FR2823212A1 - Inhibiteurs de la toxine botulique de type b - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne de nouveaux composés de formule générale (I) : (CF DESSIN DANS BOPI) dotés de propriétés inhibitrices vis-à-vis de l'activité de la toxine botulique de type B, leurs procédés de préparation et les compositions pharmaceutiques correspondantes.Elle vise également les compositions pharmaceutiques correspondantes.
Description
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La présente invention concerne de nouveaux composés dotés de propriétés inhibitrices de l'activité de la toxine botulique de type B, leurs procédés de préparation et les compositions pharmaceutiques correspondantes.
La famille des neurotoxines botuliques est constituée par sept protéines structuralement similaires mais antigéniquement différentes (sérotypes A à G) produites par différentes souches du bacille anaérobie "Clostridium botulinum". Elles sont les toxines les plus puissantes connues avec des doses létales 50 chez la souris de 0.1 à 1 ng/kg. Elles agissent au niveau du système nerveux périphérique de l'homme et de diverses espèces animales en induisant le"botulisme"qui est caractérisé par une paralysie flasque des muscles du squelette pouvant entraîner la mort. Les deux formes les plus fréquemment rencontrées sont les toxines botuliques de types A et B. La forme majeure d'intoxication par les neurotoxines est due à l'ingestion de nourriture contaminée. Mais ces protéines, qui sont faciles à produire, peuvent également constituer une arme biologique potentielle. Enfin, depuis quelques années, les toxines botuliques A et B sont utilisées pour des applications thérapeutiques dans le cadre de dystonies, d'hyperactivité motoneuronale, telle que le strabisme, le blépharospasme, etc...
Les neurotoxines botuliques sont constituées de deux sous-unités : une chaîne lourde (-100 kDa) associée à une chaîne légère (-50 kDa) par l'intermédiaire d'un pont disulfure. La chaîne lourde intervient dans la liaison de la toxine à la terminaison nerveuse, dans l'internalisation puis dans la translocation de la chaîne légère dans le cytosol. La chaîne légère est responsable de la toxicité de la protéine par inhibition de la libération, Ca2+ dépendante, de l'acétylcholine. La toxicité de la chaîne légère est due à son activité peptidasique. En effet, les toxines botuliques appartiennent à la famille des métallo peptid ases à zinc qui contiennent la séquence consensus HExxH (Schiavo et al., 1992, J. Biol. Chem. 267 (33),
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23479-23483). Elles clivent de façon très spécifique les protéines neuronales impliquées dans l'exocytose des neurotransmetteurs.
La toxine botulique de type B, coupe la synaptobrevine (VAMP) une petite protéine de 116 acides aminés enchâssée dans la membrane des petites vésicules synaptiques, au niveau de la liaison Q76-F77.
L'approche la plus efficace pour combattre les effets néfastes de la toxine BoNT/B, soit au cours d'un botulisme déclaré, soit au cours de contre-indications thérapeutiques est le développement d'inhibiteurs sélectifs et de haute affinité de l'activité métallopeptidasique de la toxine.
Quelques inhibiteurs de faible efficacité ont été précédemment décrits dans la littérature. On peut citer : i) les buforines 1 et Il (Garcia et al., 1999, J. Applied Toxicology 19 (Suppl 1) S19-S22) qui inhibent le BoNT/B avec des IC50 de 10-6 M et 2.5 10-4 M respectivement ; ii) ! CD
1578 (7-N-phenylcarbamoyl-amino-4-chloro-3-propyloxycoumarine) IC5o = 27 uM (Adler et al., 1998, FEBS Lett. 429, 234-238) ; Hi) le phosphoramidon, un inhibiteur de néprylisin, qui testé in vivo sur le nerf phrénique de la souris a une dose efficace de 0.2 mM (Deshpaude et al., 1995, Toxicon 33,551-557) ; iv) des analogues phosphonates du phosphoramidon tels que l'ICD 2821 (Adler et al., 1999, J. Applied Toxicology 16, S5-S11) qui semblent un peu plus efficace que le phosphoramidon lui-même ; v) enfin des inhibiteurs de toxine tétanique (Martin et al., 1999, J. Med. Chem. 42 (3), 515-524) ont montré des activités micromolaires sur la BoNT/B.
1578 (7-N-phenylcarbamoyl-amino-4-chloro-3-propyloxycoumarine) IC5o = 27 uM (Adler et al., 1998, FEBS Lett. 429, 234-238) ; Hi) le phosphoramidon, un inhibiteur de néprylisin, qui testé in vivo sur le nerf phrénique de la souris a une dose efficace de 0.2 mM (Deshpaude et al., 1995, Toxicon 33,551-557) ; iv) des analogues phosphonates du phosphoramidon tels que l'ICD 2821 (Adler et al., 1999, J. Applied Toxicology 16, S5-S11) qui semblent un peu plus efficace que le phosphoramidon lui-même ; v) enfin des inhibiteurs de toxine tétanique (Martin et al., 1999, J. Med. Chem. 42 (3), 515-524) ont montré des activités micromolaires sur la BoNT/B.
Toutefois, toutes ces molécules se révèlent peu efficaces sur la toxine BoNT/B.
Il demeure donc un besoin de médicaments pour traiter à doses plus réduites les maladies induites par la toxine botulique B.
La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés capables d'inhiber sélectivement l'activité enzymatique de la toxine botulique. Ces composés sont des agents thérapeutiques potentiels du botulisme.
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Plus précisément, la présente invention décrit des composés de formule générale (1), capables d'inhiber sélectivement la toxine botulique B avec une haute affinité et sélectivité pour cette toxine :
dans laquelle : - (2) et (3) figurent deux des centres d'asymétrie possibles dans la molécule ; - X représente un atome hydrogène, une amine primaire NH2 ou une amine secondaire NHR avec R représentant un groupe alkyle ou arylalkyl ; - Ri représente : un atome hydrogène, un groupement S-R'dans lequel R'représente un groupe alkyle, aryle, (aryl) alkyle, cycloalkyl, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CFs ; ou 'un groupement S-CH [CH (R2) X]-CO-R3 avec R2, X et R3 étant tels que définis ci-dessus ou ci-après ; - R2 représente un groupe alkyle, alkényle, alkynyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle ou (aryl) alkyle, substitué ou non par un groupement COOH ou COOR", SO3H ou SO3R", PO3H2 ou PO3R"2 avec R"représentant un groupe alkyle, aryle, (aryl) alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 ; - Ra représente :
dans laquelle : - (2) et (3) figurent deux des centres d'asymétrie possibles dans la molécule ; - X représente un atome hydrogène, une amine primaire NH2 ou une amine secondaire NHR avec R représentant un groupe alkyle ou arylalkyl ; - Ri représente : un atome hydrogène, un groupement S-R'dans lequel R'représente un groupe alkyle, aryle, (aryl) alkyle, cycloalkyl, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CFs ; ou 'un groupement S-CH [CH (R2) X]-CO-R3 avec R2, X et R3 étant tels que définis ci-dessus ou ci-après ; - R2 représente un groupe alkyle, alkényle, alkynyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle ou (aryl) alkyle, substitué ou non par un groupement COOH ou COOR", SO3H ou SO3R", PO3H2 ou PO3R"2 avec R"représentant un groupe alkyle, aryle, (aryl) alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3 ; - Ra représente :
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'un groupement NHR4 dans lequel R4 représente un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle, (aryl) alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl) alkyle ; ou un enchaînement peptidique (AA) R5 dans lequel : - n est égal à 1 ou 2 - Rs est égal à OH, NH2, NHR"'avec R"'représentant un groupe alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle, (aryl) alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryle) alkyle - AA représente un reste d'acide aminé de formule (II)
N (R6)- (CH2) m-CH (R7)- (CH2) p-CO (ici) dans laquelle : . m = 0 ou 1, p = 0 ou 1, . R6 représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle, de préférence méthyle, et
. R7 représente un groupe alkyle, (aryl) alkyle ou (hétéroaryl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou plusieurs groupe (s) OH, alkoxy et de préférence OCH3 ou CF3, avec lorsque n est égal à 2, les deux restes d'acides aminés
AA pouvant être identiques ou différents ; et leurs dérivés.
Les définitions des différents groupements proposés dans les formules générales (1) et (II) des composés revendiqués sont précisées dans la liste ci-dessous. Ces définitions s'appliquent aux termes tels qu'ils sont utilisés à travers ce texte (à moins qu'elles soient limitées à des exemples précis) soit individuellement soit en tant que faisant partie d'un groupe plus large.
C'est ainsi qu'au sens de l'invention, on entend désigner par : - alkyle, un groupe aliphatique saturé, linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
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- cycloalkyl, un cycle hydrocarboné ayant 3, 4, 5 ou 6 atomes de carbone ; - alkenyle, une chaîne aliphatique linéaire ou ramifiée de 2 à 6 atomes de carbone possédant au moins une double liaison ; - alkynyle, une chaîne aliphatique de 2 à 6 atomes de carbone possédant au moins une triple liaison ; - aryle, un cycle aromatique à 6 atomes de carbone condensés ou non et/ou substitué ou non par un ou deux autres cycles aromatiques à 6 atomes de carbone ; - hétéroaryle, un hétérocycle aromatique à 5 ou 6 atomes, contenant un ou deux hétéroatomes choisi parmi N, S et 0, condensé ou non et/ou substitué ou non par un ou deux cycles aromatiques à 6 atomes de carbone ou hétéroaromatiques à 5 ou 6 atomes.
L'ensemble de ces groupes peut être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupe hydroxyle, fonction carboxylique ou ester.
Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous le terme "dérivés"notamment les sels d'addition des composés de formule générale (1) obtenus avec des acides organiques ou minéraux pharmacologiquement acceptables. Il peut par exemple s'agir de sels tels que les chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate, borate, phosphate, méthane sulfonate, acétate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tartrate, maléate, malonate, benzoate, diaminobenzène sulfonate, chromoglycate, benzène sulfonate, cyclohexane sulfonate, toluène sulfonate, dipropyl acétate, glucose-1 phosphate, palmate et palmitat.
Parmi ces dérivés, on peut également citer les dimères de composés de formule générale (1), constitués par deux molécules de composés de formule générale (1), identiques ou différentes, couplées entre elles au niveau de leurs atomes de soufre respectifs. Dans ce cas particulier, Ri figure le groupement S-CH [CH (R2) X]-CO-R3 identifié précédemment.
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De même, la présente invention s'étend aux différentes formes éniantomériques des composés revendiqués.
En effet, les composés de formule (1) peuvent posséder plusieurs carbones asymétriques, ils existent donc sous forme de mélanges soit racémiques ou de diastéréoisomères ou encore sous forme de stéréoisomères purs.
Au minimum, les composés de formule générale (1) possèdent les deux centres d'asymétrie notés (2) et (3) sur la formule (1). Les composés peuvent par conséquent exister sous forme de 4 stéréoisomères. Ces quatre stéréoisomères sont du domaine de l'invention.
Le groupement R3 peut en outre contenir un ou plusieurs centres chiraux. Les stéréoisomères (R) et (S) de chaque centre chiral supplémentaire sont également du domaine de l'invention.
Les composés optiquement purs peuvent être isolés par des synthèses énantiosélectives ou des résolutions par des amines chirales.
Dans le cas de procédés de préparation conduisant à des mélanges de stéréoisomères, une séparation par HPLC semi-préparative sur colonne (Vydac C18, 10x250 mm, CH3CN-H2O) est effectuée, permettant une étude biochimique et pharmacologique séparée de chaque stéréoisomère.
Parmi ces stéréoisomères, sont préférés ceux possédant une configuration absolue (S) sur le carbone (2) portant le groupement R2, et une configuration (S) sur le carbone (3) portant la fonction-SR.
A titre de composés préférés selon l'invention, on peut plus particulièrement citer les composés de formule générale (1) dans laquelle R représente soit un atome d'hydrogène, soit un groupement S- CH [CH (R2) X]-CO-R3 identique ou différent du groupement figuré par la formule générale (1).
S'avèrent par ailleurs tout particulièrement intéressants pour leurs propriétés inhibitrices à l'égard de la toxine botulique les composés de formule générale (1) possédant un caractère hydrophobe significatif.
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Ce caractère hydrophobe est notamment favorablement induit par la présence de plusieurs groupements alkyle et plus préférentiellement de nature aryle et/ou hétéroaryle au niveau de la molécule du composé de formule générale (1).
En l'espèce, sont préférés selon l'invention, les composés de formule générale (1) dans laquelle le substituant R2 figure un groupement comprenant au moins un groupe aryle, condensé ou non.
Plus préférentiellement, R2 représente un groupe aryle ou arylalkyl, substitué par au moins une fonction carboxylique.
Cette hydrophobicité peut par ailleurs être renforcée par la présente de chaîne (s) alkyle (s) et/ou de groupe (s) aryle (s) et/ou arylalkyl (s) au niveau des autres substituants Ri et R3.
En l'espèce, selon un mode préféré de l'invention, Ri représente un groupement S-CH [CH (R2) X]-CO-R3. Le composé de formule générale (1) répond alors à la définition d'un disulfure symétrique.
En ce qui concerne R3, il figure de préférence un enchaînement peptidique (AA) nRs avec de préférence n égal à 2, et plus préférentiellement m et p égaux à zéro.
Selon une variante préférée, AA figure un groupe de formule générale (ici) dans laquelle les deux groupes R7 différents l'un de l'autre représentent un groupement (aryl) alkyle ou (hétéroaryl) alkyle.
A titre de composés préférés, on peut plus particulièrement citer ceux répondant à la formule générale (la) :
dans laquelle :
dans laquelle :
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- Ri représente un atome d'hydrogène ou de préférence un groupe -S-CH [CH (R2) NH2] COR3 avec Rz et Rs étant têts que définis ci-dessus ou ci-après ; - R2 représente un groupe (cycloalkyl) alkyle, aryle ou (aryl) alkyle, substitué par au moins une fonction COOH ; - R3 représente soit un groupement NHR4 avec R4 représentant un groupement alkyle, cycloalkyl, (cycloalkyl) alkyle, aryle, (aryl) alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl) alkyle soit un groupement de formule (lia) : [NH (CH2) m-CHR7-(CH2)p]nCOR5 (IIa) dans laquelle : - n est égal à 1, de préférence 2, avec lorsque n est égal à 2, les deux groupements figurant entre crochets pouvant être identiques ou différents ; - R7 représente un groupe (aryl) alkyle ou (hétéroaryl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou groupe (s) OH, OCH3 ou CF3,
- R5 représente un groupe NH2 ou NHR'"dans teque) R'"représente un groupe alkyle, aryle, (aryl) alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3, et - m ou p, identiques ou différents, représente 0 ou l'entier 1.
Selon un mode préféré de l'invention, m et p sont égaux à zéro et plus préférentiellement n est égal à 2.
En ce qui concerne le groupement figuré par R7 en formules générales (II) ou (IIa), il est de préférence choisi parmi les benzyl-
naphtylméthyl, benzothiénylméthyl, indolylméthyl et biphénylméthyl.
Dans le cas où n est égal à 2, les deux groupes R7 sont de préférence différents.
naphtylméthyl, benzothiénylméthyl, indolylméthyl et biphénylméthyl.
Dans le cas où n est égal à 2, les deux groupes R7 sont de préférence différents.
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A titre illustratif des composés de formule générale (la) revendiqués selon l'invention, on peut plus particulièrement citer les dérivés suivants : - acide (2S, 3S) 2- (p-méthoxybenzyl)-sulfenyi-3-N-Boc amino-4- (4-tbutyloxycarbonyl)-phénylbutanoïque ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Trp-Phe ; - N- [ (2S, 3S)-2-su ! fanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Trp-Phe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] (N-Me) TrpPhe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Tyr benzamide ; - N-[ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-His benzamide ; - N-[ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxyl) phénylbutanoyl] Bip-Phebenzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-D-Phe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl]-D-Bip-Phe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-lle benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] 1-Nap-Phe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2 benzyldisulfanediyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide, - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Tyr benzamide) ;
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- (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-lle benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Phe benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Bta benzamide) ; - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyi] bis (benzamide) ; - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl]bis (1-naphtylméthyle amide) ; et de préférence le - (2S)-2-2'-disuifanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip benzamide).
D'autres composés préférés sont les composés de formule (lob) suivante :
dans laquelle R1, R2 et R3 ont les définitions indiquées pour les composés de formule (la).
A titre illustratif des composés de formule générale (lb), on peut plus particulièrement citer les dérivés suivants : - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (benzamide) y - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (Bip benzamide) ; - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (Bip Bta benzamide).
La présente invention a également pour objet la préparation des composés revendiqués.
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Les composés de formule générale (1) pour lesquels X = NH2, sont obtenus à partir de l'intermédiaire de formule (III)
dans laquelle : - P est un groupement protecteur du thiol, de préférence le paraméthoxybenzyle et
- R'2 représente la forme protégée de R2 sur son groupement fonctionnel avec,
Si R2 possède un groupement COOH, R'2 possédant un groupement COOtBu ;
Si R2 possède un groupement SO3H, R'2 possédant un groupement SO3CH2tBu
Si R2 possède un groupement PO3H2, R'2 possédant un groupement PO3 (CH2 (p) 2 ledit composé étant obtenu par sulfénylation du 11-amino ester de formule (IV) :
dans laquelle : - P est un groupement protecteur du thiol, de préférence le paraméthoxybenzyle et
- R'2 représente la forme protégée de R2 sur son groupement fonctionnel avec,
Si R2 possède un groupement COOH, R'2 possédant un groupement COOtBu ;
Si R2 possède un groupement SO3H, R'2 possédant un groupement SO3CH2tBu
Si R2 possède un groupement PO3H2, R'2 possédant un groupement PO3 (CH2 (p) 2 ledit composé étant obtenu par sulfénylation du 11-amino ester de formule (IV) :
Cette réaction de sulfénylation est effectuée par action du 2-4dinitrophenyl p. méthoxybenzyl disulfide selon le procédé décrit par Bischoff et al. (1997, J. Org. Chem. 62,4848-4850).
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Le a-amino ester de formule (IV) est obtenu par une réaction d'homologation selon Arndt-Eisert (Meier et al., 1975, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 14,32-43) de l'a-amino acide N-protégé de formule (V).
Ces a-amino acides N protégés ne sont en général pas commerciaux et sont synthétisés de façon énantiosélective par la méthode classique d'Oppolzer (1957, Tetrahedron 43 (9), 1969-2004) qui met en jeu le synthon chiral camphosultame de formule (vol) et un dérivé halogéné, de préférence bromé de formule (VII) :
En utilisant les méthodes classiques de déprotection de l'intermédiaire camphosultame de formule (VIII) et la reprotection classique de la fonction amine libre sous forme de groupement Boc par action du (boy) 20 (1993, Synth. Commun. 23,1443), le composé de formule (V) est isolé sous forme énantiomériquement pur.
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Si l'acide aminé de formule (V) est de configuration S, l'homologation de formule (V) en formule (IV) se faisant avec rétention de configuration, la formule (IV) possède préférentiellement la configuration S. La réaction de sulfénylation de formule (IV) pour conduire à la formule (III) est essentiellement une trans addition. Le composé de formule (III) présente alors préférentiellement la configuration 2S, 3S.
La déprotection de la fonction ester méthylique de formule (III) pour conduire à la formule (IX), est effectuée soit par action de la soude aqueuse en présence de méthanol et dans ce cas on observe une racémication du carbone chiral en position 2, soit par action du BBTO (bis (tributyltin) oxyde ou oxyde de tributylétain (Salomon et ai., 1994, J.
Org. Chem. 59, 7259-7266) qui permet de conserver la configuration initiale 2S, 3S.
Les couplages du synthon de formule (IX) avec les différents groupements R3 possédant une fonction amide sont effectués selon les méthodes classiques de la synthèse peptidique.
Typiquement cette réaction est effectuée dans le dichlorométhane ou le diméthylformamide, par action de l'EDCI (1- (3-diméthylaminopropyl)-3- éthyl-carbodiimide méthiodide) en présence d'HOBt (1hydroxybenzotriazole) ou de BOP (benzotriazol-1-yl-oxytris (diméthylamino) phosphonium hexafluoro-phosphate à température ambiante en présence d'une amine tertiaire telle que la diisopropyléthylamine.
Lorsque R3 représente un acide aminé ou un peptide, le carboxylate C-terminal est protégé sous forme d'un ester t-butylique.
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La déprotection finale de tous les groupements protecteurs est obtenue classiquement en une seule étape par action de HF à 0 C en présence de diméthylsulfure, anisole et para-thiocrésol.
Le disulfure symétrique correspondant à la formule générale (1) pour laquelle R1 est S-CH (CH (R2) X)-CO-R3, est obtenu par action d'une solution éthanolique d'iode sur le composé de formule générale (1) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène.
Le disulfure dissymétrique correspondant à la formule générale (1) dans laquelle R1 figure un groupement SR'est obtenu par action sur le composé de formule générale (1) dans laquelle Ri = H, d'un disulfure activé de formule (X) :
R'-S-S-COOCH3 (X) avec R'étant tel que défini en formule générale (1).
R'-S-S-COOCH3 (X) avec R'étant tel que défini en formule générale (1).
Le composé de formule (X) est classiquement formé par action d'un mercaptan de formule R'SH sur le chlorure de méthoxycarbonylsulfényle (CH302CSCI ; Aldrich) en présence d'une amine tertiaire telle que le triméthylamine en solution dans un mélange chloroforme méthanol.
Les composés de formule (lob) dérivés de la formule générale (1) pour lesquels X = H sont obtenus à partir du synthon de formule (XI) dans lequel R'2 représente une forme protégée de R2 telle que définie précédemment.
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Le composé de formule (XI) est typiquement préparé en deux étapes à partir d'un a-amino acide de formule (XII) selon le schéma réactionnel suivant
L'a-amino acide de formule (XII) subit la réaction classique de désamination halogénante par action du nitrite de sodium en présence d'acide bromhydrique. Cette réaction se fait généralement avec rétention de configuration.
Le composé de formule (XIII) subit alors une substitution nucléophile de type SN2 par action du sel de sodium du paraméthoxy-a-toluène thiol (CH30- < p-CH2SH ; Aldrich).
Le synthon de formule (XI) est ensuite couplé avec différents composés correspondant à la formule générale pour R3 selon le protocole précédemment décrit pour conduire aux différents composés de formule générale (1) dans lesquels X = H.
Les composés revendiqués s'avèrent capables d'inhiber significativement l'activité enzymatique de la toxine botulique de type B. A ce titre, les composés revendiqués peuvent être utilisés en thérapie dans tous les processus pathologiques induits par cette toxine.
Plus précisément, les applications cliniques pour lesquelles on peut envisager l'utilisation de ces composés comprennent les maladies initiées par la toxine botulique BoNT/B.
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A ces fins, les composés revendiqués et leurs dérivés peuvent être utilisés pour la préparation de compositions pharmaceutiques correspondantes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne, selon un autre de ses aspects, une composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif au moins un composé de formule générale (1) ou un de ses dérivés.
Bien entendu, ce composé peut y être associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
On peut également envisager de lier de manière covalente le composé de formule générale (1) à un peptide (séquence de Tat, de pénétratine, etc...) afin de le vectoriser notamment à l'intérieur de la cellule.
De même, il est possible d'associer deux ou plusieurs composés de formule générale (1) dans une même composition pharmaceutique.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie orale, parentérale, sublinguale, transdermique ou topique.
En ce qui concerne l'administration par voie orale ou sublinguale, on utilise en particulier des comprimés, simples ou dragéifiés, des gélules, des granules éventuellement à libération retardée, des gouttes ou encore des liposoms. En ce qui concerne l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, on a recours à des solutions stériles ou stérilisables en particulier pour perfusion veineuse, tandis que l'on peut réaliser les patches conventionnels pour l'administration par voie transdermique. Pour l'utilisation topique on peut utiliser des crèmes ou des lotions à étendre sur la peau.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être préparées selon des méthodes usuelles bien connues dans le domaine de la technique pharmaceutique.
Le principe actif peut être incorporé dans les excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels
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que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, la stéarate de magnésium, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les différents agents mouillants, dispersants, ou émulsifiants, les conservateurs, etc...
La quantité de principe actif à administrer par jour dépend bien entendu de la particularité de l'indication thérapeutique, de la gravité des affections à traiter, ainsi que du poids du malade et de la voie d'administration.
Pour une administration systémique, la dose globale chez l'homme varie généralement entre 1 et 100 mg par jour, par exemple de 2 à 50 mg, et plus convenablement de 3 à 40 mg par jour.
Des formes unitaires de dosage pour l'administration systémique comprendront généralement de 3 à 50 mg (à savoir 3,5, 10,20, 30,40 et 50 mg de produit). Ces doses unitaires seront administrées normalement une ou plusieurs fois par jour, de préférence une à trois fois par jour.
Pour l'administration topique, les compositions pharmaceutiques contiennent généralement de 0,0001 à 10% de principe actif et de préférence de 0,01 à 5%.
Outre cette utilisation des composés de formule générale (1) à titre d'agent thérapeutique potentiel des maladies induites par la toxine BoNT/B, on peut également envisager leur utilisation conjointe avec la toxine par exemple, à des fins thérapeutiques.
En effet, il a été développé en clinique humaine des méthodes de traitement thérapeutiques symptomatiques des dystonies par hyperactivité motoneuronale. Ce type de prophylaxie est en particulier proposé pour traiter des troubles du type strabisme, blépharospasme, crampe de l'écrivain, spasme hémifacial. La thérapie consiste à injecter des doses de toxines clostridiales au niveau de l'organisme traité. Il est clair que compte tenu du caractère toxique de ces toxines, les doses mises en oeuvre, doivent être minimisées de manière à prévenir tout effet secondaire néfaste. La co-administration d'un composé selon l'invention avec une
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toxine offre donc la possibilité d'employer des doses plus significatives et donc plus efficaces en ces toxines.
En conséquence, les composés selon l'invention fournissent avantageusement un antidote pour toute activité non désirée de la toxine BoNT/B, administrée en clinique humaine.
On peut également envisager le développement de protocole de coadministration permettant la détection et/ou titration de l'activité de ces toxines dans des cibles musculaires définies pour attendre le résultat clinique désiré.
En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation conjointe d'au moins un composé de formule générale (1) avec au moins une toxine clostridiale comme la neurotoxine botulique et propose une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé de formule générale (1) en mélange avec au moins une toxine clostridiale.
Les composés décrits selon l'invention peuvent également être utilisés dans le cadre d'applications non thérapeutiques en particulier dans des systèmes de diagnostic et de détection de neurotoxine botulique.
Les exemples présentés ci-après à titre non limitatif mettront en évidence d'autres avantages de la présente invention.
PROCEDES DE PREPARATION.
Les analyses par HPLC des produits terminés sont conduites sur un appareil Shimatzu@ avec une colonne Kromasil@ (Cg ou C1s) 5 um, 100Â (débit 1 ml/min, À 210 nm) (250 x 4.6 mm ou 150 x 4.6 mm).
L'éluent est constitué d'un mélange en proportions variables des solutions A et B. A (0.05% TFA dans H20) ; B (CH3CN/H20 (0.038% TFA) = 9/1).
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Les abréviations suivantes ont été utilisées.
Bip : (L) Biphénylalanine 1 Nap : (L) 1-naphtylalanine
Bta : (L) Benzothienylalanine.
Bta : (L) Benzothienylalanine.
EXEMPLE 1
Synthèse de l'acide (2S, 3S) 2- (p-méthoxybenzyl)-sulfényl-3-N-Boc ami no-4- (4-t-butyloxyca rbonyl)-phényl butanoïqu e.
Synthèse de l'acide (2S, 3S) 2- (p-méthoxybenzyl)-sulfényl-3-N-Boc ami no-4- (4-t-butyloxyca rbonyl)-phényl butanoïqu e.
Etape 1. Synthèse de l'acide (2S) 2-(N-Boc) amino-3-[4-t-butyloxy- carbonyllphényt propanoïque.
Une solution dans le THF de 33.5 g (78.6 mM) de la copule chirale d'Oppolzer est refroidie à-78 C sous argon. On ajoute successivement 33 ml (1.05 eq) de nBuLi (2.5 M dans l'hexane) puis après 15 min, une solution de 25 g (1.2 eq) de 4-bromomethyl benzoate de t-butyl [obtenu par action du N-bromosuccinimide sur le t-butyrate de l'acide paratoluique (réaction de Wohl-Zieyler & S. Pizey. Synthesis reagents, Vol. 2, New York, 1974, pp. 1-63) dans 250 ml d'un mélange THF/HMPA. On laisse agiter 3 h à température ambiante. La réaction est arrêtée par addition à 0 C de 30 ml d'un mélange THF/AcOH = 4/1. Le mélange est concentré sous vide, repris par 600 ml d'éther et lavé par une solution à 10% de NH4CI par de l'eau puis par une solution saturée de NaCI. Après séchage sur Na2SO4 la solution est évaporée à sec. On obtient une huile jaune qui est purifiée par chromatographie. Solide blanc 34.1 g (71%) Pf 174OC ; Rf (c. hex./EtOAc= 7/3) 0.51.
La fonction amine du composé précédent (32 g) est alors déprotégée en solution dans le THF par action de 540 ml d'acide citrique à 10%.
Après 2 h à température ambiante, le THF est évaporé sous vide et la phase aqueuse lavée 3 fois à l'éther. La phase aqueuse est alors amenée à pH 8 par addition de NaHCO3 à 10% et le produit attendu est extrait par CH2CI2. Après séchage et évaporation à sec on obtient 20.7 g (88%) d'une huile incolore qui cristallise lentement.
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On dissout alors 20. 7 g du composé précédent dans 200 ml de DMF.
On ajoute alors 11. 65 ml de triéthylamine et 9. 94 g de (Boc) 20 à 0 C.
Après une nuit à température ambiante, la solution est évaporée à sec, reprise par l'acétate d'éthyle, lavée par KHIS04 à 10%, H2O, NaCl saturé et séchée sur Na2SO4. Après évaporation à sec et chromatographie sur gel de silice. On obtient 16.3 g (70%) d'une mousse blanche Rf (c. hex./EtOAc/CH2CI2 = 7/1.5/1. 5) 0.21. L'auxiliaire chiral est clivé sur le produit précédent (16.3 g) par action d'une solution de 2.78 g de LiOH, 12.57 g de LiBr et 3.73 g de (nBu) 4 NBr dans 300 ml d'acétonitrile. Après agitation 18 h à température ambiante, le mélange est évaporé à sec, repris par l'eau et lavé par de l'éther. La phase aqueuse est alors acidifiée par KHSO4 à 10% et extraite par CH2CI2. Après chromatographie sur gel de silice on obtient une mousse blanche (7.5 g, 71%).
Rf (c. hex. /EtOAc/AcOH = 5/5/0. 5) 0.75.
Etape 2. Synthèse de l'ester méthylique de l'acide (3S) 3- (N-
Boc) amino-4-[-t-butyloxycarbonyl/phénylbutano/'que.
Boc) amino-4-[-t-butyloxycarbonyl/phénylbutano/'que.
Une solution dans 60 ml de THF de 7.2 g du N-Boc a-amino acide précédent est agitée à-20 C sous argon pendant 15 min avec 2.6 ml d'isobutylchloroformate. On élimine rapidement le précipité et on ajoute à la solution 110 ml de diazométhane. Après 2 h à température ambiante on évapore à sec. Le résidu est repris dans 180 mi de méthanol et on ajoute 0.32 g de PhCOOAg et 8.5 ml de triéthylamine, et on agite 15 min à 0 C et 30 min à température ambiante. On filtre, on évapore à sec et on reprend par l'éther. On lave par NaCI saturé, on sèche sur Na2S04 et on évapore à sec. Solide jaune 5.7 g (73%). Pf= 71 C.
Etape 3. Ester méthylique de l'acide (2S, 3S) 2-(p-méthoxy benzyl)sulfényl-3-N-Boc amino-4-(4-t-butyloxycarbonyl)phénylbutanoïque.
A 0 C sous argon, on ajoute 15.25 ml de BuLi (2.5 M dans l'hexane) à un mélange de 7.5 mi de HMDS fraîchement distillé et 90 ml de THF anhydre. Après 15 min à 0 C, la solution est refroidie à-70 C et on ajoute une solution de 5 g du N-Boc ss-amino ester précédent dans 50 ml de THF
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anhydre. Après 2 h à-70 C on ajoute 4. 4 ml d'HMDA et 6. 3 g du (pméthoxybenzyl-2, 4-dinitrophényl] disulfure et on agite 1 h 30 à la même température. Le mélange réactionnel est alors versé sur un mélange 50/50 HCI 1N/Et20. On élimine le précipité. On lave la phase organique par de l'eau, et du NaCl saturé. On sèche sur Na2SO4 et évapore à sec. L'huile rouge est purifiée par chromatographie sur silice (c. hex/CH2CI2/EtOAc 8/1/1). On obtient une huile jaune qui cristallise 3.84 g (54%). Pf = 79OC.
Etape 4. Acide (2S, 3S) 2-p-méthoxybenzyl sulfényl-3-N-Boc amino 4- (4-t-butyloxycarbonyphénylbutanoïque.
A une solution de 20.3 ml d'oxyde de tributylétain (BBTO) dans 80 ml d'acétonitrile est ajoutée une solution de 3.7 g de l'ester précédent en solution dans 13.5 ml d'acétonitrile. Le mélange est porté au reflux pendant 5 jours. On refroidit à 0 C, et on ajoute en 2 h 50 ml d'HCI. Après 3 h à température ambiante on extrait par 25 ml d'EtOAc. On lave par H20, NaCI saturé, on sèche sur Na2S04 et évapore à sec. On purifie par chromatographie sur gel de silice (c. hex./EtOAc/AcOH = 8/2/0. 5). Solide jaune 2.85 g (79%) Tr = [C18 Kromasil 5 M/100 , 250 x 4.6 mm, 80% CH3CN/20% H20 (TFA 0. 05%), 1 ml/min] = 6.1 min.
EXEMPLE 2 N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] TrpPhe.
Etape 1. On prépare une solution du synthon décrit dans l'exemple 1 (1 eq) du dipeptide Trp-PheOtBu, (1 eq) d'HOBT (1-hydroxybenzotriazole, 1 eq) de diisopropyléthylamine (1.2 eq) et de (1- (3-diméthylaminopropyl)- 3-éthyl-carbodiimide méthiodide (EDCI) 4 eq dans le minimum de DMF et on agite pendant 2 jours à température ambiante. Le solvant est évaporé, le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle, lavé dans les conditions classiques d'un couplage peptidique, séché et évaporé à sec.
Etape 2. Le pseudopeptide entièrement protégé est mis en présence de 5 ut/mg de diméthylsulfure, 5 l/mg d'anisole et 1 ut/mg de p-
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thiolcresol, et est placé dans le réacteur où le HF est distillé à 0 C. Après réaction pendant 1 h à OOC, le HF est évaporé et le résidu est précipité dans un mélange éther/hexane à-20 C. Le solide est alors solubilisé dans l'eau et lyophilisé. Le résidu est purifié par HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 uM, 100A, 250 x 4.6 mm, avec un gradient en 30 min de 30 à 90% de B, 1 ml/min, Tr 13.5 min. Masse = MH+ 589. 3.
EXEMPLE 3
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] TrpPhe benzamide.
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] TrpPhe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Trp-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-PheOtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 M, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (55% de B) 5.2 min. Masse MH+ = 678.4.
EXEMPLE 4
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] (NMe) Trp-Phe benzamide.
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] (NMe) Trp-Phe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la a 1ère étape le dipeptide amide (N-Me) Trp-PheNHBzl à la place du dipeptide ester Trp-PheOtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 M, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (50% de B) 7.4 min. Masse MH+ = 692.6.
EXEMPLE 5 N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Tyr benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-Tyr-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 uM,
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IOOA, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) =11. 1 min. Masse MH+ = 731.
EXEMPLE 6
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-His benzamide.
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-His benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-His-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 uM, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (35% de B) = 6.2 min. Masse MH+ = 705.3.
EXEMPLE 7
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] BipPhe benzamide.
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] BipPhe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 pM, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (60% de B) = 13.2 min. Masse MH+ = 715. 5.
EXEMPLE 8
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-DPhe benzamide.
N-[(2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4-(4-carboxy)phénylbutanoyl] Bip-DPhe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-D-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 uM, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 13.2 min. Masse MH+ = 715.5.
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EXEMPLE 9 N- [ (2S, 3S)-2-su) fanyt-3-amino-4- (4-carboxy) phény) butanoyt]-D-BipPhe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide D-Bip-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 uM, 100Â, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 12. 6 min. Masse MH+ = 715. 6.
EXEMPLE 10 N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-lle benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-lie-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 uM, 1 OOÂ, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 11 min. Masse MH+ = 680.
EXEMPLE 11 N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] 1-NapPhe benzamide.
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide 1-Nap-Phe-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 uM, 100Â, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (50% de B) = 7. 4 min. Masse Mu+ = 689. 5.
EXEMPLE 12 N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide.
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Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la 1ère étape le dipeptide amide Bip-Bta-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 M 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 55 à 100% de B en 15 min) = 8. 9 min. Masse MH+ = 771.7.
EXEMPLE 13
N- [2S, 3S)-2-benzy ! disulfanediyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide.
N- [2S, 3S)-2-benzy ! disulfanediyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Bta benzamide.
Ce composé est préparé par action du disulfure active BzCH2S- SCOOCH3 (obtenu par action du chlorure de méthoxy carbonyl sulfényle sur le benzyl mercaptan) sur le composé 12 en présence de triéthylamine en solution dans CCl4. On purifie par HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 M, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 16. 1 min. Masse MH+ = 893.2.
EXEMPLE 14 (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Tyr benzamide.
Ce composé est obtenu en traitant le composé de l'exemple 6 par une solution iode 10-2 M dans l'éthanol, en solution dans un mélange acétonitrile/eau jusqu'à coloration jaune persistante. On évapore à sec ; le produit est lyophilisé. HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 uM, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 19 min.
Masse MH+ = 1461.1.
EXEMPLE 15
(2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-lle benzamide).
(2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-lle benzamide).
Ce composé est obtenu à partie du composé 11 en suivant le protocole décrit dans l'exemple 14. HPLC sur co ! onne Cg Kromasi) 5 pM,
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1 OOÂ, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 13. 6 min. Masse MH+ = 1360. 2.
EXEMPLE 16 (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Phe benzamide).
Ce composé est obtenu à partir du composé 8 en suivant le protocole décrit dans l'exemple 14. HPLC sur colonne C8 Kromasil 5 uM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (70% de B) = 6.4 min. Masse MH+ = 1428.8.
EXEMPLE 17 (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-Bta benzamide).
Ce composé est obtenu à partir du composé 13 en suivant le protocole décrit dans l'exemple 14. HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 uM, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 15. 6 min. Masse MH+ = 1541.0.
EXEMPLE 18 (2S) -2, 2'[disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl)] bis (benzamide).
Ce composé est préparé en couplant le synthon décrit dans l'exemple 1 avec la benzylamine en présence de BOP et de diisopropylamine dans le dichlorométhane. Le solvant est évaporé et le produit lavé dans les conditions acidobasiques. Il est séché. Le produit est ensuite déprotégé comme décrit précédemment dans l'exemple 1 et purifié par HPLC semi-préparative. Il est oxydé en disulfure comme décrit précédemment. HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 uM, 100Â, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (35%) = 5.6 min. Masse MH+ = 689.8.
<Desc/Clms Page number 27>
EXEMPLE 19 (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (1-naphtylméthyl amide).
Ce composé est préparé en couplant le synthon décrit précédemment dans l'exemple 1 avec la 1-naphtalène méthylamine comme décrit dans l'exemple 2, c'est-à-dire en présence d'HOBT, de diisopropyléthylamine et d'EDCI dans un minimum de DMF. Le produit est traité, ainsi que décrit dans l'exemple 2. Il est déprotégé de la même façon (étape 2 de l'exemple 2). Il est purifié par HPLC semi-préparative. Il est ensuite oxydé en disulfure comme décrit précédemment. HPLC sur colonne Ca Kromasil 5 uM, 100A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 15.0 min. Masse MH+ = 787.9.
EXEMPLE 20 (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl] bis (Bip-benzamide).
Ce composé est préparé selon le protocole décrit dans l'exemple 2 en utilisant dans la première étape l'acide aminé, amide benzylé Bip-NHBzl à la place du dipeptide ester Trp-Phe-OtBu à la différence qu'après couplage, déprotection et purification, il est oxydé en disulfure. HPLC sur
colonne Ca Kromasil 5 uM, 100A, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 20. 5 min. Masse MH+ =1134. 3.
colonne Ca Kromasil 5 uM, 100A, 250 x 4. 6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 20. 5 min. Masse MH+ =1134. 3.
Exemple 21 2, 2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (benzamide). Etape 1. Synthèse de l'acide (2S)-2- (N-Boc) amino-3-[4methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
La même méthode que pour l'étape 1 de l'exemple 1 est appliquée mais en utilisant le 4-bromomethyl benzoate de méthyle.
Etape 2. Synthèse de l'acide (2S)-2-amino-3-[4-methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
<Desc/Clms Page number 28>
L'amine est déprotégée à l'aide de TFA dans le dichlorométhane. Le TFA est ensuite évaporé ainsi que le DCM. Le produit est ensuite séché.
Etape 3. Synthèse de l'acide (2R)-2-bromo-3-[4-methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
L'acide précédemment obtenu (1 équiv. ) est mélangé avec une solution aqueuse à 48% de HBr aqueuse à 0 C dans l'eau puis 1.6 équiv. de NaN02 dans l'eau sont additionnés. Le mélange est agité pendant 2 h 30 à température ambiante. Les vapeurs nitreuses sont évaporées et le produit est extrait par l'éther et séché.
Etape 4. Synthèse de l'acide (2R)-2-thioacétate-3-[4methyloxycarbonyl] phenylpropanoique.
Le produit précédent est dissout dans la DMF (diméthylformamide) et 3 équiv. de thioacétate de potassium sont additionnés. La réaction dure 1 nuit à température ambiante. Le mélange est ensuite acidifié et le produit est extrait à l'acétate d'éthyle et séché.
Etape 5. Synthèse de la N-[ (2S)-2-thioacétate-3- (4-methoxycarbonyl) phenylpropanoyl] benzamide.
La benzylamide est couplé au produit précédent comme décrit précédemment (1ère étape de l'exemple 2).
Etape 6.
Le produit précédent est traité par de la soude 0.5N dans le méthanol sous atmosphère oxydante. Après acidification, traitement et purification par HPLC semi-préparative, le produit est obtenu, sous forme d'un mélange de 2 stéréoisomères. HPLC sur colonne C18 Kromasil, 5 um, 100 À, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (35% B) = 8.1 et 8.63 min. Masse MH+ = 629.7.
Exemple 22.
2, 2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (Bip-NH benzamide).
<Desc/Clms Page number 29>
Ce produit est obtenu comme le composé 21 mais en couplant Bip- NHBzl dans l'étape 5. HPLC sur colonne C18 Kromasil, 5 um, 100 , 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 10 à 100% de B en 30 min) = 22.8 et 23.4 min. Masse MH+ = 1076.3.
Exemple 23.
2, 2'-disulfanediyl bis [4- (4-carboxy) phenylpropanoyl] bis (Bip Btabenzamide).
Ce produit est obtenu comme pour l'exemple 21 mais en couplant Bip Bta-NHBzl dans l'étape 5. HPLC sur colonne C18 Kromasil, 5 um, 100 A, 250 x 4.6 mm, 1 ml/min, Tr (gradient de 40 à 100% de B en 20 min) = 17.4 et 18.1 min. Masse MH+ = 1480.7.
EXEMPLE 24
Mesure de l'activité inhibitrice des molécules décrites vis à vis de l'activité protéolytique de la BoNT/B.
Mesure de l'activité inhibitrice des molécules décrites vis à vis de l'activité protéolytique de la BoNT/B.
On préincube dans 100 ut final de tampon HEPES 20 mM pH 7.4 en présence ou en absence de 0.1 mM DTT (dithiothreitol) des quantités croissantes d'inhibiteurs et 0.35 ng de chaîne légère de BoNT/B à 37 C pendant 30 min. On ajoute alors 18 M du substrat spécifique de BoNT/B Syb 60-94 [Pya, Nop] et l'incubation est poursuivie pendant 30 min à 37 C. La réaction est stoppée par addition de HCI 0.2 M et la lecture de la fluorescence est faite directement.
La quantité de métabolite formé dans chaque essai est déterminée à partir des courbes étalon de fluorescence. Le Ki de l'inhibiteur est déterminé à partir de la relation de Cheng Prussof ; Ki = ICgo/1 +S/KM.
<Desc/Clms Page number 30>
Pouvoir inhibiteur vis à vis de la toxine botulique de type B des exemples décrits
Molécule No Ki (BoNT/B) l d'exemple Exemple 5 8. 1 x 10-7M 1 SH H T r) Hooch
Molécule No Ki (BoNT/B) l d'exemple Exemple 5 8. 1 x 10-7M 1 SH H T r) Hooch
<Desc/Clms Page number 31>
Exemple 2 5. 9 x 10-7 M SH H N OH OH 0 0 0 HOO c Exemple 8 5. 8 x 10-7 M SH (L ".
H c 00
<Desc/Clms Page number 32>
Exemple 9 5. 4 x 10-7 M SH D H rT T "" 0 Exemple 10 5. 4 x10-7 M ... 8 N (L) HOOC"" " HOOC
<Desc/Clms Page number 33>
Exemple 6 5. 0 x 10-7 M SH H2N.,.,... H N 0 0 Hooch P1Exemple 3 3. 5 x 10-7 M sH o r"r 0 N L) 0 0 HOOC",-u
<Desc/Clms Page number 34>
Exemple Il 2. 2 x 10-7 M SH H SH 0 f"" HOO HOO "" Exemple 4 1. 7 x 10-7 M sH o r"" [ri SH 0 0 HOOC -
<Desc/Clms Page number 35>
Exemple 7 1. 6 x 10-7 M SH : D 1 # onc boa ".
0 0 1 1 HOOC Exemple 12 2. 0 x 10-M s SH H 1 Oh 0 0 1 1 HOOC 1
<Desc/Clms Page number 36>
S-) 2 Exemple 19 1. 3 x 10-M H2N...,. g HOOC Exemple 18 5. 1 x 10-7 M H2N...,. g c S-) 2 Q Exemple 20 4. 5 x 10-M H2N.... H < HOOC < < HOOC
<Desc/Clms Page number 37>
! Exemple 15 2. 3 x 10-8 M S-) 2 n (\ H2N......... . 8 H 1 1 HOO 0'00.
Exemple 16 1. 8 x 10-M H 1 rT m (L) N 0 0 1 1 HOOC 1
<Desc/Clms Page number 38>
Exemple 14 1. 4 x 10-8 M 1 H2N.,. \HL '" 0 0 1 1'-O HOO c Exemple 13 1. 0 x 10-M s H b d'tC C y N Xt N | , : D-l s\ s s H H 1 0 0 1 1 HOOC
<Desc/Clms Page number 39>
Exemple 17 3. 4 x 10-9 M 9 f X N < N < H H2.... H '" HOO Exemple21 4. 4 x 10-M COOH N # COOH
<Desc/Clms Page number 40>
Exemple 22 3. 6 x 10-8 M 0 TH COOH Exemple 23 2. 8 x 10-M v Ì g -) 2 H Rooe 0 0 0 HOOC
Claims (16)
- 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Ri représente un atome d'hydrogène ou figure un groupement -S-CH [CH (R2) X]-CO-R3, identique ou différent du groupement figuré par la formule générale 1.
- 3. Composé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R2 figure un groupement comprenant au moins un groupe aryle, condensé ou non.<Desc/Clms Page number 43>
- 4. Composé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que R2 est un groupe aryle ou arylalkyl, substitué par au moins une fonction carboxylique.
- 5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que R3 figure un enchaînement peptidique (AA) nRs avec de préférence n égal à 2
- 6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que m et p sont égaux à zéro.
- 7. Composé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que AA figure un groupe de formule générale (il) dans laquelle les deux Ry différents l'un de l'autre, représentent un groupement (aryl) alkyle ou (hétéroaryl) alkyle.
- 8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (la) :
dans laquelle : - Ri représente un atome d'hydrogène ou de préférence un groupe -S-CH [CH (R2) NH2] COR3 avec R2 et R3 étant tels que définis ci-après ; - R2 représente un groupe (cycloalkyl) alkyle, aryle ou (aryl) alkyle, substitué par au moins une fonction COOH ;<Desc/Clms Page number 44>- R3 représente soit un groupement NHR4 avec R4 représentant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl) alkyle, aryle, (aryl) alkyle, hétéroaryle ou (hétéroaryl) alkyle soit un groupement de formule (lia) [NH (CH2) m-CHR7- (CH2) p] nCOR5 (lia) dans laquelle - n est égal à 1, de préférence 2, avec lorsque n est égal à 2, les deux groupements figurant entre crochets pouvant être identiques ou différents ; - m ou p, identiques ou différents, représente zéro ou l'entier 1, et de préférence représente tous deux zéro, - R7 représente un groupe (aryl) alkyle ou (hétéroaryl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène et/ou groupe (s) OH, OCH3 ou CF3, et - R5 représente un groupe NH2 ou NHR"'dans lequel R"'représente un groupe alkyle, aryle, (aryl) alkyle, cycloalkyle, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CF3. - 9. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une configuration 2S, 3S.
- 10. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
- N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Trp-Phe ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Trp-Phe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-su ! fanyt-3-amino-4- (4-carboxy) phény) butanoy !] (N- ! vte) TrpPhe benzamide ;<Desc/Clms Page number 45>
- N- [ (2S, 3S)-2-sulfany !-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] Bip-Tyr benzamide ; - N-[ (2S, 38)-2-su ! fanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoy ! ] Bip-His benzamide ; - N-[ (28, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxyl) phénylbutanoyl] Bip-Phe benzamide ; - N-[ (2S, 3S)-2-sulfanyl-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoyl} Bip-D-Phe benzamide ; - N- [ (28, 3S)-2-su ! fany !-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoy']-D-Bip-Phe benzamide ; Il-im ; - N-[ (2S, 3S)-2-sulfany !-3-amino-4- (4-carboxy) phény'butanoy !] Bip-'le L v p y i benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-su ! fany !-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoy ! j 1-Nap-Phe benzamide ; - N- [ (2S, 3S)-2-sulfany !-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoy !] Bip-Bta benzamide ; - N-[ (2S, 3S)-2-benzyl) disulfanediyl-3-amino-4- ( 4-carboxy) phényl butanoyl) Bip-Bta benzamide, - (2S)-2-2'-disu ! fanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoy !] bis (Bip-Tyr benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoyl] bis (Bip-! ! e benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediy ! bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Phe benzamide) ; - (2S)-2-2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phénylbutanoyl] bis (Bip-Bta benzamide) - (2S)-2, 2'-disulfanediyl bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phényl butanoyl]bis (benzamide) ; - (2S)-2, 2'-disu ! fanediyl bis [ (3S) =3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoyi] 1 L 1 r, Y i bis (1-naphtylméthyle amide) ;<Desc/Clms Page number 46>
- (2S)-2-2'-disu'fanediy ! bis [ (3S)-3-amino-4- (4-carboxy) phény ! butanoy ! j bis (Bip benzamide). - 11. Composé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale ( ! b) : 1R1 R2CH2CH-COR3 dans laquelle Ri, R2 et Rs sont te ! s que définis en revendication 8.
- 12. Composé seion ! a revendication 11, caractérisé en ce qu'i ! est choisi parmi les dérivés suivants : (2S)-2, 2'-disu ! fanediy ! bis4= (4-carboxy) pheny ! propanoy ! j bis ,,. L. S) 2, 2',--Iisulfanedly ! . Y vy, j (benzamide) ; - (2S)-2-2'-disu ! fanediy ! bis [4- (4-carboxy) pheny ! prcpanoy !] bis (Bip benzamide) ; - (2S)-2-2'-disu ! fanediy ! bis [4- (4-carboxy) pheny ! propanoy ! j bis (Bip Bts benzamide). ben4-amide,, 13. Procédé de préparation d'un composé de formu ! e générale ( !) e ! on !'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que''on procède a un couplage soit du synthon de formule générale (IX) :
soit du synthon de formule générale (XI) :<Desc/Clms Page number 47>
f irilr dans lesquelles R'2 figure la forme protégée de R2, avec n groupement Rs portant une fonction amide, selon la synthèse peptidique puis à la déprotection finale de tous les groupements protecteurs, 14. Procédé se ! on la revendication 13, caractérisé en ce que ! e disu ! fure symétrique correspondant à la formule générale (1) pour laquelle 1-1-\1 1 . 1 Ri représente S=CH (CH (R2) X) =CO=R3, est obtenu par action d'une L. il À solution éthanotique d'iode sur ! edit composé de formu'e généraie ( !) dans laque ! ! e Ri représente un atome d'hydrogène. - 15. Procédé se ! on la revendication 13, caractérisé en ce que ie L-, ce Il-disulfure dissymétrique correspondant à la formule générale (1) dans laquelle Ri figure un groupement SR'te ! que défini en revendication 1, est obtenu par action sur ledit composé de formule générale (1) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène, d'un disulfure activé de formule (X) : R'SS=S=COOCH3 (X) avec R'représentant un groupe alkyle, aryle, (ary !) a ! kyle, cyc ! oalkyle, ou (cycloalkyl) alkyle, éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor, ou un groupe CFs.
- 16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un composé de formule générale (1) tel que défini en revendication 1 à 12.<Desc/Clms Page number 48>
- 17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, 18. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu'e ! ! e comprend en outre au moins une toxine clostridiale.
- 19. Composition pharmaceutique se'on''une des revendications 16 à 1 caractérisée en ce que ! e composé de formu'e généraie ( !) est'ié de manière cova ! ente a un peptide capable de ! e vectohser.
- 90. Système de diagnostic pour détecter des neurotoxines botu'iques nn r% es caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de formuie 'l. m.. généraie ( !) se'on''une des revendications 1 à 12.
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