EP1364071A2 - Novel method for analysing phenotypic characteristics of human immunodeficiency virus (hiv) - Google Patents

Novel method for analysing phenotypic characteristics of human immunodeficiency virus (hiv)

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EP1364071A2
EP1364071A2 EP01993700A EP01993700A EP1364071A2 EP 1364071 A2 EP1364071 A2 EP 1364071A2 EP 01993700 A EP01993700 A EP 01993700A EP 01993700 A EP01993700 A EP 01993700A EP 1364071 A2 EP1364071 A2 EP 1364071A2
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EP
European Patent Office
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seq
hiv
primers
amplification
virus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01993700A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
François Clavel
Fabrizio Mammano
Esther Race
Elisabeth Dam
Véronique OBRY
Virginie Trouplin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EUROFINS VIRALLIANCE Inc
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Bioalliance Pharma SA
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from FR0103970A external-priority patent/FR2816635A1/en
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701Specific hybridization probes
    • C12Q1/702Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703Viruses associated with AIDS
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing the phenotypic characteristics which exhibit certain strains of virus, in particular of HIV virus.
  • Genotypic tests which are rapid and widely available for detecting the presence of mutations in the viral genes have been developed for example to detect mutations present in the genes coding for the protease or the reverse transcriptase of HIV. Although some mutations have been associated with a particular inhibitor of viral activity, many others are associated with treatment with multiple molecules. In addition, with the development of new inhibitor molecules, the genotyping of variants of viruses that escape treatment becomes more and more complex. This makes it difficult to assess and know against which inhibitors the viruses become resistant or still retain a slight susceptibility.
  • phenotypic tests which measure directly in the culture medium, the modification of the phenotypic characteristic of the virus, such as the inhibition of viral activity, for example in the presence of compounds inhibiting said viral activity, provide a quantitative index of resistance .
  • phenotypic characteristics whose analysis proves to be interesting, in particular from a medical point of view, are those which confer on a virus its resistance towards inhibitory agents capable of blocking at least one mechanism involved in the viral activity, those which confer on a virus its replicative capacity, those which confer on a virus its tropism towards particular targets or those which confer on a virus its aptitude to be neutralized by molecules, such as antibodies, chemokines or inhibitors.
  • the present invention makes it possible to test several distinct but complementary phenotypic characteristics of HIV, using a rapid method based on the reconstruction of a recombinant virus from samples taken from infected patients and involving a single cycle of replication. viral.
  • This invention is part of a decision support and optimization process for the therapeutic strategy in patients infected with HIV who are in a situation of virological failure of antiretroviral treatment, or in patients naive in antiretroviral treatment. Only a complete knowledge of the different phenotypic characteristics of the virus can effectively help the clinician to make the therapeutic decisions best suited to the particular situation of his patient.
  • phenotypic characteristics of the HIV virus whose analysis is of particular interest from a medical point of view, are those linked to the expression of genes, capable of undergoing at least one mutation, located in the GAG, ENV, or POL regions. of the viral genome, such as those listed below:
  • HIV viruses can be linked to the function of all regions of the viral genome, whether they are the parts coding for proteins or regions involved in the various mechanisms or stages of the viral replicative cycle. In particular, it is important to evaluate the effect produced by the mutations in the genes coding for the protease, the reverse transcriptase, the integrase or the envelope on the replication of the viruses and very particularly in the viruses having developed resistance to antiviral agents. Its analysis makes it possible to measure the replicative capacity of a virus, also called infectivity or "fitness".
  • NRTI non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
  • HIV is linked to the expression of part of the POL region coding for integrase. Its analysis provides indications for the adjustment of antiretroviral treatments by integrase inhibitors.
  • HIV is linked to the expression of the HIV envelope glycoprotein and in particular to the expression of the transmembrane subunit of said glycoprotein encoded by a part of the ENV gene.
  • This phenotypic characteristic is also linked to the expression of at least part of the ENV region of HIV viruses which codes for polypeptides which participate in the binding with coreceptors of the target cell.
  • the envelope / co-receptor interaction allows the entry of the HIV virus into said target cell.
  • Inhibitory agents interfere with the co-receptor by inhibiting its interaction with the HIV envelope.
  • This phenotypic characteristic is also linked to the expression of at least part of the ENV region coding for polypeptides of the envelope of HIV viruses, which participate in the binding with one or more receptors of the target cell, in particular with CXCR4 or CCR5 coreceptors
  • This phenotypic characteristic is also linked to the expression of all or part of the ENV region which codes for the envelope polypeptides of HIV viruses.
  • This phenotypic characteristic is also linked to the expression of the envelope proteins of HIV viruses. Its analysis makes it possible to assess the susceptibility of viruses to the inhibitory action of antibodies or substances naturally present in the body and present in serum or in other fluids.
  • the first tests to detect, for example, the phenotypic characteristic of resistance of HIV viruses to antiviral treatments were carried out using primary isolates and peripheral blood lymphocytes (PBL) stimulated by phytoagglutinin (PHA) according to a laborious and difficult to reproduce procedure. .
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • PHA phytoagglutinin
  • An innovative alternative to these tests, a recombinant virus test, hereinafter called RVA was proposed by Kellam and Larder in 1994.
  • This RVA analysis method measured the resistance of a recombinant virus carrying reverse transcriptase isolated from the plasma of a patient carrying the virus by co-transfection of the sequences thereof duly amplified by a polymerase chain reaction (PCR). ), with a clone of virus obtained in the laboratory, which is deleted from its reverse transcriptase and is competent for replication in a variety of well-established cell lines.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Another drawback for detecting, for example, a phenotypic characteristic of resistance which is present in the methods of analysis of the prior art stems from the fact that the simultaneous presence of several mutations capable of conferring resistance with respect to the various retroviral inhibitors reduces the replicative capacity of the virus.
  • the inventors have developed a new method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses which requires only a single replication cycle. This method requiring only a single cycle of viral replication is implemented by the choice of culture conditions for the recombinant viruses obtained.
  • These culture conditions relate to either the control of the culture time, chosen to prevent viral replication beyond the first cycle, this culture time is between 12 hours to 72 hours, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the culture conditions also relate to the choice of cells of the first cellular system, they are chosen so that they are not permissive to viral infection, for example such cells do not have the CD4 receptor necessary for entry of the HIV virus into the cell.
  • examples of such cells are HeLa or 293T cells.
  • these culture conditions also relate to the recombinant viruses constructed according to the method of the invention, which have a deficit in envelope protein. These viruses, once produced in the first cellular system, are in fact incapable of re-infecting the cells of this first cellular system.
  • This analysis method is based on the construction of a recombinant virus (RAV) obtained by co-transfection and homologous recombination with: a) the DNA sequences obtained from a
  • a biological medium such as plasma, serum, saliva, sperm or other secretions
  • the method developed by the inventors is rapid, it requires approximately seven days to be carried out and can therefore be used for routine determinations such as measuring the susceptibility of patients infected with HIV to inhibitors of viral activity.
  • the inventors have already described in US Pat. No. 6,103,462 a first application of this analysis method, based on the formation of a particular recombinant virus, to determine the susceptibility of an HIV virus to protease inhibitors .
  • the new methods of analysis implemented within the framework of the present invention HIV are based on the determination of phenotypic characteristics of the HIV viruses associated with mutations likely to be present at least in a gene chosen from the group comprising the genes gag, pol, protease, reverse transcriptase, RNAse H, integrase, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef, cis-active sequences, LTR, dimerization sequences, splicing regulatory sequences, RRE using ad-hoc recombinant viruses.
  • the invention therefore relates to a method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses present in a biological sample of a patient, said phenotypic characteristic resulting from one or more mutations in the viral genome capable of influencing viral infection, characterized in that it comprises: a) the extraction of the nucleic acids contained in a biological sample, b) at least one amplification by PCR of a segment of the nucleic acids of step (a), each with a pair d primers framing a nucleic acid sequence of the viral genome capable of carrying at least one mutation, c) the preparation of a vector comprising the parts of a genome of an HIV virus necessary for viral replication with the exception of segment amplified in step (b) and optionally with the exception of the gene coding for the envelope protein, d) the transfection of a first cellular host with: the nucleic acids obtained with et ape (b),
  • a second vector comprising a gene coding for an envelope protein if the envelope gene is deleted from the vector prepared in step (c), to obtain, by homologous recombination, a chimeric virus, e) culturing said first cellular host under conditions allowing viral particles to be produced during a single replication cycle, f) infection with the viral particles obtained in step (e) of at least one second cell host capable of being infected with an HIV virus or an HIV pseudotyped virus and possibly comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, and g) detection and / or quantification of the marker expressed in step (f) in order to highlight at least one phenotypic characteristic of the HIV viruses present in the biological sample.
  • PCR of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence comprising all or part of a region of the viral genome chosen from: gag, pol, protease, reverse transcriptase, RNAse H, integrase , vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nave, cis-active sequences, LTR, dimerization sequences, splicing regulatory sequences or the Rev response element (RRE).
  • a pair of primers framing a nucleic acid sequence comprising all or part of a region of the viral genome chosen from: gag, pol, protease, reverse transcriptase, RNAse H, integrase , vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nave, cis-active sequences, LTR, dimerization sequences, splicing regulatory sequences or the Rev response element (RRE).
  • the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for a part of the gag protein of the human immunodeficiency virus and a nucleic acid sequence coding for the protease, capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease and, in that the vector of step (c ) is built from a genome of an HIV virus where all or part of the gene encoding the protease is deleted.
  • step (b) the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention, of a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences Fit A -: (5 'TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No: 1) and Pro A-: (5 'GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3 '3') (SEQ ID No: 2), or consisting of fragments thereof, or sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not modify essentially their capacity to hybridize the region of the protease gene carrying the mutation (s), followed by a second amplification with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: Fit B: ( 5 'AGA ACT T
  • step (b) the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention, of a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease is carried out with a pair of primers: Fit A -: (5 'TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No: 1) and
  • Fit B (5 'AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3') (SEQ ID No: 3) and
  • Pro B- (5 'GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3') (SEQ ID No: 4), to obtain a DNA segment of 1488 base pairs, extending between residues 1237 and 2725 inclusive, and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the region of the pol reading frame coding for the HIV-1 protease extending from residues 1505 to 2565 inclusive, deleted from the envelope region and comprising a unique MluI restriction site.
  • the PCR amplification of step (b) of the analysis method according to the invention is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for reverse transcriptase
  • the transfection of step (c) is carried out with a first vector constructed from a genome of a virus HIV where all or part of the gene coding for reverse transcriptase is deleted.
  • (b) according to the method of analysis of the invention, with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for reverse transcriptase is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences MJ3 (5 'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No: 5) and RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 6), or consisting of fragments thereof, or similar sequences thereof ci carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the transcriptase gene carrying at least one mutation, followed by a second amplification step with a pair of primers comprising the sequences: A35 (5 'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (SEQ
  • step (b) the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention, with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the reverse transcriptase is performed with a pair of primers:
  • RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 6), followed by a second amplification step with a pair of primers:
  • step (c) is a retroviral vector deleted from the region of the pol reading frame coding for HIV-1 reverse transcriptase, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a single restriction site MluI.
  • the invention also relates to an analysis method according to which the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for part of the gag protein, for the protease and for part of the reverse transcriptase of the human immunodeficiency virus capable of carrying at least one mutation in the nucleic acid sequence coding for the gag protein, or for the protease or for reverse transcriptase.
  • step (b) the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for a part of the gag protein, for the protease and for a part of the reverse transcriptase of the virus.
  • human immunodeficiency likely to carry at least one mutation in the nucleic acid sequence coding for the gag protein, or for the protease or for the reverse transcriptase is carried out with the pair of primers: gag + 1 (5 'AGGGGCAAATGGTACATCA 3') (SEQ ID No: 31) and
  • step ( c) Fit B + (SEQ ID No: 1) and RT-IN (SEQ ID No: 8) to obtain a DNA segment of 2825 base pairs, extending between residues 1237 and 4062 and the transfection of step ( c) is carried out with a retroviral vector deleted from part of the gag gene and regions of the pol reading frame coding for the protease and part of the HIV-1 reverse transcriptase extending from residues 1507 to 3870 inclusive, deleted in the envelope region and having a unique Nrul restriction site.
  • the virus resulting from the above-mentioned transfection can be used to determine the infectious or replicative capacity of the virus exhibiting mutations in the reverse transcriptase and / or the protease.
  • the quantification of the viral particles according to this last method of analysis is accomplished by the measurement of the p24 antigen. It should be noted that a similar analysis method can in no case be carried out using a vector deleted simply from the reverse transcriptase sequence since these non-viable recombinant viruses can still produce the p24 antigen.
  • a similar analysis method can in no case be carried out using a vector deleted simply from the reverse transcriptase sequence since these non-viable recombinant viruses can still produce the p24 antigen.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to a reverse transcriptase inhibitor compound, comprising whether or not to add said reverse transcriptase inhibitor compound, optionally at different concentrations, to the second host. cell, prior to infection thereof with the viral particles obtained in step (e), and comprising in step (g) comparing the expression of the marker gene with and without a transcriptase inhibitor compound reverse
  • the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for integrase
  • the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from all or part of the gene coding for integrase.
  • the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for integrase is carried out with the pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: INT B + 5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3 '(SEQ ID No: 9) and INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3' (SEQ ID No: 10), or sequences similar to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not modify essentially their capacity to hybridize the region of the integrase gene carrying at least one mutation, followed by a second amplification step, with the pair of primers: ' INT V + 5' CACCCTAACTGACACAACAA3 '(SEQ ID No: 11 ) and INT V- 5 ⁇ AGGCCTTTCTTATAGCAGA3 '(SEQ ID
  • step (b) the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the integrase is carried out with the pair of primers:
  • step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region of the pol reading frame coding for the HIV-1 integrase extending from residues 4228 to 5093 inclusive and from the region coding for the viral envelope between positions 6343 and 7611 inclusive.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to an integrase inhibitor compound, comprising whether or not to add said integrase inhibitor compound, optionally at different concentrations, during the course of the invention. step (e), before step (f) and comprising in step (g) comparing the expression of the marker gene with and without an integrase inhibitor compound.
  • the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of bringing about minus a mutation in the gene coding for the envelope protein
  • the vector of step (c) is a retroviral vector constructed from a genome of an HIV virus where all or part of the gene coding for the protein envelope is deleted.
  • the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 inclusive, from the region of the HIV-1 genome that constitutes the Rev response element (RRE).
  • RRE Rev response element
  • the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising either the sequences: FIN-A: 5 'TCAAATATTACAGGGCTGCT3' (SEQ ID No: 13) and FIN-B: 5 'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14), or the sequences FuA: 5 'AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3' (SEQ ID No: 23) and FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24) or constituted by fragments thereof or by sequences analogous thereto carrying mutations d '' one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation followed by a second amplification step
  • step (c) 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3 '(SEQ ID No: 16), to obtain a DNA segment of 965 base pairs extending from residues 7553 to 8517 inclusive and the vector of step (c) is a vector retroviral deleted from the entire region encoding the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
  • the method of analysis according to the invention allows the amplification of sequences of the envelope region of HIV virus whatever their subtype and in particular of viruses of subtypes A, B, C, D and E), using for the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
  • FuA 5 ⁇ AGCAATGTATGCCCCTCCCAT3 '(SEQ ID No: 23) and FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24) followed by a second amplification step, carried out with the primer: FuC: 5 ⁇ TATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3 '(SEQ ID No:
  • step (c) said mixing being preferably carried out in a ratio between (10%: 90%) and (90%: 10%) and most preferably between (60%: 40%) and (40%: 60%), to obtain a DNA segment of 805 base pairs extending from residues 7635 to 8440 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the subunit HIV-1 envelope gp41, spanning residues 7745 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
  • the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: NEU-A: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID No: 17) and FIN-B: 5 'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14) or FuB: 5 ' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No: 24) or consisting of fragments thereof, or alternatively by sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation, followed by a second stage of amplification, with the pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides,
  • step (b) the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers: NEU-A: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID NO: 1 .
  • step (c) 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3 '(SEQ ID No: 16), to obtain a DNA fragment between 2106 and 2320 base pairs extending from residues 6197- 6222 to residues 6197-6222 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the whole region encoding the majority of the gpl20 subunit and the extracellular portion of the gp41 of the HIV-1 envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
  • step (b) the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers: NEU-A: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID NO: 1 .
  • FuB 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers: NEU-C: 5 'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers: NEU-C: 5 'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers: NEU-C: 5 'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers: NEU-C: 5 'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers: NEU-C: 5 'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification
  • FuD2 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 27), said mixing being preferably carried out in a ratio between (10%: 90%) and (90%: 10%) and most preferably between (60%: 40%) and (40%: 60%), to obtain a DNA fragment of 2118 base pairs extending from residues 6322 to 8440 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire coding region for the majority of the sub- gpl20 unit and the extracellular portion of gp41 of the HIV-1 envelope, spanning residues 6480 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
  • (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides , comprising the sequences: E00: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3' (SEQ ID No: 19) and ES8B: 5 'CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3' (SEQ ID No: 20), or consisting of fragments thereof, or also sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation, followed by a second amplification step, with a pair primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides comprising the sequences: E20:
  • step (b) the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least a mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
  • E00 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3 '(SEQ ID No: 19) and ES8B: 5' CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3 '(SEQ ID No:
  • E20 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3 '(SEQ ID No: 21) and
  • step (c) is a deleted retroviral vector of the region, coding for domains ranging from loop VI to loop V3 of the HIV-1 envelope extending from 6617 to 7250 inclusive and has a unique Nhel restriction site.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to a fusion inhibitor compound targeting the HIV-1 gp41 protein, comprising carrying out the amplification of step (b) either with the pair of primers SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 15 SEQ ID No: 16, or with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to add or not to add said fusion inhibitor compound, optionally at different concentrations, during the culture of the cell host obtained in step (e), before step (f) and comprising in step (g) comparing the expression of the marker gene with and without a fusion inhibitor compound targeting the HIV-1 gp41.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to a compound which inhibits entry of said HIV virus into a target cell, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair. of primers SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18 and SEQ ID No: 16, whether or not to add said entry inhibitor compound, optionally at different concentrations, to the cell host obtained in step (e) before the infection in step (f) and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene with and without entry inhibitor compound.
  • the invention also relates to an analysis method for determining the susceptibility of an HIV virus to the inhibitory action of antibodies, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to add or not to add said antibodies during the culture step (e), optionally at concentrations different and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene with and without antibody.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the tropism of an HIV virus for a cellular receptor, comprising performing amplification of step (b) with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to carry out the infection of step (f) with the viral particles obtained in step (e) on two distinct cellular hosts and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene by each of the two separate cell hosts.
  • the cellular hosts used for the infection of step (f) according to the analysis method of the invention are chosen from cellular hosts expressing the CCR5 receptor or the CXCR4 receptor.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to an inhibitor compound targeting the HIV-1 co-receptors, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair of primers.
  • SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to add or not to said inhibitor compound targeting the HIV-1 co-receptors, possibly at different concentrations, during stage (e) of culture, the infection of stage (f) being carried out on two distinct cellular hosts and comprising in stage (g) the comparison of the expression of the marker gene by each of the two separate cellular hosts.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the tropism of an HIV virus for a cellular receptor, comprising performing amplification of step (b) with the pair of primers SEQ ID No: 19 and SEQ ID No: 20, followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 21 and SEQ ID No: 22, to infect in step (f) two distinct cellular hosts with the viral particles obtained in step (e) and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene by each of the two hosts separate cells.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to an inhibitor compound targeting the HIV-1 co-receptors, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair of primers.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the infectivity or the replicative capacity of an HIV virus, which consists in comparing in step (g) the expression of the marker gene by the second infected cellular host with the viral particles. obtained by applying steps (a) to (f) to a biological sample from a patient, and expression of the marker gene by the same second cellular host infected with reference viral particles obtained in applying steps (a) to (f) to a sample containing a reference virus.
  • the reference viral particles originating from a reference virus are viral particles obtained by applying steps (a) to (f) to a biological sample from the same patient at a stage prior to or before the therapeutic treatment. .
  • the invention also relates to an analysis method for determining the virulence of an HIV virus comprising carrying out the amplification of step (b) either with the pair of primers SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 15 SEQ ID No: 16, or with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair d primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, and to measure, during the infection of step (f), the cytopathogenic effect produced on the second cellular host.
  • the cytopathogenic effect produced during the infection of step (f) on the second cellular host is measured by means of cytotoxicity techniques such as measuring the induction of syncytia, the induction of apoptosis. or by flow cytometry.
  • the invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to hydroxyurea, comprising whether or not to add hydroxyurea, optionally at concentrations different, either during the culture step (e) or at the second cell host and to perform in step (g) the comparison of the expression of the marker gene with and without hydroxyurea.
  • the duration of the culture step (e) according to the method of the invention is between 12 and 72 hours, very preferably it is between 24 and 48 hours.
  • the subject of the invention is also a kit for implementing a method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses present in a biological sample of a patient, characterized in that it comprises: i) a pair primers framing a nucleic acid sequence of the viral genome capable of carrying at least one mutation, ii) a vector comprising the parts of a genome of an HIV virus necessary for viral replication with the exception of the segment amplified with the primers defined in (i) and of the gene coding for the envelope protein, iii) a second vector comprising a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cell host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) products and reagents for the detection of the expressed marker.
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences:
  • a deleted retroviral vector from the region of the pol reading frame coding for the HIV-1 protease extending from residues 1505 to 2565 inclusive, deleted from the region of envelope and comprising a single MluI restriction site, iii) a virus pseudotyped with a gene coding for an envelope protein.
  • a first cellular host capable of being infected with an HIV virus v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences: SEQ ID No: 5 and SEQ ID No: 7
  • a deleted retroviral vector from the region of the pol reading frame coding for the transcriptase reverse of HIV-1, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a single MluI restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of be infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences:
  • HIV-1 extending from residues 4228 to 5093 inclusive and of the region coding for the viral envelope between positions 6343 and 7611 inclusive, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cell host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cell host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of sequence primers - SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 14
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences
  • the kit according to the invention comprises i) the pairs of primers of sequences - SEQ ID No: 23 and SEQ ID No: 24
  • the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences
  • Figure 1 shows schematically the plasmid pSRT.
  • the region coding for the reverse transcriptase of pNL4-3xcenv is deleted by means of digestion with BalI-SnaBI. Linearization of the resulting pSRT is accomplished by the use of Nru I.
  • Figure 2 illustrates the curves of the dose response effects obtained for two patients versus AZT and 3TC, before and after treatment with reverse transcriptase inhibitors.
  • the curves show the inhibition of infection by a recombinant virus of P4 cells treated with either zidovuidine (AZT, panels A and C) or lamivudine (3TC, panels B and D), according to the technique described later in the hardware and methods section.
  • ZT zidovuidine
  • lamivudine 3TC, panels B and D
  • FIG. 3 is a diagram of the first steps (a and b) of a particular implementation of the method of the invention.
  • the diagram illustrates the steps of extraction (a) and amplification (b) of the reverse transcriptase sequences extracted from the plasma of a patient by RT PCR of the method of the invention as well as the construction diagrams of the plasmid pRVA / RT used later in step (d).
  • FIG. 4 is a diagram of steps (c) to (g) of a particular implementation of the method of the invention. This diagram illustrates step (d) of cotransfection into HeLa / 293T cells of the amplified nucleic acids of step (b), of a first plasmid p43xcsn ⁇ env RT constructed from a genome of an HIV virus.
  • step (e) making it possible to produce viral particles, the step (f) of transfection of the viral particles obtained in step (e) into P4 cells, previously incubated in the presence or not of serial dilutions of different reverse transcriptase inhibitors, said P4 indicator cells having a expression system of the gene coding for the beta-galactosidase enzyme activatable exclusively by the tat activation sequences expressed by the recombinant virus, and step (g) of detection and / or quantification of beta-galactosidase by means of the CPRG substrate.
  • FIG. 5 illustrates the results of the phenotypic analysis obtained in the presence of the T20 fusion inhibitor for viruses present in patient plasmas (P1, P2 and P3) and reference viral prototypes (NL 43 and the resistant clone SUN) .
  • FIG. 6 illustrates the results of measurement of the replicative capacity of viruses L1, L2 and L3 extracted from different samples.
  • RNA is isolated from patient plasma using a Roche Amplicor ® kit (Roche).
  • Amplification of the region coding for reverse transcriptase is carried out using the external primers MJ3 (5 'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (Sequence SEQ ID No: 5, in appendix) and RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (Sequence SEQ ID No: 6, in appendix) and internal primers A35 (5 'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (Sequence SEQ ID No: 7, in appendix) and RT-IN (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 8, in appendix) with an initial cycle at 50 ° C (30 minutes) and 94 ° C (2 minutes), followed by 40 cycles at 94 ° C (30 seconds), 55 ° C (30 seconds) and 68 ° C (90 seconds) and a final extension step at 98 ° C for 10
  • the nucleotide sequences of the regions of reverse transcriptase coding are determined by automatic sequencing of the termination of the dideoxinucleotide chain of the crude PCR products.
  • the molecular clones of HIV-1 used in the analysis method are derived from pNL4-3.
  • the plasmid deleted in reverse transcriptase is constructed by a modification of pNL4-3xc ⁇ env mut e to carry unique SnaBI restriction sites in position 3872 and of Nru I in position 3892.
  • the enzymes Ba I and SnaB I are used to remove the region coding for reverse transcriptase (between positions 2618 and 2872) and linearization of the resulting plasmid pSRT is carried out by means of the enzyme Nru I.
  • the expression of the envelope glycoprotein VSV-G in the transfected cells is ensured by the plasmid pVSV which contains the coding sequence vsv-g under the control of a CMV promoter.
  • HeLa, 293 T and P4 cells are cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 50 IU / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • P4 cells are Hela-CD4, LTR-LacZ cells in which the expression of beta-galactosidase is strictly inducible by the HIV transactivating Tat protein, therefore allowing precise quantification of the infectivity or the replicative capacity.
  • HIV-I viruses based on a single cycle of replication (Chameau, P., Mirambeau, G., Roux, P., Paulous, S., Bue, H. and Clavel, F. (1994) "HIV-1 reverse transcription. A termination step at the center of the genome ". J Mol Biol 241 (5), 651-62.).
  • P4 cells are cultured in the presence of 500 ⁇ g / ml of geneticin.
  • the determination of the susceptibility of an HIV virus to a reverse transcriptase inhibitor is carried out as follows: 293 T cells are transfected with 7.5 ⁇ g of plasmid pSRT linearized with NruI, 0.1 ⁇ g of the plasmid pVSV-G and 0.5 and 1 ⁇ g of the product resulting from the PCR reaction of the reverse transcription of HIV. The transfection precipitate is removed from the cells after 18 hours of incubation and from the growth medium. fee is added.
  • the supernatant is clarified by centrifugation (500 g, 15 minutes) and transferred to P4 indicator cells which have been pre-incubated with serial dilutions of a reverse transcriptase inhibitor, in triplicate wells, for four hours.
  • the range of inhibitor concentrations used varies among the compounds.
  • the signal produced by the activation of the marker gene was developed with CPRG for 48 hours, as for the analysis of the susceptibility to a reverse transcriptase inhibitor and the IC50 index was calculated using the equation of effect. median.
  • the plasmid pSRT carrying a deletion in the region coding for pol ranging from codon 24 of reverse transcriptase (base 2618) to codon 432 of reverse transcriptase (base 3872) includes all the mutations associated with a resistance phenomenon known to date.
  • the homologous sequences of the reverse transcriptase product derived from PCR extend 88 base pairs upstream and 186 bases downstream of the deletion in pSRT.
  • the transfections for determining the susceptibility to reverse transcriptase inhibitors are carried out with a 293T cell line having a high capacity to be transfected rather than with HeLa cells. This is not a problem because the cells are removed from the virus-containing supernatant by centrifugation before the transfer of P4 cells.
  • the transfer conditions are optimized by means of a chessboard test.
  • the variation in the ratio of the plasmid / product resulting from PCR does not significantly modify the quantity of p24 or reverse transcriptase produced or the speed of reaction with CPRG. Since the circular plasmid, pVSV-G appears to be extremely toxic to 293T cells, the amount thereof has been reduced from 3 ⁇ g to 0.1 ⁇ g in the transfection mixture, leading to high yields of p24
  • the inhibitor concentration ranges used are chosen according to the cellular toxicity of each compound and the IC50 / IC90 ratio for the susceptibility of resistant isolates (Table 1). For example, as the IC50 index for abacavir for P4 cells is approximately 250 ⁇ M while the IC50 index for this compound for the native strain of the virus is approximately 3 ⁇ M, the detection of resistance is limited by toxicity. A range of four serial dilutions, starting at 200 ⁇ M, has been used for abacavir, allowing the detection of up to 60 times more resistance.
  • IC50 is used rather than the IC90 index because detection of the IC90 index for resistant viruses could require toxic compound levels for most reverse transcriptase inhibitors.
  • the method of analysis to determine the susceptibility of the HIV virus to reverse transcriptase inhibitors gives a Standard Deviation of the geometric mean for 20 tests between 1.78 (abacavir) and 2.7 (D4T and AZT). Median standard deviation for reverse transcriptase inhibitors (RTIs) tested
  • IR Resistance Index
  • NL43 is a reference virus suitable for comparison with clinical isolates
  • a panel of samples taken from patients with ordinary treatment was tested on 3 RVA replicates for their susceptibility to reverse transcriptase inhibitors.
  • the median ICso found for 22 viruses tested tends to be slightly higher than that found for the NL43 virus with a median IR around 0.92 (for stavudine) and 1.22 (lamivudine).
  • the IR is below the defined limit of 5 on the total of inhibitors for most of the samples tested, the range of IR seems wide, especially for non-nucleoside inhibitors.
  • the inter-test variation for the determination of the susceptibility of HIV viruses to reverse transcriptase inhibitors indicates that in some cases there is a difference greater than 5 between the maximum IR and the minimum IR found for repeated determinations.
  • the Resistance Index is the ratio of the IC 50 in the sample compared to that of NL43 determined in parallel.
  • Reverse transcriptase inhibitors show agreement with the genotypic profiles of the samples.
  • Sample R2 which shows a high degree of resistance compared to all the compounds tested, has multiple mutations including those of the multi-compound resistance complex (62V, 751, 77L, 116Y and 151M) which confers resistance to RTI nucleotides, 3TC resistance associated with the 184V mutation and mutations known to induce reduced susceptibility to NNRTI (181C, 190A).
  • the multi-compound resistance complex 62V, 751, 77L, 116Y and 151M
  • Sample R3 shows a high resistance level to 3TC, again modulated by the mutation 184V, with a considerable variation of the IR for AZT which probably reflects the inconsistent nature of the suppression of resistance induced by 215F by 184V.
  • the R5 sample remains sensitive to AZT despite a 41L mutation and a 215Y mutation because of the effects of the 1001 mutation which, in combination with 103N, is responsible for the high resistance levels observed with efavirenz and nevirapine.
  • step (b) The recombinations obtained using for the amplification of step (b) the pair of primers FuA: 5 ⁇ AGCAATGTATGCCCCTCCCAT3 '(SEQ ID No: 23) and FuB: 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No: 24) followed by a second amplification, carried out with the primer: FuC: 5 ⁇ TATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3 '(SEQ ID No: 25) and a mixture of the following primers:
  • FuDl 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26)
  • FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27) are very effective.
  • a viral production corresponding to 50-400 ng / ml of p24 is obtained after transfection.
  • For the infection of the target cells between 0.5 and 5 ng p24 / well (96-well plates) are used. The increase in optical density obtained after infection of target cells is linear if the infection is carried out under these conditions
  • fusion inhibitors In order to validate the analysis method concerning the susceptibility of HIV viruses to fusion inhibitors, two fusion inhibitors were used: a peptide derived from the distal helix sequence in HIV gp41 (called DP178 or T20) and a derivative of betulinic acid (RPR103611). For each inhibitor, the reduction in sensitivity of one or more resistant viruses (previously identified by other authors) compared to two reference viruses: a primary plasma virus T5A1 and a virus suitable for in vitro culture (LAI) a been performed. All viruses were produced by recombination.
  • the highly resistant DIM virus shows an increase in the IC50 value of 80 times compared to T5A1 and more than 100 times compared to LAI.
  • the partially resistant NL4.3 virus is characterized by an increase in IC50 of 10 times compared to T5A1 and of 12.5 times compared to LAI.
  • V.1.1 Onlytprnni nat i on de la susr.ppt i hi 1 it é a VTH pi asmat i qip à l f inhihifpnr dp fusi on T? 0
  • Viral RNA is extracted from the plasmas of HIV positive patients.
  • a first PCR amplification is carried out with the pair of primers ED3_E01-.
  • a second amplification is carried out by PCR with the pair of primers E10_FuB to obtain a DNA fragment of 2200 base pairs s' extending between residues 6322 and 8522.
  • the transfection of a first cellular host is carried out with: - the nucleic acids obtained after the second amplification.
  • the retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extacellular portion of the gp41 of the HIV envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive and comprising a unique restriction site MluI.
  • the first cell host is cultured under conditions allowing the production of viral particles.
  • Infection is carried out with the viral particles produced in the preceding step, of a second cellular host (comprising a marker gene which can be activated following viral infection) in the presence of an increasing dose of T20 fusion inhibitor.
  • the expressed marker is quantified in order to highlight the level of susceptibility of HIV viruses present in biological samples to the T20 fusion inhibitor.
  • the increase in the IC50 relative to LAI and to T5A1 is greater than 100 times.
  • step (b) The recombinations obtained using for the amplification of step (b) a pair of primers NEU- A: 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3 '(SEQ ID No: 17) and
  • FuB 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification, with the primers:
  • NEU-C 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3 '(SEQ ID No: 18) and a mixture of primers FuDl: 5' TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '
  • a viral production corresponding to 50-400 ng / ml of p24 after transfection is obtained.
  • For the infection of the target cells between 0.5 and 5 ng p24 / well (96-well plates) are used.
  • the increase in optical density obtained after infection of target cells is linear if the infection is carried out under these conditions.
  • a first PCR amplification is carried out with the pair of primers FITA and PROA-
  • a second PCR amplification is carried out with the pair of primers FITB and PROB- to obtain a DNA fragment of 1488 base pairs extending between residues 1237 and 2725.
  • the transfection of a first cellular host is carried out with: the nucleic acids obtained after the second amplification. - the retroviral vector deleted from a region coding for part of Gag and all of the protease and comprising a unique MluI restriction site.
  • the culture of the first cell host is carried out under conditions allowing the production of viral particles.
  • the quantity of recombinant viral particles in the supernatant of this culture is measured by an Elisa test assaying the quantity of p24 antigen.
  • Infection is carried out with the viral particles produced in the preceding step, of a second cellular host (comprising a marker gene which can be activated following viral infection), by increasing dilutions of the viral supernatant
  • Quantification of the expressed marker is carried out in order to demonstrate the level of infectivity of the recombinant virus.
  • the replicative capacity of the recombinant virus is calculated by establishing a regression line from the measured values and retaining the slope of this line.
  • the viral replicative capacity is expressed relative to that of a laboratory reference virus or relative to the recombinant virus carrying the viral sequences originating from the same patient before establishment of the treatment and before development of the resistance. The results obtained are illustrated in FIG. 6 in the appendix.
  • the L1, L2 and L3 viruses correspond to recombinant viruses carrying protease sequences obtained at three different times in the same patient.
  • the L1 virus carries protease sequences obtained before treatment. Each point corresponds to the optical density measured after infection of P4 indicator cells by a dilution of each of the 3 viruses.
  • the replicative capacity of L2 is expressed by the ratio of the slope of L2 to that of Ll, and the replicative capacity of L3 by the ratio of the slope of L3 to that of Ll.
  • the reference virus is the pre-therapeutic virus L1. When the pre-therapeutic virus is lacking, the replicative capacity of a patient virus can be expressed relative to a laboratory reference virus such as pNL4-3.

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Abstract

The invention concerns a method for analysing characteristics exhibited by certain virus strains, in particular, the human immunodeficiency viruses, using the construct of a recombinant virus obtained by homologous recombining. The invention also concerns a kit comprising primers, vectors, cell hosts, products and reagents necessary for producing PCR amplification, and the products and reagents for detecting a marker, for implementing the inventive method.

Description

NOUVELLE METHODE D'ANALYSE DES CARACTERISTIQUES PHENOTYPIQUES DES VIRUS DE L' IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH)NOVEL METHOD FOR THE ANALYSIS OF PHENOTYPIC CHARACTERISTICS OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV)
La présente invention concerne une méthode d'analyse des caractéristiques phénotypiques qui présentent certaines souches de virus, notamment de virus VIH.The present invention relates to a method for analyzing the phenotypic characteristics which exhibit certain strains of virus, in particular of HIV virus.
Des tests génotypiques qui sont rapides et largement disponibles pour détecter la présence de mutations dans les gènes viraux ont été développées par exemple pour détecter des mutations présentes dans les gènes codant pour la protéase ou la transcriptase inverse de VIH. Bien que certaines mutations aient été associées à un inhibiteur particulier de l'activité virale, bien d'autres sont associés avec le traitement par plusieurs molécules. De plus, avec le développement de nouvelles molécules d'inhibiteurs, le génotypage de variantes des virus qui échappent aux traitements devient de plus en plus complexe. Ceci rend difficile l'évaluation et le fait de savoir vis-à-vis de quels inhibiteurs les virus deviennent résistants ou conservent encore une légère susceptibilité. Dans ces circonstances, la présence et l'accumulation de mutations de résistance peuvent sûrement constituer un bon indice de l'évolution de la résistance, mais la simple détection de ces mutations au niveau génotypique ne suffit plus pour évaluer quantitativement le niveau de résistance, un paramètre qui s'avère crucial pour optimiser les orientations thérapeutiques de patients chez qui la thérapie antivirale est défaillante. Les caractéristiques phénotypiques des virus sont liées aux divers aspects du comportement viral et directement impliquées dans des nombreuses interactions entre lesdits virus et leur environnement.Genotypic tests which are rapid and widely available for detecting the presence of mutations in the viral genes have been developed for example to detect mutations present in the genes coding for the protease or the reverse transcriptase of HIV. Although some mutations have been associated with a particular inhibitor of viral activity, many others are associated with treatment with multiple molecules. In addition, with the development of new inhibitor molecules, the genotyping of variants of viruses that escape treatment becomes more and more complex. This makes it difficult to assess and know against which inhibitors the viruses become resistant or still retain a slight susceptibility. Under these circumstances, the presence and accumulation of resistance mutations can surely constitute a good index of the evolution of resistance, but the simple detection of these mutations at the genotypic level is no longer sufficient to quantitatively assess the level of resistance, a a parameter which is crucial for optimizing the therapeutic orientations of patients in whom antiviral therapy is failing. The phenotypic characteristics of viruses are linked to various aspects of viral behavior and directly involved in numerous interactions between said viruses and their environment.
Seuls les tests phénotypiques, qui mesurent directement dans le milieu de culture la modification de la caractéristique phénotypique du virus, telle que l'inhibition de l'activité virale, par exemple en présence de composés inhibiteurs de ladite activité virale, fournissent un indice quantitatif de la résistance .Only phenotypic tests, which measure directly in the culture medium, the modification of the phenotypic characteristic of the virus, such as the inhibition of viral activity, for example in the presence of compounds inhibiting said viral activity, provide a quantitative index of resistance .
D'autres caractéristiques phénotypiques dont l'analyse s'avère intéressant, notamment d'un point de vue médical, sont celles qui confèrent à un virus sa résistance vis-à-vis des agents inhibiteurs susceptibles de bloquer au moins un mécanisme impliqué dans l'activité virale, celles qui confèrent à un virus sa capacité réplicative, celles qui confèrent à un virus son tropisme envers des cibles particulières ou encore celles qui confèrent à un virus son aptitude à être neutralisé par des molécules, tels des anticorps, des chimiokines ou des inhibiteurs .Other phenotypic characteristics whose analysis proves to be interesting, in particular from a medical point of view, are those which confer on a virus its resistance towards inhibitory agents capable of blocking at least one mechanism involved in the viral activity, those which confer on a virus its replicative capacity, those which confer on a virus its tropism towards particular targets or those which confer on a virus its aptitude to be neutralized by molecules, such as antibodies, chemokines or inhibitors.
La présente invention permet de tester plusieurs caractéristiques phénotypiques distinctes mais complémentaires du VIH, à l'aide d'une méthode rapide reposant sur la reconstruction d'un virus recombinant à partir de prélèvements effectués chez des patients infectés et faisant intervenir un cycle unique de réplication virale. Cette invention s'inscrit dans une démarche d'aide à la décision et d'optimisation de la stratégie thérapeutique chez les patients infectés par le VIH se trouvant dans une situation d' échec virologique de traitement antirétroviral, ou encore chez des patients naïfs de traitement antirétroviral. Seule une connaissance complète des différentes caractéristiques phénotypiques du virus peut aider efficacement le clinicien à prendre les décisions thérapeutiques les mieux adaptées à la situation particulière de son patient .The present invention makes it possible to test several distinct but complementary phenotypic characteristics of HIV, using a rapid method based on the reconstruction of a recombinant virus from samples taken from infected patients and involving a single cycle of replication. viral. This invention is part of a decision support and optimization process for the therapeutic strategy in patients infected with HIV who are in a situation of virological failure of antiretroviral treatment, or in patients naive in antiretroviral treatment. Only a complete knowledge of the different phenotypic characteristics of the virus can effectively help the clinician to make the therapeutic decisions best suited to the particular situation of his patient.
Parmi les caractéristiques phénotypiques du virus VIH dont l'analyse présente un intérêt particulier du point de vue médical, se trouvent celles liées à l'expression des gènes, susceptibles de subir au moins une mutation, situés dans les régions GAG, ENV, ou POL du génome viral, telles que celles ci-dessous énumérées :Among the phenotypic characteristics of the HIV virus whose analysis is of particular interest from a medical point of view, are those linked to the expression of genes, capable of undergoing at least one mutation, located in the GAG, ENV, or POL regions. of the viral genome, such as those listed below:
I Tnfρ<-t i vi té, r-.a ar-.i t repli na i e ! I Tnfρ <-ti vi té, r-.a ar-.it repli na ie!
Ces caractéristiques phénotypiques des virus VIH peuvent être liées à la fonction de toutes les régions du génome virale, qu'il s'agisse des parties codant pour des protéines ou des régions intervenant dans les différents mécanismes ou étapes du cycle réplicatif viral. En particulier il est important d'évaluer l'effet produit par les mutations dans le gènes codant pour la protéase, la transcriptase inverse, l'intégrase ou l'enveloppe sur la réplication des virus et tout particulièrement chez les virus ayant développé une résistance aux agents antiviraux. Son analyse permet de mesurer la capacité réplicative d'un virus, aussi appelée infectivité ou " fitness ".These phenotypic characteristics of HIV viruses can be linked to the function of all regions of the viral genome, whether they are the parts coding for proteins or regions involved in the various mechanisms or stages of the viral replicative cycle. In particular, it is important to evaluate the effect produced by the mutations in the genes coding for the protease, the reverse transcriptase, the integrase or the envelope on the replication of the viruses and very particularly in the viruses having developed resistance to antiviral agents. Its analysis makes it possible to measure the replicative capacity of a virus, also called infectivity or "fitness".
I I .qn s re t i h i 1 i t é / R é g i .g t a n i-p aux i nh i h i 1- pn r.q II .qn s re tihi 1 it é / R égi .gtan ip aux i nh ihi 1- pn rq
Cette caractéristique phénotypique des virus VIH est liée à l'expression d'une partie de la région POL codant pour la transcriptase inverse. Son analyse permet l'ajustement des traitements antirétroviraux par les analogues nucleosidiques ou les inhibiteurs de transcriptase inverse non nucleosidiques (NNRTI).This phenotypic characteristic of HIV viruses is linked to the expression of part of the POL region coding for reverse transcriptase. Its analysis allows the adjustment of antiretroviral treatments with nucleoside analogs or non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTI).
III Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs d' intégrase .III Susceptibility / Resistance to integrase inhibitors.
Cette caractéristique phénotypique des virusThis phenotypic characteristic of viruses
VIH est liée à l'expression d'une partie de la région POL codant pour l' intégrase. Son analyse fournit des indications pour l'ajustement des traitements antirétroviraux par les inhibiteurs d' intégrases .HIV is linked to the expression of part of the POL region coding for integrase. Its analysis provides indications for the adjustment of antiretroviral treatments by integrase inhibitors.
IV. Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs d'entrée du virus dans la cellule cible.IV. Susceptibility / Resistance to inhibitors of entry of the virus into the target cell.
Cette caractéristique phénotypique des virusThis phenotypic characteristic of viruses
VIH est liée à l'expression de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH et en particulier à l'expression de la sous-unité transmembranaire de ladite glycoprotéine codée par une partie du gène ENV.HIV is linked to the expression of the HIV envelope glycoprotein and in particular to the expression of the transmembrane subunit of said glycoprotein encoded by a part of the ENV gene.
L' analyse de cette caractéristique phénotypique permet la mise en évidence de l'action des agents inhibiteurs qui bloquent la fusion de la membrane virale avec la membrane de la cellule cible.The analysis of this phenotypic characteristic allows the demonstration of the action of inhibitory agents that block the fusion of the viral membrane with the membrane of the target cell.
V Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs ciblant les corecepteurs des virus VIH.V Susceptibility / Resistance to inhibitors targeting HIV virus co-receptors.
Cette caractéristique phénotypique est liée également à l'expression d'au moins une partie de la région ENV des virus VIH qui code pour des polypeptides qui se participent à la liaison avec des corecepteurs de la cellule cible. L'interaction enveloppe/corécepteur permet l'entrée du virus VIH dans ladite cellule cible.This phenotypic characteristic is also linked to the expression of at least part of the ENV region of HIV viruses which codes for polypeptides which participate in the binding with coreceptors of the target cell. The envelope / co-receptor interaction allows the entry of the HIV virus into said target cell.
Son analyse permet de mesurer la résistance des virus VIH à l'action des inhibiteurs bloquant les corecepteurs utilisés par le VIH pour effectuer son entrée dans la cellule cible.Its analysis makes it possible to measure the resistance of HIV viruses to the action of inhibitors blocking the receptors used by HIV to effect its entry into the target cell.
Les agents inhibiteurs interfèrent avec le co-récepteur en inhibant son interaction avec l'enveloppe du VIH.Inhibitory agents interfere with the co-receptor by inhibiting its interaction with the HIV envelope.
En particulier il est important d'évaluer l'effet des mutations dans la région ENV qui modifientIn particular it is important to assess the effect of mutations in the ENV region which modify
1' interaction de certaines régions de la protéine d'enveloppe avec les récepteurs CXCR4 ou CCR5 des cellules cible des VIH.The interaction of certain regions of the envelope protein with the CXCR4 or CCR5 receptors of the target cells of HIV.
VI TropismeVI Tropism
Cette caractéristique phénotypique est aussi liée à l'expression d'au moins une partie de la région ENV codant pour des polypeptides de l'enveloppe des virus VIH, qui participent à la liaison avec un ou plusieurs récepteurs de la cellule cible, en particulier avec les corecepteurs CXCR4 ou CCR5This phenotypic characteristic is also linked to the expression of at least part of the ENV region coding for polypeptides of the envelope of HIV viruses, which participate in the binding with one or more receptors of the target cell, in particular with CXCR4 or CCR5 coreceptors
Son analyse permet de mesurer in vivo la capacité du virus VIH à utiliser lesdits récepteurs, notamment CXCR4 ou CCR5, qui sont exprimés de façon différente dans divers types cellulaires et permet de savoir si le virus utilise l'un ou l'autre des récepteurs, ou les deux. Les indications fournies par cette analyse permettent de déduire le comportement viral dans certains types de cellules, cibles naturelles des VIH.Its analysis makes it possible to measure in vivo the capacity of the HIV virus to use said receptors, in particular CXCR4 or CCR5, which are expressed differently in various cell types and makes it possible to know whether the virus uses one or the other of the receptors, or both. The indications provided by this analysis make it possible to deduce the viral behavior in certain types of cells, natural targets of HIV.
VII Virulence. Cette caractéristique phénotypique est aussi liée à l'expression de tout ou partie de la région ENV qui code pour les polypeptides d'enveloppe des virus VIH.VII Virulence. This phenotypic characteristic is also linked to the expression of all or part of the ENV region which codes for the envelope polypeptides of HIV viruses.
Son analyse permet d'évaluer le pouvoir cytopathogène d'un virus VIH.Its analysis makes it possible to evaluate the cytopathogenic power of an HIV virus.
VIII Capacité neutralisante.VIII Neutralizing capacity.
Cette caractéristique phénotypique est aussi liée à l'expression des protéines d'enveloppe des virus VIH. Son analyse permet d' évaluer la susceptibilité des virus à l'action inhibitrice des anticorps ou des substances naturellement présentes dans l'organisme et présentes dans le sérum ou dans d'autres fluides . Les premiers tests pour détecter par exemple la caractéristique phénotypique de résistance des virus VIH aux traitements antiviraux ont été effectués en utilisant des isolats primaires et des lymphocytes du sang périphérique (PBL) stimulés par de la phytoagglutinine (PHA) selon une procédure laborieuse et difficilement reproductible. Une alternative innovante à ces tests, un test de virus recombinant, ci-après nommé RVA, a été proposée par Kellam et Larder en 1994. Cette méthode d' analyse RVA, mesurait la résistance d'un virus recombinant portant la transcriptase inverse isolé du plasma d'un patient porteur du virus par co-transfection des séquences de celui-ci dûment amplifiées par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR), avec un clone de virus obtenu en laboratoire, lequel est délété de sa transcriptase inverse et est compétent pour la réplication dans une variété de lignées cellulaires bien établies .This phenotypic characteristic is also linked to the expression of the envelope proteins of HIV viruses. Its analysis makes it possible to assess the susceptibility of viruses to the inhibitory action of antibodies or substances naturally present in the body and present in serum or in other fluids. The first tests to detect, for example, the phenotypic characteristic of resistance of HIV viruses to antiviral treatments were carried out using primary isolates and peripheral blood lymphocytes (PBL) stimulated by phytoagglutinin (PHA) according to a laborious and difficult to reproduce procedure. . An innovative alternative to these tests, a recombinant virus test, hereinafter called RVA, was proposed by Kellam and Larder in 1994. This RVA analysis method measured the resistance of a recombinant virus carrying reverse transcriptase isolated from the plasma of a patient carrying the virus by co-transfection of the sequences thereof duly amplified by a polymerase chain reaction (PCR). ), with a clone of virus obtained in the laboratory, which is deleted from its reverse transcriptase and is competent for replication in a variety of well-established cell lines.
Plusieurs modifications de cette méthode ont maintenant été décrites (Boucher, C, Keulen, W., Bommel, T., Nijhuis, M., Jong, D., Jong, M., SChipper, P. and Back, N., K. (1996) « HIV-1 drug susceptibility détermination by using recombinant viruses generated from patient sera tested in a cell-killing assay.Several modifications of this method have now been described (Boucher, C, Keulen, W., Bommel, T., Nijhuis, M., Jong, D., Jong, M., SChipper, P. and Back, N., K . (1996) "HIV-1 drug susceptibility determination by using recombinant viruses generated from patient sera tested in a cell-killing assay.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy" 40(10), 2404-2409)Antimicrobial Agents and Chemotherapy "40 (10), 2404-2409)
(Shi, C. and Mellors, J.W. (1997) "A recombinant retroviral system for rapid in vivo analysis of human immunodeficiency virus type 1 susceptibility to reverse transcriptase inhibitors". Antimicrob Agents Chemother 41(12), 2781-5) (Hertogs, K., de Bethune, M. P., Miller, V., Ivens, T., Schel, P., Van Cauwenberge, A., Van Den Eynde, C, Van Gerwen, V., Azijn, H., Van Houtte, M., Peeters, F., Stasze ski, S., Conant, M., Bloor, S., Kemp, S., Larder, B. and Pauwels, R. (1998) "A rapid method for simultaneous détection of phenotypic résistance to inhibitors of protéase and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolâtes from patients treated with antirétroviral drugs". Antimicrob Agents Chemother 42(2), 269-76.) (Hecht, F. M., Grant, R.M., Petropoulos, C.J., Dillon, B., Chesney, M. A., Tian, H., Hellmann, N.S., Bandrapalli, N.I., Digilio, L., Branson, B. and Kahn, J.O. (1998) "Sexual transmission of an HIV-1 variant résistant to multiple reverse- transcriptase and protéase inhibitors". N Engl J Med 339(5), 307-11) (Médina, D.J., Tung, P.P., Nelson, C.J., Sathya, B., Casareale, D. and Strair, R.K. (1998) "Characterization and use of a recombinant retroviral system for the analysis of drug résistant HIV". J Virol Methods 71 (2) , 169-76) .(Shi, C. and Mellors, JW (1997) "A recombinant retroviral system for rapid in vivo analysis of human immunodeficiency virus type 1 susceptibility to reverse transcriptase inhibitors". Antimicrob Agents Chemother 41 (12), 2781-5) (Hertogs, K., de Bethune, MP, Miller, V., Ivens, T., Schel, P., Van Cauwenberge, A., Van Den Eynde, C, Van Gerwen, V., Azijn, H., Van Houtte, M ., Peeters, F., Stasze ski, S., Conant, M., Bloor, S., Kemp, S., Larder, B. and Pauwels, R. (1998) "A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs ". Antimicrob Agents Chemother 42 (2), 269-76.) (Hecht, FM, Grant, RM, Petropoulos, CJ, Dillon , B., Chesney, MA, Tian, H., Hellmann, NS, Bandrapalli, NI, Digilio, L., Branson, B. and Kahn, JO (1998) "Sexual transmission of an HIV-1 variant resistant to multiple reverse- transcriptase and protease inhibitors" . N Engl J Med 339 (5), 307-11) (Medina, DJ, Tung, PP, Nelson, CJ, Sathya, B., Casareale, D. and Strair, RK (1998) "Characterization and use of a recombinant retroviral system for the analysis of drug resistant to HIV ". J Virol Methods 71 (2), 169-76).
Cependant, la plupart de ces systèmes recombinants présentent des inconvénients car , comme pour la méthode utilisant des PBMC, la production d'une réserve de particules infectieuses exprimant une caractéristique phénotypique particulière que l'on cherche à détecter et à mesurer nécessite une amplification du virus par croissance exponentielle des cellules lymphocytaires . Le virus est alors soumis à des dérives génétiques pendant sa réplication et peut perdre des mutations qui sont essentielles pour l'expression de la caractéristique phénotypique recherchée modifiant ainsi la fiabilité de la méthode.However, most of these recombinant systems have drawbacks because, as for the method using PBMCs, the production of a reserve of infectious particles expressing a particular phenotypic characteristic which one seeks to detect and measure requires an amplification of the virus. by exponential growth of lymphocyte cells. The virus is then subjected to genetic derivatives during its replication and can lose mutations which are essential for the expression of the phenotypic characteristic sought, thus modifying the reliability of the method.
Un autre inconvénient pour déceler par exemple une caractéristique phénotypique de résistance qui est présent dans les méthodes d'analyse de l'art antérieur provient du fait que la présence simultanée de plusieurs mutations susceptibles de conférer une résistance vis-à-vis des différents inhibiteurs rétroviraux réduit la capacité réplicative du virus.Another drawback for detecting, for example, a phenotypic characteristic of resistance which is present in the methods of analysis of the prior art stems from the fact that the simultaneous presence of several mutations capable of conferring resistance with respect to the various retroviral inhibitors reduces the replicative capacity of the virus.
Les inventeurs ont développé une nouvelle méthode d'analyse d'une caractéristique phénotypique des virus VIH qui ne nécessite qu'un cycle unique de réplication. Cette méthode ne nécessitant qu'un seul cycle de réplication virale est mise en œuvre par le choix des conditions de culture des virus recombinants obtenues.The inventors have developed a new method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses which requires only a single replication cycle. This method requiring only a single cycle of viral replication is implemented by the choice of culture conditions for the recombinant viruses obtained.
Ces conditions de culture concernent, soit le contrôle du temps de culture, choisi pour empêcher la réplication virale au delà du premier cycle, ce temps de culture est compris entre 12 heures à 72 heures, de préférence de 24 heures à 48 heures.These culture conditions relate to either the control of the culture time, chosen to prevent viral replication beyond the first cycle, this culture time is between 12 hours to 72 hours, preferably 24 hours to 48 hours.
Les conditions de culture concernent également le choix des cellules du premier système cellulaire, elles sont choisies de manière à ce qu'elles ne soient pas permissives à l'infection virale, par exemple de telles cellules ne possèdent pas le récepteur CD4 nécessaire à l'entrée du virus VIH dans la cellule. Des exemples de telles cellules sont les cellules HeLa ou 293T.The culture conditions also relate to the choice of cells of the first cellular system, they are chosen so that they are not permissive to viral infection, for example such cells do not have the CD4 receptor necessary for entry of the HIV virus into the cell. Examples of such cells are HeLa or 293T cells.
Enfin, ces conditions de culture concernent aussi les virus recombinants construits selon la méthode de l'invention, qui présentent une déficit en protéine d'enveloppe. Ces virus, une fois produits dans le premier système cellulaire, sont de fait incapables de re- infecter les cellules de ce premier système cellulaire.Finally, these culture conditions also relate to the recombinant viruses constructed according to the method of the invention, which have a deficit in envelope protein. These viruses, once produced in the first cellular system, are in fact incapable of re-infecting the cells of this first cellular system.
Cette méthode d'analyse est basée sur la construction d'un virus recombinant (RAV) obtenu par co- transfection et recombinaison homologue avec : a) les séquences d'ADN obtenues à partir d'unThis analysis method is based on the construction of a recombinant virus (RAV) obtained by co-transfection and homologous recombination with: a) the DNA sequences obtained from a
VIH à analyser susceptibles de comprendre des mutations susceptibles de modifier la caractéristique phénotypique recherchée, lesdites séquences étant extraites d'un milieu biologique tel que le plasma, le sérum, la salive, le sperme ou autres sécrétions, d'un patient porteur dudit virus, b) un premier vecteur présentant une délétion spécifique des séquences permettant la réplication du VIH ainsi qu'une délétion de tout ou partie de la séquence conférant au VIH la caractéristique phénotypique recherchée et c) un deuxième vecteur, par exemple un plasmide, comprenant les séquences complétant celles nécessaires à la réplication dudit virus et qui sont absentes du premier vecteur.HIV to be analyzed likely to include mutations likely to modify the phenotypic characteristic sought, said sequences being extracted from a biological medium such as plasma, serum, saliva, sperm or other secretions, from a patient carrying said virus, b) a first vector having a specific deletion of sequences allowing replication of HIV as well as a deletion of any or part of the sequence conferring on HIV the phenotypic characteristic sought and c) a second vector, for example a plasmid, comprising the sequences completing those necessary for the replication of said virus and which are absent from the first vector.
La méthode développée par les inventeurs est rapide, elle nécessite environ sept jours pour être réalisée et peut dons être utilisé pour des déterminations de routine tels que la mesure de la susceptibilité des patients infectés par des VIH aux inhibiteurs de l'activité virale. Ainsi, les inventeurs ont déjà décrit dans le brevet US 6 103 462 une première application de cette méthode d'analyse, basée sur la formation d'un virus recombinant particulier, pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à des inhibiteurs de la protéase.The method developed by the inventors is rapid, it requires approximately seven days to be carried out and can therefore be used for routine determinations such as measuring the susceptibility of patients infected with HIV to inhibitors of viral activity. Thus, the inventors have already described in US Pat. No. 6,103,462 a first application of this analysis method, based on the formation of a particular recombinant virus, to determine the susceptibility of an HIV virus to protease inhibitors .
Les nouvelles méthodes d'analyse mises en œuvre dans le cadre de la présente invention VIH, sont basées sur la détermination de caractéristiques phénotypiques des virus VIH associées à des mutations susceptibles d' être présentes au moins dans un gène choisi parmi le groupe comprenant les gènes gag, pol, protéase, transcriptase inverse, RNAse H, intégrase, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef, séquences cis-actives, LTR, séquences de dimérisation, séquences régulatrices de l'épissage, RRE au moyen de virus recombinants ad-hoc.The new methods of analysis implemented within the framework of the present invention HIV, are based on the determination of phenotypic characteristics of the HIV viruses associated with mutations likely to be present at least in a gene chosen from the group comprising the genes gag, pol, protease, reverse transcriptase, RNAse H, integrase, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef, cis-active sequences, LTR, dimerization sequences, splicing regulatory sequences, RRE using ad-hoc recombinant viruses.
L' invention concerne donc une méthode d'analyse d'une caractéristique phénotypique des virus VIH présents dans un échantillon biologique d'un patient, ladite caractéristique phénotypique résultant d'une ou plusieurs mutations du génome viral susceptibles d'influencer l'infection virale, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) l'extraction des acides nucléiques contenus dans un échantillon biologique, b) au moins une amplification par PCR d'un segment des acides nucléiques de l'étape (a), chacune avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique du génome viral susceptible de porter au moins une mutation, c) la préparation d'un vecteur comprenant les parties d'un génome d'un virus VIH nécessaires à la réplication virale à l'exception du segment amplifié à l'étape (b) et éventuellement à l'exception du gène codant pour la protéine d'enveloppe, d) la transfection d'un premier hôte cellulaire avec : les acides nucléiques obtenus à l'étape (b),The invention therefore relates to a method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses present in a biological sample of a patient, said phenotypic characteristic resulting from one or more mutations in the viral genome capable of influencing viral infection, characterized in that it comprises: a) the extraction of the nucleic acids contained in a biological sample, b) at least one amplification by PCR of a segment of the nucleic acids of step (a), each with a pair d primers framing a nucleic acid sequence of the viral genome capable of carrying at least one mutation, c) the preparation of a vector comprising the parts of a genome of an HIV virus necessary for viral replication with the exception of segment amplified in step (b) and optionally with the exception of the gene coding for the envelope protein, d) the transfection of a first cellular host with: the nucleic acids obtained with et ape (b),
- le vecteur préparé à l'étape (c) ,- the vector prepared in step (c),
- éventuellement un second vecteur comprenant un gène codant pour une protéine d' enveloppe si le gène d'enveloppe est délété du vecteur préparé à l'étape (c), pour obtenir par recombinaison homologue un virus chimérique, e) la culture dudit premier hôte cellulaire dans des conditions permettant de produire des particules virales au cours d'un seul cycle de réplication, f) l'infection par les particules virales obtenues à l'étape (e) d'au moins un second hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH ou un virus pseudotypé VIH et comportant éventuellement un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, et g) la détection et/ou la quantification du marqueur exprimé à l'étape (f) afin de mettre en évidence au moins une caractéristique phénotypique des virus VIH présents dans l'échantillon biologique.- optionally a second vector comprising a gene coding for an envelope protein if the envelope gene is deleted from the vector prepared in step (c), to obtain, by homologous recombination, a chimeric virus, e) culturing said first cellular host under conditions allowing viral particles to be produced during a single replication cycle, f) infection with the viral particles obtained in step (e) of at least one second cell host capable of being infected with an HIV virus or an HIV pseudotyped virus and possibly comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, and g) detection and / or quantification of the marker expressed in step (f) in order to highlight at least one phenotypic characteristic of the HIV viruses present in the biological sample.
Plus particulièrement, l'amplification parMore particularly, the amplification by
PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique comprenant tout ou partie d'une région du génome virale choisie parmi: gag, pol, protéase, transcriptase inverse, RNAse H, intégrase, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef, séquences cis-actives, LTR, séquences de dimérisation, séquences régulatrices de l'épissage ou l'élément de réponse de Rev (RRE) .PCR of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence comprising all or part of a region of the viral genome chosen from: gag, pol, protease, reverse transcriptase, RNAse H, integrase , vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nave, cis-active sequences, LTR, dimerization sequences, splicing regulatory sequences or the Rev response element (RRE).
Selon un mode de mise en œuvre particulier de la méthode d'analyse de l'invention, l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique codant pour une partie de la protéine gag du virus de l' immunodeficience humain et une séquence d' acide nucléique codant pour la protéase, susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéase et, en ce que le vecteur de l'étape (c) est construit à partir d'un génome d'un virus VIH où tout ou partie du gène codant pour la protéase est délété.According to a particular embodiment of the analysis method of the invention, the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for a part of the gag protein of the human immunodeficiency virus and a nucleic acid sequence coding for the protease, capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease and, in that the vector of step (c ) is built from a genome of an HIV virus where all or part of the gene encoding the protease is deleted.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) selon la méthode d'analyse de l'invention, d'une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéase est effectuée avec une paire d' amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences Fit A - :(5' TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No : 1) et Pro A- : (5' GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3' 3') (SEQ ID No : 2), ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de la protéase portant la ou les mutations, suivie d'une deuxième amplification avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences : Fit B : (5' AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3') (SEQ ID No : 3) et Pro B- : (5' GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3') (SEQ ID No : 4), ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de la protéase portant la ou les mutationsAdvantageously, the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention, of a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences Fit A -: (5 'TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No: 1) and Pro A-: (5 'GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3 '3') (SEQ ID No: 2), or consisting of fragments thereof, or sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not modify essentially their capacity to hybridize the region of the protease gene carrying the mutation (s), followed by a second amplification with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: Fit B: ( 5 'AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3') (SEQ ID No: 3) and Pro B-: (5 'GGA GTA TTG TAT GGA TT T TCA GG 3 ') (SEQ ID No: 4), or consisting of fragments thereof, or sequences analogous thereto carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their ability to hybridize the protease gene region carrying the mutation (s)
Tout préférentiellement , l'amplification de l'étape (b) selon la méthode d'analyse de l'invention, d'une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéase est effectuée avec une paire d'amorces : Fit A - : (5' TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No : 1) etMost preferably, the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention, of a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease is carried out with a pair of primers: Fit A -: (5 'TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No: 1) and
Pro A- : (5' GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3 ' 3' ) (SEQ ID No : 2) , suivie d'une deuxième amplification avec une paire d' amorces :Pro A-: (5 'GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3' 3 ') (SEQ ID No: 2), followed by a second amplification with a pair of primers:
Fit B : (5' AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3') (SEQ ID No : 3) etFit B: (5 'AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3') (SEQ ID No: 3) and
Pro B- : (5' GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3' ) (SEQ ID No : 4) , pour obtenir un segment d'ADN de 1488 paires de bases, s' étendant entre les résidus 1237 et 2725 inclus, et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase du VIH-1 s' étendant des résidus 1505 à 2565 inclus, délété de la région d'enveloppe et comportant un site unique de restriction MluI .Pro B-: (5 'GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3') (SEQ ID No: 4), to obtain a DNA segment of 1488 base pairs, extending between residues 1237 and 2725 inclusive, and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the region of the pol reading frame coding for the HIV-1 protease extending from residues 1505 to 2565 inclusive, deleted from the envelope region and comprising a unique MluI restriction site.
Selon un deuxième mode de mise en œuvre particulier de la méthode d'analyse de l'invention, l'amplification par PCR de l'étape (b) de la méthode d'analyse selon l'invention est réalisée avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la transcriptase inverse, et la transfection de l'étape (c) est réalisée avec un premier vecteur construit à partir d'un génome d'un virus VIH où tout ou partie du gène codant pour la transcriptase inverse est délété .According to a second particular embodiment of the analysis method of the invention, the PCR amplification of step (b) of the analysis method according to the invention is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for reverse transcriptase, and the transfection of step (c) is carried out with a first vector constructed from a genome of a virus HIV where all or part of the gene coding for reverse transcriptase is deleted.
Avantageusement, l'amplification de l'étapeAdvantageously, the amplification of the step
(b) selon la méthode d'analyse de l'invention, avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la transcriptase inverse est effectuée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences MJ3 (5' AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No : 5) et RT-EXT (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No : 6), ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de la transcriptase portant au moins une mutation, suivie d'une deuxième étape d'amplification avec une paire d'amorces comprenant les séquences : A35 (5' TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3' ) (SEQ ID No : 7) et RT-IN (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No : 8) ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de la transcriptase inverse portant au moins une mutation.(b) according to the method of analysis of the invention, with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for reverse transcriptase is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences MJ3 (5 'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No: 5) and RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 6), or consisting of fragments thereof, or similar sequences thereof ci carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the transcriptase gene carrying at least one mutation, followed by a second amplification step with a pair of primers comprising the sequences: A35 (5 'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (SEQ ID No: 7) and RT-IN (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 8) or constituted by fragments thereof, or also sequences analogous thereto carrying mutations of one or more nucleus otides that do not change so essential capacity to hybridize the region of the reverse transcriptase gene carrying at least one mutation.
Tout préférentiellement, l'amplification de l'étape (b) selon la méthode d'analyse de l'invention, avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la transcriptase inverse est effectuée avec une paire d'amorces :Most preferably, the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention, with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the reverse transcriptase is performed with a pair of primers:
MJ3 (5' AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No : 5) etMJ3 (5 'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No: 5) and
RT-EXT (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No : 6) , suivie d'une deuxième étape d'amplification avec une paire d'amorces :RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 6), followed by a second amplification step with a pair of primers:
A35 (5' TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (SEQ ID No : 7) et RT-IN (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQA35 (5 'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (SEQ ID No: 7) and RT-IN (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ
ID No : 8) pour obtenir un segment d'ADN de 1530 paires de bases s' étendant au-delà du codon 93 de la région codant pour la protéase et au-delà du codon 503 de la région codant pour la polymèrase (POL) et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la transcriptase inverse du VIH-1, s' étendant des résidus 2618 à 2872 inclus, et comportant un site unique de restriction MluI.ID No: 8) to obtain a DNA segment of 1530 base pairs extending beyond codon 93 of the region coding for the protease and beyond codon 503 of the region coding for the polymerase (POL) and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the region of the pol reading frame coding for HIV-1 reverse transcriptase, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a single restriction site MluI.
Selon un troisième mode de mise en œuvre, l'invention a également pour objet une méthode d'analyse selon laquelle l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique codant pour une partie de la protéine gag, pour la protéase et pour une partie de la transcriptase inverse du virus de l' immunodeficience humaine susceptible de porter au moins une mutation dans la séquence d' acide nucléique codant pour la protéine gag, ou pour la protéase ou pour la transcriptase inverse .According to a third embodiment, the invention also relates to an analysis method according to which the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for part of the gag protein, for the protease and for part of the reverse transcriptase of the human immunodeficiency virus capable of carrying at least one mutation in the nucleic acid sequence coding for the gag protein, or for the protease or for reverse transcriptase.
Tout préférentiellement l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique codant pour une partie de la protéine gag, pour la protéase et pour une partie de la transcriptase inverse du virus de l' immunodeficience humaine susceptible de porter au moins une mutation dans la séquence d' acide nucléique codant pour la protéine gag, ou pour la protéase ou pour la transcriptase inverse est effectuée avec la paire d' amorces : gag+1 (5' AGGGGCAAATGGTACATCA 3') (SEQ ID No : 31) etMost preferably the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for a part of the gag protein, for the protease and for a part of the reverse transcriptase of the virus. human immunodeficiency likely to carry at least one mutation in the nucleic acid sequence coding for the gag protein, or for the protease or for the reverse transcriptase is carried out with the pair of primers: gag + 1 (5 'AGGGGCAAATGGTACATCA 3') (SEQ ID No: 31) and
RT-EX (SEQ ID n° 6) , suivie d'une deuxième étape d'amplification avec une paire d' amorces :RT-EX (SEQ ID No. 6), followed by a second amplification step with a pair of primers:
Fit B+ (SEQ ID No : 1) et RT-IN (SEQ ID No : 8) pour obtenir un segment d'ADN de 2825 paires de bases, s' étendant entre les résidus 1237 et 4062 et la transfection de l'étape (c) est réalisée avec un vecteur retroviral délété d'une partie du gène gag et des régions du cadre de lecture pol codant pour la protéase et une partie de la transcriptase inverse du VIH-1 s' étendant des résidus 1507 à 3870 inclus, délété dans la région d'enveloppe et comportant un site unique de restriction Nrul.Fit B + (SEQ ID No: 1) and RT-IN (SEQ ID No: 8) to obtain a DNA segment of 2825 base pairs, extending between residues 1237 and 4062 and the transfection of step ( c) is carried out with a retroviral vector deleted from part of the gag gene and regions of the pol reading frame coding for the protease and part of the HIV-1 reverse transcriptase extending from residues 1507 to 3870 inclusive, deleted in the envelope region and having a unique Nrul restriction site.
Avantageusement, le virus résultant de la transfection mentionnée ci-dessus peut être utilisé pour déterminer la capacité infective ou réplicative du virus pré&sentant des mutations dans la transcriptase inverse et/ou la protéase. La quantification des particules virales selon cette dernière méthode d'analyse es accomplie par la mesure de l'antigène p24. Il est a signaler qu'une méthode d'analyse similaire ne peut en aucun cas être effectuée en utilisant un vecteur délété simplement de la séquence de la transcriptase inverse puisque ces virus recombinants non-viables peuvent encore produire l'antigène p24. En construisant un virus recombinant présentant une délétion additionnelle de la région correspondante à la protéase, seulement les virus correctement recombinés produisent l'antigène p24 et permettent ainsi une mesure sûre et fiable des particules virales produites.Advantageously, the virus resulting from the above-mentioned transfection can be used to determine the infectious or replicative capacity of the virus exhibiting mutations in the reverse transcriptase and / or the protease. The quantification of the viral particles according to this last method of analysis is accomplished by the measurement of the p24 antigen. It should be noted that a similar analysis method can in no case be carried out using a vector deleted simply from the reverse transcriptase sequence since these non-viable recombinant viruses can still produce the p24 antigen. By constructing a recombinant virus with an additional deletion of the region corresponding to the protease, only correctly recombined viruses produce the p24 antigen and thus allow a safe and reliable measurement of the viral particles produced.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur de la transcriptase inverse, consistant à ajouter ou non ledit composé inhibiteur de la transcriptase inverse, éventuellement à des concentrations différentes, au deuxième hôte cellulaire, préalablement à l'infection de celui-ci par les particules virales obtenues à l'étape (e) , et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur de la transcriptase inverseThe invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to a reverse transcriptase inhibitor compound, comprising whether or not to add said reverse transcriptase inhibitor compound, optionally at different concentrations, to the second host. cell, prior to infection thereof with the viral particles obtained in step (e), and comprising in step (g) comparing the expression of the marker gene with and without a transcriptase inhibitor compound reverse
Selon un troisième mode de mise en oeuvre particulier de la méthode d'analyse de l'invention, l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour l' intégrase, et le vecteur de l'étape (c ) est un vecteur retroviral délété de tout ou partie du gène codant pour l' intégrase.According to a third particular embodiment of the analysis method of the invention, the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for integrase, and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from all or part of the gene coding for integrase.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) selon la méthode d'analyse de l'invention avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour l' intégrase est effectuée avec la paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences : INT B+ 5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3' (SEQ ID No: 9) et INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3' (SEQ ID No: 10), ou encore des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l' intégrase portant au moins une mutation, suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d'amorces : 'INT V+ 5' CACCCTAACTGACACAACAA3' (SEQ ID No: 11) et INT V- 5ΑAGGCCTTTCTTATAGCAGA3' (SEQ ID No: 12), ou encore des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l' intégrase portant au moins une mutationAdvantageously, the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for integrase is carried out with the pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: INT B + 5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3 '(SEQ ID No: 9) and INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3' (SEQ ID No: 10), or sequences similar to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not modify essentially their capacity to hybridize the region of the integrase gene carrying at least one mutation, followed by a second amplification step, with the pair of primers: ' INT V + 5' CACCCTAACTGACACAACAA3 '(SEQ ID No: 11 ) and INT V- 5ΑAGGCCTTTCTTATAGCAGA3 '(SEQ ID No: 12), or sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the gene region l integrase carrying at least one mutation
Tout préférentiellement , l'amplification de l'étape (b) selon la méthode d'analyse de l'invention avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour l' intégrase est effectuée avec la paire d' amorces :Most preferably, the amplification of step (b) according to the analysis method of the invention with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the integrase is carried out with the pair of primers:
INT B+ -5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3' (SEQ ID No: 9) etINT B + -5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3 '(SEQ ID No: 9) and
INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3' (SEQ ID No: 10), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d' amorces :INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3 '(SEQ ID No: 10), followed by a second amplification step, with the pair of primers:
INT V+ 5'CACCCTAACTGACACAACAA3' (SEQ ID No: 11) et INT V- 5' AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3' (SEQ ID No:INT V + 5'CACCCTAACTGACACAACAA3 '(SEQ ID No: 11) and INT V- 5' AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3 '(SEQ ID No:
12), pour obtenir un fragment d'ADN de 1460 paires de bases s' étendant des résidus 3950 à 5410 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région du cadre de lecture pol codant pour 1' intégrase du VIH-1 s' étendant des résidus 4228 à 5093 inclus et de la région codant pour l'enveloppe virale entre les positions 6343 et 7611 incluses.12), to obtain a DNA fragment of 1460 base pairs extending from residues 3950 to 5410 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region of the pol reading frame coding for the HIV-1 integrase extending from residues 4228 to 5093 inclusive and from the region coding for the viral envelope between positions 6343 and 7611 inclusive.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur de l' intégrase, consistant à ajouter ou non ledit composé inhibiteur de l' intégrase, éventuellement à des concentrations différentes, durant l'étape (e) , avant l'étape (f) et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur de l' intégrase.The invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to an integrase inhibitor compound, comprising whether or not to add said integrase inhibitor compound, optionally at different concentrations, during the course of the invention. step (e), before step (f) and comprising in step (g) comparing the expression of the marker gene with and without an integrase inhibitor compound.
Selon un quatrième mode particulier de mise en œuvre de la méthode d'analyse de l'invention l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d'enveloppe, et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral construit à partir d'un génome d'un virus VIH où tout ou partie du gène codant pour la protéine d'enveloppe est délété.According to a fourth particular embodiment of the analysis method of the invention, the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of bringing about minus a mutation in the gene coding for the envelope protein, and the vector of step (c) is a retroviral vector constructed from a genome of an HIV virus where all or part of the gene coding for the protein envelope is deleted.
Préférentiellement le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous-unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, de la région du génome VIH-1 constitutrice de l'élément de réponse à Rev (RRE). Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d'enveloppe est effectuée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant soit les séquences : FIN-A : 5' TCAAATATTACAGGGCTGCT3' (SEQ ID No: 13) et FIN-B : 5' TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14), soit les séquences FuA : 5 ' AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3 ' (SEQ ID No: 23) et FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24) ou constitués par des fragments de celles-ci ou encore par des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l'enveloppe portant au moins une mutation suivie d' une deuxième étape d'amplification, effectuée avec une paire d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant soit les séquences : FIN-C : 5'CTATTAACAAGAGATGGTGG3' (SEQ ID No: 15) et FIN-D : 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No: 16), soit les séquences FuC : 5 ' ATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3' (SEQ ID No: 25), utilisée en combinaison avec un mélange de deux séquences suivantes: FuDl : 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 26) et FuD2 : 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27) ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore par des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l'enveloppe portant au moins une mutation Tout préférentiellement, l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces :Preferably, the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 inclusive, from the region of the HIV-1 genome that constitutes the Rev response element (RRE). Advantageously, the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising either the sequences: FIN-A: 5 'TCAAATATTACAGGGCTGCT3' (SEQ ID No: 13) and FIN-B: 5 'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14), or the sequences FuA: 5 'AAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3' (SEQ ID No: 23) and FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24) or constituted by fragments thereof or by sequences analogous thereto carrying mutations d '' one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation followed by a second amplification step, carried out with a pair of primers having a size included between 10 and 50 oligonucleo tides, comprising either the sequences: FIN-C: 5'CTATTAACAAGAGATGGTGG3 '(SEQ ID No: 15) and FIN-D: 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No: 16), or the sequences FuC: 5 'ATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3' (SEQ ID No: 25), used in combination with a mixture of the following two sequences: FuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) and FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27) these, or alternatively by sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the gene of the envelope carrying at least one mutation Most preferably, the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
FIN-A : 5'TCAAATATTACAGGGCTGCT3' (SEQ ID No:FIN-A: 5'TCAAATATTACAGGGCTGCT3 '(SEQ ID No:
13) et13) and
FIN-B : 5'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No:FIN-B: 5'TAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No:
14) suivie d'une deuxième étape d'amplification, effectuée avec la paire d'amorces :14) followed by a second amplification step, carried out with the pair of primers:
FIN-C : 5'CTATTAACAAGAGATGGTGG3' (SEQ ID No:FIN-C: 5'CTATTAACAAGAGATGGTGG3 '(SEQ ID No:
15) et15) and
FIN-D : 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No: 16), pour obtenir un segment d'ADN de 965 paires de bases s' étendant des résidus 7553 à 8517 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous-unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.FIN-D: 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3 '(SEQ ID No: 16), to obtain a DNA segment of 965 base pairs extending from residues 7553 to 8517 inclusive and the vector of step (c) is a vector retroviral deleted from the entire region encoding the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
Tout préférentiellement, la méthode d'analyse selon l'invention permet l'amplification de séquences de la région d' enveloppe de virus VIH quel que soit leur sous-type et en particulier des virus des sous-types A,B,C,D et E), en utilisant pour l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces :Most preferably, the method of analysis according to the invention allows the amplification of sequences of the envelope region of HIV virus whatever their subtype and in particular of viruses of subtypes A, B, C, D and E), using for the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
FuA : 5ΑAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3' (SEQ ID No: 23) et FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24) suivie d'une deuxième étape d'amplification, effectuée avec l'amorce : FuC : 5ΑTATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3' (SEQ IDFuA: 5ΑAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3 '(SEQ ID No: 23) and FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24) followed by a second amplification step, carried out with the primer: FuC: 5ΑTATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3 '(SEQ ID
No: 25) et un mélange des amorces suivantes : FuDl :5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 26) FuD2 :5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ IDNo: 25) and a mixture of the following primers: FuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID
No: 27) , ledit mélange étant préférentiellement effectué dans un rapport compris entre (10% :90%) et (90% :10%) et tout préférentiellement entre (60% :40%) et (40% :60%), pour obtenir un segment d'ADN de 805 paires de bases s' étendant des résidus 7635 à 8440 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous-unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.No: 27), said mixing being preferably carried out in a ratio between (10%: 90%) and (90%: 10%) and most preferably between (60%: 40%) and (40%: 60%), to obtain a DNA segment of 805 base pairs extending from residues 7635 to 8440 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the subunit HIV-1 envelope gp41, spanning residues 7745 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
Avantageusement, l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences : NEU-A : 5' TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID No: 17) et FIN-B : 5' TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14) ou FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24) ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore par des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l'enveloppe portant au moins une mutation, suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d' amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences : NEU-C : 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 18) et FIN-D : 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No: 16) ou un mélange des séquences suivantes : FuDl :5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 26) et FuD2 :5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27), ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore par des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l'enveloppe portant au moins une mutation .Advantageously, the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: NEU-A: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID No: 17) and FIN-B: 5 'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14) or FuB: 5 ' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No: 24) or consisting of fragments thereof, or alternatively by sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation, followed by a second stage of amplification, with the pair of primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides, comprising the sequences: NEU-C: 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3 '(SEQ ID No: 18) and FIN-D: 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No : 16) or a mixture of the following sequences: FuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) and FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27), or consisting of fragments thereof, or alternatively by sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation.
Tout préférentiellement, l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d'enveloppe est effectuée avec une paire d'amorces : NEU-A : 5' TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQMost preferably, the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers: NEU-A: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ
ID No: 17) etID No: 17) and
FIN-B : 5'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d'amorces: NEU-C : 5 ' GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ IDFIN-B: 5'TAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No: 14), followed by a second amplification step, with the pair of primers: NEU-C: 5' GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3 '(SEQ ID
No: 18) etNo: 18) and
FIN-D : 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No: 16), pour obtenir un fragment d'ADN compris entre 2106 et 2320 paires de bases s' étendant des résidus 6197- 6222 jusqu'aux résidus 6197-6222 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.FIN-D: 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3 '(SEQ ID No: 16), to obtain a DNA fragment between 2106 and 2320 base pairs extending from residues 6197- 6222 to residues 6197-6222 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the whole region encoding the majority of the gpl20 subunit and the extracellular portion of the gp41 of the HIV-1 envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
Tout préférentiellement, l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces : NEU-A : 5' TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQMost preferably, the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers: NEU-A: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ
ID No: 17) etID No: 17) and
FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec les amorces: NEU-C : 5' GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ IDFuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers: NEU-C: 5 'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID
No: 18) et un mélange des amorces suivantesNo: 18) and a mixture of the following primers
FuDl :5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 26) etFuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) and
FuD2 :5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27), ledit mélange étant préférentiellement effectué dans un rapport compris entre (10% :90%) et (90% :10%) et tout préférentiellement entre (60% :40%) et (40% :60%), pour obtenir un fragment d'ADN de 2118 paires de bases s' étendant des résidus 6322 à 8440 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous- unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 27), said mixing being preferably carried out in a ratio between (10%: 90%) and (90%: 10%) and most preferably between (60%: 40%) and (40%: 60%), to obtain a DNA fragment of 2118 base pairs extending from residues 6322 to 8440 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire coding region for the majority of the sub- gpl20 unit and the extracellular portion of gp41 of the HIV-1 envelope, spanning residues 6480 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
Avantageusement, l'amplification de l'étapeAdvantageously, the amplification of the step
(b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides, comprenant les séquences : E00 : 5' TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3' (SEQ ID No: 19) et ES8B : 5' CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3' (SEQ ID No: 20), ou constitués par des fragments de celles-ci, ou encore par des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de l'enveloppe portant au moins une mutation, suivie d'une deuxième étape d' amplification, avec une paire d' amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50 oligonucléotides comprenant les séquences : E20:(b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers having a size of between 10 and 50 oligonucleotides , comprising the sequences: E00: 5 'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3' (SEQ ID No: 19) and ES8B: 5 'CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3' (SEQ ID No: 20), or consisting of fragments thereof, or also sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not essentially modify their capacity to hybridize the region of the envelope gene carrying at least one mutation, followed by a second amplification step, with a pair primers having a size between 10 and 50 oligonucleotides comprising the sequences: E20:
5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3' (SEQ ID No: 21) et E115 : 5ΑGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3' (SEQ ID No: 22), ou encore par des séquences analogues de celles-ci portant des mutations d'un ou plusieurs nucléotides qui ne modifient pas de manière essentielle leur capacité à hybrider la région du gène de la protéase portant au moins une mutation.5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3 '(SEQ ID No: 21) and E115: 5ΑGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3' (SEQ ID No: 22), or by sequences analogous to these carrying mutations of one or more nucleotides which do not modify in an essential way their ability to hybridize the region of the protease gene carrying at least one mutation.
Tout préférentiellement, l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces :Most preferably, the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least a mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
E00 : 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3' (SEQ ID No: 19) et ES8B : 5' CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3' (SEQ ID No:E00: 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3 '(SEQ ID No: 19) and ES8B: 5' CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3 '(SEQ ID No:
20), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d'amorces:20), followed by a second amplification step, with the pair of primers:
E20: 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3' (SEQ ID No: 21) etE20: 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3 '(SEQ ID No: 21) and
El15 : 5ΑGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3' (SEQ ID No: 22), pour obtenir un segment d'ADN de 938 paires de bases s' étendant des résidus 6426 à 7364 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de la région, codant pour les domaines allant de la boucle VI à la boucle V3 de l'enveloppe du VIH-1 s' étendant de 6617 à 7250 inclus et comporte un site de restriction unique Nhel.El15: 5ΑGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3 '(SEQ ID No: 22), to obtain a DNA segment of 938 base pairs extending from residues 6426 to 7364 inclusive and the vector of step (c) is a deleted retroviral vector of the region, coding for domains ranging from loop VI to loop V3 of the HIV-1 envelope extending from 6617 to 7250 inclusive and has a unique Nhel restriction site.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur de fusion ciblant la protéine gp41 du VIH-1, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) soit avec la paire d'amorces SEQ ID No : 13 , SEQ ID No : 14 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 15 SEQ ID No : 16, soit avec la paire d'amorces SEQ ID No : 17 SEQ ID No : 18 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 18 , SEQ ID No : 16, à ajouter ou non ledit composé inhibiteur de fusion, éventuellement à des concentrations différentes, durant la culture de l'hôte cellulaire obtenu à l'étape (e), avant l'étape (f) et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur de fusion ciblant la gp41 du VIH-1.The invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to a fusion inhibitor compound targeting the HIV-1 gp41 protein, comprising carrying out the amplification of step (b) either with the pair of primers SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 15 SEQ ID No: 16, or with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to add or not to add said fusion inhibitor compound, optionally at different concentrations, during the culture of the cell host obtained in step (e), before step (f) and comprising in step (g) comparing the expression of the marker gene with and without a fusion inhibitor compound targeting the HIV-1 gp41.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur d'entrée dudit virus VIH dans une cellule cible, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) avec la paire d'amorces SEQ ID No : 17 et SEQ ID No : 18 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 18 et SEQ ID No : 16, à ajouter ou non ledit composé inhibiteur d'entrée, éventuellement à des concentrations différentes, à l'hôte cellulaire obtenu à l'étape (e) avant l'infection de l'étape (f) et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur d'entrée.The invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to a compound which inhibits entry of said HIV virus into a target cell, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair. of primers SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18 and SEQ ID No: 16, whether or not to add said entry inhibitor compound, optionally at different concentrations, to the cell host obtained in step (e) before the infection in step (f) and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene with and without entry inhibitor compound.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à l'action inhibitrice des anticorps, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) avec la paire d'amorces SEQ ID No : 17 SEQ ID No : 18 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 18 , SEQ ID No : 16, à ajouter ou non lesdits anticorps durant l'étape (e) de culture, éventuellement à des concentrations différentes et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans anticorps.The invention also relates to an analysis method for determining the susceptibility of an HIV virus to the inhibitory action of antibodies, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to add or not to add said antibodies during the culture step (e), optionally at concentrations different and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene with and without antibody.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer le tropisme d'un virus VIH pour un récepteur cellulaire, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) avec la paire d'amorces SEQ ID No : 17 SEQ ID No : 18 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 18 , SEQ ID No : 16, à effectuer l'infection de l'étape (f) avec les particules virales obtenues à l'étape (e) sur deux hôtes cellulaires distincts et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts.The invention also relates to an analytical method for determining the tropism of an HIV virus for a cellular receptor, comprising performing amplification of step (b) with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to carry out the infection of step (f) with the viral particles obtained in step (e) on two distinct cellular hosts and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene by each of the two separate cell hosts.
Avantageusement les hôtes cellulaires utilisés pour l'infection de l'étape (f) selon la méthode d'analyse de l'invention sont choisis parmi des hôtes cellulaires exprimant le récepteur CCR5 ou le récepteur CXCR4.Advantageously, the cellular hosts used for the infection of step (f) according to the analysis method of the invention are chosen from cellular hosts expressing the CCR5 receptor or the CXCR4 receptor.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) avec la paire d'amorces SEQ ID No : 17 SEQ ID No : 18 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 18 , SEQ ID No : 16, à ajouter ou non ledit composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, éventuellement à des concentrations différentes, durant l'étape (e) de culture, l'infection de l'étape (f) étant effectuée sur deux hôtes cellulaires distincts et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts .The invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to an inhibitor compound targeting the HIV-1 co-receptors, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair of primers. SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, to add or not to said inhibitor compound targeting the HIV-1 co-receptors, possibly at different concentrations, during stage (e) of culture, the infection of stage (f) being carried out on two distinct cellular hosts and comprising in stage (g) the comparison of the expression of the marker gene by each of the two separate cellular hosts.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer le tropisme d'un virus VIH pour un récepteur cellulaire, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) avec la paire d'amorces SEQ ID No : 19 et SEQ ID No : 20, suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 21 et SEQ ID No : 22, à infecter à l'étape (f) deux hôtes cellulaires distincts avec les particules virales obtenues à l'étape (e) et comprenant à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts.The invention also relates to an analytical method for determining the tropism of an HIV virus for a cellular receptor, comprising performing amplification of step (b) with the pair of primers SEQ ID No: 19 and SEQ ID No: 20, followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 21 and SEQ ID No: 22, to infect in step (f) two distinct cellular hosts with the viral particles obtained in step (e) and comprising in step (g) the comparison of the expression of the marker gene by each of the two hosts separate cells.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) avec la paire d'amorces SEQ ID No : 19 et SEQ ID No : 20 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 21 et SEQ ID No : 22, à ajouter ou non ledit composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, éventuellement à des concentrations différentes, durant la culture de l'étape (d) , à effectuer l'infection de l'étape (f) avec les particules virales obtenues à l'étape (e) sur deux hôtes cellulaires distincts et à comparer à l'étape (g) l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts.The invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to an inhibitor compound targeting the HIV-1 co-receptors, comprising carrying out the amplification of step (b) with the pair of primers. SEQ ID No: 19 and SEQ ID No: 20 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 21 and SEQ ID No: 22, whether or not to add said inhibitor compound targeting HIV-1 co-receptors, optionally at different concentrations, during the culture of step (d), to carry out the infection of step (f) with the viral particles obtained in step (e) on two distinct cellular hosts and to compare with step (g) the expression of the marker gene by each of the two distinct cellular hosts.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer l' infectivité ou la capacité réplicative d'un virus VIH consistant à comparer à l'étape (g) l'expression du gène marqueur par le second hôte cellulaire infecté avec les particules virales obtenues en appliquant les étapes (a) à (f) à un échantillon biologique d'un patient, et l'expression du gène marqueur par le même second hôte cellulaire infecté avec des particules virales de référence obtenues en appliquant les étapes (a) à (f) à un échantillon contenant un virus de référence.The invention also relates to an analytical method for determining the infectivity or the replicative capacity of an HIV virus, which consists in comparing in step (g) the expression of the marker gene by the second infected cellular host with the viral particles. obtained by applying steps (a) to (f) to a biological sample from a patient, and expression of the marker gene by the same second cellular host infected with reference viral particles obtained in applying steps (a) to (f) to a sample containing a reference virus.
Avantageusement les particules virales de référence issues d'un virus de référence sont des particules virales obtenues par l'application des étapes (a) à (f) à un échantillon biologique du même patient à un stade préalable du traitement thérapeutique ou avant celui-ci .Advantageously, the reference viral particles originating from a reference virus are viral particles obtained by applying steps (a) to (f) to a biological sample from the same patient at a stage prior to or before the therapeutic treatment. .
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la virulence d'un virus VIH consistant à effectuer l'amplification de l'étape (b) soit avec la paire d'amorces SEQ ID No : 13 , SEQ ID No : 14 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 15 SEQ ID No : 16, soit avec la paire d'amorces SEQ ID No : 17 SEQ ID No : 18 suivie d'une deuxième amplification avec la paire d'amorces SEQ ID No : 18 , SEQ ID No : 16, et à mesurer, lors de l'infection de l'étape (f), l'effect cytopathogène produit sur le second hôte cellulaire.The invention also relates to an analysis method for determining the virulence of an HIV virus comprising carrying out the amplification of step (b) either with the pair of primers SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 followed by a second amplification with the pair of primers SEQ ID No: 15 SEQ ID No: 16, or with the pair of primers SEQ ID No: 17 SEQ ID No: 18 followed by a second amplification with the pair d primers SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 16, and to measure, during the infection of step (f), the cytopathogenic effect produced on the second cellular host.
Avantageusement l'effet cytopathogène produit lors de l'infection de l'étape (f) sur le second hôte cellulaire est mesuré au moyen des techniques de cytotoxicité telles que la mesure de l'induction de syncytia, de l'induction de l'apoptose ou par cytométrie de flux.Advantageously, the cytopathogenic effect produced during the infection of step (f) on the second cellular host is measured by means of cytotoxicity techniques such as measuring the induction of syncytia, the induction of apoptosis. or by flow cytometry.
L' invention concerne également une méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à l' hydroxyurée, consistant à ajouter ou non de 1' hydroxyurée, éventuellement à des concentrations différentes, soit durant l'étape (e) de culture, soit au deuxième hôte cellulaire et à effectuer à l'étape (g) la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans hydroxyurée .The invention also relates to an analytical method for determining the susceptibility of an HIV virus to hydroxyurea, comprising whether or not to add hydroxyurea, optionally at concentrations different, either during the culture step (e) or at the second cell host and to perform in step (g) the comparison of the expression of the marker gene with and without hydroxyurea.
De manière préférentielle, la durée de l'étape de culture (e) selon la méthode de l'invention est comprise entre 12 et 72 heures, tout préférentiellement elle est comprise entre 24 et 48 heures.Preferably, the duration of the culture step (e) according to the method of the invention is between 12 and 72 hours, very preferably it is between 24 and 48 hours.
L'invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode d'analyse d'une caractéristique phénotypique des virus VIH présents dans un échantillon biologique d'un patient caractérisé en ce qu' il comprend : i) une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique du génome viral susceptible de porter au moins une mutation, ii) un vecteur comprenant les parties d'un génome d'un virus VIH nécessaires à la réplication virale à l'exception du segment amplifié avec les amorces définies en (i) et du gène codant pour la protéine d' enveloppe, iii) un second vecteur comprenant un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.The subject of the invention is also a kit for implementing a method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses present in a biological sample of a patient, characterized in that it comprises: i) a pair primers framing a nucleic acid sequence of the viral genome capable of carrying at least one mutation, ii) a vector comprising the parts of a genome of an HIV virus necessary for viral replication with the exception of the segment amplified with the primers defined in (i) and of the gene coding for the envelope protein, iii) a second vector comprising a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cell host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) products and reagents for the detection of the expressed marker.
Avantageusement, le kit selon l'invention comprend : i) les paires d'amorces de séquences :Advantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences:
- SEQ ID No : 1 et SEQ ID No : 2- SEQ ID No: 1 and SEQ ID No: 2
- SEQ ID No : 3 et SEQ ID No : 4 ii) un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase du VIH-1 s' étendant des résidus 1505 à 2565 inclus, délété de la région d' enveloppe et comportant un site unique de restriction MluI, iii) un virus pseudotypé avec un gène codant pour une protéine d'enveloppe. iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 3 and SEQ ID No: 4 ii) a deleted retroviral vector from the region of the pol reading frame coding for the HIV-1 protease extending from residues 1505 to 2565 inclusive, deleted from the region of envelope and comprising a single MluI restriction site, iii) a virus pseudotyped with a gene coding for an envelope protein. iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
Avantageusement le kit selon l' invention comprend : i) les paires d'amorces de séquences : - SEQ ID No : 5 et SEQ ID No : 7Advantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences: SEQ ID No: 5 and SEQ ID No: 7
- SEQ ID No : 6 et SEQ ID No : 8 ii) un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la transcriptase inverse du VIH-1, s' étendant des résidus 2618 à 2872 inclus, et comportant un site unique de restriction MluI, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 6 and SEQ ID No: 8 ii) a deleted retroviral vector from the region of the pol reading frame coding for the transcriptase reverse of HIV-1, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a single MluI restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of be infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
Avantageusement le kit selon l'invention comprend : i) les paires d'amorces de séquences :Advantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences:
- SEQ ID No : 9 et SEQ ID No : 10 - SEQ ID No : 11 et SEQ ID No : 12 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région du cadre de lecture pol codant pour l' intégrase du- SEQ ID No: 9 and SEQ ID No: 10 - SEQ ID No: 11 and SEQ ID No: 12 ii) a retroviral vector deleted from the entire region of the pol reading frame coding for the integrase of the.
VIH-1 s' étendant des résidus 4228 à 5093 inclus et de la région codant pour l'enveloppe virale entre les positions 6343 et 7611 incluses, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l' infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.HIV-1 extending from residues 4228 to 5093 inclusive and of the region coding for the viral envelope between positions 6343 and 7611 inclusive, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cell host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cell host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
Avantageusement le kit selon l' invention comprend : i) les paires d'amorces de séquencesAdvantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 13 et SEQ ID No : 14 - SEQ ID No : 15 et SEQ ID No : 16 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous- unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 13 and SEQ ID No: 14 - SEQ ID No: 15 and SEQ ID No: 16 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the envelope of the HIV-1, ranging from residues 7745 to 8263 inclusive, and having a single Mull restriction site, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected by an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
Avantageusement le kit selon l'invention comprend : i) les paires d'amorces de séquences - SEQ ID No : 17 et SEQ ID No : 14Advantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of sequence primers - SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 14
- SEQ ID No : 18 et SEQ ID No : 16 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement par des particules virales, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 18 and SEQ ID No: 16 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extracellular portion of gp41 of the HIV-1 envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and comprising a single Mull restriction site, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus , v) a second cell host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene activatable only by viral particles, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing detection of the expressed marker.
Avantageusement le kit selon l' invention comprend : i) les paires d'amorces de séquencesAdvantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 19 et SEQ ID No : 20- SEQ ID No: 19 and SEQ ID No: 20
- SEQ ID No : 21 et SEQ ID No : 22 ii) un vecteur retroviral délété de la région, codant pour les domaines allant de la boucle VI à la boucle V3 de l'enveloppe du VIH-1 s' étendant de 6617 à- SEQ ID No: 21 and SEQ ID No: 22 ii) a deleted retroviral vector of the region, coding for the domains ranging from loop VI to loop V3 of the HIV-1 envelope extending from 6617 to
7250 inclus et comportant un site de restriction unique7250 inclusive and having a single restriction site
Nhel, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé. Avantageusement le kit selon l'invention comprend i) les paires d'amorces de séquences - SEQ ID No : 23 et SEQ ID No : 24Nhel, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi ) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker. Advantageously, the kit according to the invention comprises i) the pairs of primers of sequences - SEQ ID No: 23 and SEQ ID No: 24
- SEQ ID No : 25 et SEQ ID No : 26 avec SEQ ID No : 27 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous- unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l' infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 25 and SEQ ID No: 26 with SEQ ID No: 27 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, s' extending from residues 7745 to 8263 inclusive, and comprising a single Mull restriction site, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can only be activated following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
Avantageusement le kit selon l'invention comprend : i) les paires d'amorces de séquencesAdvantageously, the kit according to the invention comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 17 et SEQ ID No : 24- SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 24
- SEQ ID No : 18 et SEQ ID No : 26 et SEQ ID No : 27 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement par des particules virales, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 18 and SEQ ID No: 26 and SEQ ID No: 27 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extracellular portion of the gp41 of the envelope of HIV-1, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and comprising a single Mull restriction site, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene activatable only by viral particles, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
D' autres avantages et caractéristiques de l'invention sont illustrés dans les exemples qui suivent et qui font référence aux figures suivantes :Other advantages and characteristics of the invention are illustrated in the examples which follow and which refer to the following figures:
La figure 1 représenté schématiquement le plasmide pSRT. La région codant pour la transcriptase inverse de pNL4-3xcenv est délétée au moyen d'une digestion par BalI-SnaBI . La linéarisation du pSRT résultant est accomplie par l'utilisation de Nru I .Figure 1 shows schematically the plasmid pSRT. The region coding for the reverse transcriptase of pNL4-3xcenv is deleted by means of digestion with BalI-SnaBI. Linearization of the resulting pSRT is accomplished by the use of Nru I.
La figure 2 illustre les courbes des effets dose réponse obtenues pour deux patients versus l'AZT et le 3TC, avant et après le traitement avec des inhibiteurs de la transcriptase inverse.Figure 2 illustrates the curves of the dose response effects obtained for two patients versus AZT and 3TC, before and after treatment with reverse transcriptase inhibitors.
Les détails du traitement, les prélèvements d' échantillons par rapport au temps et les génotypes se trouvent sur les entêtes des figures.The details of the treatment, the samples taken over time and the genotypes are found on the headings of the figures.
Les courbes montrent l'inhibition de 1' infection par un virus recombinant des cellules P4 traitées soit avec la zidovuidine (AZT, panels A et C) ou la lamivudine (3TC, panels B et D) , selon la technique décrite plus loin, dans le paragraphe matériel et méthodes. Pour le patient I, les échantillons ont été testés à 0 (*), 9 (•) et 18 (D) mois aPrès le traitement, et pour le patient 2 à 0( ) et 27 (•) mois après le traitement.The curves show the inhibition of infection by a recombinant virus of P4 cells treated with either zidovuidine (AZT, panels A and C) or lamivudine (3TC, panels B and D), according to the technique described later in the hardware and methods section. For the patient I, the samples were tested at 0 (*), 9 (•) and 18 (D) month Prof. Bachelor treatment, and patient 2 0 () and 27 (•) months after the treatment.
La figure 3 est un schéma des premières étapes (a et b) d'une mise en oeuvre particulière de la méthode de l'invention. Le schéma illustre les étapes d'extraction (a) et d'amplification (b) des séquences de transcriptase inverse extraites du plasma d'un patient par RT PCR de la méthode de l'invention ainsi que les schémas de constructions du plasmide pRVA/RT utilisé ultérieurement à l'étape (d) .FIG. 3 is a diagram of the first steps (a and b) of a particular implementation of the method of the invention. The diagram illustrates the steps of extraction (a) and amplification (b) of the reverse transcriptase sequences extracted from the plasma of a patient by RT PCR of the method of the invention as well as the construction diagrams of the plasmid pRVA / RT used later in step (d).
La figure 4 est un schéma des étapes (c) à (g) d'une mise en oeuvre particulière de la méthode de l'invention. Ce schéma illustre l'étape (d) de co- transfection dans des cellules HeLa/293T des acides nucléiques amplifiés de l'étape (b) , d'un premier plasmide p43xcsnΔenv RT construit à partir d'un génome d'un virus VIH, ne comprenant pas un segment d'acide nucléique correspondant à tout ou partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée à l'étape (b) ni un fragment de la séquence d' acide nucléique codant pour la protéine d' enveloppe et un deuxième plasmide pVSV-G comportant la séquence codant pour la protéine d'enveloppe; l'étape (e) de culture permettant de produire des particules virale, l'étape (f) de transfection des particules virales obtenues à l'étape (e) dans des cellules P4, préalablement incubées en présence ou non de dilutions sériées de différents inhibiteurs de la transcriptase inverse, lesdites cellules indicatrices P4 comportant un système d'expression du gène codant pour l'enzyme beta- galactosidase activable exclusivement par les séquences d' activation tat exprimées par le virus recombinant, et l'étape (g) de détection et/ou quantification de la beta- galactosidase au moyen du substrat CPRG.Figure 4 is a diagram of steps (c) to (g) of a particular implementation of the method of the invention. This diagram illustrates step (d) of cotransfection into HeLa / 293T cells of the amplified nucleic acids of step (b), of a first plasmid p43xcsnΔenv RT constructed from a genome of an HIV virus. , not comprising a nucleic acid segment corresponding to all or part of the nucleic acid sequence amplified in step (b) nor a fragment of the nucleic acid sequence coding for the envelope protein and a second plasmid pVSV-G comprising the sequence coding for the envelope protein; the culture step (e) making it possible to produce viral particles, the step (f) of transfection of the viral particles obtained in step (e) into P4 cells, previously incubated in the presence or not of serial dilutions of different reverse transcriptase inhibitors, said P4 indicator cells having a expression system of the gene coding for the beta-galactosidase enzyme activatable exclusively by the tat activation sequences expressed by the recombinant virus, and step (g) of detection and / or quantification of beta-galactosidase by means of the CPRG substrate.
La figure 5 illustre les résultats de l'analyse phénotypique obtenus en présence de l'inhibiteur de fusion T20 pour des virus présents dans des plasmas de patients (P1,P2 et P3) et des prototypes viraux de référence (NL 43 et le clone résistant DIM) .FIG. 5 illustrates the results of the phenotypic analysis obtained in the presence of the T20 fusion inhibitor for viruses present in patient plasmas (P1, P2 and P3) and reference viral prototypes (NL 43 and the resistant clone SUN) .
La figure 6 illustre les résultats de mesure de la capacité replicative de virus Ll, L2 et L3 extraits de différents échantillons.FIG. 6 illustrates the results of measurement of the replicative capacity of viruses L1, L2 and L3 extracted from different samples.
I- Matériel et méthodesI- Materials and methods
I . 1 - Ampl i f i ral i nn pa r réa ct i on de po l ymé r i wa t i nn en ch a î ne LEUR) .I. 1 - Ampl i f i ral i nn pa r réa ct i on of po l ymé r i wa t i nn en ch a î ne LEUR).
L'ARN est isolé à partir du plasma des patients au moyen d'une trousse Roche Amplicor ® (RocheRNA is isolated from patient plasma using a Roche Amplicor ® kit (Roche
Diagnostics, 38242 Meylan Cedex, France) , et les gènes d'intérêt sont isolés au moyen d'une transcriptase inverse et une réaction PCR subséquente.Diagnostics, 38242 Meylan Cedex, France), and the genes of interest are isolated by means of reverse transcriptase and a subsequent PCR reaction.
L'amplification de la région codant pour la transcriptase inverse (RT) est effectuée au moyen des amorces externes MJ3 (5' AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (Séquence SEQ ID No : 5 , en annexe) et RT-EXT (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (Séquence SEQ ID No : 6, en annexe) et des amorces internes A35 (5' TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (Séquence SEQ ID No : 7 , en annexe) et RT-IN (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (Séquence SEQ ID No : 8, en annexe) avec un cycle initial à 50°C (30 minutes) et à 94°C (2 minutes), suivi de 40 cycles à 94°C (30 secondes), 55°C (30 secondes) et 68°C (90 secondes) et une étape finale d'extension à 98°C durant 10 minutes. Ceci amplifie un produit de 1530 pb qui s'étend au-delà du codon 93 de la région codant de la protéase et au-delà du codon 503 de la région codant de la polymérase (pol). Les produits ainsi obtenus par PCR sont purifiés sur des colonnes QuiaAmp® et analysés en ce qui concerne leur taille, leur degré de pureté et leur concentration approximative par électrophorèse sur des gels d' agarose .Amplification of the region coding for reverse transcriptase (RT) is carried out using the external primers MJ3 (5 'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (Sequence SEQ ID No: 5, in appendix) and RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (Sequence SEQ ID No: 6, in appendix) and internal primers A35 (5 'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (Sequence SEQ ID No: 7, in appendix) and RT-IN (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 8, in appendix) with an initial cycle at 50 ° C (30 minutes) and 94 ° C (2 minutes), followed by 40 cycles at 94 ° C (30 seconds), 55 ° C (30 seconds) and 68 ° C (90 seconds) and a final extension step at 98 ° C for 10 minutes. This amplifies a 1530 bp product which extends beyond codon 93 of the protease coding region and beyond codon 503 of the polymerase coding region (pol). The products thus obtained by PCR are purified on QuiaAmp® columns and analyzed with regard to their size, their degree of purity and their approximate concentration by electrophoresis on agarose gels.
1.2 - πénntypagp1.2 - πénntypagp
Les séquences de nucléotides des régions codantes de la transcriptase inverse sont déterminées par séquençage automatique de la terminaison de la chaîne didéoxinucléotidique des produits de PCR bruts.The nucleotide sequences of the regions of reverse transcriptase coding are determined by automatic sequencing of the termination of the dideoxinucleotide chain of the crude PCR products.
Les clones moléculaires du VIH-1 utilisés dans la méthode d'analyse dérivent de pNL4-3.The molecular clones of HIV-1 used in the analysis method are derived from pNL4-3.
Le plasmide délété en transcriptase inverse est construit par une modification du pNL4-3xcΔenv mute pour porter des sites de restriction SnaBI uniques dans la position 3872 et de Nru I dans la position 3892. Les enzymes Ba I et SnaB I sont utilisées pour retirer la région codant pour la transcriptase inverse (entre les positions 2618 et 2872) et la linéarisation du plasmide résultant pSRT est effectuée au moyen de l'enzyme Nru I. L'expression de la glycoprotéine d' enveloppe VSV-G dans les cellules transfectees est assuré par le plasmide pVSV qui contient la séquence codante vsv-g sous le contrôle d' un promoteur CMV.The plasmid deleted in reverse transcriptase is constructed by a modification of pNL4-3xcΔenv mut e to carry unique SnaBI restriction sites in position 3872 and of Nru I in position 3892. The enzymes Ba I and SnaB I are used to remove the region coding for reverse transcriptase (between positions 2618 and 2872) and linearization of the resulting plasmid pSRT is carried out by means of the enzyme Nru I. The expression of the envelope glycoprotein VSV-G in the transfected cells is ensured by the plasmid pVSV which contains the coding sequence vsv-g under the control of a CMV promoter.
1.4 - Cul ures πel 1 u 1 a i rps .1.4 - Cul ures πel 1 u 1 a i rps.
Des cellules HeLa, 293 T et P4 sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 50 Ul/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine. Les cellules P4 son des cellules Hela-CD4, LTR-LacZ dans lesquelles l'expression de la beta- galactosidase est strictement inductible par la protéine Tat transactivateur du VIH, permettant par conséquent, une quantification précise de l' infectivité ou de la capacité réplicative des virus VIH-I basée sur un cycle unique de réplication (Chameau, P., Mirambeau, G., Roux, P., Paulous, S., Bue, H. and Clavel, F. (1994) « HIV-1 reverse transcription. A termination step at the center of the génome". J Mol Biol 241(5), 651-62.). Les cellules P4 sont cultivées en présence de 500 μg/ml de geneticine.HeLa, 293 T and P4 cells are cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 50 IU / ml of penicillin and 50 μg / ml of streptomycin. P4 cells are Hela-CD4, LTR-LacZ cells in which the expression of beta-galactosidase is strictly inducible by the HIV transactivating Tat protein, therefore allowing precise quantification of the infectivity or the replicative capacity. of HIV-I viruses based on a single cycle of replication (Chameau, P., Mirambeau, G., Roux, P., Paulous, S., Bue, H. and Clavel, F. (1994) "HIV-1 reverse transcription. A termination step at the center of the genome ". J Mol Biol 241 (5), 651-62.). P4 cells are cultured in the presence of 500 μg / ml of geneticin.
II. — vi rus VTH à un i nhi hi teur de T ran s r-.r i pt i rin i nverse . (RTT) .II. - vi rus VTH to an i nhi hi tor of T ran s r-.ri pt i rin i nverse. (RTT).
La détermination de la susceptibilité d'un virus VIH à un inhibiteur de transcriptase inverse est effectuée de la manière suivante: des cellules 293 T sont transfectees avec 7,5 μg de plasmide pSRT linéarisé par NruI, 0,1 μg du plasmide pVSV-G et 0,5 et 1 μg du produit issu de la réaction PCR de la transcription inverse de VIH. Le précipité de transfection est retiré des cellules après 18 heures d' incubation et du milieu de croissance frais est ajouté. Après 24 heures de culture, le surnageant est clarifié par centrifugation (500 g, 15 minutes) et transféré sur des cellules indicatrices P4 lesquelles ont été pré-incubées avec des dilutions sériées d'un inhibiteur de la transcriptase inverse, dans de puits triplicatas, durant quatre heures. La gamme de concentrations d' inhibiteur utilisée varie selon les composés. Le signal produit par l' activation du gène marqueur a été développé avec du CPRG durant 48 heures, comme pour l'analyse de la susceptibilité à un inhibiteur de transcriptase inverse et l' indice IC50 a été calculé en utilisant l'équation d'effet médian.The determination of the susceptibility of an HIV virus to a reverse transcriptase inhibitor is carried out as follows: 293 T cells are transfected with 7.5 μg of plasmid pSRT linearized with NruI, 0.1 μg of the plasmid pVSV-G and 0.5 and 1 μg of the product resulting from the PCR reaction of the reverse transcription of HIV. The transfection precipitate is removed from the cells after 18 hours of incubation and from the growth medium. fee is added. After 24 hours of culture, the supernatant is clarified by centrifugation (500 g, 15 minutes) and transferred to P4 indicator cells which have been pre-incubated with serial dilutions of a reverse transcriptase inhibitor, in triplicate wells, for four hours. The range of inhibitor concentrations used varies among the compounds. The signal produced by the activation of the marker gene was developed with CPRG for 48 hours, as for the analysis of the susceptibility to a reverse transcriptase inhibitor and the IC50 index was calculated using the equation of effect. median.
III - Opt i mi sat i nn d p 1 a méthndp d' analyse pmir Hétprminpr la susr.ppt i hi "1 i t é d'un vi rus VTH aux i nhi hi tpurs ήp t ra nsr-ri pt a SP i nvprss .III - Opt i mi sat i nn dp 1 a analysis method pmir Hétprminpr la susr.ppt i hi " 1 it é of a VTH virus to i nhi hi tpurs ήp t ra nsr-ri pt a SP i nvprss.
Le plasmide pSRT portant une délétion dans la région codant pour pol allant du codon 24 de la transcriptase inverse (base 2618) au codon 432 de la transcriptase inverse (base 3872) inclut toutes les mutations associées à un phénomène de résistance connus à ce jour. Les séquences homologues du produit transcriptase inverse issu de PCR s'étendent 88 paires de base en amont et 186 bases en aval de la délétion dans pSRT . Les transfections pour la détermination de la susceptibilité aux inhibiteurs de la transcriptase inverse sont effectuées avec une lignée cellulaire 293T ayant une forte capacité à être transfectée plutôt qu'avec des cellules HeLa . Ceci ne constitue pas un problème car les cellules sont éliminées du surnagent contenant le virus par centrifugation avant le transfert de cellules P4. Les conditions de transfert sont optimisées au moyen d'un test en échiquier. La variation du ratio du plasmide/produit issu de PCR ne modifie significativement la quantité de p24 ou de transcriptase inverse produites ou la vitesse de réaction avec CPRG. Etant donné que le plasmide circulaire, pVSV-G semble être extrêmement toxique pour les cellules 293T, la quantité de celui-ci a été réduite de 3 μg à 0,1 μg dans le mélange de transfection, conduisant à des rendements élevés en p24The plasmid pSRT carrying a deletion in the region coding for pol ranging from codon 24 of reverse transcriptase (base 2618) to codon 432 of reverse transcriptase (base 3872) includes all the mutations associated with a resistance phenomenon known to date. The homologous sequences of the reverse transcriptase product derived from PCR extend 88 base pairs upstream and 186 bases downstream of the deletion in pSRT. The transfections for determining the susceptibility to reverse transcriptase inhibitors are carried out with a 293T cell line having a high capacity to be transfected rather than with HeLa cells. This is not a problem because the cells are removed from the virus-containing supernatant by centrifugation before the transfer of P4 cells. The transfer conditions are optimized by means of a chessboard test. The variation in the ratio of the plasmid / product resulting from PCR does not significantly modify the quantity of p24 or reverse transcriptase produced or the speed of reaction with CPRG. Since the circular plasmid, pVSV-G appears to be extremely toxic to 293T cells, the amount thereof has been reduced from 3 μg to 0.1 μg in the transfection mixture, leading to high yields of p24
(>20 ng/ml comparé à 9,8 ng/ml) .(> 20 ng / ml compared to 9.8 ng / ml).
Etant donné que les phases précoces de la réplication du virus, incluant la transcription inverse, se produisent dans les cellules P4 indicatrices dans ce type de détermination, ce sont ces cellules qui sont traitées avec des dilutions en série des inhibiteurs de la transcriptase inverse.Since the early phases of virus replication, including reverse transcription, occur in indicator P4 cells in this type of determination, it is these cells that are treated with serial dilutions of reverse transcriptase inhibitors.
Les gammes de concentration d' inhibiteur utilisées sont choisies en fonction de la toxicité cellulaire de chaque composé et du ratio IC50/IC90 pour la susceptibilité des isolats résistants (Tableau 1) . Par exemple, comme l'indice IC50 pour l'abacavir pour les cellules P4 est d'environ 250 μM alors que l'indice IC50 pour ce composé pour la souche native du virus est d' environ 3 μM, la détection de la résistance est limitée par la toxicité. Une gamme de quatre dilutions en série, commençant à 200 μM a été utilisée pour l'abacavir, permettant la détection de jusqu'à 60 fois plus de résistance .The inhibitor concentration ranges used are chosen according to the cellular toxicity of each compound and the IC50 / IC90 ratio for the susceptibility of resistant isolates (Table 1). For example, as the IC50 index for abacavir for P4 cells is approximately 250 μM while the IC50 index for this compound for the native strain of the virus is approximately 3 μM, the detection of resistance is limited by toxicity. A range of four serial dilutions, starting at 200 μM, has been used for abacavir, allowing the detection of up to 60 times more resistance.
D'autre part, puisque la toxicité de l'AZT pour les cellules P4 est élevée (>300 μM) alors que l'indice IC50 est considérablement inférieur, une gamme plus large de dilutions a été utilisée (dilution en série 1/10 à partir de 5 μM) de manière a permettre la détection de niveaux élevés de résistance (jusqu'à 100 fois) .On the other hand, since the toxicity of AZT for P4 cells is high (> 300 μM) while the IC50 index is considerably lower, a wider range of dilutions has been used (dilution in series 1/10 from 5 μM) so as to allow the detection of high levels of resistance (up to 100 times).
Pour la transcriptase inverse RVA, l' indiceFor RVA reverse transcriptase, the index
IC50 est utilisé plutôt que l' indice IC90 car la détection de l'indice IC90 pour les virus résistants pourrait demander des niveaux de composé toxiques pour la plupart d'inhibiteurs de transcriptase inverse. IC50 is used rather than the IC90 index because detection of the IC90 index for resistant viruses could require toxic compound levels for most reverse transcriptase inhibitors.
TABLEAU 1 : Susceptibili é du virus ή^ référpnr-.p NT, -^ aux i nhi hi tpurs ή^ t ransr-r pta SP invprsp (RTT) .TABLE 1: Susceptibility of the virus ή ^ referpnr-.p NT, - ^ aux i nhi hi tpurs ή ^ t ransr-r pta SP invprsp (RTT).
a- moyenne géométrique et déviation standard de 20 tests répétés pour les inhibiteurs de transcriptase inverse. b- différence maximale approximative pour les indices ICso et IC90 entre NL43 et le virus testé qui peut être mesurée en utilisant la gamme de concentrations en drogues donnée a- geometric mean and standard deviation of 20 repeated tests for reverse transcriptase inhibitors. b- approximate maximum difference for the ICso and IC90 indices between NL43 and the tested virus which can be measured using the range of drug concentrations given
La méthode d' analyse pour déterminer la susceptibilité du virus VIH aux inhibiteurs de transcriptase inverse donne une Déviation Standard de la moyenne géométrique pour 20 tests entre 1,78 (abacavir) et 2,7 (D4T et AZT) . La déviation standard médiane pour les inhibiteurs de la transcriptase inverse (RTI) essayésThe method of analysis to determine the susceptibility of the HIV virus to reverse transcriptase inhibitors gives a Standard Deviation of the geometric mean for 20 tests between 1.78 (abacavir) and 2.7 (D4T and AZT). Median standard deviation for reverse transcriptase inhibitors (RTIs) tested
(AZT, 3TC, D4T, DDI, abacavir, efavirenz et nevirapine) est de 2,2. De manière à simplifier l'interprétation automatique des résultats des échantillons des patients, une valeur Index de Résistance (IR) arbitraire, IR = 5 a été défini comme le minimum de réduction de la susceptibilité à un RTI considéré comme étant significativement réduit par rapport à NL43.(AZT, 3TC, D4T, DDI, abacavir, efavirenz and nevirapine) is 2.2. In order to simplify the automatic interpretation of the results of the patient samples, an arbitrary Resistance Index (IR) value, IR = 5 was defined as the minimum reduction in susceptibility to an ITR considered to be significantly reduced compared to NL43.
Pour déterminer si NL43 est un virus de référence convenable pour la comparaison avec les isolats cliniques, un panel d'échantillons pris de patients avec un traitement banal a été essayé sur 3 replicats RVA pour leur susceptibilité aux inhibiteurs de transcriptase inverse. l' ICso médian trouvé pour 22 virus testés tend à être légèrement supérieur à celui trouvé pour le virus NL43 avec un IR médian aux alentours de 0,92 (pour stavudine) et de 1,22 (lamivudine) . Bien que l' IR soit inférieur à la limite définie de 5 sur le total d'inhibiteurs pour la plupart d'échantillons testés, la gamme d' IR semble large, en particulier pour les inhibiteurs non-nucléosides . En particulier, un indice de résistance de 11,0 pour la nevirapine a été obtenu pour un virus or, ce virus portait une mutation sur le codon 98 (A pour S) de la transcriptase inverse, qui avait été précédemment impliqué dans la résistance aux NNRTIs. IV - Reprnduct hi 1 i téTo determine whether NL43 is a reference virus suitable for comparison with clinical isolates, a panel of samples taken from patients with ordinary treatment was tested on 3 RVA replicates for their susceptibility to reverse transcriptase inhibitors. the median ICso found for 22 viruses tested tends to be slightly higher than that found for the NL43 virus with a median IR around 0.92 (for stavudine) and 1.22 (lamivudine). Although the IR is below the defined limit of 5 on the total of inhibitors for most of the samples tested, the range of IR seems wide, especially for non-nucleoside inhibitors. In particular, a resistance index of 11.0 for nevirapine was obtained for a virus or, this virus carried a mutation on codon 98 (A for S) of reverse transcriptase, which had previously been implicated in resistance to NNRTIs. IV - Reprnduct hi 1 i té
La reproductibilité de la méthode de détermination de la susceptibilité du virus recombinant (RVA) aux inhibiteurs de transcriptase inverse (RTI) a été évaluée par une série de tests sur 5 échantillons, choisis de manière à représenter une large gamme de profils de susceptibilité, entre 4 et 8 tests par échantillon, en utilisant des préparations d'ARN et des réactions PCR séparées.The reproducibility of the method for determining the susceptibility of the recombinant virus (RVA) to reverse transcriptase inhibitors (RTI) was evaluated by a series of tests on 5 samples, chosen so as to represent a wide range of susceptibility profiles, between 4 and 8 tests per sample, using RNA preparations and separate PCR reactions.
La variation inter-test pour la détermination de la susceptibilité des virus VIH aux inhibiteurs de la transcriptase inverse indique que dans quelques cas il existe une différence supérieure à 5 entre l' IR maximum et l' IR minimum trouvés pour des déterminations répétéesThe inter-test variation for the determination of the susceptibility of HIV viruses to reverse transcriptase inhibitors indicates that in some cases there is a difference greater than 5 between the maximum IR and the minimum IR found for repeated determinations.
(Tableau 2), cependant, la déviation standard de la moyenne géométrique est maintenue = 2,2 dans tous les cas sauf un (R4, AZT) . Dans trois des échantillons l' IR obtenu lors des tests répétés varie entre <5 et >5 pour les composés pour lesquels les virus peuvent être modérément résistants (IR non supérieur à 12) . (Table 2), however, the standard deviation of the geometric mean is maintained = 2.2 in all cases except one (R4, AZT). In three of the samples the IR obtained during the repeated tests varies between <5 and> 5 for the compounds for which the viruses can be moderately resistant (IR not greater than 12).
TABLEAU 2 Rpprodirt i hi 1 i té c\p la ςnsrppt i bi 1 i té ηy PTTTABLE 2 Rpprodirt i hi 1 i té c \ p la ςnsrppt i bi 1 i té ηy PTT
(a) Seules les substitutions en acides aminés déjà connues pour être associées avec une résistance aux inhibiteurs de la transcriptase inverse sont indiquées.(a) Only amino acid substitutions already known to be associated with resistance to reverse transcriptase inhibitors are indicated.
(b) L'Index de Résistance est le rapport de 1' ICso dans l'échantillon par rapport à celui de NL43 déterminé en parallèle.(b) The Resistance Index is the ratio of the IC 50 in the sample compared to that of NL43 determined in parallel.
(c ) Moyenne géométrique.(c) Geometric mean.
(d) Déviation standard de la moyenne géométrique . (e) L'index de résistance le plus élevé obtenu dans les tests divisé par le plus faible.(d) Standard deviation from the geometric mean. (e) The highest resistance index obtained in the tests divided by the lowest.
(f) Le nombre de tests donnant un index de résistance >4 classant le virus comme résistant/ au nombre total de tests réalisés. (g) Un IC50 au-dessus de la gamme détectable dans tous les tests est indiqué par >. Dans ces cas, une déviation standard et un minimum/ maximum ne sont pas applicables (na) .(f) The number of tests giving a resistance index> 4 classifying the virus as resistant / to the total number of tests carried out. (g) An IC50 above the detectable range in all tests is indicated by>. In these cases, a standard deviation and a minimum / maximum are not applicable (na).
Les résultats phénotypiques obtenus pour cesThe phenotypic results obtained for these
Inhibiteurs de transcriptase inverse montrent une concordance avec les profils génotypiques des échantillons .Reverse transcriptase inhibitors show agreement with the genotypic profiles of the samples.
L'échantillon R2 , qui montre un degré élevé de résistance par rapport à tous les composés testés, comporte des mutations multiples en incluant celles du complexe de résistance multi-composé (62V, 751, 77L, 116Y et 151M) qui confère la résistance aux nucléotides RTI, la résistance 3TC associée à la mutation 184V et des mutations connues pour induire une susceptibilité réduite aux NNRTI (181C, 190A) .Sample R2, which shows a high degree of resistance compared to all the compounds tested, has multiple mutations including those of the multi-compound resistance complex (62V, 751, 77L, 116Y and 151M) which confers resistance to RTI nucleotides, 3TC resistance associated with the 184V mutation and mutations known to induce reduced susceptibility to NNRTI (181C, 190A).
L' échantillon R3 montre un niveau de résistance élevé à 3TC, à nouveau modulé par la mutation 184V, avec une variation considérable de l' IR pour AZT qui reflète probablement la nature inconsistante de la suppression de la résistance induite par 215F par 184V.Sample R3 shows a high resistance level to 3TC, again modulated by the mutation 184V, with a considerable variation of the IR for AZT which probably reflects the inconsistent nature of the suppression of resistance induced by 215F by 184V.
Dans l'échantillon R4, une telle suppression est contrecarrée par la présence de mutations multiples incluant une mutation 208Y.In the R4 sample, such deletion is counteracted by the presence of multiple mutations including a 208Y mutation.
L'échantillon R5 se maintient sensible à AZT malgré une mutation 41L et une mutation 215Y à cause des effets de la mutation 1001 qui, en combinaison avec 103N, est responsable des niveaux de résistance élevés observés vis-à-vis d' efavirenz et de nevirapine.The R5 sample remains sensitive to AZT despite a 41L mutation and a 215Y mutation because of the effects of the 1001 mutation which, in combination with 103N, is responsible for the high resistance levels observed with efavirenz and nevirapine.
V- Va 1 i dat i on de La méthode d' ana 1 yse pour détprminpr La susr.ppt i hi 1 i té f un vi rus VTH aux inhihitpurs dp fusion.V- Va 1 i dat i on of The method of ana yse for detprminpr The susr.ppt i hi 1 i té f a VTH virus with inhihitpurs of fusion.
Les recombinaisons obtenues en utilisant pour l'amplification de l'étape (b) la paire d'amorces FuA : 5ΑAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3' (SEQ ID No: 23) et FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24) suivie d'une deuxième amplification, effectuée avec l'amorce : FuC : 5ΑTATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3' (SEQ ID No: 25) et un mélange des amorces suivantes :The recombinations obtained using for the amplification of step (b) the pair of primers FuA: 5ΑAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3 '(SEQ ID No: 23) and FuB: 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No: 24) followed by a second amplification, carried out with the primer: FuC: 5ΑTATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3 '(SEQ ID No: 25) and a mixture of the following primers:
FuDl :5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 26) FuD2 :5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27) sont très efficaces.FuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27) are very effective.
En effet, pour obtenir une production virale satisfaisante il suffit généralement de 10-50 ng de produit de PCR, utilisé dans l'étape de recombinaison. Dans cette méthode destinée à analyser la caractéristique phénotypique de fusion, une production virale correspondante à 50-400 ng/ml de p24 est obtenue après transfection. Pour l'infection des cellules cible, entre 0,5 et 5 ng p24/ puit (plaques 96 puits) sont utilisés. L'augmentation de la densité optique obtenue après infection de cellules cible est linéaire si l'infection est conduite dans ces conditionsIndeed, to obtain a satisfactory viral production, it generally suffices from 10-50 ng of PCR product, used in the recombination step. In this method intended to analyze the phenotypic characteristic of fusion, a viral production corresponding to 50-400 ng / ml of p24 is obtained after transfection. For the infection of the target cells, between 0.5 and 5 ng p24 / well (96-well plates) are used. The increase in optical density obtained after infection of target cells is linear if the infection is carried out under these conditions
Afin de valider la méthode d' analyse concernant la susceptibilité des virus VIH aux inhibiteurs de fusion, deux inhibiteurs de fusion, ont été utilisés: un peptide dérivé de la séquence de l'hélice distale dans la gp41 de VIH (appelé DP178 ou T20) et un dérivé de l'acide bétulinique (RPR103611). Pour chaque inhibiteur, la réduction de sensibilité d'un ou plus virus résistant (précédemment identifié par d'autres auteurs) par rapport à deux virus de référence: un virus plasmatique primaire T5A1 et un virus adapté à la culture in vitro (LAI) a été effectuée. Tous les virus ont été produits par recombinaison.In order to validate the analysis method concerning the susceptibility of HIV viruses to fusion inhibitors, two fusion inhibitors were used: a peptide derived from the distal helix sequence in HIV gp41 (called DP178 or T20) and a derivative of betulinic acid (RPR103611). For each inhibitor, the reduction in sensitivity of one or more resistant viruses (previously identified by other authors) compared to two reference viruses: a primary plasma virus T5A1 and a virus suitable for in vitro culture (LAI) a been performed. All viruses were produced by recombination.
RésultatsResults
V.1- TnhihitPiir DP178 ou T?0.V.1- TnhihitPiir DP178 or T? 0.
L'augmentation de l'IC50 pour un virus fortement résistant NL-DIM (décrit par Rimsky L.T. et al. J. Virol. 1998, vol 72, pages 986-993) et pour le virus NL4.3 (qui est partiellement résistant) ont été mesurées vis-à-vis de cet inhibiteur.The increase in IC50 for a highly resistant NL-DIM virus (described by Rimsky LT et al. J. Virol. 1998, vol 72, pages 986-993) and for the NL4.3 virus (which is partially resistant) were measured against this inhibitor.
Le virus fortement résistant DIM présente une augmentation de la valeur de l'IC50 de 80 fois par rapport à T5A1 et de plus de 100 fois par rapport a LAI.The highly resistant DIM virus shows an increase in the IC50 value of 80 times compared to T5A1 and more than 100 times compared to LAI.
Le virus partiellement résistant NL4.3 est caractérisé par une augmentation de l'IC50 de 10 fois par rapport à T5A1 et de 12,5 fois par rapport a LAI. V.1.1 nétprnni nat i on de la susr.ppt i hi 1 i t é d'un VTH pi asmat i qip à lf inhihifpnr dp fusi on T?0The partially resistant NL4.3 virus is characterized by an increase in IC50 of 10 times compared to T5A1 and of 12.5 times compared to LAI. V.1.1 nétprnni nat i on de la susr.ppt i hi 1 it é a VTH pi asmat i qip à l f inhihifpnr dp fusi on T? 0
L'ARN viral est extrait à partir des plasmas de patients VIH positifs.Viral RNA is extracted from the plasmas of HIV positive patients.
On effectue une première amplification par PCR avec la paire d'amorces ED3_E01-.A first PCR amplification is carried out with the pair of primers ED3_E01-.
On effectue une seconde amplification par PCR avec la paire d'amorces E10_FuB pour obtenir un fragment d'ADN de 2200 paires de bases s' étendant entre les résidus 6322 et 8522.A second amplification is carried out by PCR with the pair of primers E10_FuB to obtain a DNA fragment of 2200 base pairs s' extending between residues 6322 and 8522.
On effectue la transfection d'un premier hôte cellulaire avec : - les acides nucléiques obtenus après la seconde amplification.The transfection of a first cellular host is carried out with: - the nucleic acids obtained after the second amplification.
- le vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extacellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH, s' étendant des résidus 6480 à 8263 inclus et comportant un site de restriction unique MluI.- the retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extacellular portion of the gp41 of the HIV envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive and comprising a unique restriction site MluI.
On met en culture du premier hôte cellulaire dans des conditions permettant de produire des particules virales.The first cell host is cultured under conditions allowing the production of viral particles.
On effectue l' infection par les particules virales produites à l'étape précédente, d'un second hôte cellulaire (comportant un gène marqueur activable suite à l'infection virale) en présence de dose croissante d'inhibiteur de fusion T20.Infection is carried out with the viral particles produced in the preceding step, of a second cellular host (comprising a marker gene which can be activated following viral infection) in the presence of an increasing dose of T20 fusion inhibitor.
On effectue la quantification du marqueur exprimé afin de mettre en évidence le niveau de susceptibilité des virus VIH présents dans les échantillons biologiques à l'inhibiteur de fusion T20.The expressed marker is quantified in order to highlight the level of susceptibility of HIV viruses present in biological samples to the T20 fusion inhibitor.
Les résultats de l'analyse phénotypique décrite ci-dessus pour des virus présents dans des plasmas de patients (P1,P2 et P3) et des prototypes viraux de référence (NL 43 et le clone résistant DIM) sont illustrés dans la figure 5 en annexe et les indices IC50 sont représentés dans le tableau 3 ci-dessous.The results of the phenotypic analysis described above for viruses present in patient plasmas (P1, P2 and P3) and reference viral prototypes (NL 43 and the resistant DIM clone) are illustrated in FIG. 5 in the appendix. and the IC50 indices are shown in Table 3 below.
Tableau 3Table 3
V . 2 - T n h i h i t PJ i r R PR 1 m fi l 1V. 2 - T n h i h i t PJ i r R PR 1 m fi l 1
L'augmentation de l'IC50 du virus résistant LAI-L91H (Labrosse B. et al. J Virol. 2000 vol 74 pages 2142-2150) vis -à-vis de cet inhibiteur a été mesurée.The increase in the IC50 of the resistant virus LAI-L91H (Labrosse B. et al. J Virol. 2000 vol 74 pages 2142-2150) vis-à-vis this inhibitor was measured.
Pour le virus LAI-L91H, l'augmentation de l'IC50 par rapport à LAI et à T5A1 est supérieure à 100 fois .For the LAI-L91H virus, the increase in the IC50 relative to LAI and to T5A1 is greater than 100 times.
VI- Optimisation ή p la méthode d'analyse po r HétPrminPr la (-.APΑr.TTF. NF.HTR AT.T SANTE ή > v rus VTH.VI- Optimization ή p the analysis method for HétPrminPr la (-.APΑr.TTF. NF.HTR AT.T SANTE ή> v rus VTH.
Les recombinaisons obtenues en utilisant pour l'amplification de l'étape (b) une paire d'amorces NEU- A : 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID No: 17) etThe recombinations obtained using for the amplification of step (b) a pair of primers NEU- A: 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3 '(SEQ ID No: 17) and
FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24), suivie d'une deuxième amplification, avec les amorces:FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification, with the primers:
NEU-C : 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 18) et un mélange des amorces FuDl : 5 ' TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 'NEU-C: 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3 '(SEQ ID No: 18) and a mixture of primers FuDl: 5' TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '
(SEQ ID No: 26) et FuD2 : 5 ' TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) and FuD2: 5 'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3'
(SEQ ID No: 27) sont également très efficaces.(SEQ ID No: 27) are also very effective.
En effet, lors des contrôles de production virale, il s'est avéré que pour obtenir une production virale satisfaisante il suffit généralement de 10-50 ng de produit de PCR, utilisé dans l'étape de recombinaison.Indeed, during the viral production checks, it has been found that to obtain a satisfactory viral production it is generally sufficient to have 10-50 ng of PCR product, used in the recombination step.
Une production virale correspondante à 50-400 ng/ml de p24 après transfection est obtenue. Pour l'infection des cellules cible, entre 0,5 et 5 ng p24/ puit (plaques 96 puits) sont utilisés. L'augmentation de la densité optique obtenue après infection de cellules cible est linéaire si l'infection est conduite dans ces conditions.A viral production corresponding to 50-400 ng / ml of p24 after transfection is obtained. For the infection of the target cells, between 0.5 and 5 ng p24 / well (96-well plates) are used. The increase in optical density obtained after infection of target cells is linear if the infection is carried out under these conditions.
VII . Mesure dp 1 ' i n fpot i vi é viralp (ou pst dp o paoité répl i Γ Ά t i P )VII. Measure dp 1 'i n fpot i vi é viralp (or pst dp o paid repl i Γ Ά t i P)
On effectue un première amplification par PCR avec la paire d'amorces FITA et PROA-A first PCR amplification is carried out with the pair of primers FITA and PROA-
On effectue une seconde amplification par PCR avec la paire d' amorces FITB et PROB- pour obtenir un fragment d'ADN de 1488 paires de bases s' étendant entre les résidus 1237 et 2725. On effectue la transfection d'un premier hôte cellulaire avec : les acides nucléiques obtenus après la seconde amplification. - le vecteur retroviral délété d'une région codant pour une partie de Gag et la totalité de la protéase et comportant un site de restriction unique MluI.A second PCR amplification is carried out with the pair of primers FITB and PROB- to obtain a DNA fragment of 1488 base pairs extending between residues 1237 and 2725. The transfection of a first cellular host is carried out with: the nucleic acids obtained after the second amplification. - the retroviral vector deleted from a region coding for part of Gag and all of the protease and comprising a unique MluI restriction site.
On effectue la culture du premier hôte cellulaire dans des conditions permettant de produire des particules virales.The culture of the first cell host is carried out under conditions allowing the production of viral particles.
On mesure la quantité de particules virales recombinantes dans le surnageant de cette culture par un test Elisa dosant la quantité d'antigène p24.The quantity of recombinant viral particles in the supernatant of this culture is measured by an Elisa test assaying the quantity of p24 antigen.
On effectue l' infection par les particules virales produites à l'étape précédente, d'un second hôte cellulaire (comportant un gène marqueur activable suite à l'infection virale), par des dilutions croissantes du surnageant viralInfection is carried out with the viral particles produced in the preceding step, of a second cellular host (comprising a marker gene which can be activated following viral infection), by increasing dilutions of the viral supernatant
On effectue la quantification du marqueur exprimé afin de mettre en évidence le niveau d ' infectivité du virus recombinantQuantification of the expressed marker is carried out in order to demonstrate the level of infectivity of the recombinant virus.
On calcule la capacité réplicative du virus recombinant en établissant une droite de régression à partir des valeurs mesurées et en retenant la pente de cette droite.The replicative capacity of the recombinant virus is calculated by establishing a regression line from the measured values and retaining the slope of this line.
On exprime la capacité réplicative virale par rapport à celle d'un virus de référence de laboratoire ou relativement au virus recombinant porteur des séquences virales provenant du même patient avant établissement du traitement et avant développement de la résistance. Les résults obtenus sont illustrés sur la figure 6 en annexe.The viral replicative capacity is expressed relative to that of a laboratory reference virus or relative to the recombinant virus carrying the viral sequences originating from the same patient before establishment of the treatment and before development of the resistance. The results obtained are illustrated in FIG. 6 in the appendix.
Les virus Ll, L2 et L3 correspondent à des virus recombinants porteurs de séquences de protéase obtenues à trois moments différents chez un même patient. Le virus Ll porte des séquences de protéase obtenues avant traitement. Chaque point correspond à la densité optique mesurée après infection de cellules indicatrices P4 par une dilution de chacun des 3 virus. On trace une droite de régression pour la série des mesures de chaque virus. On calcule la pente de la droite. On exprime la capacité réplicative de L2 par le rapport de la pente de L2 à celle de Ll, et la capacité réplicative de L3 par le rapport de la pente de L3 à celle de Ll . Ici le virus de référence est le virus préthérapeutique Ll . Lorsque le virus préthérapeutique manque, on peut exprimer la capacité réplicative d'un virus de patient relativement à un virus de référence de laboratoire comme pNL4-3. The L1, L2 and L3 viruses correspond to recombinant viruses carrying protease sequences obtained at three different times in the same patient. The L1 virus carries protease sequences obtained before treatment. Each point corresponds to the optical density measured after infection of P4 indicator cells by a dilution of each of the 3 viruses. We draw a regression line for the series of measurements for each virus. We calculate the slope of the line. The replicative capacity of L2 is expressed by the ratio of the slope of L2 to that of Ll, and the replicative capacity of L3 by the ratio of the slope of L3 to that of Ll. Here the reference virus is the pre-therapeutic virus L1. When the pre-therapeutic virus is lacking, the replicative capacity of a patient virus can be expressed relative to a laboratory reference virus such as pNL4-3.

Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode d'analyse d'une caractéristique phénotypique des virus VIH présents dans un échantillon biologique d'un patient, ladite caractéristique phénotypique résultant d'une ou plusieurs mutations du génome viral susceptibles d'influencer l'infection virale, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) l'extraction des acides nucléiques contenus dans ledit échantillon biologique, b) au moins une amplification par PCR d'un segment des acides nucléiques de l'étape (a), chacune avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique du génome viral susceptible de porter au moins une mutation, c) la préparation d'un vecteur comprenant les parties d'un génome d'un virus VIH nécessaires à la réplication virale à l'exception du segment amplifié à l'étape (b) et éventuellement à l'exception du gène codant pour la protéine d'enveloppe, d) la transfection d'un premier hôte cellulaire avec : les acides nucléiques obtenus à l'étape (b), - le vecteur préparé à l'étape (c),1) Method for analyzing a phenotypic characteristic of HIV viruses present in a biological sample from a patient, said phenotypic characteristic resulting from one or more mutations in the viral genome capable of influencing viral infection, characterized in that 'It comprises: a) the extraction of the nucleic acids contained in said biological sample, b) at least one PCR amplification of a segment of the nucleic acids of step (a), each with a pair of primers framing a nucleic acid sequence of the viral genome capable of carrying at least one mutation, c) the preparation of a vector comprising the parts of a genome of an HIV virus necessary for viral replication with the exception of the segment amplified at l step (b) and optionally with the exception of the gene coding for the envelope protein, d) the transfection of a first cellular host with: the nucleic acids obtained in step (b), the vector pr parried in step (c),
- éventuellement un second vecteur comprenant un gène codant pour une protéine d'enveloppe si le gène d'enveloppe est délété du vecteur préparé à l'étape (c), pour obtenir par recombinaison homologue un virus chimérique, e) la culture dudit premier hôte cellulaire dans des conditions permettant de produire des particules virales au cours d'un seul cycle de réplication, f) l'infection par les particules virales obtenues à l'étape (e) d'au moins un second hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH ou un virus pseudotypé VIH et comportant éventuellement un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, g) la détection et/ou la quantification du marqueur exprimé à l'étape (f) afin de mettre en évidence au moins une caractéristique des virus VIH présents dans l'échantillon biologique.- optionally a second vector comprising a gene coding for an envelope protein if the envelope gene is deleted from the vector prepared in step (c), to obtain by homologous recombination a chimeric virus, e) the culture of said first host cell under conditions allowing viral particles to be produced during a single replication cycle, f) infection by the viral particles obtained in step (e) of at least one second cellular host capable of being infected with an HIV virus or a virus pseudotyped HIV and possibly comprising a marker gene which can be activated only after viral infection, g) detection and / or quantification of the marker expressed in step (f) in order to demonstrate at least one characteristic of the HIV viruses present in the biological sample.
2) Méthode d'analyse selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique comprenant tout ou partie d'une région du génome virale choisie parmi: gag, pol, protéase, transcriptase inverse, RNAse H, intégrase, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef, séquences cis-actives, LTR, séquences de dimérisation, séquences régulatrices de l'épissage ou élément de réponse de Rev (RRE) .2) Method of analysis according to claim 1 characterized in that the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence comprising all or part of a region of the viral genome chosen from: gag, pol, protease, reverse transcriptase, RNAse H, integrase, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef, cis-active sequences, LTR, dimerization sequences, splicing regulatory sequences or Rev response element (RRE).
3) Méthode d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique codant pour une partie de la protéine gag du virus de l' immunodeficience humain et une séquence d'acide nucléique codant pour la protéase, susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéase et, en ce que le vecteur de l'étape (c) est construit à partir d'un génome d'un virus VIH où tout ou partie du gène codant pour la protéase est délété. 4) Méthode d'analyse selon les revendications 1 à 3 caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) portant au moins une mutation dans le gène codant pour la protéase est effectuée avec une paire d' amorces :3) Method of analysis according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence coding for a part of the gag protein of the human immunodeficiency virus and a nucleic acid sequence coding for the protease, capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the protease and, in that the vector of step (c) is constructed from a genome of an HIV virus where all or part of the gene encoding the protease is deleted. 4) Method of analysis according to claims 1 to 3 characterized in that the amplification of step (b) carrying at least one mutation in the gene coding for the protease is carried out with a pair of primers:
Fit A - : (5' TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No : 1) etFit A -: (5 'TCA CCT AGA ACT TTA AAT GC 3') (SEQ ID No: 1) and
Pro A- : (5' GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3 ' 3' ) (SEQ ID No : 2) , suivie d'une deuxième amplification avec une paire d' amorces :Pro A-: (5 'GGC AAA TAC TGG AGT ATT GTA TG3' 3 ') (SEQ ID No: 2), followed by a second amplification with a pair of primers:
Fit B : (5' AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3' ) (SEQ ID No : 3) etFit B: (5 'AGA ACT TTA AAT GCA TGG GT 3') (SEQ ID No: 3) and
Pro B- : (5' GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3' ) (SEQ ID No : 4) , pour obtenir un segment d'ADN de 1488 paires de bases, s' étendant entre les résidus 1237 et 2725 inclus, et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase du VIH-1 s' étendant des résidus 1505 à 2565 inclus, délété de la région d'enveloppe et comportant un site unique de restriction MluI.Pro B-: (5 'GGA GTA TTG TAT GGA TTT TCA GG 3') (SEQ ID No: 4), to obtain a DNA segment of 1488 base pairs, extending between residues 1237 and 2725 inclusive, and in that the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the region of the pol reading frame coding for the protease of HIV-1 extending from residues 1505 to 2565 inclusive, deleted from the region of envelope and comprising a single MluI restriction site.
5) Méthode d'analyse selon les revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la transcriptase inverse, et la transfection de l'étape (c) est réalisée avec un premier vecteur construit à partir d'un génome d'un virus VIH où tout ou partie du gène codant pour la transcriptase inverse est délété.5) Method of analysis according to claims 1 or 2 characterized in that the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for reverse transcriptase, and the transfection of step (c) is carried out with a first vector constructed from a genome of an HIV virus where all or part of the gene coding for reverse transcriptase is deleted.
6) Méthode d'analyse selon la revendication 1 , 2 ou 5, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces :6) Method of analysis according to claim 1, 2 or 5, characterized in that the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers:
MJ3 (5' AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No : 5) etMJ3 (5 'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (SEQ ID No: 5) and
RT-EXT (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No : 6) , suivie d'une deuxième étape d'amplification avec une paire d' amorces :RT-EXT (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ ID No: 6), followed by a second amplification step with a pair of primers:
A35 (5' TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (SEQ ID No : 7) et RT-IN (5' TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQA35 (5 'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (SEQ ID No: 7) and RT-IN (5 'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (SEQ
ID No : 8) pour obtenir un segment d'ADN de 1530 paires de bases s' étendant au delà du codon 93 de la région codant pour la protéase et au delà du codon 503 de la région codant pour la polymèrase (POL) et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la transcriptase inverse du VIH-ID No: 8) to obtain a DNA segment of 1530 base pairs extending beyond codon 93 of the region coding for the protease and beyond codon 503 of the region coding for the polymerase (POL) and that the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the region of the pol reading frame coding for HIV reverse transcriptase
1, s' étendant des résidus 2618 à 2872 inclus, et comportant un site unique de restriction MluI.1, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a single MluI restriction site.
7) Méthode d'analyse selon la revendication 1, ou 2, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique codant pour une partie de la protéine gag, pour la protéase et pour une partie de la transcriptase inverse du virus de 1' immunodeficience humaine susceptible de porter au moins une mutation dans la séquence d' acide nucléique codant pour la protéine gag, ou pour la protéase ou pour la transcriptase inverse.7) Method of analysis according to claim 1, or 2, characterized in that the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a sequence of nucleic acid coding for a part of the protein gag, for the protease and for part of the reverse transcriptase of the human immunodeficiency virus capable of carrying at least a mutation in the nucleic acid sequence encoding the gag protein, or the protease or the reverse transcriptase.
8) Méthode d'analyse selon la revendication8) Method of analysis according to claim
1, 2 ou 7 caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec la paire d'amorces : gag+1 (5' AGGGGCAAATGGTACATCA 3') (SEQ ID No : 31) et RT-EX (SEQ ID n° 6) , suivie d'une deuxième étape d'amplification avec une paire d' amorces :1, 2 or 7 characterized in that the amplification of step (b) is carried out with the pair of primers: gag + 1 (5 'AGGGGCAAATGGTACATCA 3') (SEQ ID No: 31) and RT-EX ( SEQ ID No. 6), followed by a second amplification step with a pair of primers:
Fit B+ (SEQ ID No : 1) et RT-IN (SEQ ID No : 8) pour obtenir un segment d'ADN de 2825 paires de bases, s' étendant entre les résidus 1237 et 4062 et en ce que la transfection de l'étape (c) est réalisée avec un vecteur retroviral délété d'une partie du gène gag et des régions du cadre de lecture pol codant pour la protéase et une partie de la transcriptase inverse du VIH-1 s' étendant des résidus 1507 à 3870 inclus, délété dans la région d'enveloppe et comportant un site unique de restriction NruI .Fit B + (SEQ ID No: 1) and RT-IN (SEQ ID No: 8) to obtain a DNA segment of 2825 base pairs, extending between residues 1237 and 4062 and in that the transfection of l step (c) is carried out with a retroviral vector deleted from part of the gag gene and regions of the pol reading frame coding for the protease and part of the HIV-1 reverse transcriptase extending from residues 1507 to 3870 included, deleted in the envelope region and having a unique NruI restriction site.
9) Méthode d'analyse selon les revendications9) Method of analysis according to the claims
1, 2, 5 ou 6 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur de la transcriptase inverse, caractérisée en ce que l'on ajoute ou non ledit composé inhibiteur de la transcriptase inverse, éventuellement à des concentrations différentes, au deuxième hôte cellulaire, préalablement à l' infection de celui-ci par les particules virales obtenues à l'étape (e) , et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur de la transcriptase inverse1, 2, 5 or 6 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to a reverse transcriptase inhibitor compound, characterized in whether or not said reverse transcriptase inhibitor compound is added, optionally at different concentrations, to the second cell host, prior to infection thereof with the viral particles obtained in step (e), and in that step (g) comprises the comparison of expression of the marker gene with and without reverse transcriptase inhibitor compound
10) Méthode d'analyse selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d' amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour l' intégrase, et le vecteur de l'étape (c ) est un vecteur retroviral délété de tout ou partie du gène codant pour l' intégrase.10) Method of analysis according to claims 1 or 2, characterized in that the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for integrase, and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from all or part of the gene coding for integrase.
11) Méthode d'analyse selon les revendication 1, 2 ou 10, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec la paire d'amorces :11) Method of analysis according to claim 1, 2 or 10, characterized in that the amplification of step (b) is carried out with the pair of primers:
INT B+ -5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3' (SEQ ID No: 9) etINT B + -5'GTTACTAATAGAGGAAGACAAA3 '(SEQ ID No: 9) and
INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3' (SEQ ID No: 10), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d' amorces :INT B- 5'TTTTGGTGTTATTAATGCT3 '(SEQ ID No: 10), followed by a second amplification step, with the pair of primers:
INT V+ 5'CACCCTAACTGACACAACAA3' (SEQ ID No:INT V + 5'CACCCTAACTGACACAACAA3 '(SEQ ID No:
11) et11) and
INT V- 5' AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3' (SEQ ID No:INT V- 5 'AAGGCCTTTCTTATAGCAGA3' (SEQ ID No:
12) pour obtenir un fragment d'ADN de 1460 paires de bases s' étendant des résidus 3950 à 5410 inclus et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région du cadre de lecture pol codant pour l' intégrase du VIH-1 s' étendant des résidus 4228 à 5093 inclus et de la région codant pour l'enveloppe virale entre les positions 6343 et 7611 incluses . 12) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 10 ou 11 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur de 1' intégrase, caractérisée en ce que l'on ajoute ledit composé inhibiteur de l' intégrase, éventuellement à des concentrations différentes, durant l'étape (e) , avant l'étape (f) et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur de l' intégrase.12) to obtain a DNA fragment of 1460 base pairs extending from residues 3950 to 5410 inclusive and in that the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region of the reading frame pol encoding HIV-1 integrase ranging from residues 4228 to 5093 inclusive and of the region encoding the viral envelope between positions 6343 and 7611 inclusive. 12) Method of analysis according to claims 1, 2, 10 or 11 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to an integrase inhibitor compound, characterized in that said integrase inhibitor compound is added , optionally at different concentrations, during step (e), before step (f) and in that step (g) comprises the comparison of the expression of the marker gene with and without compound inhibiting the integrase.
13) Méthode d'analyse selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'amplification par PCR de l'étape (b) est réalisée avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d'enveloppe, et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral construit à partir d'un génome d'un virus VIH où tout ou partie du gène codant pour la protéine d'enveloppe est délété.13) Method of analysis according to claims 1 or 2, characterized in that the PCR amplification of step (b) is carried out with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein, and in that the vector of step (c) is a retroviral vector constructed from a genome of an HIV virus where all or part of the gene coding for the envelope protein is deleted.
14) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2 ou 13 caractérisée en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous-unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, de la région du génome VIH-1 constitutrice de l'élément de réponse à Rev (RRE).14) Method of analysis according to claims 1, 2 or 13 characterized in that the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the envelope of HIV-1, ranging from residues 7745 to 8263 inclusive, of the region of the HIV-1 genome constituting the response element to Rev (RRE).
15) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13 ou 14, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d' amorces :15) Method of analysis according to claims 1, 2, 13 or 14, characterized in that the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers:
FIN-A : 5'TCAAATATTACAGGGCTGCT3' (SEQ ID No:FIN-A: 5'TCAAATATTACAGGGCTGCT3 '(SEQ ID No:
13) et FIN-B : 5' TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No:13) and FIN-B: 5 'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No:
14) suivie d'une deuxième étape d'amplification, effectuée avec la paire d'amorces :14) followed by a second amplification step, carried out with the pair of primers:
FIN-C : 5'CTATTAACAAGAGATGGTGG3' (SEQ ID No:FIN-C: 5'CTATTAACAAGAGATGGTGG3 '(SEQ ID No:
15) et FIN-D : 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No:15) and FIN-D: 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3 '(SEQ ID No:
16), pour obtenir un segment d'ADN de 965 paires de bases s' étendant des résidus 7553 à 8517 inclus et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous-unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.16), to obtain a DNA segment of 965 base pairs extending from residues 7553 to 8517 inclusive and in that the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the portion extracellular of the HIV-1 envelope gp41 subunit, ranging from residues 7745 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
16) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13 ou 14 caractérisé en ce que l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d' enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces :16) Method of analysis according to claims 1, 2, 13 or 14 characterized in that the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
FuA : 5ΑAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3' (SEQ ID No: 23) etFuA: 5ΑAGCAATGTATGCCCCTCCCAT3 '(SEQ ID No: 23) and
FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24) suivie d'une deuxième étape d'amplification, effectuée avec l'amorce : FuC : 5ΑTATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3' (SEQ IDFuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24) followed by a second amplification step, carried out with the primer: FuC: 5ΑTATGAGGGACAATTGGAGAAGTGA3 '(SEQ ID
No: 25! et un mélange des amorces suivantes :No: 25! and a mixture of the following primers:
FuDl :5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ IDFuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID
No: 261No: 261
FuD2 :5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ IDFuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID
No: 27' ledit mélange étant préférentiellement effectué dans un rapport compris entre (10% :90%) et (90% :10%) et tout préférentiellement entre (60% :40%) et (40% :60%), pour obtenir un segment d'ADN de 805 paires de bases s' étendant des résidus 7635 à 8440 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous-unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s' étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.No: 27 ', said mixing preferably being carried out in a ratio between (10%: 90%) and (90%: 10%) and most preferably between (60%: 40%) and (40%: 60%), for obtaining a DNA segment of 805 base pairs extending from residues 7635 to 8440 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
17) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13 ou 14 , caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces :17) Method of analysis according to claims 1, 2, 13 or 14, characterized in that the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers:
NEU-A : 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID No: 17) etNEU-A: 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3 '(SEQ ID No: 17) and
FIN-B : 5'TAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 14), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d'amorces:FIN-B: 5'TAGCTGAAGAGGCACAGG3 '(SEQ ID No: 14), followed by a second amplification step, with the pair of primers:
NEU-C : 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 18) etNEU-C: 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3 '(SEQ ID No: 18) and
FIN-D : 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3' (SEQ ID No: 16), pour obtenir un fragment d'ADN compris entre 2106 et 2320 paires de bases s'étendant des résidus 6197- 6222 jusqu'aux résidus 6197-6222 inclus et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique MluI.FIN-D: 5'TCCACCTTCTTCTTCGATT3 '(SEQ ID No: 16), to obtain a DNA fragment between 2106 and 2320 base pairs extending from residues 6197- 6222 to residues 6197-6222 inclusive and in that the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region encoding the majority of the gpl20 subunit and the extracellular portion of the gp41 of the HIV-1 envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and has a unique MluI restriction site.
18) Méthode d'analyse selon les revendication 1, 2, 13 ou 14 , caractérisée en ce l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d'enveloppe est effectuée avec une paire d' amorces :18) Method of analysis according to claims 1, 2, 13 or 14, characterized in that the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene coding for the envelope protein is carried out with a pair of primers:
NEU-A : 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3' (SEQ ID No: 17) etNEU-A: 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATG3 '(SEQ ID No: 17) and
FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec les amorces:FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24), followed by a second amplification step, with the primers:
NEU-C : 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3' (SEQ ID No: 18) et un mélange des amorcesNEU-C: 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGG3 '(SEQ ID No: 18) and a mixture of primers
FuDl :5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 26) etFuDl: 5'TCTGTCTCTCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 26) and
FuD2 :5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3' (SEQ ID No: 27), ledit mélange étant préférentiellement effectué dans un rapport compris entre (10% :90%) et (90% :10%) et tout préférentiellement entre (60% :40%) et (40% :60%), pour obtenir un fragment d'ADN de 2118 paires de bases s'étendant des résidus 6322 à 8440 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous- unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull.FuD2: 5'TCTGTCTTGCTCTCCACCTTCTTCTT3 '(SEQ ID No: 27), said mixing being preferably carried out in a ratio between (10%: 90%) and (90%: 10%) and most preferably between (60%: 40%) and (40%: 60%), to obtain a DNA fragment of 2118 base pairs extending from residues 6322 to 8440 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extracellular portion of the gp41 of the HIV-1 envelope, extending from residues 6480 at 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site.
19) Méthode d'analyse selon les revendication 1, 2, 13 ou 14, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique susceptible de porter au moins une mutation dans le gène codant pour la protéine d'enveloppe est effectuée avec la paire d'amorces :19) Analysis method according to claims 1, 2, 13 or 14, characterized in that the amplification of step (b) with a pair of primers framing a nucleic acid sequence capable of carrying at least one mutation in the gene encoding the envelope protein is carried out with the pair of primers:
ED3 : 5'TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG3' (SEQ ID No: 28) etED3: 5'TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG3 '(SEQ ID No: 28) and
E01 : 5' TCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTAAAAA3 ' (SEQ ID No: 29), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec les amorces: E10 : 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGT3' (SEQ IDE01: 5 'TCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTAAAAA3' (SEQ ID No: 29), followed by a second amplification step, with the primers: E10: 5'GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGT3 '(SEQ ID
No: 30) etNo: 30) and
FuB : 5' GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3 ' (SEQ ID No: 24) pour obtenir un fragment d'ADN de 2200 paires de bases s'étendant des résidus 6322 à 8522 inclus et le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous- unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull. 20) Méthode d'analyse selon les revendication 1, 2, 13 ou 14, caractérisée en ce que l'amplification de l'étape (b) est effectuée avec une paire d'amorces :FuB: 5 'GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG3' (SEQ ID No: 24) to obtain a 2200 base pair DNA fragment extending from residues 6322 to 8522 inclusive and the vector of step (c) is a retroviral vector deleted from the entire region encoding the majority of the gpl20 subunit and the extracellular portion of gp41 of the HIV-1 envelope, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and has a unique Mull restriction site. 20) Method of analysis according to claims 1, 2, 13 or 14, characterized in that the amplification of step (b) is carried out with a pair of primers:
E00 : 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3' (SEQ ID No: 19) etE00: 5'TAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGA3 '(SEQ ID No: 19) and
ES8B : 5'CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3' (SEQ ID No: 20), suivie d'une deuxième étape d'amplification, avec la paire d'amorces: E20: 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3' (SEQ IDES8B: 5'CACTTCTCCAATTGTCCCTCA3 '(SEQ ID No: 20), followed by a second amplification step, with the pair of primers: E20: 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG3' (SEQ ID
No: 21) etNo: 21) and
El 15 : 5ΑGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3' (SEQ ID No: 22), pour obtenir un segment d'ADN de 938 paires de bases s'étendant des résidus 6426 à 7364 inclus et en ce que le vecteur de l'étape (c) est un vecteur retroviral délété de la région, codant pour les domaines allant de la boucle VI à la boucle V3 de l'enveloppe du VIH-1 s'étendant de 6617 à 7250 inclus et comporte un site de restriction unique Nhel.El 15: 5ΑGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA3 '(SEQ ID No: 22), to obtain a DNA segment of 938 base pairs extending from residues 6426 to 7364 inclusive and in that the vector of step (c) is a vector retroviral deleted from the region, coding for domains ranging from loop VI to loop V3 of the HIV-1 envelope extending from 6617 to 7250 inclusive and comprises a unique Nhel restriction site.
21) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13 à 20 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur de fusion ciblant la protéine gp41 du VIH-1, caractérisée en ce que l'on ajoute ledit composé inhibiteur de fusion, éventuellement à des concentrations différentes, durant la culture de l'hôte cellulaire obtenu à l'étape (e), avant l'étape (f) et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur de fusion ciblant la gp41 du VIH-1. 22) Méthode d'analyse selon les revendication 1, 2, 13, 14 ou 16 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur d'entrée dudit virus VIH dans une cellule cible, caractérisée en ce que l'on ajoute ledit composé inhibiteur d'entrée, éventuellement à des concentrations différentes, à l'hôte cellulaire obtenu à l'étape (e) avant l'infection de l'étape (f) et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans composé inhibiteur d'entrée.21) Method of analysis according to claims 1, 2, 13 to 20 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to a fusion inhibitor compound targeting the gp41 protein of HIV-1, characterized in that the said is added fusion inhibitor compound, optionally at different concentrations, during the culture of the cell host obtained in step (e), before step (f) and in that step (g) comprises the comparison of the expression of the marker gene with and without a fusion inhibitor compound targeting HIV-1 gp41. 22) Method of analysis according to claims 1, 2, 13, 14 or 16 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to a compound which inhibits entry of said HIV virus into a target cell, characterized in that one add said entry inhibitor compound, optionally at different concentrations, to the cell host obtained in step (e) before infection in step (f) and in that step (g) comprises comparison of marker gene expression with and without entry inhibitor compound.
23) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13, 14 ou 17 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à l'action inhibitrice des anticorps, caractérisée en ce que ladite méthode est réalisée, d'une part sans anticorps et d'autre part avec l'anticorps, éventuellement à différentes concentrations, ledit anticorps étant présents à l'étape (e) , et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans anticorps.23) Method of analysis according to claims 1, 2, 13, 14 or 17 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to the inhibitory action of antibodies, characterized in that said method is carried out, on the one hand without antibody and on the other hand with the antibody, optionally at different concentrations, said antibody being present in step (e), and in that step (g) comprises comparing the expression of the marker gene with and without antibodies.
24) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13, 14 ou 17 consistant à déterminer le tropisme d'un virus VIH pour un récepteur cellulaire, caractérisée en ce que l'infection de l'étape (f) avec les particules virales obtenues à l'étape (e) est effectuée sur deux hôtes cellulaires distincts et l'étape24) Method of analysis according to claims 1, 2, 13, 14 or 17 consisting in determining the tropism of an HIV virus for a cellular receptor, characterized in that the infection of step (f) with the particles obtained in step (e) is performed on two separate cellular hosts and step
(g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts.(g) includes comparing the expression of the marker gene by each of the two distinct cell hosts.
25) Méthode d'analyse selon la revendication 24 caractérisée en ce que l'un de deux hôtes cellulaires infectés à l'étape (f) exprime le récepteur CCR5 et l'autre exprime le récepteur CXCR4.25) Method of analysis according to claim 24 characterized in that one of two cellular hosts infected in step (f) expresses the CCR5 receptor and the other expresses the CXCR4 receptor.
26) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13, 14 ou 17 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, caractérisée en ce que l'on ajoute ou non ledit composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, éventuellement à des concentrations différentes, durant l'étape (e) de culture, en ce que l'infection de l'étape (f) est effectuée sur deux hôtes cellulaires distincts et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts .26) Method of analysis according to claims 1, 2, 13, 14 or 17 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to an inhibitor compound targeting the HIV-1 coreceptors, characterized in that one adds or not said inhibitor compound targeting HIV-1 coreceptors, optionally at different concentrations, during culture step (e), in that the infection in step (f) is carried out on two distinct cellular hosts and in this that step (g) comprises the comparison of the expression of the marker gene by each of the two distinct cellular hosts.
27) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13, 14 ou 20 consistant à analyser le tropisme d'un virus VIH pour un récepteur cellulaire, caractérisée en ce que l'infection de l'étape (f) avec les particules virales obtenues à l'étape (e) est effectuée sur deux hôtes cellulaires distincts et l'étape27) Method of analysis according to claims 1, 2, 13, 14 or 20 consisting in analyzing the tropism of an HIV virus for a cellular receptor, characterized in that the infection of step (f) with the particles obtained in step (e) is performed on two separate cellular hosts and step
(g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts.(g) includes comparing the expression of the marker gene by each of the two distinct cell hosts.
28) Méthode d'analyse selon les revendications 1, 2, 13, 14 ou 20 consistant à analyser la susceptibilité d'un virus VIH à un composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, caractérisée en ce que l'on ajoute ledit composé inhibiteur ciblant les corecepteurs du VIH-1, éventuellement à des concentrations différentes, durant la culture de l'étape (d) , en ce que l'infection de l'étape (f) avec les particules virales obtenues à l'étape (e) est effectuée sur deux hôtes cellulaires distincts et en ce que l'étape28) Method of analysis according to claims 1, 2, 13, 14 or 20 consisting in analyzing the susceptibility of an HIV virus to an inhibitor compound targeting the HIV-1 coreceptors, characterized in that said compound is added inhibitor targeting HIV-1 co-receptors, possibly at different concentrations, during the culture of step (d), in that the infection of step (f) with the viral particles obtained in step (e) is carried out on two distinct cellular hosts and in that the step
(g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur par chacun des deux hôtes cellulaires distincts.(g) includes comparing the expression of the marker gene by each of the two distinct cell hosts.
29) Méthode d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 consistant à déterminer 1' infectivité ou la capacité réplicative d'un virus VIH caractérisée en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur par le second hôte cellulaire infecté avec les particules virales obtenues en appliquant les étapes (a) à (f) à un échantillon biologique d'un patient, et l'expression du gène marqueur par le même second hôte cellulaire infecté avec les particules virales de référence obtenues en appliquant les étapes (a) à (f) à un échantillon contenant un virus de référence.29) Method of analysis according to any one of claims 1 to 20 consisting in determining the infectivity or the replicative capacity of an HIV virus characterized in that step (g) comprises the comparison of the expression of the gene marker by the second cellular host infected with the viral particles obtained by applying steps (a) to (f) to a biological sample from a patient, and the expression of the marker gene by the same second cellular host infected with the viral particles standards obtained by applying steps (a) to (f) to a sample containing a reference virus.
30) Méthode d'analyse selon la revendication 29 caractérisée en ce que les particules virales de référence issues d'un virus de référence sont des particules virales obtenues par l'application des étapes (a) à (f) à un échantillon biologique du même patient à un stade préalable du traitement thérapeutique ou avant celui-ci.30) Method of analysis according to claim 29 characterized in that the reference viral particles derived from a reference virus are viral particles obtained by the application of steps (a) to (f) to a biological sample of the same patient at a stage prior to or before the therapeutic treatment.
31) Méthode d'analyse selon les revendications 1 à 20 consistant à déterminer la susceptibilité d'un virus VIH à l' hydroxyurée, caractérisée en ce que l'on ajoute ou non de 1' hydroxyurée, éventuellement à des concentrations différentes, soit durant l'étape (e) de culture, soit au deuxième hôte cellulaire, avant l'infection de celui-ci à l'étape (f) et en ce que l'étape (g) comprend la comparaison de l'expression du gène marqueur avec et sans hydroxyurée .31) Method of analysis according to claims 1 to 20 consisting in determining the susceptibility of an HIV virus to hydroxyurea, characterized in that hydroxyurea is added or not, optionally at different concentrations, either during stage (e) of culture, that is to say the second cell host, before the infection thereof step (f) and in that step (g) comprises comparing the expression of the marker gene with and without hydroxyurea.
32) Méthode d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 31 caractérisé en ce que l'étape (e) de culture est effectuée durant une période allant de 12 heures à 72 heures, de préférence de 24 heures à 48 heures .32) Method of analysis according to any one of claims 1 to 31 characterized in that the culture step (e) is carried out during a period ranging from 12 hours to 72 hours, preferably from 24 hours to 48 hours.
33) Un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 caractérisé en ce qu' il comprend : i) une paire d'amorces encadrant une séquence d' acide nucléique du génome viral susceptible de porter au moins une mutation, ii) un vecteur comprenant les parties d'un génome d'un virus VIH nécessaires à la réplication virale à l'exception du segment amplifié avec les amorces définies en (i) et du gène codant pour la protéine d' enveloppe, iii) un second vecteur comprenant un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé. 34) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences : - SEQ ID No : 1 et SEQ ID No : 233) A kit for implementing a method according to any one of claims 1 to 32, characterized in that it comprises: i) a pair of primers framing a nucleic acid sequence of the viral genome capable of carry at least one mutation, ii) a vector comprising the parts of a genome of an HIV virus necessary for viral replication with the exception of the segment amplified with the primers defined in (i) and of the gene coding for the protein d envelope, iii) a second vector comprising a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker. 34) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences: - SEQ ID No: 1 and SEQ ID No: 2
- SEQ ID No : 3 et SEQ ID No : 4 ii) un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la protéase du VIH-1 s'étendant des résidus 1505 à 2565 inclus, délété de la région d'enveloppe et comportant un site unique de restriction MluI, iii) un virus pseudotypé avec un gène codant pour une protéine d'enveloppe. iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 3 and SEQ ID No: 4 ii) a deleted retroviral vector from the region of the pol reading frame coding for the HIV-1 protease extending from residues 1505 to 2565 inclusive, deleted from the region of envelope and comprising a single MluI restriction site, iii) a virus pseudotyped with a gene coding for an envelope protein. iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
35) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences :35) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences:
- SEQ ID No : 5 et SEQ ID No : 7- SEQ ID No: 5 and SEQ ID No: 7
- SEQ ID No : 6 et SEQ ID No : 8 ii) un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la transcriptase inverse du VIH-1, s'étendant des résidus 2618 à 2872 inclus, et comportant un site unique de restriction MluI, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 6 and SEQ ID No: 8 ii) a deleted retroviral vector from the region of the pol reading frame coding for HIV-1 reverse transcriptase, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a site unique MluI restriction, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene activatable only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
36) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences :36) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences:
- SEQ ID No : 9 et SEQ ID No : 10- SEQ ID No: 9 and SEQ ID No: 10
- SEQ ID No : 11 et SEQ ID No : 12 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région du cadre de lecture pol codant pour l' intégrase du- SEQ ID No: 11 and SEQ ID No: 12 ii) a deleted retroviral vector from the entire region of the pol reading frame coding for the integrase of the.
VIH-1 s'étendant des résidus 4228 à 5093 inclus et de la région codant pour l'enveloppe virale entre les positionsHIV-1 extending from residues 4228 to 5093 inclusive and the region encoding the viral envelope between positions
6343 et 7611 incluses, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.6343 and 7611 inclusive, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with a HIV virus and comprising a marker gene which can only be activated following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) products and reagents for the detection of the expressed marker.
37) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences37) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 13 et SEQ ID No : 14- SEQ ID No: 13 and SEQ ID No: 14
- SEQ ID No : 15 et SEQ ID No : 16 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous- unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l' infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 15 and SEQ ID No: 16 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 included, and comprising a single Mull restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of to be infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the marker Express.
38) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences - SEQ ID No : 23 et SEQ ID No : 2438) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of sequence primers - SEQ ID No: 23 and SEQ ID No: 24
- SEQ ID No : 25 et SEQ ID No : 26 avec SEQ ID No : 27 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la portion extracellulaire de la sous- unité gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 7745 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l' infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 25 and SEQ ID No: 26 with SEQ ID No: 27 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the extracellular portion of the gp41 subunit of the HIV-1 envelope, extending from residues 7745 to 8263 inclusive, and comprising a single Mull restriction site, iii ) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected by an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected by an HIV virus and comprising a gene marker activatable only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
39) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences39) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 17 et SEQ ID No : 14- SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 14
- SEQ ID No : 18 et SEQ ID No : 16 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement par des particules virales, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.- SEQ ID No: 18 and SEQ ID No: 16 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extracellular portion of the gp41 of the HIV-1 envelope, s extending residues 6480 to 8263 inclusive, and comprising a unique Mull restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene activatable only by viral particles, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
40) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences40) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 17 et SEQ ID No : 24- SEQ ID No: 17 and SEQ ID No: 24
- SEQ ID No : 18 et SEQ ID No : 26 et SEQ ID No : 27 ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comportant un site de restriction unique Mull, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement par des particules virales, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé. 41) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences- SEQ ID No: 18 and SEQ ID No: 26 and SEQ ID No: 27 ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extracellular portion of the gp41 of the envelope of HIV-1, extending from residues 6480 to 8263 inclusive, and comprising a unique Mull restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene activatable only by viral particles, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker. 41) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences
- SEQ ID No : 19 et SEQ ID No : 20 - SEQ ID No : 21 et SEQ ID No : 22 ii) un vecteur retroviral délété de la région, codant pour les domaines allant de la boucle VI à la boucle V3 de l'enveloppe du VIH-1 s'étendant de 6617 à- SEQ ID No: 19 and SEQ ID No: 20 - SEQ ID No: 21 and SEQ ID No: 22 ii) a retroviral vector deleted from the region, coding for domains ranging from loop VI to loop V3 of HIV-1 envelope ranging from 6617 to
7250 inclus et comportant un site de restriction unique Nhel, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.7250 inclusive and comprising a unique Nhel restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host susceptible to be infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the marker Express.
42) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences: (SEQ ID No : 5) et (SEQ ID No : 6), (SEQ ID No : 7) et (SEQ ID No : 8) ii) un vecteur retroviral délété de la région du cadre de lecture pol codant pour la transcriptase inverse du VIH-1, s'étendant des résidus 2618 à 2872 inclus, et comportant un site unique de restriction MluI . iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d'être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé.42) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences: (SEQ ID No: 5) and (SEQ ID No: 6), (SEQ ID No: 7) and (SEQ ID No: 8) ii) a deleted retroviral vector from the pol reading frame region coding for HIV-1 reverse transcriptase, extending from residues 2618 to 2872 inclusive, and comprising a single MluI restriction site . iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cellular host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene activatable only following viral infection, vi) the products and reagents necessary to carry out the amplification by PCR, vii) the products and reagents allowing the detection of the expressed marker.
43) Un kit selon la revendication 33, caractérisé en ce qu' il comprend : i) les paires d'amorces de séquences: (SEQ ID No: 28) et (SEQ ID No: 29) et (SEQ ID No: 30) et (SEQ ID No: 24) ii) un vecteur retroviral délété de toute la région codant pour la majorité de la sous-unité gpl20 et de la portion extracellulaire de la gp41 de l'enveloppe du VIH-1, s'étendant des résidus 6480 à 8263 inclus, et comporte un site de restriction unique Mull, iii) un virus pseudotypé par un gène codant pour une protéine d'enveloppe, iv) un premier hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH, v) un second hôte cellulaire susceptible d' être infecté par un virus VIH et comportant un gène marqueur activable uniquement à la suite de l'infection virale, vi) les produits et réactifs nécessaires pour réaliser l'amplification par PCR, vii) les produits et réactifs permettant la détection du marqueur exprimé. 43) A kit according to claim 33, characterized in that it comprises: i) the pairs of primers of sequences: (SEQ ID No: 28) and (SEQ ID No: 29) and (SEQ ID No: 30) and (SEQ ID No: 24) ii) a retroviral vector deleted from the entire region coding for the majority of the gpl20 subunit and of the extracellular portion of the gp41 of the HIV-1 envelope, extending from the residues 6480 to 8263 inclusive, and includes a unique Mull restriction site, iii) a virus pseudotyped by a gene coding for an envelope protein, iv) a first cellular host capable of being infected with an HIV virus, v) a second cell host capable of being infected with an HIV virus and comprising a marker gene which can be activated only following viral infection, vi) the products and reagents necessary for carrying out the amplification by PCR, vii) products and reagents for the detection of the expressed marker.
EP01993700A 2000-11-10 2001-11-09 Novel method for analysing phenotypic characteristics of human immunodeficiency virus (hiv) Withdrawn EP1364071A2 (en)

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