EP1368455A1 - Transgenic cells and animals for the study of the polarization of the immune response - Google Patents

Transgenic cells and animals for the study of the polarization of the immune response

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EP1368455A1
EP1368455A1 EP02716884A EP02716884A EP1368455A1 EP 1368455 A1 EP1368455 A1 EP 1368455A1 EP 02716884 A EP02716884 A EP 02716884A EP 02716884 A EP02716884 A EP 02716884A EP 1368455 A1 EP1368455 A1 EP 1368455A1
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immune response
type
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protein
transgene
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Withdrawn
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EP02716884A
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Kader Thiam
Alexandre Fraichard
Christine Lapize-Gauthey
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Genoway SA
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Genoway SA
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Abstract

The invention relates to a transgenic non-human animal cell expressing at least one transgene coding for at least one reporter protein, characterized in that the expression of said reporter protein is correlated to the expression of at least one protein which is naturally produced by said cell and which is specific for a type of polarization of the immune response and/or an effector function of the immune response. The invention also relates to a corresponding transgenic animal. According to the invention, the cell and the transgenic animal can be used in a method for characterizing the type of immune response, i.e. Th1 and Th 2, caused by an immunogene, a pathogen or chemical agent.

Description

CELLULES ET ANIMAUX TRANSGENIQUES D'ETUDE DE LA POLARISATION DE LA REPONSE IMMUNE. TRANSGENIC CELLS AND ANIMALS FOR STUDYING THE POLARIZATION OF THE IMMUNE RESPONSE.
La présente invention concerne le domaine de la biologie et plus particulièrement le domaine de la transgenèse animale. L'invention se rapporte à une cellule animale transgénique non humaine exprimant au moins un transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse, caractérisée en ce que l'expression de ladite protéine rapporteuse est corrélée à l'expression d'au moins une protéine naturellement produite par ladite cellule et spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune. L'invention porte également sur l'animal transgénique correspondant. La cellule et l'animal transgénique selon l'invention peuvent être mise en œuvre dans un procédé pour caractériser le type de réponse immune, notamment Thl et Th2 , induite par un immunogene. Une méthode de criblage de composés qui modulent le type de polarisation de la réponse immune et/ou le type de fonction effectrice de la réponse immune est également revendiquée .The present invention relates to the field of biology and more particularly the field of animal transgenesis. The invention relates to a non-human transgenic animal cell expressing at least one transgene encoding at least one reporter protein, characterized in that the expression of said reporter protein is correlated with the expression of at least one naturally produced protein. by said cell and specific for a type of polarization of the immune response and / or an effector function of the immune response. The invention also relates to the corresponding transgenic animal. The cell and the transgenic animal according to the invention can be used in a method for characterizing the type of immune response, in particular Th1 and Th2, induced by an immunogen. A method of screening for compounds which modulate the type of polarization of the immune response and / or the type of effector function of the immune response is also claimed.
Une réponse immune spécifique contre des pathogènes résulte de la combinaison de paramètres multiples qui incluent la production précoce de certaines cytokines et chimiokines, l'induction de la synthèse de molécules cellulaires de surface, des interactions cellule/cellule et l'activation d'un certain nombre de types cellulaires différents. Typiquement, deux types principaux d'immunité acquise sont à distinguer en fonction de la nature du pathogène. Des microorganismes intracellulaires tels que les virus, tels que certains types de bactéries et protozoaires induisent des réponses immunes médiées par les cellules T cytotoxiques et une production de cytokines inflammatoires tel que l'interféron γ,A specific immune response against pathogens results from the combination of multiple parameters which include the early production of certain cytokines and chemokines, the induction of synthesis of cell surface molecules, cell / cell interactions and the activation of a certain number of different cell types. Typically, two main types of acquired immunity are to be distinguished depending on the nature of the pathogen. Intracellular microorganisms such as viruses, such as certain types of bacteria and protozoa induce immune responses mediated by cytotoxic T cells and production of inflammatory cytokines such as interferon γ,
1 ' interleukine 1, le TNF α, dont le but est d'induire une résistance à l'infection et/ou d'éliminer les cellules infectées. Les pathogènes extra-cellulaires tels que les helminthes induisent, quant à eux, une réponse humorale associée à la production d'anticorps spécifiques qui neutralisent l'antigène.1 interleukin 1, TNF α, the purpose of which is to induce resistance to infection and / or to eliminate infected cells. Extracellular pathogens such as helminths induce a humoral response associated with the production of specific antibodies which neutralize the antigen.
La polarisation appropriée de l'une ou de l'autre des réponses est cruciale pour assurer une élimination efficace du pathogène. Cette polarisation nécessite la différenciation des cellules T CD4+ naïves en cellules effectrices Thl/Th2. Cette étape constitue un élément majeur de la décision du type de réponse immuneAppropriate polarization of either response is crucial to ensure effective elimination of the pathogen. This polarization requires the differentiation of naive CD4 + T cells into Th1 / Th2 effector cells. This step is a major element in deciding the type of immune response
(Mossmann et al . , 1986 ; Mossmann et al . , 1989 ; Romagnani, 1999). L'aptitude des différents sous-types de cellules T à diriger les réponses immunes effectrices sont dues à une combinaison exclusive de cytokines qui sont exprimées entre autre dans un sous-type de cellules Th particulier. Ainsi, chez l'homme, comme chez la souris, les cellules Thl produisent preferentiellement de 1 ' interleukine 2 et de l'interféron γ ; ces cellules Thl sont à l'origine d'une réponse de type hypersensibilité retardée, alors que les cellules Th2 sécrètent, quant à elles, de l' interleukine 4, de 1 ' interleukine 5, de 1 ' interleukine 10 et induisent l'activâtion des cellules B et la production d'anticorps. Un déséquilibre dans les. réponses Thl/Th2 a été observé dans des situations cliniques variées telles par exemple l'allergie atopique (médiée par les IgE) , notamment l'asthme, la rhinite allergique, mais également les rejets de greffe, les maladies du greffon contre hôte, les leishmanioses, la lèpre, la tuberculose, ou les maladies inflammatoires chroniques telle que la maladie de Crohn, l'arthrite réactive, le diabète insulino-dépendant . Il a été suggéré de manipuler la réponse Thl/Th2 pour développer des vaccins de meilleure qualité, de nouvelles approches anti-tumorales et des stratégies immunoprophylaxiques alternatives pour la thérapie des allergies et des maladies auto-immunes. Ainsi, un effort constant est réalisé pour augmenter la compréhension des mécanismes impliquant le rapport Thl/Th2 ou pour découvrir de nouvelles molécules qui pourraient altérer ces deux processus. Les réponses Thl/Th2 sont habituellement étudiées en contrôlant le type cellulaire et l'expression des marqueurs de surfaces cellulaires, ainsi que la production de cytokines soit dans le sérum, soit dans les organes lymphoïdes. Des méthodes, telles que la méthode ELISA, des méthodes de RT-PCR quantitative et de cytométrie de flux sont communément utilisées. La plupart de ces essais sont longs et laborieux car ils nécessitent un grand nombre de manipulations. Ces méthodes ne sont pas adaptées pour tester une multitude de conditions expérimentales ; ces méthodes peuvent en outre fausser l'analyse car elles peuvent altérer la réponse naturelle des cellules, comme par exemple dans le cas de méthodes qui impliquent une réactivation ex vivo des cellules T. Pour pallier ces différents inconvénients de l'art antérieur, des modèles animaux permettant une caracterisation rapide du type de la réponse immune constituerait des outils extrêmement appréciables pour réaliser ces études. En effet, de tels modèles animaux permettraient d'obtenir une réponse rapide, facile, reproductible et sûre de la réponse biologique naturelle et permettrait d'identifier de manière fiable les paramètres Thl/Th2.(Mossmann et al., 1986; Mossmann et al., 1989; Romagnani, 1999). The ability of different T cell subtypes to direct effector immune responses is due to an exclusive combination of cytokines which are expressed, among other things, in a particular Th cell subtype. Thus, in humans, as in mice, Th1 cells preferentially produce interleukin 2 and interferon γ; these Thl cells are responsible for a delayed hypersensitivity response, while Th2 cells secrete interleukin 4, interleukin 5, interleukin 10 and induce activation B cells and the production of antibodies. An imbalance in the. Thl / Th2 responses have been observed in various clinical situations such as for example atopic allergy (mediated by IgE), in particular asthma, allergic rhinitis, but also transplant rejection, graft versus host diseases, leishmaniasis, leprosy, tuberculosis, or chronic inflammatory diseases such as Crohn's disease, reactive arthritis, insulin-dependent diabetes. It has been suggested to manipulate the Thl / Th2 response to develop better quality vaccines, new anti-tumor approaches and alternative immunoprophylaxis strategies for the therapy of allergies and autoimmune diseases. Thus, a constant effort is made to increase the understanding of the mechanisms involving the Thl / Th2 ratio or to discover new molecules which could alter these two processes. Thl / Th2 responses are usually studied by controlling cell type and expression of cell surface markers, as well as the production of cytokines either in serum or in lymphoid organs. Methods, such as the ELISA method, quantitative RT-PCR methods and flow cytometry are commonly used. Most of these tests are long and laborious because they require a large number of manipulations. These methods are not suitable for testing a multitude of experimental conditions; these methods can also distort the analysis because they can alter the natural response of cells, as for example in the case of methods which involve ex vivo reactivation of T cells. To overcome these various drawbacks of the prior art, models animals allowing rapid characterization of the type of the immune response would constitute extremely appreciable tools for carrying out these studies. Indeed, such animal models would make it possible to obtain a quick, easy, reproducible and reliable response to the natural biological response and would allow the Thl / Th2 parameters to be identified reliably.
C'est la raison pour laquelle les inventeurs se proposent de développer de nouveaux modèles en manipulant le génome animal, notamment murin, afin que le type de réponse immune soit directement représenté par l'expression d'un gène rapporteur spécifique. La présente invention vise donc à fournir une cellule animale transgénique non humaine exprimant au moins un transgène codant __ pour au moins une protéine rapporteuse, caractérisée en ce que l'expression de ladite protéine rapporteuse est corrélée à l'expression d'au moins une protéine naturellement produite par ladite cellule et spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune.This is the reason why the inventors propose to develop new models by manipulating the animal genome, in particular murine, so that the type of immune response is directly represented by the expression of a specific reporter gene. The present invention therefore aims to provide a non-human transgenic animal cell expressing at least one transgene encoding __ for at least one reporter protein, characterized in that the expression of said reporter protein is correlated with the expression of at least one protein. naturally produced by said cell and specific to a type of polarization of the immune response and / or to an effector function of the immune response.
Par les termes « l'expression de ladite protéine rapporteuse est corrélée à l'expression d'au moins une protéine naturellement produite », on entend indiquer que l'expression de la protéine rapporteuse est associée directement ou indirectement à l'expression de la protéine naturellement produite. Ainsi, lorsque la protéine naturellement produite est exprimée, respectivement non-exprimée, la protéine rapporteuse est également exprimée, respectivement non-exprimée. De préférence, le taux d'expression de la protéine rapporteuse sera directement proportionnel au taux d'expression de la protéine naturellement produite. Ainsi à titre d'exemple, lorsque le taux d'expression de la protéine naturellement produite est élevé, respectivement faible, le taux d'expression de la protéine rapporteuse est élevé, respectivement faible. Comme on le verra par la suite, cette corrélation est obtenue de préférence en plaçant le gène rapporteur sous le contrôle des éléments de régulation de l'expression du gène codant pour la protéine naturellement produite, sans invalider l'expression de ce gène; Dans ce cas l'expression des deux gènes est régulée en CIS, c'est-à-dire que l'expression de la protéine rapporteuse est directement associée à l'expression de la protéine naturellement produite. Cette corrélation peut également être obtenue en plaçant le gène rapporteur sous le contrôle d'éléments de régulation de la transcription inductible par la protéine naturellement produite ou l'une des protéines de la cascade métabolique induite par l'expression de la protéine naturellement produite. Dans ce cas l'expression des deux gènes est régulée en TRANS, c'est-à-dire que l'expression de la protéine rapporteuse est indirectement associée à l'expression de la protéine naturellement produite.By the terms “the expression of said reporter protein is correlated with the expression of at least one naturally produced protein”, it is meant to indicate that the expression of the reporter protein is directly or indirectly associated with the expression of the protein naturally produced. Thus, when the naturally produced protein is expressed, respectively unexpressed, the reporter protein is also expressed, respectively unexpressed. Preferably, the level of expression of the reporter protein will be directly proportional to the level of expression of the naturally produced protein. Thus, for example, when the expression level of the naturally produced protein is high, respectively low, the expression rate of the reporter protein is high, respectively low. As will be seen below, this correlation is preferably obtained by placing the reporter gene under the control of the regulatory elements for the expression of the gene coding for the naturally produced protein, without invalidating the expression of this gene; In this case the expression of the two genes is regulated in CIS, that is to say that the expression of the reporter protein is directly associated with the expression of the protein naturally. produced. This correlation can also be obtained by placing the reporter gene under the control of regulatory elements of transcription inducible by the naturally produced protein or one of the proteins of the metabolic cascade induced by the expression of the naturally produced protein. In this case the expression of the two genes is regulated in TRANS, that is to say that the expression of the reporter protein is indirectly associated with the expression of the naturally produced protein.
La cellule selon la présente invention se caractérise en outre par le fait que pour chaque type de polarisation de la réponse immune et/ou pour chaque type de fonction effectrice correspond une protéine rapporteuse distincte ce qui permet de distinguer aisément, rapidement, simultanément le ou les types de polarisation de la réponse immune et/ou le type de fonctions effectrices impliquées dans la réponse de la cellule ou de l'animal selon l'invention à un ou plusieurs immunogènes ou agents pathogènes.The cell according to the present invention is further characterized in that for each type of polarization of the immune response and / or for each type of effector function corresponds a distinct reporter protein which makes it possible to distinguish easily, quickly, simultaneously the types of polarization of the immune response and / or the type of effector functions involved in the response of the cell or animal according to the invention to one or more immunogens or pathogens.
Par polarisation de la réponse immune, on entend désigner la nature de la réponse immune, cellulaire ou humorale, qui suit la première rencontre avec un antigène. Parmi la réponse immune à médiation cellulaire, il convient de distinguer différents sous-types de polarisation tels que, de manière non exhaustive, la réponse immune médiée par les lymphocytes T auxiliaire' (« T helper ») , les lymphocytes T répresseurs (Groux et al . , 1997), les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules NK, les cellules K et le type humoral. De préférence, il s'agit du type de polarisation « T helper » qui est choisi parmi les types ThO (Firestein et al . , 1989), Thl, Th2, Th3, Tri. De préférence, il s'agit du type Thl (Mossmann et al . , 1986 ; Mossmann et al . , 1989 ; Del Prête et al . , 1991 ; Wiernenga et al . , 1990 ; Yamamura et al . , 1991 ; Robinson et al . , 1993) et Th2. Parmi la réponse immune humorale, il convient de citer la réponse immune médiée par les lymphocytes B. Les types de fonction effectrice de la réponse immune au sens de la présente invention comprennent de manière non exhaustive les activités ou fonctions CTL, les activités ou fonctions phagocytaires, les activités ou fonctions cytotoxiques, les activités ou fonctions immunosuppressives, les activités ou fonctions de présentation d'antigènes, les activités ou fonctions d'activation cellulaire.By polarization of the immune response is meant to denote the nature of the immune response, cellular or humoral, which follows the first encounter with an antigen. Among the immune cell-mediated response, one must distinguish different polarization subtypes such as, but not limited to, the immune response mediated by helper T lymphocytes ( "T helper") T cells repressors (Groux and al., 1997), cytotoxic T lymphocytes, NK cells, K cells and the humoral type. Preferably, it is the type of polarization "T helper" which is chosen from the types ThO (Firestein et al., 1989), Thl, Th2, Th3, Tri. Preferably, it is of the Thl type (Mossmann et al., 1986; Mossmann et al., 1989; Del Prête et al. , 1991; Wiernenga et al. , 1990 ; Yamamura et al. , 1991; Robinson et al. , 1993) and Th2. Among the humoral immune response, mention should be made of the immune response mediated by B lymphocytes. The types of effector function of the immune response within the meaning of the present invention include, in a non-exhaustive manner, CTL activities or functions, phagocytic activities or functions , cytotoxic activities or functions, immunosuppressive activities or functions, activities or functions of presentation of antigens, activities or functions of cellular activation.
Par fonction effectrice, on entend désigner une fonction cellulaire d'un ou plusieurs types de cellules ayant une résultante effectrice sur une type donnée de cellules cibles. Ces fonctions participent à la mise en place d'une immunité protectrice et/ou au développement d'une réponse immune adéquate telle le contrôle d'une réponse immune exacerbée par exemple. Par « protéine naturellement exprimée », on entend désigner une protéine exprimée à partir d'un gène présent dans son environnement chromatinien naturel, qui de ce fait présente une régulation naturelle de son expression. Ainsi, de manière très préférée, le gène codant pour la protéine naturellement exprimée n'a pas été introduit par transfection ou transgenèse dans la cellule ; il s'agit d'un gène dit endogène.By effector function is meant a cell function of one or more types of cells having an effector resultant on a given type of target cells. These functions participate in the establishment of protective immunity and / or in the development of an adequate immune response such as the control of an exacerbated immune response for example. By “naturally expressed protein” is meant a protein expressed from a gene present in its natural chromatin environment, which therefore has natural regulation of its expression. Thus, very preferably, the gene coding for the naturally expressed protein was not introduced by transfection or transgenesis into the cell; it is a so-called endogenous gene.
L'invention peut être réalisée dans n'importe quelle cellule de mammifère compétente pour la recombinaison homologue. De préférence, il s'agit de cellules de rongeurs, notamment de souris, de rat, de hamster, de cobaye. De préférence, il s'agit de cellules de souris. Alternativement, il s'agit de cellules de primates, à l'exception de l'homme, tels que les singes, chimpanzés, macaques, babouins. Il peut également s'agir de cellules de bovins, de caprins, d'ovins, de porcins, notamment de mini-porcs, de chevaux, de lapins.The invention can be carried out in any mammalian cell competent for homologous recombination. Preferably, these are rodent cells, in particular mice, rats, hamsters, guinea pigs. Preferably, these are mouse cells. Alternatively, these are primate cells, with the exception of humans, such as monkeys, chimpanzees, macaques, baboons. It can also be cells of cattle, goats, sheep, pigs, in particular mini-pigs, horses, rabbits.
Les cellules selon l'invention peuvent être définies fonctionnellement comme étant capables de réaliser la recombinaison homologue du ou des fragment (s) d'ADN exogène qui contient au moins une, de préférence deux, région (s) ayant des homologies de séquences avec une séquence d'ADN cellulaire endogène. De telles cellules contiennent naturellement des recombinases endogènes ou ont été génétiquement modifiées pour en contenir ou pour contenir les composés nécessaires pour réaliser la recombinaison de l'ADN.The cells according to the invention can be defined functionally as being capable of carrying out the homologous recombination of the fragment (s) of exogenous DNA which contains at least one, preferably two, region (s) having sequence homologies with a endogenous cellular DNA sequence. Such cells naturally contain endogenous recombinases or have been genetically modified to contain them or to contain the compounds necessary for carrying out the recombination of DNA.
De manière préférée, parmi les cellules selon l'invention, il convient de citer tous les types cellulaires exprimant naturellement des protéines spécifiques impliquées dans un ou plusieurs types de polarisation de la réponse immune et/ou des protéines spécifiques impliquées dans les mécanismes de communication cellulaire et dans la mise en place d'une ou plusieurs fonctions effectrices de la réponse immune. Les gènes codant pour ses protéines spécifiques, appelés dans la présente invention, gènes endogènes, codent de préférence pour des protéines solubles, des protéines intracellulaires ou membranaires, impliquées dans la signalisation intracellulaire et dans la communication cellulaire. Il s'agit de protéines du système immunitaire, telles par exemple les cytokines, chimiokines, lymphokines, les protéines de surface cellulaires (marqueurs de différenciation CD, récepteurs membranaires) , des protéines impliquées dans la transduction du signal associé à différents types de récepteurs, et ou dans l'activâtion de gênes cibles. Selon un mode particulier et préféré de l'invention, la protéine naturellement produite et spécifique de la polarisation de type Thl est choisie parmi de manière non exhaustive parmi l' interleukine 2 (IL-2) , 1 ' interleukine 12 (IL-12) , l' interleukine 18 (IL-18) , l' interféron γ, le TNF-β, 1-e TNF-α T-bet, STAT-4, la chaîne β du récepteur l'interféron γ (IFN-γ) , les chaînes du récepteur à l'IL- 12 et à l'IL-18, RANTES, MlP-lα, MlP-lβ, CD26, la chaîne β2 du récepteur à l' interleukine 12 (IL-12Rβ2) , CCR5, CCR2,CXCR3. De préférence, la protéine spécifique de la polarisation de type Thl est l'IFN-γ. La protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est choisie de préférence dans le groupe composé de manière non exhaustive de l' interleukine 3 (IL-3), 1 ' interleukine 4Preferably, among the cells according to the invention, mention should be made of all cell types naturally expressing specific proteins involved in one or more types of polarization of the immune response and / or specific proteins involved in cellular communication mechanisms and in the establishment of one or more effector functions of the immune response. The genes coding for its specific proteins, called in the present invention, endogenous genes, preferably code for soluble proteins, intracellular or membrane proteins, involved in intracellular signaling and in cellular communication. These are proteins of the immune system, such as for example cytokines, chemokines, lymphokines, cell surface proteins (CD differentiation markers, membrane receptors), proteins involved in signal transduction associated with different types of receptors, and or in the activation of target genes. According to a particular and preferred embodiment of the invention, the naturally produced protein specific for Thl polarization is chosen from, but not limited to, interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12), interleukin 18 (IL-18), l γ, TNF-β, 1-e TNF-α T-bet, STAT-4, the β chain of the interferon γ receptor (IFN-γ), the chains of the IL-12 and IL-18, RANTES, MlP-1α, MlP-1β, CD26, the β2 chain of the interleukin 12 receptor (IL-12Rβ 2 ), CCR5, CCR2, CXCR3. Preferably, the specific protein of the Thl type polarization is IFN-γ. The specific polarization protein of the Th2 type is preferably chosen from the group made up non-exhaustively of interleukin 3 (IL-3), 1 'interleukin 4
(IL-4), l' interleukine 5 (IL-5) , 1 ' interleukine 10 (IL- 10), l' interleukine 13 (IL- 13) , GATA-3, STAT-6, c-maf, NFAT, NIP45, CD30, CD26L, ST2L, CCR3 , CCR4 , CCR8, CXCR4 , CRTH2, STIF (WO 98 46 638) . De manière préférée, la protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l' interleukine 4 (IL-4) . Parmi ces cellules, il convient de citer les cellules du système immunitaire et de manière non exhaustive, les lymphocytes T, les cellules NK, les cellules K, les lymphocytes B, les basophiles, les mastocytes, les macrophages, les éosinophiles, les monocytes, les neutrophiles, les plaquettes, les cellules de Langerhans, les monocytes des cellules dendritiques. Les cellules selon l'invention peuvent également être par exemple des cellules neuronales. Il convient également de citer les cellules qui dans certaines conditions de culture, ou après différenciation ou manipulation génétique sont capables d'exprimer des protéines spécifiques impliquées dans un ou plusieurs types de polarisation de la réponse immune et/ou des protéines spécifiques impliquées dans une ou plusieurs fonctions effectrices de la réponse immune. On peut citer les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches embryonnaires totipotentes (cellules ES) ou pluripotentes . Ces cellules souches peuvent se différencier en une cellule exprimant les protéines spécifiques selon l'invention. Par cellules souches, on entend désigner tous les types de cellules indifférenciées multipotentes ou pluripotentes, cultivables in vi tro de façon prolongée sans perdre leurs caractéristiques, et qui sont susceptibles de se différencier en un ou plusieurs types cellulaires lorsqu'elles sont placées dans des conditions de culture définies. Ainsi, lorsque la cellule selon l'invention est une cellule ES ou une cellule hématopoïétique, on peut envisager d'induire la différenciation de celle-ci en différents types cellulaires susceptibles d'exprimer la ou les protéines spécifiques de la réponse immune tels par exemple les cellules neuronales et les cellules du système immunitaire, et plus précisément les mastocytes, les basophiles, les monocytes, les éosinophiles, les lymphocytes T, les cellules NK, les cellules K, les lymphocytes B, les cellules de Langerhans, les plaquettes, les monocytes des cellules dendritiques.(IL-4), interleukin 5 (IL-5), 1 interleukin 10 (IL-10), interleukin 13 (IL-13), GATA-3, STAT-6, c-maf, NFAT, NIP45, CD30, CD26L, ST2L, CCR3, CCR4, CCR8, CXCR4, CRTH2, STIF (WO 98 46 638). Preferably, the specific polarization protein of the Th2 type is interleukin 4 (IL-4). Among these cells, mention should be made of cells of the immune system and in a non-exhaustive manner, T lymphocytes, NK cells, K cells, B lymphocytes, basophils, mast cells, macrophages, eosinophils, monocytes, neutrophils, platelets, Langerhans cells, monocytes of dendritic cells. The cells according to the invention can also be, for example, neuronal cells. Mention should also be made of cells which, under certain culture conditions, or after genetic differentiation or manipulation, are capable of expressing specific proteins involved in one or more types of polarization of the immune response and / or specific proteins involved in one or more several functions immune response effectors. Mention may be made of hematopoietic stem cells, totipotent embryonic stem cells (ES cells) or pluripotent. These stem cells can differentiate into a cell expressing the specific proteins according to the invention. The term “stem cells” is intended to denote all the types of undifferentiated multipotent or pluripotent cells, cultivable in vi tro in a prolonged manner without losing their characteristics, and which are capable of differentiating into one or more cell types when they are placed under conditions of defined cultures. Thus, when the cell according to the invention is an ES cell or a hematopoietic cell, it is possible to envisage inducing the differentiation of the latter into different cell types capable of expressing the specific protein or proteins of the immune response such as for example neuronal cells and cells of the immune system, and more precisely mast cells, basophils, monocytes, eosinophils, T lymphocytes, NK cells, K cells, B lymphocytes, Langerhans cells, platelets, dendritic cell monocytes.
Lorsqu'il est nécessaire d'employer des cellules souches embryonnaires (ES) , pour la production de l'animal transgénique selon l'invention par exemple, une lignée cellulaire de cellules ES peut être employée ou des cellules embryonnaires peuvent être obtenues fraîchement à partir d'un hôte animal selon l'invention, en général d'une souris, d'un rat, d'un hamster, d'un cobaye. De telles cellules sont cultivées sur une couche de fibroblastes nourriciers appropriés ou sur de la gélatine, en présence de facteurs de croissance appropriés tels que du facteur inhibiteur de leucémie (LIF pour « Leukemia Inhibi ting Factor ») .When it is necessary to use embryonic stem cells (ES), for the production of the transgenic animal according to the invention for example, an ES cell cell line can be used or embryonic cells can be obtained fresh from an animal host according to the invention, generally a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig. Such cells are grown on a layer of suitable nourishing fibroblasts or on gelatin, in the presence of growth factors. appropriate drugs such as leukemia inhibiting factor (LIF).
Plus généralement les cellules selon l'invention correspondent à toutes les cellules animales, de préférence de mammifères, à l'exception des cellules humaines. Des exemples de cellules de mammifères compétentes pour la recombinaison comprennent donc les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules habituellement cultivées en laboratoire telles les cellules Hela, les cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary ») , Dorris, AE7, D10.64, DAX, Dl.l, CDC25 par exemple.More generally, the cells according to the invention correspond to all animal cells, preferably mammalian cells, with the exception of human cells. Examples of mammalian cells competent for recombination therefore include fibroblasts, endothelial cells, epithelial cells, cells usually cultivated in the laboratory such as Hela cells, CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, Dorris, AE7, D10. .64, DAX, Dl.l, CDC25 for example.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par transgénique une cellule comportant un transgène. On entend désigner par « transgène » ou par séquence d'acides nucléiques exogène ou par gène exogène du matériel génétique qui a été ou qui va être inséré artificiellement dans le génome d'un mammifère, particulièrement dans une cellule de mammifère cultivée in vi tro ou dans une cellule de mammifère vivant, ou qui va se maintenir dans la dite cellule sous forme épisomale. De manière préférée, le transgène selon la présente invention comprend au moins une séquence susceptible d'être transcrite ou transcrite et traduite en protéine. Le ou les transgènes selon l'invention ou leur expression n' affecte (nt) pas le fonctionnement du réseau biologique du système immunitaire, ni plus' généralement le fonctionnement du réseau biologique de la cellule. Le transgène peut être clone dans un vecteur de clonage qui permet d'en assurer sa propagation dans une cellule hôte, et/ou facultativement dans un vecteur d'expression pour assurer l'expression du transgène. Les technologies de l'ADN recombinant utilisées pour la construction du vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention sont celles connues et communément utilisées par les hommes de l'art. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement de l'ADN, l'amplification, et la purification ; les réactions enzymatiques impliquant l'ADN ligase, l'ADN polymérase, les endonucléases de restriction sont effectuées selon les recommandations du fabricant. Ces techniques et les autres sont généralement réalisées selon Sambrook et al . , 1989) . Les vecteurs incluent des plasmides, les cosmides, les phagemides, les bactériophages, les rétrovirus et autres virus animaux, les chromosomes artificiels, tels les YAC, BAC, HAC et autres vecteurs analogues .For the purposes of the present invention, the term “transgenic” is intended to denote a cell comprising a transgene. The term “transgene” or by exogenous nucleic acid sequence or by exogenous gene is intended to denote genetic material which has been or which is going to be inserted artificially in the genome of a mammal, particularly in a mammalian cell cultivated in vi tro or in a living mammalian cell, or one that will remain in said cell in episomal form. Preferably, the transgene according to the present invention comprises at least one sequence capable of being transcribed or transcribed and translated into protein. The one or more transgenes of the invention or their expression n 'affects (es) not the operation of the organic network of the immune system, no more' generally the operation of the biological system of the cell. The transgene can be cloned into a cloning vector which makes it possible to ensure its propagation in a host cell, and / or optionally in an expression vector to ensure the expression of the transgene. Recombinant DNA technologies used for the construction of the cloning and / or expression vector according to the invention are those known and commonly used by those skilled in the art. Standard techniques are used for cloning, DNA isolation, amplification, and purification; enzymatic reactions involving DNA ligase, DNA polymerase, restriction endonucleases are carried out according to the manufacturer's recommendations. These and other techniques are generally performed according to Sambrook et al. , 1989). The vectors include plasmids, cosmids, phagemids, bacteriophages, retroviruses and other animal viruses, artificial chromosomes, such as YAC, BAC, HAC and the like.
Les méthodes pour générer des cellules transgéniques selon l'invention sont bien connues de l'homme de l'art (Gordon et al . , 1989). Diverses techniques pour transfecter des cellules de mammifères ont été décrites (pour revue, voir Keon et al . , 1990). Le transgène selon l'invention, facultativement compris dans un vecteur linéarisé ou non, ou sous la forme d'un fragment de vecteur, peut être introduit dans la cellule hôte par des méthodes standard telles que par exemple la microinjection dans le noyau (US 4 873 191) , la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l' électroporation (Lo, 1983), le choc thermique, la transformation avec des polymères cationiques (PEG, polybrene, DEAE-Dextran...), l'infection virale (Van der Putten et al . , 1985), le spermeThe methods for generating transgenic cells according to the invention are well known to those skilled in the art (Gordon et al., 1989). Various techniques for transfecting mammalian cells have been described (for review, see Keon et al., 1990). The transgene according to the invention, optionally included in a linearized vector or not, or in the form of a vector fragment, can be introduced into the host cell by standard methods such as for example microinjection into the nucleus (US 4 873 191), transfection by precipitation with calcium phosphate, lipofection, electroporation (Lo, 1983), thermal shock, transformation with cationic polymers (PEG, polybrene, DEAE-Dextran ...), viral infection (Van der Putten et al., 1985), sperm
(Lavitrano et al . , 1989). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cellule transgénique selon l'invention est obtenue par ciblage génique (« gène targeting »)du ou des transgène (s) au niveau d'une ou des séquences du génome de la cellule hôte. Plus précisément, le transgène est inséré de manière stable par recombinaison homologue au niveau de séquences homologues dans le génome de la cellule hôte. Lorsqu'il s'agit d'obtenir une cellule transgénique en vue de produire un animal transgénique, la cellule hôte est de préférence une cellule souche embryonnaire (cellule ES) (Thompson et al . , 1989).(Lavitrano et al., 1989). According to a preferred embodiment of the invention, the transgenic cell according to the invention is obtained by gene targeting (“gene targeting”) of the transgene (s) at the level of one or more sequences of the genome of the host cell . More specifically, the transgene is stably inserted by homologous recombination at the level of homologous sequences in the genome of the host cell. When it comes to obtaining a transgenic cell in order to produce a transgenic animal, the host cell is preferably an embryonic stem cell (ES cell) (Thompson et al., 1989).
Le ciblage génique représente la modification dirigée d'un locus chromosomique par recombinaison homologue avec une séquence d'ADN exogène ayant une homologie de séquence avec la séquence endogène ciblée. On distingue différents types de ciblage génétique. Ainsi le ciblage génique peut être utilisé pour modifier, en général augmente l'expression d'un ou de plusieurs gène (s) endogène (s), ou pour remplacer un gène endogène par un gène exogène, ou pour placer un gène exogène sous le contrôle d'éléments de régulation de l'expression génique de gène endogène particulier qui reste actif. Dans ce cas, il le ciblage génique est appelé « Knock-in » (Kl) . Alternativement, le ciblage génique peut être utilisé pour diminuer ou annihiler l'expression d'un ou plusieurs gènes. Il s'agit alors de ciblage génique appelé « Knock- out » (KO) (voir Bolkey et al . , 1989).Gene targeting represents the directed modification of a chromosomal locus by homologous recombination with an exogenous DNA sequence having a sequence homology with the targeted endogenous sequence. There are different types of genetic targeting. Thus gene targeting can be used to modify, in general increase the expression of one or more endogenous gene (s), or to replace an endogenous gene with an exogenous gene, or to place an exogenous gene under the control of regulatory elements for gene expression of a particular endogenous gene which remains active. In this case, gene targeting is called "Knock-in" (Kl). Alternatively, gene targeting can be used to decrease or suppress the expression of one or more genes. This then involves gene targeting called “knockout” (KO) (see Bolkey et al., 1989).
Selon la présente invention, l'intégration dans le génome de ladite cellule dudit transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse constitue un « Knock- in » ; il est réalisé au niveau dudit ou desdits gènes endogènes codant pour une ou des protéines spécifiques d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'un type de fonction effectrice de la réponse immune sans que ledit transgène n'invalide l'expression dudit gène endogène, ou que l'expression dudit transgène n'affecte le réseau biologique de la cellule. La cellule selon l'invention se caractérise en ce que le transgène est intégré de manière stable dans le génome de ladite cellule, et en ce que son expression est contrôlée par les éléments de régulation du gène endogène codant pour ladite protéine naturellement produite et spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune. Par intégration de manière stable, on entend signifier l'insertion du transgêne dans l'ADN génomique de la cellule selon l'invention. Le transgène ainsi inséré est ensuite transmis à la descendance cellulaire. L'intégration du transgène est réalisée en amont, en aval ou au milieu du gène endogène cible. De préférence, le transgène comprend une séquence de reprise de la traduction telle par exemple une séquence IRES (site d'entrée interne des ribosomes) (Mountford et al . , 1995 ; Zhu et al . , 1999 ; Liu et al . , 2000), ladite séquence étant située entre la séquence codante de ladite protéine rapporteuse et de la séquence codante de ladite protéine spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune. Selon un mode préféré de réalisation, la cellule selon l'invention exprime un ou plusieurs transgènes, de préférence deux transgènes codant chacun pour une protéine rapporteuse distincte, l'expression de chaque protéine rapporteuse étant spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et de préférence du type Thl ou Th2. Plus particulièrement, la cellule animale transgénique non- humaine selon l'invention se caractérise en ce qu'elle exprime (a) un premier transgène codant pour une première protéine rapporteuse, ledit premier transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène animal endogène codant pour une protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune sans invalider l'expression dudit gène a endogène, l'expression dudit premier transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène animal endogène ; et/ou (b) un second transgène codant pour une deuxième protéine rapporteuse, distincte de ladite première protéine rapporteuse, ledit second transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique du type Th2 de polarisation de la réponse immune, sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit second transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène endogène.According to the present invention, the integration into the genome of said cell of said transgene coding for at least one reporter protein constitutes a "knock-in"; it is carried out at the level of said endogenous gene or genes coding for one or more proteins specific for a type of polarization of the immune response and / or for a type of effector function of the immune response without said transgene invalidating the expression of said endogenous gene, or that the expression of said transgene does not affect the biological network of the cell. The cell according to the invention is characterized in that the transgene is stably integrated into the genome of said cell cell, and in that its expression is controlled by the regulatory elements of the endogenous gene coding for said naturally produced protein and specific for a type of polarization of the immune response and / or of an effector function of the immune response. By stable integration is meant the insertion of the transgene into the genomic DNA of the cell according to the invention. The transgene thus inserted is then transmitted to the cell descendants. Integration of the transgene is carried out upstream, downstream or in the middle of the target endogenous gene. Preferably, the transgene comprises a sequence for resumption of translation such as for example an sequence IRES (internal entry site of the ribosomes) (Mountford et al., 1995; Zhu et al., 1999; Liu et al., 2000) , said sequence being located between the coding sequence of said reporter protein and the coding sequence of said protein specific for a type of polarization of the immune response and / or of an effector function of the immune response. According to a preferred embodiment, the cell according to the invention expresses one or more transgenes, preferably two transgenes each coding for a distinct reporter protein, the expression of each reporter protein being specific for a type of polarization of the immune response and preferably of the Thl or Th2 type. More particularly, the non-human transgenic animal cell according to the invention is characterized in that it expresses (a) a first transgene coding for a first reporter protein, said first transgene being integrated by homologous recombination ("Knock-In") at the level of an endogenous animal gene coding for a specific protein of the Thl type for polarization of the immune response without invalidating the expression of said endogenous a gene, the expression of said first transgene being correlated with expression of said endogenous animal gene; and / or (b) a second transgene coding for a second reporter protein, distinct from said first reporter protein, said second transgene being integrated by homologous recombination ("Knock-In") at the level of an endogenous gene coding for a specific protein of the Th2 type of polarization of the immune response, without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said second transgene being correlated with the expression of said endogenous gene.
Pour réaliser la recombinaison homologue il est nécessaire que le transgène contiennent au moins une séquence d'ADN comprenant au moins le gène rapporteur, avec éventuellement les modifications génétiques désirées et facultativement un ou plusieurs gènes de sélection positive ou négative, et également des régions d'ADN d'homologie avec le locus cible, de préférence au nombre de deux, situé de part et d'autre de la portion du gène rapporteur. Par «régions d'ADN d'homologies » ou «séquences d'ADN homologues ou substantiellement homologues », on entend désigner deux séquences d'ADN qui, après un alignement optimal et après comparaison, sont identiques pour environ au moins environ 75% des nucleotides, au moins environ 80% des nucleotides, habituellement au moins environ 90% à 95% des nucleotides et, de manière plus préférée, au moins environ 98 à 99,5% des nucleotides. Par «pourcentage d'identité» entre deux' séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucleotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) , au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) , au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) , au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genêtics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) . Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PA ou PAM250. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d' identité d'au moins 85 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. La longueur des régions d'homologie est partiellement dépendante du degré d'homologie. Ceci est dû au fait qu'une diminution de la quantité d'homologie résulte dans une diminution de la fréquence de recombinaison homologue. Si des régions de non homologie existent entre les portions de séquences homologues, il est préférable que cette non homologie ne s'étale pas sur toute la portion de séquence homologue mais plutôt dans des portions discrètes. Dans tous les cas, plus le degré d'homologie est faible, plus la région d'homologie doit être longue pour faciliter la recombinaison homologue. Bien que aussi peu que 14 pb homologue à 100% soient suffisantes pour réaliser la recombinaison homologue dans les bactéries, dans les cellules de mammifère, des portions de séquences homologues plus longues sont préférées, en général. Ces portions font au moins 250 pb, 500 pb, 750 pb, 1 000 pb, 1500 pb, 1750 pb, 2000 pb, 2500 pb, 3000pb, 4000 pb de préférence au moins 5 000 pb pour chaque portion de séquence homologue. Selon l'invention, les fragments d'ADN sont de n'importe quelle taille. La taille minimale requise est subordonnée à la nécessité d'avoir au moins une région d'homologie suffisamment longue pour faciliter la recombinaison homologue. Les fragments d'ADN ont une taille d'au moins environ 2 kb, de manière préférée d'au moins environ 3 kb, 5 kb, 6 kb. Le transgène n'est pas limité à une séquence particulière d'ADN. Ainsi les séquences d'ADN d'homologie présentes dans le transgène peuvent être d'une origine purement synthétique (par exemple réalisée en routine à partir d'un synthétiseur d'ADN), ou peuvent dériver de séquences d'ARNm par reverse transcription, ou peuvent dériver directement de séquences d'ADN génomique . Lorsque la séquence d'ADN d'homologie dérive de séquences d'ARN par reverse transcription, celle-ci peut contenir ou non tout ou partie de séquences non codantes telles les introns, selon que la molécule d'ARN correspondante a ou non subi, partiellement ou totalement, un epissage. De préférence, les séquences d'ADN homologue utilisée pour réaliser la recombinaison homologue comprennent des séquences d'ADN génomique plutôt que de l'ADNc. En effet, d'importantes séquences cis-régulatrices présentes dans les introns, les régions distales, les régions promotrices peuvent être présentes. Les séquences dérivant d'ADN génomique codent généralement au moins pour une portion de gène mais peuvent alternativement coder pour des régions non transcrites ou des régions d'un locus génétique non réarrangé telles que les loci des immunoglobulines ou du récepteur des cellules T. Généralement, les séquences d'ADN génomique incluent une séquence codant pour un transcrit d'ARN. De préférence, le transcrit d'ARN code pour un polypeptide ; de préférence, il s'agit de l'interféron γ et l' interleukineTo carry out the homologous recombination it is necessary that the transgene contain at least one DNA sequence comprising at least the reporter gene, optionally with the desired genetic modifications and optionally one or more selection genes positive or negative, and also regions of DNA homology with the target locus, preferably two in number, located on either side of the portion of the reporter gene. The term “homologous DNA regions” or “homologous or substantially homologous DNA sequences” is intended to denote two DNA sequences which, after optimal alignment and after comparison, are identical for approximately at least approximately 75% of the nucleotides, at least about 80% of the nucleotides, usually at least about 90% to 95% of the nucleotides and, more preferably, at least about 98 to 99.5% of the nucleotides. The term "percentage identity" between two 'nucleic acid sequences within the meaning of the present invention, is meant a percentage of identical nucleotides between the two sequences to compare, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length. We mean by "best alignment "or" optimal alignment ", the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having aligned them optimally, said comparison being carried out by segment or by “comparison window” in order to identify and compare the local regions of sequence similarity. The optimal alignment of the sequences for comparison can be carried out, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981), using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970), using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genêtics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). In order to obtain optimal alignment, the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix. The PA or PAM250 matrices can also be used. The percentage of identity between two nucleic acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences, the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may include additions or deletions with respect to the sequence of benchmark for optimal alignment between these two sequences. The percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences. By nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 85%, preferably at least 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence, is meant the nucleic acid sequences having, with respect to the reference nucleic acid sequence, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular punctual, and whose nucleic sequence has at least 85%, preferably at minus 90%, 95%, 98% and 99% identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence. The length of the regions of homology is partially dependent on the degree of homology. This is due to the fact that a decrease in the amount of homology results in a decrease in the frequency of homologous recombination. If regions of non-homology exist between the portions of homologous sequence, it is preferable that this non-homology does not extend over the entire portion of homologous sequence but rather in discrete portions. In all cases, the lower the degree of homology, the longer the region of homology must be to facilitate homologous recombination. Although as little as 14 bp 100% homologous is sufficient to achieve homologous recombination in bacteria, in mammalian cells, portions of longer homologous sequences are generally preferred. These portions are at least 250 bp, 500 bp, 750 bp, 1,000 bp, 1,500 bp, 1,750 bp, 2,000 bp, 2,500 bp, 3,000 bp, 4,000 bp, preferably at least 5,000 bp for each portion of homologous sequence. According to the invention, the DNA fragments are of any size. The minimum size required is subject to the need to have at least one region of sufficient homology long to facilitate homologous recombination. The DNA fragments are at least about 2 kb in size, preferably at least about 3 kb, 5 kb, 6 kb in size. The transgene is not limited to a particular DNA sequence. Thus the homology DNA sequences present in the transgene may be of purely synthetic origin (e.g. routinely performed from a DNA synthesizer), or may be derived from RNA sequences by reverse transcription m , or can be derived directly from genomic DNA sequences. When the DNA sequence of homology is derived from RNA sequences by reverse transcription, this may or may not contain all or part of non-coding sequences such as introns, depending on whether or not the corresponding RNA molecule has undergone, partially or totally, splicing. Preferably, the homologous DNA sequences used to carry out the homologous recombination comprise genomic DNA sequences rather than cDNA . Indeed, important cis-regulatory sequences present in introns, distal regions, promoter regions may be present. The sequences deriving from genomic DNA generally code at least for a portion of gene but can alternatively code for non-transcribed regions or regions of a non-rearranged genetic locus such as the loci of the immunoglobulins or of the T cell receptor. Generally, genomic DNA sequences include a sequence encoding an RNA transcript. Preferably, the RNA transcript encodes a polypeptide; preferably it is interferon γ and interleukin
11-4. Selon un mode préféré de réalisation, le transgène comprend tout ou partie du gène de l'IL-4 murin caractérisé en ce que dans l'extrémité 3' non codante du gène de l'IL-4 murin sont insérées séquentiellement une séquence IRES, une séquence codant pour une protéine autofluorescente, une cassette de sélection positive encadrée ou non de sites-spécifiques à l'action des recombinases, par exemples une cassette Lox/Néo-TK/Lox ou lox/Néo/lox ou FRT/Néo-TK/FRT ou FRT/Néo/FRT pouvant être également présente en position 5' du gène rapporteur, et caractérisé en ce que une cassette de sélection négative contenant par exemple le ou les gènes DTA et/ou TK est présente à au moins une des extrémités du transgène . Lorsque la protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l'IL-4, alors la protéine auto-fluorescente est de préférence la RFP. Selon un autre mode de réalisation, le transgène comprend tout ou partie du gène murin de l'IFN-γ, caractérisé en ce que dans l'extrémité 3' non codante du gène murin de l'IFN-γ sont insérées séquentiellement une séquence IRES, une séquence codant pour une protéine autofluorescente, une cassette de sélection positive encadrée ou non de sites-spécifiques à l'action des recombinases, par exemples une cassette Lox/Néo-TK/Lox ou lox/Néo/lox ou FRT/Néo-TK/FRT ou FRT/Néo/FRT pouvant être également présente en position 5' du gène rapporteur et caractérisé en ce que une cassette de sélection négative contenant par exemple le ou les gènes DTA et/ou TK est présente à au moins une des extrémités du transgène. Lorsque la protéine spécifique de la polarisation de type Thl est l'IFN-γ, alors la protéine auto-fluorescente est de préférence la GFP.11-4. According to a preferred embodiment, the transgene comprises all or part of the murine IL-4 gene characterized in that in the non-coding 3 ′ end of the murine IL-4 gene are sequentially inserted a IRES sequence, a sequence coding for an autofluorescent protein, a positive selection cassette framed or not with sites-specific to the action of recombinases, for example a Lox / Neo-TK / Lox or lox / Neo / lox or FRT / cassette Neo-TK / FRT or FRT / Neo / FRT may also be present at position 5 ′ of the reporter gene, and characterized in that a negative selection cassette containing for example the gene (s) DTA and / or TK is present at least one end of the transgene. When the specific protein of the Th2 type polarization is IL-4, then the auto-fluorescent protein is preferably RFP. According to another embodiment, the transgene comprises all or part of the murine gene for IFN-γ, characterized in that in the non-coding 3 ′ end of the murine gene for IFN-γ are sequentially inserted an IRES sequence , a sequence encoding an autofluorescent protein, a positive selection cassette framed or not with sites-specific to the action of recombinases, for example a Lox / Neo-TK / Lox or lox / Neo / lox or FRT / Neo- cassette TK / FRT or FRT / Neo / FRT can also be present at position 5 ′ of the reporter gene and characterized in that a negative selection cassette containing for example the gene (s) DTA and / or TK is present at at least one of the ends of the transgene. When the specific protein for Th1 polarization is IFN-γ, then the auto-fluorescent protein is preferably GFP.
Le transgène peut être aussi petit que quelques centaines de paires de bases d'ADNc ou aussi large qu'une centaine de milliers de paires de bases d'un locus génique comprenant la séquence codante exonique- intronique et les séquences de régulation nécessaires à l'obtention d'une expression contrôlée de manière spatiotemporelle. De préférence, le segment d'ADN recombiné a une taille comprise entre 2,5 kb et 1 000 kb. Quoi qu'il en soit, les segments d'ADN recombinés peuvent être inférieurs à 2,5 kb et supérieurs à 1 000 kb.The transgene may be as small as a few hundred DNA base pairs or c as large as hundreds of thousands of basepairs of a gene locus comprising the coding sequence exonique- intronic and regulatory sequences necessary for the obtaining a spatiotemporally controlled expression. Preferably, the recombinant DNA segment has a size between 2.5 kb and 1000 kb. In any case, the recombined DNA segments can be less than 2.5 kb and more than 1000 kb.
Le transgène de la présente invention est de préférence sous forme native, c'est-à-dire dérivé directement d'une séquence d'ADN exogène présente naturellement dans une cellule animale. Cette séquence d'ADN sous forme native peut être modifiée par exemple par insertion de sites de restriction nécessaires au clonage et/ou par insertion de sites de recombinaison site-spécifiques (séquences lox et flp) . Alternativement, le transgène de la présente invention peut avoir été créée artificiellement in vi tro par les techniques de l'ADN recombinant, en associant par exemple des portions d'ADN génomique et d'ADNc. Il s'agit là de transgène chimérique. La séquence d'ADN selon l'invention, sous forme native ou chimérique, peut être mutée en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier. Pour les séquences codantes, ces mutations peuvent affecter la séquence d'acides aminés.The transgene of the present invention is preferably in native form, that is to say derived directly from an exogenous DNA sequence naturally present in an animal cell. This DNA sequence in native form can be modified for example by insertion of restriction sites necessary for cloning and / or by insertion of site-specific recombination sites (lox and flp sequences). Alternatively, the transgene of the present invention may have been created artificially in vi tro by recombinant DNA techniques, for example by combining portions of genomic DNA and cDNA . These are chimeric transgene. The DNA sequence according to the invention, in native or chimeric form, can be mutated using the techniques well known to those skilled in the art. For coding sequences, these mutations can affect the amino acid sequence.
Lorsque les cellules ont été transformées par le transgène, elles peuvent être cultivées in vi tro ou bien être utilisées pour produire des animaux transgéniques. Après transformation, les cellules sont ensemencées sur une couche nourricière et/ou dans un milieu approprié. Les cellules contenant la construction peuvent être, détectées en utilisant un milieu sélectif. Après un temps suffisant pour laisser les colonies pousser, celles-ci sont récupérées et analysées pour déterminer si un événement de recombinaison homologue et/ou une intégration de la construction s'est produite. Pour réaliser le criblage des clones ayant satisfait à la recombinaison homologue, des marqueurs positifs et négatifs, encore appelés gènes de sélection, peuvent être insérés dans le vecteur de recombinaison homologue. Différents systèmes de sélection des cellules ayant réalisé l'événement de recombinaison homologue ont été décrits ; il convient de citer le premier système décrit qui utilise des vecteurs de sélection positif/négatif (Mansour et al . , 1988 ; Capecchi, 1989).When the cells have been transformed with the transgene, they can be cultured in vitro or else used to produce transgenic animals. After transformation, the cells are seeded on a feeder layer and / or in an appropriate medium. Cells containing the construct can be detected using a selective medium. After sufficient time to allow the colonies to grow, they are collected and analyzed to determine if a homologous recombination event and / or integration of the construct has occurred. In order to screen the clones having satisfied the homologous recombination, positive and negative markers, also called selection genes, can be inserted into the homologous recombination vector. Different systems for selecting cells that have achieved the homologous recombination event have been described; mention should be made of the first system described which uses positive / negative selection vectors (Mansour et al., 1988; Capecchi, 1989).
Par gène de sélection, on entend désigner un gène qui permet aux cellules qui le possèdent d'être sélectionnées spécifiquement pour ou contre la présence d'un agent sélectif correspondant. Pour illustrer ce propos, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif qui permet à une cellule hôte d'être sélectionnée positivement en présence de l'antibiotique correspondant. Une variété de marqueurs positifs et négatifs sont connus de l'homme du métier (pour revue voir brevet US 5 627 059) . Ce gène de sélection peut se trouver soit à l'intérieur ou à l'extérieur du transgène linéarisé. Lorsque le gène de sélection se trouve à l'intérieur du transgène, c'est-à- dire entre les extrémités 5' et 3 ' du transgène , celui- ci peut être présent sous la forme d'une entité génique distincte du gène rapporteur selon l'invention. Dans ce cas, le gêne de sélection est lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler son expression ; alternativement le gène de sélection peut être mis sous le contrôle des séquences de régulation de l'expression dudit gène rapporteur. Ces séquences, connues de l'homme du métier, correspondent notamment aux séquences promotrices, facultativement aux séquences activatrices et aux signaux de terminaison de la transcription. Facultativement, le gène de sélection peut constituer un gène de fusion avec le gène rapporteur. Ledit gène de fusion est alors lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler l'expression dudit gêne de fusion. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le gène de sélection est situé aux extrémités 5' ou 3 ' du transgène de sorte que si un événement de recombinaison homologue se produit le gène de sélection n'est pas intégré dans l'ADN génomique cellulaire; dans ce cas le gène de sélection est un gène de sélection négatif (pour revue voir brevet US 5 627 059) .The term “selection gene” is intended to denote a gene which allows the cells which possess it to be specifically selected for or against the presence of a corresponding selective agent. To illustrate this point, an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker gene which allows a host cell to be positively selected in the presence of the corresponding antibiotic. A variety of positive and negative markers are known to those skilled in the art (for review see US Patent 5,627,059). This selection gene can be found either inside or outside the linearized transgene. When the selection gene is located inside the transgene, that is to say between the 5 ′ and 3 ′ ends of the transgene, it can be present in the form of a gene entity distinct from the reporter gene. according to the invention. In this case, the selection gene is operably linked with DNA sequences making it possible to control its expression; alternatively the selection gene can be put under the control of the sequences for regulating the expression of said reporter gene. These sequences, known to those skilled in the art, correspond in particular to promoter sequences, optionally to activator sequences and to transcription termination signals. Optionally, the selection gene can constitute a fusion gene with the reporter gene. Said fusion gene is then operably linked with DNA sequences making it possible to control the expression of said fusion discomfort. According to another embodiment of the invention, the selection gene is located at the 5 ′ or 3 ′ ends of the transgene so that if a homologous recombination event occurs the selection gene is not integrated into the DNA cell genomics; in this case the selection gene is a negative selection gene (for a review, see US Pat. No. 5,627,059).
Ledit gène de sélection positive selon l'invention est de préférence choisi parmi les gènes de résistance aux antibiotiques. Parmi les antibiotiques, il convient de citer de manière non exhaustive la néomycine, la tétracycline, l'ampicilline, la kanamycine, la phléomycine, la bléomycine, 1 ' hygromycine, le chloramphénicol, la carbénicilline, la généticine, la puromycine. Les gènes de résistance correspondant à ces antibiotiques sont connus de l'homme du métier ; à titre d'exemple, le gène de la néomycine rend les cellules résistantes à la présence de l'antibiotique G418 dans le milieu de culture. Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène HisD, l'agent sélectif correspondant étant l'histidinol . Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène de la guanine-phosphoribosyl-transférase (GpT) , l'agent sélectif correspondant étant la xanthine. Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène de l'hypoxanthine-phosphoribosyl- transférase (HPRT) , l'agent sélectif correspondant étant 1 ' hypoxanthine . Ledit gène de sélection négative selon l'invention est de préférence choisi parmi le gène de la 6- thioxanthine ou thyτnidine kinase (TK) (Mzoz et al . , 1993) , les gènes codant pour des toxines bactériennes ou virales telles par exemple l'exotoxine A de Pseudomonas, la toxine diphtérique (DTA) , la toxine cholérique, la toxine anthrox de Bacillus, la toxine Pertussis, la toxine Shiga de Shigella, la toxine apparentée à la toxine Shiga, les toxines d 'Escherichia coli , la colicine A, la d-endotoxine . On peut également citer le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide (Wei et al., 1994), la purine nucleoside phosphorylase d'Escherichia coli (E. coli) et la 6-methylpurine déoxyribonucléoside (Sorscher et al . , 1994), les cytosines déaminases (Cdase) ou uracil phosphoribosyl transferase (UPRTase) qui peuvent être utilisées avec la 5-fluorocytosine (5-FC) .Said positive selection gene according to the invention is preferably chosen from the antibiotic resistance genes. Among the antibiotics, mention should be made, in a non-exhaustive manner, of neomycin, tetracycline, ampicillin, kanamycin, phleomycin, bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, carbenicillin, geneticin, puromycin. The resistance genes corresponding to these antibiotics are known to those skilled in the art; for example, the neomycin gene makes cells resistant to the presence of the antibiotic G418 in the culture medium. The positive selection gene can also be selected from the HisD gene, the corresponding selective agent being histidinol. The positive selection gene can also be selected from the guanine phosphoribosyl transferase (GpT) gene, the corresponding selective agent being xanthine. The positive selection gene can also be selected from the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene, the corresponding selective agent being hypoxanthine. Said negative selection gene according to the invention is preferably chosen from the 6-thioxanthine or thyτnidine kinase (TK) gene (Mzoz et al., 1993), the genes coding for bacterial or viral toxins such as for example the Pseudomonas exotoxin A, diphtheria toxin (DTA), cholera toxin, anthrox toxin from Bacillus, pertussis toxin, Shiga toxin from Shigella, toxin related to Shiga toxin, toxins from Escherichia coli, colicin A, d-endotoxin . Mention may also be made of rat cytochrome p450 and cyclophosphophamide (Wei et al., 1994), purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli (E. coli) and 6-methylpurine deoxyribonucleoside (Sorscher et al., 1994) cytosine deaminases (Cdase) or uracil phosphoribosyl transferase (UPRTase) which can be used with 5-fluorocytosine (5-FC).
Le ou les marqueurs de sélection utilisés pour permettre d'identifier les événements de recombinaison homologue peuvent affecter par la suite l'expression génique, et peuvent être éliminés, si nécessaire, par la mise en œuvre de recombinases site-spécifiques telle la recombinase Cre spécifique des sites Lox (Sauer, 1994 ; Rajewsky et al . , 1996; Sauer, 1998) ou FLP spécifique des sites FRT (Kilby et al . , 1993). Les colonies positives, c'est-à-dire contenant des cellules dans lesquelles au moins un événement de recombinaison homologue s'est produit sont identifiées par une analyse par Southern Blotting et/ou par des techniques de PCR. Le taux d'expression, dans les cellules isolées ou les cellules de l'animal transgénique selon l'invention, de l'ARNm correspondant au transgène peut également être déterminé par des techniques comprenant l'analyse par Northern blotting, l'analyse par hybridation in situ, par RT-PCR. Egalement les cellules ou tissus animaux exprimant le transgène peuvent être identifiés en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine rapporteuse. Les cellules positives peuvent ensuite être utilisées pour réaliser les manipulations sur l'embryon et notamment l'injection des cellules modifiées par recombinaison homologue dans les blastocystes. Pour ce qui concerne la souris, les blastocystes sont obtenus à partir de femelles superovulées de 4 à 6 semaines. Les cellules sont trypsinées et les cellules modifiées sont injectées dans le blastocell d'un blastocyste. Après l'injection, les blastocystes sont introduits dans la corne utérine de femelles pseudo-gestantes. On laisse ensuite les femelles aller jusqu'à leur terme et les portées résultantes sont analysées pour déterminer la présence de cellules mutantes possédant la construction. L'analyse du génotype ou d'un phénotype différent entre les cellules de l'embryon nouveau-né et les cellules du blastocyste ou des cellules ES permet de détecter les nouveau-nés chimériques. Les embryons chimériques sont ensuite élevés jusqu'à l'âge adulte. Les chimères ou animaux chimériques, sont des animaux dans lesquels seule une sous-population de cellules possède un génome altéré. Les animaux chimériques présentant le gène ou les gènes modifiés, sont en général croisés entre eux ou avec un animal de type sauvage afin d'obtenir une descendance hétérozygote ou homozygote. Les hétérozygotes mâles et femelles sont ensuite croisés pour générer des animaux homozygotes. A moins qu'il ne soit indiqué, l'animal transgénique selon l'invention comprend des changements stables de la séquence nucléotidique des cellules de la lignée germinale.The selection marker (s) used to identify homologous recombination events can subsequently affect gene expression, and can be eliminated, if necessary, by the use of site-specific recombinases such as specific Cre recombinase. Lox sites (Sauer, 1994; Rajewsky et al., 1996; Sauer, 1998) or specific FLP for FRT sites (Kilby et al., 1993). Positive colonies, that is to say containing cells in which at least one homologous recombination event has occurred, are identified by analysis by Southern blotting and / or by PCR techniques. The level of expression, in the isolated cells or the cells of the transgenic animal according to the invention, of the mRNA corresponding to the transgene can also be determined by techniques comprising analysis by Northern blotting, analysis by hybridization in situ, by RT-PCR. Also animal cells or tissues expressing the transgene can be identified using an antibody directed against the reporter protein. The positive cells can then be used to carry out the manipulations on the embryo and in particular the injection of the cells. modified by homologous recombination in blastocysts. As for the mouse, the blastocysts are obtained from 4 to 6 week old superovulated females. The cells are trypsinized and the modified cells are injected into the blastocell of a blastocyst. After the injection, the blastocysts are introduced into the uterine horn of pseudo-pregnant females. The females are then allowed to go to term and the resulting litters are analyzed to determine the presence of mutant cells having the construct. Analysis of the genotype or of a different phenotype between the cells of the newborn embryo and the cells of the blastocyst or ES cells makes it possible to detect chimeric newborns. The chimeric embryos are then reared until adulthood. Chimeras, or chimeric animals, are animals in which only a subpopulation of cells has an altered genome. The chimeric animals presenting the modified gene or genes are generally crossed with each other or with a wild-type animal in order to obtain heterozygous or homozygous descendants. The male and female heterozygotes are then crossed to generate homozygous animals. Unless otherwise indicated, the transgenic animal according to the invention comprises stable changes in the nucleotide sequence of cells of the germ line.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule transgénique non humaine selon l'invention peut servir de cellule donneuse de noyau dans le cadre d'un transfert de noyau ou transfert nucléaire. Par transfert nucléaire, on entend désigner le transfert de noyau d'une cellule vivante donneuse de vertébré, d'un organisme adulte ou au stade fœtal, dans le cytoplasme d'une cellule receveuse énucléée de la même espèce ou d'une espèce différente. Le noyau transféré est reprogrammé pour diriger le développement des embryons clones qui peuvent ensuite être transférés dans des femelles porteuses pour produire les fœtus et les nouveau-nés, ou utilisés pour produire des cellules de la masse cellulaire interne en culture. Différentes techniques de clonage nucléaire sont susceptibles d'être utilisées ; parmi celles-ci, il convient de citer de manière non exhaustive celles qui font l'objet des demandes de brevet WO 95 17500, WO 97 07668, WO 97 07669, WO 98 30683, WO 99 01163, WO 99 37143.According to another embodiment of the invention, the non-human transgenic cell according to the invention can serve as a nucleus donor cell in the context of a nuclear transfer or nuclear transfer. The term nuclear transfer is intended to denote the transfer of the nucleus of a living vertebrate donor cell, from an adult organism or at the fetal stage, into the cytoplasm of a enucleated recipient cell of the same or a different species. The transferred nucleus is reprogrammed to direct the development of cloned embryos which can then be transferred into carrier females to produce fetuses and newborns, or used to produce cells from the cultured internal cell mass. Different nuclear cloning techniques are likely to be used; among these, non-exhaustive mention should be made of those which are the subject of patent applications WO 95 17500, WO 97 07668, WO 97 07669, WO 98 30683, WO 99 01163, WO 99 37143.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le ciblage génique selon la présente invention constitue un « Knock-In » (K-I) . Le transgène ou le gène exogène codant pour au moins une protéine rapporteuse selon l'invention est ciblée par recombinaison homologue dans le génome de l'organisme. Selon un mode préféré de réalisation, le transgène selon l'invention est dépourvu d'éléments de régulation de l'expression geniques et est placé sous le contrôle des éléments endogènes de régulation de l'expression du gène codant pour la protéine spécifique d'au moins un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'un type de fonction effectrice de la réponse immune. Ainsi, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, au moins un transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse selon l'invention est introduit dans le génome d'une cellule animale de préférence murine sous le contrôle d'éléments de régulation de l'expression du gène de l'interféron γ murin et/ou sous le contrôle des éléments de régulation de l'expression du gène de 1 ' interleukine 4 (11-4) murin, sans invalider l'expression de ces deux gènes endogènes. Le transgène comprend au moins un gène, appelé gène rapporteur, qui code pour la protéine rapporteuse selon l'invention. Le gène rapporteur comprend soit l'ensemble des séquences contenant l'information pour la production régulée_ de l'ARN correspondant (transcription) soit de la chaîne polypeptidique correspondante (transcription- traduction) . Le gène rapporteur peut être un gène de type sauvage présentant un polymorphisme naturel ou pour une séquence d'ADN manipulée génétiquement, par exemple ayant des délétions, substitutions ou insertions dans les régions codantes ou non codantes. De manière préférée, le ou les gènes rapporteur sont dépourvus de séquences de régulation nécessaires pour diriger et contrôler leur expression dans un ou des type (s) cellulaire (s) approprié (s) ; en effet, ils sont placés après recombinaison homologue sous le contrôle des séquences animales endogènes de régulation de l'expression du gène endogène animal cible qui demeure de préférence actif suite à l'événement de recombinaison homologue et l'intégration du gène rapporteur.According to a preferred embodiment of the invention, the gene targeting according to the present invention constitutes a "Knock-In" (KI). The transgene or the exogenous gene coding for at least one reporter protein according to the invention is targeted by homologous recombination in the genome of the organism. According to a preferred embodiment, the transgene according to the invention lacks elements for regulating gene expression and is placed under the control of endogenous elements for regulating the expression of the gene coding for the protein specific for minus one type of polarization of the immune response and / or one type of effector function of the immune response. Thus, according to a preferred embodiment of the invention, at least one transgene coding for at least one reporter protein according to the invention is introduced into the genome of an preferably murine animal cell under the control of regulatory elements of the expression of the murine interferon γ gene and / or under the control of elements for regulating the expression of the murine interleukin 4 (11-4) gene, without invalidating the expression of these two endogenous genes. The transgene comprises at least one gene, called the reporter gene, which codes for the reporter protein according to the invention. The reporter gene comprises either all of the sequences containing the information for the regulated production of the corresponding RNA (transcription) or of the corresponding polypeptide chain (transcription-translation). The reporter gene can be a wild-type gene exhibiting a natural polymorphism or for a genetically manipulated DNA sequence, for example having deletions, substitutions or insertions in the coding or non-coding regions. Preferably, the reporter gene (s) lack the regulatory sequences necessary to direct and control their expression in an appropriate cell type (s); in fact, they are placed after homologous recombination under the control of endogenous animal sequences for regulating the expression of the target animal endogenous gene which preferably remains active following the event of homologous recombination and the integration of the reporter gene.
Alternativement, le transgène selon l'invention peut contenir des séquences de régulation appropriées pour diriger et contrôler l'expression dudit ou desdits protéines rapporteuses dans la cellule. Dans ce cas, le transgène est intégré de manière aléatoire dans le génome, ou est présent sous forme épisomale dans la cellule. Dans ce cas de figure, les séquences de régulation appropriées sont des séquences inductibles par une ou plusieurs protéines d'un type spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune ou d'un type de fonction effectrice de la réponse immune, ou par une ou plusieurs protéines de la voie métabolique spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune ou d'un type de fonction effectrice de la réponse immune. Par éléments de régulation de l'expression du gène, on entend désigner toutes les séquences d'ADN impliquées dans la régulation de l'expression génique c'est-à-dire essentiellement les séquences régulatrices de la transcription, de l' epissage, de la traduction. Parmi les séquences d'ADN régulatrices de la transcription, il convient de citer la séquence promotrice minimale, les séquences amonts (par exemple, la boite SP1, l'IRE pourAlternatively, the transgene according to the invention can contain regulatory sequences suitable for directing and controlling the expression of said reporter protein (s) in the cell. In this case, the transgene is randomly integrated into the genome, or is present in episomal form in the cell. In this case, the appropriate regulatory sequences are sequences inducible by one or more proteins of a specific type, a type of polarization of the immune response or a type of effector function of the immune response, or by one or more proteins of the specific metabolic pathway of a type of polarization of the immune response or of a type of effector function of the immune response. By elements for regulating gene expression is intended to denote all the DNA sequences involved in the regulation of gene expression, that is to say essentially the regulatory sequences for transcription, splicing, the translation. Among the DNA sequences regulating transcription, mention should be made of the minimum promoter sequence, the upstream sequences (for example, the SP1 box, the IRE for
« interferon responsive élément »,...), les séquences activatrices (« enhancers ») , éventuellement les séquences inhibitrices (« silencers ») , les séquences insulateurs (« insulator ») , les séquences d'épissage."Interferon responsive element", ...), activator sequences ("enhancers"), possibly inhibitor sequences ("silencers"), insulator sequences ("insulator"), splicing sequences.
Ces séquences de régulation de l'expression sont liées de manière opérationnelle au (x) gène (s) rapporteur (s) . Une séquence nucléique est « liée de manière opérationnelle » lorsqu'elle est placée dans une relation fonctionnelle avec une autre séquence d'acide nucléique. Par exemple, un promoteur ou un activateurThese expression regulation sequences are operably linked to the reporter gene (s). A nucleic acid sequence is "operably linked" when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a promoter or activator
(« enhancer ») est lié de manière opérationnelle à une séquence codante, s'il affecte la transcription de ladite séquence codante. Concernant les séquences régulatrices de la transcription, « lié de manière opérationnelle » signifie que les séquences d'ADN liées sont contiguës, et lorsqu'il s'agit de lier deux régions codantes pour des protéines, contiguës et en phase de lecture.(“Enhancer”) is operably linked to a coding sequence, if it affects the transcription of said coding sequence. With regard to transcriptional regulatory sequences, "operably linked" means that the linked DNA sequences are contiguous, and when it comes to linking two regions coding for proteins, contiguous and in reading phase.
La cellule transgénique et/ou l'animal transgénique non humain selon l'invention est obtenu en introduisant au moins un transgène codant pour une protéine rapporteuse, dans une cellule, un zygote ou un embryon précoce de l'animal non humain. L'introduction de différents transgènes dans la cellule selon l'invention peut également être réalisée de manière simultanée ou de manière décalée dans le temps. Lorsque la cellule contient plusieurs, transgènes, elle peut être obtenue directement par introduction simultanée des fragments d'ADN nécessaires à la recombinaison homologue dans ladite cellule en utilisant des méthodes favorisant la co-transformation de molécules d'ADN multiples. Les cellules sont alors sélectionnées pour les multiples événements de recombinaison attendus en utilisant un système de sélection adapté. Alternativement, la cellule multi-transgénique peut être obtenue en réalisant les événements de recombinaison homologue séparément et de manière décalée dans le temps. Ainsi, la cellule, après introduction d'un premier vecteur de recombinaison homologue, est sélectionnée pour le premier événement de recombinaison homologue, en utilisant un système de sélection adaptée ; cette cellule nouvellement transgénique est ensuite transformée avec un second vecteur de recombinaison homologue, puis sélectionnée pour le second événement de recombinaison homologue en utilisant un système de sélection identique ou différent. Facultativement, cette cellule double transgénique peut ensuite être transformée avec un troisième vecteur de recombinaison homologue, puis sélectionnée pour le troisième événement de recombinaison homologue en utilisant un système de sélection identique ou différent, et ainsi de suite. Alternativement, la cellule double, triple ou multi-transgénique selon l'invention peut être obtenue par croisement successif d'animaux transgéniques. Par exemple, une cellule double transgénique peut être obtenue par croisement de deux animaux simples transgéniques homozygotes ; elle peut être obtenue par croisement puis sélection de deux animaux simples transgéniques hétérozygotes, ou par croisement et sélection d'un animal simple transgénique homozygote et d'un animal simple transgénique hétérozygote. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule est caractérisée en ce que ledit transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse est intégré de manière aléatoire dans ladite cellule sans que ladite intégration du transgène n'invalide l'expression d'un ou plusieurs gènes codant pour des protéines impliquées dans la polarisation de la réponse immune et/ou un type de fonction effectrice de la réponse immune, ni n'affecte le réseau biologique cellulaire ou animal. Dans ce cas, le transgène est de préférence intégré dans une région non codante du génome, sous la dépendance d'éléments de réponse à des protéines impliquées dans la polarisation de la réponse immune ou dans des fonctions effectrices.The transgenic cell and / or the non-human transgenic animal according to the invention is obtained by introducing at least one transgene coding for a reporter protein, into a cell, a zygote or an early embryo of the non-human animal. The introduction of different transgenes into the cell according to the invention can also be carried out simultaneously or in a time-delayed manner. When the cell contains several transgenes, it can be obtained directly by simultaneously introducing the DNA fragments necessary for homologous recombination into said cell using methods promoting the co-transformation of multiple DNA molecules. The cells are then selected for the multiple recombination events expected using a suitable selection system. Alternatively, the multi-transgenic cell can be obtained by carrying out the homologous recombination events separately and in a time-delayed manner. Thus, the cell, after introduction of a first homologous recombination vector, is selected for the first homologous recombination event, using a suitable selection system; this newly transgenic cell is then transformed with a second homologous recombination vector, then selected for the second homologous recombination event using an identical or different selection system. Optionally, this double transgenic cell can then be transformed with a third homologous recombination vector, then selected for the third homologous recombination event using the same or different selection system, and so on. Alternatively, the double, triple or multi-transgenic cell according to the invention can be obtained by successive crossing of transgenic animals. For example, a double transgenic cell can be obtained by crossing two single homozygous transgenic animals; it can be obtained by crossing and then selecting two simple heterozygous transgenic animals, or by crossing and selecting a single homozygous transgenic animal and a single heterozygous transgenic animal. According to another embodiment of the invention, the cell is characterized in that said transgene coding for at least one reporter protein is randomly integrated into said cell without said integration of the transgene invalidating the expression of a or several genes coding for proteins involved in the polarization of the immune response and / or a type of effector function of the immune response, nor does it affect the cellular or animal biological network. In this case, the transgene is preferably integrated into a non-coding region of the genome, under the dependence of response elements on proteins involved in the polarization of the immune response or in effector functions.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule est caractérisée en ce que ledit transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse est présent sous forme épisomale dans ladite cellule. Il est à la portée de l'homme du métier de définir la nature et les caractéristiques du vecteur d'expression utilisé pour permettre le maintien et l'expression sous forme épisomale du transgène dans la cellule de l'invention.According to another embodiment of the invention, the cell is characterized in that said transgene coding for at least one reporter protein is present in episomal form in said cell. It is within the reach of those skilled in the art to define the nature and characteristics of the expression vector used to allow the maintenance and expression in episomal form of the transgene in the cell of the invention.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par gène rapporteur, un gène qui permet aux cellules comportant ce gène d'être détectées de manière spécifique suite à l'expression de ce dernier, c'est-à-dire d'être distinguées des autres cellules qui ne portent pas ce gène marqueur. Ledit gène rapporteur selon l'invention code pour une protéine rapporteuse choisie de préférence dans le groupe composé des protéines auto-fluorescentes, telles que la protéine de fluorescence verte (GFP, pour « Green Fluorescence Protein ») , la protéine de fluorescente verte augmentée (EGFP) , la protéine de fluorescence jaune (YFP) , la protéine de fluorescence bleue (BFP) , la protéine de fluorescence rouge (RFP) , ainsi que les variants de ces protéines de fluorescence obtenues par mutagenèse pour générer une fluorescence de couleur différente. Ledit gène « reporter » code également pour toute enzyme détectable de manière fluorescente, phosphorescente, ou visible par un procédé histochimique sur des cellules vivantes ou toutes autres méthodes d'analyse cellulaire, ou par microscopie. De façon non exhaustive, il convient de citer la β- galactosidase (β-GAL) , la β-glucoronidase (β-GUS) , la phosphatase alcaline, notamment la phosphatase alcaline placentaire (PLAP) , la déshydrogénase alcoolique, notamment la déshydrogénase alcoolique de drosophileFor the purposes of the present invention, the term “reporter gene” is intended to denote a gene which allows cells containing this gene to be detected specifically following the expression of the latter, that is to say to be distinguished. other cells that do not carry this marker gene. Said reporter gene according to the invention codes for a reporter protein preferably chosen from the group composed of auto-fluorescent proteins, such as the green fluorescence protein (GFP, for Green Fluorescence Protein), the increased green fluorescent protein ( EGFP), yellow fluorescence protein (YFP), blue fluorescence protein (BFP), red fluorescence protein (RFP), as well as the variants of these fluorescence proteins obtained by mutagenesis to generate a fluorescence of different color. Said "reporter" gene also codes for any enzyme detectable in a fluorescent, phosphorescent or visible manner by a histochemical process on living cells or any other methods of cell analysis, or by microscopy. Non-exhaustively, mention should be made of β-galactosidase (β-GAL), β-glucoronidase (β-GUS), alkaline phosphatase, in particular placental alkaline phosphatase (PLAP), alcoholic dehydrogenase, in particular alcoholic dehydrogenase Drosophila
(ADH) , la luciférase, notamment la « Firefly(ADH), luciferase, in particular "Firefly
Luciferase » , la chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT) , l'hormone de croissance (GH) .Luciferase ", chloramphenicol-acetyl transferase (CAT), growth hormone (GH).
La présente invention porte également sur l'animal transgénique non-humain comprenant au moins une cellule selon l'invention. Par « animal transgénique », on entend désigner un animal non humain, de préférence un mammifère choisi dans le groupe des rongeurs et notamment de la souris, du rat, du hamster, du cobaye. La souris est particulièrement appréciée car son système immunitaire a été étudié en profondeur. Alternativement, l'animal transgénique est choisi parmi les animaux d'élevage et notamment les porcins, ovins, caprins, bovins, équidés, notamment le cheval, les lagomorphes, notamment le lapin. L'animal transgénique selon l'invention peut également être choisi parmi les primates, notamment les singes, tels le macaque, le chimpanzé, le babouin. Compte tenu des polymorphismes génétiques présents dans la population, il peut être intéressant pour analyser ou obtenir une réponse physiologique ou comportementale caractéristique que les animaux transgéniques selon l'invention, et notamment les souris transgéniques selon l'invention présentent des fonds génétiques différents. Ainsi, les souris selon l'invention peuvent être sélectionnées dans les lignées murines consanguines (« inbred ») 129Sv, 12901a, C57B16, BalB/C^ DBA/2, mais également dans les lignées non consanguines (« outbred ») , ou des lignées hybrides.The present invention also relates to the non-human transgenic animal comprising at least one cell according to the invention. The term “transgenic animal” is intended to denote a non-human animal, preferably a mammal chosen from the group of rodents, and in particular mice, rats, hamsters and guinea pigs. The mouse is particularly appreciated because its immune system has been studied in depth. Alternatively, the transgenic animal is chosen from farm animals and in particular pigs, sheep, goats, cattle, horses, especially horses, lagomorphs, especially rabbits. The transgenic animal according to the invention can also be chosen from primates, in particular monkeys, such as the macaque, the chimpanzee, the baboon. Given the genetic polymorphisms present in the population, it may be advantageous to analyze or obtain a physiological or behavioral response characteristic that the transgenic animals according to the invention, and in particular the mice transgenic according to the invention have different genetic backgrounds. Thus, the mice according to the invention can be selected from inbred murine lines ("inbred") 129Sv, 12901a, C57B16, BalB / C ^ DBA / 2, but also from outbred lines ("outbred"), or from Hybrid lines.
L'animal transgénique selon l'invention comprend au moins une cellule dont le génome comprend au moins transgène selon l'invention, présent soit sous forme d'élément extra-chromosomal, soit intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique. De préférence, l'ensemble des cellules de l'animal et notamment ses cellules de la lignée germinale sont transgéniques.The transgenic animal according to the invention comprises at least one cell whose genome comprises at least transgene according to the invention, present either in the form of an extra-chromosomal element, or stably integrated into the chromosomal DNA. Preferably, all of the animal's cells and in particular its cells of the germ line are transgenic.
Selon un mode préféré de réalisation, l'invention concerne un animal transgénique non-humain caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule exprimant (i) un premier transgêne codant pour une première protéine rapporteuse, ledit premier transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit premier transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène endogène ; et (ii) un second transgène codant pour une deuxième protéine rapporteuse, distincte de ladite première protéine rapporteuse, ledit second transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique du type Th2 de polarisation de la réponse immune, sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit second transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène animal endogène. De manière encore préférée, cet transgénique non-humain se caractérise en ce que la protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune est l'IFN-γ, la protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l' interleukine 4 (IL-4) , le dit premier transgène code pour la protéine rapporteuse GFP et le second transgêne code pour la protéine rapporteuse RFP.According to a preferred embodiment, the invention relates to a non-human transgenic animal characterized in that it comprises at least one cell expressing (i) a first transgene encoding a first reporter protein, said first transgene being integrated by homologous recombination (“Knock-In”) at the level of an endogenous gene coding for a specific protein of the Thl type for polarization of the immune response without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said first transgene being correlated with the expression of said endogenous gene; and (ii) a second transgene coding for a second reporter protein, distinct from said first reporter protein, said second transgene being integrated by homologous recombination ("Knock-In") at the level of an endogenous gene coding for a specific protein of the type Th2 of polarization of the immune response, without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said second transgene being correlated with the expression of said endogenous animal gene. More preferably, this non-human transgenic is characterized in that the specific protein of the Thl type of polarization of the immune response is IFN-γ, the specific protein of polarization of type Th2 is interleukin 4 (IL-4), the said first transgene codes for the reporter protein GFP and the second transgene codes for the RFP reporter protein.
C'est également un des objets de l'invention de fournir un procédé in vi tro pour caractériser le type de polarisation de la réponse immune induite par un immunogene, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (a) mise en contact dudit immunogene avec une cellule selon l'invention; (b) détermination si une expression ou des expressions de transgène (s) codant pour au moins une protéine rapporteuse dont l'expression est associée à un type de polarisation de la réponse immune, ou un type de fonction effectrice, se produit (respectivement « se produisent ») ; (c) facultativement, évaluation quantitative de l'expression du ou des protéine (s) rapporteuse (s) ; et enfin (d) caracterisation qualitative, facultativement quantitative, du ou des type (s) de polarisation de la réponse immune.It is also one of the objects of the invention to provide an in vitro method for characterizing the type of polarization of the immune response induced by an immunogen, characterized in that it comprises the steps of (a) bringing said said into contact immunogen with a cell according to the invention; (b) determining whether an expression or expressions of transgene (s) encoding at least one reporter protein whose expression is associated with a type of polarization of the immune response, or a type of effector function, occurs (respectively " occur ") ; (c) optionally, quantitative evaluation of the expression of the reporter protein (s); and finally (d) qualitative characterization, optionally quantitative, of the type (s) of polarization of the immune response.
L'invention concerne également le procédé in vivo pour caractériser le type de réponse immune induite par un immunogene, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (a) mise en contact dudit immunogene avec un animal selon l' invention; (b) détermination si une expression ou des expressions de transgène (s) codant pour au moins une protéine rapporteuse dont l'expression est associée à un type de réponse immune se produit (respectivement « se produisent ») dans au moins une cellule dudit animal ; (c) facultativement, évaluation quantitative de l'expression du ou des protéine (s) rapporteuse (s) ; et enfin (d) caracterisation qualitative, facultativement quantitative, du ou des types de polarisation de la réponse immune. C'est également un des objets de la présente invention de fournir un procédé d'obtention de cellules animales non humaines spécifiques d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (a) mise en contact d'un immunogene ou d'un agent pathogène induisant la mise en place d'une réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune avec une cellule selon l'invention; (b) détermination si une expression du transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse, dont l'expression est associée au dit type de polarisation de la réponse immune et/ou au dit type de fonction effectrice de la réponse immune, se produit ; et enfin (c) identification des cellules exprimant ladite protéine rapporteuse.The invention also relates to the in vivo method for characterizing the type of immune response induced by an immunogen, characterized in that it comprises the steps of (a) bringing said immunogen into contact with an animal according to the invention; (b) determining whether an expression or expressions of transgene (s) coding for at least one reporter protein whose expression is associated with a type of immune response occurs (respectively "occur") in at least one cell of said animal ; (c) optionally, quantitative evaluation of the expression of the reporter protein (s); and finally (d) qualitative characterization, optionally quantitative, of the type or types of polarization of the immune response. It is also one of the objects of the present invention to provide a process for obtaining non-human animal cells specific for a type of polarization of the immune response and / or an effector function of the immune response, characterized in that that it comprises the steps of (a) bringing an immunogen or a pathogenic agent inducing the establishment of an immune response and / or an effector function of the immune response with a cell according to 'invention; (b) determining whether expression of the transgene encoding at least one reporter protein, the expression of which is associated with said type of polarization of the immune response and / or with said type of effector function of the immune response, occurs; and finally (c) identification of cells expressing said reporter protein.
C'est également un des objets de l'invention de fournir un procédé d'obtention de cellules animales non humaines spécifiques d'un type de réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (a) mise en contact d'un immunogene ou d'un agent pathogène induisant la mise en place d'une réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune avec un animal selon l'invention ; (b) de détermination si une expression du transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse associée audit type de réponse immune et/ou à une fonction effectrice de la réponse immune se produit dans au moins une cellule dudit animal ; (c) d'isolement de tout ou partie des cellules de l'animal ; et enfin (d) d'identification parmi les cellules du dit l'animal des cellules exprimant ladite protéine rapporteuse. De préférence, les cellules sont identifiées et/ou caractérisées en utilisant un trieur de cellules (cytométrie de flux) mais tous autres moyens manuels ou automatiques de tri peuvent être employés.It is also one of the objects of the invention to provide a process for obtaining non-human animal cells specific for a type of immune response and / or for an effector function of the immune response, characterized in that it comprises the steps of (a) bringing an immunogen or a pathogenic agent inducing the establishment of an immune response and / or an effector function of the immune response with an animal according to the invention; (b) determining if expression of the transgene encoding at least one reporter protein associated with said type of immune response and / or an immune response effector occurs in at least one cell of said animal; (c) isolation of all or part of the animal's cells; and finally (d) identifying, among the cells of said animal, cells expressing said reporter protein. Preferably, the cells are identified and / or characterized using a cell sorter (flow cytometry) but any other manual or automatic sorting means can be used.
Selon un mode préféré de réalisation, 1 ' immunogene spécifique d'un type de réponse immune a été caractérisé par un_ procédé selon l'invention tel que précédemment décrit. Par immunogene au sens de la présente invention, on entend désigner un composé capable de déclencher une réponse immune. Parmi les immunogènes on peut citer les antigènes, qui réagissent avec les récepteurs des cellules T et B, ou avec des anticorps préformés, ou avec tout autre types de récepteur exprimés sur les cellules impliquées dans la mise en place et le développement d'une réponse immune innée ou spécifique. Parmi les immunogènes il convient de citer les antigènes classiquement utilisés par l'homme de l'art, les allergènes, les mitogènes, les agents pathogènes, ou l'un de leurs constituants, d'origine virale, bactérienne, parasitaire, fongique, mycoplasmique, les vaccins et compositions vaccinales, les adjuvants, les médicaments, les composés ou agents chimiques. La mise en contact d'un immunogene spécifique avec une cellule ou un animal selon l'invention peut se faire par diverses voies telles par exemple une infection classique par un microorganisme pathogène, ou via un vecteur biologique de délivrance (moustique, tique, bactérie , virus et parasites ou agent commensale recombinant, ADN nu...) , par inhalation, en aérosol, par la nourriture. Expérimentalement, l' immunogene peut être mis en contact avec l'animal par une administration par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, contact cutané ou par voie orale.According to a preferred embodiment, the specific immunogen of a type of immune response has been characterized by a method according to the invention as previously described. By immunogen within the meaning of the present invention is intended to denote a compound capable of triggering an immune response. Among the immunogens, there may be mentioned antigens, which react with T and B cell receptors, or with preformed antibodies, or with any other type of receptor expressed on the cells involved in the establishment and development of a response. innate or specific immune. Among the immunogens, it is appropriate to cite the antigens conventionally used by those skilled in the art, allergens, mitogens, pathogens, or one of their constituents, of viral, bacterial, parasitic, fungal, mycoplasmic origin. , vaccines and vaccine compositions, adjuvants, drugs, chemical compounds or agents. The contacting of a specific immunogen with a cell or an animal according to the invention can be done by various routes such as for example a conventional infection by a pathogenic microorganism, or via a biological delivery vector (mosquito, tick, bacteria, virus and parasites or recombinant commensal agent, naked DNA ...), by inhalation, in aerosol, by food. Experimentally, the immunogen can be brought into contact with the animal by administration by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route, skin contact or by oral route.
C'est également un objet de l'invention de fournir un procédé de criblage de composés modulant au moins un type de polarisation de la réponse immune et/ou au moins une fonction effectrice de la réponse immune caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (a) mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogene responsable du déclenchement d'une réponse immune, de préférence spécifique d'un type de polarisation, et/ou d'une fonction effectrice, et de manière simultanée ou décalée dans le temps avec ledit composé ; (b) la mise en contact d'une cellule et/ou un animal selon l'invention avec ledit immunogene de l'étape (a) ; (c) la détermination qualitative, facultativement quantitative, de l'expression d'au moins un transgène codant pour une protéine rapporteuse dont l'expression est corrélée à un type spécifique de polarisation et/ou d'une fonction effectrice puis comparaison desdites expressions déclenchées en a) et b) ; puis (d) l'identification du composé qui module sélectivement la réponse immune et/ou une fonction effectrice. Selon un mode préféré de réalisation, la dite polarisation de la réponse immune est de type Thl . Selon un autre mode préféré de réalisation, la dite polarisation de la réponse immune est de type Th2. Selon un mode préféré de réalisation, la dite fonction effectrice peut être de manière non exhaustive une activité CTL, une fonction cytotoxique autre, une fonction phagocytaire, une activité humorale, une fonction immunosuppressive .It is also an object of the invention to provide a method for screening for compounds modulating at least one type of polarization of the immune response and / or at least one effector function of the immune response characterized in that it comprises the steps of (a) bringing a cell and / or an animal according to the invention into contact with an immunogen responsible for triggering an immune response, specific preference of a type of polarization, and / or of an effector function, and simultaneously or offset in time with said compound; (b) bringing a cell and / or an animal according to the invention into contact with said immunogen from step (a); (c) the qualitative determination, optionally quantitative, of the expression of at least one transgene coding for a reporter protein whose expression is correlated with a specific type of polarization and / or of an effector function then comparison of said triggered expressions in a) and b); then (d) identifying the compound which selectively modulates the immune response and / or an effector function. According to a preferred embodiment, said polarization of the immune response is of the Th1 type. According to another preferred embodiment, said polarization of the immune response is of the Th2 type. According to a preferred embodiment, said effector function can be non-exhaustively a CTL activity, another cytotoxic function, a phagocytic function, a humoral activity, an immunosuppressive function.
Enfin, l'invention porte également sur l'utilisation d'une composition comprenant un composé modulant la' réponse immune, de préférence spécifique d'un type de polarisation, et/ou d'un type de fonction effectrice et un véhicule pharmaceutiquement acceptable à titre de médicament pour le traitement préventif et/ou curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, caractérisé en ce que l'aptitude dudit composé à inhiber ou activer sélectivement la réponse immune spécifique d'un type de polarisation et/ou d'un type de fonction effectrice est déterminée par (a) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogene responsable du déclenchement d'une réponse immune, de préférence spécifique d'un type de polarisation et/ou d'une fonction effectrice, et de manière simultanée ou décalée dans le temps avec ledit composé ; (b) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogene responsable du déclenchement d'une réponse immune, de préférence spécifique d'un type de polarisation et/ou d'une fonction effectrice ; (c) la détermination qualitative, facultativement quantitative de l'expression d'au moins un transgène codant pour une protéine rapporteuse dont l'expression est corrélée à un type spécifique de polarisation et/ou d'une fonction effectrice puis comparaison desdites expressions déclenchées en a) et b) ; puis (d) l'identification du composé qui module sélectivement la réponse immune spécifique d'un type de polarisation et/ou d'une fonction effectrice. De préférence la dite réponse immune est de type Thl. La composition selon l'invention peut être utilisée dans un traitement préventif ou curatif d'un certain nombre de pathologies pour lesquelles un dysfonctionnement d'un type de polarisation de la réponse immune, notamment Thl, a été observé. Parmi ces pathologies, il convient de citer le rejet des allo-greffes, la sclérose en plaque, les maladies inflammatoires et chroniques de l'intestin (MICI) et/ou rectocoliques, la maladie de Crohn, la sarcoïdite, l'ulcère peptidique induit par helicobacter pylori, l'arthrite rhumatoïde, l'arthrite réactive, notamment la maladie de Lyme.Finally, the invention also relates to the use of a composition comprising a compound modulating the 'immune response, preferably specific for a type of polarization, and / or type of effector function and a pharmaceutically acceptable carrier to drug title for the preventive and / or curative treatment of a man or an animal in need of such treatment, characterized in that the ability of said compound to selectively inhibit or activate the specific immune response of a type of polarization and / or of a type of effector function is determined by (a) bringing a cell and / or an animal according to the invention into contact with an immunogen responsible for triggering a immune response, preferably specific to a type of polarization and / or to an effector function, and simultaneously or delayed in time with said compound; (b) bringing a cell and / or an animal according to the invention into contact with an immunogen responsible for triggering an immune response, preferably specific for a type of polarization and / or for a function Effector ; (c) the qualitative, optionally quantitative determination of the expression of at least one transgene coding for a reporter protein, the expression of which is correlated with a specific type of polarization and / or of an effector function, then comparison of said expressions triggered by a) and b); then (d) identifying the compound which selectively modulates the specific immune response of a type of polarization and / or of an effector function. Preferably said immune response is of the Thl type. The composition according to the invention can be used in a preventive or curative treatment of a certain number of pathologies for which a dysfunction of a type of polarization of the immune response, in particular Thl, has been observed. Among these pathologies, mention should be made of the rejection of allografts, multiple sclerosis, inflammatory and chronic intestinal diseases (IBD) and / or rectocolic, Crohn's disease, sarcoiditis, induced peptide ulcer by helicobacter pylori, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, especially Lyme disease.
Selon un autre mode préféré, la dite réponse immune est de type Th2 et le dit traitement est destiné à traiter une pathologie choisie dans le groupe composé de la tolérance aux allo-greffes, le passage de l'infection VIH au SIDA déclaré, le syndrome d'Omenn, les maladies atopiques (allergies médiées par les IgE) , telles que les réactions d'hypersensibilité immédiate et/ou inflammatoire notamment 1 ' anaphylaxie systémique, 1 ' anaphylaxie cutanée, l'asthme, l'eczéma, la dermatite atopique, notamment le psoriasis, les maladies inflammatoires et chroniques de l'intestin (MICI) et/ou rectocoliques, les maladies parasitaires dans lesquelles une réponse IgE est connue comme étant protectrice, notamment les maladies parasitaires helminthiques (infections par Schistosoma mansoni et Nippostrongylus filiaires) , la sclérose systémique progressive, la péridontite chronique, la progression tumorale. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions pharmaceutiques et vaccinales, c'est-à-dire un diluant, vecteur synthétique ou biologique, un agent de suspension telle une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galeniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. Quand l'agent est un polypeptide, un antagoniste, un ligand, un polynucléotide, par exemple une composition antisens, un vecteur, par exemple un vecteur antisens, on peut l'introduire dans des tissus ou des cellules hôtes par un certain nombre de façons, incluant l'infection virale, la micro- injection ou la fusion de vésicules. On peut également utiliser l'injection par jet pour une administration intramusculaire.According to another preferred mode, the said immune response is of the Th2 type and the said treatment is intended for treat a pathology chosen from the group consisting of tolerance to allografts, the transition from HIV infection to declared AIDS, Omenn syndrome, atopic diseases (allergies mediated by IgE), such as immediate and / or inflammatory hypersensitivity, in particular systemic anaphylaxis, cutaneous anaphylaxis, asthma, eczema, atopic dermatitis, in particular psoriasis, inflammatory and chronic intestinal diseases (IBD) and / or rectocolic, parasitic diseases in which an IgE response is known to be protective, in particular helminthic parasitic diseases (infections with filial Schistosoma mansoni and Nippostrongylus), progressive systemic sclerosis, chronic peridontitis, tumor progression. The term “pharmaceutically acceptable vehicle” is intended to denote any type of vehicle usually used in the preparation of pharmaceutical and vaccine compositions, that is to say a diluent, synthetic or biological vector, a suspending agent such as an isotonic or buffered saline solution. Preferably, these compounds will be administered by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route. Their optimal modes of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a treatment adapted to a patient such as for example the patient's age or body weight, the severity of his general condition, tolerance to treatment and side effects observed, etc. When the agent is a polypeptide, an antagonist, a ligand, a polynucleotide, for example an antisense composition, a vector, for example an antisense vector, it is possible to introduce it into host tissues or cells in a number of ways, including viral infection, microinjection or fusion of vesicles. Jet injection can also be used for intramuscular administration.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'une cellule ou d'un animal selon l'invention à des fins de recherches expérimentales pour l'analyse et l'étude des mécanismes moléculaires, biologiques, biochimiques, physiologiques et/ou physiopathologiques d'au moins un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'un type de fonction effectrice de la réponse immune. En fonction du type de recherche que l'on veut développer, on utilise soit l'animal entier, soit des cellules dérivées dudit animal. Ces cellules peuvent être soit isolées fraîchement de l'animal ou peuvent être immortalisées en culture, soit en multipliant les passages, soit en transformant les cellules par des virus tels le virus SV40 ou le virus d' Epstein-Bahr . D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes :Finally, the invention relates to the use of a cell or an animal according to the invention for the purposes of experimental research for the analysis and study of the molecular, biological, biochemical, physiological and / or physiopathological mechanisms of '' at least one type of polarization of the immune response and / or one type of effector function of the immune response. Depending on the type of research that we want to develop, we use either the whole animal or cells derived from said animal. These cells can either be isolated fresh from the animal or can be immortalized in culture, either by multiplying the passages, or by transforming the cells with viruses such as the SV40 virus or the Epstein-Bahr virus. Other characteristics and advantages of the invention appear in the following description with the examples shown below. In these examples we will refer to the following figures:
FIGURE 1 : Représentation schématique du transgène codant pour la protéine autofluorescente RFP destinée au « Knock-In » dans l'extrémité 3' non codante du gène de l'IL-4.FIGURE 1: Schematic representation of the transgene coding for the autofluorescent protein RFP intended for “Knock-In” in the 3 ′ non-coding end of the IL-4 gene.
En haut : représentation schématique de l'extrémité 3' du gêne de l'IL-4. En hachuré est représentée la région génique transcrite. En pointillés est représentée la région avale au gène de l'IL-4 qui contient des séquences régulatrices. Le site d'arrêt de la traduction est indiqué par un « STOP » . En bas : représentation schématique du transgène. IRES : site interne d'entrée des ribosomes du virus de 1 ' encéphalomyocarditis RFP : _ protéine de fluorescence rougeAbove: schematic representation of the 3 'end of the IL-4 gene. Hatched represents the transcribed gene region. Dotted is the region downstream of the IL-4 gene which contains regulatory sequences. The translation stop site is indicated by a "STOP". Below: schematic representation of the transgene. IRES: internal entry site for encephalomyocarditis virus ribosomes RFP: _ red fluorescence protein
Lox : site d'action de la recombinase CreLox: Cre recombinase action site
Néo : gène de résistance à la Néomycine sous la dépendance d'un promoteur eucaryote TK : gène de la thymidine kinase. DTA : gène de la toxine diphtérique A.Neo: gene for resistance to neomycin dependent on a eukaryotic promoter TK: gene for thymidine kinase. DTA: gene for diphtheria toxin A.
FIGURE 2 : Représentation schématique du transgène codant pour la protéine autofluorescente GFP destinée au « Knock-In » dans l'extrémité 3' non codante du gène de l'IFN-γ.FIGURE 2: Schematic representation of the transgene coding for the autofluorescent protein GFP intended for "Knock-In" in the 3 'non-coding end of the IFN-γ gene.
En haut : représentation schématique de l'extrémité 3' du gène de l'IFN-γ. En hachuré est représentée la région génique transcrite. En pointillés est représentée la région avale au gène de l'IL-γ qui contient des séquences régulatrices. Le site d'arrêt de la traduction est indiqué par un « STOP » .Above: schematic representation of the 3 'end of the IFN-γ gene. Hatched represents the transcribed gene region. In dotted lines is represented the region downstream of the IL-γ gene which contains regulatory sequences. The translation stop site is indicated by a "STOP".
En bas : représentation schématique du transgêne. IRES : site interne d'entrée des ribosomes du virus de 1' encéphalomyocarditisBelow: schematic representation of the transgene. IRES: internal entry site for ribosomes of the encephalomyocarditis virus
RFP : protéine de fluorescence rouge Lox : site d'action de la recombinase Cre Néo : gène de résistance à la Néomycine sous la dépendance d'un promoteur eucaryote TK : gène de la thymidine kinase sous la dépendance d'un promoteur eucaryote DTA : gène de la toxine diphtérique A. EXEMPLESRFP: red fluorescence protein Lox: site of action of the Cre Neo recombinase: gene for resistance to Neomycin under the dependence of a eukaryotic promoter TK: thymidine kinase gene under the dependence of a eukaryotic promoter DTA: gene diphtheria toxin A. EXAMPLES
EXEMPLE 1 ; MATERIEL ET METHODESEXAMPLE 1; MATERIAL AND METHODS
1.1. Gènes endogènes cibles1.1. Target endogenous genes
1.1.1. Interleukine 41.1.1. Interleukin 4
L' interleukine 4 (IL-4) est une protéine majoritairement sécrétée par exemple par les mastocytes activés (Bradding et al . , 1992) et les cellules T,Interleukin 4 (IL-4) is a protein mainly secreted for example by activated mast cells (Bradding et al., 1992) and T cells,
(Mossmann et al . , 1986). L'IL4 joue un rôle important dans la différenciation des cellules T naïves CD4+ murines en cellules effectrices de la réponse Th2 (Mossmann et al. 1986, Swain et al . , 1990 ; Gross et al . , 1993 ; Kopf et al . , 1993).(Mossmann et al., 1986). IL4 plays an important role in the differentiation of murine CD4 + naive T cells into effector cells of the Th2 response (Mossmann et al. 1986, Swain et al., 1990; Gross et al., 1993; Kopf et al., 1993 ).
Le gène murin codant pour 1 ' interleukine 4 est localisé sur le chromosome 7 du génome de la souris où il est organisé en 4 exons et 3 introns avec des séquences promotrices identifiées à l'extrémité 5' entre les positions - 760 et - 1 (Otsuka et al . , 1987). Le mécanisme de l'expression de l' interleukine 4 implique un certain nombre de facteurs de transcription qui incluent GATA-3, C-MAF, NFAT, NIP-45 et JUN B (Li-Weber et al . , 1997) .The murine gene coding for interleukin 4 is located on chromosome 7 of the mouse genome where it is organized into 4 exons and 3 introns with promoter sequences identified at the 5 'end between positions - 760 and - 1 ( Otsuka et al., 1987). The mechanism of expression of interleukin 4 involves a number of transcription factors which include GATA-3, C-MAF, NFAT, NIP-45 and JUN B (Li-Weber et al., 1997).
Un certain nombre de modèles de souris déficientes en IL-4 ont été générées (Kuhn et al . , 1991 ; Kopf et al . , 1993 ; Noben-Trauth et al . , 1996 ; Metwali et al . , 1996 1996 ; Hu-Li J. et al. 2001). Il semble que le phénotype de souris adulte, homozygote nulle (« knock-out ») pour le gène de l' interleukine 4, présente des taux d' IgGl et d'IgE réduits avec un développement normal des cellules B et T et des réponses Th2 altérées. Les hétérozygotes présentent, quant à elles, des réponses ayant un phénotype intermédiaire.A number of mouse models deficient in IL-4 have been generated (Kuhn et al., 1991; Kopf et al., 1993; Noben-Trauth et al., 1996; Metwali et al., 1996 1996; Hu-Li J. et al. 2001). The phenotype of an adult mouse, homozygous null (“knockout”) for the interleukin 4 gene, seems to have reduced IgG1 and IgE levels with normal development of B and T cells and responses Th2 altered. Heterozygotes show responses with an intermediate phenotype.
Un fragment d'ADNc de 585 paires de bases codant pour l'IL-4 de souris a été isolé à partir d'une banque d'ADNc obtenue à partir de cellules T helper. Ce fragment d'ADNc code pour une protéine de 140 aminoacides (Lee et al . , 1986) qui, après glycosylation, a une masse moléculaire de 20 kDa (Sidéras et al . , 1987).A 585 base pair cDNA fragment encoding mouse IL-4 was isolated from a cDNA library obtained from T helper cells. This cDNA fragment codes for a protein of 140 amino acids (Lee et al., 1986) which, after glycosylation, has a molecular mass of 20 kDa (Sideras et al., 1987).
1.1.2. Interféron γ1.1.2. Interferon γ
Un ADNc de 1292 pb codant pour 1 ' IFN-γ de souris à été identifié par homology avec 1 ' IFN- γ humain par criblage d'une librairie de phage λ de souris (Gray et al . , 1983) . Il code pour une protéine de 15-kDa, sécrétée exclusivement sous la forme d'un homodimère non covalent. Les cellules T (majorité des CD8 , CD4 ThO et Thl) et les macrophages sont la source principale d'IFN- γ. L'IFN-γ est souvent désigné comme une cytokine inflammatoire du fait de sa propriété d'activer les macrophages en augmentant l'expression de molécules de surface de classe II du MHC, et en induisant la libération de cytokine pro-inflammatoires (Farrar et al . , 1993) . Le gène codant pour 1 ' IFN-γ de souris a été localisé sur le chromosome 10. Il est organisé en 4 exons et 3 introns précédés par une région promoteur de 4 kb en 5' (Gray et al . , 1983). Un nouveau facteur de transcription appelé T-bet a été récemment identifié comme responsable de l'induction de la réponse Thl par l'intermédiaire de la production d'IFN-γ (Szabo et al . , 2000). Les souris homozygotes déficientes pour l'IFN-γ se développent normalement et sont en bonne santé en l'absence de pathogène. Elles présentent une susceptibilité augmentée aux infections microbactériennes dues à des fonctions altérées des macrophages (Dalton et al . , 1993). Les animaux hétérozygotes présentent un phénotype plus modéré . _A cDNA of 1292 bp coding for the mouse IFN-γ has been identified by homology with the human IFN-γ by screening a library of mouse phage λ (Gray et al., 1983). It codes for a 15-kDa protein, secreted exclusively in the form of a non-covalent homodimer. T cells (majority of CD8, CD4 ThO and Thl) and macrophages are the main source of IFN-γ. IFN-γ is often designated as an inflammatory cytokine because of its property of activating macrophages by increasing the expression of class II surface molecules of MHC, and by inducing the release of pro-inflammatory cytokines (Farrar and al., 1993). The gene coding for the mouse IFN-γ has been located on chromosome 10. It is organized into 4 exons and 3 introns preceded by a promoter region of 4 kb in 5 '(Gray et al., 1983). A new transcription factor called T-bet has recently been identified as responsible for the induction of the Th1 response through the production of IFN-γ (Szabo et al., 2000). Homozygous mice deficient in IFN-γ develop normally and are healthy in the absence of pathogens. They have a increased susceptibility to microbacterial infections due to impaired functions of macrophages (Dalton et al., 1993). Heterozygous animals exhibit a more moderate phenotype. _
1.2. Gênes rapporteurs1.2. Genoa Rapporteurs
Le marquage intracellulaire par des anticorps monoclonaux spécifiques est une méthode communément utilisée pour la détection des cytokines dans un typeIntracellular labeling with specific monoclonal antibodies is a commonly used method for the detection of cytokines in a type
• cellulaire donné. Cependant, les protocoles actuels nécessitent des procédures longues qui comprennent une étape de culture in vi tro accompagnée d'une restimulation, suivie de la fixation des cellules et de leur perméabilisation, et entraînent la mort cellulaire des cellules étudiées. En revanche, le suivi d'un marqueur fluorescent associé à la production de la cytokine ciblée permettrait l'identification quasi instantanée des cellules productrices avec un minimum de manipulation et l'isolation et la collecte de cellules productrices de façon viable (en utilisant le triage par cytométrie en flux par exemple) . • given cell. However, current protocols require lengthy procedures which include an in vitro culture step accompanied by restimulation, followed by cell fixation and permeabilization, and result in cell death of the cells studied. On the other hand, the follow-up of a fluorescent marker associated with the production of the targeted cytokine would allow the almost instantaneous identification of producer cells with a minimum of manipulation and the isolation and collection of producer cells in a viable manner (using triage by flow cytometry for example).
De nombreux mutants ont été dérivés de la forme native de la Green Fluorescent Protein (GFP) de la méduse Aeςruoria Victoria et sont commercialisés par différent fournisseurs. Les deux gènes rapporteurs seront choisis de façon à donner l'expression de protéines à forte intensité de fluorescence détectable par cytométrie en flux de façon simultanée à deux longueurs d'ondes distinctes. Le mutant donnant la plus forte intensité de fluorescence sera associé à l'IL-4 produite en quantité moindre par rapport à l'iFN-γ. L'expression des protéines autofluorescentes à partir des transgènes ne semble pas induire de toxicité significative ou une altération de la réponse immune. Les souris transgéniques de l'art antérieur exprimant la GFP ou un mutant de GFP semblent se développer normalement. Les protéines autofluorescentes selon l'invention sont majoritairement séquestrées à l'intérieur de la cellule.Many mutants have been derived from the native form of the Green Fluorescent Protein (GFP) of the jellyfish Aeςruoria Victoria and are marketed by different suppliers. The two reporter genes will be chosen so as to give the expression of proteins with high fluorescence intensity detectable by flow cytometry simultaneously at two distinct wavelengths. The mutant giving the highest fluorescence intensity will be associated with IL-4 produced in less quantity compared to iFN-γ. The expression of autofluorescent proteins from the transgenes does not seem to induce significant toxicity or an alteration in the immune response. Prior art transgenic mice expressing GFP or a GFP mutant appear to develop normally. The autofluorescent proteins according to the invention are mainly sequestered inside the cell.
De préférence, les gènes rapporteurs choisis sont laPreferably, the reporter genes chosen are the
GFP et la RFP. En effet, ce couple de permet une détection par la majorité des cytometres de flux disponibles dans le commerce. L'expression de la protéineGFP and RFP. Indeed, this pair of allows detection by the majority of commercially available flow cytometers. Protein expression
RFP est de préférence associée à la protéine 11-4 et celle de la GFP avec l'interféron γ.RFP is preferably associated with protein 11-4 and that of GFP with interferon γ.
1.3. Le vecteur de recombinaison homologue1.3. The homologous recombination vector
Un vecteur contenant le gène codant pour la protéine fluorescente choisie sera transfecté dans des cellules embryonnaires de souris choisies dans un fond génétique approprié afin que s'effectue une recombinaison homologue du vecteur dans le locus de la cytokine ciblée.A vector containing the gene coding for the chosen fluorescent protein will be transfected into selected mouse embryonic cells in an appropriate genetic background in order to carry out homologous recombination of the vector in the locus of the targeted cytokine.
Il a été démontré que le site d'entrée interne du ribosome (IRES pour Internai ribosome entry si te) du virus de l'encéphalite du myocarde (EMCV pour Encéphalomyocardi tis virus) permettait la transduction simultanée à partir d'un seul transcrit d'ARNm, de deux gènes rapporteurs placés sous le contrôle d'un même promoteur (Mountford et al . , 1995; Zhu et al . , 1999; Liu et al ;, 2000). Ce modèle a été utilisé récemment pour obtenir dans les cellules T activées de souris, une relation linéaire entre l'expression de l'IL-4 et celle du gène de la GFP introduit par infection rétrovirale (Costa et al . , 2000) . Dans le système proposé par les inventeurs, un vecteur contenant le gène rapporteur sous l'influence d'une séquence IRES sera introduit par knock- in à la suite ou dans le locus du gène de la cytokine ciblée. Afin de perturber au minimum les mécanismes naturels de la sécrétion des cytokines ciblées, les constructions IRES—gène rapporteur devront être introduit dans une portion du gène ne comportant pas de séquences régulatrices connues. Des marqueurs de sélection positive (tel que le gène de résistance à la néomycine) et négative (tel que DTA ou tk) seront également introduit dans le vecteur afin de sélectionner les cellules embryonnaires ayant effectuées la recombinaison homologue. Des séquences Lox seront ajoutées pour permettre l'excision des marqueurs de sélection par l'action de la Cre, ceci afin d'obtenir un animal transgénique dépourvu des gènes de sélections.The internal ribosome entry site (IRES for Internai ribosome entry si te) of the myocardial encephalitis virus (EMCV for Encephalomyocardi tis virus) has been shown to allow simultaneous transduction from a single transcript of MRNA, of two reporter genes placed under the control of the same promoter (Mountford et al., 1995; Zhu et al., 1999; Liu et al;, 2000). This model was recently used to obtain in activated T cells from mice a linear relationship between the expression of IL-4 and that of the GFP gene introduced by retroviral infection (Costa et al., 2000). In the system proposed by the inventors, a vector containing the reporter gene under the influence of an IRES sequence will be introduced by knock-in following or in the locus of the gene of the targeted cytokine. In order to minimize the natural mechanisms of secretion of targeted cytokines, the IRES-reporter gene constructs should be introduced into a portion of the gene that does not have known regulatory sequences. Positive selection markers (such as the neomycin resistance gene) and negative selection markers (such as DTA or tk) will also be introduced into the vector in order to select the embryonic cells which have carried out homologous recombination. Lox sequences will be added to allow excision of the selection markers by the action of Cre, in order to obtain a transgenic animal lacking the selection genes.
1.4. Souris transgéniques1.4. Transgenic mice
Des souris transgéniques exprimant l'un ou l'autre des gènes rapporteurs (l'un associé à l'IFN-γ, l'autre associé à l'IL-4) seront produites de façon indépendantes . Les homozygotes pour chaque type de transgénique seront ensuite croisés et la descendance sera testée afin de sélectionner les animaux exprimant les deux transgéniques.Transgenic mice expressing either of the reporter genes (one associated with IFN-γ, the other associated with IL-4) will be produced independently. The homozygotes for each type of transgenic will then be crossed and the progeny will be tested in order to select the animals expressing the two transgenics.
Le fond génétique des animaux transgéniques pourra également être changé par croisements successifs avec des animaux d'un autre fond génétique que celui utilisé initialement. REFERENCESThe genetic background of transgenic animals can also be changed by successive crosses with animals of a different genetic background than that used initially. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule animale transgénique non humaine exprimant au moins un transgène intégré de manière stable dans le génome de ladite cellule , et codant pour au moins une protéine rapporteuse caractérisée en ce que :1. Non-human transgenic animal cell expressing at least one transgene stably integrated into the genome of said cell, and coding for at least one reporter protein characterized in that:
-l'expression de ladite protéine rapporteuse est corrélée à l'expression d'au moins une protéine naturellement produite par ladite cellule et spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune,the expression of said reporter protein is correlated with the expression of at least one protein naturally produced by said cell and specific for a type of polarization of the immune response and / or of an effector function of the immune response,
- l'expression du dit transgène est contrôlée par les éléments de régulation du gène animal endogène codant pour la dite protéine naturellement produite et spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune .- The expression of said transgene is controlled by the regulatory elements of the endogenous animal gene coding for said naturally produced protein and specific for a type of polarization of the immune response and / or of an effector function of the immune response.
2. Cellule selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit transgène, ou son expression, n'affecte pas le réseau biologique de la dite cellule.2. Cell according to claim 1 characterized in that said transgene, or its expression, does not affect the biological network of said cell.
3. Cellule selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que à chaque type de polarisation de la réponse immune correspond une protéine rapporteuse distincte .3. Cell according to claims 1 and 2 characterized in that each type of polarization of the immune response corresponds to a separate reporter protein.
4. Cellule selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que à chaque type de fonction effectrice de la réponse immune corresponde une protéine rapporteuse distincte.4. Cell according to claims 1 and 2 characterized in that each type of effector function of the immune response corresponds to a separate reporter protein.
5. Cellule selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le type de polarisation de la réponse immune est choisi parmi le type T helper (T auxiliaire) , T répresseur, T cytotoxique, le type NK, le type K et le type humoral .5. Cell according to claims 1 to 4, characterized in that the type of polarization of the immune response is chosen from the helper T type (helper T), repressor T, cytotoxic T, NK type, K type and humoral type.
6. Cellule selon la revendications 5, caractérisée en ce que le type T helper est choisi parmi le type ThO , Thl, Th2, Th3, Tri.6. Cell according to claims 5, characterized in that the type T helper is chosen from the type ThO, Thl, Th2, Th3, Tri.
7. Cellule selon la revendications 6, caractérisée en ce que le type T helper est choisi parmi le type Thl et Th2.7. Cell according to claims 6, characterized in that the type T helper is chosen from the type Th1 and Th2.
8. Cellule selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cellule exprime deux transgènes codant chacun pour une protéine rapporteuse distincte, l'expression de chaque protéine rapporteuse étant spécifique du type Thl ou Th2 de polarisation de la réponse immune .8. Cell according to claim 7, characterized in that said cell expresses two transgenes each coding for a distinct reporter protein, the expression of each reporter protein being specific for the Th1 or Th2 type of polarization of the immune response.
9. Cellule selon les revendications 1, 2 et 4, caractérisée en ce que le type de fonction effectrice de la réponse immune est choisi parmi les activités ou fonctions CTL, les activités ou fonctions phagocytaires, les activités ou fonctions cytotoxiques, les activités ou fonctions immunosuppressives, les activités ou fonctions de présentation d'antigènes, les fonction d'activation cellulaire.9. Cell according to claims 1, 2 and 4, characterized in that the type of effector function of the immune response is chosen from CTL activities or functions, phagocytic activities or functions, cytotoxic activities or functions, activities or functions immunosuppressive, activities or functions of presentation of antigens, cell activation functions.
10. Cellule selon les revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'intégration dudit transgène est réalisée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau dudit gène animal endogène codant pour ladite protéine spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune, sans invalider l'expression dudit gène animal endogène .10. Cell according to claims 1 to 9, characterized in that the integration of said transgene is carried out by homologous recombination ("Knock-In") at the level of said endogenous animal gene coding for said specific protein of a type of polarization of the immune response and / or an effector function of the immune response, without invalidating the expression of said endogenous animal gene.
11. Cellule selon la revendication 10, caractérisée en ce ç[ue l'intégration dudit transgène est réalisée en amont, en aval ou au milieu du gène codant pour ladite protéine spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune .11. Cell according to claim 10, characterized in that the integration of said transgene is carried out upstream, downstream or in the middle of the gene coding for said specific protein of a type of polarization of the immune response and / or d an effector function of the immune response.
12. Cellule selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit transgène comprend une séquence de reprise de la traduction, ladite séquence étant située entre la séquence codante de ladite protéine rapporteuse et de la séquence codante de ladite protéine spécifique d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune.12. Cell according to claim 11, characterized in that said transgene comprises a sequence for resumption of translation, said sequence being located between the coding sequence of said reporter protein and the coding sequence of said protein specific for a type of polarization of the immune response and / or an effector function of the immune response.
13. Cellule selon les revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'intégration dudit transgène est réalisée de manière aléatoire sans que ladite intégration n'affecte le réseau biologique de l'animal ni n'invalide l'expression desdits gènes codant pour les protéines spécifiques d'un type de polarisation de la réponse immune, ou d'un type de fonction effectrice.13. Cell according to claims 1 to 9, characterized in that the integration of said transgene is carried out randomly without said integration affecting the biological network of the animal or invalidating the expression of said genes coding for proteins specific to a type of polarization of the immune response, or to a type of effector function.
14. Cellule animale transgénique non-humaine caractérisée en ce qu'elle exprime : a) un premier transgène codant pour une première protéine rapporteuse, ledit premier transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène animal endogène codant pour une protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit premier transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène animal endogène ; et/ou b) un second transgène codant pour une deuxième protéine rapporteuse, distincte de ladite première protéine rapporteuse, ledit second transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique du type Th2 de polarisation de la réponse immune, sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit second transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène animal endogène.14. Non-human transgenic animal cell characterized in that it expresses: a) a first transgene coding for a first reporter protein, said first transgene being integrated by homologous recombination ("Knock-In") at the level of an animal gene endogenous coding for a specific protein of the Thl type for polarizing the immune response without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said first transgene being correlated with the expression of said endogenous animal gene; and / or b) a second transgene coding for a second reporter protein, distinct from said first reporter protein, said second transgene being integrated by homologous recombination ("Knock-In") at the level of an endogenous gene coding for a protein specific for Th2 type of polarization of the immune response, without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said second transgene being correlated with the expression of said endogenous animal gene.
15. Cellule selon les revendications 1 à 14 caractérisé en ce que ladite protéine rapporteuse est sélectionnée dans le groupe composé des protéines autofluorescentes et des enzymes détectables par un procédé histochimique.15. Cell according to claims 1 to 14 characterized in that said reporter protein is selected from the group consisting of autofluorescent proteins and enzymes detectable by a histochemical process.
16. Cellule selon la revendications 15 caractérisé en ce que ladite protéine autofluorescente est choisie dans le groupe composé de la protéine de fluorescence verte (GFP) , la protéine de fluorescence verte augmentée (EGFP) , la protéine de fluorescence rouge (RFP) , la protéine de fluorescence bleue (BFP) , la protéine de fluorescence jaune (YFP) , et les variants fluorescents de ces protéines.16. Cell according to claim 15 characterized in that said autofluorescent protein is chosen from the group composed of green fluorescence protein (GFP), augmented green fluorescence protein (EGFP), red fluorescence protein (RFP), blue fluorescence protein (BFP), yellow fluorescence protein (YFP), and fluorescent variants of these proteins.
17. Cellule selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite enzyme est choisie dans le groupe composé de la β-galactosidase, de la β-glucoronidase, de la phosphatase alcaline, de la déshydrogénase alcoolique, de la luciférase, de la chloramphénicol-acétyl- transférase, de l'hormone de croissance. 17. Cell according to claim 15, characterized in that said enzyme is chosen from the group composed of β-galactosidase, β-glucoronidase, alkaline phosphatase, alcoholic dehydrogenase, luciferase, chloramphenicol- acetyl transferase, growth hormone.
18. Cellule selon les revendications 1 à 17, caractérisée en ce que ladite protéine spécifique de la polarisation de type Thl est choisie dans le groupe composé de 1 ' interleukine 2 (IL-2) , l' interleukine 12 (IL-12)-, 1 ' interleukine 18 (IL-18) , l' interféron-γ, le TNF-β, le TNF-α, T-bet, STAT-4, la chaîne β du récepteur de l'interféron γ (IFN-γ) , les chaînes du récepteur à l'IL-12 et à l'IL-18, RANTES, MlP-lα, MlP-lβ, CD26, la chaîne β2 du récepteur de 1 ' interleukine 12 (IL-12Rβ2) CCR5, CCR2, CXCR3.18. Cell according to claims 1 to 17, characterized in that said specific protein of Thl type polarization is chosen from the group composed of 1 interleukin 2 (IL-2), interleukin 12 (IL-12) - , Interleukin 18 (IL-18), interferon-γ, TNF-β, TNF-α, T-bet, STAT-4, the β chain of the interferon γ receptor (IFN-γ) , the IL-12 and IL-18 receptor chains, RANTES, MlP-1α, MlP-1β, CD26, the β2 chain of the interleukin 12 receptor (IL-12Rβ2) CCR5, CCR2, CXCR3.
19. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce que la protéine spécifique de la polarisation de type Thl est l'IFN-γ.19. Cell according to claim 18, characterized in that the specific protein of the Thl type polarization is IFN-γ.
20. Cellule selon la revendication 19, caractérisée en ce que ladite protéine spécifique de la polarisation de type Thl est l'IFN-γ et la protéine rapporteuse est la GFP.20. Cell according to claim 19, characterized in that said specific protein of the Thl type polarization is IFN-γ and the reporter protein is GFP.
21. Cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que ladite protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est choisie dans le groupe composé de 1 ' interleukine 3 (IL- 3), 1 ' interleukine 4 (IL-4) , 1 ' interleukine 5 (IL-5) , l' interleukine 10 (IL-10) , l' interleukine 13 (IL-13) , GATA-3, STAT-6, c-maf, NFAT, NIP45, CD30, CD26L, ST2L, CCR3, CCR4, CCR8, CXCR4 , CRTH2 , STIF.21. Cell according to any one of claims 1 to 17, characterized in that said specific polarization protein of the Th2 type is chosen from the group composed of 1 interleukin 3 (IL-3), 1 'interleukin 4 (IL -4), 1 interleukin 5 (IL-5), interleukin 10 (IL-10), interleukin 13 (IL-13), GATA-3, STAT-6, c-maf, NFAT, NIP45, CD30, CD26L, ST2L, CCR3, CCR4, CCR8, CXCR4, CRTH2, STIF.
22. Cellule selon la revendication 21, caractérisée en ce que ladite protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l' interleukine 4 (IL-4) . 22. Cell according to claim 21, characterized in that said specific protein of the Th2 type polarization is interleukin 4 (IL-4).
23. Cellule selon la revendication 22, caractérisée en ce que ladite protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l'IL-4 et la protéine rapporteuse est la RFP. _23. Cell according to claim 22, characterized in that said specific protein of the Th2 type polarization is IL-4 and the reporter protein is RFP. _
24. Cellule selon l'une des revendications 1 à 23 choisie dans le groupe composé des cellules de souris, de rat, de hamster, de cobaye, de lapin, de primates, des ovins, des caprins, des porcins, des bovins, du cheval.24. Cell according to one of claims 1 to 23 chosen from the group composed of mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, primate, sheep, goat, pig, bovine, horse.
25. Cellule de souris selon la revendication 24.25. Mouse cell according to claim 24.
26. Cellule selon les revendications 1 à 25, caractérisée en ce que ladite cellule est choisie parmi les cellules du système immunitaire, les cellules neuronales, les cellules souches embryonnaires, les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches neuronales .26. Cell according to claims 1 to 25, characterized in that said cell is chosen from cells of the immune system, neuronal cells, embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, neuronal stem cells.
27. Cellule selon la revendication 26, caractérisée en ce que ladite cellule du système immunitaire est choisie parmi les lymphocytes T, les cellules NK, les cellules K, les lymphocytes B, les mastocytes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les plaquettes, les monocytes des cellules dendritiques, les cellules de Langerhans .27. Cell according to claim 26, characterized in that said cell of the immune system is chosen from T lymphocytes, NK cells, K cells, B lymphocytes, mast cells, macrophages, monocytes, neutrophils, eosinophils , basophils, platelets, monocytes of dendritic cells, Langerhans cells.
28. Cellule souche selon la revendication 26, caractérisée en ce que ladite cellule souche est subséquemment différenciée en une cellule choisie parmi les cellules du système immunitaire selon la revendication 27 et les cellules neuronales. 28. Stem cell according to claim 26, characterized in that said stem cell is subsequently differentiated into a cell chosen from cells of the immune system according to claim 27 and neuronal cells.
29. Animal transgénique, non-humain, comprenant au moins une cellule selon les revendications 1 à 28.29. Transgenic animal, non-human, comprising at least one cell according to claims 1 to 28.
30. Animal selon la revendication 29, caractérisé en ce _qu'il est choisi dans le groupe composé de la souris, du rat, du hamster, du cobaye, des lagomorphes, des primates, des ovins, des caprins, des porcins, des bovins, des équidés.30. Animal according to claim 29, characterized in that it is chosen from the group consisting of mice, rats, hamsters, guinea pigs, lagomorphs, primates, sheep, goats, pigs, cattle , equines.
31. Animal selon la revendication 30, caractérisé en ce que l'animal est une souris.31. Animal according to claim 30, characterized in that the animal is a mouse.
32. Animal transgénique non-humain selon la revendication 31 caractérisée en ce qu'il comprend au moins une cellule exprimant : a) un premier transgène codant pour une première protéine rapporteuse, ledit premier transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit premier transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène animal endogène ; et b) un second transgène codant pour une deuxième protéine rapporteuse, distincte de ladite première protéine rapporteuse, ledit second transgène étant intégré par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'un gène endogène codant pour une protéine spécifique du type Th2 de polarisation de la réponse immune, sans invalider l'expression dudit gène endogène, l'expression dudit second transgène étant corrélée avec l'expression dudit gène endogène. 32. A non-human transgenic animal according to claim 31 characterized in that it comprises at least one cell expressing: a) a first transgene coding for a first reporter protein, said first transgene being integrated by homologous recombination (“Knock-In”) ) at the level of an endogenous gene coding for a specific protein of the Th1 type of polarization of the immune response without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said first transgene being correlated with the expression of said endogenous animal gene; and b) a second transgene coding for a second reporter protein, distinct from said first reporter protein, said second transgene being integrated by homologous recombination ("Knock-In") at the level of an endogenous gene coding for a specific protein of the Th2 type. polarizing the immune response, without invalidating the expression of said endogenous gene, the expression of said second transgene being correlated with the expression of said endogenous gene.
33. Animal transgénique non-humain selon la revendication 32 caractérisée en ce que la dite protéine spécifique du type Thl de polarisation de la réponse immune est l'IFN-γ et la dite protéine spécifique de la polarisation de type Th2 est l' interleukine 4 (IL-4) .33. A non-human transgenic animal according to claim 32 characterized in that said specific protein of the Thl type of polarization of the immune response is IFN-γ and said said specific protein of the Th2 type of polarization is interleukin 4 (IL-4).
34. Animal transgénique non-humain selon la revendication 33 caractérisée en ce que le dit premier transgène code pour la protéine rapporteuse GFP et en ce que le dit second transgène code pour la protéine rapporteuse RFP.34. A non-human transgenic animal according to claim 33 characterized in that said first transgene codes for the reporter protein GFP and in that said second transgene codes for the reporter protein RFP.
35. Procédé in vi tro pour caractériser le type de polarisation de la réponse immune induite par un immunogene, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact dudit immunogene avec une cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 28 ; b) détermination si une expression ou des expressions de transgène (s) codant pour au moins une protéine rapporteuse dont l'expression est associée à un type de polarisation de la réponse immune se produit (respectivement « se produisent ») ; c) facultativement, évaluation quantitative de l'expression du ou des protéine (s) rapporteuse (s) ; d) caracterisation qualitative, facultativement quantitative, du ou des type (s) de polarisation de la réponse immune .35. In vitro method for characterizing the type of polarization of the immune response induced by an immunogen, characterized in that it comprises the steps of: a) bringing said immunogen into contact with a cell according to any one of claims 1 at 28; b) determining whether an expression or expressions of transgene (s) coding for at least one reporter protein whose expression is associated with a type of polarization of the immune response occurs (respectively "occur"); c) optionally, quantitative evaluation of the expression of the reporter protein (s); d) qualitative characterization, optionally quantitative, of the type (s) of polarization of the immune response.
36. Procédé in vivo pour caractériser le type de réponse immune induite par un immunogene, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact dudit immunogene avec un animal selon l'une quelconque des revendications 29 à 34 ; b) détermination si une expression ou des expressions de transgène (s) codant pour au moins une protéine rapporteuse dont l'expression est associée à un type de réponse immune se produit (respectivement « se produisent ») dans au moins une cellule dudit animal ; c) facultativement, évaluation quantitative de l'expression du ou des protéine (s) rapporteuse (s) ; d) caracterisation qualitative, facultativement quantitative, du ou des types de polarisation de la réponse immune.36. An in vivo method for characterizing the type of immune response induced by an immunogen, characterized in that it comprises the steps of: a) bringing said immunogen into contact with an animal according to any one of claims 29 to 34; b) determining whether an expression or expressions of transgene (s) coding for at least one reporter protein whose expression is associated with a type of immune response occurs (respectively "occur") in at least one cell of said animal; c) optionally, quantitative evaluation of the expression of the reporter protein (s); d) qualitative characterization, optionally quantitative, of the type or types of polarization of the immune response.
37. Procédé d'obtention de cellules animales non humaines spécifiques d'un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact d'un immunogene ou d'un agent pathogène induisant la mise en place une réponse immune /ou d'une fonction effectrice de la réponse immune avec une cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 28 ; b) détermination si une expression du transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse, dont l'expression est associée au dit type de polarisation de la réponse immune et/ou au dit type de fonction effectrice de la réponse immune, se produit ; c) identification des cellules exprimant ladite' protéine rapporteuse.37. Method for obtaining non-human animal cells specific for a type of polarization of the immune response and / or for an effector function of the immune response, characterized in that it comprises the steps of: a) contact of an immunogen or of a pathogenic agent inducing the establishment of an immune response / or of an effector function of the immune response with a cell according to any one of claims 1 to 28; b) determining whether expression of the transgene encoding at least one reporter protein, the expression of which is associated with said type of polarization of the immune response and / or with said type of effector function of the immune response, occurs; c) identification of cells expressing said 'reporter protein.
38. Procédé d'obtention de cellules animales non humaines spécifiques d'un type de réponse immune et/ou d'une fonction effectrice de la réponse immune, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact d'un immunogene ou d'un agent pathogène induisant la mise en place d'une réponse immune ou d'une fonction effectrice de la réponse immune avec un animal selon l'une quelconque des revendications 29 à 34 ; b) détermination si une expression du transgène codant pour au moins une protéine rapporteuse associée audit type de réponse immune et/ou à une fonction effectrice de la réponse immune se produit dans au moins une cellule dudit animal ; c) isolement de tout ou partie des cellules de 1 ' animal ; d) identification parmi les cellules du dit l'animal des cellules exprimant ladite protéine rapporteuse.38. Process for obtaining non-human animal cells specific for a type of immune response and / or an effector function of the immune response, characterized in that it comprises the steps of: a) contacting an immunogen or a pathogenic agent inducing the establishment of an immune response or an effector function of the immune response with an animal according to any one of claims 29 to 34; b) determining whether an expression of the transgene encoding at least one reporter protein associated with said type of immune response and / or with an effector function of the immune response occurs in at least one cell of said animal; c) isolation of all or part of the cells of the animal; d) identification among cells of said animal of cells expressing said reporter protein.
39. Procédé selon les revendications 37 et 38 caractérisée en ce que ledit immunogene spécifique d'un type de réponse immune est caractérisé par un procédé selon les revendications 35 ou 36.39. Method according to claims 37 and 38 characterized in that said specific immunogen of a type of immune response is characterized by a method according to claims 35 or 36.
40. Procédé selon les revendications 37 à 39 caractérisé en ce que les cellules sont identifiées ou caractérisées par cytométrie de flux.40. Method according to claims 37 to 39 characterized in that the cells are identified or characterized by flow cytometry.
41. Procédé de criblage de composés modulant au moins un type de polarisation de la réponse immune et/ou au moins une fonction effectrice de la réponse immune caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact d'une cellule selon les revendications 1 à 28 et/ou d'un animal selon l'une des revendications 29 à 34 avec un immunogene responsable du déclenchement d'une réponse immune et/ou d'une fonction effectrice, et de manière simultanée ou décalée dans le temps avec ledit composé ; b) la mise en contact d'une cellule selon les revendications 1 à 28 et/ou un animal selon l'une des revendications 29 à 34 avec ledit immunogene de l'étape a) ; c) la détermination qualitative, facultativement quantitative, de l'expression d'au moins un transgène codant pour une protéine rapporteuse dont l'expression est corrélée à un type spécifique de polarisation et/ou d'une fonction effectrice puis comparaison desdites expressions déclenchées en a) et b) ; puis d) l'identification du composé qui module sélectivement la réponse immune et/ou d'une fonction effectrice.41. A method of screening for compounds modulating at least one type of polarization of the immune response and / or at least one effector function of the immune response characterized in that it comprises the steps of: a) bringing a cell into contact according to claims 1 to 28 and / or an animal according to one of claims 29 to 34 with an immunogen responsible for triggering an immune response and / or a function effector, and simultaneously or offset in time with said compound; b) bringing a cell according to claims 1 to 28 and / or an animal according to one of claims 29 to 34 into contact with said immunogen from step a); c) the qualitative determination, optionally quantitative, of the expression of at least one transgene coding for a reporter protein, the expression of which is correlated with a specific type of polarization and / or of an effector function, then comparison of said expressions triggered by a) and b); then d) identifying the compound which selectively modulates the immune response and / or an effector function.
42. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que la dite polarisation de la réponse immune est de type Thl .42. Method according to claim 41 characterized in that said polarization of the immune response is of the Thl type.
43. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que la dite polarisation de la réponse immune est de type Th2.43. Method according to claim 41 characterized in that said polarization of the immune response is of the Th2 type.
44. Utilisation d'une cellule selon les revendications 1 à 28 ou d'un animal selon les revendications 29 à 34 pour l'analyse et l'étude des mécanismes moléculaires, biologiques, biochimiques, physiologiques et/ou physiopathologiques d'au moins un type de polarisation de la réponse immune et/ou d'un type de fonction effectrice de la réponse immune.44. Use of a cell according to claims 1 to 28 or an animal according to claims 29 to 34 for the analysis and study of the molecular, biological, biochemical, physiological and / or physiopathological mechanisms of at least one type of polarization of the immune response and / or a type of effector function of the immune response.
45. Transgène comprenant tout ou partie du gène de l'IL-4 murin caractérisé en ce que dans l'extrémité 3' non codante du gène de l'IL-4 murin sont insérées séquentiellement une séquence IRES, une séquence codant pour une protéine autofluorescente, une cassette de sélection positive encadrée ou non de sites-spécifiques à l'action des recombinases, et caractérisé en ce que une cassette de sélection négative DTA et/ou TK est présente à au moins une des extrémités du transgène.45. Transgene comprising all or part of the murine IL-4 gene characterized in that in the 3 'end non-coding for the murine IL-4 gene are sequentially inserted an IRES sequence, a sequence coding for an autofluorescent protein, a positive selection cassette framed or not with sites-specific to the action of recombinases, and characterized in that a DTA and / or TK negative selection cassette is present at at least one of the ends of the transgene.
46. Transgène comprenant tout ou partie du gène murin de l'IFN-γ, caractérisé en ce que dans l'extrémité 3' non codante du gène murin de l'IFN-γ sont insérées séquentiellement une séquence IRES, une séquence codant pour une protéine autofluorescente, une cassette de sélection encadrée ou non de sites-spécifiques à l'action des recombinases, et caractérisé en ce que une cassette de sélection négative DTA et/ou TK est présente à au moins une des extrémités du transgène. 46. Transgene comprising all or part of the murine IFN-γ gene, characterized in that in the non-coding 3 ′ end of the murine IFN-γ gene are inserted sequentially an IRES sequence, a sequence coding for a autofluorescent protein, a selection cassette framed or not by sites-specific to the action of recombinases, and characterized in that a negative selection cassette DTA and / or TK is present at at least one of the ends of the transgene.
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