EP1409019A2 - Gd3-synthase-inhibitoren zur behandlung neuropathologischer störungen - Google Patents

Gd3-synthase-inhibitoren zur behandlung neuropathologischer störungen

Info

Publication number
EP1409019A2
EP1409019A2 EP00991582A EP00991582A EP1409019A2 EP 1409019 A2 EP1409019 A2 EP 1409019A2 EP 00991582 A EP00991582 A EP 00991582A EP 00991582 A EP00991582 A EP 00991582A EP 1409019 A2 EP1409019 A2 EP 1409019A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
synthase
treatment
inhibitors
disorders
neurons
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00991582A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ana Martin-Villalba
Johannes Schenkel
Susanne Kleber
Roberto Testi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott GmbH and Co KG
Original Assignee
Abbott GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott GmbH and Co KG filed Critical Abbott GmbH and Co KG
Publication of EP1409019A2 publication Critical patent/EP1409019A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • GD3 synthase inhibitors for the treatment of neuropathological disorders.
  • the present invention relates to the use of GD3-syn thast-jlnhibitoren for the treatment of neuropathological disorders, especially cerebral ischemia, traumatic brain and spinal cord injuries and neurodegenerative disorders and related signs, symptoms, and malfunctions, and to methods for preparing pharmaceutical compositions for the treatment neuropathological disorders, which can be interpreted in particular as primary screening.
  • Sialic acids (in short: Sia) play an important role in intercellular transmission processes, cytoplasmic interactions and cellular adhesion. They are found at the end of the hydrocarbon groups of glycoproteins and glycolipids. Sialic acids are introduced into these positions enzymatically as part of post-translational processes. Sia- ⁇ -2,3-Gal and Sia- ⁇ -2,8-Sia are common sequence types observed in gangliosides.
  • Enzymes that transmit sialic acids are glycosyltransferases and are called sialyltransferases. In view of the large number of sialyl oligosaccharide structures known to date, it is assumed that at least 12 different sialyl transferases are involved in their synthesis.
  • EP 0 654 529 describes an ⁇ -2,8-sialyltransferase, the physiological activity of which is useful in the generation of ganglioside GD3.
  • Oligonucleotide primers subjected the total mRNA from mouse brain to a PCR, whereby a further ⁇ -2,8-sialyltransferase, there called ST8Sialll, was identified. It is also a GD3 synthase, more precisely a Sia- ⁇ -2, 3-Gal- ⁇ -1, 4-GlcNAc- ⁇ -2,8-sialyltransferase from mouse brain.
  • the use of the enzyme for sperm maturation, prevention of cancer metastases, inhibition of inflammatory processes and reactivation of nerve tissue is proposed.
  • Other ⁇ -2, 8-sialyltransferases are also mentioned, namely
  • ST8SiaI human, mouse
  • ST8SiaII STX with N-glycan- ⁇ -2,8-sialyltransferase activity.
  • Gangliosides are amphiphilic sialic acid-containing glycosphingolipids. Signal-transmitting properties are attributed to them. Quantitative and qualitative changes in gangliosides are observed in the development, aging and disease of the central nervous system. In general, their concentration in the gray matter of the brain is greater than in the white or peripheral nerve tissue. Neurons usually also show higher concentrations of gangliosides than astroglia. Gangliosides are mainly found in the plasma membrane and in lower concentrations on the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the lysosomes and the nuclear membrane.
  • the gangliosides GM1, GDla, GDlb and GTlb make up 80-90% of the total ganglioside content, while GD3, a main component of the developing brain, is only present in traces.
  • the GD3 level increases in pathological conditions, for example astrocytic scarring, Creutzfeld-Jakob and multiple sclerosis.
  • a decrease in the total brain ganglioside content in neurological diseases for example early stages of Alzheimer's, has been reported. Treatment of early stages of Alzheimer's and other neurodegenerative diseases such as Parkinson's, spinal cord trauma and at least transient stroke with GM1 has again proven to be beneficial.
  • the gangliosides should represent endogenous regeneration factors and should therefore be researched with a view to treating neurodegenerative disorders such as Alzheimer's and acute brain lesions such as cerebral ischemia, cf. Kraun, I. et al., Periodicum Biologorum, Vol. 97, No. 2, 113-118 (1995).
  • gangliosides are also described as cancer antigens.
  • EP 0 654 529 describes overexpression of GD3 in neuroectodermal tumors, e.g. malignant tumors, reported. Therefore, GD3 is said to be involved in the attachment of cancer cells to extracellular substrates.
  • gangliosides are generally considered to be neuroprotective, e.g. GMl in models for stroke, Alzheimer's, Parkinson's, etc., Testi et al. in Science, 227, 1652-1655 (1997) that cellular GD3 increases at the beginning of CD95-induced apoptosis in lymphocytes and that apoptosis can be prevented by inhibiting GD3 synthesis by means of antisense oligonucleotides.
  • Further studies on hepatoma cells and isolated mitochondria show that GD3 induces the opening of mitochondrial permeability transition pores and could be involved in cell death via this mechanism, cf. Scorrano L. et al., J. Biol. Chem., 274, 22581-22585 (1999) and Kristal, B.S. and Brown, A.M., J. Biol. Chem., 274, 23169-23175 (1999).
  • CNS diseases affect large parts of the population today. The number of patients is constantly increasing, particularly due to the increase in older people.
  • Neuropathological conditions such as cerebral ischemia, stroke, and neurogenerative diseases, e.g. Dementia, in particular Alzheimer's, demyelinating diseases, in particular multiple sclerosis, and brain tumors lead to damage to the brain and the associated neuronal deficits.
  • the object of the present invention is to provide new applications for modulating the GD3 synthase activity. Surprisingly, it has now been found that the inhibition of the GD3 synthase activity enables treatment of neuropathological disorders and associated signs, symptoms and malfunctions.
  • the present invention therefore relates to the use of at least one GD3 synthase inhibitor for the treatment of neuropathological disorders and also associated signs, symptoms and malfunctions.
  • neuropathological disorders are understood to be disorders which are accompanied by neurological deficits, ie. H. a condition characterized by neurological deficits.
  • This condition can exist temporarily, progressively, or persistently.
  • the treatment of cerebral ischemia, traumatic brain and spinal cord damage, in particular brain and spinal cord trauma, and neurodegenerative disorders, especially of dementia, in particular Alzheimer's dementia, Parkinson's, ALS (amyotrophic lateral sclerosis), multiple sclerosis, is preferred.
  • Treatment of neuropathological is particularly preferred
  • neuropathological disorders which are preferably treated according to the invention are based on one or more of the changes in nerve tissue listed below: degeneration or death of neurons, in particular ganglion cells, for example tigrolysis, nuclear membrane blur, cell shrinkage, cytoplasmic vacuolation and incrustation, parenchymal necrosis of the brain, brain edema Oxygen deficiency caused changes in neurons, atrophy, morphological changes, such as demyelination, in particular a decay of the medullary cord, perivascular kular infiltrates, gliole proliferation and / or glian scars; Degeneration of the substantia nigra.
  • the indication to be treated according to the invention is often characterized by progressive development, i.e. the states described above change over time, the degree of severity generally increases and, if necessary, states can merge into one another or further states can join existing states.
  • a number of other signs, symptoms and / or malfunctions which are related to the neuropathological disorders can be treated by the treatment according to the invention or the conditions on which they are based, i.e. especially accompany the disease states described above.
  • These include, for example, shock lung; Cranial nerve failures, e.g.
  • Treatment in the sense of the invention includes not only the treatment of acute or chronic signs, symptoms and / or malfunctions, but also preventive treatment (prevention).
  • One purpose of acute or chronic treatment is to correct the disorders, regulate the conditions, or alleviate the signs, symptoms and / or malfunctions.
  • the purpose of the treatment is to reduce the enzymatic activity associated with the GD3 synthase.
  • One purpose of preventive (preventive) treatment is to avoid the occurrence of the disorders, conditions, signs, symptoms and / or malfunctions, which also includes a delay in the occurrence.
  • Treatment can be symptomatic, for example as symptom suppression. It can be short-term, medium-term, or it can also be long-term treatment, for example as part of maintenance therapy.
  • GD3 synthase inhibitor describes substances which inhibit the enzymatic activity of GD3 synthases or their expression.
  • enzyme inhibition means a reduction in enzyme activity, especially in the vity understood as glycosyltransferase, sialyltransferase, ⁇ -2, 8-sialyltransferase and in particular Sia- ⁇ -2, 3-gal- ⁇ -l, 4-GlcNAc- ⁇ -2,8-sialyltransferase (EC 2.4.99.8).
  • the GD3 synthase activity leads, for example, to the implementation of a glycosyl donor with a glycosyl acceptor to give an oligosaccharide
  • Donors are usually nucleotides through which
  • Phosphate groups a monosaccharide is bound.
  • glucose (Glc), galactose (Gal), N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), xylose (xyl) and glucoronic acid (GlcA) are donated by uridine diphosphate, fucose (Fuc) and Mannose (Man) through guanosine diphosphate donors and sialic acid (N-acetylneuraminic acid, NeuAc, NANA) through cytidine monophosphate donors.
  • CMP-NeuAc is preferred as a glycosyl donor.
  • the glycosyl acceptors are usually glycoproteins, oligosaccharides or glycolipids.
  • the sialyltransferase activity of the GD3 synthase is directed above all to those glycosyl acceptors which have a terminal ⁇ -gal or sialic acid residue.
  • a sialic acid residue is bound to a terminal sialic acid residue via an ⁇ -2,8 linkage.
  • preferred to inhibit the activity of the GD3 synthase m it will transfer a sialic acid residue to the sequence Sia ⁇ -2, 3-Gal-beta-l, 4-GlcNAc.
  • GD3 II 3 (NeuAc- ⁇ -2, 8-NeuAc JLacCer).
  • mammalian GD3 synthase and especially of human GD3 synthase, in particular GD3 synthase with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and homologous sequences thereof, is preferred according to the invention.
  • these are type II transmembrane proteins (approx. 40 kD), which are located in the early Golgi and whose catalytic domain is usually characterized by the COOH-terminal sialyl motif S.
  • the inhibition of GD3 synthase leads to a decrease in the enzymatic activity associated with GD3 synthase. This can be done, for example, by modulating the enzyme itself or the amount of enzyme expressed. According to a particular aspect of the present invention, the modulation relates in particular to neuronal tissue and, above all, to neurons themselves.
  • Inhibitors according to the invention generally bind to nucleic acids encoding GD3 synthases or GD3 synthase, for example DNA or mRNA. Binding is understood to mean any molecular interaction between inhibitor and enzyme or nucleic acid, in particular under physiological conditions. These are usually classic interactions, which include electrostatic forces, van der Waals forces, hydrogen bonds, hydrophobic bonds, or metal complex-like coordinative bonds. In addition to the reversible molecular interactions mentioned above, irreversible interactions between inhibitor and enzyme can also be considered, for example covalent bonds.
  • competitive enzyme inhibitors bind in the region of or one of the active domains of GD3 synthase and compete with other substrates for their binding site (competition).
  • competitive enzyme inhibitors are understood to mean those which compete with a reference substrate, in the present case glycosyl donors and / or glycosyl acceptors, preferably UDP-NeuAc and / or GM3, for binding to GD3 synthases, i.e. the bond of one hinders the bond of the other. Because of this binding to GD3 synthase, competitive enzyme inhibitors can also be referred to as GD3 synthase substrates.
  • inhibitors are preferably substrates which, in comparison to the natural substrate or substrates, are not or at least less accessible to the catalytic activity of GD3 synthase, i.e. they are not or only to a comparatively small extent implemented by GD3 synthase. It is also possible to use non-competitive inhibitors which, for example, bind essentially irreversibly to active domains or elsewhere to the GD3 synthase and which, for example via allosteric effects, influence the enzyme activity.
  • the principle applies that the displacement of a substrate by an inhibitor increases with decreasing binding affinity of the competing substrate or increasing binding affinity of the inhibitor. It is therefore expedient for inhibitors which can be used according to the invention to have a high binding affinity for GD3 synthase.
  • Such a favorable binding affinity allows an effective displacement of naturally occurring enzyme substrates, ie above all of glycosyl donors and / or glycosyl acceptors, for example UDP-NeuAc and / or GM3, the required concentration of inhibitor for binding a certain amount of this inhibitor decreases to the enzyme or to replace a certain amount of a substrate with increasing binding affinity of the inhibitor.
  • inhibitors are therefore preferred whose binding affinity is so great that these can be administered as an active ingredient in an effective medical treatment in reasonable amounts.
  • Inhibitors according to the invention are therefore preferably administered in daily doses of approximately 0.01 to 30 mg / kg body weight and in particular of approximately 0.1 to 15 mg / kg body weight.
  • ICso values the competitive inhibition of the binding of GD3 synthase inhibitors can also be evaluated in such a way that inhibitors preferred according to the invention semi-maximal inhibitory constants IC 50 in vitro of less than 10 -4 M, preferably less than 10 ⁇ 5 M and in particular less than 10 Have -6 sts.
  • the expression inhibitors are substances which impair the synthesis of GD3 synthase quantitatively or qualitatively, in particular oligonucleotides or suitable synthetic compounds which, for example, in the sense of an antisense RNA or DNA, or in the sense of the triple Helix technology works.
  • the gangliosides GQlb, GTla and GTlb inhibit GD3 synthase activity.
  • glycosylation inhibitors such as tunicamycin impair the glycosylation of GD3 synthase, which can cause it to lose its enzymatic activity.
  • GD3 synthase-specific antibodies can also be useful as GD3 synthase inhibitors. It can be polyclonal antisera, monoclonal antibodies, antibody fragments such as F (ab), Fc, etc., chimeras, humanized and recombinant antibodies. Such antibodies can be produced in a manner known per se. GD3 synthase as such or antigenic fragments thereof, which are generally coupled to conventional carrier proteins, can be used as the immunogen.
  • Low molecular weight GD3 synthase inhibitors mostly synthetic compounds, can be used advantageously in many ways.
  • Aptamers which are nucleic acids, usually oligonucleotides, with sufficient affinity for GD3 synthase can also be used as inhibitors.
  • the application according to the invention is not limited to the inhibitors mentioned above. Rather, any substance in the presence of which the GD3 synthase activity is lower than in its absence can be used according to the invention as a GD3 synthase inhibitor.
  • Test systems are known for measuring the GD3 synthase activity, in which GD3 synthase inhibitors which can be used according to the invention as test substance lead to a reduction in the GD3 synthase activity.
  • These test systems are generally based on the implementation of labeled substrates, whereby donor and / or acceptor substrates can be labeled, thus for example on the incorporation of labeled donor substrates, especially fluorescent, for example fluorescence, and radio, eg 35 S-, 14 C-, or 3 H-labeled substrates, eg CMP- [ 14 C] Neu5Ac (synonym: [ 14 C] -labeled CMP-ß-D-sialic acid, CMP-NANA or CMP-N Acetylneuraminic acid; see Yusuf et al., Eur.
  • acceptor substrates generally glycoproteins, oligosaccharides or glycolipids, especially those with the sequence Gal- ⁇ -l, 4-GlcNAc and especially gangliosides, for example GM3, NeuAc- ⁇ -2, 3-Gal-ß-l, 4-GlcNAc, the implementation, ie the attachment of this substrate to an acceptor substrate and the associated structure of certain glycoproteins or glycolipids can be tracked using the label.
  • the acceptor substrates can also be marked.
  • the reaction products can be separated chromatographically, for example by means of thin layer chromatography, HPLC or electrophoretically.
  • Glycoproteins of the reaction mixture can be separated and stained electrophoretically, for example using SDS-PAGE, for example using Coomassie Brilliant Blue.
  • Glycolipids of the reaction mixture can be separated and stained with HPLC, for example with orcinol / sulfuric acid. The incorporation of the label into certain glycoproteins or glycolipids can thus be quantified.
  • the type and amount of the GD3 synthase expressed can be immunologically, for example with antibody R24 directed against GD3 synthase or with antibodies against optionally co-expressed signal or carrier peptides, for example influenza virus hemagglutinin nonapeptide, or via the Incorporation of markings in GD3-synthase, for example determining [2- 3 H] -labeled mannose.
  • the substrates can be obtained biologically or chemically synthesized.
  • CMP-5-fluoresceinyl-sialic acid and [ 14 C] -labelled CMP-sialic acid are commercially available (eg Calbiochem or Amersham).
  • GM3 and pyrene-labeled GM3 eg Sigma.
  • the coupling chemistry common in this area can be used.
  • the GD3 synthase used for tests can be of natural or recombinant origin.
  • Golgi vesicles can e.g. isolate from rat liver and determine the GD3 synthase activity in the homogenates obtained therefrom.
  • You can also with the in WO 94/23020 or by Martina et al. in J. Biol. Chem. 273 (6): 3725-3731 (1998) can be produced in a recombinant manner.
  • the present invention therefore also relates to a method for identifying GD3 synthase inhibitors, the activity of GD3 synthase being determined in the presence and in the absence of at least one test substance.
  • test systems described above and other similarly suitable test systems can form the basis for in vitro screening methods, preferably for primary screening, with which one can read out from a large number of different substances those which are useful with regard to the use according to the invention
  • the present invention thus also relates to corresponding methods for identifying active substances for the treatment of neuropathological disorders and, based on this, the production of pharmaceutical compositions for the treatment of neuropathological disorders.
  • Such a process for the development of active substances for the treatment of neuropathological disorders is characterized in that GD3 synthase inhibitors are first selected from a large number of substances and these are used to prepare the agent.
  • GD3 synthase inhibitors are first selected from a large number of substances and these are used to prepare the agent.
  • extensive substance banks can be created that include myriads of potential active substances.
  • the screening of combinatorial substance libraries for substances with the desired activity can be automated. Screening robots are used for the efficient evaluation of the individual assays, which are preferably arranged on microtiter plates.
  • Kits and components for performing this assay can be obtained commercially, for example from Amersham Pharmacia Biotech.
  • solubilized or membrane-bound substrates are immobilized on small fluomicrosphere containing scintillation substance.
  • the substrate is radiolabelled and the scintillation substance is used for light emission.
  • FlashPlate technology known in the field of active substance screening.
  • Kits and components for performing this assay can be obtained commercially, for example from NEN Life Science Products.
  • This principle is also based on microtiter plates (96 or 384), which are coated with scintillation substance.
  • test methods which are particularly suitable for secondary screening are based on in-vitro and in-vivo models for indications to be treated according to the invention.
  • in-vitro and in-vivo models for stroke are known and established. This allows you to cultivate neurons with an oxygen-glucose deficiency and determine the percentage of dead cells. Inhibitors which can be used according to the invention reduce the proportion of dead cells.
  • ischemia can be experimentally induced in experimental animals, for example by clamping off the middle cerebral artery (focal cerebral ischemia).
  • the extent of the induced ischemia can, for example, be determined histologically.
  • Inhibitors which can be used according to the invention reduce the extent of the induced ischemia.
  • GD3 synthase inhibitors includes a method as part of the treatment.
  • An effective amount of one or more GD3 synthase inhibitors is administered to the individual to be treated, preferably a mammal, in particular a human, useful or domestic animal. Whether such treatment is indicated and in what form it must be carried out depends on the individual case and is subject to a medical assessment (diagnosis) to develop the existing signs, symptoms and / or malfunctions, risks, certain signs, symptoms and / or malfunctions - none, and takes other factors into account.
  • the treatment is generally carried out by single or repeated daily administration, optionally together or alternating with other active substances or preparations containing active substances, so that an individual to be treated is given a daily dose of from about 0.001 g to 10 g, preferably from about 0.001 g to about 1 g is fed.
  • the invention also relates to the production of pharmaceutical compositions for the treatment of an individual, preferably a mammal, in particular a human, useful or domestic animal.
  • the inhibitors are usually administered in the form of pharmaceutical compositions which comprise a pharmaceutically acceptable excipient with at least one inhibitor according to the invention and optionally further active ingredients.
  • These compositions can be administered, for example, by the oral, rectal, transdermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular or intranasal route.
  • suitable pharmaceutical formulations are solid pharmaceutical forms, such as powders, powders, granules, tablets, troches, sachets, cachets, dragees, capsules such as hard and soft gelatin capsules, suppositories or vaginal pharmaceutical forms, semi-solid pharmaceutical forms, such as ointments, creams, hydrogels, pastes or plasters , as well as liquid pharmaceutical forms, such as solutions, emulsions, in particular oil-in-water emulsions, suspensions, for example lotions, injection and infusion preparations, eye and ear drops.
  • Implanted delivery devices can also be used for the administration of inhibitors according to the invention. Liposomes, microspheres or polymer matrices can also be used.
  • inhibitors according to the invention are usually mixed or diluted with an excipient.
  • Excipients can be solid, semi-solid or liquid materials which serve as vehicles, carriers or media for the active ingredient.
  • Suitable excipients include, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starches, acacia, calcium phosphate, alginates, tragacanth, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup and methyl cellulose.
  • the formulations can be pharmaceutically acceptable carriers or customary auxiliaries, such as lubricants, for example talc, magnesium stearate and mineral oil; Wetting agents; emulsifying and suspending agents; preservatives such as methyl and propyl hydroxybenzoates; Antioxidants; Antiirritatives; chelating agents; coating aids; emulsifier sion stabilizers; film formers; gelling agents; Odor masking agents; masking flavors; resins; Hydrocolloids; Solvents; Solubilizing agents; Neutralizing agents; Permeation accelerator; pigments; quaternary ammonium compounds; Refatting and overfatting agents; Ointment, cream or oil base materials; Silicone derivatives; spreading aids; stabilizers; Sterilanzien; Fundamentals of the suppository; Tablet excipients such as binders, fillers, lubricants, disintegrants or coatings; Propellant; Desiccant; Opacifiers; Thickener; waxe
  • a design in this regard is based on professional knowledge, as is shown, for example, in Fiedler, HP, Lexicon of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related areas, 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Cantor-Verlag, 1996.
  • Figure la shows the percentage of specific death of primary neurons after 6 hours of oxygen-glucose deficiency and reperfusion times of 3 h, 18 h and 24 h;
  • FIG. 2a the percentage increase in the specific death of primary neurons 24 h after the addition of GD3 in final concentrations of 250 ⁇ M, 375 ⁇ M and 500 ⁇ M and of GDla in a final concentration of 500 ⁇ M to the culture medium;
  • 2c shows the specific death of primary neurons after a 6-hour lack of oxygen-glucose and subsequent 3-hour, 18-hour and 24-hour reperfusion after addition of antisense oligodeoxynucleotides against GD3 synthase (ST8-As) or Oligodeoxynucleotides with a random sequence of the same nucleotides (ST8-Sc) to the culture medium 48 h before
  • FIG. 3a shows the specific death of primary neurons from mice with acid-sphingoyelinase deficiency (ASM- / -) and from wild-type mice of the same generation (ASM + / + ) after 6 hours of oxygen-glucose deficiency and subsequent 24- hourly reperfusion;
  • mice In mice (strain C57BL6), focal cerebral ischemia was triggered by occlusion of the cerebral artery (ACM) (Longa et al, Stroke 20, 84-91 (1989)).
  • ACM cerebral artery
  • ketamine and rompun; each 150 mg / kg body weight were under deep anesthesia (ketamine and rompun; each 150 mg / kg body weight) and the rectal temperature was kept at around 37 ° C with heating lamps and heating pads. After an observation period of 24 hours, the animals were anesthetized again and the brains were prepared after perfusion.
  • Reference example 2 Reference example 2
  • cryostatic coronary sections with a thickness of 20 ⁇ m were made at a distance of 400 ⁇ m and subjected to silver staining.
  • the sections were impregnated with a silver nitrate / lithium carbonate solution for 2 minutes and developed with a hydroquinone / formaldehyde solution for 3 minutes (Vogel, R.A., Clin. Cardiol., II 34-9 (1999)).
  • the stained sections were scanned directly (MCID-M4, 3.0; Imaging Res. Inc.).
  • the infarct volume was determined by numerically integrating the scanned areas with considerable pallor (corrected for cerebral edema x section thickness) with the aid of digital planimetry (Swanson, RA et al, Stroke 21, 322-7 (1990); Lin, TN, et al., Stroke 24, 117-21 (1993)). All values are given as the mean ⁇ standard deviation. The significance was determined using the Mann-Whitney test. Maps of the frequency distribution of infarcts were created (Belayev, L. et al., Neuroreport 8, 55-9 (1996); Schneider, A. et al., Biochemistry 38, 3549-58 (1999)) by using the respective sections a series were scanned, and the infarcts were delimited and projected onto a mask. The averaging was done with Scion-Image b 3.b.
  • Coronary cryostatic sections (20 ⁇ m) from reference example 2 were 48-72 h either with the monoclonal anti-GD3-IgG3 mouse antibody (R24) or with the polyclonal antibodies anti-NF200, (Sigma, Deisenhofen, Germany), anti- GFAP (Chemicon, Canada) or anti-cytochrome c (H-104; Santa Cruz, Canada) incubated.
  • the immunoreactivities were depicted either with a monoclonal or a polyclonal Cy3 / FITC-labeled second antibody (Dianova, Hamburg, Germany) or with the conventional avidin-biotin complexation method (Vectastain, Vector Lab, USA).
  • the sections were treated with 0.3 ul Flu-dUTP (Amersham, Braunschweig, Germany), 1 ul terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), 5 10 ul 5x TdT buffer, 2 ul CoCl 2 (Boehringer, Mannheim, Germany), 0 , 3 ⁇ l of dATP (Perkin Elmer) and 36.4 ⁇ l of distilled H 2 0 were incubated in a humid chamber at 37 ° C. for 90 min. The reaction was stopped by transferring the slides into TE buffer for 10 min at room temperature. Normal cell nuclei that are simply nothing
  • Neurons were obtained from transgenic mice whose acid sphingomyelinase was inactivated (ASM- / _ ; Hirunouchi, K., et al., Nature Genetics 10, 288-294 (1995)) and wild-type mice of the same generation (ASM + + ) , Primary neuron cultures were from 15 to
  • GFAP glial-fibrilary-acidic protein
  • Cultures 5 were then returned to a wet incubator containing 8% CO 2 and atmospheric oxygen for a further 3 h, 18 h or 24 h.
  • the cultures were treated with 80 nM GD3 synthase antisense 01igodeoxynucleotides (SEQ ID NO: 2) and a randomly selected oligodeoxynucleotide (SEQ 0 ID NO: 3) 48 hours before induction of the oxygen-glucose Incubated for lack.
  • Bovine Brain GD3 was obtained from Sigma (Deisenhofen, Germany).
  • the percentage of dead cells was determined by Try-5 pan blue exclusion and expressed as a percentage of the specific death. This was calculated as follows:
  • % specific death (found death - spontaneous death - die 0) / (100 - spontaneous death) x 100
  • GD3 was determined as previously described by De Maria, R., et al., Science 277, 1652-5 (1997). Tissue and cells were broken with two freeze-thaw cycles. The polar lipids were extracted and the gangliosides were on silica gel plates
  • FIG. 1 a A 6-hour oxygen-glucose deficiency and increasing reperfusion times according to reference example 6 induced up to 48% specific death of primary neurons (FIG. 1 a).
  • Using quantitative thin-layer chromatography according to Reference Example 7, it could be shown that this increase in neuronal death was accompanied by an increase in GD3 levels (149.45 _t 3.00% compared to the untreated control, n 3; FIG. 1b).
  • GD3 The distribution of GD3 accumulation within the ischemic brain could be examined immunohistochemically.
  • GD3 was detected in the lateral striatum and the adjacent neocortex as early as 4 h after ACM closure.
  • GD3 accumulation progressively increased up to 24 h after ischemia; At this time, GD3 was detected in the lateral striatum, ventrolateral thalamus, the CA1 and CA3 hippocampus layers and the cortex adjacent to the ischemic lesion.
  • GD3 could not be detected either in the brains of sham operated animals or in the control staining performed without the first antibody.
  • Double-label studies showed that after 24 hours of reperfusion, GD3 neosynthesis mainly takes place in neurons.
  • increasing cellular levels of GD3 correlated with increased mitochondrial release of cytochrome c. Accordingly, GD3 was found in apoptotic neurons.
  • GD3 promotes neuronal death
  • Cortical neuronal cells were treated with increasing doses of GD3. Specific neuron death increased with dose, up to 80% 24 hours after the addition of 500 ⁇ M GD3 (Fig. 2a). Another disialoganglioside GDla had no effect at the highest dose used (Fig. 2a).
  • ASM + / + mice are determined with regard to the specific neuronal death assessed according to reference example 6 (31.09 + 11.95 or 38.28 + 10.28% specific death; FIG. 3a). Accordingly, GD3 accumulated in approximately equal amounts after oxygen-glucose deficiency / reperfusion in both ASM - / - and in ASM + / + - neurons (689.43 + 13.53 and 647.53 + 67.21 mg GD3 / ⁇ mol neuraminic acid; Fig. 3b).
  • D-PDMP D-threo-l-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen, insbesondere cerebraler Ischämie, traumatischer Hirn- und Rückenmarksschädigungen und neurodegenerativer Störungen, sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen, und Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Mittel zur Behandlung neuropathologischer Störungen.

Description

GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen.
Die vorliegende Erfindung" betrifft die Verwendung von GD3-Syn- thast-jlnhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen, insbesondere cerebraler Ischämie, traumatischer Hirn- und Rückenmarksschädigungen und neurodegenerativer Störungen sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome, und Fehlfunktionen, und Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Mittel zur Behandlung neuropathologischer Störungen, das insbesondere als Primär-Scree- ning ausgelegt werden kann.
Sialinsäuren (kurz: Sia) spielen eine wichtige Rolle bei inter- zellulären Transmissionsvorgängen, cytoplasmatischen Wechselwirkungen und zellulärer Adhäsion. Man findet sie am Ende der Kohlenwasserstoffgruppen von Glycoproteinen und Glycolipiden. Sialinsäuren werden im Rahmen posttranslationaler Vorgänge enzyma- tisch in diese Positionen eingeführt. Sia-α-2,3-Gal und Sia- α-2,8-Sia stellen häufig in Gangliosiden beobachtete Sequenztypen dar.
Sialinsäuren übertragende Enzyme sind Glycosyltransferasen und werden als Sialyltransferasen bezeichnet. Angesichts der Vielzahl bisher bekannter Sialyloligosaccharid-Strukturen, wird angenommen, dass wenigstens 12 verschiedene Sialyltransferasen an deren Synthese beteiligt sind.
Ausgehend von einer aus humanen Melanomzellen isolierten mRNA be- schreibt die EP 0 654 529 eine α-2, 8-Sialyltransferase, deren physiologische Aktivität bei der Erzeugung von Gangliosid GD3 nützlich ist.
In der EP 0 736 602 wurde mittels degenerierter, auf konservierte Sialyltransferase-Domänen (Sialyl-Motive L und S) gerichteter
Oligonukleotid-Primer die Gesamt-mRNA aus Mäusehirn einer PCR unterworfen, wodurch eine weitere α-2 ,8-Sialyltransferase, dort ST8Sialll genannt, identifiziert wurde. Es handelt sich ebenfalls um eine GD3-Synthase, genauer eine Sia-α-2 , 3-Gal-ß-l,4-GlcNAc- α-2,8-Sialyltransferase aus Mäusehirn. Es wird die Verwendung des Enzyms zur Spermienreifung, Prävention von Krebsmetastasen, Inhibition enzündlicher Vorgänge und Reaktivierung von Nervengewebe vorgeschlage . Erwähnt werden auch weitere α-2 , 8-Sialyltransferasen, und zwar
ST8SiaI (Human, Maus) und ST8SiaII (STX) mit N-Glycan-α-2, 8-Sia- lyltransferase-Aktivität .
Ganglioside sind amphiphile Sialinsäure-haltige Glycosphingoli- pide. Ihnen werden Signal übertragende Eigenschaften zugeschrieben. Bei Entwicklung, Alterung und Erkrankung des zentralen Nervensystems beobachtet man quantitative und qualitative Veränderungen von Gangliosiden. Im Allgemeinen ist ihre Konzentration in der grauen Hirnsubstanz größer als in der weißen bzw. in periphe- rem Nervengewebe. Auch Neuronen zeigen in der Regel höhere Konzentrationen an Gangliosiden als Astroglia. Ganglioside finden sich hauptsächlich in der Plasmamembran und in niedrigeren Konzentrationen am endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, den Lysosomen und der Kernmembran. Im Gehirn eines Erwachsenen machen die Ganglioside GM1, GDla, GDlb und GTlb 80-90 % des gesamten Gangliosidgehalts aus, während GD3, eine Hauptkomponente des sich entwickelnden Gehirns, nur in Spuren vorhanden ist. Interessanterweise nimmt der GD3-Spiegel bei pathologischen Zustän- den, beispielsweise astrocytischen Vernarbungen, Creutzfeld-Jakob und Multipler Sklerose, zu. Darüber hinaus ist über eine Abnahme des Gesamtgehalts an Hirngangliosiden bei neurologischen Erkrankungen, beispielsweise frühen Stadien von Alzheimer, berichtet worden. Eine Behandlung früher Stadien von Alzheimer und weiterer neurodegenerativer Erkrankungen, wie Parkinson, Rückenmarkstrauma und zumindest transientem Schlaganfall, mit GM1 hat sich wiederum als günstig erwiesen.
Die Ganglioside sollen in diesem Zusammenhang endogene regenerie- rende Faktoren darstellen und deshalb mit Blick auf eine Behandlung neurodegenerativer Störungen wie Alzheimer und akuter Hirnläsionen wie cerebraler Ischämie erforscht werden, vgl. Kra- cun, I. et al., Periodicum Biologorum, Vol. 97, Nr. 2, 113-118 (1995) .
Andererseits werden Ganglioside auch als Krebsantigene beschrieben. Beispielsweise wird in der EP 0 654 529 über eine Überexpression von GD3 in neuroectodermalen Tumoren, z.B. malignen Tumoren, berichtet. Deshalb soll GD3 bei der Anhaftung von Krebs- Zellen an extrazelluläre Substrate beteiligt sein.
Kensuke Kawai et al. beschrieben kürzlich in Psychiatry and Cli- nical Neuroscience, 53, 79-82 (1999) den Nachweis von GD3 im Zy- toplasma reaktiver Astrocyten (Gliazellen) , und zwar an Gehirn- schnitten, die Menschen mit Creutzfeld-Jakob bzw. alten cerebra- len Infarkten per Autopsie entnommen worden waren. Astrocyten sollen aktiv an der Wiederherstellung von ZNS-Läsionen beteiligt sein. Diesem als reaktive Gliosis bekannten Vorgang wird regenerative Funktion zugeschrieben. Die Astrocyten proliferieren als Reaktion auf den neuronalen Zellverlust. Dementsprechend wurden Konzentrationsanstiege von GD3 und GM3 in Astrozyten für die Spätphase derartiger Erkfankungszustände berichtet, d.h. viele Stunden bzw. Tage nach Eintritt ischämischer Ereignisse und erst im Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen.
Obwohl Ganglioside im allgemein als neuroprotektiv betrachtet werden, z.B. GMl in Modellen für Schlaganfall, Alzheimer, Parkinson etc., berichteten Testi et al. in Science, 227, 1652-1655 (1997), daß in Lymphozyten zu Beginn der CD95-induzierten Apop- tose zelluläres GD3 ansteigt, und eine Apoptose durch Inhibition der GD3-Synthese mittels Antisense-Oligonukleotiden verhindert werden kann. Weiteren Untersuchungen an Hepatomzellen und isolierten Mitochondrien zufolge induziert GD3 die Öffnung mitochon- drialer Permeabilitätstransitionsporen und könnte über diesen Mechanismus am Zelltod beteiligt sein, vgl. Scorrano L. et al., J. Biol. Chem., 274, 22581-22585 (1999) bzw. Kristal, B.S. und Brown, A.M., J. Biol. Chem., 274, 23169-23175 (1999).
Im Gegensatz zu obigen an Lymphozyten oder Hepatomzellen erhalten Ergebnissen wurde in anderen Fällen berichtet, daß beispielsweise während einer experimentell induzierten cerebralen fokalen Ischä- mie nach Okklusion der mittleren Cerebralarterie die Enzymaktivität stetig abnahm (Geng Fuqiang et al., Acta Academiae Medicinae Shanghai, Vol. 22, Nr. 4, 295-298 (1995)).
ZNS-Erkrankungen betreffen heutzutage große Bevölkerungsteile. Insbesondere aufgrund der Zunahme älterer Menschen steigen die Patientenzahlen ständig. Neuropathologische Zustände wie cere- brale Ischämie, Schlaganfall, und neurogenerative Erkrankungen, z.B. Demenz, insbesondere Alzheimer Demenz, demyelinisierende Erkrankungen, insbesondere Multiple Sklerose, und Gehirntumore füh- ren zu Schädigungen des Gehirns und den damit verbundenen neuronalen Defizite.
Insbesondere im Hinblick auf die Behandlung von Schlaganfall als häufigste lebensbedrohliche neurologische Erkrankung sind die Be- mühungen groß, ein möglichst rasches Eintreffen eines betroffenen Patienten in der Klinik sicherzustellen. Allerdings sind die therapeutischen Möglichkeiten begrenzt, ungeachtet der durch rt-PA und Aspirin-Behandlung erzielten Teilerfolge.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Anwendungen einer Modulation der GD3-Synthase-Aktivität bereitzustellen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Inhibition der GD3-Synthase-Aktivität eine Behandlung neuropathologischer Störungen sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen ermöglicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung wenigstens eines GD3-Synthase-Inhibitors zur Behandlung neuropathologischer Störungen sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen.
Unter neuropathologischen Störungen versteht man erfindungsgemäß Störungen, die von neurologischen Defiziten begleitet sind, d. h. einen durch neurologische Ausfallerscheinungen gekennzeichneten Zustand.
Dieser Zustand kann vorübergehend, fortschreitend oder persistie- rend bestehen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Behandlung cerebraler Ischämie, traumatischer Hirn- und Rückenmarksschädigungen, also insbesondere Hirn- und Rückenmarkstrauma, sowie neurodegenerativer Störungen, vor allem von Demenz, insbesondere Alzheimer Demenz, Parkinson, ALS ( amyotrophische Lateralsklerose), Multipler Sklerose.
Insbesondere bevorzugt ist die Behandlung neuropathologischer
Störungen, die mit cerebraler Ischämie in Zusammenhang stehen und insbesondere diejenigen, die darauf zurückzuführen sind. Zu nennen ist hier vor allem der Schlaganfall (Synonym: Apoplexia cere- bri, cerebraler oder apoplektischer Insult, Gehirnschlag) . Erfin- dungsgemäß behandelbar sind transitorisch-ischämische Attacken, reversible ischämische neurologische Defizite, prolongierte reversible ischämische neurologische Defizite, partiell reversible ischämische neurologische Symptomatiken und auch persistierende komplette Hirninfarkte. Besonders vorteilhaft ist erfindungsgemäß die Behandlung akuter Formen.
Den erfindungsgemäß bevorzugt behandelten Formen neuropathologischer Störungen liegen eine oder mehrere der nachfolgend aufgezählten Veränderungen von Nervengeweben zugrunde: Degeneration oder Absterben von Neuronen, insbesondere der Ganglienzellen, z.B. Tigrolyse, Kernmembranunschärfe, Zellschrumpfung, Zytoplas- mavakuolisierung und -inkrustation, Parenchymnekrosen des Gehirns, Hirnödeme, durch Sauerstoffmangel verursachte Veränderungen von Neuronen, Atrophie, morphologische Veränderungen, wie De- myelinisierungen, insbesondere ein Markscheidenzerfall, perivas- kuläre Infiltrate, gliöse Proliferation und/oder Glianarben; Degeneration der Substantia nigra.
Die erfindungsgemäß zu behandelnde Indikation ist häufig gekenn- zeichnet durch eine progressive Entwicklung, d.h. die vorstehend beschriebenen Zustände verändern sich im Laufe der Zeit, in der Regel nimmt der Schweregrad zu und gegebenenfalls können Zustände ineinander übergehen oder weitere Zustände zu bereits bestehenden Zuständen hinzutreten.
Durch die erfindungsgemäße Behandlung neuropathologischer Störungen bzw. den ihr zugrundeliegenden Zuständen lassen sich eine Reihe weiterer Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen behandeln, die mit den neuropathologischen Störungen zusammenhängen, d.h. insbesondere die oben beschriebenen Erkrankungszustände begleiten. Hierzu gehören beispielsweise Schocklunge; Hirnnerve- nausfälle, z.B. retrobulbäre Neuritis, Augenmuskellähmungen, skandierende Sprache, spastische Lähmungen, Kleinhirnsymptome, Sensibilitäts-, Blasen- und Mastdarmstörungen, Euphorie, Demenz; Hypo- und Akinese, fehlende Mitbewegung, kleinschrittiger Gang, Beugehaltung von Rumpf und Gliedern, Pro-, Retro- und Lateropul- sion, Tremor, Mimikarmut, monotone Sprache, Depressionen, Apathie, labile oder starre Affektivität, erschwerte Spontaneität und Entschlußkraft, verlangsamtes Denken, verarmte Assoziations- fähigkeit; Muskelatrophie.
Eine Behandlung im erfindungsgemäßen Sinne umfaßt nicht nur die Behandlung akuter oder chronischer Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen, sondern auch eine vorbeugende Behandlung (Präven- tion) . Ein Zweck der akuten oder chronischen Behandlung ist eine Behebung der Störungen, Regulation der Zustände, bzw. Linderung der Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen. Einem besonderen Aspekt zufolge ist es Zweck der Behandlung, die mit der GD3-Syn- thase verbundene enzymatische Aktivität zu verringern. Ein Zweck der vorbeugenden (präventiven) Behandlung ist es, das Auftreten der Störungen, Zustände, Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen zu vermeiden, wozu auch eine zeitliche Verzögerung des Auftretens zählt. Die Behandlung kann symptomatisch, beispielsweise als Symptomsuppression ausgerichtet sein. Sie kann kurzzei- tig erfolgen, mittelfristig ausgerichtet sein, oder es kann sich auch um eine Langzeitbehandlung, beispielsweise im Rahmen einer Erhaltungstherapie, handeln.
Der Begriff "GD3-Synthase-Inhibitor" beschreibt Substanzen, wel- ehe die enzymatische Aktivität von GD3-Synthasen oder deren Expression inhibieren. Unter Enzym-Inhibition wird in diesem Zusammenhang eine Verminderung der Enzymaktivität, vor allem der Akti- vität als Glycosyltransferase, Sialyltransferase, α-2 , 8-Sialyl- transferase und insbesondere Sia-α-2, 3-Gal-ß-l,4-GlcNAc- α-2,8-Sialyltransferase (EC 2.4.99.8) verstanden. Die GD3-Syn- thase-Aktivität führt beispielsweise zur Umsetzung eines Glyco- syl-Donors mit einem Glycosyl-Acceptor zu einem Oligosaccharid-
Produkt. Dabei wird in der Regel ein Monosaccharid von dem Glyco- syl-Donor auf den Glycosyl-Acceptor übertragen. Bei dem Glycosyl-
Donor handelt es sich gewöhnlicherweise um Nukleotide, über deren
Phosphatgruppen ein Monosaccharid gebunden ist. So werden bei- spielsweise Glukose (Glc), Galactose (Gal), N-Acetylglucosamin (GlcNAc), N-Acetylgalactosamin (GalNAc), Xylose (Xyl) und Gluco- ronsäure (GlcA) durch Uridindiphosphat-Donatoren, Fucose (Fuc) und Mannose (Man) durch Guanosindiphosphat-Donatoren und Sialin- säure (N-Acetylneuraminsäure, NeuAc, NANA) durch Cytidinmono- phosphat-Donatoren übertragen. Im Sinne der Sialyltransferase-Ak- tivität ist CMP-NeuAc als Glycosyl-Donor bevorzugt. Bei den Gly- cosyl-Acceptoren handelt es sich in der Regel um Glycoproteine, Oligosaccharide oder Glycolipide. Die Sialyltransferase-Aktivität der GD3-Synthase ist vor allem auf solche Glycosyl-Acceptoren ge- richtet, die einen endständigen ß-Gal- oder Sialinsäurerest aufweisen. Im Sinne der α-2 , 8-Sialyltransferase-Aktivität der GD3-Synthase wird ein Sialinsäurerest über eine α-2, 8-Verknüpfung an einen endständigen Sialinsäurerest gebunden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, die Aktivität der GD3-Synthase zu inhibieren, mit der ein Sialinsäurerest auf die Sequenz Sia- α-2 , 3-Gal-ß-l, 4-GlcNAc übertragen wird. Ganz besonders bevorzugt ist die Übertragung eines Sialinsäurerestes auf das Gangliosid GM3 unter Ausbildung einer α-2 , 8-Verknüpfung, nämlich die Umsetzung von GM3 zu GD3. (GD3 = II3 (NeuAc-α-2 , 8-NeuAc JLacCer) .
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Inhibierung von Säuger-GD3-Syn- thase und vor allem von humaner GD3-Synthase, insbesondere der GD3-Synthase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:l sowie homologer Sequenzen davon. Es handelt sich in der Regel um transmem- brane Proteine vom Typ II (etwa 40 kD), die im frühen Golgi ansässig sind und deren katalytische Domäne in der Regel durch COOH-terminales Sialyl-Motiv S gekennzeichent ist.
Die Inhibierung der GD3-Synthase führt zu einer Verminderung der mit GD3-Synthase verbundenen enzymatischen Aktivität. Dies kann beispielsweise über eine Modulation des Enzyms selbst oder der exprimierten Menge an Enzym erfolgen. Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Modulation insbesondere neuronales Gewebe und vor allem Neuronen selbst. Erfindungsgemäße Inhibitoren binden in der Regel an GD3-Synthasen bzw. GD3-Synthase kodierende Nukleinsäuren, z.B. DNA oder mRNA. Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwischen Inhibitor und Enzym bzw. Nukleinsäure, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische Kräfte, van-der- Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken-Bindungen, hydrophobe Bindungen, oder metallkomplexartige koordinative Bindungen gehören. Zusätzlich zu den vorstehend genannten, reversiblen molekularen Wech- selwirkungen können auch irreversible Wechselwirkungen zwischen Inhibitor und Enzym in Betracht kommen, z.B. kovalente Bindungen.
In der Regel binden Enzym-Inhibitoren im Bereich der oder einer der aktiven Domänen von GD3-Synthase und konkurrieren mit anderen Substraten um deren Bindungsstelle (Kompetition) . Dementsprechend versteht man unter kompetitiven Enzym-Inhibitoren diejenigen, die mit einem Vergleichssubstrat, im vorliegenden Fall Glycosyl-Dona- toren und/oder Glycosyl-Akzeptoren, vorzugsweise UDP-NeuAc und/ oder GM3, um die Bindung an GD3-Synthasen konkurrieren, d.h. die Bindung des einen behindert die Bindung des anderen. Wegen dieser Bindung an GD3-Synthase können kompetitive Enzym-Inhibitoren auch als GD3-Synthase-Substrat bezeichnet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Inhibitoren um Substrate, die im Vergleich zu dem oder den natürlichen Substraten der katalytischen Aktivität von GD3-Synthase nicht oder zumindest weniger zugänglich sind, d.h. sie werden nicht oder in vergleichsweise geringem Ausmaß durch GD3-Synthase umgesetzt. Ebenfalls brauchbar sind nicht-kom- petitive Inhibitoren, die beispielsweise im wesentlichen irreversibel an aktive Domänen, oder an anderer Stelle an die GD3-Syn- thase binden und, beispielsweise über allosterische Effekte, Einfluß auf die Enzymaktivität nehmen.
Zumindest für den Fall der kompetitiven Inhibition gilt der Grundsatz, daß die Verdrängung eines Substrats durch einen Inhi- bitor mit abnehmender Bindungsaffinität des konkurrierenden Substrats bzw. zunehmender Bindungsaffinität des Inhibitors zunimmt. Zweckmäßigerweise besitzen daher erfindungsgemäß brauchbare Inhibitoren eine hohe Bindungsaffinität für GD3-Synthase. Eine derartig günstig ausfallende Bindungsaffinität gestattet eine wirksame Verdrängung natürlich vorkommender Enzymsubstrate, d.h. vor allem von Glycosyl-Donatoren und/oder Glycosyl-Akzeptoren, beispielsweise von UDP-NeuAc und/oder GM3 , wobei die erforderliche Konzentration an Inhibitor zur Bindung einer bestimmten Menge dieses Inhibitors an das Enzym bzw. zur Verdrängung einer bestimmten Menge eines Substrats mit zunehmender Bindungsaffinität des Inhibitors abnimmt. Im Hinblick auf die medizinische Anwendung werden daher Inhibitoren bevorzugt, deren Bindungsaffinität so groß ist, daß diese als Wirkstoff im Rahmen einer wirksamen medizinischen Behandlung in vertretbaren Mengen verabreicht werden können. Erfindungsgemäße Inhibitoren werden daher vorzugsweise in Tagesdosen von etwa 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht und insbesondere von etwa 0,1 bis 15 mg/kg Körpergewicht verabreicht.
Eine Möglichkeit, die Bindungsaffinität auszudrücken, bieten die oben angesprochenen Kompetitionsexperimente, mit denen man diejenige Konzentration an Inhibitor ermittelt, die das Enzym im Hin- blick auf die Umsetzung eines anderen Substrats zu 50% hemmt
(ICso-Werte) . So läßt sich auch die kompetitive Hemmung der Bindung von GD3-Synthase-Inhibitoren dahingehend auswerten, daß erfindungsgemäß bevorzugte Inhibitoren halbmaximale Hemmkonstanten IC50 in vitro von weniger als 10-4 M, vorzugweise von weniger als 10~5 M und insbesondere von weniger als 10-6 M aufweisen.
Bei den Expressionsinhibitoren handelt es sich im weitesten Sinne um Substanzen, welche die Synthese der GD3-Synthase quantitativ oder qualitativ beeinträchtigen, insbesondere um Oligonukleotide oder geeignete synthetische Verbindungen, die beispielsweise im Sinne einer antisense-RNA oder -DNA, oder im Sinne der Triple-He- lix-Technik wirken.
Beispielsweise ist bekannt, daß die Ganglioside GQlb, GTla und GTlb die GD3-Synthase-Aktivität hemmen.
Auch ist bekannt, daß Glycosylierungsinhibitoren wie Tunicamycin die Glycosylierung von GD3-Synthase beeinträchtigen, wodurch diese ihre enzymatische Aktivität verlieren kann.
Auch GD3-Synthase-spezifische Antikörper können als GD3-Synthase- Inhibitoren brauchbar sein. Es kann sich um polyklonale Antise- ren, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, wie F(ab), Fc, etc., Chimäre, humanisierte und rekombinante Antikörper handeln. Die Herstellung solcher Antikörper kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Als Immunogen kann man GD3-Synthase als solche oder antigene, in der Regel an übliche Trägerproteine gekoppelte Fragmente davon verwenden.
Niedermolekulare GD3-Synthase-Inhibitoren, meist synthetische Verbindungen, sind in vielerlei Hinsicht vorteilhaft brauchbar.
Auch Aptamere, das sind Nukleinsäuren, in der Regel Oligonukleotide, mit ausreichender Affinität zu GD3-Synthase, können als In- hibitoren Anwendung finden. Die erfindungsgemäße Anwendung ist nicht auf die vorstehend genannten Inhibitoren beschränkt. Vielmehr kann jede Substanz, in deren Gegenwart die GD3-Synthase-Aktivität geringer ist als in deren Abwesenheit, erfindungsgemäß als GD3-Synthase-Inhibitor An- Wendung finden.
Zur Messung der GD3-Synthase-Aktivität sind Testsysteme bekannt, in denen erfindungsgemäß brauchbare GD3-Synthase-Inhibitoren als Testsubstanz zu einer Verringerung der GD3-Synthase-Aktivität führen. Diese Testsysteme beruhen in der Regel auf der Umsetzung markierter Substrate, wobei Donor- und /oder Akzeptor-Substrat markiert sein können, somit beispielsweise auf dem Einbau markierter Donor-Substrate, vor allem fluoreszenz-, z.B. fluore- scein-, und radio-, z.B. 35S-, 14C-, oder 3H-markierter Substrate, z.B. CMP-[14C]Neu5Ac (synonym: [ 14C] -markierte CMP-ß-D-Sialin- säure, CMP-NANA oder CMP-N-Acetylneuraminsäure; vgl. Yusuf et al., Eur. J. Biochem. 134(1) : 47-54 (1983)), in Akzeptorsubstrate, in der Regel Glycoproteine, Oligosaccharide oder Glycolipide, vor allem solche mit der Sequenz Gal-ß-l,4-GlcNAc und insbesondere Ganglioside, z.B. GM3, NeuAc-α-2 , 3-Gal-ß-l,4-GlcNAc, wobei die Umsetzung, d.h. die Anfügung dieses Substrats an ein Akzeptorsubstrat und der damit verbundene Aufbau bestimmter Glycoproteine bzw. Glycolipide anhand der Markierung verfolgt werden kann. Auch die Akzeptor-Substrate können markiert sein. Die Reaktionspro- dukte können chromatographisch aufgetrennt werden, beispielsweise mittels Dünnschichtchromatographie, HPLC oder elektrophoretisch. Glycoproteine des Reaktionsgemisches können elektrophoretisch, z.B. mittels SDS-PAGE, aufgetrennt and angefärbt werden, z.B. mit Coomassie Brilliant Blue. Glycolipide des Reaktionsgemisches kön- nen mit HPLC aufgetrennt and angefärbt werden, z.B. mit Orcinol/ Schwefelsäure. So kann der Einbau der Markierung in bestimmte Glycoproteine bzw. Glycolipide quantifiziert werden.
Betrifft die Inhibition die Expression der GD3-Synthase, so kann Art und Menge der exprimierten GD3-Synthase immunologisch, beispielsweise mit gegen GD3-Synthase gerichtetem Antikörper R24 oder mit Antikörpern gegen gegebenenfalls coexprimierte Signaloder Trägerpeptide, beispielsweise Influenzavirus-Hämagglutinin- Nonapeptid, oder über den Einbau von Markierungen in GD3-Syn- thase, beispielweise [ 2-3H] -markierter Mannose bestimmen.
Die Substrate können auf biologischem Wege erhalten oder auf chemischem Wege synthetisiert werden. CMP-5-Fluoresceinyl-Sialin- säure und [14C] -markierte CMP-Sialinsäure sind kommerziell erhält- lieh (z.B. Calbiochem bzw. Amersham) . Das gleiche gilt für GM3 und Pyren-markiertes GM3 (z.B. Sigma) . Es kann von Vorteil sein, solche Substrate an einen festen Träger zu koppeln, was den Nach- weis freigesetzter Fragmente erleichtert. Zu diesem Zweck kann man die in diesem Bereich übliche Kopplungschemie anwenden.
Die zu Tests verwendete GD3-Synthase kann natürlichen oder rekom- binanten Ursprungs sein. Beispielsweise kann man Golgi-Vesikel z.B. aus Rattenlebern isolieren und die GD3-Synthase-Aktivität in den daraus erhaltenen Homogenisaten bestimmen. Sie kann auch mit den in WO 94/23020 oder von Martina et al. in J. Biol. Chem. 273 ( 6) :3725-3731 (1998) beschriebenen Expressionssystemen rekom- binant hergestellt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren, wobei man die Aktivität von GD3-Synthase in Gegenwart und in Abwesenheit wenigstens einer Testsubstanz bestimmt.
Die vorstehend beschriebenen und weitere in ähnlicher Weise geeignete Testsysteme können die Grundlage bilden für in vitro-Scree- ning-Verfahren, vorzugsweise zum primären Screening, mit denen man aus einer Vielzahl verschiedener Substanzen diejenigen auslesen kann, die im Hinblick auf die erfindungsgemäße Anwendung brauchbar sind. So betrifft die vorliegende Erfindung auch entsprechende Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen zur Behandlung neuropathologischer Störungen und darauf aufbauend die Herstellung pharmazeutischer Mittel zur Behandlung neuropathologischer Störungen. Ein solches Verfahren zur Entwicklung von Wirkstoffen zur Behandlung neuropathologischer Störungen ist dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst aus einer Vielzahl von Substanzen GD3-Synthase-Inhibitoren auswählt und diese zur Her- Stellung des Mittels verwendet. Beispielsweise können mittels kombinatorischer Chemie umfangreiche Stoffbanken angelegt werden, die Myriaden potentieller Wirkstoffe umfassen. Das Durchmustern kombinatorischer Substanzbibliotheken nach Stoffen mit gewünschter Aktivität ist automatisierbar. Screening-Roboter dienen der effizienten Auswertung der vorzugsweise auf Mikrotiterplatten angeordneten Einzelassays .
Eine besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist der im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte Scintillation Proximity Assay, kurz SPA genannt. Kits und Komponenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei Amersham Pharmacia Biotech. Für enzymatische Testanwendungen werden im Prinzip solubilisierte oder membrangebundene Substrate auf Scintillationssubstanz enthaltenden, kleinen Fluomikrospharen immobilisert. Je nach Art der zu testenden enzymatischen Aktivität ist das Substrat radioaktiv markiert und die Scintillationssubstanz wird solange zur Lichtemission an- geregt, wie die räumliche Nähe zwischen Scintillationssubstanz und Radiomarkierung gegeben ist, oder es wird die radioaktive Markierung in das immobilisierte Substrat eben durch die zu messende Enzymaktivität eingefügt und als Folge die Scintillations- Substanz zur Lichtemission angeregt. So ergeben sich Testformate, bei denen eine abnehmende bzw. zunehmende Signalintensität gemessen wird.
Eine weitere besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist die im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte FlashPlate-Technologie. Kits und Komponenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei NEN Life Science Products. Dieses Prinzip basiert ebenfalls auf Mikrotiterplatten (96er oder 384er), die mit Scin- tillationssubstanz beschichtet sind.
Weitere, vor allem zum sekundären Screening geeignete Testverfahren beruhen auf in-vitro und in-vivo Modellen für erfindungsgemäß zu behandelnde Indikationen.
Beispielsweise sind eine Reihe von in-vitro und in-vivo Modellen für Schlaganfall bekannt und etabliert. So kann man Neuronen unter Sauerstoff-Glukose-Mangel kultivieren und den Anteil abgestorbener Zellen bestimmen. Erfindungsgemäß brauchbare Inhibito- ren verringern den Anteil an abgestorbenen Zellen.
In vivo kann man in Versuchstieren experimentell eine Ischämie induzieren, indem man beispielsweise die mittlere Cerebralarterie abklemmt (fokale cerebrale Ischämie). Das Ausmaß der induzierten Ischämie kann beispielsweise histologisch bestimmt werden. Erfindungsgemäß brauchbare Inhibitoren verringern das Ausmaß der induzierten Ischämie.
Die erfindungsgemäße Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren beinhaltet im Rahmen der Behandlung ein Verfahren. Dabei wird dem zu behandelnden Individuum, vorzugsweise einem Säuger, insbesondere einem Menschen, Nutz- oder Haustier, eine wirksame Menge eines oder mehrerer GD3-Synthase-Inhibitoren, in der Regel der pharmazeutischen und tierarzneilichen Praxis entsprechend for u- liert, verabreicht. Ob eine solche Behandlung angezeigt ist und in welcher Form sie zu erfolgen hat, hängt vom Einzelfall ab und unterliegt einer medizinischen Beurteilung (Diagnose), die vorhandene Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen, Risiken, bestimmte Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen zu entwik- kein, und weitere Faktoren miteinbezieht . Die Behandlung erfolgt in der Regel durch einmalige oder mehrmalige tägliche Verabfolgung gegebenenfalls zusammen oder im Wechsel mit anderen Wirkstoffen oder Wirkstoffhaltigen Präparaten, so daß einem zu behandelnder^ Individuum eine Tagesdosis von etwa 0,001 g bis 10 g, vorzugsweise von etwa 0,001 g bis etwa 1 g zugeführt wird.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung pharmazeutischer Mittel zur Behandlung eines Individuums, vorzugsweise eines Säugers, insbesondere eines Menschen, Nutz- oder Haustieres. So werden die Inhibitoren gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Exzi- pienten mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Inhibitor und gegebenenfalls weiteren Wirkstoffen umfassen. Diese Zusammensetzun- gen können beispielsweise auf oralem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem oder intranasalem Weg verabreicht werden.
Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Pastillen, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatinekapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbeson- dere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohrentropfen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Inhibitoren verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikrosphären oder Polymermatrizes zur An- wendung kommen.
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Inhibitoren gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder verdünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Materia- lien sein, die als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dienen.
Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dextrose, Sucrose, Sorbitol, Mannitol, Stärken, Akaziengummi, Calci- umphosphat, Alginate, Traganth, Gelatine, Calciumsilikat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen pharmazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleitmittel, beispielsweise Talk, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservierende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidan- tien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emul- sionsstabilisatoren; Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungsmittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuni- ger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettunσsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon- Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppo- sitoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Cantor-Verlag, 1996, dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.
Es zeigt die
Figur la den prozentualen Anteil des spezifischen Absterbens primärer Neuronen nach 6-stündigem Sauerstoff-Glukose-Mangel und Re- perfusionsdauern von 3 h, 18 h und 24 h;
Figur lb Veränderungen von GD3-Spiegeln in Neuronen nach 24-stün- diger Reperfusion (in vitro) und in Neuronen der ischämischen Hemisphäre nach 90-minütigem ACM-Verschluss und anschließender 24-stündiger Reperfusion (in vivo) (% GD3-Spiegel relativ zu 100 % Kontroll-Spiegeln; Mittelwert ± Standardabweichung; n = 3);
Figur 2a den prozentualen Anstieg des spezifischen Absterbens primärer Neuronen 24 h nach Zugabe von GD3 in Endkonzentrationen von 250 μM, 375 μM und 500 μM sowie von GDla in einer Endkonzentration von 500 μM zum Kulturmedium;
Figur 2b die durch 6-stündigen Sauerstoff-Glukose-Mangel und nach 24-stündiger Reperfusion induzierten GD3-Spiegel nach Zugabe von Antisense-Oligodesoxynukleotiden gegen GD3-Synthase (ST8-As) oder Oligodesoxynukleotiden mit einer per Zufall angeordneten Sequenz der gleichen Nukleotide (ST8-Sc) 48 h vor der Induktion des Sauerstoff-Glukose-Mangels (% GD3-Spiegel ST8-As-behandelter Neurone relativ zu 100 % GD3-Spiegel ST8-Sc-behandelter Neurone; n = 3);
Figur 2c das spezifische Absterben primärer Neuronen nach 6-stün- digem Sauerstoff-Glukose-Mangel und anschließender 3-stündiger, 18-stündiger und 24-stündiger Reperfusion nach Zugabe von Anti- sense-Oligodesoxynukleotiden gegen GD3-Synthase (ST8-As) oder Oligodesoxynukleotiden mit einer per Zufall angeordneten Sequenz der gleichen Nukleotide (ST8-Sc) zum Kulturmedium 48 h vor der
Induktion des Sauerstoff-Glukose-Mangels (% Absterben ST8-As-be- handelter Neurone relatiy_ zu 100 % Absterben ST8-Sc-behandelter Neurone, n=5 ) ;
Figur 3a das spezifische Absterben primärer Neuronen aus Mäusen mit Saure-Sphingo yelinase-Defizienz (ASM-/-) und aus Wildtyp-Mäusen derselben Generation (ASM+/+) nach 6-stündigem Sauerstoff-Glu- kose-Mangel und anschließender 24-stündiger Reperfusion;
Figur 3b die GD3-Konzentration in Neuronen aus Mäusen mit Saure- Sphingomyelinase-Defizienz (ASM_/-) und aus Wildtyp-Mäusen dergleichen Generation (ASM+/+) nach 6-stündigem Sauerstoff-Glukose- Mangel und 24-stündiger Reperfusion (ng/μmol Neuraminsäure; Mittelwert + Standardabweichung; n = 3);
Figur 4a die GD3-Spiegel in der ischämischen Hemisphäre von Mäusen nach 90-minütigem ACM-Verschluss und 24-stündiger Reperfusion ohne vorherige Verabreichung von D-PDMP (ohne D-PDMP) oder nach vorheriger Verabreichung von D-PDMP (mit D-PDMP) (% GD3-Spiegel relativ zu 100 % GD3-Spiegeln in der nichtischämischen Hemisphäre; n = 3 ) ;
Figur 4b die 24 h nach 90-minütigem ACM-Verschluss bestimmten Infarktvolumina unbehandelter (ohne D-PDMP, n=7 ) und behandelter (mit D-PDMP, n=6) Mäuse.
Referenzbeispiel 1
Ischämie-Tiermodell
In Mäusen (Stamm C57BL6) wurde eine fokale cerebrale Ischämie durch einen Verschluß der Arteria cerebri media (ACM) ausgelöst (Longa et al, Stroke 20, 84-91 (1989)). Hierzu wurde ein siliko- nisierter Nylon-Wundfaden durch die Arteria carotis communis bis zur ACM geschoben und der Blutfluß durch die ACM unterbrochen. Nach 90 min wurde der Faden wieder gezogen und so die BlutZirkulation wieder hergestellt. Während des gesamten Eingriffs befan- den sich die Tiere in tiefer Narkose (Ketamin und Rompun; jeweils 150 mg/kg Körpergewicht) und die rektale Temperatur wurde mit Wärmelampen und Heizkissen bei etwa 37 °C gehalten. Nach einer Beobachtungszeit von 24 Stunden wurden die Tiere erneut narkotisiert, und die Gehirne wurden nach Perfusion präpariert. Referenzbeispiel 2
Bestimmung des Infarktvolumens
An den in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Vorderhirnen wurden kryo- statische Koronarschnitte mit einer Dicke von 20 μm im Abstand von 400 μm angefertigt und einer Silberfärbung unterzogen. Dazu wurden die Schnitte mit einer Silbernitrat/Lithiumcarbonat-Lösung 2 min imprägniert und mit einer Hydrochinon/Formaldehyd-Lösung 3 min entwickelt (Vogel, R. A. , Clin. Cardiol., II 34-9 (1999)). Die gefärbten Schnitte wurden direkt gescannt (MCID-M4 , 3,0; Imaging Res. Inc.). Das Infarktvolumen wurde bestimmt, indem man die gescannten Bereiche mit erheblicher Blässe (korrigiert um Hirnödem x Schnittdicke) mit Hilfe der digitalen Planimetrie numerisch in- tegrierte (Swanson, R. A. et al, Stroke 21, 322-7 (1990); Lin, T. N., et al., Stroke 24, 117-21 (1993)). Sämtliche Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Signifikanz wurde mit dem Mann-Whitney-Test bestimmt. Karten über die Häufigkeitsverteilung von Infarkten wurden erstellt (Belayev, L. et al., Neuroreport 8, 55-9 (1996); Schneider, A. et al., Biochemistry 38, 3549-58 (1999)), indem die jeweiligen Schnitte einer Serie gescannt wurden, und die Infarkte abgegrenzt und auf eine Maske projeziert wurden. Die Mittelung erfolgte mit Scion-Image b 3.b.
Referenzbeispiel 3
Immunhistochemie
Koronare kryostatische Schnitte (20 μm) aus Referenzbeispiel 2 wurden 48-72 h entweder mit dem monoklonalen anti-GD3-IgG3-Mau- santikörper (R24) oder mit den polyklonalen Antikörpern anti- NF200, (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), anti-GFAP (Chemicon, Kanada) oder anti-Cytochrom c (H-104; Santa Cruz, Kanada) inkubiert. Die bildliche Darstellung der Immunreaktivitäten erfolgte entweder mit einem monoklonalen oder einem polyklonalen Cy3/FITC- markierten Zweitantikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) oder mit der herkömmlichen Avidin-Biotin-Komplexierungsmethode (Vecta- stain, Vector Lab, USA) .
Referenzbeispiel 4
Transferase-dUTPnick-Endmarkierung (TUNEL)
Kryostatische Frontalschnitte (25 μm) wurden mit der Transferase dUTPnick-Endmarkierungstechnik behandelt (Gavrieli, Y. et al., J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992)). Zellkerne wurden von Proteinen durch Inkubation von PBS mit 1 % Triton (PBST) bei 4 °C über Nacht abgelöst. Endogene Peroxidasen wurden inaktiviert, indem man die Schnitte mit 2 % H202 5 min bei Raumtemperatur bedeckte. Die Schnitte wurden mit 0,3 μl Flu-dUTP (Amersham, Braunschweig, Deutschland), 1 μl terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT), 5 10 μl 5x TdT-Puffer, 2 μl CoCl2 (Boehringer, Mannheim, Deutschland), 0,3 μl dATP (Perkin Eimer) und 36,4 μl destilliertem H20 in einer Feuchtkammer 90 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem man die Objektträger in TE-Puffer 10 min bei Raumtemperatur überführte. Normale Zellkerne, die lediglich nichtsi-
10 gnifikante Mengen an DNA-3 '-OH-Enden enthielten, zeigten mit dieser Technik keine Färbung. Zellen mit nekrotischer Morphologie und nachweisbaren Konzentrationen an DNA-Enden zeigten eine im Vergleich zu apoptotischen Zellkernen diffusere Markierung. Als Kontrolle wurden Schnitte inkubiert, entweder ohne Enzym oder
15 ohne Nukleotid.
Referenzbeispiel 5
Zellkultur
20
Aus transgenen Mäusen, deren Saure Sphingomyelinase inaktiviert wurde (ASM-/_; Hirunouchi, K., et al., Nature Genetics 10, 288-294 (1995)), und Wildtyp-Mäusen derselben Generation (ASM+ +) wurden Neuronen gewonnen. Primäre Neuronen-Kulturen wurden aus 15- bis
25 17-tägigen Mausföten, wie zuvor von Dawson, T. M. , et al, Ann. neurol. 30, 843-6 (1991) beschrieben, präpariert. Demnach wurden nach Trituration in MEM-Medium mit 20 % Pferdeserum, 25 mM Glukose und 2 mM L-Glutamin (allesamt von Gibco/Life Technologies, Paisley, Schottland) und anschließender 30-minütiger Verdauung in
30 0,025 Trypsin/Kochsalz-Lösung kortikale Neuronen erhalten. Die Zellen wurden auf Polyornithin-beschichtete 24-Well-Platten aufgetragen (Sigma, Deisenhofen, Deutschland). Nach 4 Tagen wurden die Zellen weitere 4 Tage mit Cytosin-Arabinosid (5 μM) behandelt, um die Proliferation nichtneuraler Zellen zu inhibieren. Danach
35 wurden die Zellkulturen in MEM, 10 % Pferdeserum, 25 mM Glukose und 2 mM L-Glutamin in einem Feuchtinkubator bei 8 % C02 und 37 °C gehalten. Man ließ die Neuronen wenigstens 8 Tage in Kultur reifen, bevor sie zum Experiment herangezogen wurden. Der Anteil an Gliazellen in der Kultur wurde mit einem gegen Gliales Fibrillä-
40 res Saures Protein (glial-fibrilary-acidic protein; GFAP) gerichteten Antikörper zu weniger als 10 % bestimmt.
45 Referenzbeispiel 6
Sauerstoff-Glukose-Mangel in vitro
5 Zur Erzeugung eines kombinierten Sauerstoff-Glukose-Mangels ging man in an sich bekannter Weise vor (Kaku, D. A. , et al . , Brain Res. 554:344-7; Monyer, H. et al., Neuron 8, 967-73 (1992); mit leichten Veränderungen) . Das Kulturmedium wurde durch MEM, 1 % Pferdeserum und 2 mM L-Glutamin ersetzt. Die Kulturen wurden 6 h 0 in einer anaeroben Kammer gehalten, die bei 37 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit ein Gasgemisch aus 5 % H2, 85 % N2 und 5 % C0 enthielt. Der Sauerstoff-Glukose-Mangel wurde aufgehoben, indem man die Kulturen aus der Kammer nahm und Pferdeserum und Glukose bis zu einer Endkonzentration von 10 % bzw. 25 mM zugab. Die Kulturen 5 wurden dann weitere 3 h, 18 h oder 24 h in einen Feuchtinkubator zurückgegeben, der 8 % C02 und atmosphärischen Sauerstoff enthielt. Zur Inhibition der GD3-Synthese wurden die Kulturen mit 80 nM GD3-Synthase-Antisense-01igodesoxynukleotiden (SEQ ID NO:2) und einem per Zufall zusammengestellten Oligodesoxynukleotid (SEQ 0 ID NO:3) 48 h vor der Induzierung des Sauerstoff-Glukose-Mangels inkubiert. Bovines Hirn-GD3 wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
Der prozentuale Anteil an abgestorbenen Zellen wurde durch Try- 5 pan-Blau-Exklusion bestimmt und als prozentualer Anteil des spezifischen Absterbens ausgedrückt. Dieses wurde wie folgt berechnet:
% spezifisches Absterben = (gefundenes Absterben - spontanes Ab- 0 sterben) /( 100 - spontanes Absterben) x 100
Referenzbeispiel 7
Dünnschichtchromatographie (GD3-Analyse)
35
GD3 wurde, wie zuvor von De Maria, R. , et al., Science 277, 1652-5 (1997) beschrieben, bestimmt. So wurden Gewebe und Zellen mit zwei Gefrier-Tau-Zyklen aufgebrochen. Die polaren Lipide wurden extrahiert, und die Ganglioside wurden auf Silicagel-Platten
40 60 für die Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC)
(Merck, Darmstadt, Deutschland) chromatographiert, getrocknet und mit Resorcinol sichtbar gemacht. Gleiche Mengen an Neuraminsäure wurden mit dem Thiobarbitursäure-Assay gefunden (Warren, L., J. Biol. Chem. 234, 1871-1975 (1959)). Zur Immunfärbung wurden die
45 Platten mit 0,5 % Polyisobutylmethacrylat in Hexan plastifiziert, getrocknet, 1 h mit dem gegen GD3 gerichteten monoklonalen Antikörper R24 (IgG3) inkubiert und über die Immunperoxidase-Färbung abgelesen. Die Banden wurden dann gescannt und densitometrisch mit dem AIDA-1000/lB-Bildanalysegerät (Raytest Isotopenmessge- räte, Straubenhardt , Deutschland) analysiert.
Beispiel 1
GD3-Spiegel in Neuronen nach induzierter Ischämie
Ein 6-stündiger Sauerstoff-Glukose-Mangel und zunehmende Reperfu- sionsdauern gemäß Referenzbeispiel 6 induzierten bis zu 48 % spezifisches Absterben von primären Neuronen (Fig. la) . Mittels quantitativer Dünnschichtchromatographie gemäß Referenzbeispiel 7 konnte gezeigt werden, dass dieser Zuwachs des Neuronensterbens begleitet war von einem Anstieg der GD3-Spiegel (149,45 _t 3,00 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, n = 3; Fig. lb). Die gleiche Art der Analyse ergab für die ischämische Hemisphäre gemäß Referenzbeispiel 1 behandelter Mäuse einen 250 %-igen Anstieg der GD3-Spiegel im Vergleich zur nichtischämischen Hemisphäre (252,03 ±4,81 %, n = 3; Fig. lb) .
Die Verteilung der GD3-Akkumulation innerhalb des ischämischen Gehirns konnte immunhistochemisch untersucht werden. Schon 4 h nach ACM-Verschluss wurde GD3 in dem lateralen Striatum und dem anliegenden Neokortex nachgewiesen. Die GD3-Akkumulation nahm bis zu 24 h nach Ischämie progressiv zu; GD3 wurde zu diesem Zeitpunkt in dem lateralen Striatum, ventrolateralen Thalamus, den CA1- und CA3-Hippocampus-Schichten und dem an die ischämische Lä- sion angrenzenden Kortex nachgewiesen. GD3 konnte weder in den Gehirnen scheinoperierter Tiere noch in den ohne den ersten Antikörper durchgeführten Kontrollfärbungen nachgewiesen werden.
Doppelmarkierungsuntersuchungen zeigten, dass nach 24-stündiger Reperfusion eine GD3-Neosynthese in der Hauptsache in Neuronen stattfindet. Darüber hinaus korrelierten ansteigende zelluläre Mengen an GD3 mit einer verstärkten mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c. Demnach wurde GD3 in apoptotischen Neuronen gefunden.
Beispiel 2
GD3 fördert das Neuronensterben
Kortikale neuronale Zellen wurden mit zunehmenden Dosen an GD3 behandelt. Das spezifische Neuronensterben nahm in Abhängigkeit von der Dosis zu, und zwar bis 80 % 24 h nach der Zugabe von 500 μM GD3 (Fig. 2a). Ein anderes Disialogangliosid GDla zeigte bei der höchsten verwendeten Dosis keinerlei Wirkung (Fig. 2a).
Die Zugabe von GD3-Synthase-Antisense-Oligodesoxynukleotiden, nicht aber die Zugabe einer zufällig zusammengestellten Sequenz der gleichen Nukleotide, 48 h vor der Induktion des Sauerstoff- Glukose-Mangels mit anschließender 24-stündiger Reperfusion gemäß Referenzbeispiel 6 führte zu einer Verminderung der Akkumulation von GD3 auf 55 % der Kontrollen (Fig. 2b). Diese Reduktion führte zu einer Verringerung der Mortalität in Antisense-behandelten
Kulturen auf 50 % des Wertes, der in denjenigen Kulturen gefunden wurde, die lediglich mit der per Zufall angeordneten Sequenz der Nukleotide der Antisense-Oligodesoxynukleotid-Sequenz behandelt worden waren (Fig. 2c).
Beispiel 3
Keine Abhängigkeit von der Aktivität der Sauren Sphingomyelinase
Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen ASM_/_ und
ASM+/+-Mäusen im Hinblick auf das gemäß Referenzbeispiel 6 beurteilte spezifische Neuronensterben festgestellt werden (31,09 + 11,95 bzw 38,28 + 10,28 % spezifisches Absterben; Fig. 3a). Dementsprechend akkumulierte GD3 in annähernd gleichen Mengen nach Sauerstoff-Glukose-Mangel/Reperfusion sowohl in ASM-/-- als auch in ASM+/+-Neuronen (689,43 + 13,53 bzw. 647,53 + 67,21 mg GD3/μmol Neuraminsäure; Fig. 3b).
Beispiel 4
Die Inhibierung der GD3-Synthese bewahrt vor Schäden durch Schlaganfall
Kurz nach Induktion einer transienten fokalen Ischämie gemäß Referenzbeispiel 1 wurden die Tiere mit dem Glucosylceramidsyn- thase-Inhibitor D-threo-l-Phenyl-2-decanoylamino-3-morpho- lino-1-propanol (D-PDMP) behandelt. Es wurde eine einzige i.p.- Injektion von D-PDMP (100 mg/kg Körpergewicht; Biological Techno- logy, London, GB) zusammen mit Piperonylbutoxid (400 mg/kg Körpergewicht; Fluka, Deisenhofen, Deutschland) 15 min nach Ver- schluss der ACM verabreicht. Die dünnschichtchromatographische Bestimmung von GD3 ergab für diese Tiere einen lediglich 10 %-igen Zuwachs von GD3 auf der ischämischen Seite im Vergleich zur nichtischämischen Seite, während in unbehandelten Tieren ein 250 %-iger Anstieg nachgewiesen wurde (Fig. 4a).

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung wenigstens^ eines GD3-Synthase-Inhibitors zur Her- Stellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung neuropathologischer Störungen und damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von cerebraler Ischämie.
3. Verwendung nach Anspruch 2 zur Behandlung von Schlaganfall, vorzugsweise akutem Schlaganfall.
4. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von traumatischen Hirn- und Rückenmarksschädigungen.
5. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung neurodegenerativer Störungen.
6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Behandlung von Demenz , insbesondere Alzheimer Demenz, Parkinson, ALS, Multipler Sklerose.
7. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung neuropathologischer Störungen, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst aus einer Vielzahl von Substanzen wenigstens einen GD3-Synthase-Inhibitor auswählt und diesen zur Herstellung des Mittels verwendet.
EP00991582A 1999-12-06 2000-12-05 Gd3-synthase-inhibitoren zur behandlung neuropathologischer störungen Withdrawn EP1409019A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19958684 1999-12-06
DE19958684A DE19958684A1 (de) 1999-12-06 1999-12-06 Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen und Verfahren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren
PCT/EP2000/012224 WO2001039804A2 (de) 1999-12-06 2000-12-05 Gd3-synthase-inhibitoren zur behandlung neuropathologischer störungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1409019A2 true EP1409019A2 (de) 2004-04-21

Family

ID=7931551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP00991582A Withdrawn EP1409019A2 (de) 1999-12-06 2000-12-05 Gd3-synthase-inhibitoren zur behandlung neuropathologischer störungen

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20040092438A1 (de)
EP (1) EP1409019A2 (de)
AU (1) AU3362901A (de)
DE (1) DE19958684A1 (de)
WO (1) WO2001039804A2 (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090111812A1 (en) * 2004-06-14 2009-04-30 Musc Foundation For Research Development Methods for treating inflammatory disorders
US7745400B2 (en) * 2005-10-14 2010-06-29 Gregg Feinerman Prevention and treatment of ocular side effects with a cyclosporin
GB0614947D0 (en) * 2006-07-27 2006-09-06 Isis Innovation Epitope reduction therapy
EP4326903A1 (de) * 2021-04-23 2024-02-28 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von krankheiten im zusammenhang mit zellalterungsansammlung
JP2024541501A (ja) 2021-11-25 2024-11-08 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ Ｃｄ９５ポリペプチド

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59222424A (ja) * 1983-06-01 1984-12-14 Katsutaka Nagai 神経障害疾患治療剤
AU6079199A (en) * 1998-08-07 2000-02-28 Richard R. Schmidt Sialyltransferase inhibitors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0139804A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU3362901A (en) 2001-06-12
WO2001039804A3 (de) 2002-04-11
WO2001039804A2 (de) 2001-06-07
US20040092438A1 (en) 2004-05-13
DE19958684A1 (de) 2001-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Polysaccharides from Lycium barbarum ameliorate amyloid pathology and cognitive functions in APP/PS1 transgenic mice
Zhang et al. Oligodendrogenesis after cerebral ischemia
Hur et al. Neurite outgrowth induced by spicatoside A, a steroidal saponin, via the tyrosine kinase A receptor pathway
Miller Jr et al. Sphingosine toxicity in EAE and MS: evidence for ceramide generation via serine-palmitoyltransferase activation
Takeuchi et al. Stimulation of nerve growth factor synthesis/secretion by 1, 4-benzoquinone and its derivatives in cultured mouse astroglial cells
JP6951449B2 (ja) （＋）−２−ボルネオールの、スフィンゴシンキナーゼ−１および／又はｂｄｎｆの発現の上方制御を促進する医薬の調製における使用
Mena et al. Effects of dibutyryl cyclic AMP and retinoic acid on the differentiation of dopamine neurons: prevention of cell death by dibutyryl cyclic AMP
Kaechi et al. 4-Methylcatechol, an inducer of nerve growth factor synthesis, enhances peripheral nerve regeneration across nerve gaps.
CN121287846A (zh) 促进神经元新生的医药组合物以及利用天麻萃取物或腺苷类似物促进神经元新生的方法
EP1409019A2 (de) Gd3-synthase-inhibitoren zur behandlung neuropathologischer störungen
Yim et al. Differentiation of oligodendrocytes cultured from developing rat brain is enhanced by exogenous GM3 ganglioside
EP0786004A1 (de) Klonierung, expression und charakterisierung einer neuen form der phosphatidylinositol-3-kinase
Cannella et al. Derivatives of ganglioside GM1 as neuronotrophic agents: comparison of in vivo and in vitro effects
Bochelen et al. 7β-hydroxycholesterol and 7β-hydroxycholesteryl-3-esters reduce the extent of reactive gliosis caused by an electrolytic lesion in rat brain
Stull et al. GM1 ganglioside partially rescues cultured dopaminergic neurons from MPP+-induced damage: dependence on initial damage and time of treatment
Lu et al. Radiation‐induced apoptosis of oligodendrocytes and its association with increased ceramide and down‐regulated protein kinase B/Akt activity
Lin et al. Synthesis, biological activity evaluation and mechanism analysis of new ganglioside GM3 derivatives as potential agents for nervous functional recovery
Obinata et al. Induction of epidermal transglutaminase by hydrocortisone in chick embryonic skin
Belmonte et al. Developmental expression of muscarinic acetylcholine receptors in chick retina: selective induction of M2 muscarinic receptor expression in ovo by a factor secreted by Müller glial cells
Tipbunjong et al. Diarylheptanoid 1-(4-hydroxyphenyl)-7-phenyl-(6 E)-6-hepten-3-one enhances C2C12 myoblast differentiation by targeting membrane estrogen receptors and activates Akt-mTOR and p38 MAPK-NF-κB signaling axes
Sobue et al. Gangliosides modulate Schwann cell proliferation and morphology
Funke et al. Tyrosine phosphorylation is increased in the rat hippocampus during the status epilepticus induced by pilocarpine
Dasgupta et al. Tumor necrosis factor‐α up‐regulates glucuronosyltransferase gene expression in human brain endothelial cells and promotes T‐cell adhesion
EP1229921A1 (de) Heparanase-inhibitoren zur behandlung von herzinsuffizienz
EP0998294A1 (de) Gm3 ganglioside induzierte apoptose der neuralen zellen

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20020709

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO SI

17Q First examination report despatched

Effective date: 20041213

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20050426