DE19958684A1 - Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen und Verfahren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neurophathologischer Störungen, insbesondere cerebraler Ischämie, traumatischer Hirn- und Rückenmarkschädigungen und neurodegenerativer Störungen, sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen, und ein Verfahren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren, das insbesondere als Primär-Screening ausgelegt werden kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von GD3-Syn­ thase-Inhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen, insbesondere cerebraler Ischämie, traumatischer Hirn- und Rücken­ marksschädigungen und neurodegenerativer Störungen sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome, und Fehlfunktionen, und ein Verfahren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren, das insbesondere als Primär-Screening ausgelegt werden kann.

Sialinsäuren (kurz: Sia) spielen eine wichtige Rolle bei inter­ zellulären Transmissionsvorgängen, cytoplasmatischen Wechselwir­ kungen und zellulärer Adhäsion. Man findet sie am Ende der Koh­ lenwasserstoffgruppen von Glycoproteinen und Glycolipiden. Sia­ linsäuren werden im Rahmen posttranslationaler Vorgänge enzyma­ tisch in diese Positionen eingeführt. Sia-α-2,3-Gal und Sia-α-2,8-Sia stellen häufig in Gangliosiden beobachtete Sequenztypen dar.

Sialinsäuren übertragende Enzyme sind Glycosyltransferasen und werden als Sialyltransferasen bezeichnet. Angesichts der Vielzahl bisher bekannter Sialyloligosaccharid-Strukturen, wird angenom­ men, dass wenigstens 12 verschiedene Sialyltransferasen an deren Synthese beteiligt sind.

Ausgehend von einer aus humanen Melanomzellen isolierten mRNA be­ schreibt die EP 0 654 529 eine α-2,8-Sialyltransferase, deren physiologische Aktivität bei der Erzeugung von Gangliosid GD3 nützlich ist.

In der EP 0 736 602 wurde mittels degenerierter, auf konservierte Sialyltransferase-Domänen (Sialyl-Motive L und S) gerichteter Oligonukleotid-Primer die Gesamt-mRNA aus Mäusehirn einer PCR un­ terworfen, wodurch eine weitere α-2,8-Sialyltransferase, dort ST8SiaIII genannt, identifiziert wurde. Es handelt sich ebenfalls um eine GD3-Synthase, genauer eine Sia-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc- α-2,8-Sialyltransferase aus Mäusehirn. Es wird die Verwendung des Enzyms zur Spermienreifung, Prävention von Krebsmetastasen, Inhi­ bition entzündlicher Vorgänge und Reaktivierung von Nervengewebe vorgeschlagen.

Erwähnt werden auch weitere α-2,8-Sialyltransferasen, und zwar ST8SiaI (Human, Maus) und ST8SiaII (STX) mit N-Glycan-α-2,8-Sia­ lyltransferase-Aktivität.

Ganglioside sind amphiphile Sialinsäure-haltige Glycosphingoli­ pide. Ihnen werden Signal übertragende Eigenschaften zugeschrie­ ben. Bei Entwicklung, Alterung und Erkrankung des zentralen Ner­ vensystems beobachtet man quantitative und qualitative Verände­ rungen von Gangliosiden. Im Allgemeinen ist ihre Konzentration in der grauen Hirnsubstanz größer als in der weißen bzw. in periphe­ rem Nervengewebe. Auch Neuronen zeigen in der Regel höhere Kon­ zentrationen an Gangliosiden als Astroglia. Ganglioside finden sich hauptsächlich in der Plasmamembran und in niedrigeren Kon­ zentrationen am endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, den Lysosomen und der Kernmembran. Im Gehirn eines Erwachsenen machen die Ganglioside GM1, GD1a, GD1b und GT1b 80-90% des ge­ samten Gangliosidgehalts aus, während GD3, eine Hauptkomponente des sich entwickelnden Gehirns, nur in Spuren vorhanden ist. In­ teressanterweise nimmt der GD3-Spiegel bei pathologischen Zustän­ den, beispielsweise astrocytischen Vernarbungen, Creutzfeld-Jakob und Multipler Sklerose, zu. Darüber hinaus ist über eine Abnahme des Gesamtgehalts an Hirngangliosiden bei neurologischen Erkran­ kungen, beispielsweise frühen Stadien von Alzheimer, berichtet worden. Eine Behandlung früher Stadien von Alzheimer und weiterer neurodegenerativer Erkrankungen, wie Parkinson, Rückenmarkstrauma und zumindest transientem Schlaganfall, mit GM1 hat sich wiederum als günstig erwiesen.

Die Ganglioside sollen in diesem Zusammenhang endogene regenerie­ rende Faktoren darstellen und deshalb mit Blick auf eine Behand­ lung neurodegenerativer Störungen wie Alzheimer und akuter Hirnläsionen wie cerebraler Ischämie erforscht werden, vgl. Kra­ cun, I. et al., Periodicum Biologorum, Vol. 97, Nr. 2, 113-118 (1995).

Andererseits werden Ganglioside auch als Krebsantigene beschrie­ ben. Beispielsweise wird in der EP 0 654 529 über eine Überex­ pression von GD3 in neuroectodermalen Turmoren, z. B. malignen Tu­ moren, berichtet. Deshalb soll GD3 bei der Anhaftung von Krebs­ zellen an extrazelluläre Substrate beteiligt sein.

Kensuke Kawai et al. beschrieben kürzlich in Psychiatry and Cli­ nical Neuroscience, 53, 79-82 (1999) den Nachweis von GD3 im Zy­ toplasma reaktiver Astrocyten (Gliazellen), und zwar an Gehrin­ schnitten, die Menschen mit Creutzfeld-Jakob bzw. alten cerebra­ len Infarkten per Autopsie entnommen worden waren. Astrocyten sollen aktiv an der Wiederherstellung von ZNS-Läsionen beteiligt sein. Diesem als reaktive Gliosis bekannten Vorgang wird regene­ rative Funktion zugeschrieben. Die Astrocyten proliferieren als Reaktion auf den neuronalen Zellverlust. Dementsprechend wurden Konzentrationsanstiege von GD3 und GM3 in Astrozyten für die Spätphase derartiger Erkrankungszustände berichtet, d. h. viele Stunden bzw. Tage nach Eintritt ischämischer Ereignisse und erst im Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen.

Obwohl Ganglioside im allgemein als neuroprotektiv betrachtet werden, z. B. GM1 in Modellen für Schlaganfall, Alzheimer, Parkin­ son etc., berichteten Testi et al. in Science, 227, 1652-1655 (1997), daß in Lymphozyten zu Beginn der CD95-induzierten Apop­ tose zelluläres GD3 ansteigt, und eine Apoptose durch Inhibition der GD3-Synthese mittels Antisense-Oligonukleotiden verhindert werden kann. Weiteren Untersuchungen an Hepatomzellen und iso­ lierten Mitochondrien zufolge induziert GD3 die Öffnung mitochon­ drialer Permeabilitätstransitionsporen und könnte über diesen Me­ chanismus am Zelltod beteiligt sein, vgl. Scorrano L. et al., J. Biol. Chem., 274, 22581-22585 (1999) bzw. Kristal, B. S. und Brown, A. M., J. Biol. Chem., 274, 23169-23175 (1999).

Im Gegensatz zu obigen an Lymphozyten oder Hepatomzellen erhalten Ergebnissen wurde in anderen Fällen berichtet, daß beispielsweise während einer experimentell induzierten cerebralen fokalen Ischä­ mie nach Okklusion der mittleren Cerebralarterie die Enzymaktivi­ tät stetig abnahm (Geng Fuqiang et al., Acta Academiae Medicinae Shanghai, Vol. 22, Nr. 4, 295-298 (1995)).

ZNS-Erkrankung betreffen heutzutage große Bevölkerungsteile. Ins­ besondere aufgrund der Zunahme älterer Menschen steigen die Pa­ tientenzahlen ständig. Neuropathologische Zustände wie cerebrale Ischämie, Schlaganfall, und neudegenerative Erkrankungen, z. B. Demenz, insbesondere Alzheimer Demenz, demyelinisierende Erkran­ kungen, insbesondere Multiple Sklerose, und Gehirntumore führen zu Schädigungen des Gehirns und den damit verbundenen neuronalen Defizite.

Insbesondere im Hinblick auf die Behandlung von Schlaganfall als häufigste lebensbedrohliche neurologische Erkrankung sind die Be­ mühungen groß, ein möglichst rasches Eintreffen eines betroffenen Patienten in der Klinik sicherzustellen. Allerdings sind die the­ rapeutischen Möglichkeiten begrenzt, ungeachtet der durch rt-PA und Aspirin-Behandlung erzielten Teilerfolge.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Anwendungen einer Modulation der GD3-Synthase-Aktivität bereitzustellen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Inhibition der GD3-Synthase-Aktivität eine Behandlung neuropathologischer Stö­ rungen sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen ermöglicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neuropathologischer Störungen sowie damit zusammenhängender Anzeichen, Symptome und Fehlfunktionen.

Unter neuropathologischen Störungen versteht man erfindungsgemäß Störungen, die von neurologischen Defiziten begleitet sind, d. h. einen durch neurologische Ausfallerscheinungen gekennzeichneten Zustand.

Dieser Zustand kann vorübergehend, fortschreitend oder persistie­ rend bestehen.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Behandlung cerebraler Ischämie, traumatischer Hirn- und Rückenmarksschädigungen, also insbeson­ dere Hirn- und Rückenmarkstrauma, sowie neurodegenerativer Stö­ rungen, vor allem von Demenz, insbesondere Alzheimer Demenz, Par­ kinson, ALS (amyotropische Lateralsklerose), Multipler Sklerose.

Insbesondere bevorzugt ist die Behandlung neuropathologischer Störungen, die mit cerebraler Ischämie in Zusammenhang stehen und insbesondere diejenigen, die darauf zurückzuführen sind. Zu nen­ nen ist hier vor allem der Schlaganfall (Synonym: Apoplexia cere­ bri, cerebraler oder apoplektischer Insult, Gehirnschlag). Erfin­ dungsgemäß behandelbar sind transitorisch-ischämische Attacken, reversible ischämische neurologische Defizite, prolongierte re­ versible ischämische neurologische Defizite, partiell reversible ischämische neurologische Symptomatiken und auch persistierende komplette Hirninfarkte. Besonders vorteilhaft ist erfindungsgemäß die Behandlung akuter Formen.

Den erfindungsgemäß bevorzugt behandelten Formen neuropathologi­ scher Störungen liegen eine oder mehrere dar nachfolgend aufge­ zählten Veränderungen von Nervengeweben zugrunde: Degeneration oder Absterben von Neuronen, insbesondere der Ganglienzellen, z. B. Tigrolyse, Kernmembranunschärfe, Zellschrumpfung, Zytoplas­ mavakuolisierung und -inkrustation, Parenchymnekrosen des Ge­ hirns, Hirnödeme, durch Sauerstoffmangel verursachte Veränderun­ gen von Neuronen, Atrophie, morphologische Veränderungen, wie De­ myelinisierungen, insbesondere ein Markscheidenzerfall, perivas­ kuläre Infiltrate, gliöse Proliferation und/oder Glianarben; De­ generation der Substantia nigra.

Die erfindungsgemäß zu behandelnde Indikation ist häufig gekenn­ zeichnet durch eine progressive Entwicklung, d. h. die vorstehend beschriebenen Zustände verändern sich im Laufe der Zeit, in der Regel nimmt der Schweregrad zu und gegebenenfalls können Zustände ineinander übergehen oder weitere Zustände zu bereits bestehenden Zuständen hinzutreten.

Durch die erfindungsgemäße Behandlung neuropathologischer Störun­ gen bzw. den ihr zugrundeliegenden Zuständen lassen sich eine Reihe weiterer Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen behan­ deln, die mit den neuropathologischen Störungen zusammenhängen, d. h. insbesondere die oben beschriebenen Erkrankungszustände be­ gleiten. Hierzu gehören beispielsweise Schocklunge; Hirnnerven­ ausfälle, z. B. retrobulbäre Neuritis, Augenmuskellähmungen, skandierende Sprache, spastische Lähmungen, Kleinhirnsymptome, Sensibilitäts-, Blasen- und Mastdarmstörungen, Euphorie, Demenz; Hypo- und Akinese, fehlende Mitbewegung, kleinschrittiger Gang, Beugehaltung von Rumpf und Gliedern, Pro-, Retro- und Lateropul­ sion, Tremor, Mimikarmut, monotone Sprache, Depressionen, Apa­ thie, labile oder starre Affektivität, erschwerte Spontaneität und Entschlußkraft, verlangsamtes Denken, verarmte Assoziationsfä­ higkeit; Muskelatrophie.

Eine Behandlung im erfindungsgemäßen Sinne umfaßt nicht nur die Behandlung akuter oder chronischer Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen, sondern auch eine vorbeugende Behandlung (Präven­ tion).

Der Begriff "GD3-Synthase-Inhibitor" beschreibt Substanzen, wel­ che die enzymatische Aktivität von GD3-Synthasen oder deren Ex­ pression inhibieren. Unter Enzym-Inhibition wird in diesem Zusam­ menhang eine Verminderung der Enzymaktivität, vor allem der Akti­ vität als Glycosyltransferase, Sialyltransferase, α-2,8-Sialyl­ transferase und insbesondere Sia-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc- α-2,8-Sialyltransferase (EC 2.4.99.8) verstanden. Die GD3-Syn­ thase-Aktivität führt beispielsweise zur Umsetzung eines Glyco­ syl-Donors mit einem Glycosyl-Acceptor zu einem Oligosaccharid- Produkt. Dabei wird in der Regel ein Monosaccharid von dem Glyco­ syl-Donor auf den Glycosyl-Acceptor übertragen. Bei dem Glycosyl- Donor handelt es sich gewöhnlicherweise um Nukleotide, über deren Phosphatgruppen ein Monosaccharid gebunden ist. So werden bei­ spielsweise Glukose (Glc), Galactose (Gal), N-Acetylglucosamin (GlcNAc), N-Acetylgalactosamin (GalNAc), Xylose (Xyl) und Gluco­ ronsäure (GlcA) durch Uridindiphosphat-Donatoren, Fucose (Fuc) und Mannose (Man) durch Guanosindiphosphat-Donatoren und Sialin­ säure (N-Acetylneuraminsäure, NeuAc, NANA) durch Cytidinmono­ phosphat-Donatoren übertragen. Im Sinne der Sialyltransferase-Ak­ tivität ist CMP-NeuAc als Glycosyl-Donor bevorzugt. Bei den Gly­ cosyl-Acceptoren handelt es sich in der Regel um Glycoproteine, Oligosaccharide oder Glycolipide. Die Sialyltransferase-Aktivität der GD3-Synthase ist vor allem auf solche Glycosyl-Acceptoren ge­ richtet, die einen endständigen β-Gal- oder Sialinsäurerest auf­ weisen. Im Sinne der α-2,8-Sialyltransferase-Aktivität der GD3-Synthase wird ein Sialinsäurerest über eine α-2,8-Verknüpfung an einen endständigen Sialinsäurerest gebunden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, die Aktivität der GD3-Synthase zu inhibieren, mit der ein Sialinsäurerest auf die Sequenz Sia­ α-2,3-Gal-β-1,4-GleNAc übertragen wird. Ganz besonders bevorzugt ist die Übertragung eines Sialinsäurerestes auf das Gangliosid GM3 unter Ausbildung einer α-2,8-Verknüpfung, nämlich die Umset­ zung von GM3 zu GD3. (GD3 = II³(NeuAc-α-2,8-NeuAc)LacCer).

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Inhibierung von Säuger-GD3-Syn­ thase und vor allem von humaner GD3-Synthase, insbesondere der GD3-Synthase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 sowie homolo­ ger Sequenzen davon. Es handelt sich in der Regel um transmebrane Proteine vom Typ II (etwa 40 kD), die im frühen Golgi ansässig sind und deren katalytische Domäne in der Regel durch COOH-termi­ nales Sialyl-Motiv 5 gekennzeichent ist.

Erfindungsgemäße Inhibitoren binden in der Regel an GD3-Synthasen bzw. GD3-Synthase kodierende Nukleinsäuren, z. B. DNA oder mRNA. Unter Bindung versteht man jede molekulare Wechselwirkung zwi­ schen Inhibitor und Enzym bzw. Nukleinsäure, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Dies sind in der Regel klassische Wechselwirkungen, zu denen elektrostatische Kräfte, van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken-Bindungen, hydrophobe Bindungen, oder metallkomplexartige koordinative Bindungen gehören. Zusätz­ lich zu den vorstehend genannten, reversiblen molekularen Wech­ selwirkungen können auch irreversible Wechselwirkungen zwischen Inhibitor und Enzym in Betracht kommen, z. B. kovalente Bindungen.

In der Regel binden Enzym-Inhibitoren im Bereich der oder einer der aktiven Domänen von GD3-Synthase und konkurrieren mit anderen Substraten um deren Bindungsstelle (Kompetition). Dementsprechend versteht man unter kompetitiven Enzym-Inhibitoren diejenigen, die mit einem Vergleichssubstrat, im vorliegenden Fall Glycosyl-Dona­ toren und/oder Glycosyl-Akzeptoren, vorzugsweise UDP-NeuAc und/oder GM3, um die Bindung an GD3-Synthasen konkurrieren, d. h. die Bindung des einen behindert die Bindung des anderen. Wegen dieser Bindung an GD3-Synthase können kompetitive Enzym-Inhibitoren auch als GD3-Synthase-Substrat bezeichnet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Inhibitoren um Substrate, die im Vergleich zu dem oder den natürlichen Substraten der katalytischen Aktivität von GD3-Synthase nicht oder zumindest weniger zugänglich sind, d. h. sie werden nicht oder in vergleichsweise geringem Ausmaß durch GD3-Synthase umgesetzt. Ebenfalls brauchbar sind nicht-kom­ petitive Inhibitoren, die beispielsweise im wesentlichen irrever­ sibel an aktive Domänen, oder an anderer Stelle an die GD3-Syn­ thase binden und, beispielsweise über allosterische Effekte, Ein­ fluß auf die Enzymaktivität nehmen.

Zumindest für den Fall der kompetitiven Inhibition gilt der Grundsatz, daß die Verdrängung eines Substrats durch einen Inhi­ bitor mit abnehmender Bindungsaffinität des konkurrierenden Sub­ strats bzw. zunehmender Bindungsaffinität des Inhibitors zunimmt. Zweckmäßigerweise besitzen daher erfindungsgemäß brauchbare Inhi­ bitoren eine hohe Bindungsaffinität für GD3-Synthase. Eine derar­ tig günstig ausfallende Bindungsaffinität gestattet eine wirksame Verdrängung natürlich vorkommender Enzymsubstrate, d. h. vor allem von Glycosyl-Donatoren und/oder Glycosyl-Akzeptoren, beispiels­ weise von UDP-NeuAc und/oder GM3, wobei die erforderliche Konzen­ tration an Inhibitor zur Bindung einer bestimmten Menge dieses Inhibitors an das Enzym bzw. zur Verdrängung einer bestimmten Menge eines Substrats mit zunehmender Bindungsaffinität des Inhi­ bitors abnimmt. Im Hinblick auf die medizinische Anwendung werden daher Inhibitoren bevorzugt, deren Bindungsaffinität so groß ist, daß diese als Wirkstoff im Rahmen einer wirksamen medizinischen Behandlung in vertretbaren Mengen verabreicht werden können. Er­ findungsgemäße Inhibitoren werden daher vorzugsweise in Tagesdo­ sen von etwa 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht und insbesondere von etwa 0,1 bis 15 mg/kg Körpergewicht verabreicht.

Eine Möglichkeit, die Bindungsaffinität auszudrücken, bieten die oben angesprochenen Kompetitionsexperimente, mit denen man dieje­ nige Konzentration an Inhibitor ermittelt, die das Enzym im Hin­ blick auf die Umsetzung eines anderen Substrats zu 50% hemmt (IC₅₀-Werte). So läßt sich auch die kompetitive Hemmung der Bin­ dung von GD3-Synthase-Inhibitoren dahingehend auswerten, daß er­ findungsgemäß bevorzugte Inhibitoren halbmaximale Hemmkonstanten IC₅₀ in vitro von weniger als 10^-4 M, vorzugweise von weniger als 10^-5 M und insbesondere von weniger als 10^-6 M aufweisen.

Bei den Expressionsinhibitoren handelt es sich im weitesten Sinne um Substanzen, welche die Synthese der GD3-Synthase quantitativ oder qualitativ beeinträchtigen, insbesondere um Oligonukleotide oder geeignete synthetische Verbindungen, die beispielsweise im Sinne einer antisense-RNA oder -DNA, oder im Sinne der Triple-He­ lix-Technik wirken.

Beispielsweise ist bekannt, daß die Ganglioside GQ1b, GT1a und GT1b die GD3-Synthase-Aktivität hemmen.

Auch ist bekannt, daß Glycosylierungsinhibitoren wie Tunicamycin die Glycosylierung von GD3-Synthase beeinträchtigen, wodurch diese ihre enzymatische Aktivität verlieren kann.

Auch GD3-Synthase-spezifische Antikörper können als GD3-Synthase- Inhibitoren brauchbar sein. Es kann sich um polyklonale Antise­ ren, monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, wie F(ab), Fc, etc., chimäre und rekombinante Antikörper handeln. Die Herstel­ lung solcher Antikörper kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Als Immunogen kann man GD3-Synthase als solche oder antigene, in der Regel an übliche Trägerproteine gekoppelte Fragmente davon verwenden.

Niedermolekulare GD3-Synthase-Inhibitoren, meist synthetische Verbindungen, sind in vielerlei Hinsicht vorteilhaft brauchbar.

Auch Aptamere, das sind Nukleinsäuren, in der Regel Oligonukleo­ tide, mit ausreichender Affinität zu GD3-Synthase, können als In­ hibitoren Anwendung finden.

Die erfindungsgemäße Anwendung ist nicht auf die vorstehend ge­ nannten Inhibitoren beschränkt. Vielmehr kann jede Substanz, in deren Gegenwart die GD3-Synthase-Aktivität geringer ist als in deren Abwesenheit, erfindungsgemäß als GD3-Synthase-Inhibitor An­ wendung finden.

Zur Messung der GD3-Synthase-Aktivität sind Testsysteme bekannt, in denen erfindungsgemäß brauchbare GD3-Synthase-Inhibitoren als Testsubstanz zu einer Verringerung der GD3-Synthase-Aktivität führen. Diese Testsysteme beruhen in der Regel auf der Umsetzung markierter Substrate, wobei Donor- und /oder Akzeptor-Substrat markiert sein können, somit beispielsweise auf dem Einbau mar­ kierter Donor-Substrate, vor allem fluoreszenz-, z. B. fluorescein-, und radio-, z. B. ³⁵S-, ¹⁴C-, oder ³H-markierter Substrate, z. B. CMP-[¹⁴C]Neu5Ac (synonym: [¹⁴C]-markierte CMP-β-D-Sialin­ säure, CMP-NANA oder CMP-N-Acetylneuraminsäure; vgl. Yusuf et al., Eur. J. Biochem. 134(1): 47-54 (1983)), in Akzeptorsubstrate, in der Regel Glycoproteine, Oligosaccharide oder Glycolipide, vor allem solche mit der Sequenz Gal-β-1,4-GlcNAc und insbesondere Ganglioside, z. B. GM3, NeuAc-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc, wobei die Umsetzung, d. h. die Anfügung dieses Substrats an ein Akzeptorsub­ strat und der damit verbundene Aufbau bestimmter Glycoproteine bzw. Glycolipide anhand der Markierung verfolgt werden kann. Auch die Akzeptor-Substrate können markiert sein. Die Reaktionspro­ dukte können chromatographisch aufgetrennt werden, beispielsweise mittels Dünnschichtchromatographie, HPLC oder elektrophoretisch. Glycoproteine des Reaktionsgemisches können elektrophoretisch, z. B. mittels SDS-PAGE, aufgetrennt and angefärbt werden, z. B. mit Coomassie Brilliant Blue. Glycolipide des Reaktionsgemisches kön­ nen mit HPLC aufgetrennt and angefärbt werden, z. B. mit Orcinol/Schwefelsäure. So kann der Einbau der Markierung in bestimmte Glycoproteine bzw. Glycolipide quantifiziert werden.

Betrifft die Inhibition die Expression der GD3-Synthase, so kann Art und Menge der exprimierten GD3-Synthase immunologisch, bei­ spielsweise mit gegen GD3-Synthase gerichtetem Antikörper R24 oder mit Antikörpern gegen gegebenenfalls coexprimierte Signal- oder Trägerpeptide, beispielsweise Influenzavirus-Hämagglutinin-Nonapeptid, oder über den Einbau von Markierungen in GD3-Syn­ thase, beispielweise [2-³H]-markierter Mannose erfolgen.

Die Substrate können auf biologischem Wege erhalten oder auf che­ mischem Wege synthetisiert werden. CMP-5-Fluoresceinyl-Sialin­ säure und [¹⁴C]-markierte CMP-Sialinsäure sind kommerziell erhält­ lich (z. B. Calbiochem bzw. Amersham). Das gleiche gilt für GM3 und Pyren-markiertes GM3 (z. B. Sigma). Es kann von Vorteil sein, solche Substrate an einen festen Träger zu koppeln, was den Nach­ weis freigesetzter Fragmente erleichtert. Zu diesem Zweck kann man die in diesem Bereich übliche Kopplungschemie anwenden.

Die zu Tests verwendete GD3-Synthase kann natürlichen oder rekom­ binanten Ursprungs sein. Beispielsweise kann man Golgi-Vesikel z. B. aus Rattenlebern isolieren und die GD3-Synthase-Aktivität in den daraus erhaltenen Homogenisaten bestimmen. Sie kann auch mit den in WO 94/23020 oder von Martina et al. in J. Biol. Chem. 273(6): 3725-3731 (1998) beschriebenen Expressionssystemen rekom­ binant hergestellt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfah­ ren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren, wobei man die Aktivität von GD3-Synthase in Gegenwart und in Abwesenheit wenigstens einer Testsubstanz bestimmt.

Die vorstehend beschriebenen und weitere in ähnlicher Weise geei­ gnete Testsysteme können die Grundlage bilden für in vitro-Scree­ ning-Verfahren, vorzugsweise zum primären Screening, mit denen man aus einer Vielzahl verschiedener Substanzen diejenigen ausle­ sen kann, die im Hinblick auf die erfindungsgemäße Anwendung brauchbar sind. Beispielsweise können mittels kombinatorischer Chemie umfangreiche Stoffbanken angelegt werden, die Myriaden po­ tentieller Wirkstoffe umfassen. Das Durchmustern kombinatorischer Substanzbibliotheken nach Stoffen mit gewünschter Aktivität ist automatisierbar. Screening-Roboter dienen der effizienten Auswer­ tung der vorzugsweise auf Mikrotiterplatten angeordneten Einzel­ assays.

Eine besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist der im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte Scintillation Proximity Assay, kurz SPA genannt. Kits und Kompo­ nenten zur Durchführung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, beispielweise bei Amersham Pharmacia Biotech. Für enzyma­ tische Testanwendungen werden im Prinzip solubilisierte oder mem­ brangebundene Substrate auf Scintillationssubstanz enthaltenden, kleinen Fluoromikrosphären immobilisiert. Je nach Art der zu te­ stenden enzymatischen Aktivität ist das Substrat radioaktiv mar­ kiert und die Scintillationssubstanz wird solange zur Lichtemis­ sion angeregt, wie die räumliche Nähe zwischen Scintillationssub­ stanz und Radiomarkierung gegeben ist, oder es wird die radioak­ tive Markierung in das immobilisierte Substrat eben durch die zu messende Enzymaktivität eingefügt und als Folge die Scintillati­ onssubstanz zur Lichtemission angeregt. So ergeben sich Testfor­ mate, bei denen eine abnehmende bzw. zunehmende Signalintensität gemessen wird.

Eine weitere besonders effektive Technologie zur Durchführung derartiger Verfahren ist die im Bereich des Wirkstoffscreenings bekannte FlashPlate-Technologie. Kits und Komponenten zur Durch­ führung dieses Assays können kommerziell bezogen werden, bei­ spielweise bei NEN Life Science Products. Dieses Prinzip basiert ebenfalls auf Mikrotiterplatten (96er oder 384er), die mit Scin­ tillationssubstanz beschichtet sind.

Weitere, vor allem zum sekundären Screening geeignete Testverfah­ ren beruhen auf in-vitro und in-vivo Modellen für erfindungsgemäß zu behandelnde Indikationen.

Beispielsweise sind eine Reihe von in-vitro und in-vivo Modellen für Schlaganfall bekannt und etabliert. So kann man Neuronen un­ ter Sauerstoff-Glukose-Mangel kultivieren und den Anteil abge­ storbener Zellen bestimmen. Erfindungsgemäß brauchbare Inhibito­ ren verringern den Anteil an abgestorbenen Zellen.

In vivo kann man in Versuchstieren experimentell eine Ischämie induzieren, indem man beispielsweise die mittlere Cerebralarterie abklemmt (fokale cerebrale Ischämie). Das Ausmaß der induzierten Ischämie kann beispielsweise histologisch bestimmt werden. Erfin­ dungsgemäß brauchbare Inhibitoren verringern das Ausmaß der indu­ zierten Ischämie.

Die erfindungsgemäße Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren bein­ haltet im Rahmen der Behandlung ein Verfahren. Dabei wird dem zu behandelnden Individuum, vorzugsweise einem Säuger, insbesondere einem Menschen, Nutz- oder Haustier, eine wirksame Menge eines oder mehrerer GD3-Synthase-Inhibitoren, in der Regel der pharma­ zeutischen und tierarzneilichen Praxis entsprechend formuliert, verabreicht. Ob eine solche Behandlung angezeigt ist und in wel­ cher Form sie zu erfolgen hat, hängt vom Einzelfall ab und unter­ liegt einer medizinischen Beurteilung (Diagnose), die vorhandene Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen, Risiken, bestimmte Anzeichen, Symptome und/oder Fehlfunktionen zu entwickeln, und weitere Faktoren miteinbezieht.

Die Behandlung erfolgt in der Regel durch einmalige oder mehrma­ lige tägliche Verabfolgung gegebenenfalls zusammen oder im Wech­ sel mit anderen Wirkstoffen oder wirkstoffhaltigen Präparaten, so daß einem zu behandelnden Individuum eine Tagesdosis von etwa 0,001 g bis 10 g, vorzugsweise von etwa 0,001 g bis etwa 1 g zu­ geführt wird.

Die Erfindung betrifft auch die Herstellung pharmazeutischer Mit­ tel zur Behandlung eines Individuums, vorzugsweise eines Säugers, insbesondere eines Menschen, Nutz- oder Haustieres. So werden die Inhibitoren gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammenset­ zungen verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Exzi­ pienten mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Inhibitor und ge­ gebenenfalls weiteren Wirkstoffen umfassen. Diese Zusammensetzun­ gen können beispielsweise auf oralem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem oder intranasalem Weg verabreicht werden.

Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, Pastillen, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatine­ kapseln, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arz­ neiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbeson­ dere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotio­ nen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohren­ tropfen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verab­ reichung erfindungsgemäßer Inhibitoren verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikrosphären oder Polymermatrizes zur An­ wendung kommen.

Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Inhibitoren gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder ver­ dünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Materia­ lien sein, die als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dienen.

Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dex­ trose, Succrose, Sorbitol, Manitol, Stärken, Akaziengummi, Calci­ umphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikro­ kristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Wasser, Sirup und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen phar­ mazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleit­ mittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservie­ rende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidan­ tien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emul­ sionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungs­ mittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuni­ ger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon-Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppo­ sitoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füll­ stoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen. Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angren­ zende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.

Es zeigt die

Fig. 1a den prozentualen Anteil des spezifischen Absterbens pri­ märer Neuronen nach 6-stündigem Sauerstoff-Glukose-Mangel und Re­ perfusionsdauern von 3 h, 18 h und 24 h;

Fig. 1b Veränderungen von GD3-Spiegeln in Neuronen nach 24-stün­ diger Reperfusion (in vitro) und in Neuronen der ischämischen He­ misphäre nach 90-minütigem ACM-Verschluss und anschließender 24-stündiger Reperfusion (in vivo) (% GD3-Spiegel relativ zu 100% Kontroll-Spiegeln; Mittelwert ± Standardabweichung; n = 3);

Fig. 2a den prozentualen Anstieg des spezifischen Absterbens primärer Neuronen 24 h nach Zugabe von GD3 in Endkonzentrationen von 250 µM, 375 µM und 500 µM sowie von GD1a in einer Endkonzen­ tration von 500 µM zum Kulturmedium;

Fig. 2b die durch 6-stündigen Sauerstoff-Glukose-Mangel und nach 24-stündiger Reperfusion induzierten GD3-Spiegel nach Zugabe von Antisense-Oligodesoxynukleotiden gegen GD3-Synthase (ST8-As) oder Oligodesoxynukleotiden mit einer per Zufall angeordneten Sequenz der gleichen Nukleotide (ST8-Sc) 48 h vor der Induktion des Sau­ erstoff-Glukose-Mangels (% GD3-Spiegel ST8-As-behandelter Neurone relativ zu 100% GD3-Spiegel ST8-Sc-behandelter Neurone; n = 3);

Fig. 2c das spezifische Absterben primärer Neuronen nach 6-stün­ digem Sauerstoff-Glukose-Mangel und anschließender 3-stündiger, 18-stündiger und 24-stündiger Reperfusion nach Zugabe von Anti­ sense-Oligodesoxynukleotiden gegen GD3-Synthase (ST8-As) oder Oligodesoxynukleotiden mit einer per Zufall angeordneten Sequenz der gleichen Nukleotide (ST8-Sc) zum Kulturmedium 48 h vor der Induktion des Sauerstoif-Glukose-Mangels (% Absterben ST8-As-be­ handelter Neurone relativ zu 100% Absterben ST8-Sc-behandelter Neurone, n = 5);

Fig. 3a das spezifische Absterben primärer Neuronen aus Mäusen mit Saure-Sphingomyelinase-Defizienz (ASM^-/-) und aus Wildtyp-Mäu­ sen derselben Generation (ASM^+/+) nach 6-stündigem Sauerstoff-Glu­ kose-Mangel und anschließender 24-stündiger Reperfusion;

Fig. 3b die GD3-Konzentration in Neuronen aus Mäusen mit Saure-Sphingomyelinase-Defizienz (ASM^-/-) und aus Wildtyp-Mäusen der­ gleichen Generation (ASM^+/+) nach 6-stündigem Sauerstoff-Glukose-Mangel und 24-stündiger Reperfusion (ng/µmol Neuraminsäure; Mit­ telwert ± Standardabweichung; n = 3);

Fig. 4a die GD3-Spiegel in der ischämischen Hemisphäre von Mäu­ sen nach 90-minütigem ACM-Verschluss und 24-stündiger Reperfusion ohne vorherige Verabreichung von D-PDMP (ohne D-PDMP) oder nach vorheriger Verabreichung von D-PDMP (mit D-PDMP) (% GD3-Spiegel relativ zu 100% GD3-Spiegeln in der nichtischämischen Hemisp­ häre; n = 3);

Fig. 4b die 24 h nach 90-minütigem ACM-Verschluss bestimmten In­ farktvolumina unbehandelter (ohne D-PDMP, n = 7) und behandelter (mit D-PDMP, n = 6) Mäuse.

Referenzbeispiel 1 Ischämie-Tiermodell

In Mäusen (Stamm C57BL6) wurde eine fokale cerebrale Ischämie durch einen Verschluß der Arteria cerebri media (ACM) ausgelöst (Longa et al. Stroke 20, 84-91 (1989)). Hierzu wurde ein siliko­ nisierter Nylon-Wundfaden durch die Arteria carotis communis bis zur ACM geschoben und der Blutfluß durch die ACM unterbrochen. Nach 90 min wurde der Faden wieder gezogen und so die Blutzirku­ lation wieder hergestellt. Während des gesamten Eingriffs befan­ den sich die Tiere in tiefer Narkose (Ketamin und Rompun; jeweils 150 mg/kg Körpergewicht) und die rektale Temperatur wurde mit Wärmelampen und Heizkissen bei etwa 37°C gehalten. Nach einer Be­ obachtungszeit von 24 Stunden wurden die Tiere erneut narkoti­ siert, und die Gehirne wurden nach Perfusion präpariert.

Referenzbeispiel 2 Bestimmung des Infarktvolumens

An den in Beispiel 1 erhaltenen Vorderhirnen wurden kryostatische Koronarschnitte mit einer Dicke von 20 µm im Abstand von 400 µm angefertigt und einer Silberfärbung unterzogen. Dazu wurden die Schnitte mit einer Silbernitrat/Lithiumcarbonat-Lösung 2 min im­ prägniert und mit einer Hydrochinon/Formaldehyd-Lösung 3 min ent­ wickelt (Vogel, R. A., Clin. Cardiol., II 34-9 (1999)). Die ge­ färbten Schnitte wurden direkt gescannt (MCID-M4,3,0; Imaging Res. Inc.). Das Infarktvolumen wurde bestimmt, indem man die ge­ scannten Bereiche mit erheblicher Blässe (korrigiert um Hirnödem × Schnittdicke) mit Hilfe der digitalen Planimetrie numerisch integrierte (Swanson, R. A. et al. Stroke 21, 322-7 (1990); Lin, T. N., et al., Stroke 24, 117-21 (1993)). Sämtliche Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Signifikanz wurde mit dem Mann-Whitney-Test bestimmt. Karten über die Häufig­ keitsverteilung von Infarkten wurden erstellt (Belayev, L. et al., Neuroreport 8, 55-9 (1996); Schneider, A. et al., Biochemis­ try 38, 3549-58 (1999)), indem die jeweiligen Schnitte einer Se­ rie gescannt wurden, und die Infarkte abgegrenzt und auf eine Maske projeziert wurden. Die Mittelung erfolgte mit Scion-Image b 3.b.

Referenzbeispiel 3 Immunhistochemie

Koronare kryostatische Schnitte (20 µm) aus Beispiel 2 wurden 48-72 h entweder mit da monoklonalen anti-GD3-IgG3-Mausantikör­ per (R24) oder mit den polyklonalen Antikörpern (anti-NF200), (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), anti-GFAP (Chemicon, Kanada) oder anti-Cytochrom c (H-104; Santa Cruz, Kanada) inkubiert. Die bildliche Darstellung der Immunreaktivitäten erfolgte entweder mit einem monoklonalen oder einem polyklonalen Cy3/FITC-markier­ ten Zweitantikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) oder mit der herkömmlichen Avidin-Biotin-Komplexierungsmethode (Vectastain, Vector Lab, USA).

Referenzbeispiel 4 Transferase-dUTFnick-Endmarkierung (TUNEL)

Kryostatische Frontalschnitte (25 µm) wurden mit der Transferase dUTPnick-Endmarkierungstechnik behandelt (Gavrieli, 1% et al., J. Cell Biol. 119, 493-507L (1992)). Zellkerne wurden von Proteinen durch Inkubation von PBS mit 1% Triton (PBST) bei 4°C über Nacht abgelöst. Endogene Peroxidasen wurden inaktiviert, indem man die Schnitte mit 2% H₂O₂ 5 min bei Raumtemperatur bedeckte. Die Schnitte wurden mit 0,3 µl Flu-dUTP (Amersham, Braunschweig, Deutschland), 1 µl terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT), 10 µl 5 × TdT-Puffer, 2 µl CoCl₂ (Boehringer, Mannheim, Deutsch­ land), 0,3 µl dATP (Perkin Elmer) und 36,4 µl destilliertem H₂O in einer Feuchtkammer 90 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde beendet, indem man die Objektträger in TE-Puffer 10 min bei Raum­ temperatur überführte. Normale Zellkerne, die lediglich nichtsi­ gnifikante Mengen an DNA-3'-OH-Enden enthielten, zeigten mit die­ ser Technik keine Färbung. Zellen mit nekrotischer Morphologie und nachweisbaren Konzentrationen an DNA-Enden zeigten eine im Vergleich zu apoptischen Zellkernen diffusere Markierung. Als Kontrolle wurden Schnitte inkubiert, entweder ohne Enzym oder ohne Nukleotid.

Referenzbeispiel 5 Zellkultur

Aus transgenen Mäusen, deren Saure Sphingomeylinase inaktiviert wurde (ASM^-/-; Hirunouchi, K., et al., Nature Genetics 10, 288-294 (1995)), und Wildtyp-Mäusen derselben Generation (ASM^+/+) wurden Neuronen gewonnen. Primäre Neuronen-Kulturen wurden aus 15- bis 17-tägigen Mausföten, wie zuvor von Dawson, T. M., et al. Ann. neurol. 30, 843-6 (1991) beschrieben, präpariert. Demnach wurden nach Trituration in MEM-Medium mit 20% Pferdeserum, 25 mM Glu­ kose und 2 mM L-Glutamin (allesamt von Gibco/Life Technologies, Paisley, Schottland) und anschließender 30-minütiger Verdauung in 0,025 Trypsin/Kochsalz-Lösung kortikale Neuronen erhalten. Die Zellen wurden auf Polyornithin-beschichtete 24-Well-Platten auf­ getragen (Sigma, Deisenhofen, Deutschland). Nach 4 Tagen wurden die Zellen weitere 4 Tage mit Cytosin-Arabinosid (5 µM) behandelt, um die Proliferation nichtneuraler Zellen zu inhibieren. Danach wurden die Zellkulturen in MEM, 10% Pferdeserum, 25 mM Glukose und 2 mM L-Glutamin in einem Feuchtinkubator bei 8% Co₂ und 37°C gehalten. Man ließ die Neuronen wenigstens 8 Tage in Kultur rei­ fen, bevor sie zum Experiment herangezogen wurden. Der Anteil an Gliazellen in der Kultur wurde mit einem gegen Gliales Fibriläres Saures Protein (glial-fibrilary-acidic protein; GFAP) gerichteten Antikörper zu weniger als 10% bestimmt.

Referenzbeispiel 6 Sauerstoff-Glukose-Mangel in vitro

Zur Erzeugung eines kombinierten Sauerstoff-Glukose-Mangels ging man in an sich bekannter Weise vor (Kaku, D. A., et al., Brain Res. 554: 344-7; Monyer, H. et al., Neuron 8, 967-73 (1992); mit leichten Veränderungen). Das Kulturmedium wurde durch MEM, 1% Pferdeserum und 2 mM L-Glutamin ersetzt. Die Kulturen wurden 6 h in einer anaeroben Kammer gehalten, die bei 37°C und 100% Luft­ feuchtigkeit ein Gasgemisch aus 5% H₂, 85% N₂ und 5% CO₂ ent­ hielt. Der Sauerstoff-Glukose-Mangel wurde aufgehoben, indem man die Kulturen aus der Kammer nahm und Pferdeserum und Glukose bis zu einer Endkonzentration von 10% bzw. 25 mM zugab. Die Kulturen wurden dann weitere 3 h, 18 h oder 24 h in einen Feuchtinkubator zurückgegeben, der 8% CO₂ und atmosphärischen Sauerstoff ent­ hielt. Zur Inhibition der GD3-Synthese wurden die Kulturen mit 80 nM GD3-Synthase-Antisense-Oligodesoxynukleotiden (SEQ ID NO: 2) und einem per Zufall zusammengestellten Oligodesoxynukleotid (SEQ ID NO: 3) 48 h vor der Induzierung des Sauerstoff-Glukose-Mangels inkubiert. Bovines Hirn-GD3 wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.

Der prozentuale Anteil an abgestorbenen Zellen wurde durch Tryp­ tan-Blau-Exklusion bestimmt und als prozentualer Anteil des spe­ zifischen Absterbens ausgedrückt. Dieses wurde wie folgt berech­ net:

% spezifisches Absterben = (gefundenes Absterben - spontanes Ab­ sterben)/(100 - spontanes Absterben) × 100.

Referenzbeispiel 7 Dünnschichtchromatographie (GD3-Analyse)

GD3 wurde, wie zuvor von De Maria, R., et al., Science 277, 1652-5 (1997) beschrieben, bestimmt. So wurden Gewebe und Zellen mit zwei Gefrier-Tau-Zyklen aufgebrochen. Die polaren Lipide wur­ den extrahiert, und die Ganglioside wurden auf Silicagel-Platten 60 für die Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) (Merck, Darmstadt, Deutschland) chromatographiert, getrocknet und mit Resorcinol sichtbar gemacht. Gleiche Mengen an Neuraminsäure wurden mit dem Thiobarbitursäure-Assay gefunden (Warren, L., J. Biol. Chem. 234, 1871-1975 (1959)). Zur Immunfärbung wurden die Platten mit 0,5% Polyisobutylmethacrylat in Hexan plastifiziert, getrocknet, 1 h mit dem gegen GD3 gerichteten monoklonalen Anti­ körper R24 (IgG3) inkubiert und über die Immunperoxidase-Färbung abgelesen. Die Banden wurden dann gescannt und densitometrisch mit dem AIDA-1000/1B-Bildanalysegerät (Raytest Isotopenmessgerät, Straubenhardt, Deutschland) analysiert.

Beispiel 1 GD3-Spiegel in Neuronen nach induzierter Ischämie

Ein 6-stündiger Sauerstoff-Glukose-Mangel und zunehmende Reperfu­ sionsdauern gemäß Referenzbeispiel 6 induzierten bis zu 48% spe­ zifisches Absterben von primären Neuronen (Fig. 1a). Mittels quantitativer Dünnschichtchromatographie gemäß Referenzbeispiel 7 konnte gezeigt werden, dass dieser Zuwachs des Neuronensterbens begleitet war von einem Anstieg der GD3-Spiegel (149,45 ± 3,00% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, n = 3; Fig. 1b). Die gleiche Art der Analyse ergab für die ischämische Hemisphäre ge­ mäß Referenzbeispiel 1 behandelter Mäuse einen 250%-igen Anstieg der GD3-Spiegel im Vergleich zur nichtischämischen Hemisphäre (252,03 ± 4,81%, n = 3; Fig. 1b).

Die Verteilung der GD3-Akkumulation innerhalb des ischämischen Gehirns konnte immunhistochemisch untersucht werden. Schon 4 h nach ACM-Verschluss wurde GD3 in dem lateralen Striatum und dem anliegenden Neokortex nachgewiesen. Die GD3-Akkumulation nahm bis zu 24 h nach Ischämie progressiv zu; GD3 wurde zu diesem Zeit­ punkt in dem lateralen Striatum, ventrolateralen Thalamus, den CA1- und CA3-Hippocampus-Schichten und dem an die ischämische Lä­ sion angrenzenden Kortex nachgewiesen. GD3 konnte weder in den Gehirnen scheinoperierter Tiere noch in den ohne den ersten Anti­ körper durchgeführten Kontrollfärbungen nachgewiesen werden.

Doppelmarkierungsuntersuchungen zeigten, dass nach 24-stündiger Reperfusion eine GD3-Neosynthese in der Hauptsache in Neuronen stattfindet. Darüber hinaus korrelierten ansteigende zelluläre Mengen an GD3 mit einer verstärkten mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c. Demnach wurde GD3 in apoptischen Neuronen gefun­ den.

Beispiel 2 GD3 fördert das Neuronensterben

Kortikale neuronale Zellen wurden mit zunehmenden Dosen an GD3 behandelt. Das spezifische Neuronensterben nahm in Abhängigkeit von der Dosis zu, und zwar bis 80% 24 h nach der Zugabe von 500 µM GD3 (Fig. 2a). Ein anderes Disialogangliosid GD1a zeigte bei der höchsten verwendeten Dosis keinerlei Wirkung (Fig. 2a).

Die Zugabe von GD3-Synthase-Antisense-Oligodesoxynukleotiden, nicht aber die Zugabe einer zufällig zusammengestellten Sequenz der gleichen Nukleotide, 48 h vor der Induktion des Sauerstoff- Glukose-Mangels mit anschließender 24-stündiger Reperfusion gemäß Referenzbeispiel 6 führte zu einer Verminderung der Akkumulation von GD3 auf 55% der Kontrollen (Fig. 2b). Diese Reduktion führte zu einer Verringerung der Mortalität in Antisense-behandelten Kulturen auf 50% des Wertes, der in denjenigen Kulturen gefunden wurde, die lediglich mit der per Zufall angeordneten Sequenz der Nukleotide der Antisense-Oligodesoxynukleotid-Sequenz behandelt worden waren (Fig. 2c).

Beispiel 3 Keine Abhängigkeit von der Aktivität der Sauren Sphingomyelinase

Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen ASM^-/- und ASM^+/+-Mäusen im Hinblick auf das gemäß Referenzbeispiel 6 beur­ teilte spezifische Neuronensterben festgestellt werden (31,09 ± 11,95 bzw 38,28 ± 10,28% spezifisches Absterben; Fig. 3a). Dem­ entsprechend akkumulierte GD3 in annähernd gleichen Mengen nach Sauerstoff-Glukose-Mangel/Reperfusion sowohl in ASM^-/-- als auch in ASM^+/+-Neuronen (689,43 ± 13,53 bzw. 647,53 ± 67,21 mg GD3/µmol Neuraminsäure; Fig. 3b).

Beispiel 4 Die Inhibierung der GD3-Synthese bewahrt vor Schäden durch Schlaganfall

Kurz nach Induktion einer transienten fokalen Ischämie gemäß Re­ ferenzbeispiel 1 wurden die Tiere mit dem Glucosylceramidsyn­ thase-Inhibitor D-threo-1-Phenyl-2-decanoylamino-3-morpho­ lino-1-propanol (D-PDMP) behandelt. Es wurde eine einzige i.p.-Injektion von D-PDMP (100 mg/kg Körpergewicht; Biological Techno­ logy, London, GB) zusammen mit Piperonylbutoxid (400 mg/kg Kör­ pergewicht; Fluka, Deisenhofen, Deutschland) 15 min nach Ver­ schluss der ACM verabreicht. Die dünnschichtchromatographische Bestimmung von GD3 ergab für diese Tiere einen lediglich 10%-igen Zuwachs von GD3 auf der ischämischen Seite im Vergleich zur nichtischämischen Seite, während in unbehandelten Tieren ein 250%-iger Anstieg nachgewiesen wurde (Fig. 4a).

Die Bestimmung des Infarktvolumens gemäß Referenzbeispiel 2 ergab eine ischämische Läsion mit einem durchschnittlichen Volumen von 6,01 ± 2,10 mm³ im Vergleich zu 77,5 ± 9,2 mm³ unbehandelter Mäuse (n = 5; Fig. 4b). Somit ergab die Inhibition der Gangliosid-Neo­ synthese in vivo eine im Vergleich zu unbehandelten ischämischen Tieren 90%-ige Reduktion der durch Schlaganfall verursachten Lä­ sion (p < 0,007). Die Karte über die Häufigkeitsverteilung zeigt eine starke Beteiligung des Hippocampus und des Hypothalamus an dem Infarkt, während die anderen Regionen nur geringfügig betei­ ligt zu sein scheinen. Die Gesamtmenge an GD3 in den Gehirnen D- PDMP-behandelter Tiere war um 355% niedriger als in Gehirnen un­ behandelter ischämischer Tiere.

SEQUENCE LISTING

Claims (8)

1. Verwendung von GD3-Synthase-Inhibitoren zur Behandlung neuro­ pathologischer Störungen und damit zusammenhängender Anzei­ chen, Symptome und Fehlfunktionen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von cerebraler Ischämie.

3. Verwendung nach Anspruch 2 zur Behandlung von Schlaganfall, vorzugsweise akutem Schlaganfall.

4. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von traumatischen Hirn- und Rückenmarksschädigungen.

5. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung neurodegenerativer Störungen.

6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Behandlung von Demenz, insbe­ sondere Alzheimer Demenz, Parkinson, ALS, Multipler Sklerose.

7. Verfahren zur Identifizierung von GD3-Synthase-Inhibitoren, wobei man die Aktivität von GD3-Synthase in Gegenwart und in Abwesenheit wenigstens einer Testsubstanz bestimmt.

6. In vitro Screening-Verfahren nach Anspruch 7.