cells).
  • the FISH technique of in situ hybridization of fluorescent probes has already been implemented in a different method disclosed in the patent application published under the number FR2783253 to detect an intrachromosomal imbalance in cellular nuclei in interphase more precisely. to detect loss, or gain of genetic material (deletion, insertion, amplification, duplication ...) of all or part of a chromosomal arm.
  • this detection method two probes marked with two different and respectively specific fluorochromes of the long arm and the short arm of a chromosome is hybridized on this same chromosome.
  • the measurement phase comprises a first step of acquisition, in a defined measurement plane, of a given number of fields so as to obtain, for a magnification of given image, at least a predetermined number (several hundred or thousands) of analyzable nuclei.
  • the acquisition step further comprises a capture, using successive optical filters with narrow passband, of several images corresponding, for each field of observation, respectively to a plurality of planes corresponding to the wavelengths d '' a plurality of fluorochromes (for example: 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) with blue fluorescence, Fluorescein isothiocyanate (FITC) with green fluorescence and Texas Red TM with red fluorescence) these acquired images and a superposition of said acquired and stored images.
  • fluorochromes for example: 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) with blue fluorescence, Fluorescein isothiocyanate (FITC) with green fluorescence and Texas Red TM with red fluorescence
  • a system for detecting imbalances in chromosomal domains by in situ hybridization of fluorescent probes on interphase cell nuclei, implementing the method according to the invention, comprising: means for carrying out an in situ hybridization of fluorescent probes on two separate chromosomes,
  • the fluorescence microscopy means and the image acquisition means cooperate to acquire, in a defined measurement plane, a given number of fields, so as to obtain, for a given image magnification, at least a predetermined number of analyzable nuclei.
  • this further comprises filtering means cooperating with the fluorescence microscopy means and the acquisition means for acquiring several corresponding images, for each field, respectively to a plurality of planes corresponding to the wavelengths of a plurality of fluorochromes (for example:
  • the fluorescence microscopy means and the acquisition means can advantageously cooperate to acquire, in the same study plan, images corresponding to a control cell population and images corresponding to a cell population subjected to detection.
  • FIG. 1 illustrates the main phases of the imbalance detection method chromosomal according to the invention
  • FIG. 2 schematically represents the structure of a detection system according to the invention
  • FIG. 3 is a flow chart representative of the detection and quantification operations carried out on the images acquired by the detection system according to the invention.
  • the samples to be tested are prepared as for a conventional cytogenetic analysis on a slide, whether these samples are cultured or analyzed directly.
  • a well centrifuge allowing punctual spreading on the slide (for example a cytospin TM) is recommended for a flat spreading of the cells. This reduces the number of cells “outside focus "during auto playback. Limited spreading also decreases image acquisition time.
  • the cultured amniotic samples are treated according to conventional prenatal diagnostic protocols.
  • a pepsin treatment is followed by a treatment with a dissociating medium of the cell clusters.
  • control slides can be prepared from normal amniotic liquids or normal fibroblasts according to the same protocol.
  • analysis may also include blood samples. In the case of a sample from maternal peripheral blood, the detection of fetal cells is made beforehand.
  • In situ hybridization can be carried out according to the usual protocols for chromosomal paints (Truong et al, 1998).
  • the slides are first incubated for 15 minutes in a 2SSC saline solution, followed by rinsing with PBS buffer, treatment with pepsin in 0.01 N (4 ⁇ g / ml, SIGMA) HCl for 10 minutes.
  • the digestion is stopped by a PBS bath for 5 minutes, the slides are fixed for 10 minutes in Carnoy (Ethanol / Acetic Acid, 3: 1 (V / V)) and the slides are dried in air.
  • the probe is then denatured for 10 minutes at 70 ° C in 70% Formamide (FLUKA) / 2SSC at pH 7.
  • the target DNA that is to say the nuclei on slides, are denatured under the same conditions for 3 minutes .
  • the slides are then rinsed with 2SSC and dehydrated in a series of alcohol baths. Hybridization of the probe is carried out overnight at 37 ° C. The post-hybridization washes are carried out at 72 ° C for 5 minutes in 2SSC buffer.
  • the detection of the probes is done by the use of antibodies coupled to different fluorochromes (green and red).
  • the slides can be stained immediately in DAPI (1 ⁇ g / ml, Molecular Probes) and mounting in p-phenyl-diamine.
  • the image cytometry device 1 implemented in the inter chromosomal imbalance detection system according to the invention, comprises, with reference to FIG. 2, an acquisition part 10 including a fluorescence microscope 2, 3, a black and white CCD 5 camera allowing integration times ranging from 40 ms to 10 s, a device (motorized filter holder wheel or motorized filter holder turret) for automatically changing the excitation and emission light spectra by the fluorescent probes 4 arranged between the lamp and the microscope 3 and, optionally, between the microscope 3 the CCD camera 5, and a sample plate holder motorized in X and Y 13, automatically controlled by the device 1 for sampling systematic, and a control and processing part 14 consisting of a computer comprising, in particular, an image acquisition card.
  • an acquisition part 10 including a fluorescence microscope 2, 3, a black and white CCD 5 camera allowing integration times ranging from 40 ms to 10 s
  • a device motorized filter holder wheel or motorized filter holder turret
  • the fluorescence measurement is broken down into two stages: 1) Acquisition and storage of images, after definition of an analysis region on the slide studied. 2) Analysis of the images and exploitation of the data resulting therefrom.
  • the first step consists in acquiring, within the limits of a defined surface, a number of given fields, with the objective allowing, for example, a magnification of 40x, so as to obtain 500 to 1000 analyzable nuclei.
  • the images are acquired using a CCD camera using selective interference optical filters.
  • For each field three image planes corresponding to the wavelengths of the different fluorochromes (blue, green, red) are stored and superimposed ( Figure 2). Benchmarks are established to prevent the observed fields from being out of focus.
  • the slides subjected to detection 11 and the control slide 12 are analyzed under the same conditions (in particular, same integration time and same camera gain).
  • the procedure is as follows, with reference to FIG. 3: 1) Segmentation of each image and detection of the nuclei to be analyzed, including a separation of nuclei in clusters, as well as the exclusion of the artefacts by criteria of size and morphology), allowing to establish a mask of the nuclei against staining, for example in DAPI, in which the fluorescence intensities are measured.
  • “Scatterplot” two-dimensional representation of the intensity values of the two colors. 7) Automatic determination of the mean and standard deviation of the values of the fluorescence ratio for a population of nuclei chosen by cluster analysis, that is to say by a point cloud analysis method and determination of the centers of gravity of these point clouds.
  • the fluorescence ratio is calculated for each sample in the same way and under the same conditions. A trisomy 21 is thus detected when the fluorescence ratio for the sample of the normalized patient compared to the control sample is 1.5.
  • the image cytometry device further comprises means for detecting nuclei and quantifying fluorescent signals of multiple wavelengths; - the detection and quantification means are arranged to segment nuclei from an analysis on multiple criteria of shape, size, fluorescence density, usually called morphometric and densitometric criteria, giving rise to the creation of a mask for the 'all the fields of a measurement plan.
  • a chromosome 21 - specifies cosmid cocktail for the detection of chromosome 21 aberrations in interphase nuclei. Prenat Diagn 1995, 15: 705-711. Verma L, Macdonald F, Leedham P, MacConachie M, Dhanjai S, Hulten M. Rapid and simple prenatal DNA diagnostics of Down's syndrome. Lancet 1998; 352: 9-12. Wei HJ, Su TH, Chien CL, Tzeng CR. Fluorescence in situ hybridization (FISH) as a method to detect aneuploid cells. Fetal Diagn Ther 1997; 12: 309-312.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization

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Abstract

Procede de detection de desequilibre chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, comprenant les phases suivantes : -une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, -une revelation de chaque sonde par un fluorochrome different, -une mesure de signaux d'intensite correspondant respectivement a chaque sonde ainsi revelee, sur un ensemble de noyaux, cette mesure etant effectuee d'une part au sein d'une population cellulaire temoin et d'autre part au sein d'une population cellulaire soumise a detection, -un calcul du rapport entre les signaux correspondant respectivement a chacune des sondes, ce calcul de rapport etant effectue d'une part sur ladite population cellulaire temoin pour foumir un rapport de reference, et d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise a detection, -une comparaison du rapport de fluorescence correspondant a la population cellulaire soumise a detection avec le rapport de reference, et -un traitement du resultat de cette comparaison pour detecter un desequilibre inter chromosomique.

Description

Procédé et système de détection de déséquilibre interchromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) sur des noyaux cellulaires en interphase
La présente invention concerne un procédé de détection de déséquilibre inter chromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) sur des noyaux cellulaires en interphase. Elle vise également un système mettant en œuvre ce procédé.
Les déséquilibres chromosomiques constitutionnels les plus récurrents que l'on retrouve chez les nouveau-nés concernent les chromosomes 21, 18, 13 et les chromosomes sexuels. La trisomie 21 (syndrome de Down) est l'anomalie la plus récurrente : environ 1,7 enfant sur 1000 est atteint (Stoll et al, 1998).
Le nombre de cas de trisomie 21 augmente avec l'âge de la mère, en particulier après 35 ans, et un examen prénatal est conseillé en cas de maternité tardive. Il existe une tendance actuelle à la maternité tardive : le pourcentage de femmes ayant un enfant à plus de 35 ans est passé de 8 % à 19 % en quatre ans (Stoll et al, 1994). On peut estimer que ce pourcentage va encore augmenter, mais dès à présent, le nombre de naissances en France étant de 750.000 par an, le besoin de tests de la trisomie 21 est, potentiellement, de l'ordre de 150.000 par an. Depuis les années 70, le diagnostic prénatal après amniocentèse est généralement réalisé en utilisant la cytogénétique classique, qui permet d'établir les caryotypes sur chromosomes métaphasiques, et ainsi de détecter un nombre anormal de chromosomes. Le délai d'attente entre le moment du prélèvement et le résultat du diagnostic relativement long (2 semaines) constitue l'inconvénient principal de cette technique. En outre, l'obtention de métaphases exploitables n'est pas assurée dans 100 % des cas (1% d'échecs) et de faux négatifs peuvent apparaître à cause de la présence de cellules maternelles (Verma étal, 1998).
Plus récemment, l'hybridation in situ sur des sondes fluorescentes (FISH) a permis de travailler directement sur noyaux interphasiques sans avoir recours à la culture cellulaire. Cette technique consiste à marquer des chromosomes (voir par exemple US 5 756 696) ou des régions chromosomiques à l'aide de sondes fluorescentes et à compter les signaux, c'est-à-dire les chromosomes émettant des signaux fluorescents (Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996 ; Wei et al, 1997 ; Eiben et al, 1999). On peut ainsi obtenir des résultats dans un temps assez court (quelques jours), et l'analyse peut être réalisée sur un petit nombre de cellules prélevées (quelques centaines) alors que la mise en culture cellulaire nécessite un nombre de cellules plus élevé (à partir de quelques dizaines de milliers). Différents types de sondes ont été utilisés pour ces études : des sondes couvrant la région centromérique ou des régions du bras long du chromosome 21 (cosmides, YAC) (Soloviev et al, 1995, Van Opstad et al, 1995 ; Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996). Le marquage partiel du chromosome 21 avec ces sondes permet d'évaluer le nombre de copies. Il faut donc procéder à un comptage des signaux, manuel ou automatique, pour détecter les cellules ayant trois signaux correspondant au chromosome 21.
Plusieurs études montrent la faisabilité technique de l'hybridation in situ sur les cellules fétales. Cependant, il y a peu d'études qui donnent des résultats de comparaison directe entre la technique FISH et le diagnostic par cytogénétique classique (Pierluigi et al, 1996 ; Steinborn et al, 1996 ; Wei et al, 1997 ; Eiben, et al, 1999 ; Thein et al, 2000). Les auteurs de ces études évoquent des concordances de 97-100% entre les deux approches, mais soulignent également les difficultés d'interprétation des résultats en FISH interphasique. Ces difficultés sont essentiellement liées à la nécessité d'un opérateur humain qui reconnaît et compte les signaux fluorescents. Or, la variabilité certaine entre différents opérateurs et surtout la signification statistique du nombre de noyaux avec un nombre anormal de signaux posent des problèmes en matière de diagnostic. La variabilité inter observateur vient des différents critères de définition d'un 'spot' (c'est-à-dire du signal fluorescent), par exemple sa taille, son intensité, sa texture, mais également du fait que les spots se trouvent souvent dans différents plans focaux, selon l'axe vertical Z dans le noyau. Les résultats peuvent donc différer de manière significative en fonction de ces critères, qui eux-mêmes dépendent de la préparation de l'échantillon dans chaque laboratoire. Un biais important est constitué par l'établissement du « cut-off », c'est- à-dire de la valeur du « seuil de positivité » à partir de laquelle l'échantillon est considéré comme anormal (Ruangvutilert et al, 2000). Cette valeur est difficile à établir, car le pourcentage de noyaux ayant trois signaux dans les cas témoins peut varier entre 10 et 20% des noyaux analysés. Ce chiffre varie en fonction des études car le nombre de cellules analysées peut varier lui-même de 50 à 200, ce qui explique cette variabilité statistique. De plus, il peut être important pour l'interprétation médicale de ce test de connaître de façon fiable la valeur de la proportion de noyaux portant une anomalie de nombre de chromosomes (mosaïque).
Le but de la présente invention est de proposer un procédé de détection automatisé qui, par sa conception même, élimine ainsi les difficultés liées à la lecture par un opérateur humain, et procure une solution aux problèmes concernant la variabilité de la préparation des échantillons, qui jusqu'à présent, en affectaient l'analyse.
Cet objectif est atteint avec un procédé de détection, utilisant un système informatisé, de déséquilibre interchromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) sur des noyaux cellulaires en interphase, comprenant les phases suivantes :
- une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts, - une révélation de chaque sonde par un fluorochrome différent,
- une mesure de signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, cette mesure étant effectuée, d'une part, au sein d'une population cellulaire témoin et, d'autre part, au sein d'une population cellulaire soumise à détection, - un calcul du rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, ce calcul de rapport étant effectué, d'une part, sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence et, d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection,
- une comparaison du rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et
- un traitement du résultat de cette comparaison pour détecter un déséquilibre interchromosomique.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par hybridation in situ une technique permettant de repérer une séquence d'ADN (ou d'ARN) au moyen d'une sonde de séquence spécifique homologue à celle étudiée. Elle est fondée sur la complémentarité des nucléotides (A/T, A/U, G/C), elle peut être réalisée en conditions physicochimiques précises sur des préparations chromosomiques, cellulaires ou tissulaires. Le résultat du processus d'hybridation in situ est la formation d'un hybride entre une sonde et une cible. L'hybridation in situ inclut une étape de dénaturation, l'étape à proprement parlé, d'hybridation in situ de la sonde sur la cible, et une étape de détection de l'hybride ou de la sonde. Dans le cadre de l'hybridation fluorescente in situ, les sondes sont marquées avec un fluorophore et l'hybridation est révélée par un marquage fluorescent. Le développement récent de cette technique permet la visualisation simultanée, sur la même préparation, de plusieurs sondes révélées chacune par un fluorophore différent.
La mesure de deux ou plusieurs signaux correspondant respectivement à chaque sonde est avantageusement effectuée par cytométrie d'image. Deux sondes peuvent par exemple être révélées respectivement par un fluorochrome vert et par un fluorochrome rouge.
On a ainsi développé une approche par cytométrie d'image qui associe les avantages de l'analyse par FISH sur noyaux interphasiques à ceux d'une lecture des signaux rapide, précise, quantitative et objective, car indépendante de l'opérateur. Cette approche consiste à utiliser des peintures chromosomiques ou de régions chromosomiques pour le chromosome présentant un déséquilibre d'une part et pour un autre chromosome (autosome ou chromosome sexuel) d'autre part, ce dernier étant choisi de sorte à ce que le signal d'hybridation obtenu avec la peinture chromosomique soit comparable à celui obtenu avec la peinture du chromosome présentant un déséquilibre. Dans la pratique le chromosome de référence et le chromosome présentant un déséquilibre sont dans la mesure du possible de taille voisine. Ainsi, par exemple, la présente approche consiste à utiliser des peintures chromosomiques ou de régions chromosomiques pour le chromosome 21, d'une part, et, par exemple, pour le chromosome 20 ou le chromosome 22, d'autre part ; les chromosomes 20 ou 22 étant pris comme référence car le signal d'hybridation obtenu avec une peinture du chromosome 21 est comparable à celui obtenu avec une peinture du chromosome 20 ou du chromosome 22 qui sont de taille voisine. Pour la aneuploïdie du chromosome 13 (par exemple : trisomie 13), le chromosome de référence est de préférence choisi parmi les chromosomes 14 et 15. Pour une aneuploïdie du chromosome 18 (par exemple trisomie 18), le chromosome de référence est de préférence choisi parmi les chromosomes 17, 19 et 20. Pour l'aneuploïdie du chromosome X, le chromosome de référence est par exemple choisi parmi les chromosomes 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Pour l'aneuploïdie du chromosome Y, le chromosome de référence est de préférence choisi parmi les chromosomes 19, 20, 21, 22.
Selon un mode préféré de réalisation, les sondes mises en œuvre dans l'hybridation in situ sont des sondes de peinture chromosomique. On entend désigner par « sonde de peinture chromosomique » ou « peinture chromosomique » une sonde ou à une composition de sondes qui est adaptée pour hybrider, sous les conditions d'hybridation, avec une cible qui comprend un chromosome prédéterminé d'un génome multi-chromosomique. Si seulement une fraction d'un tel chromosome est présente dans l'échantillon subissant une telle hybridation avec une telle composition de sondes, alors cette fraction s'hybride et est identifiée. En pratique, une sonde peinte peut être mélangée avec une seconde, une troisième, etc.. pour permettre le marquage et la détection simultanés de deux, de trois, etc.. chromosomes prédéterminés. Différentes sondes de peinture sont actuellement commercialisées (GIBCO-BRL ; ONCOR ; BOEHRTNGER-MANHEIM ; etc..) Elles sont préparées par amplification par IRS-PCR (voir par exemple WO 00 22164), par DOT-PCR utilisant des amorces PCR dégénérées de chromosomes, ou à partir de fragments de chromosomes isolés par tri chromosomique, par cytométrie de flux ou par microdissection de chromosomes. Alternativement, les sondes mises en œuvre dans la présente invention sont des sondes couvrant la région centrométrique (ADN satellite α), tout ou partie d'un bras chromosomique (séquences télomériques par exemple TTAGG„) ou spécifique de séquences d'ADN répétées spécifiques d'un ou plusieurs chromosomes (ADN satellite classique 1, 2 et 3).
Selon un mode préféré de réalisation, les sondes de peinture chromosomique sont marquées par une entité non isotopique tels les agents luminescents, les colorants, et autres. Ce marquage peut se faire de manière indirecte en marquant les sondes avec des enzymes, la biotine, l'avidine, la steptavidine, la digoxygénine, les haptènes et autres qui seront révélés par des agents luminescents ou des colorants. Les agents luminescents, selon la source d'énergie d'excitation, peuvent être classés en radio luminescents, chémiluminescents, bioluminescents et photo-luminescents (incluant fluorescents et phosphorescents). Le terme « fluorescent » se réfère en général à la propriété d'une substance (telle un fluorophore) de produire de la lumière lorsqu'elle est excitée par une source énergétique telle que la lumière ultra- violette par exemple. De façon plus préféré, les sondes sont marquées par un fluorophore.
Dans la présente invention, les inventeurs proposent de détecter un déséquilibre interchromosomique dans n'importe quelles cellules en interphase animales ou humaines, de préférence dans les cellules fétales, provenant de liquide amniotique ou du sang maternel. La détection des déséquilibres chromosomiques constitutionnels ou acquis (cancers) peut également se faire par exemple dans les cellules du sang circulant, dans les cellules de la peau, dans les cellules buccales et plus généralement dans tout types cellulaires aisément disponibles pour réaliser un test diagnostic.
Dans la présente invention, les inventeurs proposent de détecter un déséquilibre interchromosomique, à la place d'une détection du nombre de copies du chromosome analysé :
- après hybridation in situ des sondes pour le chromosome 21 et 22 (par exemple), chaque sonde est révélée par un fluorochrome différent (en vert et en rouge) ;
- à l'aide d'un système informatisé de cytométrie d'image, les intensités de chaque sonde sont mesurées sur un minimum de quelques centaines (par exemple, 500) noyaux, après leur reconnaissance par le système, au sein d'une population cellulaire témoin et d'une population à tester ;
- le calcul du rapport entre les deux signaux d'intensité de chacune des sondes permet, en le comparant au cas normal de référence, de déterminer la présence d'au moins un chromosome surnuméraire (le chromosome 21 par exemple). Le déséquilibre interchromosomique est alors supérieur à 1, et de 1,5 dans le cas d'une trisomie. Le calcul du rapport entre les deux signaux d'intensité de chacune des sondes permet également en le comparant au cas normal de référence, de déterminer la présence de monosomie chromosomique. Le déséquilibre interchromosomique serait alors de 0,5.
Les avantages du procédé de détection selon l'invention en comparaison avec les procédés de détection actuels sont les suivants :
- du fait de l'utilisation de la technique FISH, le procédé de détection selon l'invention permet d'éviter tous les inconvénients liés à la culture cellulaire, et permet d'obtenir le résultat plus rapidement (en quelques jours) et sur un nombre de cellules qui est à la fois statistiquement significatif et non contraignant pour des échantillons pauvres en cellules (entre 500 et quelques milliers de cellules).
- Toutes les difficultés liées à la lecture et à l'interprétation par un opérateur humain disparaissent avec ce procédé, car l'analyse est effectuée automatiquement par un système informatisé. En particulier, la reconnaissance des noyaux interphasiques, dans lesquels la mesure des intensités de fluorescence totale liée à l'hybridation de chaque sonde rend l'analyse beaucoup plus simple et plus robuste que celle utilisant la reconnaissance et le dénombrement des signaux fluorescents, actuellement proposée (comptage de taches ou « spot counting » in Tkachuk et al , 1991).
Par ailleurs, même si l'utilisation de sondes de petites tailles donnent des signaux de meilleure résolution pour le comptage, les dits signaux sont alors plus facilement confondus avec le bruit de fond, le rapport signal sur bruit est donc inférieur, d'autant plus que les liquides amniotiques contiennent des voiles protéiques, important source de bruit de fond. L'approche des inventeurs, utilisant des peintures chromosomiques assure un rapport signal sur bruit plus important que les méthodes mettant en œuvre le dénombrement de signaux de petite taille (dénombrement de sondes centromériques, en particulier), grâce à la taille du signal obtenu. L'évaluation et la soustraction du bruit de fond permettent la détection des cellules trisomiques dans des conditions difficiles, du fait des caractéristiques des prélèvements amniotiques.
De plus, les problèmes concernant la variabilité de la préparation des échantillons n'affectent plus l'analyse. Un changement éventuel des conditions expérimentales ne changerait pas le rapport de fluorescence, car les deux signaux seront affectés de la même manière. Il est possible de détecter la présence de deux populations au sein d'une population cellulaire avec une meilleure fiabilité grâce à la meilleure précision statistique, du fait du plus grand nombre de noyaux qu'il est possible d'analyser rapidement. Ceci permet de distinguer des cas avec une contamination de cellules maternelles ou des cas mosaïques (cas où seule une fraction des cellules fétales montrent l'anomalie).
- Enfin, on détecte avec une meilleure fiabilité les cas particuliers comprenant des iso chromosomes 21 ou encore des translocations t (21; 21) (Stoll et al, 1998), quelle que soit la nature du chromosome remanié. L'utilisation de peinture chromosomique montre une tache qui devrait doubler de taille et d'intensité ; la mesure par une caméra adaptée demeure plus précise compte tenu de la taille du signal. Cette approche est susceptible d'être applicable sur les autres pathologies concernant les chromosomes 13, 18, les chromosomes sexuels, mais également d'autres pathologies où sont présents des déséquilibres de nombre de chromosomes (monosomie, trisomie, quadrisomie,..., polysomie). Il est à noter que la technique FISH d'hybridation in situ de sondes fluorescentes a déjà été mise en œuvre dans un procédé différent divulgué dans la demande de brevet publiée sous le numéro FR2783253 pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase plus précisément pour détecter une perte, ou un gain de matériel génétique (délétion, insertion, amplification, duplication...) de tout ou partie d'un bras chromosomique. Dans ce procédé de détection, deux sondes marquées par deux fluorochromes différents et respectivement spécifiques du bras long et du bras court d'un chromosome est hybride sur ce même chromosome.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé selon l'invention, la phase de mesure comprend une première étape d'acquisition, dans un plan de mesure défini, d'un nombre donné de champs de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé (plusieurs centaines ou milliers) de noyaux analysables.
L'étape d'acquisition comprend en outre une capture, à l'aide de filtrages successifs optiques à bande passante étroite, de plusieurs images correspondant, pour chaque champ d'observation, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple : 4,6- Diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec une fluorescence bleue, Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) avec une fluorescence verte et le Texas Red™ avec une fluorescence rouge), un stockage de ces images acquises et une superposition desdites images acquises et stockées.
Suivant un autre aspect de l'invention, il est proposé un système pour détecter des déséquilibres de domaines chromosomiques par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, mettant en œuvre le procédé selon l'invention, comprenant : - des moyens pour réaliser une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts,
- des moyens pour révéler chaque sonde par un fluorochrome différent,
- un dispositif pour mesurer des signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et d'autre part au sein d'une population cellulaire soumise à détection,
- des moyens pour calculer le rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, d'une part sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et d'autre part sur ladite population cellulaire soumise à détection,
- des moyens pour comparer le rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et
- des moyens pour traiter le résultat de cette comparaison en vue de détecter un déséquilibre interchromosomique.
Le dispositif de cytométrie d'image comprend avantageusement :
- des moyens de microscopie à multiple fluorescence appliqués à des populations cellulaires préalablement soumises à une hybridation in situ de différentes sondes fluorescentes, - des moyens pour acquérir des ensembles d'images produites par les moyens de microscopie à fluorescence,
- des moyens pour stocker lesdites images acquises, et
- des moyens pour analyser lesdites images acquises et stockées. les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition d'image coopèrent pour acquérir, dans un plan de mesure défini, un nombre donné de champs, de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé de noyaux analysables.
Dans une configuration préférée d'un système de détection selon l'invention, celui-ci comprend en outre des moyens de filtrage coopérant avec les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition pour acquérir plusieurs images correspondant, pour chaque champ, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple :
DAPI, FITC (vert), Texas Red (rouge). Par ailleurs, les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition peuvent avantageusement coopérer pour acquérir dans un même plan d'étude des images correspondant à une population cellulaire témoin et des images correspondant à une population cellulaire soumise à détection.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de mise en œuvre nullement limitatif, et des dessins annexés sur lesquels : la figure 1 illustre les phases principales du procédé de détection de déséquilibre chromosomique selon l'invention ; la figure 2 représente de façon schématique la structure d'un système de détection selon l'invention ; et la figure 3 est un organigramme représentatif des opérations de détection et de quantification réalisées sur les images acquises par le système de détection selon l'invention.
On va en premier lieu décrire, dans le cadre d'un exemple de mise en œuvre du procédé de détection selon l'invention, les phases initiales de préparation et d'hybridation qui précèdent la phase de détection et de quantification, notamment en référence à la figure 1.
Préparation des échantillons
Les échantillons à tester, actuellement issus de liquide amniotique, sont préparés comme pour une analyse cytogénétique classique sur lame, qu'il s'agisse de prélèvements mis en culture ou analysés directement. Cependant, pour améliorer l'analyse automatique des lames, l'utilisation d'une centrifugeuse à puits permettant l'étalement ponctuel sur lame (par exemple une cytospin™) est recommandée pour un étalement plan des cellules. Ceci permet de réduire le nombre de cellules "hors focus" lors de la lecture automatique. L'étalement limité diminue également le temps d'acquisition des images.
Les échantillons amniotiques cultivés sont traités selon les protocoles de diagnostics prénataux classiques. Pour l'analyse des liquides en direct, un traitement à la pepsine est suivi d'un traitement avec milieu dissociant les amas de cellules.
L'étalement est également fait à l'aide d'une centrifugeuse à puits. Les lames témoins peuvent être préparées à partir de liquides amniotiques noπnaux ou des fibroblastes normaux selon le même protocole. En outre, l'analyse peut également porter sur des échantillons sanguins. Dans le cas d'un prélèvement issu de sang périphérique maternel, la détection des cellules fétales est faite au préalable.
Préparation des sondes
L'hybridation in situ peut être effectuée selon les protocoles habituels pour les peintures chromosomiques (Truong et al, 1998). Les lames sont d'abord incubées 15 minutes dans une solution saline 2SSC suivis d'un rinçage au tampon PBS, d'un traitement à la pepsine dans 0,01 N (4 μg/ml, SIGMA) HCl pendant 10 minutes. On arrête la digestion par un bain de PBS pendant 5 minutes, on fixe les lames pendant 10 minutes dans le Carnoy (Ethanol/Acide Acétique, 3 :1 (V/V)) et on sèche les lames à l'air.
La sonde est ensuite dénaturée pendant 10 minutes à 70°C dans 70% Formamide (FLUKA)/2SSC à pH 7. L'ADN cible, c'est-à-dire les noyaux sur lames sont dénaturé dans les mêmes conditions pendant 3 minutes. Les lames sont ensuite rincées au 2SSC et déshydratées dans une série de bains d'alcool. L'hybridation de la sonde est effectuée la nuit à 37°C. Les lavages post-hybridation sont effectués à 72°C pendant 5 minutes dans du tampon 2SSC.
Dans le cas d'utilisation de sondes marquées à la digoxigénine ou à la biotine, la détection des sondes se fait par une utilisation d'anticorps couplés à des fluorochromes différents (vert et rouge).
Dans le cas d'utilisation de sondes directement marquée avec des fluorochromes, on peut procéder tout de suite à la coloration des lames dans du DAPI (1 μg/ml, Molecular Probes) et au montage dans du p-phenyl-diamine. Méthode de détection et quantification des signaux fluorescents des sondes
Le dispositif de cytométrie d'image 1, mis en œuvre dans le système de détection de déséquilibre inter chromosomique selon l'invention, comprend, en référence à la figure 2, une partie d'acquisition 10 incluant un microscope à fluorescence 2, 3, une caméra CCD 5 refroidie noir et blanc permettant des temps d'intégration allant de 40 ms à 10 s, un dispositif (roue porte filtre motorisée ou tourelle porte filtre motorisée) permettant de changer automatiquement les spectres de lumière d'excitation et d'émission par les sondes fluorescentes 4 disposées entre la lampe et le microscope 3 et, éventuellement, entre le microscope 3 la caméra CCD 5, et une platine porte-lame échantillons motorisée en X et Y 13, automatiquement contrôlée par le dispositif 1 pour l'échantillonnage systématique, et une partie de contrôle et de traitement 14 constituée d'un ordinateur comprenant, en particulier, une carte d'acquisition d'images.
La mesure de fluorescence est décomposée en deux étapes : 1) Acquisition et stockage des images, après définition d'une région d'analyse sur la lame étudiée. 2) Analyse des images et exploitation des données qui en sont issues.
La première étape consiste à acquérir, dans les limites d'une surface définie, un nombre de champs donnés, à l'objectif permettant, par exemple, un grossissement de 40x, de manière à obtenir 500 à 1000 noyaux analysables. Les images sont acquises à l'aide d'une caméra CCD grâce aux filtres optiques interférentiels sélectif. Pour chaque champ, trois plans images correspondant aux longueurs d'onde des différents fluorochromes ( bleu, vert, rouge) sont stockés et superposés (figure 2). Des points de repères sont établis pour éviter que les champs observés soient hors focus. Ainsi, on analyse les lames soumises à détection 11 et la lame témoin 12 dans les mêmes conditions (en particulier, même temps d'intégration et même gain de caméra).
Lors de la deuxième étape qui inclut la détection des noyaux et la quantification des signaux, on procède comme suit, en référence à la figure 3: 1) Segmentation de chaque image et détection des noyaux à analyser, incluant une séparation de noyaux en amas, ainsi que l'exclusion des artefacts par des critères de taille et de morphologie), permettant d'établir un masque des noyaux sur le plan de contre coloration, par exemple en DAPI, dans lequel les intensités de fluorescence sont mesurées.
2) Quantification de l'intensité intégrée à l'intérieur de chaque noyau pour chaque fluorochrome (rouge et vert), correspondant à la fluorescence émise par chacune des sondes utilisées, sans aucune hypothèse sur la forme et la localisation des signaux. 3) Quantification du niveau de fond pour chaque couleur et chaque champ en dehors des noyaux; détermination du niveau de bruit le plus fréquent comme référence.
4) Soustraction du niveau de fond (valeur de référence) dans les noyaux pour chacune des sondes. 5) Calcul du rapport d'intensité vert/rouge, corrigé du niveau de fond, pour chaque noyau.
6) Représentation des données, par exemple sous forme d'histogramme ou de
« scatterplot » (représentation bidimensionnelle des valeurs d'intensités des deux couleurs). 7) Détermination automatique de la moyenne et de l'écart type des valeurs du rapport de fluorescence pour une population de noyaux choisie par analyse de clusters, c'est-à-dire par une méthode d'analyse de nuages de points et détermination des centres de gravité de ces nuages de points.
Le rapport de fluorescence est calculé pour chaque échantillon de la même manière et dans les mêmes conditions. Une trisomie 21 est ainsi détectée lorsque le rapport de fluorescence pour l'échantillon du malade normalisé par rapport à l'échantillon témoin est de 1,5.
Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. Le procédé de détection selon l'invention peut ainsi être étendu à d'autres chromosomes : X, Y, 13 et 18 ou encore d'autres anomalies moins récurrentes. Le système de détection est caractérisé en ce que : le dispositif de cytométrie d'image comprend en outre des moyens pour détecter des noyaux et quantifier des signaux en fluorescence de multiples longueurs d'onde ; - les moyens de détection et de quantification sont agencés pour segmenter des noyaux à partir d'une analyse sur critères multiples de forme, dimension, densité de fluorescence, usuellement appelés critères morphométriques et densitométriques, donnant lieu à la création d'un masque pour l'ensemble des champs d'un plan de mesure.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de déséquilibre interchromosomique par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, comprenant les phases suivantes :
- une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts,
- une révélation de chaque sonde par un fluorochrome différent,
- une mesure de signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, cette mesure étant effectuée d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et d'autre part au sein d'une population cellulaire soumise à détection,
- un calcul du rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, ce calcul de rapport étant effectué d'une part, sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection,
- une comparaison du rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et
- un traitement du résultat de cette comparaison pour détecter un déséquilibre inter chromosomique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mesure des deux signaux correspondant respectivement à chaque sonde est effectuée par cytométrie d'image automatisée.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les deux sondes sont révélées respectivement par deux fluorochromes différents (par exemple un fluorochrome vert et un fluorochrome rouge).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les signaux d'intensité de chaque sonde sont mesurés sur un nombre pouvant être défini par l'opérateur, par exemple de quelques centaines de noyaux.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase de mesure comprend une première étape d'acquisition, dans un plan de mesure défini, d'un nombre donné de champs de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé de noyaux analysables.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape d'acquisition comprend en outre une acquisition, par des filtrages optiques successifs, de plusieurs images correspondant, pour chaque champ, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple le bleu pour la contre coloration, le vert, et le rouge pour le marquage des sondes), un stockage desdites images acquises et une superposition desdites images acquises et stockées.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que l'étape d'acquisition est effectuée dans des conditions d'acquisition sensiblement identiques pour une population cellulaire témoin et une population cellulaire soumise à détection.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les acquisitions correspondant aux populations cellulaires respectivement témoin et soumises à détection sont effectuées sur deux champs inclus dans un même plan de mesure.
9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la phase de mesure comprend en outre une seconde étape pour détecter des noyaux et quantifier des signaux d'intensité de fluorescence.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comprend une segmentation des noyaux dans chaque champ inclus dans un plan de mesure.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la segmentation des noyaux inclut une séparation de noyaux en amas.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que la segmentation des noyaux inclut une élimination des artefacts par des critères de morphologie et de taille.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comporte une quantification de l'intensité du signal de fluorescence intégrée à l'intérieur de chaque noyau pour chaque couleur correspondant à chaque sonde.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comporte en outre un calcul du niveau de fond pour chaque couleur en dehors des noyaux dans chacun des champs.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de détection et de quantification comporte en outre une détermination du niveau de fond le plus fréquent comme valeur de référence de bruit et une correction par ladite valeur de référence de l'intensité de signal fluorescent quantifiée à l'intérieur de chaque noyau.
16. Système pour détecter des déséquilibres chromosomiques par hybridation in situ de sondes fluorescentes sur des noyaux cellulaires en interphase, mettant en œuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant :
- des moyens pour réaliser une hybridation in situ de sondes fluorescentes sur deux chromosomes distincts,
- des moyens pour révéler chaque sonde par un fluorochrome différent,
- un dispositif pour mesurer des signaux d'intensité correspondant respectivement à chaque sonde ainsi révélée, sur un ensemble de noyaux, d'une part au sein d'une population cellulaire témoin et, d'autre part, au sein d'une population cellulaire soumise à détection,
- des moyens pour calculer le rapport entre lesdits signaux correspondant respectivement auxdites sondes, d'une part sur ladite population cellulaire témoin pour fournir un rapport de référence, et, d'autre part, sur ladite population cellulaire soumise à détection,
- des moyens pour comparer le rapport entre signaux correspondant à la population cellulaire soumise à détection avec le rapport de référence, et
- des moyens pour traiter le résultat de cette comparaison en vue de détecter un déséquilibre inter chromosomique, même en cas de mosaïque.
17. Système de détection selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il inclut, au titre des moyens de mesure, un dispositif de cytométrie d'image.
18. Système de détection selon la revendication 17, caractérisé en ce que le dispositif de cytométrie d'image comprend :
- des moyens de microscopie à fluorescence appliqués à des populations cellulaires préalablement soumises à une hybridation in situ de sondes fluorescentes,
- des moyens pour acquérir des images produites par les moyens de microscopie à fluorescence,
- des moyens pour stocker lesdites images acquises, et
- des moyens pour analyser lesdites images acquises et stockées.
19. Système de détection selon la revendication 18, caractérisé en ce que les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition d'image coopèrent pour acquérir, dans un plan de mesure défini, un nombre de champs, de façon à obtenir, pour un grossissement d'image donné, au moins un nombre prédéterminé de noyaux analysables.
20. Système de détection selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de filtrage coopérant avec les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition pour acquérir plusieurs images correspondant, pour chaque champ, respectivement à une pluralité de plans correspondant aux longueurs d'onde d'une pluralité de fluorochromes (par exemple, le DAPI (bleu) pour la contre coloration, le FITC (vert), le Texas Red™ (rouge) pour les sondes).
21. Système de détection selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que les moyens de microscopie à fluorescence et les moyens d'acquisition coopèrent pour acquérir dans un même plan d'étude des images correspondant à une population cellulaire témoin et des images correspondant à une population cellulaire soumise à détection.
22. Système de détection selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que le dispositif de cytométrie d'image comprend en outre des moyens pour détecter des noyaux et quantifier des signaux en fluorescence de multiples longueurs d'onde.
23. Système de détection selon la revendication 22, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour segmenter des noyaux à partir d'une analyse morphométrique et densitométrique, dormant lieu à la création d'un masque pour l'ensemble des champs d'un plan de mesure.
24. Système de détection selon les revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour séparer les noyaux en amas.
25. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour exclure des artefacts par des critères de taille et de morphologie.
26. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour quantifier l'intensité des signaux de fluorescence intégrée à l'intérieur de chaque noyau pour chaque couleur.
27. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour calculer le niveau de fond pour chaque couleur en dehors des noyaux.
28. Système de détection selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que les moyens de détection et de quantification sont agencés pour déterminer le niveau de fond le plus fréquent comme valeur de référence de fond et pour soustraire ladite valeur de référence sur l'intensité quantifiée à l'intérieur de chaque noyau.
29. Application du procédé de détection inter chromosomique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, à des noyaux de cellules fétales circulant dans le sang maternel.
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