JP5186637B2 - Transgenic non-human mammal and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。詳しくは、本発明は、（１）インターロイキン−５遺伝子の発現に伴って発現するレポーター遺伝子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。さらに本発明は、（２）該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を製造するための胚性幹細胞、（３）該胚性幹細胞および該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を製造する方法、（４）該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いたスクリーニング方法、ならびに（５）該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた検査方法に関する。 The present invention relates to a transgenic non-human mammal. Specifically, the present invention relates to (1) a transgenic non-human mammal containing a reporter gene that is expressed along with the expression of interleukin-5 gene. The present invention further includes (2) an embryonic stem cell for producing the transgenic non-human mammal, (3) a method for producing the embryonic stem cell and the transgenic non-human mammal, and (4) the transgenic The present invention relates to a screening method using a non-human mammal, and (5) an inspection method using the transgenic non-human mammal.
体内の免疫システムは様々な因子によって緻密に制御されている。この免疫系を制御する因子の一つにサイトカインと呼ばれる液性因子が存在する。これまでにヒト・マウスにおいてサイトカインは３０種類以上同定されているが、これらのうち特定の１種類のサイトカインの発現が制御不能になるだけで免疫機構が破綻しアレルギー性疾患などに陥る（非特許文献１を参照）。このアレルギー性疾患に関与するサイトカインはＴ細胞の一種であるＴｈ２細胞から産生されＴｈ２サイトカインと呼ばれる。Ｔｈ２サイトカインには、インターロイキン−（ＩＬ−）４、５、１３が含まれる。 The body's immune system is closely controlled by various factors. One of the factors that control this immune system is a humoral factor called cytokine. So far, more than 30 types of cytokines have been identified in humans and mice, but if the expression of one specific type of cytokines becomes uncontrollable, the immune system is broken and falls into allergic diseases. Reference 1). Cytokines involved in this allergic disease are produced from Th2 cells, which are a kind of T cells, and are called Th2 cytokines. Th2 cytokines include interleukin- (IL-) 4,5,13.
ＩＬ−５は主に抗原感作されたＴｈ２細胞、活性化されたマスト細胞および好酸球から産生される二量体の糖タンパク質である。ＩＬ−５の生物学的効果として顕著なものは、好酸球への影響である。ＩＬ−５は、好酸球の分化や生存に深く関わっている。また、ＩＬ−５は、寄生虫感染の防御に重要な役割を担っていると考えられている。 IL-5 is a dimeric glycoprotein produced mainly from antigen-sensitized Th2 cells, activated mast cells and eosinophils. A significant biological effect of IL-5 is its effect on eosinophils. IL-5 is deeply involved in eosinophil differentiation and survival. IL-5 is also thought to play an important role in the protection of parasitic infections.
ＩＬ−５は、アレルギー性炎症反応に呼応する骨髄での好酸球前駆体の終末分化を促進させ、成熟好酸球の末梢血液への移行に大きく寄与する。その後の炎症反応部位への好酸球浸潤の細胞接着の過程にもＩＬ−５の関与が認められる。そこで、ヒトにおいてＩＬ−５を標的とした喘息治療が試みられている。 IL-5 promotes terminal differentiation of eosinophil precursors in the bone marrow that responds to an allergic inflammatory reaction and greatly contributes to the migration of mature eosinophils to peripheral blood. IL-5 is also involved in the subsequent cell adhesion process of eosinophil infiltration to the inflammatory reaction site. Therefore, asthma treatment targeting IL-5 has been attempted in humans.
ＩＬ−５を中和する抗ＩＬ−５抗体を哺乳動物へ投与すると、末梢血液中の好酸球の顕著な減少が観察されるが、肺組織中の好酸球は存続し疾患の改善は観察されない。しかしながら、難治性喘息、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎などの疾患においては、抗ＩＬ−５抗体を投与することにより、疾患の改善や喘息死の防止などが観察されている。これらの観察結果からわかるとおり、ＩＬ−５の疾患に対する作用機序は極めて複雑であり、未だ正確には解明されていない。 When anti-IL-5 antibodies that neutralize IL-5 are administered to mammals, a marked decrease in eosinophils in peripheral blood is observed, but eosinophils in lung tissue persist and disease improvement Not observed. However, in diseases such as intractable asthma, hypereosinophilic syndrome, and eosinophilic esophagitis, improvement of the disease and prevention of asthma death have been observed by administering anti-IL-5 antibody. . As can be seen from these observations, the mechanism of action of IL-5 on diseases is extremely complex and has not yet been clarified accurately.
ＩＬ−５の詳細な生理的作用の解明は、アレルギー性疾患の原因究明や治療の進歩に寄与し得る。そこで、アレルギー反応の機構を解明することを目的として、生体内におけるＩＬ−５の産生機序を分析することがこれまでに試みられている。 The elucidation of the detailed physiological action of IL-5 can contribute to the investigation of the cause of allergic diseases and the progress of treatment. Thus, in order to elucidate the mechanism of allergic reaction, attempts have been made so far to analyze the production mechanism of IL-5 in vivo.
ＩＬ−５などのＴｈ２サイトカインの細胞内産生量を検出する試験管内の培養と検出からなるＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系はすでに確立されており、様々な文献に記載されている（たとえば、非特許文献２を参照）。このようなＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系では、最初に細胞をタンパク質輸送阻害剤であるモネンシンやブレフェルジンＡで処理し、次いで細胞をホルムアルデヒドで固定し、次いで界面活性剤で細胞膜を可溶化し、最後に特異的な抗体で細胞内のサイトカインを検出することにより実施される。 In vitro assay systems comprising in vitro culture and detection for detecting intracellular production of Th2 cytokines such as IL-5 have already been established and described in various literatures (for example, Non-Patent Document 2 reference). In such an in vitro assay system, cells are first treated with the protein transport inhibitors monensin or brefeldin A, then cells are fixed with formaldehyde, then the cell membrane is solubilized with detergent, and finally specific. This method is carried out by detecting intracellular cytokines using various antibodies.
生物体を用いるＩｎ ｖｉｖｏアッセイ系としては、ＩＬ−５の生体内の挙動を調べることを目的とした、ＩＬ−５遺伝子を欠損させたＩＬ−５ノックアウトマウスを用いたアッセイ系が知られている（非特許文献３を参照）。 As an in vivo assay system using an organism, an assay system using an IL-5 knockout mouse deficient in the IL-5 gene for the purpose of examining the in vivo behavior of IL-5 is known. (See Non-Patent Document 3).
一方、上記したＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系やＩｎ ｖｉｖｏアッセイ系などを利用して、被験物質を細胞やマウスに投与し、次いでサイトカインの発現に影響を与える物質を選択（スクリーニング）する試みがある。たとえば、Ｔ細胞のサイトカイン産生を抑制する分子としてサイクロスポリンやタクロリムスなどの化合物がこれまでに得られている。これらの化合物は、すでに臨床化されており、世界中で使用されている。 On the other hand, there is an attempt to administer a test substance to cells or mice using the above-described in vitro assay system or in vivo assay system, and then select (screen) a substance that affects cytokine expression. For example, compounds such as cyclosporine and tacrolimus have been obtained so far as molecules that suppress cytokine production of T cells. These compounds have already been clinically used and are used worldwide.
上記Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系を利用すれば、ＩＬ−５の細胞内産生量を分析することができる。しかし、このＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系は、細胞を処理した後に、抗体を使用して細胞内のＩＬ−５を検出することから、細胞を処理するための複数の工程を要し、および抗体を使用するために経済的にも不利である。さらに、このＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系では、同じ細胞を使って経時的にＩＬ−５の発現を検出することができないという問題がある。 If the above in vitro assay system is used, the intracellular production amount of IL-5 can be analyzed. However, since this in vitro assay system uses cells to detect IL-5 in cells after processing the cells, it requires multiple steps to process the cells and uses the antibodies. Therefore, it is economically disadvantageous. Furthermore, in this in vitro assay system, there is a problem that the expression of IL-5 cannot be detected over time using the same cells.
上記Ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系として、ＩＬ−５遺伝子を欠損させたＩＬ−５ノックアウトマウスを利用すれば、ＩＬ−５による生体内の影響を調べることができる。しかし、ＩＬ−５ノックアウトマウスを用いたＩｎ ｖｉｖｏアッセイ系では、被験物質を投与した場合のＩＬ−５産生量の変化を調べることはできない。このような変化は、野生型マウスを用いた細胞内染色法により調べることができる。しかし、細胞内染色法は、検出感度が低く、抗体を使用するために経済性が非常に悪く、さらにＩＬ−５産生量をリアルタイムで解析することができず、生体内から細胞を取得し、該細胞を染色するまでに数時間程度を要する。 If an IL-5 knockout mouse deficient in the IL-5 gene is used as the above in vivo assay system, the in vivo effects of IL-5 can be examined. However, in an in vivo assay system using IL-5 knockout mice, changes in IL-5 production when a test substance is administered cannot be examined. Such changes can be examined by intracellular staining using wild-type mice. However, the intracellular staining method has low detection sensitivity and is very economical because of the use of an antibody. Furthermore, IL-5 production cannot be analyzed in real time, and cells are obtained from the living body. It takes about several hours to stain the cells.
一方、一部のサイトカイン産生を抑制する化合物が、臨床に用いられている。しかし、これらの化合物は、いずれも副作用を奏し、すべての患者に利用できない。一般的に、臨床可能な医薬を探求する創薬化学においては、疾患の種類や程度に幅広く対応するために、多数の候補分子のスクリーニングが要求される。 On the other hand, some compounds that suppress cytokine production are used clinically. However, all of these compounds have side effects and are not available to all patients. In general, in drug discovery chemistry to search for a clinically measurable drug, screening of a large number of candidate molecules is required in order to deal with a wide variety of disease types and degrees.
これらの従来技術の問題点から、細胞を処理するための工程や抗体を使用する工程を設けずに、細胞内ＩＬ−５量の経時的変化を調べるための、または細胞内ＩＬ−５産生量に影響を与える物質をスクリーニングするためのアッセイ系が求められている。しかし、このようなアッセイ系を可能とする試験材料はこれまでに知られていない。 From the problems of these prior arts, the amount of intracellular IL-5 produced is examined for examining the change over time in the amount of intracellular IL-5 without providing a step for treating cells or a step for using antibodies. There is a need for an assay system for screening for substances that affect aging. However, no test material that allows such an assay system has been known to date.
そこで、本発明は、細胞を処理するための工程や抗体を使用する工程を設けずに、細胞内ＩＬ−５量の経時的変化の調査や細胞内ＩＬ−５産生量に影響を与える物質のスクリーニングを可能とする試験材料やこの試験材料の製造方法を提供することを発明が解決しようとする課題とした。さらに、上記該試験材料を利用して、細胞を処理するための工程や抗体を使用する工程を設けずに、細胞内ＩＬ−５産生量に影響を与える物質をスクリーニングする方法および好酸球増加を伴う疾患を発症させる物質を検査する方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。 Therefore, the present invention does not provide a process for treating cells or a process using an antibody, and investigates changes over time in the amount of intracellular IL-5 and a substance that affects the amount of intracellular IL-5 production. An object of the present invention is to provide a test material that enables screening and a method for producing the test material. Furthermore, by using the test material, a method for screening a substance that affects the amount of intracellular IL-5 production and eosinophil increase without providing a step for treating cells or a step for using antibodies An object of the present invention is to provide a method for examining a substance that develops a disease accompanied by a disease.
本発明者らは、まず、上記試験材料として、ＩＬ−５遺伝子座にＩＬ−５遺伝子の発現の指標となるレポーター遺伝子を組み込んだノックインマウスを作製することを試みた。特に、レポーター遺伝子として自家的に蛍光発光するＧＦＰやＶｅｎｕｓなどの蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用いれば、これらの蛍光タンパク質をＦＡＣＳなどの装置を用いて検出することにより、細胞を処理するための工程や抗体の使用を必要とせずに、細胞内ＩＬ−５量の経時的変化の調査や細胞内ＩＬ−５産生量に影響を与える物質のスクリーニングを実施できるのではないかと本発明者らは考えた。特に蛍光発光は高感度で検出することができるので、ＩＬ−５遺伝子座に蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだＩＬ−５／蛍光タンパク質ノックインマウスを作製できれば、ＩＬ−５の発現への影響がごく微量な物質さえもスクリーニングすることが期待できる。一般的に、医薬は、薬理効果が大きいほど副作用が大きくなる傾向にある。そこで、薬理効果が小さくても、副作用が小さい医薬は、たとえば、幼児や老齢者などに、または比較的軽度のアレルギー性疾患の罹患者の治療に資することが期待できる。したがって、広い範囲のＩＬ−５の発現に影響を与える物質をスクリーニングできれば、投与対象者や用途によって分類された医薬の開発が期待できると本発明者らは考えた。 The present inventors first tried to produce a knock-in mouse in which a reporter gene serving as an indicator of IL-5 gene expression was incorporated into the IL-5 locus as the test material. In particular, if a gene encoding a fluorescent protein such as GFP or Venus that emits fluorescence by itself is used as a reporter gene, a process for treating cells by detecting these fluorescent proteins using a device such as FACS The present inventors consider that it is possible to investigate changes in intracellular IL-5 amount over time and screen for substances that affect the amount of intracellular IL-5 production without requiring the use of antibodies or antibodies. It was. In particular, since fluorescence emission can be detected with high sensitivity, if an IL-5 / fluorescent protein knock-in mouse in which a fluorescent protein gene is incorporated into the IL-5 locus can be prepared, the influence on the expression of IL-5 is negligible. Even substances can be expected to be screened. In general, medicines tend to have more side effects as the pharmacological effect is greater. Therefore, a medicine with small side effects even with a small pharmacological effect can be expected to contribute to the treatment of, for example, infants and the elderly, or patients with relatively mild allergic diseases. Therefore, the present inventors considered that if a substance that affects the expression of IL-5 in a wide range can be screened, development of a medicine classified according to the administration subject and application can be expected.
そこで、本発明者らは、蛍光タンパク質としてＶｅｎｕｓを選択し、ＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスを作製することを試みた。通常のノックインマウスの作製方法（たとえば、特許第４２１９６１７号公報を参照）では、２００〜８００のコンストラクト導入ＥＳクローンを用いて２〜６％程度の相同組換え率により４〜５０個のノックインＥＳクローンが得られる。しかし、本発明者らが試したＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスの作製に際しては、通常のエレクトロポレーション法の条件下でコンストラクトをＥＳ細胞内に導入して約１，０００クローンを得たが、コンストラクトのＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓ遺伝子がＥＳ細胞内のＩＬ−５遺伝子座に組み込まれたＩＬ−５／ＶｅｎｕｓノックインＥＳクローンを得ることはできなかった。これには種々の要因が考えられるが、その理由として、ＥＳ細胞内のＩＬ−５遺伝子が凝集などしている可能性があるために、ＥＳ細胞内のＩＬ−５遺伝子座へのコンストラクトＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓ遺伝子のアクセスが阻害される可能性があることや、相同組換え領域が大きい（６，０００塩基以上）などが主な理由として考えられた。 Therefore, the present inventors selected Venus as a fluorescent protein and attempted to produce an IL-5 / Venus knock-in mouse. In a normal method for producing a knock-in mouse (see, for example, Japanese Patent No. 4219617), 4 to 50 knock-in ES clones with a homologous recombination rate of about 2 to 6% using 200 to 800 construct-introduced ES clones. Is obtained. However, in the production of IL-5 / Venus knock-in mice that the present inventors tried, the construct was introduced into ES cells under the conditions of a normal electroporation method, and about 1,000 clones were obtained. It was not possible to obtain an IL-5 / Venus knock-in ES clone in which the IL-5 / Venus gene of the construct was integrated into the IL-5 locus in ES cells. Various factors can be considered for this, because the IL-5 gene in the ES cell may be aggregated and the like. Therefore, the construct IL- 5 / Venus gene access may be inhibited, and the main reason is that the homologous recombination region is large (6,000 bases or more).
そこで、本発明者らは、上記コンストラクトのＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓ遺伝子とＥＳ細胞内のＩＬ−５遺伝子座との接触頻度を向上させることを目的として、エレクトロポレーション条件を鋭意検討したところ、細胞数を通常の細胞数（１ｘ１０７個）よりも若干少ない細胞数（約５ｘ１０６個）に設定することにより、コンストラクトの導入効率が向上することを見出した。そして、細胞数を約５ｘ１０６個に設定したエレクトロポレーションにより、前回のエレクトロポレーション時よりもＥＳ細胞１クローンあたり導入コンストラクト数が多いと想定される約１，３００個のコンストラクト導入ＥＳクローンを得ることができ、この中からただ１個のノックインＥＳクローンを得ることができた。さらに、この１個のノックインＥＳクローンをマウス８細胞期胚に注入して偽妊娠マウスに移植したところ、１０〜５０％のキメラ率（通常のこの場合のキメラ率は１００％近い）でキメラマウスを得た。さらにこのキメラマウスと野生型マウスとを交配させたところ、誕生した２０３匹中ただ１匹がＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスであった。このように、通常のノックインマウスの作製方法と比べて非常に低い相同組換え率およびキメラ率でありながらも、ＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスを得ることができた。このようなＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインは、本発明者らによってはじめて作製されたものである。 Therefore, the present inventors have conducted extensive studies on electroporation conditions for the purpose of improving the contact frequency between the IL-5 / Venus gene of the construct and the IL-5 locus in ES cells. It has been found that the introduction efficiency of the construct is improved by setting the number to be slightly smaller than the normal number of cells (1 × 10 7 ) (about 5 × 10 6 ). Then, by electroporation with the number of cells set to about 5 × 10 6 cells, about 1,300 construct-introduced ES clones that are assumed to have more introduced constructs per ES cell clone than in the previous electroporation were obtained. From which only one knock-in ES clone could be obtained. Furthermore, when this one knock-in ES clone was injected into a mouse 8-cell embryo and transplanted into a pseudopregnant mouse, a chimeric mouse with a chimera rate of 10 to 50% (usually the chimera rate in this case is close to 100%) Got. Furthermore, when this chimeric mouse and wild type mouse were crossed, only one out of 203 births was an IL-5 / Venus knock-in mouse. In this way, IL-5 / Venus knock-in mice could be obtained, although the homologous recombination rate and chimera rate were very low compared to the conventional method for producing knock-in mice. Such an IL-5 / Venus knock-in was first produced by the present inventors.
したがって、本発明によれば、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。 Therefore, according to the present invention, there is provided a transgenic non-human mammal comprising a fluorescent protein gene in the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene.
好ましくは、前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ＶＥＮＵＳ又はｍＣｈｅｒｒｙである。 Preferably, the fluorescent protein is GFP, VENUS, or mCherry.
好ましくは、非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびサルから成る群から選ばれる非ヒト哺乳動物である。 Preferably, the non-human mammal is a non-human mammal selected from the group consisting of mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, dog, cat, sheep, pig, goat, cow and monkey.
好ましくは、非ヒト哺乳動物が、非ヒト哺乳動物の臓器、組織、または細胞である。 Preferably, the non-human mammal is an organ, tissue or cell of the non-human mammal.
本発明の別の側面によれば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に用いるための、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にレポーター遺伝子を含む、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞が提供される。 According to another aspect of the present invention, an embryo of a non-human mammal comprising a reporter gene in the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene for use in producing the transgenic non-human mammal of the present invention. Sex stem cells are provided.
本発明の別の側面によれば、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含む０．６×１０３塩基以上の相同領域を含有するベクターを、４×１０６〜６×１０６個の胚性幹細胞へ電気穿孔法により導入することを含む、本発明の非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞または本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を製造する方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, a vector containing a homologous region of 0.6 × 10 3 bases or more containing a fluorescent protein gene in the reading frame of exon 1 of interleukin-5 gene is used as a vector comprising 4 × 10 6 to 4 × There is provided a method for producing an embryonic stem cell of a non-human mammal of the present invention or a transgenic non-human mammal of the present invention, which comprises introducing into 6 × 10 6 embryonic stem cells by electroporation.
本発明の別の側面によれば、本発明の非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞を非ヒト哺乳動物の初期胚に注入して得られたキメラ胚を、偽妊娠非ヒト哺乳動物に移植することを含む、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の製造方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, a chimeric embryo obtained by injecting an embryonic stem cell of a non-human mammal of the present invention into an early embryo of a non-human mammal is transplanted to a pseudopregnant non-human mammal. A method for producing the transgenic non-human mammal of the present invention is provided.
本発明の別の側面によれば、候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、または候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞とを接触させること；ならびに、
前記候補物質および前記抗原を投与したトランスジェニック非ヒト哺乳動物または前記候補物質および前記抗原を接触させたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞における、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質を選択すること
を含む、前記蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法が提供される。
According to another aspect of the present invention, a candidate substance and an antigen against a T cell receptor are administered to a transgenic non-human mammal of the present invention, or an antigen against a candidate substance and a T cell receptor and a transgenic non-human of the present invention. Contacting an organ, tissue or cell of a human mammal; and
Reading of exon 1 of interleukin-5 gene in organ, tissue or cell of transgenic non-human mammal administered with said candidate substance and said antigen or transgenic non-human mammal contacted with said candidate substance and said antigen There is provided a method of screening a substance that affects the expression of the fluorescent protein gene, comprising selecting a substance that affects the expression of the fluorescent protein gene within the frame.
好ましくは、前記蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質が、前記蛍光タンパク質遺伝子の発現を低下させる物質である。 Preferably, the substance that affects the expression of the fluorescent protein gene is a substance that decreases the expression of the fluorescent protein gene.
好ましくは、前記蛍光タンパク質遺伝子の発現を低下させる物質が、ＩＬ−５遺伝子の発現を抑制及び／又は阻害する物質である。 Preferably, the substance that decreases the expression of the fluorescent protein gene is a substance that suppresses and / or inhibits the expression of the IL-5 gene.
本発明の別の側面によれば、被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、または被験物質と本発明の該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞とを接触させること；および、
前記被験物質を投与したトランスジェニック非ヒト哺乳動物または前記被験物質を接触させたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞における、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現を確認することを含む、
前記被験物質が前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して好酸球増加を伴う疾患を発症させる物質であるか否かを検査する方法が提供される。
According to another aspect of the present invention, a test substance is administered to the transgenic non-human mammal of the present invention, or the test substance is contacted with an organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention. That; and
Fluorescent protein in the reading frame of exon 1 of interleukin-5 gene in the organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal administered with the test substance or the transgenic non-human mammal contacted with the test substance Including confirming gene expression,
There is provided a method for examining whether or not the test substance is a substance that causes a disease accompanied by eosinophilia in the transgenic non-human mammal.
好ましくは、前記好酸球増加を伴う疾患が、接触性皮膚過敏症、アレルギー性炎症、気管支喘息、好酸球増多症候群および好酸球性食道炎からなる群から選択される少なくとも一種の疾患である。 Preferably, the disease accompanied by eosinophilia is at least one disease selected from the group consisting of contact skin hypersensitivity, allergic inflammation, bronchial asthma, hypereosinophilic syndrome and eosinophilic esophagitis It is.
本発明のノックイン非ヒト動物によれば、細胞を処理するための工程や抗体を使用するための工程を設けずに、細胞内インターロイキン（ＩＬ）−５量の経時的変化の調査や細胞内ＩＬ−５産生量に影響を与える物質のスクリーニングが可能となる。このような本発明のノックイン非ヒト動物は、本発明の非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞や製造方法によって製造され得る。 According to the knock-in non-human animal of the present invention, it is possible to investigate changes in intracellular interleukin (IL) -5 over time and to detect intracellular changes without providing a step for treating cells or a step for using antibodies. It is possible to screen for substances that affect the amount of IL-5 production. Such a knock-in non-human animal of the present invention can be produced by the non-human mammal embryonic stem cell or the production method of the present invention.
本発明のスクリーニング方法によれば、ＩＬ−５の発現に影響を与える物質、すなわち、ＩＬ−５の発現を維持、促進又は抑制する物質を探索することが可能となる。このようなＩＬ−５の発現を維持、促進又は抑制するための物質は、ＩＬ−５が関与すると考えられる接触性皮膚過敏症、アレルギー性炎症、気管支喘息、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎などの疾患を予防及び／又は治療するための薬剤の有効成分として使用することが期待できる。 According to the screening method of the present invention, it is possible to search for a substance that affects the expression of IL-5, that is, a substance that maintains, promotes or suppresses the expression of IL-5. Such substances for maintaining, promoting or suppressing the expression of IL-5 include contact skin hypersensitivity, allergic inflammation, bronchial asthma, hypereosinophilic syndrome, It can be expected to be used as an active ingredient of a drug for preventing and / or treating diseases such as bulbar esophagitis.
本発明の検査方法によれば、被験物質が本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して好酸球増加を伴う疾患を発症させる物質であるか否かを検査することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニングにおいてＩＬ−５産生を増強させるような物質が同定された場合、本発明の検査方法によれば、そのような物質がｉｎ ｖｉｖｏにおいて好酸球増加を伴う疾患を発症誘導する物質であるかを確認することができる。このようなアッセイ系は、好酸球増加を伴う疾患のメカニズムの解明や治療対策、および好酸球増加を伴う疾患の治療薬を探索する際に利用することが期待できる。 According to the test method of the present invention, it is possible to test whether or not the test substance is a substance that causes a disease accompanied by eosinophilia in the transgenic non-human mammal of the present invention. When a substance that enhances IL-5 production is identified in in vitro screening, according to the test method of the present invention, such a substance induces onset of a disease accompanied by eosinophilia in vivo. Can be confirmed. Such an assay system can be expected to be used for elucidation of the mechanism of a disease accompanied by eosinophilia, therapeutic measures, and searching for a therapeutic drug for a disease associated with eosinophilia.
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の特徴
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、インターロイキン（ＩＬ）−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含む。この蛍光タンパク質遺伝子は、たとえば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物におけるＴｈ２細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＴＣＲに親和性のある抗原と結合することによる刺激などによってＩＬ−５遺伝子が発現するタイミングに応じて発現する。
The present invention is described in detail below.
(1) Features of the transgenic non-human mammal of the present invention The transgenic non-human mammal of the present invention contains a fluorescent protein gene in the reading frame of exon 1 of the interleukin (IL) -5 gene. . This fluorescent protein gene is obtained by, for example, stimulating the Th2 cell T cell receptor (TCR) in the transgenic non-human mammal of the present invention by binding to an antigen having affinity for TCR. It is expressed according to the timing of expression.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、蛍光タンパク質遺伝子は、ＩＬ−５遺伝子座の片方の対立遺伝子（アリール）に存在してもよく（ヘテロ型）、両方の対立遺伝子に存在してもよい（ホモ型）。たとえば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて、ＩＬ−５遺伝子の発現およびＩＬ−５の動物体内での挙動の両方を観察したい場合やＩＬ−５遺伝子が欠失していることにより動物体内での悪影響が懸念される場合などには、蛍光タンパク質遺伝子はヘテロ型であることが好ましい。 In the transgenic non-human mammal of the present invention, the fluorescent protein gene may be present in one allele (aryl) of the IL-5 locus (heterotype) or may be present in both alleles. (Homo type). For example, when the transgenic non-human mammal of the present invention is used to observe both the expression of IL-5 gene and the behavior of IL-5 in the animal body, or when the IL-5 gene is deleted. When there is a concern about adverse effects in the animal body, the fluorescent protein gene is preferably heterozygous.
本明細書でいうインターロイキン−５およびＩＬ−５は、インターロイキン−５（interleukin-5）として当業界において通常の意味として用いられているものであり、一般的には、ヘルパーＴ細胞タイプ２（Ｔｈ２細胞）、マスト細胞、好酸球などが産生するサイトカインの一種であって、Ｂ細胞や好酸球に作用して、その増殖や分化を促進するものとして知られている。たとえば、マウス由来のＩＬ−５遺伝子はＮＣＢＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ）にてＮＭ＿０１０５５８として登録されており、さらにヒト由来のＩＬ−５遺伝子はＮＣＢＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ）にてＮＭ＿０００８７９として登録されているが、マウスまたはヒトのＩＬ−５遺伝子は上記登録された遺伝子に限定されず、これらに変異が挿入されたものなども含む。 Interleukin-5 and IL-5 as used herein are those used in the art as interleukin-5 and generally used as helper T cell type 2. (Th2 cell), a type of cytokine produced by mast cells, eosinophils and the like, which are known to act on B cells and eosinophils to promote their proliferation and differentiation. For example, a mouse-derived IL-5 gene is registered as NM_010558 in NCBI (GeneBank), and a human-derived IL-5 gene is registered as NM_000879 in NCBI (GeneBank). The IL-5 gene is not limited to the registered genes, and includes those in which mutations are inserted.
蛍光タンパク質としては、一般に入手可能なものであれば、由来、アミノ酸配列、発光色などについて特に制限はないが、たとえば、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；ＧＦＰ）が挙げられる。ＧＦＰは、緑色発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）から単離されたタンパク質であり、紫外線または青色光の照射を受けると緑色に輝く性質を持つ。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が発現する蛍光タンパク質は、ＧＦＰ以外にもＧＦＰを改変させた蛍光タンパク質や緑色以外の可視領域に蛍光を有する蛍光タンパク質であってもよい。蛍光タンパク質として好ましいのは、ＧＦＰ、ＶＥＮＵＳ、ｍＣｈｅｒｒｙなどである。ＧＦＰはシモムラらの文献（SHIMOMURA O, JOHNSON FH, SAIGA Y., J Cell Comp Physiol. 1962 Jun;59:223-39.）に記載され、ＶＥＮＵＳはナガイらの文献（Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A., Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):87-90.）に記載され、およびｍＣｈｅｒｒｙはPDB (protein data bank)にて、２ｈ５ｑとして登録されている。 The fluorescent protein is not particularly limited in terms of origin, amino acid sequence, luminescent color and the like as long as it is generally available, and examples thereof include green fluorescent protein (GFP). GFP is a protein isolated from a green luminescent jellyfish (Aequoria victoria), and has a property of shining green when irradiated with ultraviolet rays or blue light. In addition to GFP, the fluorescent protein expressed by the transgenic non-human mammal of the present invention may be a fluorescent protein obtained by modifying GFP or a fluorescent protein having fluorescence in the visible region other than green. Preferable fluorescent proteins include GFP, VENUS, mCherry and the like. GFP is described in Shimomura et al. (SHIMOMURA O, JOHNSON FH, SAIGA Y., J Cell Comp Physiol. 1962 Jun; 59: 223-39.), And VENUS is Nagai T, Ibata K, Park. ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A., Nat Biotechnol. 2002 Jan; 20 (1): 87-90.) And mCherry is registered as 2h5q in PDB (protein data bank). .
（２）本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法は、概略すると、胚性幹細胞にＩＬ−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含むターゲッティングベクター（ターゲッティングコンストラクト）を導入して相同組換えを起こさせ、次いで得られた相同組換え体を選別し、該相同組換え体を胚盤胞腔内に戻してキメラ胚を形成させ、次いでこのキメラ胚を仮親の子宮に移植することによりキメラ動物を作製し、次いで該キメラ動物を野生型動物と交配させてヘテロ接合体であるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するというプロセスを経る。ヘテロ接合体である本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の雄と雌を交配させれば、ホモ接合体が得られる。このホモ接合体も、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に含まれる。
(2) Production of the transgenic non-human mammal of the present invention The method of producing the transgenic non-human mammal of the present invention is roughly summarized as follows. The embryonic stem cell contains an exon 1 reading frame of the IL-5 gene. A targeting vector (targeting construct) containing a fluorescent protein gene is introduced into the DNA to cause homologous recombination, and then the obtained homologous recombinant is selected, and the homologous recombinant is returned to the blastocyst cavity to obtain a chimera. An embryo is formed, and then the chimeric embryo is produced by transplanting the chimeric embryo into a foster mother's uterus, and then the chimeric animal is bred with a wild-type animal to produce a heterozygous transgenic non-human mammal It goes through the process. When a heterozygous male and female of the transgenic non-human mammal of the present invention are mated, a homozygote is obtained. This homozygote is also included in the transgenic non-human mammal of the present invention.
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、マウスがより好ましい。 Examples of non-human mammals that can be used include rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits, dogs, cats, goats, sheep, cows, pigs, monkeys, etc. Rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, and rabbits are preferable, and mice are more preferable from the viewpoint of easy growth and use.
ターゲッティングベクターには、エクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含むＩＬ−５遺伝子の他に、相同組換え体を選別し濃縮するために、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びピューロマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択マーカー、並びに、ジフテリア毒素Ａ遺伝子及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等のネガティブ選択マーカーが含まれていることが好ましい。また、ターゲッティングベクターにおいて、選択マーカーはトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製後には不要となるため、これらを削除するための領域を含んでいることが好ましい。たとえば、Ｃｒｅリコンビナーゼによって特異的に認識されるloxp配列を選択マーカー遺伝子の両側に設置することができる。このようなターゲッティングベクターを構築する方法は特に制限されず、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載の方法に準じて実施することができる。 In addition to the IL-5 gene containing a fluorescent protein gene within the reading frame of exon 1, the targeting vector includes neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, and puromycin resistance in order to select and concentrate homologous recombinants. It is preferable that a positive selection marker such as a gene and a negative selection marker such as a diphtheria toxin A gene and a herpes simplex virus thymidine kinase gene are included. Moreover, in the targeting vector, since the selection marker becomes unnecessary after the production of the transgenic non-human mammal, it is preferable to include a region for deleting these. For example, a loxp sequence that is specifically recognized by Cre recombinase can be placed on both sides of the selectable marker gene. The method for constructing such a targeting vector is not particularly limited. For example, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 To 38, John Wiley & Sons (1987-1997).
ターゲッティングベクターを胚性幹（ＥＳ）細胞に導入する方法は、胚性幹細胞の細胞膜と核膜を物理的に同時に穿孔し、ターゲッティングベクターを直接核内へ送ることができることから、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）を採用することが好ましい。しかし、後述する実施例に記載がある通り、エクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含むＩＬ−５遺伝子は、胚性幹細胞内のＩＬ−５遺伝子座へ組み込まれにくいことが予想される。そこで、導入効率をさらに高めるために、エレクトロポレーション法は、胚性幹細胞の数を、通常（１ｘ１０７個）よりも少ない条件、たとえば、４×１０６〜６×１０６個、好ましくは４．５〜５．５×１０５、より好ましくは約５×１０６個で実施する。このようにターゲッティングベクターを胚性幹細胞へ導入した細胞の中から、胚性幹細胞内のＩＬ−５遺伝子座の一方の対立遺伝子にターゲッティングベクター由来の蛍光タンパク質遺伝子が組み込まれているノックインＥＳクローンを選別する。ノックインＥＳクローンの選別、ノックインＥＳクローンを非ヒト哺乳動物の初期胚へ注入することによるキメラ胚の形成、仮親の子宮へのキメラ胚の移植、キメラ動物の出産などは、当業者によく知られているラミレス−ソリスらの文献（METHODS IN ENZYMOLOGY, R. Ramirez-Solis, et al, 1993, p855-878）などに記載のトランスジェニック動物を作製する方法を参照して実施することができる。 In the method of introducing a targeting vector into embryonic stem (ES) cells, the cell membrane and nuclear membrane of embryonic stem cells can be physically and simultaneously perforated, and the targeting vector can be sent directly into the nucleus. It is preferable to employ a poration method. However, as described in Examples described later, it is expected that the IL-5 gene containing a fluorescent protein gene in the reading frame of exon 1 is unlikely to be integrated into the IL-5 locus in embryonic stem cells. Therefore, in order to further increase the introduction efficiency, the electroporation method is performed under conditions where the number of embryonic stem cells is less than normal (1 × 10 7 cells), for example, 4 × 10 6 to 6 × 10 6 cells, preferably 4 5 to 5.5 × 10 5 , more preferably about 5 × 10 6 . A knock-in ES clone in which a fluorescent protein gene derived from the targeting vector is incorporated into one allele of the IL-5 locus in the embryonic stem cell is selected from the cells into which the targeting vector has been introduced into the embryonic stem cell. To do. Selection of knock-in ES clones, formation of chimeric embryos by injecting knock-in ES clones into early embryos of non-human mammals, transplantation of chimeric embryos into temporary uterus, birth of chimeric animals, etc. are well known to those skilled in the art. The method for producing transgenic animals described in the literature of Ramirez-Soris et al. (METHODS IN ENZYMOLOGY, R. Ramirez-Solis, et al, 1993, p855-878) can be used.
得られたキメラ動物と野生型動物とを交配させ、毛色を観察することなどによってＩＬ−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内に蛍光タンパク質遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。なお、ターゲッティングベクターにおいて選択マーカー遺伝子の両側にloxp配列を設置している場合は、生殖細胞においてＣｒｅリコンビナーゼを発現する動物と交配させることが好ましい。 A transgenic non-human mammal containing a fluorescent protein gene in the reading frame of exon 1 of the IL-5 gene can be obtained by crossing the resulting chimeric animal with a wild-type animal and observing the coat color. In addition, when the loxp sequence is installed on both sides of the selection marker gene in the targeting vector, it is preferably mated with an animal that expresses Cre recombinase in germ cells.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物には、非ヒト哺乳動物の細胞、細胞内小器官、組織、および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが含まれる。 The transgenic non-human mammal of the present invention includes nonhuman mammal cells, subcellular organelles, tissues, and organs, as well as the head, fingers, hands, feet, abdomen, tail, and the like.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、内在性のＩＬ−５遺伝子が発現するタイミングに応じて蛍光タンパク質遺伝子を特異的に発現するものであり、ノックイン非ヒト哺乳動物におけるＩＬ−５が関与した発生機構の解明などの研究分野において有用である。また、後述する通りに、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ＩＬ−５が関与する可能性のある接触性皮膚過敏症、アレルギー性炎症、気管支喘息、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎などの疾患を予防及び／又は治療するための薬剤のスクリーニング試験に利用可能なモデルである。 The transgenic non-human mammal of the present invention specifically expresses a fluorescent protein gene according to the timing of expression of an endogenous IL-5 gene, and IL-5 in a knock-in non-human mammal is involved. It is useful in research fields such as elucidation of the development mechanism. In addition, as described later, the transgenic non-human mammal of the present invention has contact skin hypersensitivity, allergic inflammation, bronchial asthma, hypereosinophilic syndrome, eosinophils that may involve IL-5. It is a model that can be used for screening tests for drugs for preventing and / or treating diseases such as bulbar esophagitis.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を利用することにより、ＩＬ−５遺伝子の発現量に関与している疾患、たとえば、アレルギー性疾患の治療効果及び予防効果を評価することが可能であり、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、このような疾患の病態評価モデル動物として利用することができる。たとえば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて、これらの病態回復および重篤程度を判定し、上記疾患の治療方法を検討することも可能である。ＩＬ−５遺伝子の発現と、上記疾患の進行度などを分析することにより、該疾患の発症・進行のメカニズムを解明することができる。 By using the transgenic non-human mammal of the present invention, it is possible to evaluate the therapeutic and prophylactic effects of diseases associated with the expression level of IL-5 gene, for example, allergic diseases. The transgenic non-human mammal of the invention can be used as a model animal for evaluating the disease state of such diseases. For example, by using the transgenic non-human mammal of the present invention, it is possible to determine the recovery and severity of these pathological conditions, and to examine methods for treating the above diseases. By analyzing the expression of IL-5 gene and the degree of progression of the disease, the mechanism of the onset and progression of the disease can be elucidated.
（３）ノックイン非ヒト哺乳動物を用いたスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、または候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞とを接触させること；ならびに、前記候補物質および前記抗原を投与したトランスジェニック非ヒト哺乳動物または前記候補物質および前記抗原を接触させたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞における、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質を選択することを含む。
(3) Screening method using knock-in non-human mammal The screening method of the present invention comprises administering a candidate substance and an antigen for a T cell receptor to the transgenic non-human mammal of the present invention, or a candidate substance. And an antigen against the T cell receptor and the organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention; and the candidate substance and the transgenic non-human mammal administered the antigen or the candidate substance And selecting a substance that affects the expression of the fluorescent protein gene within the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene in the organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal contacted with the antigen. Including.
本発明のスクリーニング方法では対照を用いてもよい。対照としては、たとえば、候補物質及び／又はＴ細胞受容体に対する抗原を投与または接触させずに、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現を測定した結果を採用することができる。 A control may be used in the screening method of the present invention. As a control, for example, the result of measuring the expression of a fluorescent protein gene within the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene without administering or contacting the candidate substance and / or antigen against the T cell receptor is adopted. can do.
本発明のスクリーニング方法に供される候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。またペプチドライブラリーや化合物ライブラリーなど、多数の分子を含むライブラリーを候補物質として使用することもできる。 Candidate substances used in the screening method of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds. A library containing a large number of molecules such as a peptide library or a compound library can also be used as a candidate substance.
本発明のスクリーニング方法に供されるＴ細胞受容体に対する抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に親和性のある抗原であれば特に制限されないが、たとえば、ＣＤ３ε、マイトジェンなどが挙げられるが、このうちＣＤ３εが好ましい。 The antigen for the T cell receptor used in the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it is an antigen having affinity for the T cell receptor (TCR), and examples thereof include CD3ε and mitogen. Of these, CD3ε is preferred.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原を投与する方法は、たとえば、経口投与、静脈注射などが用いられる。投与の順番は特に制限されず、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して、候補物質を投与した後にＴ細胞受容体に対する抗原を投与しても、Ｔ細胞受容体に対する抗原を投与した後に候補物質を投与しても、候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原を同時に投与してもよい。 Examples of the method for administering a candidate substance and an antigen for a T cell receptor to the transgenic non-human mammal of the present invention include oral administration and intravenous injection. The order of administration is not particularly limited, and even if the antigen for the T cell receptor is administered after the candidate substance is administered to the transgenic non-human mammal of the present invention, the antigen for the T cell receptor is administered. The candidate substance may be administered, or the candidate substance and the antigen for the T cell receptor may be administered simultaneously.
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞と候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原とを接触させる方法としては、たとえば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞を含む溶液と、候補物質もしくは候補物質を含む溶液およびＴ細胞受容体に対する抗原もしくはＴ細胞受容体に対する抗原を含む溶液、または候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原を含む溶液を混合し、次いで本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のＩＬ−５産生条件に適した条件下でインキュベートする方法などが用いられる。この場合においても、投与の順番は特に制限されず、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞に対して、候補物質を接触させた後にＴ細胞受容体に対する抗原を接触させても、Ｔ細胞受容体に対する抗原を接触させた後に候補物質を接触させても、候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原を同時に接触させてもよい。候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原の投与量および投与時間、または接触量および接触時間は、投与または接触方法、候補物質およびＴ細胞受容体に対する抗原の性質などに応じて適宜選択することができる。 Examples of the method of bringing the organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention into contact with the candidate substance and the antigen for the T cell receptor include, for example, the organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention. And a solution containing a candidate substance or a solution containing a candidate substance and an antigen for a T cell receptor or an antigen for a T cell receptor, or a solution containing a candidate substance and an antigen for a T cell receptor, A method of incubating under conditions suitable for IL-5 production conditions of the transgenic non-human mammal of the invention is used. Also in this case, the order of administration is not particularly limited, and the candidate substance is contacted with the organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention and then the antigen against the T cell receptor is contacted. Alternatively, the candidate substance may be contacted after contacting the antigen to the T cell receptor, or the candidate substance and the antigen to the T cell receptor may be contacted simultaneously. The dose and administration time of the antigen to the candidate substance and T cell receptor, or the contact amount and contact time can be appropriately selected according to the administration or contact method, the nature of the antigen to the candidate substance and T cell receptor, and the like. .
蛍光タンパク質遺伝子の発現は、たとえば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織染色などの、通常の遺伝子の発現を定性的または定量的に検出または測定する方法により確認できる。しかし、これらの方法は、蛍光タンパク質が細胞内に蓄積する場合は、細胞を処理する工程や抗体を使用する工程を要する。そこで、蛍光タンパク質遺伝子の発現は、Ｘ線、紫外線、可視光線などの照射によってエネルギーを吸収し電子を励起させ、次いで電子が基底状態に戻る際に余分なエネルギーとして電磁波を放出するという蛍光の性質を利用して確認することが好ましい。たとえば、蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質である場合は、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に紫外線または青色光の照射をして、放出される緑色蛍光の電磁波を確認することにより、緑色蛍光タンパク質の発現を検出することができる。 The expression of the fluorescent protein gene can be confirmed by a method for detecting or measuring the expression of a normal gene qualitatively or quantitatively, such as Northern blot, RT-PCR and immunohistochemical staining. However, these methods require a step of treating cells and a step of using antibodies when fluorescent proteins accumulate in the cells. Therefore, the expression of the fluorescent protein gene is the property of fluorescence that absorbs energy by irradiation with X-rays, ultraviolet rays, visible light, etc., excites electrons, and then emits electromagnetic waves as extra energy when the electrons return to the ground state. It is preferable to confirm using. For example, when the fluorescent protein is a green fluorescent protein, the transgenic non-human mammal of the present invention is irradiated with ultraviolet light or blue light, and the emitted green fluorescent electromagnetic wave is confirmed, whereby the green fluorescent protein Expression can be detected.
細胞内在性のＩＬ−５遺伝子が発現する条件では、ＩＬ−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内に組み込んだ蛍光タンパク質遺伝子も発現することから、蛍光タンパク質の発現をＩＬ−５遺伝子の発現とみなすことができる。 Under the conditions where the endogenous IL-5 gene is expressed, the fluorescent protein gene incorporated in the reading frame of exon 1 of the IL-5 gene is also expressed, and therefore the expression of the fluorescent protein is regarded as the expression of the IL-5 gene. be able to.
本発明のスクリーニング方法の具体的態様の一つは、たとえば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器から未分化Ｔ細胞を精製分離し、次いでこの未分化Ｔ細胞の分化を誘導し、次いで分化後の細胞とＣＤ３εやマイトジェンなどのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する抗原とを接触させることにより細胞におけるＩＬ−５遺伝子発現の活性化を誘導する刺激を与えるなどしてＩＬ−５産生が活性化した細胞を得て、次いでＩＬ−５産生が活性化した細胞に候補物質を接触させ、次いでこの候補物質を接触させた細胞におけるインターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現を定性的または定量的に測定する。次いで、対照と比べるなどして、候補物質の中から蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質を、ＩＬ−５遺伝子の発現に影響を与える物質として選択する。 One specific embodiment of the screening method of the present invention includes, for example, purifying and separating undifferentiated T cells from the organ of the transgenic non-human mammal of the present invention, and then inducing differentiation of the undifferentiated T cells, IL-5 production is active by, for example, giving stimulation to induce activation of IL-5 gene expression in cells by contacting the differentiated cells with antigens against T cell receptors (TCR) such as CD3ε and mitogen A fluorescent protein within the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene in the cell contacted with the candidate substance, and then contacted with the candidate substance. Gene expression is measured qualitatively or quantitatively. Next, a substance that affects the expression of the fluorescent protein gene is selected from among candidate substances as a substance that affects the expression of the IL-5 gene, for example, by comparison with a control.
たとえば、蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質が蛍光タンパク質遺伝子の発現を低下させる物質である場合は、ＩＬ−５遺伝子の発現を低下させる物質、すなわち、ＩＬ−５遺伝子の発現を抑制及び／又は阻害する物質である可能性が高い。このようなＩＬ−５遺伝子の発現を抑制及び／又は阻害する物質は免疫抑制剤として利用できる可能性があり、さらには接触性皮膚過敏症、アレルギー性炎症、気管支喘息、好酸球増多症候群および好酸球性食道炎などの好酸球増加を伴う疾患を治療及び／又は予防するための医薬の有効成分として利用することも期待できる。 For example, when the substance that affects the expression of the fluorescent protein gene is a substance that decreases the expression of the fluorescent protein gene, the substance that decreases the expression of the IL-5 gene, ie, suppresses the expression of the IL-5 gene and / or Or it is highly possible that the substance is an inhibitor. Such a substance that suppresses and / or inhibits the expression of IL-5 gene may be used as an immunosuppressant. Furthermore, contact skin hypersensitivity, allergic inflammation, bronchial asthma, hypereosinophilic syndrome It can also be expected to be used as an active ingredient of a medicament for treating and / or preventing diseases associated with eosinophilia such as eosinophilic esophagitis.
（４）ノックイン非ヒト哺乳動物を用いた好酸球増加関連疾患を誘発する物質の検査方法
本発明の検査方法は、被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、または被験物質と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞とを接触させること；および、前記被験物質を投与したトランスジェニック非ヒト哺乳動物または前記被験物質を接触させたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞における、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現を確認することを含む。本発明の検査方法では、適宜、対照を用いてもよい。
(4) Method for testing a substance that induces an eosinophilia-related disease using a knock-in non-human mammal The test method of the present invention comprises administering a test substance to the transgenic non-human mammal of the present invention. Or contacting a test substance with an organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention; and transgenic non-human mammal administered with the test substance or transgenic with the test substance And confirming the expression of a fluorescent protein gene within the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene in an organ, tissue or cell of a non-human mammal. In the inspection method of the present invention, a control may be used as appropriate.
本発明の検査方法に供される被験物質としては特に制限はなく、例えば、合成化合物、天然物、細菌やウイルスといった微生物などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a test substance used for the test | inspection method of this invention, For example, microorganisms, such as a synthetic compound, a natural product, bacteria, and a virus, are mentioned.
被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与する方法、被験物質と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の臓器、組織もしくは細胞とを接触させる方法、および蛍光タンパク質遺伝子の発現を確認する方法は、本発明のスクリーニング方法を参照することができる。 A method of administering a test substance to the transgenic non-human mammal of the present invention, a method of contacting the test substance with an organ, tissue or cell of the transgenic non-human mammal of the present invention, and confirming the expression of a fluorescent protein gene For the method, the screening method of the present invention can be referred to.
本発明の検査方法では、被験物質が本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して好酸球増加を伴う疾患を発症させる物質であるか否かを検査することができる。たとえば、本発明の検査方法によって、蛍光タンパク質遺伝子が発現されていることを確認することにより、または蛍光タンパク質遺伝子の発現レベルが増大していることを確認することにより、被験物質が本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して好酸球増加を伴う疾患を発症させる物質であると推測し得る。 In the test method of the present invention, it is possible to test whether the test substance is a substance that causes a disease accompanied by eosinophilia in the transgenic non-human mammal of the present invention. For example, by confirming that the fluorescent protein gene is expressed by the test method of the present invention, or by confirming that the expression level of the fluorescent protein gene is increased, the test substance is transformed into the trans of the present invention. It can be assumed that this is a substance that causes a disease accompanied by eosinophilia in a transgenic non-human mammal.
好酸球増加を伴う疾患は、特に制限されず、複合的に発症する可能性がある。たとえば、好酸球増加を伴う疾患は、接触性皮膚過敏症、アレルギー性炎症、気管支喘息、好酸球増多症候群および好酸球性食道炎からなる群から選択される１種または２種以上の疾患を挙げることができる。 Diseases associated with eosinophilia are not particularly limited and may develop in a complex manner. For example, the disease associated with eosinophilia is one or more selected from the group consisting of contact skin hypersensitivity, allergic inflammation, bronchial asthma, hypereosinophilic syndrome and eosinophilic esophagitis Can be mentioned.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
［例１］ＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスの作製
（１）ターゲッティングコンストラクトの作製
ベクターpCR（登録商標）-XL-TOPO（登録商標）（Invitrogen）を用いて、マウスＩＬ−５遺伝子エクソン１の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）にフレームを一致させるようにＶｅｎｕｓ遺伝子（東京大学医科学研究所幹細胞治療部門中内先生よりご供与）を挿入したターゲッティングコンストラクトを作製した（図１参照）。ポジティブ選択マーカーにはネオマイシン耐性遺伝子（ＰＧＫ−Ｎｅｏ）を、ネガティブ選択マーカーにはヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を用いた。ターゲッティングベクターに用いたＩＬ−５遺伝子の相同領域の長さは、Ｖｅｎｕｓ遺伝子の５’側で７．０Ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子の３’側で３．０Ｋｂである。コンストラクト全体の大きさは、約１８Ｋｂである。また、ネオマイシン耐性遺伝子はノックインマウス誕生後には不必要であり、且つ強力なプロモーターを有するためにＣｒｅリコンビナーゼによって削除する必要がある。そのためＣｒｅリコンビナーゼによって特異的に認識されるloxp配列をネオマイシン耐性遺伝子の両側に設置した。
[Example 1] Preparation of IL-5 / Venus knock-in mouse (1) Preparation of targeting construct Translation of mouse IL-5 gene exon 1 using vector pCR (registered trademark) -XL-TOPO (registered trademark) (Invitrogen) A targeting construct was prepared in which the Venus gene (provided by Prof. Nakauchi, Department of Stem Cell Treatment, University of Tokyo) was inserted to match the start codon (ATG) in frame (see FIG. 1). Neomycin resistance gene (PGK-Neo) was used as a positive selection marker, and herpesvirus thymidine kinase (HSV-TK) was used as a negative selection marker. The length of the homology region of the IL-5 gene used for the targeting vector is 7.0 Kb on the 5 ′ side of the Venus gene and 3.0 Kb on the 3 ′ side of the neomycin resistance gene. The overall size of the construct is about 18 Kb. In addition, the neomycin resistance gene is unnecessary after the knock-in mouse is born, and it needs to be deleted by Cre recombinase in order to have a strong promoter. Therefore, the loxp sequence specifically recognized by Cre recombinase was placed on both sides of the neomycin resistance gene.
（２）コンストラクトのＥＳ細胞へのエレクトロポレーションの条件検討
上記（１）で作製したターゲッティングコンストラクトをマウスＥＳ細胞に電気穿孔法によって導入した後、ネオマイシンを加えた培地でＥＳクローンを選択することを試みた。このエレクトロポレーションは２回実施した。一回目のエレクトロポレーションでは、約１，０００クローンを通常のエレクトロポレーションの条件でＥＳ細胞へ導入しようとした。しかしながら、その中には目的の遺伝子座で相同組換えが起こったクローンは検出できなかった。
(2) Examination of conditions for electroporation of constructs into ES cells After introducing the targeting construct prepared in (1) above into mouse ES cells by electroporation, selecting ES clones in a medium supplemented with neomycin Tried. This electroporation was performed twice. In the first electroporation, about 1,000 clones were attempted to be introduced into ES cells under normal electroporation conditions. However, clones in which homologous recombination occurred at the target locus could not be detected.
ここで、相同組換のスクリーニングを行ったＥＳ細胞は薬剤（ネオマイシン）でスクリーニングしているので、スクリーニングされたＥＳ細胞にはＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓコンストラクトに含まれるネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている。つまり、コンストラクト自身はゲノムＤＮＡ上のＩＬ−５遺伝子座とは異なったどこかに挿入されていることなる。しかしながら、一回目のエレクトロポレーションでは目的の遺伝子座で相同組換えが起こったクローンが得られなかった。そこで、より多くのターゲッティングコンストラクトをＥＳ細胞内に導入できれば、より多くのターゲッティングコンストラクトをＥＳ細胞内のＩＬ−５遺伝子座の近傍に存在させることができ、結果として相同組換えが生じる効率を向上させることができるのではないかと考え、ターゲッティングコンストラクトをＥＳ細胞内に導入するためのエレクトロポレーションの条件を検討した。 Here, since the ES cells screened for homologous recombination are screened with a drug (neomycin), the neomycin resistance gene contained in the IL-5 / Venus construct is inserted into the screened ES cells. That is, the construct itself is inserted somewhere different from the IL-5 locus on the genomic DNA. However, in the first electroporation, a clone in which homologous recombination occurred at the target locus could not be obtained. Thus, if more targeting constructs can be introduced into ES cells, more targeting constructs can be present in the vicinity of the IL-5 locus in ES cells, resulting in improved efficiency in which homologous recombination occurs. The conditions for electroporation for introducing the targeting construct into ES cells were examined.
用いたＥＳ細胞はＡＫ−7と呼ばれるＥＳ細胞で、今回のノックインマウスの作製に用いたものである。ベクターはｐｃＤＮＡＥＧＦＰを用い、細胞内でＧＦＰを発現するベクターである。このＧＦＰを発現する細胞の割合をエレクトロポレーションの効率とした。検討した条件は細胞数であり、１ｘ１０５、１ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７個である。従来は１ｘ１０７個の細胞を用いていた。 The ES cell used was an ES cell called AK-7, which was used for the production of this knock-in mouse. The vector is a vector that expresses GFP in cells using pcDNAEGFP. The proportion of cells expressing this GFP was taken as the efficiency of electroporation. Study criteria is the number of cells, 1x10 5, 1x10 6, 5x10 6 , 1x10 7 cells. Conventionally, 1 × 10 7 cells were used.
図２に示すように５ｘ１０６個の細胞を用いた場合が最も多くの割合（３４．７％）のＧＦＰ陽性細胞が観察された。従来の１ｘ１０７個の細胞を用いるよりも５ｘ１０６個の細胞を用いた方が高効率でターゲッティングベクターがＥＳ細胞に導入されると結論づけた。この条件で２回目のエレクトロポレーションを行い、前回のエレクトロポレーション時よりもＥＳ細胞１クローンあたりの導入コンストラクト数が多いと想定されるおよそ１，３００個のＥＳ細胞が得られた。これらの細胞を用いてサザンブロット法によりスクリーニングした結果、相同組換え効率が０．０４％と低かったものの、相同組換えによるＩＬ−５遺伝子座にＶｅｎｕｓがノックインされたＥＳクローン１個を得ることができた。 As shown in FIG. 2, the largest proportion (34.7%) of GFP positive cells were observed when 5 × 10 6 cells were used. It was concluded that the targeting vector was introduced into ES cells with higher efficiency using 5 × 10 6 cells than using conventional 1 × 10 7 cells. A second electroporation was performed under these conditions, and approximately 1,300 ES cells were obtained, which were assumed to have a higher number of introduced constructs per ES cell clone than during the previous electroporation. As a result of screening by Southern blotting using these cells, one ES clone in which Venus was knocked in at the IL-5 locus by homologous recombination was obtained although the homologous recombination efficiency was as low as 0.04%. I was able to.
（３）トランスジェニックマウス（ＩＬ−５Ｖｅｎｕｓノックインマウス）の作製
上記ノックインＥＳクローンをマウス８細胞期胚に注入することにより、キメラ率が１０％−５０％キメラマウスを得た。キメラ率が低かったため、キメラマウスと野生型マウスとを交配した結果誕生した２０３匹の仔のうち２匹のみがＥＳ細胞由来のマウスであることが毛色の観察から同定された。さらに、仔２匹中１匹がＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスであることが、ＰＣＲを用いたジェノタイピングから同定された。誕生したノックインマウスからネオマイシン耐性遺伝子をＣｒｅリコンビナーゼによって削除するために生殖細胞でＣｒｅリコンビナーゼが発現するＣＡＧ−Ｃｒｅマウス（Sakai, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 318-324(1997))と交配した。Ｃｒｅリコンビナーゼによってネオマイシン耐性遺伝子が削除されたことをサザンブロット法によって確認した（図３参照）。
(3) Production of transgenic mouse (IL-5Venus knock-in mouse) The above knock-in ES clone was injected into a mouse 8-cell stage embryo to obtain a chimeric mouse having a chimera rate of 10% to 50%. Since the chimera rate was low, it was identified from observation of hair color that only 2 out of 203 pups born as a result of mating a chimeric mouse and a wild-type mouse were ES cell-derived mice. Furthermore, it was identified from genotyping using PCR that one of two pups was an IL-5 / Venus knock-in mouse. CAG-Cre mice that express Cre recombinase in germ cells (Sakai, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 318) in order to delete the neomycin resistance gene by Cre recombinase from the new knock-in mouse. -324 (1997)). It was confirmed by Southern blotting that the neomycin resistance gene was deleted by Cre recombinase (see FIG. 3).
［例２］ＩＬ−５の発現挙動の検討
例１で作製したＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスの脾臓から細胞を採取しマウスＣＤ４陽性細胞をAnti-Mouse CD4 Magnetic Particles（BD Bioscience）キットとＢＤ ＩＭａｇ細胞分離システム（BD Bioscience）を用いて精製した。精製した１ｘ１０６個のＴ細胞胞を抗ＣＤ３ε抗体を付着させた培養プレートに播種し、抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−４の存在下で２日間培養した。その後、抗ＣＤ３ε抗体を付着させていない通常の培養プレートで３日間Ｔ細胞増殖因子ＩＬ−２の存在下で培養した。用いた培地は１０％ＦＣＳ（JRH Biosciences）、１００ＩＵ/ｍｌペニシリン、１００μｇ/ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ−２ＭＥをＲＰＭＩ１６４０（Gibco Invitrogen）に添加したものを用いた。この培養系はＴｈ２細胞分化誘導培養系と知られ、未刺激Ｔ細胞をＴｈ２細胞へと分化させることが可能である。その後分化させたＴｈ２細胞を再び抗ＣＤ３ε抗体を付着させた培養プレートに播種し、分泌型蛋白質の細胞外への流出を阻害する試薬（Golgistop: BD Bioscience）の存在下で６時間培養した。
[Example 2] Examination of IL-5 expression behavior Cells were collected from the spleen of the IL-5 / Venus knock-in mouse prepared in Example 1, and mouse CD4-positive cells were collected from an Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles (BD Bioscience) kit and BD Imag. Purified using a cell separation system (BD Bioscience). Purified 1 × 10 6 T cell vesicles were seeded on a culture plate to which an anti-CD3ε antibody was attached, and cultured for 2 days in the presence of anti-IFNγ antibody, anti-IL-12 antibody, anti-CD28 antibody and IL-4. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in the presence of T cell growth factor IL-2 on a normal culture plate to which no anti-CD3ε antibody was attached. The medium used was 10% FCS (JRH Biosciences), 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 50 μM-2ME added to RPMI 1640 (Gibco Invitrogen). This culture system is known as a Th2 cell differentiation-inducing culture system, and is capable of differentiating unstimulated T cells into Th2 cells. Thereafter, the differentiated Th2 cells were seeded again on a culture plate to which an anti-CD3ε antibody was attached, and cultured for 6 hours in the presence of a reagent (Golgistop: BD Bioscience) that inhibits the secretion of the secreted protein to the outside of the cells.
細胞を固定して細胞膜を溶解させ、ＩＬ−５に特異的な抗体で細胞内のＩＬ−５を認識させ、フローサイトメトリー法で検出した（図４を参照）。図４は横軸にＶｅｎｕｓ産生を、縦軸にＩＬ−５の産生を示している。用いたマウスの遺伝子型は野生型（＋）／＋、＋／ＶｅｎｕｓとＶｅｎｕｓ／Ｖｅｎｕｓである。未刺激状態では若干のＩＬ−５陽性細胞とＶｅｎｕｓ陽性細胞が認められるのみであるが、＋／Ｖｅｎｕｓの細胞に刺激が加わるとＩＬ−５、Ｖｅｎｕｓ産生細胞が顕著に増加し、また両陽性の細胞もみられるようになる。対して＋／＋の細胞ではＶｅｎｕｓの発現が、Ｖｅｎｕｓ／Ｖｅｎｕｓ細胞ではＩＬ−５の発現が検出されない。この結果から目的のＩＬ−５遺伝子座にＶｅｎｕｓ遺伝子が相同組換えされ、その発現挙動もＩＬ-５遺伝子と同様の発現を示すことが判明した。 Cells were fixed, cell membranes were lysed, IL-5 in the cells was recognized with an antibody specific for IL-5, and detected by flow cytometry (see FIG. 4). FIG. 4 shows Venus production on the horizontal axis and IL-5 production on the vertical axis. The mouse genotypes used are wild type (+) / +, + / Venus and Venus / Venus. In the unstimulated state, only some IL-5 positive cells and Venus positive cells are observed. However, when stimulation is applied to + / Venus cells, IL-5 and Venus-producing cells are remarkably increased. Cells can also be seen. In contrast, Venus expression is not detected in + / + cells and IL-5 expression is not detected in Venus / Venus cells. From this result, it was found that the Venus gene was homologously recombined at the target IL-5 locus, and the expression behavior thereof was similar to that of the IL-5 gene.
［例３］ＩＬ−５の発現に影響を与える物質のスクリーニング
例２と同様に、ＩＬ−５／Ｖｅｎｕｓノックインマウスの脾臓からＣＤ４陽性Ｔ細胞を得て、次いでＴｈ２細胞へと分化させた。その後人工的に分化させたＴｈ２細胞を活性化（ＣＤ３ε刺激）し、候補物質（１０μＭ）の存在下で１２時間培養した。候補物質を添加しない群を対照とした。
[Example 3] Screening of substances affecting IL-5 expression As in Example 2, CD4-positive T cells were obtained from the spleen of IL-5 / Venus knock-in mice and then differentiated into Th2 cells. Thereafter, artificially differentiated Th2 cells were activated (stimulated with CD3ε) and cultured in the presence of a candidate substance (10 μM) for 12 hours. A group to which no candidate substance was added was used as a control.
候補物質として天然物ライブラリー（約５００種類）をスクリーニングしたところ、ＩＬ−５の産生を抑制する４５の候補物質が得られた（図５を参照）。これらには免疫抑制剤である、サイクロスポリンが含まれており、これは本発明の実用性を示唆するものである。 When a natural product library (about 500 types) was screened as candidate substances, 45 candidate substances that suppress the production of IL-5 were obtained (see FIG. 5). These include cyclosporine, which is an immunosuppressive agent, suggesting the utility of the present invention.
Claims (10)
前記蛍光タンパク質が、ＶＥＮＵＳである、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 A transgenic non-human mammal comprising a fluorescent protein gene in the reading frame of exon 1 of the interleukin-5 gene ,
A transgenic non-human mammal, wherein the fluorescent protein is VENUS .
前記候補物質および前記抗原を投与したトランスジェニック非ヒト哺乳動物における、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質を選択すること
を含む、前記蛍光タンパク質遺伝子の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法。 Rukoto be administered to a transgenic non-human mammal according antigens against candidate substance and T-cell receptor to claim 1 or 2; and,
The definitive candidate substances and transgenic non-human mammal animal administered said antigen comprises selecting a substance that affects the expression of a fluorescent protein gene in the interleukin-5 gene exon 1 in reading frame of, A method for screening a substance that affects the expression of the fluorescent protein gene.
前記被験物質を投与したトランスジェニック非ヒト哺乳動物における、インターロイキン−５遺伝子のエクソン１の読み取り枠内にある蛍光タンパク質遺伝子の発現を確認することを含む、
前記被験物質が前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して好酸球増加を伴う疾患を発症させる物質であるか否かを検査する方法。 Rukoto be administered to a transgenic non-human mammal according to the test substance to claim 1 or 2; and,
The test substance definitive transgenic non-human mammal animals treated with, including confirming the expression of the fluorescent protein gene in the interleukin-5 reading frame of exon 1 of the gene,
A method for examining whether or not the test substance is a substance that causes a disease accompanied by eosinophilia in the transgenic non-human mammal.
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