EP1343586B1 - Procedes de concentration d'un analyte present dans un echantillon - Google Patents

Procedes de concentration d'un analyte present dans un echantillon Download PDF

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EP1343586B1
EP1343586B1 EP01998402A EP01998402A EP1343586B1 EP 1343586 B1 EP1343586 B1 EP 1343586B1 EP 01998402 A EP01998402 A EP 01998402A EP 01998402 A EP01998402 A EP 01998402A EP 1343586 B1 EP1343586 B1 EP 1343586B1
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EP
European Patent Office
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analyte
container
bottleneck
volume
magnetic particles
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EP01998402A
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German (de)
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EP1343586A1 (fr
Inventor
Pierre Puget
Patrick Pouteau
Frédéric Ginot
Patrice Caillat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Publication date
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    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications

Definitions

  • the present invention relates to a concentration process of an analyte present in a sample according to the claims 1 and 2.
  • many diagnostic tests in in vitro consist in chemically reacting an analyte searched with a suitable reagent. The one or products of the reaction is then detected directly or indirectly.
  • immunoassays in which the chemical reaction is a antibody / antigen recognition, or more general a protein / ligand reaction, and tests by probes of nucleic acid (s) in which we detect hybridization between nucleic acids.
  • a diagnostic test is all the better presents both sensitivity and specificity high. It is all the more sensitive as it allows detect a small amount of desired analyte. he is all the more specific as it is only positive for the desired analyte and not for analytes similar ..
  • Analyte means all or part of corpuscle or molecule that one wishes to isolate, to change medium and / or concentrate to be used and / or such as a microorganism, a bacterium, a fungus, a virus, a eukaryotic cell; a chemical compound ; a molecule such as a peptide, a protein, an enzyme, a polysaccharide, a lipid, a lipoprotein, a lipopolysaccharide, an acid nucleic acid, a hormone, an antigen, an antibody, a growth factor, a hapten; a cell such than a tumor cell etc.
  • Biologists have quite the means classical concentration of an analyte using including centrifugation techniques, filtration and / or magnetic sedimentation. These techniques require transfer of solutions and manipulations of the analyte that lead to a inevitable reduction in the amount of analyte analyzable.
  • the stages of centrifugation or magnetic sedimentation as such may need to be repeated several times time, the limit of the number of repetitions being imposed by the minimum volume of solution that can be easily and reliably handled with a pipette classic.
  • This minimum volume is of the order of ten micro-liters.
  • WO-A-9426414 discloses a method of transporting an analyte attached to magnetic particles from one container to a second.
  • the present invention meets this need, and not only offers the advantage of disadvantages mentioned above, but also many others advantages that the person skilled in the art will not fail to raise.
  • the analytes are defined above.
  • the preparation of solution A from the sample includes a step in which the analyte is preferably fixed reversibly on magnetic particles. The usefulness of this reversibility is explained below.
  • Magnetic particles have an adequate size particularly with the analyte to be isolated, and with the volume of solution A. They can be of sub-micrometric size for example when the analyte is a molecule.
  • the amount of particles used is function particular of the nature and amount of analyte to fix, it is preferably sufficient in number to fix all of the analyte.
  • the particles magnetic elements which can be used in the process of this invention may be for example products such than those of the trademark Dynabeads of the company Dynal (Norway) or MACS from Miltenyi Biotec (Germany), or products of the Immunicon Corp. company (USA).
  • magnetic particles usable are classically used in biology molecular and cellular. They must be in particular superparamagnetic in order to rebroadcast spontaneously after cancellation of the magnetic field.
  • thermosensitive magnetic particles having each a magnetic core covered with a layer intermediate.
  • the middle layer is itself covered by an outer layer based on a polymer likely to interact with at least one molecule biological, the outer polymer is thermosensitive and has a lower critical temperature of solubility (LCST) of between 10 and 100 ° C and preferably between 20 and 60 ° C.
  • LCST critical temperature of solubility
  • This layer external is synthesized from monomers cationic, which generate a polymer with the capacity to bind the nucleic acids.
  • This layer intermediate isolates the magnetic charges from the nucleus, to avoid the problems of inhibition of techniques amplification of these nucleic acids.
  • the magnetic particles released from the analyte can be moved out of the second container by means of a magnetic system. This can be useful for example to avoid any detrimental interaction of particles with released analytes and / or with chemical reagents and / or means used to highlight it.
  • the release of the analyte sought, or elution of the analyte can be performed for example in a buffer solution for example by heating or another suitable method.
  • the processes of release usable are all processes classic of the state of the art.
  • the techniques chromatographies offer a whole range of protein release techniques or other ligand usable in the process of the present invention, such as a pH change or a change in strength ionic, or a change of solvent, or the buffering containing EDTA or any other chelating substance of metal cations if the analyte is attached to the particle by a technique of metal-chelate.
  • the analyte is an oligonucleotide, can for example heat to a temperature of 50 to 60 ° C for an oligonucleotide of length 15 to 25 bases to dissociate all analytes from particles magnetic.
  • the magnetic system is a system for creating a fixed magnetic field or variable generating the application of a force on the magnetic beads, capable of immobilizing them or move them. It can consist of a set magnets or coils.
  • Coils of this type are for example Collectively manufactured using technologies mentioned above for making read / write heads hard drives.
  • magnetic particles after being transported, can be brought back into suspension, for example in the second container, by cancellation of the. magnetic field created by the system magnetic.
  • the analyte can be released in the second container, and the analyte can be moved either under transport of the liquid containing the analytes, with transport by displacement of a liquid second container to a third container.
  • the particles can be displaced magnetic released from the analyte of the second container to the first container via the bottleneck, or from the bottleneck to the first container, to the means of a magnetic system.
  • the analyte can be released from the magnetic particles by changing physical or chemical conditions for example by heating or by reaction with at least one substance in the other solution.
  • an immobilization agent of the analyte can be fixed on all or part of at least a wall of the second container or any support solid present in said second container.
  • media may consist of silica beads, hollow, solid glass beads or porous, quartz particles, grains of sand, vermiculite grains, zeolite and / or feldspar, glass wool and / or rock, clay balls, cork particles, marbles polystyrene, polyethylene, polypropylene, Small sintered polyethylene, porosity variable thickness, latex balls, balls coated with gelatin, and resin grains.
  • the bottleneck can be in the form of a capillary.
  • This form can to be interesting for example to limit the diffusion from the analyte from the second container to the first containing when said analyte was released from magnetic particles.
  • hybridization pads fixed on a surface of the second container so that they are accessible to the analyte when it is in the second container. This can be done by example in the form of an integrated microarray. So, according to the present invention, when the analyte to put in evidence is a nucleic acid it can be put in evidence by a nucleic acid chip technology.
  • the second container can therefore be a reservoir of a microcomponent, by example of a biochip, for example a DNA chip.
  • biochip we mean any solid support on which are fixed ligands, and in particular by a chip DNA means any solid support on which are fixed nucleic acids.
  • the method of fixing ligands can be achieved in different ways and especially by adsorption or covalence, for example in situ synthesis by the techniques of photolithography or by a piezoelectric system, by capillary deposition of preformed ligands.
  • examples of these biochips applied DNA chips are given in G.'s publications Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p. 40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, p.
  • the second container can be also an entrance chamber to another containing a another process.
  • the second container can be connected directly or indirectly to another container used for other chemical reactions or stages of process targeting the analyte or a derivative thereof that a purification, an amplification, a marking, etc.
  • the other container or room may to be a PCR chamber to amplify a gene, possibly with then an analysis in a micro-total analysis system: MicroTAS).
  • reagents can be used, such as freeze-dried reagents, by example to make a homogeneous detection test of the analyte, for example by fluorescence transfer.
  • the analyte is defined above.
  • the volumes of the first and second containers are preferably adapted to volumes of solutions to handle. These volumes may be less than or equal to 10 ml.
  • These containers are used for example as reaction chambers.
  • the aforementioned techniques also make it possible to achieve capillaries of section from a few microns-squares to a few hundred thousand micron-squares for the transfer of solutions, or an analyte fixed on microparticles, according to the present invention, first container to a second container, for example from a reaction chamber to another chamber of reaction.
  • the ratio of the volumes ⁇ / ⁇ can be for example from 10 to 1000.
  • the first container can by example have a volume of about 0.1 to 100 ⁇ l.
  • the second container can have a volume of about 0.01 to 1 ⁇ l.
  • the invention therefore allows a reduction in volume which is 100 to 1000 times greater than what could to be achieved by laboratory or automated "macroscopic" systems of art prior art handling liquids with pipettes and bottles of a few tens of microliters. She allows to concentrate a sample by the same factor 100 to 1000.
  • photolithography techniques of solid substrates for example silicon, silica, or glass, or high-precision molding of plastics, allow the realization of containers of submillimetric dimensions, or even the order of a few microns in at least one direction, which may therefore have reduced volumes to micro-liter fractions.
  • the first container and / or the second container may / may have a shape that converges towards said bottleneck.
  • the bottleneck throttling can be for example in the form of a capillary as described in the previous paragraph.
  • the bottleneck may for example have a cross section of between 1 ⁇ m 2 to 1 mm 2 , preferably 100 ⁇ m 2 to 0.1 mm 2 .
  • the second container and / or the bottleneck can / may be provided with fluid inlet / outlet channels. These channels have heard a section adapted according to the volumes of solution they are meant to contain. So, by example for a highlighting of the analyte, when it comes to a nucleic acid, in the second containing by hybridization on capture probes supported by a solid support, these channels can be used to make the necessary washes before the reading step.
  • the aforementioned devices may include a capillary vent present at the level of the second container and connecting directly this one outside.
  • this vent serves to evacuate the fluid initially present in the container whether of air or liquid.
  • the presence of air in the second container is only a contingency. There may be events in other places, for example at bottleneck, first container etc.
  • These vent vents can be ordered by example by ball valves.
  • the invention therefore makes it possible through the use of micro-technology techniques to integrate into the devices called today labopuce, or "lab-on-a-chip” or even “micro-Total-Analysis-System” (MicroTAS) in the Anglo-Saxon terminology.
  • the device usable in the present invention can be combined with other functions to form a more complete system and more accurate biological analysis.
  • reaction chamber and transfer channels can be confused since these labs allow the realization of processes in for which reactions are capillaries, for example in certain techniques capillary electrophoresis and PCR.
  • the invention can for example be useful when the analyte sought is initially present in a sample of large volume but in limited quantity.
  • the proposed invention allows, for example, the implementation of the aforementioned micro-technologies, to concentrate a solution of molecules that we want detect, or move an analyte from a first solution to a second solution in a volume below the microliter, completely inaccessible by classical laboratory processes.
  • the present invention can be implemented by example in an in vitro diagnostic system automated, or a system for detecting contaminants in areas such as agribusiness and / or microbiological control industrial.
  • the invention can be applied for example to ultrasensitive detection without amplification of pathogens in a biological sample.
  • Acids nucleic acid pathogens potentially present in a sample can be extracted by techniques usual. They can then be purified and concentrated, always by standard techniques, up to a buffer volume of a few dozen microliters.
  • the use of the device or micro-component allows in this case to concentrate the biological material in the volume of the reaction chamber that corresponds to the second component. There, later stages of hybridization on plan and detection support can detect the presence or absence of nucleic acids of given sequence, characteristic of the infection of the sample.
  • the use of the invention thus allows to greatly increase the sensitivity of a test, to equal performance of the detection system.
  • the present invention may for example be applied to improve immunoassays. Indeed, for immunoassays in which a problem of sensitivity, the use of the invention, as previously described, concentrating the material in a very low volume, allows to greatly increase their sensitivity.
  • the use of the invention makes it possible to concentrate the sampling, and therefore to decrease the duration of the immunological reaction.
  • the biological sample is processed by means classical molecular biology to get a solution containing the target RNA molecules to detect; this solution has a volume of 200 microliters and the buffer solution is as follows: 10mM Tris, 1mM EDTA, 1M NaCl, 0.05% X-100 Triton, DNA salmon 0.14 mg / ml.
  • this capture oligonucleotide solution consists of: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8, 10 11 ⁇ l capture oligonucleotide; the capture oligonucleotide is a 5 'biotynilated oligonucleotide of a sequence of, for example, 32 bases, complementary to a sub-sequence of the target DNA.
  • Example 2 Device according to a first mode of production
  • the device or component described in this example is a micro-component that can reduce a factor 100 to 1000 the volume of buffer in which is find a desired analyte while retaining the amount of analyte present in the original sample.
  • a vent 9 allows the evacuation of air fluids or liquid when filling or transferring liquids in the rooms.
  • the sample and the different reagents or tampons can be introduced into the devices of different ways. We give two here as examples.
  • This first embodiment is produced by practicing an orifice in the cover 11 of the device and equipping this orifice of a conical bowl 15.
  • a cylindrical part 13 serves to keep the conical bowl in position and to ensure sealing between the conical bowl and the device.
  • a pipette, a mouthpiece dilutor or syringe By applying for example a pipette, a mouthpiece dilutor or syringe, on the conical bowl, one can "push" the buffer or reagent inside the device by exerting pressure on the liquid. Air or other liquid or gaseous fluid initially present in the device will be removed from the 9. This vent leads here into the reaction chamber, but it can be placed according to the cases to other places of the device. We may even have several vents.
  • FIG. 2 A second embodiment for the introduction of liquid in the device is shown in the Figure 2.
  • the liquids are introduced by a capillary 17, itself connected to the outside of the device via an interface, not shown in the figure.
  • the lid 19 does not does not include an orifice.
  • the method described in this example allows reduce the buffer volume by a factor of 100 to 1000 in which there is a sought analyte, while retaining the amount of analyte present in the initial sample. It implements the device represented in the previous example.
  • the component is filled with buffer without analyte and without magnetic particle.
  • This buffer can be introduced by pouring the amount necessary in the conical bowl 15 shown on FIG. 1, and applying a pneumatic pressure in this conical bowl. Once the component filled, the excess buffer present in the bowl taper 15 is removed, for example using a pipette.
  • the sample composed of a certain amount of buffer, for example of the order of 30 .mu.l, in which the analytes sought were previously fixed on magnetic particles is deposited in the bowl conical 15.
  • the magnetic particles are then attracted towards the bottom of the introduction chamber 3 (FIG. 1) with the help of a magnet, for example the magnet 30 of the form shown in Figure 4 positioned under the device, in line with the conical bowl.
  • the magnetic particles are then gathered into one small pellet.
  • the magnet 40 of the form shown in Figure 5 arranged such so that the device is in its air gap 42, the pellet is attracted and transported from its position in the first introductory chamber 3, to through the capillary 5, in the reaction chamber 7.
  • the analyte is then released from the particles magnetic elements by heating (elution) inside the reaction chamber 7. During this operation, the magnetic particles are eventually put back into suspension in the reaction chamber 7 by removing the magnet.
  • Magnetic particles are again gathered in a pellet in the reaction chamber 7 by using a magnet again, for example from the form shown in Figure 4. They are then transported again through capillary 5 but in the opposite direction to that of the Chamber of reaction 7 to the introduction chamber 3, in using a magnet, for example of the form presented in Figure 5.
  • the component is previously filled with buffer without magnetic particle.
  • the sample composed of a certain amount of buffer, for example of the order of 30 .mu.l, in which the analytes sought were previously fixed on magnetic particles is deposited in the bowl 15.
  • Magnetic particles are attracted towards the bottom of the introduction chamber 3 (FIG. 1) using a magnet, for example in the form indicated in Figure 4. The magnetic particles are then gathered in a small pellet.
  • the analyte is released from magnetic particles by heating (elution) inside the capillary 5. During this operation, the magnetic particles are eventually resuspended in the capillary by removing the magnet.
  • Magnetic particles are again gathered in a pellet in the capillary using again a magnet, for example of the form presented in Figure 4.
  • the analytes are free in solution inside the capillary.
  • the analytes in solution are thus driven by the displacement of the liquid in the reaction chamber 7.
  • Magnetic particles they remain in position in the capillary, held in position as a base by the magnet fixed.
  • the particles magnetic are in the form of dry entities already present in the introductory chamber. entities are well described in patents US-A-5,750,338 and 4,672,040.
  • the introduction of the sample, in said chamber 3, solubilizes the magnetic particles that then bind to the analyte present from the beginning in said sample.
  • Example 5 Use of the invention to implement evidence the analyte in a homogeneous detection test
  • the analyte is highlighted in using the "Molecular Beacons” technique, such that it is described in Tyagi, S. and Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 14: 30-308, 1996.
  • probe sequence complementary to the target, is extended on both sides by two arms of a few nucleotides long, complementary to each other.
  • a fluorophore for example the EDANS group
  • a fluorescence inhibitor for example the group DABCYL is attached to the other arm.
  • both arms of the probe hybridize one on the other and the fluorescence of EDANS is extinguished by DABCYL.
  • DABCYL fluorescence inhibitor
  • both groups are distant from each other, and the fluorescence of EDANS is released. So the presence and even the concentration of the analyte, is revealed by the signal of fluorescence and the intensity of this signal.
  • the advantage of this procedure compared to the state of art is to concentrate in an alpha / beta ratio the analyte, for example 100 times, and therefore to decrease relatively the residual fluorescence of the probes "Molecular Beacons", and thereby increase the signal-to-noise ratio intrinsic to this technique highlighting an analyte.
  • the sensitivity of test is increased accordingly.
  • Example 6 Use of the invention to implement evidence the analyte using a DNA chip
  • the analyte is highlighted by hybridization on a DNA chip; the DNA chip has the advantage, compared to the marking technique example 5, to be able to do a lot hybridizations in parallel, thus offering the biologist a much greater analytical power.
  • the bottom of the second container 7 is a DNA chip, consisting for example of a twenty or so hybridization pads.
  • the chip is made by deposition of DNA according to the standard means of the state of the art of DNA chips.
  • the concentration of the analyte before its hybridization on the DNA chip allows a faster reaction of the analyte on the DNA chip.
  • This acceleration of kinetics by compared to the state of the art allows either to decrease the hybridisation time, ie to increase the sensitivity of detection of the system, since this sensitivity is in general limited by the kinetics of hybridization of the analyte on the DNA chip.
  • Example 7 Use of the invention as a point input of a ⁇ TAS
  • the invention serves as a point input to a more complex ⁇ TAS than a device composed of only two containers separated by a bottleneck.
  • ⁇ TAS the one presented by A. Northrup's team, who consists of an amplification chamber, followed by a Capillary electrophoresis of amplified products and detection (see Anal Chem, 1996, 68, 4081-4086).
  • the second container is in does a PCR amplification chamber, for example manufactured by means of microtechnologies.
  • This means that the second container has a means heating, cooling means, and a temperature sensor, which allows to apply to the liquid sample contained in the second containing 7 thermal cycles.
  • the input-output 21, 22 of fluid cutting this second container is the channel Electrophoresis injection of the sample amplified in the separation capillary.
  • the capillary separation is not shown on our figures (see Figure 1 of the above-mentioned article), nor the microreservoirs allowing the application of the fields necessary for the injection and then the electrophoresis separation.
  • the second container further contains pellets dry goods containing all the products necessary for PCR amplification; these products are "glassified” by well-known techniques, and glass-filled, ball-shaped caps containing the various products necessary for amplification, are deposited in the second container before setting up of the lid.
  • the manufacture of these caps is good described in the state of the art, for example US-A-4,678,812 and US-A-5,275,016.
  • the separation capillary further contains a separation gel, for example hydroxyethyl cellulose, which itself contains a marker fluorescent DNA, for example thiazole orange.
  • a separation gel for example hydroxyethyl cellulose
  • a marker fluorescent DNA for example thiazole orange.
  • the speed with which the whole chain of the order of a few minutes for magnetic transport, from 10 to 15 minutes for amplification and from 1 to 2 minutes for capillary electrophoresis, makes it possible to obtain results of excellent quality, without being necessary to isolate the compartments by valves.

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Description

Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon selon les revendications 1 et 2.
Elle s'inscrit dans tous les domaines dans lesquels il existe un besoin de transporter un analyte d'une première solution à une deuxième solution, ceci par exemple pour des raisons d'incompatibilité de la solution constituée par l'échantillon, ou d'éléments présents dans cette solution, avec un réactif ou un procédé chimique ciblant l'analyte.
Elle s'inscrit également dans tous les domaines dans lesquels il existe un besoin de concentrer un analyte pour pouvoir le mettre en évidence par exemple en le faisant réagir avec un réactif par exemple de transformation et/ou de mise en évidence de l'analyte.
Par exemple, de nombreux tests de diagnostic in vitro consistent à faire réagir chimiquement un analyte recherché avec un réactif adéquat. Le ou un des produits de la réaction est ensuite détecté directement ou indirectement.
On peut citer par exemple les tests immunologiques dans lesquels la réaction chimique est une reconnaissance anticorps/antigène, ou de façon plus générale une réaction protéine/ligand, et les tests par sondes d'acide(s) nucléique (s) dans lesquels on détecte une hybridation entre acides nucléiques.
Un test de diagnostic est d'autant meilleur qu'il présente à la fois une sensibilité et une spécificité élevées. Il est d'autant plus sensible qu'il permet de détecter une quantité faible d'analyte recherché. Il est d'autant plus spécifique qu'il n'est positif que pour l'analyte recherché et non pour des analytes semblables..
On entend par analyte tout ou partie de corpuscule ou molécule que l'on désire isoler, changer de milieu et/ou concentrer pour être utilisé et/ou mis en évidence tel qu'un microorganisme, une bactérie, un champignon, un virus, une cellule eucaryote ; un composé chimique ; une molécule telle qu'un peptide, une protéine, un enzyme, un polysaccharide, un lipide, une lipoprotéine, un lipopolysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un antigène, un anticorps, un facteur de croissance, un haptène ; une cellule telle qu'une cellule tumorale etc.
Etat de la technique
De nombreux tests de diagnostic sont réalisés après des étapes d'extraction des analytes cibles des échantillons biologiques, de purification pour éliminer des produits parasites qui pénalisent les performances du test, de concentration des analytes cibles pour augmenter la quantité d'analyte par unité de volume de tampon, et de mise en solution des analytes cibles dans un tampon pour les rendre accessibles chimiquement.
En outre, pour augmenter la sensibilité et la spécificité d'un test permettant de mettre en évidence un analyte, il est parfois nécessaire de réduire le volume du tampon dans lequel se trouve les exemplaires de l'analyte recherché, tout en conservant l'intégralité de ce dernier.
Les biologistes ont des moyens tout à fait classiques de concentration d'un analyte utilisant notamment des techniques de centrifugation, de filtration et/ou de sédimentation magnétique. Ces techniques nécessitent des transferts de solutions et des manipulations de l'analyte qui conduisent à une réduction inévitable de la quantité d'analyte analysable.
Par exemple dans les procédés de centrifugation et de sédimentation magnétique, les étapes de centrifugation ou de sédimentation magnétique proprement dites peuvent devoir être répétées plusieurs fois, la limite du nombre de répétitions étant imposée par le volume minimal de solution qui peut être manipulé facilement et de façon fiable avec une pipette classique. Ce volume minimal est de l'ordre de la dizaine de micro-litre. En-deçà, on perd du liquide et donc de l'analyte en le transportant dans des "gros" contenants tels que des cônes de pipettes, des flacons, etc. En outre, il se pose des problèmes d'évaporation et d'adsorption sur les parois des contenants lors de ces manipulations.
Le document WO-A-9426414 décrit un procédé de transport d'un analyte fixé à des particules magnétiques d'un premier contenant vers un deuxième.
Dans le cas d'une concentration faible d'analyte dans l'échantillon au départ, ceci peut provoquer la disparition totale de l'analyte ou une diminution de sa quantité telle qu'il peut devenir indétectable.
Outre les inconvénients précités, ces manipulations sont coûteuses en matériel et prennent beaucoup de temps.
Ceci reste un problème constant pour de nombreuses applications industrielles, par exemple la détection de microorganismes pathogènes dans un prélèvement biologique ou un échantillon industriel.
Il existe donc un réel besoin d'un procédé et d'un dispositif permettant de faire passer un analyte d'une première solution à une deuxième solution et/ou de concentrer un analyte tout en conservant la quantité d'analyte présente au départ, ceci par exemple afin d'accroítre la sensibilité et la spécificité des têsts de diagnostic et de toute réaction chimique dirigée vers l'analyte, et de pallier les inconvénients précités.
La présente invention répond à ce besoin, et présente non seulement l'avantage de pallier aux inconvénients précités, mais aussi de nombreux autres avantages que l'homme du métier ne manquera pas de relever.
Exposé de l'invention
La présente invention fournit un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel :
  • on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, une solution A dans laquelle l'analyte est fixé sur des particules magnétiques,
  • on déplace au moyen d'un système magnétique l'analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement,
  • on libère l'analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et
  • on transporte par déplacement de liquide l'analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
La présente invention fournit également un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel :
  • on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l'analyte est fixé sur des particules magnétiques,
  • on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α,
  • on déplace au moyen d'un système magnétique l'analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement,
  • on libère l'analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et
  • on transporte par déplacement de liquide l'analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
Les analytes sont définis ci-dessus.
La préparation de la solution A à partir de l'échantillon comprend une étape dans laquelle l'analyte est fixé de préférence de façon réversible sur des particules magnétiques. L'utilité de cette réversibilité est expliquée ci-dessous.
Les particules magnétiques ont une taille adéquate notamment avec l'analyte à isoler, et avec le volume de solution A. Elles peuvent être de taille sub-micrométrique par exemple lorsque l'analyte est une molécule.
La quantité de particules utilisée est fonction notamment de la nature et de la quantité d'analyte à fixer, elle est de préférence en nombre suffisant pour fixer la totalité de l'analyte. Les particules magnétiques utilisables dans le procédé de la présente invention peuvent être par exemple des produits tels que ceux de la marque de commerce Dynabeads de la société Dynal (Norvège) ou MACS de la société Miltenyi Biotec (Allemagne), ou encore des produits de la société Immunicon Corp. (USA).
D'une manière générale, les particules magnétiques utilisables sont classiquement utilisées en biologie moléculaire et cellulaire. Elles doivent être en particulier superparamagnétiques afin de rediffuser spontanément après annulation du champ magnétique.
Des exemples de protocoles de fixation ou de capture de l'analyte sur les particules magnétiques peuvent être trouvés par exemple dans les références Bioscience Product Catalogue 2000, et Miltenyi Biotec, Tri Magnétique de Cellules, Séparation de biomolécules 1999. Les principales particules disponibles sont les particules de Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec ou Estapor (marques déposées). De telles particules peuvent être revêtues d'oligonucléotides de capture, par adsorption ou covalence. Les documents US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338 décrivent des procédés utilisables pour la présente invention. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de -ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par l'un des demandeurs sous les références suivantes :
  • PCT/FR 97/00912 sous priorité française du 24 mai 1996, et
  • PCT/FR 99/00011 sous priorité française du 6 janvier 1998.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 100°C et de préférence entre 20 et 60°C. Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques.
Selon l'invention, les particules magnétiques libérées de l'analyte peuvent être déplacées hors du deuxième contenant au moyen d'un système magnétique. Ceci peut être utile par exemple pour éviter toute interaction préjudiciable des particules avec les analytes libérés et/ou avec des réactifs chimiques et/ou des moyens utilisés pour le mettre en évidence.
Selon l'invention, la libération de l'analyte recherché, ou élution de l'analyte, peut être effectuée par exemple dans une solution tampon par exemple par chauffage ou un autre procédé adéquat. Les procédés de libération utilisables sont tous les procédés classiques de l'état de l'art. Les techniques chromatographiques offrent toute une panoplie de techniques de libération de protéines ou autre ligand utilisables dans le procédé de la présente invention, telles qu'un changement de pH ou un changement de force ionique, ou un changement de solvant, ou encore le passage en tampon contenant de l'EDTA ou toute autre substance chélatante des cations métalliques si l'analyte est fixé à la particule par une technique de métal-chélate. Si l'analyte est un oligonucléotide, on peut par exemple chauffer à une température de 50 à 60°C pour un oligonucléotide de longueur de 15 à 25 bases pour dissocier tous les analytes des particules magnétiques.
Selon l'invention, le système magnétique est un système permettant de créer un champ magnétique fixe ou variable engendrant l'application d'une force sur les billes magnétiques, capable de les immobiliser ou de les déplacer. Il peut être constitué d'un ensemble d'aimants ou de bobines.
Il peut s'agir également d'une bobine intégrée, réalisée par exemple par des procédés de micro-technologie tel qu'un dépôt de matériaux et de résines photosensibles de masquage, une insolation de ces résines, des gravures de motifs à l'échelle du micron, par exemple. Des bobines de ce type sont par exemple fabriquées collectivement au moyen des technologies précitées pour réaliser des têtes de lecture/écriture de disques durs.
Selon l'invention, après avoir été transportées, les particules magnétiques peuvent être 'remises en suspension, par exemple dans le deuxième contenant, par annulation du. champ magnétique créé par le système magnétique.
Selon une variante de la présente invention, les inventeurs fournissent également un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel :
  • on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l'analyte est fixé sur des particules magnétiques,
  • - on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α,
  • - on déplace au moyen d'un système magnétique l'analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement,
  • - on libère l'analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement,
  • - on transporte par déplacement d'un liquide l'analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant.
    • Selon une variante du procédé de concentration de la présente invention, l'analyte peut être libéré dans le deuxième contenant, et l'analyte peut être déplacé soit sous transport du liquide contenant les analytes, soit avec transport par déplacement d'un liquide du second contenant vers un troisième contenant.
    Selon l'invention, on peut déplacer les particules magnétiques libérées de l'analyte du deuxième contenant au premier contenant via le goulet d'étranglement, ou du goulet d'étranglement audit premier contenant, au moyen d'un système magnétique.
    Selon l'invention, comme décrit ci-dessus, l'analyte peut être libéré des particules magnétiques par modification des conditions physiques ou chimiques par exemple par chauffage ou par réaction avec au moins une substance présente dans l'autre solution.
    Selon l'invention, un agent d'immobilisation de l'analyte peut être fixé sur tout ou partie d'au moins une paroi du deuxième contenant ou de tout support solide présent dans ledit deuxième contenant. De tels supports peuvent par exemple être constitués par des billes de silice, des billes de verre pleines, creuses ou poreuses, des particules de quartz, des grains de sable, des grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath, de la laine de verre et/ou de roche, des billes d'argile, des particules de liège, des billes de polystyrène, de polyéthylène, de polypropylène, de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et d'épaisseur variables, de billes de latex, de billes revêtues de gélatine, et de grains de résine.
    Selon l'invention, le goulet d'étranglement peut être sous la forme d'un capillaire. Cette forme peut être intéressante par exemple pour limiter la diffusion de l'analyte du deuxième contenant vers le premier contenant lorsque ledit analyte a été libéré des particules magnétiques.
    La présente invention fournit également un procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon dans lequel :
    • on procède à une concentration de l'analyte au moyen d'un procédé de concentration de la présente invention,
    • on met en évidence l'analyte dans le deuxième contenant ou dans tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant.
    Le deuxième contenant ou chambre de réaction ou tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant peut contenir un ou des réactif(s) secs ou en solution destiné(s) à réagir directement ou indirectement avec l'analyte. Par indirectement on entend que plusieurs réactions chimiques successives peuvent être réalisées sur l'analyte ou un de ses dérivés obtenu. Des particules magnétiques sous forme de pastilles sont décrites dans l'état de la technique, par exemple dans le document EP-A-0 811 694. La fabrication des pastilles est également bien décrite dans l'état de la technique, par exemple dans les documents US-A-4,678,812 et US-A-5,275,016. Cette fabrication évoquée ci-dessus peut être utilisée pour la synthèse des autres pastilles qui seront exposées par la suite, telles que :
    • une pastille qui comporte des constituants structurels, comme des dNTP, des amorces ou des ions, permettant l'amplification ultérieure telle que décrite dans le brevet US-A-5,098,893 ou l'article "Ambiant-temperature-stable molecular biology reagents" R. Ramanujam et al., Product Application Focus, vol. 14, n°3 (1993), 470-473, par exemple,
    • une pastille contenant des constituants fonctionnels, tels que des enzymes qui, associés avec les constituants structurels précédemment cités, permettent la conduite d'une amplification. Des exemples de telles pastilles sont donnés dans le brevet US-A-4 891 319, les demandes de brevet WO-A-87/00196 et WO-A-95/33488 ou l'article "Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose : simplified molecular biology", de C. Colaço et al., Bio/Technology, vol. 10, September 1992, 1007-1011.
    On peut par exemple prévoir, selon la présente invention, des plots d'hybridation fixés sur une surface du deuxième contenant de manière à ce qu'ils soient accessibles à l'analyte lorsqu'il se trouve dans le deuxième contenant. Ceci peut être réalisé par exemple sous la forme d'une puce à ADN intégrée. Ainsi, selon la présente invention, lorsque l'analyte à mettre en évidence est un acide nucléique, il peut être mis en évidence par une technologie de puce à acide nucléique.
    Selon la présente invention, le deuxième contenant peut donc être un réservoir d'un microcomposant, par exemple d'une biopuce, par exemple d'une puce à ADN. Par biopuce, on entend tout support solide sur lequel sont fixés des ligands, et en particulier par une puce à ADN, on entend tout support solide sur lequel sont fixés des acides nucléiques. La méthode de fixation des ligands peut être réalisée de différentes manières et notamment par adsorption ou covalence comme par exemple la synthèse in situ par les techniques de photolithographie ou par un système piézo-électrique, par dépôt capillaire de ligands préformés. A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces appliqués aux puces à ADN sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p. 40-44, 1998 ; F. Ginot, Human Mutation, 10, p. 1-10, 1997 ; J. Cheng et al., Molecular diagnosis, 1(3), p. 183-200, 1996 ; T. Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), p. 2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al., Nature Biotechnology, 16, p. 541-546, 1998 ou dans les brevets US 4,981,783 (Augenlicht), US 5,700,637 (Southern), US 5,445,934 (Fodor), US 5,744,305 (Fodor), US 5,807,522 (Brown).
    Selon l'invention, le deuxième contenant peut être aussi une chambre d'entrée vers un autre contenant d'un autre procédé. Ainsi, le deuxième contenant peut être relié directement ou indirectement à un autre contenant utilisé pour d'autres réactions chimiques ou étapes de procédé ciblant l'analyte ou un de ses dérivés telle qu'une purification, une amplification, un marquage, etc. Par exemple, l'autre contenant ou chambre peut être une chambre de PCR pour amplifier un gène, éventuellement avec ensuite une analyse dans un laboratoire sur puce ("micro-total analysis system" : MicroTas).
    Néanmoins, toutes les techniques d'amplification peuvent être utilisées. Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, il existe entre autres les techniques suivantes :
    • PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4 683 195, US-A-4 683 202 et US-A-4 800 159,
    • LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184,
    • RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069,
    • 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995,
    • NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818,
    • SPSR (Single Primer Sequence Replication) avec le brevet US-A-5 194 370, et
    • TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5 399 491.
    Selon l'invention, d'autres réactifs peuvent être utilisés, tels que des réactifs lyophilisés, par exemple pour faire un test homogène de détection de l'analyte, par exemple par transfert de fluorescence.
    Selon l'invention, de manière non limitative, l'analyte est défini ci-dessus.
    On dispositif de transport d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide est décrit, ledit dispositif comprenant :
    • un premier contenant destiné à contenir un liquide et relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant,
    • un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé l'analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement.
    Les volumes des premier et deuxième contenants sont de préférence adaptés aux volumes de solutions à manipuler. Ces volumes peuvent être inférieurs ou égaux à 10 ml.
    Un autre dispositif de concentration d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide comprend:
    • un premier contenant de volume α destiné à contenir un liquide relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant,
    • ledit deuxième contenant de volume β plus petit que le volume α du premier contenant, et
    • un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé l'analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement.
    Certains éléments de ces dispositifs ont déjà été décrits pour le procédé de la présente invention, et devrons être pris en considération avec la description ci-dessous.
    Ces contenants sont utilisables par exemple comme chambres de réaction. Les techniques précitées permettent également de réaliser des capillaires de section de quelques microns-carrés à quelques centaines de milliers de microns-carrés pour le transfert de solutions, ou d'un analyte fixé sur des microparticules, selon la présente invention, d'un premier contenant à un deuxième contenant, par exemple d'une chambre de réaction à une autre chambre de réaction.
    Le rapport des volumes α/β peut être par exemple de 10 à 1000.
    Le premier contenant peut par exemple avoir un volume d'environ 0,1 à 100 µl.
    Le deuxième contenant peut avoir un volume d'environ 0,01 à 1 µl.
    L'invention permet donc une réduction de volume qui est de 100 à 1000 fois supérieure à ce qui pouvait être atteint par les pratiques de laboratoire ou de systèmes "macroscopiques" automatisés de l'art antérieur manipulant des liquides avec des pipettes et des flacons de quelques dizaines de microlitres. Elle permet de ce fait de concentrer un échantillon par le même facteur 100 à 1000.
    En effet des techniques de photolithogravure de substrats solides, par exemple de silicium, de silice, ou de verre, ou de moulage de grande précision de matières plastiques, permettent la réalisation de contenants de dimensions submillimétriques, voire de l'ordre de quelques microns dans au moins une direction, qui peuvent donc avoir des volumes réduits à des fractions de micro-litre.
    Le premier contenant et/ou le deuxième contenant peuvent/peut avoir une forme qui converge vers ledit goulet d'étranglement. Le goulet d'étranglement peut être par exemple sous la forme d'un capillaire tel que décrit dans le paragraphe précédent.
    Le goulet d'étranglement peut par exemple avoir une section comprise entre 1 µm2 à 1 mm2, préférentiellement 100 µm2 à 0,1 mm2.
    Le deuxième contenant et/ou le goulet d'étranglement peut/peuvent être muni(s) de canaux d'entrée/sortie de fluides. Ces canaux ont bien entendu une section adaptée en fonction des volumes de solution qu'ils sont destinés à contenir. Ainsi, par exemple pour une mise en évidence de l'analyte, lorsqu'il s'agit d'un acide nucléique, dans le deuxième contenant par une hybridation sur des sondes de capture portées par un support solide, ces canaux peuvent être utilisés pour faire les lavages nécessaires avant l'étape de lecture.
    Les dispositifs précités peuvent comprendre un évent sous forme de capillaire présent au niveau du deuxième contenant et reliant directement celui-ci à l'extérieur. Lors des opérations de remplissage et/ou de transfert de fluide dans le deuxième contenant, cet évent sert à évacuer le fluide initialement présent dans le contenant que ce soit de l'air ou du liquide. La présence d'air dans le deuxième contenant n'est qu'une éventualité. Il peut y avoir des évents à d'autres endroits, par exemple au niveau du goulet d'étranglement, du premier contenant etc. Ces évents de mise à l'air libre peuvent être commandés par exemple par des vannes à billes.
    L'invention permet donc grâce à l'utilisation de techniques de micro-technologies de s'intégrer dans les dispositifs appelés aujourd'hui labopuce, ou "lab-on-a-chip" ou bien encore "micro-Total-Analysis-System" (MicroTAS) dans la terminologie anglo-saxonne.
    Dans l'exemple "lab-on-a-chip" le dispositif utilisable dans la présente invention peut être combiné à d'autres fonctions pour former un système plus complet et plus précis d'analyse biologique.
    Par exemple, le dispositif de la présente invention peut être le premier élément d'un ensemble comprenant :
  • 1. un module de concentration/réduction de volume,
  • 2. un module d'amplification,
  • 3. un module de séparation, par exemple par électrophorèse,
  • 4. un module de détection.
    • Un exemple de dispositif intégré comprenant les éléments 2, 3 et 4 ci-dessus est décrit dans la référence M.A. Burns et al. , An Integrated Nanoliter DNA Analysis Device, Science, vol 282, 16 oct 98.
    Dans certaines réalisations de la présente invention, les concepts de chambre de réaction et de canaux de transfert peuvent donc se confondre puisque ces labopuces permettent la réalisation de procédés en continu pour lesquels les réactions se font dans des capillaires, par exemple dans certaines techniques d'électrophorèse capillaire et de PCR.
    L'invention peut par exemple être utile quand l'analyte recherché est initialement présent dans un échantillon de grand volume mais en quantité limitée.
    L'invention proposée permet, par exemple par la mise en oeuvre des micro-technologies précitées, de concentrer une solution de molécules que l'on veut détecter, ou de déplacer un analyte d'une première solution vers une deuxième solution dans un volume inférieur au microlitre, complètement inaccessible par les procédés classiques de laboratoire.
    La présente invention peut être mise en oeuvre par exemple dans un système de diagnostic in vitro automatisé, ou un système de détection de contaminants biologiques dans des domaines tels que l'agroalimentaire et/ou le contrôle microbiologique industriel.
    L'invention peut être appliquée par exemple pour la détection ultrasensible sans amplification de pathogènes dans un échantillon biologique. Les acides nucléiques des pathogènes potentiellement présents dans un échantillon peuvent être extraits par des techniques habituelles. Ils peuvent ensuite être purifiés et concentrés, toujours par des techniques standards, jusqu'à un volume de tampon de quelques dizaines de microlitres.
    L'utilisation du dispositif ou micro-composant permet dans ce cas de concentrer le matériel biologique dans le volume de la chambre de réaction qui correspond au deuxième composant. Là, des étapes ultérieures d'hybridation sur support plan et de détection permettent de détecter la présence ou non d'acides nucléiques de séquence donnée, caractéristique de l'infection de l'échantillon.
    L'utilisation de l'invention permet donc d'augmenter très fortement la sensibilité d'un test, à performances égales du système de détection.
    La présente invention peut par exemple être appliquée pour améliorer les immuno-essais. En effet, pour les immuno-essais dans lesquels se pose un problème de sensibilité, l'utilisation de l'invention, comme précédemment décrite, en concentrant le matériel biologique dans un volume très faible, permet d'augmenter fortement leur sensibilité.
    Pour les immuno-essais où la quantité de matériel biologique à détecter est suffisante, l'utilisation de l'invention permet de concentrer le prélèvement, et donc de diminuer la durée de la réaction immunologique.
    D'autres caractéristiques et avantages apparaítrons encore dans les exemples ci-dessous, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
    Brève description des figures
    • La figure 1 est une représentation schématique en perspective et éclatée avec une coupe partielle d'un premier mode de réalisation d'un dispositif utilisable selon la présente invention,
    • La figure 2 est une représentation schématique en perspective et éclatée d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif utilisable selon la présente invention,
    • La figure 3 est une représentation schématique en perspective et éclatée avec une coupe partielle d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif utilisable selon la présente invention,
    • La figure 4 est une représentation schématique d'un premier aimant utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention, et
    • La figure 5 est une représentation schématique d'un deuxième aimant utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention.
    Sur ces figures, les références identiques indiquent des éléments identiques.
    Exemples Exemple 1 : exemple de préparation de la solution A
    L'échantillon biologique est traité par des moyens classiques de biologie moléculaire pour obtenir une solution contenant les molécules d'ARN cible à détecter ; cette solution a un volume de 200 microlitres et la solution tampon est la suivante : Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,05%, ADN de saumon 0,14 mg/ml.
    On ajoute à cette solution 2 µl d'une solution d'oligonucléotides de capture ; cette solution d'oligonucléotides de capture est constituée de : Tris 10 mM, EDTA 1mM, pH 8, oligonucléotide de capture 1011/µl ; l'oligonucléotide de capture est un oligonucléotide, biotynilé en 5', d'une séquence par exemple de 32 bases, complémentaire d'une sous-séquence de l'ADN cible.
    Incubation pendant 2h à 35°C.
    Introduction de 1 µl de particules Immunicon Corporation, streptavidine ferrofluide, non diluées.
    Incubation 30 minutes à 35°C.
    Dans ces conditions, plus de 95% des molécules cibles se trouvent immobilisées sur les particules magnétiques.
    Exemple 2 : dispositif selon un premier mode de réalisation
    Le dispositif ou composant décrit dans cet exemple est un micro-composant qui permet de réduire d'un facteur 100 à 1000 le volume de tampon dans lequel se trouve un analyte recherché, tout en conservant la quantité d'analyte présente dans l'échantillon initial.
    L'architecture générale du composant 1 est représentée à la figure 1. Il est constitué d'une chambre d'introduction 3, éventuellement prolongée par un dispositif d'introduction constitué des pièces 13 et 15, reliée à une chambre de réaction 7 par l'intermédiaire d'un goulet d'étranglement 5, ici représenté sous la forme d'un capillaire. 'Les formes particulières des deux chambres sont données à titre d'exemple. Les chambres et le capillaire peuvent être de forme ou de taille différente suivant l'application ou la technologie de fabrication du composant. La figure 1 suggère un mode de fabrication selon lequel le composant est fabriqué en gravant les chambres et le goulet d'étranglement dans un matériau plan, puis en assemblant par collage ou tout autre mode de fixation le couvercle 11. C'est un mode de fabrication possible, mais les procédés de l'invention ne sont pas dépendantes de ce mode de fabrication. Toute autre technologie, en particulier :
    • permettant de creuser un matériau directement pour réaliser des cavités de la forme des chambres et du goulet d'étranglement,
    • ou qui consisterait à creuser les chambres 3 et 7 ainsi que le goulet d'étranglement dans la plaque supérieure, dans l'exemple dans le couvercle 11, au lieu de les creuser dans la plaque inférieure,
    pourrait être utilisée pour fabriquer le dispositif.
    On peut citer par exemple les techniques à l'image de la "LIGA" utilisant la lithographie, la galvanoplastie et le moulage.
    Un évent 9 permet l'évacuation des fluides air ou liquide lorsqu'on remplit ou transfère des liquides dans les chambres.
    L'échantillon et les différents réactifs ou tampons peuvent être introduits dans les dispositifs de différentes manières. Nous en donnons deux ici à titre d'exemples.
    Ce premier mode de réalisation, illustré sur la figure 1, est réalisé en pratiquant un orifice dans le couvercle 11 du dispositif et en équipant cet orifice d'une cuvette conique 15. Une pièce cylindrique 13 sert à maintenir la cuvette conique en position et à assurer l'étanchéité entre la cuvette conique et le dispositif. En appliquant par exemple une pipette, un embout de diluteur ou de seringue, sur la cuvette conique, on peut "pousser" le tampon ou un réactif à l'intérieur du dispositif en exerçant une pression sur le liquide. L'air ou tout autre fluide liquide ou gazeux initialement présent dans le dispositif sera évacué du dispositif par l'évent 9. Cet évent débouche ici dans la chambre de réaction, mais il pourra être placé suivant les cas à d'autres endroits du dispositif. On pourra même éventuellement disposer de plusieurs évents.
    Un second mode de réalisation pour l'introduction de liquide dans le dispositif est représenté à la figure 2. Dans ce mode de réalisation 1(a), les liquides sont introduits par un capillaire 17, lui-même connecté à l'extérieur du dispositif par une interface, non représentée sur la figure. Le couvercle 19 ne comprend pas d'orifice.
    Exemple 3 : concentration avec transport sur particules magnétiques
    Le procédé décrit dans cet exemple permet de réduire d'un facteur 100 à 1000 le volume de tampon dans lequel se trouve un analyte recherché, tout en conservant la quantité d'analyte présente dans l'échantillon initial. Il met en oeuvre le dispositif représenté dans l'exemple précédent.
    Le composant est préalablement rempli de tampon sans analyte recherché et sans particule magnétique. Ce tampon peut être introduit en versant la quantité nécessaire dans la cuvette conique 15 représentée sur la figure 1, et en appliquant une pression pneumatique dans cette cuvette conique. Une fois le composant rempli, le tampon en excès présent dans la cuvette conique 15 est retiré, par exemple à l'aide d'une pipette.
    L'échantillon composé d'une certaine quantité de tampon, par exemple de l'ordre de 30 µl, dans lequel les analytes recherchés ont été préalablement fixés sur des particules magnétiques est déposé dans la cuvette conique 15.
    Les particules magnétiques sont ensuite attirées vers le fond de la chambre d'introduction 3 (figure 1) à l'aide d'un aimant, par exemple l'aimant 30 de la forme indiquée à la figure 4 positionné sous le dispositif, à l'aplomb de la cuvette conique. Les particules magnétiques sont alors rassemblées en un culot de petite taille.
    A l'aide d'un autre aimant, par exemple l'aimant 40 de la forme indiquée à la figure 5, disposé de telle sorte que le dispositif se trouve dans son entrefer 42, le culot est attiré et transporté de sa position initiale dans la première chambre d'introduction 3, à travers le capillaire 5, dans la chambre de réaction 7.
    L'analyte est ensuite libéré des particules magnétiques par chauffage (élution) à l'intérieur de la chambre de réaction 7. Pendant cette opération, les particules magnétiques sont éventuellement remises en suspension dans la chambre de réaction 7 en retirant l'aimant.
    Les particules magnétiques sont de nouveau rassemblées en un culot dans la chambre de réaction 7 en utilisant à nouveau un aimant, par exemple de la forme présentée sur la figure 4. Elles sont ensuite transportées à nouveau à travers le capillaire 5, mais en sens inverse que précédemment, de la chambre de réaction 7 vers la chambre d'introduction 3, en utilisant un aimant, par exemple de la forme présentée à la figure 5.
    Le résultat final de cette suite d'opérations est le transport de la totalité des analytes de la cuvette conique 15 vers la chambre de réaction 7, de volume beaucoup plus faible.
    Exemple 4 : concentration avec transport fluidique
    Le procédé décrit dans cet exemple est une variante du précédent.
    Comme précédemment, le composant est préalablement rempli par du tampon sans particule magnétique. L'échantillon composé d'une certaine quantité de tampon, par exemple de l'ordre de 30 µl, dans lequel les analytes recherchés ont été préalablement fixés sur des particules magnétiques est déposé dans la cuvette conique 15. Les particules magnétiques sont attirées vers le fond de la chambre d'introduction 3 (figure 1) à l'aide d'un aimant, par exemple de la forme indiquée à la figure 4. Les particules magnétiques sont alors rassemblées en un culot de petite taille.
    A l'aide d'un autre aimant, par exemple de la forme indiquée à la figure 5, disposé de telle sorte que le dispositif se trouve dans son entrefer, le culot est attiré et transporté de sa position initiale dans le capillaire 5 (et non plus dans la chambre de réaction 7).
    L'analyte est libéré des particules magnétiques par chauffage (élution) à l'intérieur du capillaire 5. Pendant cette opération, les particules magnétiques sont éventuellement remises en suspension dans le capillaire en retirant l'aimant.
    Les particules magnétiques sont à nouveau rassemblées en un culot dans le capillaire en utilisant à nouveau un aimant, par exemple de la forme présentée à la figure 4. A ce moment, les analytes sont libres en solution à l'intérieur du capillaire. En poussant du tampon à l'intérieur du dispositif par une surpression au niveau de la cuvette conique 15, on provoque un déplacement de liquide dans le capillaire vers la chambre de réaction 7. Les analytes en solution sont ainsi entraínés par le déplacement du liquide dans la chambre de réaction 7. Les particules magnétiques, elles, restent en position dans le capillaire, maintenues en position sous forme de culot par l'aimant fixe.
    Le résultat final de cette suite d'opérations est comme précédemment le transport de la totalité des analytes de la cuvette conique 15 vers la chambre de réaction 7, de volume beaucoup plus faible.
    Selon une variante de ce procédé, les particules magnétiques sont sous la forme d'entités sèches déjà présentes dans la chambre d'introduction 3. De telles entités sont bien décrites dans les brevets US-A-5,750,338 et 4,672,040. L'introduction de l'échantillon, dans ladite chambre 3, solubilise les particules magnétiques qui se fixent alors à l'analyte présent dès le.départ dans ledit échantillon.
    Exemple 5 : utilisation de l'invention pour mettre en évidence l'analyte dans un test de détection homogène
    Dans cet exemple, l'analyte est mis en évidence en utilisant la technique des "Molecular Beacons", telle qu'elle est décrit dans Tyagi, S. and Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 14:30-308, 1996.
    Brièvement, cette technique consiste à mettre les molécules cibles avec des sondes nucléiques, les "Molecular Beacons", qui ont la structure suivante : la séquence sonde, complémentaire de la cible, est prolongée de part et d'autre par deux bras de quelques nucléotides de long, complémentaires l'un de l'autre. Un fluorophore, par exemple le groupe EDANS, est fixé à l'un des bras, alors qu'un inhibiteur de fluorescence, par exemple le groupe DABCYL est fixé à l'autre bras. En l'absence de cible, les deux bras de la sonde s'hybrident l'un sur l'autre et la fluorescence de EDANS est éteinte par le DABCYL. Quand la sonde s'hybride sur la cible, les deux groupes se trouvent éloignés l'un de l'autre, et la fluorescence de EDANS est libérée. Ainsi, la présence et même la concentration de l'analyte, est révélée par le signal de fluorescence et l'intensité de ce signal.
    La mise en oeuvre de cette technique dans un dispositif est par exemple la suivante :
  • 1. Préparation de la solution A à analyser, l'analyte étant un acide nucléique,
  • 2. Remplissage du deuxième contenant 7 du dispositif, ainsi que du goulet d'étranglement 5 et du fond 3 du premier contenant par une solution de révélation, contenant les sondes nucléiques précédemment définies nécessaires à la détection de l'analyte.
  • 3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 3 prolongé par le cône 15,
  • 4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond du premier contenant 3, puis transport magnétique des particules magnétiques dans le deuxième contenant 7, par exemple selon les modalités décrites dans l'exemple 3,
  • 5. Chauffage à 60°C de l'ensemble du dispositif, attente de 1 à 2 minutes à cette température. L'analyte est alors libéré des particules,
  • 6. Transport magnétique des particules magnétiques du deuxième contenant 7 vers le premier contenant,
  • 7. Mise à la température adéquate pour l'hybridation de la sonde nucléique beacon, par exemple 25°C,
  • 8. Lecture de la fluorescence dans le deuxième contenant 7 par exemple en plaçant le dispositif sous un microscope à épi-fluorescence équipé d'un photomultiplicateur.
    • L'avantage de cette procédure par rapport à l'état de l'art est de concentrer dans un rapport alpha/béta l'analyte, par exemple de 100 fois, et donc de diminuer relativement la fluorescence résiduelle des sondes "Molecular Beacons", et ainsi augmenter d'autant le rapport signal sur bruit intrinsèque à cette technique de mise en évidence d'un analyte. La sensibilité du test est donc augmentée d'autant.
    Exemple 6 : utilisation de l'invention pour mettre en évidence l'analyte à l'aide d'une puce à ADN
    Dans cet exemple, l'analyte est mis en évidence par hybridation sur une puce à ADN ; la puce à ADN a l'avantage, par rapport à la technique de marquage présentée à l'exemple 5, de pouvoir faire beaucoup d'hybridations en parallèle, donc d'offrir au biologiste une puissance analytique bien plus grande.
    Dans cet exemple, le fond du deuxième contenant 7 est une puce à ADN, constituée par exemple d'une vingtaine de plots d'hybridation. La puce est fabriquée par dépôt d'ADN selon les moyens standards de l'état de l'art des puces à ADN.
    La mise en oeuvre de cette technique dans un dispositif conforme à l'invention peut être par exemple la suivante :
  • 1. Préparation de la solution A à analyser, l'analyte étant un acide nucléique, marqué par un groupement fluorescent, par exemple de la fluorescéine, par des moyens classiques de l'état de l'art,
  • 2. Remplissage du deuxième contenant 7 du dispositif, ainsi que du goulet d'étranglement 5 et du fond 3 du premier contenant par le tampon d'hybridation, par exemple : Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,05%, ADN de saumon 0,14 mg/ml,
  • 3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 15,
  • 4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond 3 du premier contenant, puis transport magnétique des particules magnétiques dans le deuxième contenant 7, par exemple selon les modalités décrites dans l'exemple 3,
  • 5. Chauffage à 60°C de l'ensemble du dispositif. L'analyte est alors libéré des particules,
  • 6. Transport magnétique des particules magnétiques du deuxième contenant 7 vers le premier contenant 3,
  • 7. Hybridation dans les conditions de température et de durée adéquates pour la puce à ADN considérée. Par exemple, hybridation pendant 30 minutes à 40°C,
  • 8. Lavage par passage dans le deuxième contenant 7, au moyen de l'entrée et de la sortie de fluide par les ouvertures 21, 22 représenté sur la figure 3, d'une solution de lavage, par exemple Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,5%,
  • 9. Lecture de la fluorescence présente sur la puce à ADN, par exemple en mettant le dispositif sous un microscope à épi-fluorescence équipé d'une caméra CCD, et en utilisant un grossissement adéquat.
    • Comme dans l'exemple précédent, la concentration de l'analyte avant son hybridation sur la puce à ADN permet une réaction plus rapide de l'analyte sur la puce à ADN. Cette accélération de la cinétique par rapport à l'état de l'art permet, soit de diminuer le temps d'hybridation, soit d'augmenter la sensibilité de détection du système, puisque cette sensibilité est en général limitée par la cinétique d'hybridation de l'analyte sur la puce à ADN.
    Exemple 7 : utilisation de l'invention comme point d'entrée d'un µTAS
    Dans cet exemple, l'invention sert de point d'entrée à un µTAS plus complexe qu'un dispositif composé seulement de deux contenants séparés par un goulet d'étranglement. Nous prenons comme exemple de µTAS celui présenté par l'équipe de A. Northrup, qui consiste en une chambre d'amplification, suivie d'une électrophorèse capillaire des produits amplifiés et d'une détection (voir Anal. Chem. 1996, 68, 4081-4086).
    Dans cet exemple, le deuxième contenant est en fait une chambre d'amplification par PCR, par exemple fabriquée par les moyens des microtechnologies. Ceci signifie que le deuxième contenant est muni d'un moyen de chauffage, d'un moyen de refroidissement, et d'un capteur de température, ce qui permet d'appliquer à l'échantillon liquide contenu dans le deuxième contenant 7 des cycles thermiques. L'entrée-sortie 21, 22 dé fluide coupant ce deuxième contenant est le canal d'injection par électrophorèse de l'échantillon amplifié dans le capillaire de séparation. Le capillaire de séparation n'est pas montré sur nos figures (voir figure 1 de l'article sus-cité), ni les microréservoirs permettant l'application des champs électriques nécessaires à l'injection puis à la séparation par électrophorèse.
    Le deuxième contenant contient en outre des culots secs contenant tous les produits nécessaires à l'amplification par PCR ; ces produits sont "glassifiés" par des techniques bien connues, et les culots glassifiés, en forme de bille, contenant les divers produits nécessaires à l'amplification, sont déposés dans le deuxième contenant avant mise en place du couvercle. La fabrication de ces culots est bien décrite dans l'état de la technique, par exemple US-A-4,678,812 et US-A-5,275,016.
    Le capillaire de séparation contient en outre un gel de séparation, par exemple de l'hydroxy éthyl cellulose, qui lui-même contient un marqueur fluorescent de l'ADN, par exemple le thiazole orange. Ainsi, les fragments d'ADN seront marqués par le thiazole orange au cours de leur migration électrophorétique dans le capillaire de séparation.
    L'utilisation d'un tel dispositif est par exemple la suivante :
  • 1. Préparation de la solution A à analyser, l'analyte étant un acide nucléique,
  • 2. Remplissage de l'ensemble du dispositif, notamment des capillaires, par la solution d'électrophorèse ; les culots de réactifs présents dans le deuxième contenant commencent à s'hydrater,
  • 3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 15,
  • 4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond du premier contenant 3, puis transport magnétique dans le deuxième contenant 7, selon les modalités de l'exemple 3 ci-dessus,
  • 5. Chauffage à 60°C du deuxième contenant 7. Attente de 10 à 30 minutes selon le culot de réactif à dissoudre. En effet, ce chauffage a principalement pour but d'accélérer la remise en solution des culots de réactifs présents dans le contenant,
  • 6. Cyclage thermique pour effectuer l'opération d'amplification des cibles (il existe des particules magnétiques qui ne gênent pas l'amplification, il n'est donc pas nécessaire de les retirer de la chambre d'amplification),
  • 7. Injection par électrophorèse de l'échantillon amplifié dans le capillaire de sortie,
  • 8. Electrophorèse capillaire dans le capillaire de séparation, par exemple, selon les modalités décrites dans l'article suscité,
  • 9. Détection des fragments amplifiés par exemple par un microscope à épi-fluorescence équipé d'un photomultiplicateur, le champ du microscope étant situé en fin du capillaire de séparation.
    • Dans cet exemple, le couplage de l'invention à un système intégré d'amplification et d'électrophorèse capillaire permet :
    • de concentrer l'échantillon avant amplification, par exemple de 100 fois, donc de diminuer le nombre de cycles d'amplification nécessaires (moins 8 cycles environ), ce qui limite les risques intrinsèques à l'amplification (biais d'amplification selon les séquences, risque de contamination croisée, ...),
    • de diminuer le volume de l'échantillon pour l'amplification, donc de diminuer les quantités de réactifs nécessaires à l'amplification d'où un gain de coût sur les réactifs,
    • d'augmenter le nombre d'échantillons qu'il est possible de traiter en parallèle dans un même dispositif grâce à la diminution des dimensions de la chambre d'amplification.
    Par ailleurs, la rapidité avec laquelle s'effectue l'ensemble de la chaíne, de l'ordre de quelques minutes pour le transport magnétique, de 10 à 15 minutes pour l'amplification et de 1 à 2 minutes pour l'électrophorèse capillaire, permet d'obtenir des résultats d'excellente qualité, sans qu'il soit nécessaire d'isoler les compartiments par des vannes.

    Claims (9)

    1. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel :
      on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, une solution A dans laquelle l'analyte est fixé sur des particules magnétiques,
      on déplace au moyen d'un système magnétique l'analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement,
      on libère l'analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et
      on transporte par déplacement de liquide l'analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
    2. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel :
      on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l'analyte est fixé sur des particules magnétiques,
      on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α,
      on déplace au moyen d'un système magnétique l'analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement,
      on libère l'analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et
      on transporte par déplacement de liquide l'analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
    3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique les particules magnétiques libérées de l'analyte du goulet d'étranglement audit premier contenant.
    4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'analyte est libéré des particules magnétiques par modification des conditions physiques ou chimiques.
    5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel un agent d'immobilisation de l'analyte est fixé sur tout ou partie d'au moins une paroi du deuxième contenant ou de tout support solide présent dans ledit deuxième contenant.
    6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le goulet d'étranglement est sous la forme d'un capillaire.
    7. Procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon dans lequel :
      on procède à une concentration de l'analyte au moyen d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, et
      on met en évidence l'analyte dans le deuxième contenant ou dans tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant.
    8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'analyte est choisi parmi un microorganisme tel qu'une bactérie, un champignon, un virus, un composé chimique, une molécule telle qu'un peptide, une protéine, un enzyme, un polysaccharide, un lipide, une lipoprotéine, un lipopolysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un antigène, un anticorps, un facteur de croissance, une cellule tumorale.
    9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel l'analyte étant un acide nucléique, il est mis en évidence par une technologie de puce à acide nucléique, préférentiellement à ADN.
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