EP1377601A2 - Inhibiteurs de la toxine botulique de type b - Google Patents

Inhibiteurs de la toxine botulique de type b

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Publication number
EP1377601A2
EP1377601A2 EP20020735453 EP02735453A EP1377601A2 EP 1377601 A2 EP1377601 A2 EP 1377601A2 EP 20020735453 EP20020735453 EP 20020735453 EP 02735453 A EP02735453 A EP 02735453A EP 1377601 A2 EP1377601 A2 EP 1377601A2
Authority
EP
European Patent Office
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alkyl
group
amino
carboxy
aryl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20020735453
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Roques
Christine Anne
Serge Turcaud
Marie-Claude Fournie-Zaluski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1377601A2 publication Critical patent/EP1377601A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
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    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/60—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxyl groups bound to nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to new compounds having inhibitory properties of the activity of botulinum toxin type B, their methods of preparation and the corresponding pharmaceutical compositions.
  • botulinum neurotoxins consists of seven structurally similar but antigenically different proteins (serotypes A to G) produced by different strains of the anaerobic bacillus "Clostridium botulinum". They are the most powerful toxins known with lethal doses 50 in mice of 0.1 to 1 ng / g. They act on the peripheral nervous system of man and various animal species by inducing "botulism" which is characterized by a flaccid paralysis of the skeletal muscles which can lead to death. The two most frequently encountered forms are botulinum toxins types A and B. The major form of intoxication by neurotoxins is due to the ingestion of contaminated food. But these proteins, which are easy to produce, can also be a potential biological weapon. Finally, for several years, botulinum toxins A and B have been used for therapeutic applications in the context of dystonia, motor neuron hyperactivity, such as strabismus, blepharospasm, etc.
  • Botulinum neurotoxins are made up of two subunits: a heavy chain ( ⁇ 100 kDa) associated with a light chain ( ⁇ 50 kDa) via a disulfide bridge.
  • the heavy chain is involved in the binding of the toxin to the nerve end, in the internalization then in the translocation of the light chain in the cytosol.
  • the light chain is responsible for the toxicity of the protein by inhibiting the release, Ca 2+ dependent, of acetylcholine.
  • the toxicity of the light chain is due to its peptidasic activity.
  • Botulinum toxins belong to the family of zinc metallopeptidases which contain the consensus sequence HExxH (Schiavo et al., 1992, J. Biol. Chem. 267 (33), 23479-23483). They very specifically cleave the neuronal proteins involved in the exocytosis of neurotransmitters.
  • Botulinum toxin type B cuts synaptobrevin (VAMP), a small protein of 116 amino acids embedded in the membrane of small synaptic vesicles, at the Q76-F77 bond.
  • VAMP synaptobrevin
  • BoNT / B toxin The most effective approach to combat the harmful effects of the BoNT / B toxin, either during a declared botulism, or during therapeutic contraindications is the development of selective and high affinity inhibitors of activity. metallopeptidasique of toxin.
  • phosphoramidon a neprylisin inhibitor, which tested in vivo on the phrenic nerve of mice at an effective dose of 0.2 mM (Deshpaude et al., 1995, Toxicon 33, 551-557); iv) phosphonate analogs of phosphoramidon such as ICD 2821 (Adler et al., 1999, J. Applied Toxicology 16, S5-S11) which appear to be somewhat more effective than phosphoramidon itself; v) finally inhibitors of tetanus toxin (Martin et al., 1999, J. Med. Chem. 42 (3), 515-524) have shown micromolar activities on BoNT / B. However, all of these molecules prove to be ineffective on the BoNT / B toxin.
  • the object of the present invention is precisely to propose new compounds capable of selectively inhibiting the activity Botulinum toxin enzyme. These compounds are potential therapeutic agents of botulism.
  • the subject of the present invention is compounds of general formula (1), capable of selectively inhibiting botulinum toxin B with a high affinity and selectivity for this toxin:
  • - (2) and (3) represent two of the possible centers of asymmetry in the molecule;
  • - X represents a hydrogen atom, a primary amine NH 2 or a secondary amine NHR with R representing an alkyl or arylalkyl group;
  • R 2 represents an alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, (cycloalkyl) alkyl, aryl or (aryl) alkyl group, substituted by a group COOH or COOR ", SO 3 H or SO 3 R", PO 3 H 2 or PO 3 R " 2 , with R” representing an alkyl, aryl, (aryl) alkyl, cycloalkyl, or (cycloalkyl) alkyl group, optionally substituted by one or more halogen atoms, preferably fluorine, or a CF 3 group;
  • - R 3 represents:
  • R 4 represents an alkyl, cycloalkyl, (cycloalkyl) alkyl, aryl, (aryl) alkyl, heteroaryl or (heteroaryl) alkyl group; or • a peptide sequence (AA) n R 5 in which:
  • R 5 is equal to OH, NH 2 , NHR '"with R'" representing an alkyl, cycloalkyl, (cycloalkyl) alkyl, aryl, (aryl) alkyl, heteroaryl or (heteroaryl) alkyl group - AA represents a residue of amino acid of formula (II)
  • R ⁇ represents a hydrogen atom or an alkyl group, preferably methyl
  • R represents an alkyl, (aryl) alkyl or (heteroaryl) alkyl group, optionally substituted by one or more halogen atoms and / or more group (s) OH, alkoxy and preferably OCH 3 or CF 3 , with when n is equal to 2, the two amino acid residues AA being able to be identical or different; and the derivatives of these compounds of general formula (I).
  • the definitions of the various groups proposed in the general formulas (I) and (II) of the claimed compounds are specified in the list below. These definitions apply to terms as used throughout this text (unless they are limited to specific examples) either individually or as part of a larger group.
  • alkyl a saturated, linear or branched aliphatic group containing from 1 to 6 carbon atoms
  • - cycloalkyl a hydrocarbon ring having 3, 4, 5 or 6 carbon atoms
  • - alkenyl a linear or branched aliphatic chain of 2 to 6 carbon atoms having at least one double bond
  • alkynyl an aliphatic chain of 2 to 6 carbon atoms having at least one triple bond
  • - aryl an aromatic ring with 6 carbon atoms condensed or not and / or substituted or not substituted by one or two other aromatic rings with 6 carbon atoms;
  • heteroaryl an aromatic heterocycle with 5 or 6 atoms, containing one or two heteroatoms chosen from N, S and O, condensed or not and / or substituted or not by one or two aromatic rings with 6 carbon atoms or heteroaromatic with 5 or 6 atoms.
  • All of these groups can be substituted by one or more halogen atom (s), hydroxyl group (s), carboxylic or ester function (s).
  • the term "derivatives” is intended to cover in particular the addition salts of the compounds of general formula (I) obtained with acids, in particular pharmacologically acceptable organic or mineral acids. It may for example be salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, borate, phosphate, methane sulfonate, acetate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tartrate, maleate, malonate, benzoate , diaminobenzene sulfonate, chromoglycate, benzene sulfonate, cyclohexane sulfonate, toluene sulfonate, dipropyl acetate, glucose-1 phosphate, palmoate and palmitate.
  • salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, borate, phosphate, methan
  • dimers of compounds of general formula (I) consisting of two molecules of compounds of general formula (I), identical or different, coupled together level of their respective sulfur atoms.
  • Ri represents the group S-CH [CH (R 2 ) X] -CO-R 3 identified previously.
  • the present invention extends to the different eniantomeric forms of the claimed compounds.
  • the compounds of formula (I) can have several asymmetric carbons, they therefore exist in the form of mixtures either racemic or of diastereoisomers or also in the form of pure stereoisomers.
  • the compounds of general formula (I) have the two centers of asymmetry noted (2) and (3) on the formula (I).
  • the compounds can therefore exist in the form of 4 stereoisomers. These four stereoisomers are within the scope of the invention.
  • the group R 3 can also contain one or more chiral centers.
  • the stereoisomers (R) and (S) of each additional chiral center are also within the scope of the invention.
  • Optically pure compounds can be isolated by enantioselective syntheses or resolutions by chiral amines.
  • a separation by semi-preparative HPLC on a column (Vydac C ⁇ 8 , 10x250 mm, CH 3 CN-H 2 O) is carried out, allowing a biochemical and pharmacological study separate from each stereoisomer.
  • stereoisomers those having an absolute configuration (S) on the carbon (2) carrying the group R 2 , and a configuration (S) on the carbon (3) carrying the -SR function are preferred. Mention may more particularly be made, as preferred compounds according to the invention, of the compounds of general formula (I) in which R represents either a hydrogen atom or an S- CH [CH (R 2 ) X] -CO group -R 3 identical or different from the grouping represented by the general formula (I). Furthermore, the compounds of general formula (I) possessing a significant hydrophobic character are found to be particularly advantageous for their inhibitory properties with respect to botulinum toxin.
  • This hydrophobic character is notably favorably induced by the presence of several alkyl groups and more preferably of aryl and / or heteroaryl nature at the level of the molecule of the compound of general formula (I).
  • R 2 represents an aryl or arylalkyl group, substituted by at least one carboxylic function.
  • This hydrophobicity can moreover be reinforced by the presence of alkyl chain (s) and / or of aryl group (s) and / or arylalkyl (s) at the level of the other substituents R 1 and R 3 .
  • Ri represents an S-CH [CH (R 2 ) X] -CO-R 3 group .
  • the compound of general formula (I) then meets the definition of a symmetrical disulfide.
  • R 3 there is preferably a peptide sequence (AA) n Rs with preferably n equal to 2, and more preferably m and p equal to zero.
  • AA represents a group of general formula (II) in which the two groups R 7 different from each other represent an (aryl) alkyl or (heteroaryl) alkyl group.
  • R 7 different from each other represent an (aryl) alkyl or (heteroaryl) alkyl group.
  • la general formula (la):
  • - Ri represents a hydrogen atom or preferably a group -S-CH [CH (R 2 ) NH 2 ] COR 3 with R 2 and R 3 being as defined above or below;
  • R 2 represents a (cycloalkyl) alkyl, aryl or (aryl) alkyl group, substituted by at least one COOH function;
  • R 3 represents either an NHR 4 group with R 4 representing an alkyl, cycloalkyl, (cycloalkyl) alkyl, aryl, (aryl) alkyl, heteroaryl or (heteroaryl) alkyl group or a group of formula (IIa):
  • - n is equal to 1, preferably 2, with when n is equal to 2, the two groups appearing in square brackets can be identical or different;
  • - R 7 represents an (aryl) alkyl or (heteroaryl) alkyl group, optionally substituted by one or more halogen atoms and / or OH, OCH 3 or CF 3 group (s)
  • - R 5 represents an NH 2 group or NHR '"in which R'" represents an alkyl, aryl, (aryl) alkyl, cycloalkyl, or (cycloalkyl) alkyl group, optionally substituted by one or more halogen atoms, preferably fluorine, or a CF 3 group
  • - m or p identical or different, represents 0 or the integer 1. According to a preferred embodiment of the invention, m and p are equal to zero and more preferably n is equal to 2.
  • R 7 in general formulas (II) or (IIa), it is preferably chosen from benzylnaphthylmethyl, benzothienylmethyl, indolylmethyl and biphenylmethyl. In the case where n is equal to 2, the two groups R 7 are preferably different. Mention may more particularly be made, by way of illustration of the compounds claimed according to the invention, of the following derivatives:
  • the present invention also relates to the preparation of the claimed compounds.
  • R - R ' 2 represents the protected form of R 2 on its functional group with
  • R 2 has a COOH group, R ′ 2 having a COOtBu group;
  • R 2 has an SO 3 H group
  • R ' 2 has an SO 3 CH 2 tBu group
  • R 2 has a PO 3 H 2 group
  • R ' 2 has a group
  • This sulfenylation reaction is carried out by the action of 2-4-dinitrophenyl p.methoxybenzyl disulfide according to the method described by Bischoff et al. (1997, J. Org. Chem. 62, 4848-4850).
  • the ⁇ -amino ester of formula (IV) is obtained by a homologation reaction according to Arndt-Eisert (Meier et al., 1975, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 14, 32-43) of ⁇ -N-protected amino acid of formula (V).
  • the formula (IV) preferentially has the configuration S.
  • the sulfenylation reaction of formula (IV) to lead to formula (III) is essentially a trans addition.
  • the compound of formula (III) then preferably has the 2S, 3S configuration.
  • this reaction is carried out in dichloromethane or dimethylformamide, by the action of EDCI (1- (3-dimethylaminopropyl) -3- ethyl-carbodiimide methiodide) in the presence of HOBt (1-hydroxy-benzothazole) or BOP ( benzothazol-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluoro-phosphate at room temperature in the presence of a tertiary amine such as diisopropylethylamine.
  • EDCI 3- (3-dimethylaminopropyl) -3- ethyl-carbodiimide methiodide
  • HOBt 1-hydroxy-benzothazole
  • BOP benzothazol-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluoro-phosphate
  • a tertiary amine such as diisopropyleth
  • R 3 represents an amino acid or a peptide
  • the C-terminal carboxylate is protected in the form of a t-butyl ester.
  • R ' being as defined in general formula (I).
  • the compound of formula (X) is conventionally formed by the action of a mercaptan of formula R'SH on methoxycarbonylsulfenyl chloride (CH 3 O 2 CSCI; Aldrich) in the presence of a tertiary amine such as trimethylamine in solution in a methanol chloroform mixture.
  • the compound of formula (XI) is typically prepared in two stages starting from an ⁇ -amino acid of formula (XII) according to the following reaction scheme
  • the ⁇ -amino acid of formula (XII) undergoes the conventional halogenating desamination reaction by the action of sodium nitrite in the presence of hydrobromic acid. This reaction is generally done with configuration retention.
  • the claimed compounds prove capable of significantly inhibiting the enzymatic activity of the botulinum toxin type B. As such, the claimed compounds can be used in therapy in all the pathological processes induced by this toxin.
  • the clinical applications for which the use of these compounds can be envisaged include diseases initiated by the botulinum toxin BoNT / B.
  • the claimed compounds and their derivatives can be used for the preparation of corresponding pharmaceutical compositions.
  • the present invention relates, according to another of its aspects, to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active principle at least one compound of general formula (I) or one of its derivatives.
  • this compound can be associated therewith at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions can be administered by oral, parenteral, sublingual, transdermal or topical route.
  • oral or sublingual administration use is made in particular of tablets, simple or coated, capsules, granules possibly with delayed release, drops or else liposomes.
  • administration by the intravenous, subcutaneous or intramuscular route sterile or sterilizable solutions are used, in particular for venous infusion, while conventional patches can be produced for transdermal administration.
  • creams or lotions can be used to spread on the skin.
  • compositions according to the present invention can be prepared according to usual methods well known in the field of pharmaceutical technology.
  • the active principle can be incorporated in the excipients usually used in these pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, aqueous vehicles or not, fatty substances of animal origin or vegetable, paraffinic derivatives, glycols, different wetting agents, dispersants, or emulsifiers, preservatives, etc ...
  • the amount of active ingredient to be administered per day depends of course on the particularity of the therapeutic indication, the severity of the conditions to be treated, as well as the weight of the patient and the route of administration.
  • the overall dose in humans generally varies between 1 and 100 mg per day, for example from 2 to 50 mg, and more suitably from 3 to 40 mg per day.
  • Unit dosage forms for systemic administration will generally comprise from 3 to 50 mg (i.e., 3, 5, 10, 20, 30, 40 and 50 mg of product). These unit doses will normally be administered one or more times a day, preferably one to three times a day.
  • the pharmaceutical compositions generally contain from 0.0001 to 10% of active principle and preferably from 0.01 to 5%.
  • the compounds of general formula (I) as a potential therapeutic agent for toxin-induced diseases BoNT / B, we can also consider their joint use with the toxin for example, for therapeutic purposes.
  • the compounds according to the invention advantageously provide an antidote for any unwanted activity of the BoNT / B toxin, administered in human clinic.
  • the present invention also relates to the joint use of at least one compound of general formula (I) with at least one clostridial toxin such as the botulinum neurotoxin and provides a pharmaceutical composition comprising at least one compound of general formula ( I) mixed with at least one clostridial toxin.
  • the compounds described according to the invention can also be used in the context of non-therapeutic applications in particular in systems for the diagnosis and detection of botulinum neurotoxin.
  • the examples presented below without implied limitation will demonstrate other advantages of the present invention.
  • HPLC analyzes of finished products are carried out on a Shimatzu® device with a Kromasil® column (C 8 or C-ie) 5 ⁇ m, 100 ⁇ (flow rate 1 ml / min, ⁇ 210 nm) (250 x 4.6 mm or 150 x 4.6 mm).
  • the eluent consists of a mixture in variable proportions of solutions A and B.
  • A 0.05% TFA in H 2 O
  • a THF solution of 33.5 g (78.6 mM) of the OppoIzer chiral copula is cooled to -78 ° C under argon.
  • 33 ml (1.05 eq) of nBuLi (2.5 M in hexane) are successively added, then after 15 min, a solution of 25 g (1.2 eq) of t-butyl 4-bromomethyl benzoate [obtained by the action of N-bromosuccinimide on paratoluic acid t-butyrate (reaction of Wohl-Zieyler & S. Pizey. Synthesis reagents, Vol. 2, New York, 1974, pp.
  • the amino function of the above compound (32 g) is then deprotected in solution in THF by the action of 540 ml of 10% citric acid. After 2 h at room temperature, the THF is evaporated under vacuum and the aqueous phase washed 3 times with ether. The aqueous phase is then brought to pH 8 by addition of 10% NaHCO 3 and the expected product is extracted with CH 2 CI 2 . After drying and evaporation to dryness, 20.7 g (88%) of a colorless oil are obtained which crystallizes slowly.
  • Step 2 Synthesis of the methyl ester of (3S) 3- (N-Boc) amino-4- [4-t-butyloxycarbonyl] phenylbutanoic acid.
  • tributyltin oxide BBTO
  • acetonitrile tributyltin oxide
  • the mixture is brought to reflux for 5 days.
  • the mixture is cooled to 0 ° C. and 50 ml of HCl are added over 2 hours.
  • Step 1 A solution of the synthon described in Example 1 (1 eq) of the dipeptide Trp-PheOtBu, (1 eq) of HOBT (1-hydroxybenzotriazole, 1 eq) of diisopropylethylamine (1.2 eq) and of (1 eq) is prepared.
  • EDCI 3-ethyl-carbodiimide methiodide
  • Step 2 The fully protected pseudopeptide is placed in the presence of 5 ⁇ l / mg of dimethylsulfide, 5 ⁇ l / mg of anisole and 1 ⁇ l / mg of p-thiolcresol, and is placed in the reactor where the HF is distilled at 0 °. vs. After reaction for 1 h at 0 ° C, the HF is evaporated and the residue is precipitated in an ether / hexane mixture at -20 ° C. The solid is then dissolved in water and lyophilized.
  • This compound is prepared according to the protocol described in Example 2 using in the 1 st step the dipeptide amide Bip-Tyr-NHBzl in place of the dipeptide ester Trp-Phe-OtBu.
  • This compound is prepared according to the protocol described in Example 2 using in the 1 st step the dipeptide amide Bip-D-Phe-NHBzl in place of the dipeptide ester Trp-Phe-OtBu.
  • HPLC on column C 8 Kromasil 5 ⁇ M, 100 ⁇ , 250 x 4.6 mm, 1 ml / min, T r (gradient from 40 to 100% of B in 20 min) 13.2 min.
  • Mass MH + 715.5.
  • This compound is prepared according to the protocol described in Example 2 using in the 1 st step the dipeptide amide Bip-lle-NHBzl in place of the dipeptide ester Trp-Phe-OtBu.
  • This compound is prepared according to the protocol described in Example 2 using in the 1 st step the dipeptide amide Bip-Bta-NHBzl in place of the dipeptide ester Trp-Phe-OtBu.
  • HPLC on column C 8 Kromasil 5 ⁇ M, 100 ⁇ , 250 x 4.6 mm, 1 ml / min, T r (gradient of 55 to 100% of B in 15 min)
  • This compound is prepared by coupling the synthon described above in Example 1 with 1-naphthalene methylamine as described in Example 2, that is to say in the presence of HOBT, diisopropylethylamine and EDCI in a minimum of DMF.
  • Mass MH + 787.9.
  • This compound is prepared according to the protocol described in Example 2 using in the first step the amino acid, benzylated amide Bip-NH-Bzl in place of the dipeptide ester Trp-Phe-OtBu with the difference that after coupling, deprotection and purification, it is oxidized to disulfide.
  • Mass MH + 1134.3.
  • Step 1 Synthesis of (2S) -2- (N-Boc) amino-3- [4-methyl oxycarbonyl] phenylpropanoic acid.
  • Step 2 Synthesis of (2S) -2-amino-3- [4-methyloxycarbonyl] phenylpropanoic acid.
  • the amine is deprotected using TFA in dichloromethane.
  • the TFA is then evaporated along with the DCM.
  • the product is then dried.
  • Step 5 Synthesis of N - [(2S) -2-thioacetate-3- (4-methoxycarbonyI) phenylpropanoyl] benzamide.
  • the benzylamide is coupled to the preceding product as described above (1 st step of Example 2).
  • Step 1 Synthesis of 4- (3-Bromo-3-carboxy-propyl) -benzoic acid tert-butyl ester.
  • Step 2 Synthesis of 4- (3-acetylsulfanyl-3-carboxy-propyl) -benzoic acid tert butyl ester.
  • a solution of 0.125 g (0.36 mM) of the ester obtained in step 1 in 0.364 ml of 1 N sodium hydroxide is cooled to 0 ° C.
  • 0.05 g (1.2 eq) of potassium thioacetate is added and the mixture is stirred at room temperature for 48 hours.
  • Extraction is carried out with ethyl acetate, the organic phase is washed with water and a saturated solution of sodium chloride. After drying and evaporation, a colorless oil is obtained (mass: 0.12 g, 98%).
  • Rf (c.Hex / EtOAc / AcOH: 7/3 / 0.5) 0.11.
  • Step 3 Synthesis of 2,2 '[disulfanediyl bis (4-tert butoxycarbonyl phenyl) butanoic] bis acid.
  • a solution of 0.12 g (0.35 mM) of the ester from step 2 in 2 ml of methanol is cooled to 0 ° C.
  • 0.7 ml (2.1 eq) of a 1N sodium hydroxide solution is added and the mixture is left to stir at ambient temperature for 30 minutes.
  • a 0.25 M solution of iodine in ethanol is then added dropwise until persistent yellow coloring and acidified to pH 1-2 with a 1N hydrochloric acid solution.
  • Step 4 Synthesis of 2,2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (Bip Bta benzamide).
  • This compound is prepared according to the protocol described in Example 2 using, in the first step, the synthon from step 3 above instead of the synthon from Example 1, and the dipeptide amide Bip-Bta-NHBzl instead of the dipeptide ester Trp-PheOtBu.
  • the pseudodipeptide ester is then placed in the presence of 0.13 ⁇ l / mg of anisole and 5 ⁇ l / mg of trifluoroacetic acid for 1 hour at room temperature.
  • the reaction medium is evaporated and the product is precipitated in the diethyl ester.
  • the quantity of metabolite formed in each test is determined from the standard fluorescence curves.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux composés de formule générale (I) :(I) dotés de propriétés inhibitrices vis-à-vis de l'activité de la toxine botulique de type B, leurs procédés de préparation et les compositions pharmaceutiques correspondantes. Elle vise également les compositions pharmaceutiques correspondantes.

Description

INHIBITEURS DE LA TOXINE BOTULIQUE DE TYPE B
La présente invention concerne de nouveaux composés dotés de propriétés inhibitrices de l'activité de la toxine botulique de type B, leurs procédés de préparation et les compositions pharmaceutiques correspondantes.
La famille des neurotoxines botuliques est constituée par sept protéines structuralement similaires mais antigéniquement différentes (sérotypes A à G) produites par différentes souches du bacille anaérobie "Clostridium botulinum". Elles sont les toxines les plus puissantes connues avec des doses létales 50 chez la souris de 0.1 à 1 ng/ g. Elles agissent au niveau du système nerveux périphérique de l'homme et de diverses espèces animales en induisant le "botulisme" qui est caractérisé par une paralysie flasque des muscles du squelette pouvant entraîner la mort. Les deux formes les plus fréquemment rencontrées sont les toxines botuliques de types A et B. La forme majeure d'intoxication par les neurotoxines est due à l'ingestion de nourriture contaminée. Mais ces protéines, qui sont faciles à produire, peuvent également constituer une arme biologique potentielle. Enfin, depuis quelques années, les toxines botuliques A et B sont utilisées pour des applications thérapeutiques dans le cadre de dystonies, d'hyperactivité motoneuronale, telle que le strabisme, le blépharospasme, etc ...
Les neurotoxines botuliques sont constituées de deux sous-unités : une chaîne lourde (~ 100 kDa) associée à une chaîne légère (~ 50 kDa) par l'intermédiaire d'un pont disulfure. La chaîne lourde intervient dans la liaison de la toxine à la terminaison nerveuse, dans l'internalisation puis dans la translocation de la chaîne légère dans le cytosol. La chaîne légère est responsable de la toxicité de la protéine par inhibition de la libération, Ca2+ dépendante, de l'acétylcholine. La toxicité de la chaîne légère est due à son activité peptidasique. En effet, les toxines botuliques appartiennent à la famille des métallopeptidases à zinc qui contiennent la séquence consensus HExxH (Schiavo et al., 1992, J. Biol. Chem. 267(33), 23479-23483). Elles clivent de façon très spécifique les protéines neuronales impliquées dans l'exocytose des neurotransmetteurs.
La toxine botulique de type B, coupe la synaptobrevine (VAMP) une petite protéine de 116 acides aminés enchâssée dans la membrane des petites vésicules synaptiques, au niveau de la liaison Q76-F77.
L'approche la plus efficace pour combattre les effets néfastes de la toxine BoNT/B, soit au cours d'un botulisme déclaré, soit au cours de contre-indications thérapeutiques est le développement d'inhibiteurs sélectifs et de haute affinité de l'activité métallopeptidasique de la toxine.
Quelques inhibiteurs de faible efficacité ont été précédemment décrits dans la littérature. On peut citer : i) les buforines I et II (Garcia et al., 1999, J. Applied Toxicology 19(Suppl 1) S19-S22) qui inhibent le
BoNT/B avec des IC50 de 10"6 M et 2.5 10"4 M respectivement ; ii) l'ICD 1578 (7-N-phenylcarbamoyl-amino-4-chloro-3-propyloxycoumahne) IC50 = 27 μM (Adler et al., 1998, FEBS Lett. 429, 234-238) ; iii) le phosphoramidon, un inhibiteur de néprylisin, qui testé in vivo sur le nerf phrénique de la souris a une dose efficace de 0.2 mM (Deshpaude et al., 1995, Toxicon 33, 551-557) ; iv) des analogues phosphonates du phosphoramidon tels que l'ICD 2821 (Adler et al., 1999, J. Applied Toxicology 16, S5-S11 ) qui semblent un peu plus efficace que le phosphoramidon lui-même ; v) enfin des inhibiteurs de toxine tétanique (Martin et al., 1999, J. Med. Chem. 42(3), 515-524) ont montré des activités micromolaires sur la BoNT/B. Toutefois, toutes ces molécules se révèlent peu efficaces sur la toxine BoNT/B.
Il demeure donc un besoin de médicaments pour traiter à doses plus réduites les maladies induites par la toxine botulique B.
La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés capables d'inhiber sélectivement l'activité enzymatique de la toxine botulique. Ces composés sont des agents thérapeutiques potentiels du botulisme.
Plus précisément, selon un de ses aspects, la présente invention a pour objet des composés de formule générale (1), capables d'inhiber sélectivement la toxine botulique B avec une haute affinité et sélectivité pour cette toxine :
dans laquelle :
- (2) et (3) figurent deux des centres d'asymétrie possibles dans la molécule ; - X représente un atome hydrogène, une aminé primaire NH2 ou une aminé secondaire NHR avec R représentant un groupe alkyle ou arylalkyle ;
- Ri représente :
• un atome hydrogène, • un groupement S-R' dans lequel R' représente un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 ; ou
• un groupement S-CH[CH(R2)X]-CO-R3 avec R2, X et R3 étant tels que définis ci-dessus ou ci-après ;
- R2 représente un groupe alkyle, alkényle, alkynyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou (aryl)alkyle, substitué par un groupement COOH ou COOR", SO3H ou SO3R", PO3H2 ou PO3R"2, avec R" représentant un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 ; - R3 représente :
• un groupement NHR dans lequel R4 représente un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, (aryl)alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl)alkyle ; ou • un enchaînement peptidique (AA)nR5 dans lequel :
- n est égal à 1 ou 2
- R5 est égal à OH, NH2, NHR'" avec R'" représentant un groupe alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, (aryl)alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryle)alkyle - AA représente un reste d'acide aminé de formule (II)
N(R6)-(CH2)m-CH(R7)-(CH2)p-CO (II)
dans laquelle : . m = 0 ou 1 , p = 0 ou 1 ,
. Rβ représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, de préférence méthyle, et
R représente un groupe alkyle, (aryl)alkyle ou (hétéroaryl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou plusieurs groupe(s) OH, alkoxy et de préférence OCH3 ou CF3, avec lorsque n est égal à 2, les deux restes d'acides aminés AA pouvant être identiques ou différents ; et les dérivés de ces composés de formule générale (I). Les définitions des différents groupements proposés dans les formules générales (I) et (II) des composés revendiqués sont précisées dans la liste ci-dessous. Ces définitions s'appliquent aux termes tels qu'ils sont utilisés à travers ce texte (à moins qu'elles soient limitées à des exemples précis) soit individuellement soit en tant que faisant partie d'un groupe plus large.
C'est ainsi qu'au sens de l'invention, on entend désigner par: - alkyle : un groupe aliphatique saturé, linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
- cycloalkyle : un cycle hydrocarboné ayant 3, 4, 5 ou 6 atomes de carbone ; - alkényle : une chaîne aliphatique linéaire ou ramifiée de 2 à 6 atomes de carbone possédant au moins une double liaison ;
- alkynyle : une chaîne aliphatique de 2 à 6 atomes de carbone possédant au moins une triple liaison ;
- aryle : un cycle aromatique à 6 atomes de carbone condensés ou non et/ou substitué ou non par un ou deux autres cycles aromatiques à 6 atomes de carbone ;
- hétéroaryle : un hétérocycle aromatique à 5 ou 6 atomes, contenant un ou deux hétéroatomes choisi parmi N, S et O, condensé ou non et/ou substitué ou non par un ou deux cycles aromatiques à 6 atomes de carbone ou hétéroaromatiques à 5 ou 6 atomes.
L'ensemble de ces groupes peut être substitué par un ou plusieurs atome(s) d'halogène, groupe(s) hydroxyle, fonction(s) carboxylique ou ester.
Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous le terme "dérivés" notamment les sels d'addition des composés de formule générale (I) obtenus avec des acides, en particulier des acides organiques ou minéraux pharmacologiquement acceptables. Il peut par exemple s'agir de sels tels que les chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate, borate, phosphate, méthane sulfonate, acétate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tartrate, maléate, malonate, benzoate, diaminobenzène sulfonate, chromoglycate, benzène sulfonate, cyclohexane sulfonate, toluène sulfonate, dipropyl acétate, glucose-1 phosphate, palmoate et palmitate.
Parmi ces dérivés, on peut également citer les dimères de composés de formule générale (I), constitués par deux molécules de composés de formule générale (I), identiques ou différentes, couplées entre elles au niveau de leurs atomes de soufre respectifs. Dans ce cas particulier, R-i figure le groupement S-CH[CH(R2)X]-CO-R3 identifié précédemment.
De même, la présente invention s'étend aux différentes formes éniantomériques des composés revendiqués. En effet, les composés de formule (I) peuvent posséder plusieurs carbones asymétriques, ils existent donc sous forme de mélanges soit racémiques ou de diastéréoisomères ou encore sous forme de stéréoisomères purs.
Au minimum, les composés de formule générale (I) possèdent les deux centres d'asymétrie notés (2) et (3) sur la formule (I). Les composés peuvent par conséquent exister sous forme de 4 stéréoisomères. Ces quatre stéréoisomères sont du domaine de l'invention.
Le groupement R3 peut en outre contenir un ou plusieurs centres chiraux. Les stéréoisomères (R) et (S) de chaque centre chiral supplémentaire sont également du domaine de l'invention.
Les composés optiquement purs peuvent être isolés par des synthèses énantiosélectives ou des résolutions par des aminés chirales. Dans le cas de procédés de préparation conduisant à des mélanges de stéréoisomères, une séparation par HPLC semi-préparative sur colonne (Vydac Cι8, 10x250 mm, CH3CN-H2O) est effectuée, permettant une étude biochimique et pharmacologique séparée de chaque stéréoisomère.
Parmi ces stéréoisomères, sont préférés ceux possédant une configuration absolue (S) sur le carbone (2) portant le groupement R2, et une configuration (S) sur le carbone (3) portant la fonction -SR. A titre de composés préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement citer les composés de formule générale (I) dans laquelle R représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupement S- CH[CH(R2)X]-CO-R3 identique ou différent du groupement figuré par la formule générale (I). S'avèrent par ailleurs tout particulièrement intéressants pour leurs propriétés inhibitrices à l'égard de la toxine botulique les composés de formule générale (I) possédant un caractère hydrophobe significatif.
Ce caractère hydrophobe est notamment favorablement induit par la présence de plusieurs groupements alkyle et plus préférentiellement de nature aryle et/ou hétéroaryle au niveau de la molécule du composé de formule générale (I).
En l'espèce, sont préférés selon l'invention, les composés de formule générale (I) dans laquelle le substituant R2 figure un groupement comprenant au moins un groupe aryle, condensé ou non.
Plus préférentiellement, R2 représente un groupe aryle ou arylalkyle, substitué par au moins une fonction carboxylique.
Cette hydrophobicité peut par ailleurs être renforcée par la présente de chaîne(s) alkyle(s) et/ou de groupe(s) aryle(s) et/ou arylalkyle(s) au niveau des autres substituants Ri et R3.
En l'espèce, selon un mode préféré de l'invention, Ri représente un groupement S-CH[CH(R2)X]-CO-R3. Le composé de formule générale (I) répond alors à la définition d'un disulfure symétrique.
En ce qui concerne R3, il figure de préférence un enchaînement peptidique (AA)nRs avec de préférence n égal à 2, et plus préférentiellement m et p égaux à zéro.
Selon une variante préférée, AA figure un groupe de formule générale (II) dans laquelle les deux groupes R7 différents l'un de l'autre représentent un groupement (aryl)alkyle ou (hétéroaryl)alkyle. A titre de composés préférés, on peut plus particulièrement citer ceux répondant à la formule générale (la) :
SR1
NH, -CH CH CO R,
R, (la) dans laquelle :
- Ri représente un atome d'hydrogène ou de préférence un groupe -S-CH[CH(R2)NH2]COR3 avec R2 et R3 étant tels que définis ci-dessus ou ci-après ;
- R2 représente un groupe (cycloalkyl)alkyle, aryle ou (aryl)alkyle, substitué par au moins une fonction COOH ;
- R3 représente soit un groupement NHR4 avec R4 représentant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, (aryl)alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl)alkyle soit un groupement de formule (lia) :
[NH(CH2)m-CHR7-(CH2)p]nCOR5 (Ma)
dans laquelle :
- n est égal à 1 , de préférence 2, avec lorsque n est égal à 2, les deux groupements figurant entre crochets pouvant être identiques ou différents ;
- R7 représente un groupe (aryl)alkyle ou (hétéroaryl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou groupe(s) OH, OCH3 ou CF3, - R5 représente un groupe NH2 ou NHR'" dans lequel R'" représente un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3, et - m ou p, identiques ou différents, représente 0 ou l'entier 1. Selon un mode préféré de l'invention, m et p sont égaux à zéro et plus préférentiellement n est égal à 2.
En ce qui concerne le groupement figuré par R7 en formules générales (II) ou (lia), il est de préférence choisi parmi les benzyl- naphtylméthyl, benzothiénylméthyl, indolylméthyl et biphénylméthyl. Dans le cas où n est égal à 2, les deux groupes R7 sont de préférence différents. A titre illustratif des composés revendiqués selon l'invention, on peut plus particulièrement citer les dérivés suivants :
- acide (2S, 3S) 2-(p-méthoxybenzyl)-sulfenyl-3-N-Boc amino-4-(4-t- butyloxycarbonyl)-phénylbutanoïque ; - N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Trp-Phe ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Trp-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] (N-Me)Trp- Phe benzamide ; - N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Tyr benzamide;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-His benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxyl)phénylbutanoyl] Bip-Phe- benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-D-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] -D-Bip-Phe benzamide; - N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Ile benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] 1 -Nap-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2 benzyldisulfanediyl-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Tyr benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Ile benzamide) ;
- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Phe benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Bta benzamide) ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis(benzamide) ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis[4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (benza- mide) ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (Bip benzamide) ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phenyl- butanoyl]bis (1-naphtylméthyle amide) ; et de préférence le
- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip benzamide) ; ou
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (Bip Bta benzamide).
La présente invention a également pour objet la préparation des composés revendiqués.
Les composés de formule générale (I) pour lesquels X = NH2, sont obtenus à partir de l'intermédiaire de formule (III) on o) γ
Boc— NH-CH-CH— COOCH3
K 2 (2) (m) dans laquelle : - P est un groupement protecteur du thiol, de préférence le paraméthoxybenzyle
et
- R'2 représente la forme protégée de R2 sur son groupement fonctionnel avec,
Si R2 possède un groupement COOH, R'2 possédant un groupement COOtBu ;
Si R2 possède un groupement SO3H, R'2 possédant un groupement SO3CH2tBu
Si R2 possède un groupement PO3H2, R'2 possédant un groupement
PO3(CH2φ)2 ledit composé étant obtenu par sulfénylation du β-amino ester de formule (IV) :
Boc— NH-CH-CH2— COOCH3
R' 2 (IV)
Cette réaction de sulfénylation est effectuée par action du 2-4- dinitrophenyl p.methoxybenzyl disulfide selon le procédé décrit par Bischoff et al. (1997, J. Org. Chem. 62, 4848-4850).
Le α-amino ester de formule (IV) est obtenu par une réaction d'homologation selon Arndt-Eisert (Meier et al., 1975, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 14, 32-43) de l'α-amino acide N-protégé de formule (V).
Boc— NH-CH-COOH I
R'2 (V)
Ces α-amino acides N protégés ne sont en général pas commerciaux et sont synthétisés de façon enantiosélective par la méthode classique d'OppoIzer (1957, Tetrahedron 43(9), 1969-2004) qui met en jeu le synthon chiral camphosultame de formule (VI) et un dérivé halogène, de préférence brome de formule (VII) :
étant
En utilisant les méthodes classiques de déprotection de l'intermédiaire camphosultame de formule (VIII) et la reprotection classique de la fonction aminé libre sous forme de groupement Boc par action du (Boc)2O (1993, Synth. Commun. 23, 1443), le composé de formule (V) est isolé sous forme énantiomériquement pur.
Si l'acide aminé de formule (V) est de configuration S, l'homologation de formule (V) en formule (IV) se faisant avec rétention de configuration, la formule (IV) possède préférentiellement la configuration S. La réaction de sulfénylation de formule (IV) pour conduire à la formule (III) est essentiellement une trans addition. Le composé de formule (III) présente alors préférentiellement la configuration 2S, 3S.
La déprotection de la fonction ester méthylique de formule (III) pour conduire à la formule (IX), est effectuée soit par action de la soude aqueuse en présence de méthanol et dans ce cas on observe une racémication du carbone chiral en position 2, soit par action du BBTO (bis(tributyltin)oxyde ou oxyde de tributylétain (Salomon et al., 1994, J. Org. Chem. 59, 7259-7266) qui permet de conserver la configuration initiale 2S, 3S. β (3). S | P
Boc— NH-CH-CH-COOH JL (2)
R' (IX)
Les couplages du synthon de formule (IX) avec les différents groupements R3 possédant une fonction amide sont effectués selon les méthodes classiques de la synthèse peptidique.
Typiquement cette réaction est effectuée dans le dichlorométhane ou le diméthylformamide, par action de l'EDCI (1-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthyl-carbodiimide méthiodide) en présence d'HOBt (1-hydroxy- benzothazole) ou de BOP (benzothazol-1-yl-oxy-tris (diméthylamino) phosphonium hexafluoro-phosphate à température ambiante en présence d'une aminé tertiaire telle que la diisopropyléthylamine.
Lorsque R3 représente un acide aminé ou un peptide, le carboxylate C-terminal est protégé sous forme d'un ester t-butylique.
La déprotection finale de tous les groupements protecteurs est obtenue classiquement en une seule étape par action de HF à 0°C en présence de diméthylsulfure, anisole et para-thiocrésol.
Le disulfure symétrique correspondant à la formule générale (I) pour laquelle R-, est S-CH(CH(R2)X)-CO-R3, est obtenu par action d'une solution éthanolique d'iode sur le composé de formule générale (I) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène.
Le disulfure dissymétrique correspondant à la formule générale (I) dans laquelle R-i figure un groupement SR' est obtenu par action sur le composé de formule générale (I) dans laquelle R-i - H, d'un disulfure activé de formule (X) :
R'-S-S-COOCH3 (X)
avec R' étant tel que défini en formule générale (I). Le composé de formule (X) est classiquement formé par action d'un mercaptan de formule R'SH sur le chlorure de méthoxycarbonylsulfényle (CH3O2CSCI ; Aldrich) en présence d'une aminé tertiaire telle que le triméthylamine en solution dans un mélange chloroforme méthanol.
Les composés de formule générale (I) pour lesquels X = H sont obtenus à partir du synthon de formule (XI) dans lequel R'2 représente une forme protégée de R2 telle que définie précédemment.
Le composé de formule (XI) est typiquement préparé en deux étapes à partir d'un α-amino acide de formule (XII) selon le schéma réactionnel suivant
(XI) (XII)
L'α-amino acide de formule (XII) subit la réaction classique de desamination halogenante par action du nitrite de sodium en présence d'acide bromhydrique. Cette réaction se fait généralement avec rétention de configuration.
Le composé de formule (XIII) subit alors une substitution nucléophile de type SN2 par action du sel de sodium du paraméthoxy-α-toluène thiol
(CH3O-φ-CH2SH ; Aldrich). Le synthon de formule (XI) est ensuite couplé avec différents composés correspondant à la formule générale pour R3 selon le protocole précédemment décrit pour conduire aux différents composés de formule générale (I) dans lesquels X = H.
Les composés revendiqués s'avèrent capables d'inhiber significativement l'activité enzymatique de la toxine botulique de type B. A ce titre, les composés revendiqués peuvent être utilisés en thérapie dans tous les processus pathologiques induits par cette toxine.
Plus précisément, les applications cliniques pour lesquelles on peut envisager l'utilisation de ces composés comprennent les maladies initiées par la toxine botulique BoNT/B.
A ces fins, les composés revendiqués et leurs dérivés peuvent être utilisés pour la préparation de compositions pharmaceutiques correspondantes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne, selon un autre de ses aspects, une composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif au moins un composé de formule générale (I) ou un de ses dérivés.
Bien entendu, ce composé peut y être associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On peut également envisager de lier de manière covalente le composé de formule générale (I) à un peptide (séquence de Tat, de pénétratine, etc..) afin de le vectoriser notamment à l'intérieur de la cellule. De même, il est possible d'associer deux ou plusieurs composés de formule générale (I) dans une même composition pharmaceutique.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie orale, parentérale, sublinguale, transdermique ou topique.
En ce qui concerne l'administration par voie orale ou sublinguale, on utilise en particulier des comprimés, simples ou dragéifiés, des gélules, des granules éventuellement à libération retardée, des gouttes ou encore des liposomes. En ce qui concerne l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, on a recours à des solutions stériles ou stérilisables en particulier pour perfusion veineuse, tandis que l'on peut réaliser les patches conventionnels pour l'administration par voie transdermique. Pour l'utilisation topique on peut utiliser des crèmes ou des lotions à étendre sur la peau.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être préparées selon des méthodes usuelles bien connues dans le domaine de la technique pharmaceutique. Le principe actif peut être incorporé dans les excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, la stéarate de magnésium, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les différents agents mouillants, dispersants, ou émulsifiants, les conservateurs, etc ...
La quantité de principe actif à administrer par jour dépend bien entendu de la particularité de l'indication thérapeutique, de la gravité des affections à traiter, ainsi que du poids du malade et de la voie d'administration. Pour une administration systémique, la dose globale chez l'homme varie généralement entre 1 et 100 mg par jour, par exemple de 2 à 50 mg, et plus convenablement de 3 à 40 mg par jour.
Des formes unitaires de dosage pour l'administration systémique comprendront généralement de 3 à 50 mg (à savoir 3, 5, 10, 20, 30, 40 et 50 mg de produit). Ces doses unitaires seront administrées normalement une ou plusieurs fois par jour, de préférence une à trois fois par jour.
Pour l'administration topique, les compositions pharmaceutiques contiennent généralement de 0,0001 à 10% de principe actif et de préférence de 0,01 à 5%. Outre cette utilisation des composés de formule générale (I) à titre d'agent thérapeutique potentiel des maladies induites par la toxine BoNT/B, on peut également envisager leur utilisation conjointe avec la toxine par exemple, à des fins thérapeutiques.
En effet, il a été développé en clinique humaine des méthodes de traitement thérapeutiques symptomatiques des dystonies par hyperactivité motoneuronale. Ce type de prophylaxie est en particulier proposé pour traiter des troubles du type strabisme, blépharospasme, crampe de l'écrivain, spasme hémifacial. La thérapie consiste à injecter des doses de toxines clostridiales au niveau de l'organisme traité. Il est clair que compte tenu du caractère toxique de ces toxines, les doses mises en œuvre, doivent être minimisées de manière à prévenir tout effet secondaire néfaste. La co-administration d'un composé selon l'invention avec une toxine offre donc la possibilité d'employer des doses plus significatives et donc plus efficaces en ces toxines.
En conséquence, les composés selon l'invention fournissent avantageusement un antidote pour toute activité non désirée de la toxine BoNT/B, administrée en clinique humaine.
On peut également envisager le développement de protocole de co- administration permettant la détection et/ou titration de l'activité de ces toxines dans des cibles musculaires définies pour atteindre le résultat clinique désiré.
En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation conjointe d'au moins un composé de formule générale (I) avec au moins une toxine clostridiale comme la neurotoxine botulique et propose une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé de formule générale (I) en mélange avec au moins une toxine clostridiale.
Les composés décrits selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'applications non thérapeutiques en particulier dans des systèmes de diagnostic et de détection de neurotoxine botulique. Les exemples présentés ci-après à titre non limitatif mettront en évidence d'autres avantages de la présente invention.
PROCÉDÉS DE PRÉPARATION. Les analyses par HPLC des produits terminés sont conduites sur un appareil Shimatzu® avec une colonne Kromasil® (C8 ou C-ie) 5 μm, 100Â (débit 1 ml/min, λ 210 nm) (250 x 4.6 mm ou 150 x 4.6 mm).
L'éluent est constitué d'un mélange en proportions variables des solutions A et B. A (0.05% TFA dans H2O) ; B (CH3CN/H2O (0.038% TFA) = 9/1 ).
Les abréviations suivantes ont été utilisées. Bip : (L)Biphénylalanine 1 Nap : (L)l-naphtylalanine Bta : (L)Benzothienylalanine.
EXEMPLE 1
Synthèse de l'acide (2S, 3S) 2-(p-méthoxybenzyl)-sulfényl-3-N-Boc amino-4-(4-t-butyloxycarbonyl)-phénylbutanoïque. Etape 1. Synthèse de l'acide (2S) 2-(N-Boc) amino-3-[4-t-butyloxy- carbonyljphényl propanoïque.
Une solution dans le THF de 33.5 g (78.6 mM) de la copule chirale d'OppoIzer est refroidie à -78°C sous argon. On ajoute successivement 33 ml (1.05 eq) de nBuLi (2.5 M dans l'hexane) puis après 15 min, une solution de 25 g (1.2 eq) de 4-bromomethyl benzoate de t-butyl [obtenu par action du N-bromosuccinimide sur le t-butyrate de l'acide paratoluique (réaction de Wohl-Zieyler & S. Pizey. Synthesis reagents, Vol. 2, New York, 1974, pp. 1-63) dans 250 ml d'un mélange THF/HMPA. On laisse agiter 3 h à température ambiante. La réaction est arrêtée par addition à 0°C de 30 ml d'un mélange THF/AcOH = 4/1. Le mélange est concentré sous vide, repris par 600 ml d'éther et lavé par une solution à 10% de NH CI par de l'eau puis par une solution saturée de NaCI. Après séchage sur Na2SO la solution est évaporée à sec. On obtient une huile jaune qui est purifiée par chromatographie. Solide blanc 34.1 g (71 %) Pf 174°C ; Rf(c.hex./EtOAc = 7/3) 0.51. La fonction aminé du composé précédent (32 g) est alors déprotégée en solution dans le THF par action de 540 ml d'acide citrique à 10%. Après 2 h à température ambiante, le THF est évaporé sous vide et la phase aqueuse lavée 3 fois à l'éther. La phase aqueuse est alors amenée à pH 8 par addition de NaHCO3 à 10% et le produit attendu est extrait par CH2CI2. Après séchage et evaporation à sec on obtient 20.7 g (88%) d'une huile incolore qui cristallise lentement.
On dissout alors 20.7 g du composé précédent dans 200 ml de DMF. On ajoute alors 11.65 ml de triéthylamine et 9.94 g de (Boc)2O à 0°C. Après une nuit à température ambiante, la solution est évaporée à sec, reprise par l'acétate d'éthyle, lavée par KHSO4 à 10%, H2O, NaCI saturé et séchée sur Na2SO . Après evaporation à sec et chromatographie sur gel de silice. On obtient 16.3 g (70%) d'une mousse blanche Rf(c.hex./EtOAc/CH2CI2 = 7/1.5/1.5) 0.21. L'auxiliaire chiral est clivé sur le produit précédent (16.3 g) par action d'une solution de 2.78 g de LiOH, 12.57 g de LiBr et 3.73 g de (nBu)4 NBr dans 300 ml d'acétonitrile. Après agitation 18 h à température ambiante, le mélange est évaporé à sec, repris par l'eau et lavé par de l'éther. La phase aqueuse est alors acidifiée par KHSO4 à 10% et extraite par CH2CI2. Après chromatographie sur gel de silice on obtient une mousse blanche (7.5 g, 71 %). Rf(c.hex./EtOAc/AcOH = 5/5/0.5) 0.75.
Etape 2. Synthèse de l'ester méthylique de l'acide (3S) 3-(N- Boc)amino-4-[4-t-butyloxycarbonyl]phénylbutanoïque.
Une solution dans 60 ml de THF de 7.2 g du N-Boc α-amino acide précédent est agitée à -20°C sous argon pendant 15 min avec 2.6 ml d'isobutylchloroformate. On élimine rapidement le précipité et on ajoute à la solution 110 ml de diazométhane. Après 2 h à température ambiante on évapore à sec. Le résidu est repris dans 180 ml de méthanol et on ajoute 0.32 g de PhCOOAg et 8.5 ml de triéthylamine, et on agite 15 min à 0°C et 30 min à température ambiante. On filtre, on évapore à sec et on reprend par l'éther. On lave par NaCI saturé, on sèche sur Na2SO et on évapore à sec. Solide jaune 5.7 g (73%). Pf = 71 °C.
Etape 3. Ester méthylique de l'acide (2S, 3S) 2-(p-méthoxy benzyl)sulfényl-3-N-Boc amino-4-(4-t-butyloxycarbonyl)phénylbutanoïque. A 0°C sous argon, on ajoute 15.25 ml de BuLi (2.5 M dans l'hexane) à un mélange de 7.5 ml de HMDS fraîchement distillé et 90 ml de THF anhydre. Après 15 min à 0°C, la solution est refroidie à -70°C et on ajoute une solution de 5 g du N-Boc β-amino ester précédent dans 50 ml de THF anhydre. Après 2 h à -70°C on ajoute 4.4 ml d'HMDA et 6.3 g du (p- méthoxybenzyl-2,4-dinitrophényl]disulfure et on agite 1 h 30 à la même température. Le mélange réactionnel est alors versé sur un mélange 50/50 HCI 1 N/Et2O. On élimine le précipité. On lave la phase organique par de l'eau, et du NaCI saturé. On sèche sur Na2SO4 et évapore à sec. L'huile rouge est purifiée par chromatographie sur silice (c.hex/CH2CI2/EtOAc = 8/1/1 ). On obtient une huile jaune qui cristallise 3.84 g (54%). Pf = 79°C.
Etape 4. Acide (2S, 3S) 2-p-méthoxybenzyl sulfényl-3-N-Boc amino 4-(4-t-butyloxycarbonyl)phénylbutanoïque.
A une solution de 20.3 ml d'oxyde de tributylétain (BBTO) dans 80 ml d'acétonitrile est ajoutée une solution de 3.7 g de l'ester précédent en solution dans 13.5 ml d'acétonitrile. Le mélange est porté au reflux pendant 5 jours. On refroidit à 0°C, et on ajoute en 2 h 50 ml d'HCI. Après 3 h à température ambiante on extrait par 25 ml d'EtOAc. On lave par H2O, NaCI saturé, on sèche sur Na2SO4 et évapore à sec. On purifie par chromatographie sur gel de silice (c.hex./EtOAc/AcOH = 8/2/0.5). Solide jaune 2.85 g (79%) Tr = [C18 Kromasil 5 μM/10θA, 250 x 4.6 mm, 80% CH3CN/20% H2O (TFA 0.05%), 1 ml/min] = 6.1 min.
EXEMPLE 2 N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Trp-
Phe.
Etape 1. On prépare une solution du synthon décrit dans l'exemple 1 (1 eq) du dipeptide Trp-PheOtBu, (1 eq) d'HOBT (1-hydroxybenzotriazole, 1 eq) de diisopropyléthylamine (1.2 eq) et de (1-(3-diméthylaminopropyl)- 3-éthyl-carbodiimide méthiodide (EDCI) 4 eq dans le minimum de DMF et on agite pendant 2 jours à température ambiante. Le solvant est évaporé, le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle, lavé dans les conditions classiques d'un couplage peptidique, séché et évaporé à sec.
Etape 2. Le pseudopeptide entièrement protégé est mis en présence de 5 μl/mg de diméthylsulfure, 5 μl/mg d'anisole et 1 μl/mg de p- thiolcresol, et est placé dans le réacteur où le HF est distillé à 0°C. Après réaction pendant 1 h à 0°C, le HF est évaporé et le résidu est précipité dans un mélange éther/hexane à -20°C. Le solide est alors solubilisé dans l'eau et lyophilisé. Le résidu est purifié par HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, avec un gradient en 30 min de 30 à 90% de B, 1 ml/min, Tr 13.5 min. Masse = MH+ 589.3.
EXEMPLE 3 N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Trp-
Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Trp-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-PheOtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(55% de B) 5.2 min. Masse MH+ = 678.4. EXEMPLE 4
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] (N- Me)Trp-Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide (N-Me) Trp-PheNHBzl à la place du dipeptide ester Trp-PheOtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(50% de B) 7.4 min. Masse MH+ =
692.6.
EXEMPLE 5
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Tyr benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide Bip-Tyr-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM,
100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min)
= 11.1 min. Masse MH+ = 731.
EXEMPLE 6 N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-His benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide Bip-His-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(35% de B) = 6.2 min. Masse MH+ =
705.3. EXEMPLE 7
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxyl)phénylbutanoyl] Bip- Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM,
100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(60% de B) = 13.2 min. Masse MH+ =
715.5.
EXEMPLE 8
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-D- Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide Bip-D-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 13.2 min. Masse MH+ = 715.5.
EXEMPLE 9 N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] -D-Bip-
Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide D-Bip-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 12.6 min. Masse MH+ = 715.6. EXEMPLE 10
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Ile benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide Bip-lle-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM,
100À, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min)
= 11 min. Masse MH+ = 680.
EXEMPLE 11
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] 1 -Nap- Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide 1-Nap-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(50% de B) = 7.4 min. Masse MH+ =
689.5.
EXEMPLE 12 N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ere étape le dipeptide amide Bip-Bta-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 55 à 100% de B en 15 min)
= 8.9 min. Masse MH+ = 771.7. EXEMPLE 13
N-[2S,3S)-2-benzyldisulfanediyl-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide.
Ce composé est préparé par action du disulfure active BzCH2S- SCOOCH3 (obtenu par action du chlorure de méthoxy carbonyl suifényle sur le benzyl mercaptan) sur le composé 12 en présence de triéthylamine en solution dans CCI4. On purifie par HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 16.1 min. Masse MH+ = 893.2.
EXEMPLE 14
(2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Tyr benzamide).
Ce composé est obtenu en traitant le composé de l'exemple 6 par une solution iode 10"2 M dans l'éthanol, en solution dans un mélange acétonitrile/eau jusqu'à coloration jaune persistante. On évapore à sec ; le produit est lyophilisé. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 10θA, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 19 min. Masse MH+ = 1461.1.
EXEMPLE 15
(2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Ile benzamide).
Ce composé est obtenu à partie du composé 11 en suivant le protocole décrit dans l'exemple 14. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 13.6 min. Masse MH+ = 1360.2. EXEMPLE 16
(2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Phe benzamide).
Ce composé est obtenu à partir du composé 8 en suivant le protocole décrit dans l'exemple 14. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(70% de B) = 6.4 min. Masse MH+ = 1428.8.
EXEMPLE 17 (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Bta benzamide).
Ce composé est obtenu à partir du composé 13 en suivant le protocole décrit dans l'exemple 14. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 15.6 min. Masse MH+ = 1541.0.
EXEMPLE 18
(2S)-2,2'[disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl)] bis(benzamide). Ce composé est préparé en couplant le synthon décrit dans l'exemple 1 avec la benzylamine en présence de BOP et de diisopropylamine dans le dichlorométhane. Le solvant est évaporé et le produit lavé dans les conditions acidobasiques. Il est séché. Le produit est ensuite déprotégé comme décrit précédemment dans l'exemple 1 et purifié par HPLC semi-préparative. Il est oxydé en disulfure comme décrit précédemment. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(35%) = 5.6 min. Masse MH+ = 689.8. EXEMPLE 19
(2S)-2,2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] bis (1-naphtylméthyl amide).
Ce composé est préparé en couplant le synthon décrit précédemment dans l'exemple 1 avec la 1-naphtalène methylamine comme décrit dans l'exemple 2, c'est-à-dire en présence d'HOBT, de diisopropyléthylamine et d'EDCI dans un minimum de DMF. Le produit est traité, ainsi que décrit dans l'exemple 2. Il est déprotégé de la même façon (étape 2 de l'exemple 2). Il est purifié par HPLC semi-préparative. Il est ensuite oxydé en disulfure comme décrit précédemment. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 10θA, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 15.0 min. Masse MH+ = 787.9.
EXEMPLE 20 (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-benzamide).
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la première étape l'acide aminé, amide benzylé Bip-NH- Bzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu à la différence qu'après couplage, déprotection et purification, il est oxydé en disulfure. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 μM, 10θA, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 20.5 min. Masse MH+ = 1134.3.
EXEMPLE 21 2,2'-disulfanediyl bis[4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (benzamide).
Etape 1. Synthèse de l'acide (2S)-2-(N-Boc)amino-3-[4-methyl oxycarbonyl] phenylpropanoique.
La même méthode que pour l'étape 1 de l'exemple 1 est appliquée mais en utilisant le 4-bromomethyl benzoate de méthyle. Etape 2. Synthèse de l'acide (2S)-2-amino-3-[4-methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
L'aminé est déprotégée à l'aide de TFA dans le dichlorométhane. Le TFA est ensuite évaporé ainsi que le DCM. Le produit est ensuite séché.
Etape 3. Synthèse de l'acide (2R)-2-bromo-3-[4-methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
L'acide précédemment obtenu (1 équiv.) est mélangé avec une solution aqueuse à 48% de HBr aqueuse à 0°C dans l'eau puis 1.6 équiv. de NaNO2 dans l'eau sont additionnés. Le mélange est agité pendant 2 h
30 à température ambiante. Les vapeurs nitreuses sont évaporées et le produit est extrait par l'éther et séché.
Etape 4. Synthèse de l'acide (2R)-2-thioacétate-3-[4- methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
Le produit précédent est dissout dans la DMF (diméthylformamide) et 3 équiv. de thioacétate de potassium sont additionnés. La réaction dure 1 nuit à température ambiante. Le mélange est ensuite acidifié et le produit est extrait à l'acétate d'éthyle et séché.
Etape 5. Synthèse de la N-[(2S)-2-thioacétate-3-(4-methoxycarbonyI) phenylpropanoyl]benzamide.
La benzylamide est couplé au produit précédent comme décrit précédemment (1ère étape de l'exemple 2).
Etape 6.
Le produit précédent est traité par de la soude 0.5N dans le methanol sous atmosphère oxydante. Après acidification, traitement et purification par HPLC semi-préparative, le produit est obtenu, sous forme d'un mélange de 2 stéréoisomères. HPLC sur colonne Cι8 Kromasil, 5 μm, 100 A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(35%B) = 8.1 et 8.63 min. Masse MH+ = 629.7.
EXEMPLE 22. 2,2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (Bip-NH benzamide).
Ce produit est obtenu comme le composé 21 mais en couplant Bip- NHBzl dans l'étape 5. HPLC sur colonne C18 Kromasil, 5 μm, 100 A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 22.8 et 23.4 min. Masse MH+ = 1076.3.
EXEMPLE 23.
2,2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (Bip Bta- benzamide). Ce produit est obtenu comme pour l'exemple 21 mais en couplant
Bip Bta-NHBzl dans l'étape 5. HPLC sur colonne C18 Kromasil, 5 μm, 100 A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr(gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 17.4 et 18.1 min. Masse MH+ = 1480.7.
EXEMPLE 24
Synthèse du 2,2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl]bis (Bip Bta benzamide)
Etape 1. Synthèse du 4-(3-Bromo-3-carboxy-propyl)-benzoic acid tert-butyl ester.
Une solution de 0.291 g (3.7 eq) de bromure de potassium dans 0.87 ml d'acide bromhydrique (0.75 M) est refroidie à 0°C. On ajoute successivement 0.0874 g (1.9 eq) de nitrite de sodium et une solution du composé ester tethiobutylique de l'homophenylalanine (J. Org. Chem., 1987, 52, 5143-5150 et BioOrg. And Med. Chem. 2000, 8, 1677-1696) 0.24 g (0.66 mM) dans 3 ml d'acide bromhydrique (0.75 M). On laisse agiter à 0°C pendant 90 minutes et on ajoute 20 ml d'acétate d'éthyle froid. Cette phase organique est récupérée, lavée par de l'eau, une solution saturée de chlorure de sodium et séchée sur sulfate de sodium. Après evaporation, on obtient une huile jaune qui est purifiée par chromatographie (huile incolore, masse : 0.14 g (62%), Rf (c. Hex/ EtOAc/ AcOH : 7/3/0.5) = 0.19
Etape 2. Synthèse du 4-(3-acetylsulfanyl-3-carboxy-propyl)-benzoic acid tert butyl ester. Une solution de 0.125 g (0.36 mM) de l'ester obtenu dans l'étape 1 dans 0.364 ml de soude 1 N est refroidie à 0°C. On ajoute 0.05 g (1.2 eq) de thioacétate de potassium et laisse sous agitation à température ambiante pendant 48 heures. On acidifie à 0°C avec une solution d'acide chlorhydrique 1 N. On extrait par de l'acétate d'éthyle, lave la phase organique par de l'eau et une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage et evaporation, on obtient une huile incolore (masse : 0,12 g, 98%). Rf (c.Hex/EtOAc/AcOH : 7/3/0.5) = 0.11.
Etape 3. Synthèse du 2,2'[disulfanediyl bis (4-tert butoxycarbonyl phényl) butanoic] bis acid.
Une solution de 0.12 g (0.35 mM) de l'ester de l'étape 2 dans 2 ml de methanol est refroidie à 0°C. On ajoute 0.7 ml (2.1 eq) d'une solution de soude 1 N et laisse agiter à température ambiante pendant 30 minutes. On ajoute ensuite goutte à goutte une solution de 0.25 M d'iode dans l'éthanol jusqu'à coloration jaune persistante et acidifie à pH 1-2 avec une solution d'acide chlorhydrique 1 N. Le produit est extrait par de l'acétate d'éthyle, lavé par de l'eau et séché (huile incolore, masse : 0.1 g (95%), Rf (c.Hex/EtOAc/AcOH : 6/4/0.5) = 0.25.
Etape 4. Synthèse du 2,2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenyl- propanoyl]bis (Bip Bta benzamide). Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant, dans la première étape, le synthon de l'étape 3 ci-dessus au lieu du synthon de l'exemple 1 , et le dipeptide amide Bip-Bta-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-PheOtBu. HPLC sur colonne Kromasil 5 μm, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/mn, Tr : 25 mn et 25.6 mn, isocratique à 75% de B pendant 10 mn puis gradient à 95% de B en 10 mn, isocratique à 95% de B en 10 mn.
Le pseudodipeptide ester est ensuite mis en présence de 0.13 μl/mg d'anisole et de 5 μl/mg d'acide trifluoroacétique pendant 1 heure à température ambiante. Le milieu reactionnel est évaporé et on fait précipiter le produit dans l'ester diéthylique. Le produit est purifié par HPLC semi-préparative et lyophylisé. HPLC sur colonne Kromasil 5 μm, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/mn, Tr : 15.3 mn et 16.5 mn, isocratique à 75% de B pendant 10 mn puis gradient à 95% de B en 10 mn, isocratique à 95% de B en 10 mn. Masse (M-H) = 1508.
EXEMPLE 25
Mesure de l'activité inhibitrice des molécules exemplifiées vis-à-vis de l'activité protéolytique de la BoNT/B. On préincube dans 100 μl final de tampon HEPES 20 mM pH 7.4 en présence ou en absence de 0.1 mM DTT (dithiotheol) des quantités croissantes d'inhibiteurs et 0.35 ng de chaîne légère de BoNT/B à 37°C pendant 30 min. On ajoute alors 18 μM du substrat spécifique de BoNT/B Syb 60-94 [Pya74, Nop77] et l'incubation est poursuivie pendant 30 min à 37°C. La réaction est stoppée par addition de HCI 0.2 M et la lecture de la fluorescence est faite directement.
La quantité de métabolite formé dans chaque essai est déterminée à partir des courbes étalon de fluorescence. Le Ki de l'inhibiteur est déterminé à partir de la relation de Cheng Prussof ; Ki = IC5o/1+S/KM. Pouvoir inhibiteur vis à vis de la toxine botulique de type B des exemples décrits
41


Claims

REVENDICATIONS
1. Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (I):
SR, (2) | π
X— CH— CH— CO— R3
I O)
R2 (I) dans laquelle :
- (2) et (3) figurent deux des centres d'asymétrie possibles dans la molécule ;
- X représente un atome hydrogène, une aminé primaire NH2 ou une aminé secondaire NHR avec R représentant un groupe alkyle ou arylalkyle ;
- Ri représente : • un atome hydrogène,
• un groupement S-R' dans lequel R' représente un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 ; ou • un groupement S-CH[CH(R2)X]-CO-R3 avec R2, X et R3 étant tels que définis ci-dessus ou ci-après ;
- R2 représente un groupe alkyle, alkényle, alkynyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou (aryl)alkyle, substitué par un groupement COOH ou COOR", SO3H ou SO3R", PO3H2 ou PO3R"2, avec R" représentant un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 ;
- R3 représente :
• un groupement NHR dans lequel * représente un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, (aryl)alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl)alkyle ; ou • un enchaînement peptidique (AA)nR5 dans lequel :
- n est égal à 1 ou 2
- R5 est égal à OH, NH2, NHR'" avec R"' représentant un groupe alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, (aryl)alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryle)alkyle
- AA représente un reste d'acide aminé de formule (II)
N(R6)-(CH2)m-CH(R7)-(CH2)p-CO (II)
dans laquelle :
. m = 0 ou 1 , p = 0 ou 1 ,
. Rβ représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, de préférence méthyle, et
R représente un groupe alkyle, (aryl)alkyle ou (hétéroaryl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou plusieurs groupe(s) OH, alkoxy et de préférence OCH3 ou CF3, avec lorsque n est égal à 2, les deux restes d'acides aminés AA pouvant être identiques ou différents ; ou caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé d'un composé de formule
(I), tel qu'un sel d'addition d'un composé de formule (I) avec un acide, ou bien un dimère de composés de formule (I).
2. Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que Ri représente un atome d'hydrogène ou figure un groupement
-S-CH[CH(R2)X]-CO-R3, identique ou différent du groupement figuré par la formule générale I.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R2 figure un groupement comprenant au moins un groupe aryle, condensé ou non.
4. Composé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que R2 est un groupe aryle ou arylalkyle, substitué par au moins une fonction carboxylique.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que R3 figure un enchaînement peptidique (AA)πR5 avec de préférence n égal à 2.
6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que m et p sont égaux à zéro.
7. Composé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que AA figure un groupe de formule générale (II) dans laquelle les deux R7 différents l'un de l'autre, représentent un groupement (aryl)alkyle ou (hétéroaryl)alkyle.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (la) :
SR1
dans laquelle :
- Ri représente un atome d'hydrogène ou de préférence un groupe -S-CH[CH(R2)NH2]COR3 avec R2 et R3 étant tels que définis ci-après ;
- R2 représente un groupe (cycloalkyl)alkyle, aryle ou (aryl)alkyle, substitué par au moins une fonction COOH ; - R3 représente soit un groupement NHR4 avec R4 représentant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, (aryl)alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl)alkyle soit un groupement de formule (Ha) :
[NH(CH2)m-CHR7-(CH2)pJnCOR5 (Ma)
dans laquelle :
- n est égal à 1 , de préférence 2, avec lorsque n est égal à 2, les deux groupements figurant entre crochets pouvant être identiques ou différents ;
- m ou p, identiques ou différents, représente zéro ou l'entier 1 , et de préférence représente tous deux zéro,
- R7 représente un groupe (aryl)alkyle ou (hétéroaryl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou groupe(s) OH, OCH3 ou CF3, et
- R5 représente un groupe NH2 ou NHR'" dans lequel R'" représente un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 .
9. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une configuration 2S, 3S.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Trp-Phe ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Trp-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] (N-Me)Trp- Phe benzamide ; - N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Tyr benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-His benzamide ; - N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxyl)phénylbutanoyl] Bip-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-D-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] -D-Bip-Phe benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Ile benzamide ;
- N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] 1 -Nap-Phe benzamide ; - N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide ;
N-[(2S, 3S)-2-benzyl)disulfanediyl-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl] Bip-Bta benzamide ,
- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Tyr benzamide) ;
- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Ile benzamide) ;
- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Phe benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Bta benzamide) ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phényl butanoyl]bis(benzamide) ;
- (2S)-2,2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (1-naphtylméthyle amide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [(3S)-3-amino-4-(4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip benzamide).
11. Composé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (Ib) :
dans laquelle R-i, R2 et R3 sont tels que définis en revendication 8.
12. Composé selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les dérivés suivants :
(2S)-2,2'-disulfanediyl bis[4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (benzamide); - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (Bip benzamide) ;
- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [4-(4-carboxy)phenylpropanoyl] bis (Bip Bta benzamide).
13. Procédé de préparation d'un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'on procède à un couplage soit du synthon de formule générale (IX) :
(3) ψ Boc— NH-CH-CH-COOH (|X)
I (2)
R' 2 soit du synthon de formule générale (XI) :
dans lesquelles R'2 figure la forme protégée de R2, avec un groupement R3 portant une fonction amide, selon la synthèse peptidique puis à la déprotection finale de tous les groupements protecteurs.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le disulfure symétrique correspondant à la formule générale (I) pour laquelle R- représente S-CH(CH(R2)X)-CO-R3, est obtenu par action d'une solution éthanolique d'iode sur ledit composé de formule générale (I) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène.
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le disulfure dissymétrique correspondant à la formule générale (I) dans laquelle Ri figure un groupement SR' tel que défini en revendication 1 , est obtenu par action sur ledit composé de formule générale (I) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène, d'un disulfure activé de formule (X) :
R'-S-S-COOCH3 (X) avec R' représentant un groupe alkyle, aryle, (aryl)alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl)alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3.
16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un composé de formule générale (I) tel que défini en revendication 1 à 12.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une toxine clostridiale.
19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que le composé de formule générale (I) est lié de manière covalente à un peptide capable de le vectoriser.
20. Système de diagnostic pour détecter des neurotoxines botuliques caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 12.
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