EP1342080A1 - Method and system for method optimisation in chromatography - Google Patents

Method and system for method optimisation in chromatography

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Publication number
EP1342080A1
EP1342080A1 EP01978338A EP01978338A EP1342080A1 EP 1342080 A1 EP1342080 A1 EP 1342080A1 EP 01978338 A EP01978338 A EP 01978338A EP 01978338 A EP01978338 A EP 01978338A EP 1342080 A1 EP1342080 A1 EP 1342080A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
column
optimized
parameters
solvent
parameter
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01978338A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Sergey Golushko
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1342080A1 publication Critical patent/EP1342080A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8658—Optimising operation parameters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8658—Optimising operation parameters
    • G01N30/8662—Expert systems; optimising a large number of parameters

Definitions

  • the present invention relates to a method and a system for method optimization of chromatography, in particular HPLC (high-performance liquid chromatography), with an analytical column (separation column) and a precolumn, which is provided for sample preparation, for example macromolecules of biological samples separate.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • an analytical column separation column
  • precolumn precolumn
  • Chromatography is an analytical method frequently used in laboratory operations. It is a separation process in which different components of a sample to be examined move through a predetermined area at different speeds.
  • This predetermined range can be, for example, a so-called column of an adsorbent.
  • the adsorbent is a carrier of a thinly distributed phase, the so-called adsorption layer. If the sample is now passed through a column, some substances are adsorbed on the adsorbent, while other substances can flow through the column almost unhindered.
  • the moving liquid phase is generally referred to as the mobile phase, while the adsorbent layer is referred to as the stationary phase.
  • the solute is distributed between these phases in contact. This behavior, which is based on the law of mass action, ensures that the solutes flow very slowly through the column.
  • the different components of the sample will cross the column at different speeds. There is therefore a separation of the individual components of the sample. Details of various chromatographic separation processes, in particular reversed-phase chromatography, are known to the person skilled in the art.
  • Liquid chromatography is particularly suitable for the separation and analysis of high molecular weight compounds.
  • Liquid chromatography is generally divided into liquid-solid (adsorption) chromatography, liquid-liquid (distribution) chromatography, ion-exchange chromatography and gel filtration (gel permeation) according to the type of stationary phase chromatography).
  • the liquid is moved through the system with the aid of gravity or by pumps with a constant delivery rate.
  • gradient devices can provide gradual or continuous changes in the composition of the moving phase (gradient elution).
  • the individual components are detected using suitable detectors.
  • Detectors can, for example, differential refractometers, adsorption heat detectors, modified hydrogen flame ionization detectors, but also detectors based on photometry in the visible, infrared or ultraviolet range, or water-selective detectors. Sometimes the eluted compounds are also reacted with suitable substances, for example to form colored substances that can be easily detected.
  • method parameters are understood to mean all parameters that can characterize an analysis method.
  • the type of solvent to be used i.e. the mobile phase is a method parameter.
  • Other method parameters are e.g. B. the column temperature and the concentration of the solvent to be used.
  • the known chromatography methods and in particular also HPLC analysis fail to analyze biological samples that contain macromolecules, such as proteins.
  • macromolecules are namely precipitated by higher proportions of organic solvents in the mobile phase or irreversibly bound or denatured by hydrophobic groups on the surface of the chromatographic support.
  • the macromolecules are mainly adsorbed or precipitated on the outer surface of the porous stationary phase. The macromolecules thereby block access to the pores for the analytical substances actually to be investigated and thus reduce the number of chromatographic adsorption centers.
  • This sample preparation is preferably carried out in a precolumn in which the sample is separated into the sample matrix and the analyte or the analytes.
  • the protein matrix can be flushed directly into the waste while the analyte fraction is selectively extracted and enriched on the stationary phase of a guard column.
  • the analyte fraction can be transferred from the guard column to the separation column and separated and quantified there in the known manner.
  • This separation of the sample matrix takes place with the help of sorbents, which were developed as a special carrier material for the sample preparation of biological liquids. These sorbents have pore diameters that are significantly smaller than the diameter of the macromolecules. They have two chemically different surfaces.
  • hydrophilic, electroneutral groups are bound on the outer surface of the generally spherical particles.
  • This inert layer prevents any interaction with the protein matrix and any contamination during multiple use.
  • Only the inner surface of the porous particles has a hydrophobic distribution phase, essentially C, C 8 or C 18 alkyl chains.
  • the internal surfaces can also be modified by ion exchange groups.
  • the adsorption centers which are predominantly bound to the surface inside the pore, are freely accessible for the low-molecular sample components, ie the analytes. Different sorbents with different hydrophobicity are available for different biological samples.
  • biological samples such as e.g. hemolyzed blood, plasma, serum, milk, fermentation broth, supernatants from cell culture, food and tissue homogenates allowed.
  • this object is achieved by a system and a method for method optimization in chromatography, in particular HPLC (high-performance liquid chromatography) with an analytical column and a precolumn, which is provided for sample preparation, for example macromolecules of biological samples to separate,
  • the system comprising: a device for inputting data for the acquisition of experimental data and / or chemical structural formulas, a computing unit which has access to a database, the computing unit being intended as a function of the acquired data To optimize at least one method parameter based on the database entries and / or physico-chemical models, an output unit which is intended to output the at least one optimized method parameter, a device for inputting method parameters being provided and at least one optimized method pair rameter is a parameter of the guard column.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • optimization is to be understood here in the broadest sense.
  • the optimization can also only be carried out by an estimate based on chemical-physical models and / or on database entries.
  • the optimized parameter does not have to be an optimum, but merely an improved parameter.
  • the optimization can also take place in several (iteration) steps, from which it becomes clear that an optimal method parameter is not necessarily present after the first optimization.
  • An optimized method parameter of the guard column is preferably a parameter from the group comprising guard column type, type of solvent for the guard column, concentration of solvent for the guard column, separation time, type of solvent for transfer to the analytical column, concentration of solvent for transfer to the analytical column and transfer duration.
  • This optimization can take place, for example, by accessing database entries on the basis of the recorded data, which represent method parameters based on empirical values. It is therefore preferable to enter chemical structure formulas provided an editor for chemical formulas.
  • the loading of a file which contains the corresponding chemical structural formula in a conventional format can also be provided.
  • the device for entering method parameters can be used, for example, to tell the system which different types of guard columns are currently available, so that the method parameters are optimized on the basis of the experimental options actually available.
  • the database contains parameters from different guard columns, preferably for several concentrations of a mobile phase, preferably of methanol water and / or acetonitrile water.
  • the database contains optimized method parameters that are based on empirical values.
  • the optimization then takes place on the basis of a physically mathematical model and / or on the basis of the database entries.
  • experimental data can be acquired and at least one method parameter can be optimized on the basis of the experimental data. For example, it is possible to detect the separation process in a test run at the exit of the guard column in order to determine the required separation time. At least one method parameter is then optimized on the basis of the separation time determined in this way.
  • the computing unit is preferably provided for optimizing at least one further method parameter in the event that no experimental data were recorded, but rather only structural formulas and possibly method parameters were recorded.
  • the chemical structural formula and the type of guard column and the type of solvent can be communicated to the system, for example, whereupon the computing unit then determines, for example, an optimized solvent concentration and outputs it via the output unit. This is particularly advantageous if only one type of guard column and only one specific solvent is used Available.
  • the system can thus be easily adapted to the local conditions and optimizes the method parameters within the scope of the locally given degrees of freedom.
  • the system is able to actuate a switching valve which connects the guard column to the analytical column.
  • the guard column is connected to the analytical column so that the analyte retained in the guard column can be transferred to the analytical column.
  • the guard column is then separated again from the analytical column, so that the HPLC analysis can be carried out in the analytical column.
  • the switching times of the switching valve are optimized depending on the experimental data and / or on the basis of the database entries.
  • the sample matrix is separated from the actual analyte in the guard column.
  • the outlet of the guard column is connected to a corresponding waste or disposal container.
  • the analyte is retained in the guard column while the sample matrix passes quickly through the guard column.
  • the movement of the analyte in the guard column is so severely restricted that it can only leave the guard column after the sample matrix has left the guard column for a long time. It is therefore necessary to determine the point in time at which the sample matrix has been almost completely removed from the guard column.
  • the first switching time of the switching valve i.e.
  • the point in time at which the guard column is connected to the analytical column must therefore lie between the point in time when the sample matrix is completely separated and the point in time at which the analyte also leaves the guard column.
  • the analyte is transferred from the guard column to the analytical column. Only after this transfer is almost complete can the valve be switched on again, so that the guard column is again separated from the analytical column and the 'normal' analysis process can be started with the analytical column.
  • the two switching times of the switching valve are optimized on the basis of experimental data and / or on the basis of chemical-physical models and / or on the basis of empirical values entered in the database, in order to accelerate the analysis time and at the same time ensure that the sample matrix has been completely separated.
  • the empirical values cannot necessarily be obtained by "trial and error” tests, but preferably were originally obtained by the optimization according to the invention.
  • the optimized method parameters can therefore preferably be stored in the database, so that future analysis methods may refer to them can be used and the optimization may be based on these optimized parameters.
  • the above-mentioned object is also achieved by a chromatography device, in particular an HPLC chromatography device (high-performance liquid chromatography), with an analytical column and a guard column and a detector assigned to the guard column, the separation column being provided for this purpose Sample preparation, for example, to separate macromolecules from biological samples, the chromatography device having a system which was described at the beginning.
  • the chromatography device preferably has a number of different guard columns, which can optionally be used for the separation, which have a porous support material with a pore diameter, preferably of about 4-8 nm.
  • a preferably controllable switching valve is provided, which optionally connects the guard column with a pump for the guard column solvent or with several analytical columns.
  • a method for method optimization in chromatography which comprises the following steps: at least partially acquiring a characteristic data set consisting of one or more structural formulas of one or more analytes, the type of biological matrix, method parameters and experimental data and determining at least one optimized parameter of the precolumn and possibly further optimized method parameters as a function of the at least partially recorded characteristic data set.
  • a characteristic data record is understood to be a data record in which all the characteristic parameters are entered for an analysis process, including the separation of the sample matrix.
  • access is preferably made to a database in which inherent column parameters for a plurality of different precolumn types are stored, depending on different solvent types and their concentration.
  • the determination of the at least one optimized parameter on the basis of empirical values stored in the database and / or depending on the molecular volume of the or the analyte and / or depending on the interaction energy of the analyte or analytes with H 2 O and / or depending on the inherent column parameters stored in the database.
  • the theoretical retention time can be calculated, for example, as a function of the solvent concentration for each component of the analyte.
  • a compromise can be found between the best possible separation of the different components of the analyte and a minimal analysis time.
  • the optimized parameters are preferably the precolumn type, the type of solvent for the precolumn, the concentration of the solvent for the precolumn, optionally the type and the concentration of the transfer solvent for the transfer of the analyte or analytes from the precolumn to the analytical column and optionally the type the analytical column.
  • the optimized parameters are the concentration of the solvent for the precolumn and, if appropriate, the type of solvent for the precolumn.
  • the at least partial acquisition of a characteristic data set and the determination of the optimized parameter are repeated at least once, wherein when the step of at least partial acquisition of the characteristic data set is repeated, experimental data is obtained on the basis of the optimized method parameters determined in the previous step were recorded. In other words, (test) tests are carried out on the basis of the optimized parameters.
  • the experimental data determined in this way are used to further optimize the method parameters. In principle, the method can be continued as often as desired, although in general a few optimization steps are sufficient to obtain very suitable method parameters.
  • the method particularly preferably provides that the optimized method parameters, preferably in the form of an optimized characteristic data set, are stored in the database.
  • the present invention allows HPLC analysis to be used as a standard analysis method also for biological samples. Because the otherwise very expensive separation procedure can be significantly shortened with the aid of the method, an HPLC analysis on biological samples can be carried out very inexpensively.
  • Figure 1 A and 1 B is a schematic diagram of the analysis method.
  • FIGS. 1A and 1B A chromatography device in which the system according to the invention and the method according to the invention are used is shown schematically in FIGS. 1A and 1B.
  • a first mobile phase A is pumped into the precolumn VS via the openings 6 and 1 of the switching valve SV by means of a first pump P1.
  • the downstream part of the guard column is connected to a waste collecting container 7 via the openings 4, 5 of the switching valve.
  • the injector IN through which the biological sample is injected for analysis, is provided between the pump P1 and the precolumn VS.
  • the biological sample is advantageously centrifuged before injection.
  • the biological sample is injected via the injector IN and the fractionation, ie the separation of the analyte from the sample matrix, is carried out.
  • the injection can be done manually or via an automatic sampler.
  • the mobile phase conveyed by the first pump P1 rinses the sample into the guard column via valve positions 1-6.
  • the guard column is equipped with a special carrier material for the sample preparation of biological liquids as a sorbent.
  • This special carrier material is porous with a pore diameter of about 6 nm. This has the consequence that macromolecules (for example proteins) with a large molecular weight cannot penetrate into the pores and therefore elute in the dead volume of the column.
  • the sorbent used has two chemically different surfaces.
  • hydrophilic, electroneutral diol groups are bound on the outer surface of the generally spherical parts.
  • modification of the inner surfaces can also be carried out by ion exchange groups.
  • This layer serves to prevent any interaction between the sorbent and the protein matrix and thereby minimize contamination of the guard column when used multiple times.
  • the inner surfaces of the pores of the porous particles also have a hydrophobic distribution phase (C, C 8 or C 8 alkyl chains). These adsorption centers bound on the surface inside the pore are generally freely accessible for the low molecular weight sample components, ie the actual analyte.
  • the switching valve SV must also not be switched too late, since the precolumn VS only delays the analyte in the biological sample, so that if the position shown in FIG. 1A is maintained too long, the analyte also moves via the switching valve position 4-5 is flushed into the waste container 7.
  • the elution profile of the sample matrix is therefore first determined.
  • the guard column is connected directly to a detector, for example a UV detector.
  • the elution profile of the protein matrix is then determined.
  • the separation process ie the complete elution of the protein matrix, is complete when the protein peak reaches the baseline.
  • t M The time until complete fractionation is referred to as t M below.
  • the analyte elution profile is determined.
  • the analyte is eluted with the same mobile phase and flow rate as was used for the elution of the sample matrix.
  • Let t A be the time after which the analyte begins to elute.
  • t A > t M. This can be done by a suitable choice of the sorbent and the mobile phase.
  • the switching valve SV is switched, as already mentioned, so that the arrangement shown in FIG. 1B is produced.
  • a second mobile phase B is transferred to the precolumn via the switching valve position 3-4, which in turn is connected to the analytical column AS via the switching valve SV position 1-2.
  • the switching valve position 3-4 which in turn is connected to the analytical column AS via the switching valve SV position 1-2.
  • Waste container 7 arranged. There is a detector between the analytical column AS and the waste container 7 D provided. In this position, the analyte is rinsed out of the guard column and placed on the analytical column. After the analyte has been completely transmitted, the switching valve SV is switched again, so that the arrangement shown in FIG. 1A results again. The analyte is now on the analytical column and the actual analysis can be carried out in the known manner.
  • the mobile phase B is transferred to the analytical column by means of the pump P2 via the valve position 2-3, which in turn is connected to the waste container 7 via the detector D.
  • the second valve switching point is also of crucial importance.
  • the elution profile of the analyte transfer is measured.
  • the analyte is preferably applied directly to the precolumn without a sample matrix in a preliminary test.
  • the elution profile of the analyte from the precolumn is then measured on a detector, which is preferably arranged directly in front of the analytical column, in the arrangement of FIG. 1B.
  • the point in time at which the elution profile of the analyte transfer reaches the baseline is denoted by t ⁇ . This is the earliest point in time at which the switching valve SV can be switched back to the position shown in FIG. 1A, since only then has the analyte been completely transferred to the analytical column.
  • the optimum valve switching times can be calculated from the measurement results, so that for analytes which have a value of ⁇ 10 min for t A , a first valve switching time results which switches from the arrangement shown in FIG. 1A to the arrangement shown in FIG. 1B
  • t v1 y 2 (t M + t A ).
  • t ⁇ should be at least t M + 5 min. It should be noted that t M ⁇ t A. If this is not the case, the sorbent material of the guard column or the mobile phase of the guard column must be changed.
  • the second valve switching time t V2 at which the guard column is again separated from the analytical column, is preferably at least t ⁇ + 1min.
  • one embodiment of the system according to the invention provides that the user who wants to detect a certain analyte in a certain sample matrix informs the system of the chemical structural formula of the analyte and / or the sample matrix. The system then suggests a type of guard column and an optimized concentration of the mobile phase for the guard column to the user. Based on the proposal, the user can now experimentally determine the elution profile of the analyte and the sample matrix. After entering the experimental data into the system, the system calculates the valve switching time for the matrix separation step t v1 .
  • the system tration of the organic solvent for the transfer of the analyte determined.
  • the user now determines the elution profile for the transfer of the analyte.
  • the system uses the experimental data to determine the valve switching time t V2 for the transfer step of the analyte. Based on the results, the system performs the optimized method parameters.
  • the system is able to enter the optimized parameters in a database, so that in the event that the user later wants to analyze the analysis of an identical or chemically similar analyte in an identical or chemically similar protein matrix, Preliminary tests can be completely dispensed with and the system only suggests the method parameters that have already been optimized. For example, according to the invention it is possible to completely do without the preliminary tests, provided that there are entries in the database which already include method parameters which have been optimized in preliminary tests.
  • the present invention therefore makes it possible for the first time to use chromatography in general, in particular HPLC chromatography, in a simple and inexpensive manner also for analytes contained in a biological sample.
  • HPLC chromatography is also available as the standard analysis method for biological samples.

Abstract

The invention relates to a system for method optimisation in chromatography, in particular in HPLC (high-performance liquid chromatography), comprising an analytical column (separation column) and a precolumn designed for preparing samples, for example, for separating macromolecules from biological samples. The invention aims to provide a system, a method and a chromatography device that enable an automated and rapid HPLC analysis of a plurality of different analytes in various biological samples, such as e.g. haemolysed blood, plasma, serum, milk, fermentation broth and supernatants of cell culture, food and tissue homogenates. To achieve this, the system comprises: a device for entering data, for registering experimental data and/or chemical structural formulas of the analyte and/or the sample matrix, an arithmetic unit, which accesses a database, said arithmetic unit being provided for optimising at least one method parameter in accordance with the registered data and an output unit, which is provided for outputting the optimised method parameter(s), at least one optimised method parameter constituting a parameter of the precolumn.

Description

Verfahren und System zur Methodenoptimierung in der Chromatographie Method and system for method optimization in chromatography
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein System zur Methodenoptimierung der Chromatographie, insbesondere der HPLC (High-Performance-Liquid-Chromatography), mit einer analytischen Säule (Trennsäule) und einer Vorsäule, die dafür vorgesehen ist, zur Probenvorbereitung beispielsweise Makromoleküle von biologischen Proben abzutrennen. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Chromatographievorrichtung mit dem erfindungsgemäßen System.The present invention relates to a method and a system for method optimization of chromatography, in particular HPLC (high-performance liquid chromatography), with an analytical column (separation column) and a precolumn, which is provided for sample preparation, for example macromolecules of biological samples separate. The invention further relates to a chromatography device with the system according to the invention.
Die Chromatographie ist ein im Laborbetrieb häufig verwendetes Analyseverfahren. Sie ist ein Trennprozeß, bei dem verschiedene Bestandteile einer zu untersuchenden Probe sich unterschiedlich schnell durch einen vorgegebenen Bereich bewegen.Chromatography is an analytical method frequently used in laboratory operations. It is a separation process in which different components of a sample to be examined move through a predetermined area at different speeds.
Dieser vorgegebene Bereich kann beispielsweise eine sogenannte Säule eines Adsorbens sein. Das Adsorbens ist Träger einer dünn verteilten Phase, der sogenannten Adsorptionsschicht. Wird nun die Probe durch eine Säule geleitet, so werden einige Stoffe an dem Adsorbens adsorbiert, während andere Stoffe nahezu unbehindert durch die Säule abfließen können. Die sich bewegende flüssige Phase wird im allgemeinen als mobile Phase bezeichnet, während die adsorbierende Schicht als stationäre Phase bezeichnet wird. Der gelöste Stoff wird zwischen diesen in Kontakt stehenden Phasen verteilt. Dieses Verhalten, das auf dem Massenwirkungsgesetz beruht, sorgt dafür, daß die gelösten Stoffe nur sehr langsam durch die Säule fließen. Je nach verwendeten Adsorbens und zu untersuchenden Proben werden die verschiedenen Bestandteile der Probe die Säule unterschiedlich schnell durchqueren. Es findet daher eine Trennung der einzelnen Bestandteile der Probe statt. Ein- zelheiten verschiedener chromatographischer Trennverfahren, insbesondere die reversed-phase Chromatographie, sind dem Fachmann bekannt.This predetermined range can be, for example, a so-called column of an adsorbent. The adsorbent is a carrier of a thinly distributed phase, the so-called adsorption layer. If the sample is now passed through a column, some substances are adsorbed on the adsorbent, while other substances can flow through the column almost unhindered. The moving liquid phase is generally referred to as the mobile phase, while the adsorbent layer is referred to as the stationary phase. The solute is distributed between these phases in contact. This behavior, which is based on the law of mass action, ensures that the solutes flow very slowly through the column. Depending on the adsorbent used and the samples to be examined, the different components of the sample will cross the column at different speeds. There is therefore a separation of the individual components of the sample. Details of various chromatographic separation processes, in particular reversed-phase chromatography, are known to the person skilled in the art.
Für die Trennung und Analyse von hochmolekularen Verbindungen ist die Flüssigchromatographie besonders geeignet. Die Flüssigchromatographie wird nach der Art der stationären Phase im allge- meinen eingeteilt in die Flüssig-Fest-(Adsorptions-)Chromatographie, die Flüssig-Flüssig-(Vertei- lungs-)Chromatographie, die lonenaustausch-Chromatographie und die Gelfiltration (Gelpermeati- ons-Chromatographie). Hierbei wird die Flüssigkeit mit Hilfe der Schwerkraft oder durch Pumpen mit konstanter Fördermenge durch das System bewegt. Während der Analyse können Gradientenvorrichtungen für stufenweise oder kontinuierliche Änderung in der Zusammensetzung der bewegten Phase sorgen (Gradientenelution). Am Ende der analytischen Säule werden die einzelnen Bestandteile mit Hilfe von geeigneten Detektoren erfaßt. Detektoren können beispielsweise differentielle Refraktometer, Adsorptions-Wärmedetektoren, modifizierte Wasserstoff-Flammenionisationsdetektoren, aber auch Detektoren, die auf der Photometrie im sichtbaren, infraroten oder ultravioletten Bereich beruhen, oder wasserselektive Detektoren sein. Manchmal werden auch die eluierten Verbindungen mit geeigneten Stoffen zur Reaktion gebracht, um zum Beispiel farbige Substanzen zu bilden, die leicht nachgewiesen werden können.Liquid chromatography is particularly suitable for the separation and analysis of high molecular weight compounds. Liquid chromatography is generally divided into liquid-solid (adsorption) chromatography, liquid-liquid (distribution) chromatography, ion-exchange chromatography and gel filtration (gel permeation) according to the type of stationary phase chromatography). Here, the liquid is moved through the system with the aid of gravity or by pumps with a constant delivery rate. During the analysis, gradient devices can provide gradual or continuous changes in the composition of the moving phase (gradient elution). At the end of the analytical column, the individual components are detected using suitable detectors. Detectors can, for example, differential refractometers, adsorption heat detectors, modified hydrogen flame ionization detectors, but also detectors based on photometry in the visible, infrared or ultraviolet range, or water-selective detectors. Sometimes the eluted compounds are also reacted with suitable substances, for example to form colored substances that can be easily detected.
Auch wenn die Analyse mittels Chromatographie eine vielseitig einsetzbare Methode ist, so müssen doch, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, im allgemeinen eine ganze Reihe von Testtrennversuchen durchgeführt werden, die sehr viel Arbeitszeit erfordern, um optimale Methodenparameter zu erhalten, die eine saubere Trennung der einzelnen Stoffe der zu untersuchenden Probe in akzep- tabler Zeit erlauben. So kann es beispielsweise sein, daß zwei Bestandteile der Probe etwa gleich lang benötigen, um die analytische Säule zu durchqueren. Um diese beiden Bestandteile voneinander unterscheiden zu können, muß daher zumindest ein Methodenparameter, beispielsweise die Art des Adsorbens, verändert werden. Neben einer guten Auflösung der Peaks der unterschiedlichen Bestandteile der Probe ist es weiterhin von Vorteil, die Methodenparameter möglichst so zu wählen, daß die Dauer des Analyseverfahrens minimiert wird. Dem Experimentator stehen hierbei eine Vielzahl von veränderbaren Methodenparametern gegenüber, die ein strukturiertes Vorgehen bei der Suche nach .guten' Methodenparametem erschwert. Unter Methodenparametern werden im Prinzip alle Parameter verstanden, die ein Analyseverfahren kennzeichnen können. So ist zum Beispiel der Typ des zu verwendenden Lösungsmittels, d.h. die mobile Phase ein Methodenparameter. Weitere Methodenparameter sind z. B. die Säulentemperatur und die Konzentration des zu verwendenden Lösungsmittels.Even though analysis using chromatography is a versatile method, in order to obtain meaningful results, a whole series of test separation tests must generally be carried out, which require a great deal of work in order to obtain optimal method parameters that ensure a clean separation of the individual Allow substances of the sample to be examined in an acceptable time. For example, two components of the sample may take approximately the same length to cross the analytical column. In order to be able to distinguish these two components from one another, at least one method parameter, for example the type of adsorbent, must therefore be changed. In addition to a good resolution of the peaks of the different constituents of the sample, it is also advantageous to choose the method parameters as far as possible so that the duration of the analysis process is minimized. The experimenter is faced with a multitude of changeable method parameters, which complicates a structured procedure in the search for "good" method parameters. In principle, method parameters are understood to mean all parameters that can characterize an analysis method. For example, the type of solvent to be used, i.e. the mobile phase is a method parameter. Other method parameters are e.g. B. the column temperature and the concentration of the solvent to be used.
Es gibt bereits ein System zur Optimierung der Methodenparameter der analytischen Chromatographiesäule. Dieses System ist in der Lage, nach Eingabe der Strukturformeln des Analyten Start- bedingungen für die isokratische und die Gradienten-Umkehrphasen HPLC vorherzusagen. Werden auf Grundlage der vorhergesagten Startbedingungen Experimente durchgeführt, so ist das System überdies in der Lage, nach Eingabe der gewonnenen experimentellen Daten die vorhergesagten Methodenparameter zu optimieren. Mit dem bekannten System ist es möglich, die Säulentemperatur, den pH-Wert, die Konzentration von organischen Modifikatoren und ein Gradientenprofil, d.h. die Veränderung der Konzentration, zu optimieren. Nach der Optimierung steht daher für einen gegebenen Analyten ein Satz von Methodenparametem zur Verfügung, deren Verwendung einen zügigen Analyseablauf und aussagekräftige Ergebnisse gewährleistet.There is already a system for optimizing the method parameters of the analytical chromatography column. After entering the structural formulas of the analyte, this system is able to predict start conditions for the isocratic and the gradient reversal phases HPLC. If experiments are carried out on the basis of the predicted starting conditions, the system is also able to optimize the predicted method parameters after entering the experimental data obtained. With the known system it is possible to determine the column temperature, the pH, the concentration of organic modifiers and a gradient profile, i.e. to optimize the change in concentration. After optimization, a set of method parameters is therefore available for a given analyte, the use of which ensures a rapid analysis process and meaningful results.
Mathematische Modelle zur Chromatographie werden zum Beispiel beschrieben von S. V. Galushko in J. of Chromatography 552 (1991) 91 - 102, und von S. V. Galushko, A. A. Kamenchuk und G. L Pit in J. of Chromatography A, 660 (1994) 47 - 59. Durch das bestehende System ist die Entwicklung von HPLC-Chromatographiemethoden stark automatisiert worden und wird standardmäßig als Methodenoptimierungssystem eingesetzt.Mathematical models for chromatography are described, for example, by SV Galushko in J. of Chromatography 552 (1991) 91-102, and by SV Galushko, AA Kamenchuk and G. L Pit in J. of Chromatography A, 660 (1994) 47-59 , The existing system has greatly automated the development of HPLC chromatography methods and is used as standard as a method optimization system.
Die bekannten Chromatographieverfahren und insbesondere auch HPLC-Analyse versagen jedoch bei der Analyse von biologischen Proben, die Makromoleküle, wie zum Beispiel Proteine, enthalten. Diese Makromoleküle werden nämlich durch höhere Anteile von organischen Lösungsmitteln in der mobilen Phase ausgefällt oder durch hydrophobe Gruppen an der Oberfläche des chromatographischen Trägers irreversibel gebunden oder denaturiert. Überdies werden die Makromoleküle aufgrund ihrer Größe vorwiegend auf der Außenoberfläche der porösen stationären Phase adsorbiert bzw. präzipitiert. Die Makromoleküle blockieren dadurch den Zugang zu den Poren für die eigentlich zu untersuchenden analytischen Substanzen und verringern damit die Anzahl der chromatographischen Adsorptionszentren. Diese Vorgänge führen zu einem irreversiblen Druckanstieg, zu einem Kapazitätsverlust, da der Stoffaustausch zwischen mobiler und stationärer Phase verringert wird und zu einem Selektivitätsverlust, da die Trägeroberfläche durch die funktioneilen Gruppen (Aminosäuren) der adsorbierten Proteine verändert wird. Dies kann zu einer schweren Schädigung der analytischen Trennsäule führen.The known chromatography methods and in particular also HPLC analysis fail to analyze biological samples that contain macromolecules, such as proteins. These macromolecules are namely precipitated by higher proportions of organic solvents in the mobile phase or irreversibly bound or denatured by hydrophobic groups on the surface of the chromatographic support. Furthermore, due to their size, the macromolecules are mainly adsorbed or precipitated on the outer surface of the porous stationary phase. The macromolecules thereby block access to the pores for the analytical substances actually to be investigated and thus reduce the number of chromatographic adsorption centers. These processes lead to an irreversible increase in pressure, to a loss of capacity, since the mass transfer between the mobile and stationary phases is reduced, and to a loss of selectivity, since the carrier surface is changed by the functional groups (amino acids) of the adsorbed proteins. This can lead to severe damage to the analytical separation column.
Es ist daher in der Bioanalytik üblich, solche Proben zunächst aufzubereiten. Diese Probenaufbereitung erfolgt bevorzugterweise in einer Vorsäule, in der die Probe in die Probenmatrix und den Analy- ten oder die Analyte aufgetrennt wird. Die Proteinmatrix kann direkt in den Abfall gespült werden, während die Analytfraktion selektiv extrahiert und auf der stationären Phase einer Vorsäule angereichert wird. Nach diesem Trennschritt kann die Analytfraktion von der Vorsäule auf die Trennsäule übertragen werden und dort in der bekannten Weise getrennt und quantifiziert werden. Diese Abtrennung der Probenmatrix erfolgt mit Hilfe von Sorbentien, die als spezielles Trägermaterial für die Probenaufbereitung von biologischen Flüssigkeiten entwickelt wurden. Diese Sorbentien haben Porendurchmesser, die wesentlich kleiner als der Durchmesser der Makromoleküle sind. Sie besitzen zwei chemisch unterschiedliche Oberflächen. So sind auf der äußeren Oberfläche der im allgemeinen sphärischen Teilchen hydrophile, elektroneutrale Gruppen (Diolgruppen) gebunden. Diese inerte Schicht verhindert jede Wechselwirkung mit der Proteinmatrix und jede Kontamination bei mehrfa- ehern Einsatz. Nur die innere Oberfläche der porösen Teilchen besitzt eine hydrophobe Verteilungsphase, im wesentlichen C -, C8- oder C18-Alkylketten. Die Modifizierung der inneren Oberflächen kann auch durch lonenaustauschergruppen erfolgen. Die überwiegend auf der Oberfläche im Poreninneren gebundenen Adsorptionszentren sind für die niedermolekularen Probenkomponenten, d.h. die Analyte frei zugänglich. Für verschiedene biologische Proben stehen unterschiedliche Sorbentien mit unterschiedlicher Hydrophobizität zur Verfügung. Mit Hilfe der Vorsäule ist zwar die HPLC- Analyse von biologischen Proben möglich geworden, der Abtrennvorgang ist jedoch sehr zeitaufwendig und kann nur nach einer entsprechend großen Anzahl von Vorversuchen optimal durchge- führt werden. Die aus den Vorversuchen extrahierten Methodenparameter sind dann nur für einen bestimmten Analyten in einer bestimmten Probenmatrix geeignet. Eine schnelle Anpassung derIt is therefore common in bioanalytics to prepare such samples first. This sample preparation is preferably carried out in a precolumn in which the sample is separated into the sample matrix and the analyte or the analytes. The protein matrix can be flushed directly into the waste while the analyte fraction is selectively extracted and enriched on the stationary phase of a guard column. After this separation step, the analyte fraction can be transferred from the guard column to the separation column and separated and quantified there in the known manner. This separation of the sample matrix takes place with the help of sorbents, which were developed as a special carrier material for the sample preparation of biological liquids. These sorbents have pore diameters that are significantly smaller than the diameter of the macromolecules. They have two chemically different surfaces. Thus, hydrophilic, electroneutral groups (diol groups) are bound on the outer surface of the generally spherical particles. This inert layer prevents any interaction with the protein matrix and any contamination during multiple use. Only the inner surface of the porous particles has a hydrophobic distribution phase, essentially C, C 8 or C 18 alkyl chains. The internal surfaces can also be modified by ion exchange groups. The adsorption centers, which are predominantly bound to the surface inside the pore, are freely accessible for the low-molecular sample components, ie the analytes. Different sorbents with different hydrophobicity are available for different biological samples. With the help of the guard column, HPLC analysis of biological samples has become possible, but the separation process is very time-consuming and can only be carried out optimally after a correspondingly large number of preliminary tests. leads. The method parameters extracted from the preliminary tests are then only suitable for a specific analyte in a specific sample matrix. A quick adjustment of the
Chromatographievorrichtung, so daß andere Analyten nachgewiesen werden können, ist indes nicht möglich. Für diese Probenvorbereitung besonders geeignete Sorbentien sind in der DE 41 30 475 offenbart.Chromatography equipment so that other analytes can be detected is not possible. Sorbents which are particularly suitable for this sample preparation are disclosed in DE 41 30 475.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein System, ein Verfahren und eine Chromatographievorrichtung zur Verfügung zu stellen, das bzw. der die automatisierte und zügige HPLC-Analyse einer Vielzahl von unterschiedlichen Analyten in den verschiedensten biologischen Proben, wie z.B. hämolysiertes Blut, Plasma, Serum, Milch, Fermenterbrühe, Überstände von Zellkultur-, Lebensmittel- und Gewebehomogenaten, erlaubt.It is therefore the object of the present invention to provide a system, a method and a chromatography device which enables the automated and rapid HPLC analysis of a large number of different analytes in the most varied biological samples, such as e.g. hemolyzed blood, plasma, serum, milk, fermentation broth, supernatants from cell culture, food and tissue homogenates allowed.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein System und ein Verfahren zur Methodenoptimierung der Chromatographie, insbesondere der HPLC (High-Performance-Liquid-Chromatogra- phy) mit einer analytischen Säule und einer Vorsäule, die dafür vorgesehen ist, zur Probenvorbereitung beispielsweise Makromoleküle von biologischen Proben abzutrennen, wobei das System aufweist: eine Einrichtung zur Eingabe von Daten für die Erfassung von experimentellen Daten und/oder von chemischen Strukturformeln, eine Recheneinheit, die Zugriff auf eine Datenbank hat, wobei die Recheneinheit dafür vorgesehen ist, in Abhängigkeit von den erfaßten Daten auf Basis der Datenbankeinträge und/oder physikalisch-chemischen Modellen zumindest einen Methodenparameter zu optimieren, eine Ausgabeeinheit, die dafür vorgesehen ist, den zumindest einen optimierten Methodenparameter auszugeben, wobei eine Einrichtung zur Eingabe von Methodenparametem vorgesehen ist und zumindest ein optimierter Methodenparameter ein Parameter der Vorsäule ist. Optimierung ist hier im weitesten Sinne zu verstehen. So kann die Optimierung zum Beispiel auch lediglich durch eine Abschätzung auf Basis von chemisch-physikalischen Modellen und/oder auf Datenbankeinträgen erfolgen. Demzufolge muß der optimierte Parameter auch kein Optimum, sondern lediglich ein verbesserter Parameter sein. Wie im folgenden noch erläutert wird, kann die Optimierung auch in mehreren (Iterations-)Schritten erfolgen, woraus deutlich wird, daß nach der ersten Optimierung nicht notwendigerweise ein optimaler Methodenparameter vorliegt.According to the invention, this object is achieved by a system and a method for method optimization in chromatography, in particular HPLC (high-performance liquid chromatography) with an analytical column and a precolumn, which is provided for sample preparation, for example macromolecules of biological samples to separate, the system comprising: a device for inputting data for the acquisition of experimental data and / or chemical structural formulas, a computing unit which has access to a database, the computing unit being intended as a function of the acquired data To optimize at least one method parameter based on the database entries and / or physico-chemical models, an output unit which is intended to output the at least one optimized method parameter, a device for inputting method parameters being provided and at least one optimized method pair rameter is a parameter of the guard column. Optimization is to be understood here in the broadest sense. For example, the optimization can also only be carried out by an estimate based on chemical-physical models and / or on database entries. As a result, the optimized parameter does not have to be an optimum, but merely an improved parameter. As will be explained in the following, the optimization can also take place in several (iteration) steps, from which it becomes clear that an optimal method parameter is not necessarily present after the first optimization.
Dabei ist vorzugsweise ein optimierter Methodenparameter der Vorsäule ein Parameter aus der Gruppe umfassend Vorsäulentyp, Art des Lösungsmittels für die Vorsäule, Konzentration des Lösungsmittels für die Vorsäule, Abtrenndauer, Art des Lösungsmittels für die Übertragung auf die analytische Säule, Konzentration des Lösungsmittels für die Übertragung auf die analytische Säule und Übertragungsdauer. Diese Optimierung kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß auf Basis der erfaßten Daten auf Datenbankeinträge zugegriffen wird, die auf Erfahrungswerten beruhende Methodenparameter repräsentieren. Vorzugsweise ist daher für die Eingabe von chemischen Struktur- formeln ein Editor für chemische Formeln vorgesehen. Alternativ oder in Kombination dazu kann auch das Laden einer Datei, welche die entsprechende chemische Strukturformel in einem üblichen Format enthält, vorgesehen sein. Die Einrichtung zur Eingabe von Methodenparametem kann beispielsweise dazu dienen, dem System .mitzuteilen', welche unterschiedlichen Vorsäulentypen aktuell zur Verfügung stehen, so daß eine Optimierung der Methodenparameter auf Basis der tatsächlich verfügbaren experimentellen Möglichkeiten erfolgt.An optimized method parameter of the guard column is preferably a parameter from the group comprising guard column type, type of solvent for the guard column, concentration of solvent for the guard column, separation time, type of solvent for transfer to the analytical column, concentration of solvent for transfer to the analytical column and transfer duration. This optimization can take place, for example, by accessing database entries on the basis of the recorded data, which represent method parameters based on empirical values. It is therefore preferable to enter chemical structure formulas provided an editor for chemical formulas. As an alternative or in combination, the loading of a file which contains the corresponding chemical structural formula in a conventional format can also be provided. The device for entering method parameters can be used, for example, to tell the system which different types of guard columns are currently available, so that the method parameters are optimized on the basis of the experimental options actually available.
Die Datenbank enthält in einer bevorzugten Ausführungsform Parameter von unterschiedlichen Vorsäulen, vorzugsweise für mehrere Konzentrationen einer mobilen Phase von vorzugsweise Metha- noI-Wasser und/oder Acetonitril-Wasser.In a preferred embodiment, the database contains parameters from different guard columns, preferably for several concentrations of a mobile phase, preferably of methanol water and / or acetonitrile water.
Überdies ist es von Vorteil, wenn die Datenbank optimierte Methodenparameter enthält, die auf Erfahrungswerten beruhen. Die Optimierung erfolgt dann in einer zweckmäßigen Ausführungsform auf Basis eines physikalisch mathematischen Modells und/oder auf Basis der Datenbankeinträge.In addition, it is advantageous if the database contains optimized method parameters that are based on empirical values. In an expedient embodiment, the optimization then takes place on the basis of a physically mathematical model and / or on the basis of the database entries.
So ist es beispielsweise möglich, aus der chemischen Strukturformel die Lösungsenergien des Analyten in der mobilen Phase und der stationären Phase zu bestimmen. Aus der Differenz der beiden Energien kann eine theoretische Retentionszeit berechnet werden. Da jedoch die theoretische Berechnung oftmals nicht völlig mit den praktischen Ergebnissen übereinstimmt und lokale Einflüsse und Wechselwirkungen eine Rolle spielen können, ist es von Vorteil, wenn die Optimierung sowohl auf Basis eines physikalisch-chemischen Modells als auch auf Basis der Datenbankeinträge, die sowohl aus Säulenparametern, d.h. Parametern, welche die Eigenschaften der zur Verfügung stehenden Vorsäulen beschreiben, als auch aus optimierten Methodenparametem bestehen.For example, it is possible to determine the solution energies of the analyte in the mobile phase and the stationary phase from the chemical structural formula. A theoretical retention time can be calculated from the difference between the two energies. However, since the theoretical calculation often does not fully correspond to the practical results and local influences and interactions may play a role, it is advantageous if the optimization is based both on a physico-chemical model and on the basis of the database entries, which both consist of column parameters , ie Parameters that describe the properties of the available precolumns and consist of optimized method parameters.
Überdies können in einer bevorzugten Ausführungsform experimentelle Daten erfaßt werden und auf Basis der experimentellen Daten zumindest ein Methodenparameter optimiert werden. So ist es beispielsweise möglich, am Ausgang der Vorsäule den Abtrennvorgang in einem Testlauf zu detektie- ren, um die benötigte Abtrennzeit zu bestimmen. Auf Basis der so ermittelten Abtrennzeit wird dann zumindest ein Methodenparameter optimiert.In addition, in a preferred embodiment, experimental data can be acquired and at least one method parameter can be optimized on the basis of the experimental data. For example, it is possible to detect the separation process in a test run at the exit of the guard column in order to determine the required separation time. At least one method parameter is then optimized on the basis of the separation time determined in this way.
Vorzugsweise ist die Recheneinheit dafür vorgesehen, im Falle, daß keine experimentellen Daten erfaßt wurden, sondern lediglich Strukturformeln und gegebenenfalls Methodenparameter erfaßt wurden, zumindest einen weiteren Methodenparameter zu optimieren. Mit anderen Worten können beispielsweise dem System die chemische Strukturformel und der Typ der Vorsäule sowie die Art des Lösungsmittels mitgeteilt werden, worauf die Recheneinheit dann beispielsweise eine optimierte Lösungsmittelkonzentration bestimmt und über die Ausgabeeinheit ausgibt. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn lediglich ein Vorsäulentyp und lediglich ein bestimmtes Lösungsmittel zur Verfügung steht. Das System kann dadurch leicht an die lokalen Gegebenheiten angepaßt werden und optimiert die Methodenparameter im Rahmen der lokal gegebenen Freiheitsgrade.The computing unit is preferably provided for optimizing at least one further method parameter in the event that no experimental data were recorded, but rather only structural formulas and possibly method parameters were recorded. In other words, the chemical structural formula and the type of guard column and the type of solvent can be communicated to the system, for example, whereupon the computing unit then determines, for example, an optimized solvent concentration and outputs it via the output unit. This is particularly advantageous if only one type of guard column and only one specific solvent is used Available. The system can thus be easily adapted to the local conditions and optimizes the method parameters within the scope of the locally given degrees of freedom.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Systems ist das System in der Lage, ein Schaltventil, welches die Vorsäule mit der analytischen Säule verbindet, anzusteuern. Nach erfolgtem Abtrennvorgang wird die Vorsäule mit der analytischen Säule verbunden, so daß der in der Vorsäule zurückgehaltene Analyt auf die analytische Säule übertragen werden kann. Nach Beendigung des Übertragungsvorgangs wird dann die Vorsäule wieder von der analytischen Säule getrennt, so daß in der analytischen Säule die HPLC-Analyse durchgeführt werden kann.In a preferred embodiment of the system, the system is able to actuate a switching valve which connects the guard column to the analytical column. After the separation process has taken place, the guard column is connected to the analytical column so that the analyte retained in the guard column can be transferred to the analytical column. After the transfer process has ended, the guard column is then separated again from the analytical column, so that the HPLC analysis can be carried out in the analytical column.
In einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform des Systems ist vorgesehen, daß die Schaltzeiten des Schaltventils in Abhängigkeit von den experimentellen Daten und/oder auf Basis der Datenbankeinträge optimiert werden. Wie bereits erwähnt, wird in der Vorsäule die Probenmatrix von dem eigentlichen Analyten getrennt. Während dieses Trennvorgangs ist der Ausgang der Vorsäule mit einem entsprechenden Abfall- bzw. Entsorgungsbehälter verbunden. In der Vorsäule wird der Analyt zurückgehalten, während die Probenmatrix zügig durch die Vorsäule tritt. Die Bewegung des Analyten in der Vorsäule wird so stark eingeschränkt, daß dieser erst die Vorsäule verlassen kann, nachdem die Probenmatrix die Vorsäule lange verlassen hat. Es ist daher notwendig, den Zeitpunkt zu bestimmen, bei dem die Probenmatrix nahezu vollständig aus der Vorsäule abgezogen wurde. Der erste Schaltzeitpunkt des Schaltventils, d.h. der Zeitpunkt, zu dem die Vorsäule mit der analytischen Säule verbunden wird, muß demzufolge zwischen dem Zeitpunkt der vollständigen Abtrennung der Probenmatrix und dem Zeitpunkt, bei dem auch der Analyt die Vorsäule verläßt, liegen. Nach der Verbindung der Vorsäule mit der analytischen Säule wird der Analyt von der Vorsäule auf die analytische Säule übertragen. Erst nachdem diese Übertragung nahezu vollständig erfolgt ist, kann das Ventil erneut geschaltet werden, so daß die Vorsäule wieder von der analytischen Säule getrennt wird und der .normale' Analysevorgang mit Hilfe der analytischen Säule gestartet werden kann. In der bevorzugten Ausführungsform werden die beiden genannten Schaltzeiten des Schaltventils auf Basis von experimentellen Daten und/oder auf Basis von chemisch-physikalischen Modellen und/oder auf Basis von in der Datenbank eingetragenen Erfahrungswerten optimiert, um die Analy- sezeit zu beschleunigen und zugleich sicherzustellen, daß die Probenmatrix vollständig abgetrennt wurde.In a particularly expedient embodiment of the system it is provided that the switching times of the switching valve are optimized depending on the experimental data and / or on the basis of the database entries. As already mentioned, the sample matrix is separated from the actual analyte in the guard column. During this separation process, the outlet of the guard column is connected to a corresponding waste or disposal container. The analyte is retained in the guard column while the sample matrix passes quickly through the guard column. The movement of the analyte in the guard column is so severely restricted that it can only leave the guard column after the sample matrix has left the guard column for a long time. It is therefore necessary to determine the point in time at which the sample matrix has been almost completely removed from the guard column. The first switching time of the switching valve, i.e. the point in time at which the guard column is connected to the analytical column must therefore lie between the point in time when the sample matrix is completely separated and the point in time at which the analyte also leaves the guard column. After connecting the guard column to the analytical column, the analyte is transferred from the guard column to the analytical column. Only after this transfer is almost complete can the valve be switched on again, so that the guard column is again separated from the analytical column and the 'normal' analysis process can be started with the analytical column. In the preferred embodiment, the two switching times of the switching valve are optimized on the basis of experimental data and / or on the basis of chemical-physical models and / or on the basis of empirical values entered in the database, in order to accelerate the analysis time and at the same time ensure that the sample matrix has been completely separated.
Es soll hier betont werden, daß die Erfahrungswerte nicht unbedingt durch „trial and error" Versuche gewonnen werden können, sondern vorzugsweise ursprünglich durch die erfindungsgemäße Optimierung gewonnen wurden. Vorzugsweise sind daher die optimierten Methodenparameter in der Datenbank ablegbar, so daß bei zukünftigen Analyseverfahren gegebenenfalls darauf zurückgegriffen werden kann und die Optimierung gegebenenfalls auf Basis dieser optimierten Parameter erfolgt. Erfindungsgemäß wird die eingangs genannte Aufgabe ebenfalls durch eine Chromatographievorrichtung, insbesondere eine HPLC Chromatographievorrichtung (High-Performance-Liquid-Chro- matography), mit einer analytischen Säule und einer Vorsäule und einem der Vorsäule zugeordneten Detektor gelöst, wobei die Trennsäule dafür vorgesehen ist, zur Probenvorbereitung beispielsweise Makromoleküle von biologischen Proben abzutrennen, wobei die Chromatographievorrichtung ein System aufweist, das eingangs beschrieben worden ist. Dabei weist die Chromatographievorrichtung vorzugsweise mehrere verschiedene Vorsäulen, die wahlweise für die Abtrennung verwendet werden können, auf, die ein poröses Trägermaterial aufweisen mit einem Porendurchmesser vorzugs- weise von etwa 4 - 8 nm. In einer zweckmäßigen Ausführungsform ist ein vorzugsweise ansteuerbares Schaltventil vorgesehen, das die Vorsäule wahlweise mit einer Pumpe für das Vorsäulenlösungsmittel oder mit mehreren analytischen Säulen verbindet.It should be emphasized here that the empirical values cannot necessarily be obtained by "trial and error" tests, but preferably were originally obtained by the optimization according to the invention. The optimized method parameters can therefore preferably be stored in the database, so that future analysis methods may refer to them can be used and the optimization may be based on these optimized parameters. According to the invention, the above-mentioned object is also achieved by a chromatography device, in particular an HPLC chromatography device (high-performance liquid chromatography), with an analytical column and a guard column and a detector assigned to the guard column, the separation column being provided for this purpose Sample preparation, for example, to separate macromolecules from biological samples, the chromatography device having a system which was described at the beginning. The chromatography device preferably has a number of different guard columns, which can optionally be used for the separation, which have a porous support material with a pore diameter, preferably of about 4-8 nm. In a suitable embodiment, a preferably controllable switching valve is provided, which optionally connects the guard column with a pump for the guard column solvent or with several analytical columns.
Die eingangs erwähnte Aufgabe wird auch durch ein Verfahren zur Methodenoptimierung in der Chromatographie gelöst, das die folgenden Schritte aufweist: zumindest teilweises Erfassen eines charakteristischen Datensatzes, bestehend aus einer oder mehreren Strukturformeln eines oder mehrerer Analyten, des Typs der biologischen Matrix, Methodenparametem und experimenteller Daten und Bestimmen von mindestens einem optimierten Parameter der Vorsäule und gegebenenfalls weite- rer optimierter Methodenparameter in Abhängigkeit von dem zumindest teilweise erfaßten charakteristischen Datensatz.The task mentioned at the outset is also achieved by a method for method optimization in chromatography, which comprises the following steps: at least partially acquiring a characteristic data set consisting of one or more structural formulas of one or more analytes, the type of biological matrix, method parameters and experimental data and determining at least one optimized parameter of the precolumn and possibly further optimized method parameters as a function of the at least partially recorded characteristic data set.
Unter einem charakteristischen Datensatz wird ein Datensatz verstanden, in dem für einen Analysevorgang einschließlich der Abtrennung der Probenmatrix alle charakteristischen Parameter ein- getragen sind. Zum Bestimmen des mindestens einen optimierten Parameters wird vorzugsweise auf eine Datenbank zugegriffen, in der inhärente Säulenparameter für eine Mehrzahl von verschiedenen Vorsäulentypen jeweils in Abhängigkeit von verschiedenen Lösungsmitteltypen und deren Konzentration abgelegt sind.A characteristic data record is understood to be a data record in which all the characteristic parameters are entered for an analysis process, including the separation of the sample matrix. To determine the at least one optimized parameter, access is preferably made to a database in which inherent column parameters for a plurality of different precolumn types are stored, depending on different solvent types and their concentration.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird vorgesehen, daß dann, wenn von dem charakteristischen Datensatz lediglich eine oder mehrere Strukturformeln erfaßt wurden, das Bestimmen des mindestens einen optimierten Parameters auf Basis von in der Datenbank abgelegten Erfahrungswerten und/oder in Abhängigkeit von dem molekularen Volumen des oder der Analyten und/oder in Abhängigkeit von der Wechselwirkungsenergie des oder der Analyten mit H2O und/oder in Abhängigkeit von den in der Datenbank abgelegten inhärenten Säulenparametern erfolgt. Nach theoretischen Berechnungen gilt die Beziehung: ln&'= a(V)2 + b(ΔG) + c , wobei V das molekulare Volumen des Analyten ist, ΔG die Wechselwirkungsenergie des Analyten mit H2O ist, k' die Retentionszeit und a, b, c Parameter des Sor- bens/Eluens-Systems sind. Die Parameter a, b, c sind daher die inhärenten Säulenparameter.In a particularly preferred embodiment it is provided that when only one or more structural formulas have been recorded from the characteristic data set, the determination of the at least one optimized parameter on the basis of empirical values stored in the database and / or depending on the molecular volume of the or the analyte and / or depending on the interaction energy of the analyte or analytes with H 2 O and / or depending on the inherent column parameters stored in the database. According to theoretical calculations, the relationship is: ln &'= a (V) 2 + b (ΔG) + c, where V is the molecular volume of the analyte, ΔG is the interaction energy of the analyte with H 2 O, k' is the retention time and a, b, c are parameters of the sorbent / eluent system. The parameters a, b, c are therefore the inherent column parameters.
Mit Hilfe der obigen Formel kann für jeden Bestandteil des Analyten die theoretische Retentionszeit beispielsweise in Abhängigkeit von der Lösungsmittelkonzentration berechnet werden. Bei der anschließenden Optimierung ist ein Kompromiß zwischen möglichst guter Trennung der unterschiedlichen Bestandteile des Analyten und minimaler Analysendauer zu finden.Using the above formula, the theoretical retention time can be calculated, for example, as a function of the solvent concentration for each component of the analyte. In the subsequent optimization, a compromise can be found between the best possible separation of the different components of the analyte and a minimal analysis time.
Die optimierten Parameter sind vorzugsweise der Vorsäulentyp, die Art des Lösungsmittels für die Vorsäule, die Konzentration des Lösungsmittels für die Vorsäule, gegebenenfalls die Art und die Konzentration des Übertragungslösungsmittels für die Übertragung des oder der Analyten von der Vorsäule auf die analytische Säule und gegebenenfalls den Typ der analytischen Säule. Für den Fall, daß wenn von dem charakteristischen Datensatz lediglich die Strukturformel, der Vorsäulentyp und gegebenenfalls die Art des Lösungsmittels erfaßt wurden, sind die optimierten Parameter die Konzentration des Lösungsmittels für die Vorsäule und gegebenenfalls die Art des Lösungsmittels für die Vorsäule.The optimized parameters are preferably the precolumn type, the type of solvent for the precolumn, the concentration of the solvent for the precolumn, optionally the type and the concentration of the transfer solvent for the transfer of the analyte or analytes from the precolumn to the analytical column and optionally the type the analytical column. In the event that only the structural formula, the precolumn type and, if applicable, the type of solvent have been recorded from the characteristic data set, the optimized parameters are the concentration of the solvent for the precolumn and, if appropriate, the type of solvent for the precolumn.
In einem besonders bevorzugten Verfahren werden das zumindest teilweise Erfassen eines charakteristischen Datensatzes und das Bestimmen des optimierten Parameters zumindest einmal wiederholt, wobei beim wiederholten Durchlaufen des Schritts der zumindest teilweisen Erfassung des charakteristischen Datensatzes experimentelle Daten, die auf Basis der im vorherigen Schritt bestimmten optimierten Methodenparameter gewonnen wurden, erfaßt werden. Mit anderen Wor- ten werden auf Basis der optimierten Parameter (Test-) Versuche durchgeführt. Diese so ermittelten experimentellen Daten werden verwendet, um die Methodenparameter weiter zu optimieren. Das Verfahren kann prinzipiell beliebig oft fortgesetzt werden, wobei im allgemeinen jedoch wenige Optimierungsschritte genügen, um sehr gut geeignete Methodenparameter zu erhalten.In a particularly preferred method, the at least partial acquisition of a characteristic data set and the determination of the optimized parameter are repeated at least once, wherein when the step of at least partial acquisition of the characteristic data set is repeated, experimental data is obtained on the basis of the optimized method parameters determined in the previous step were recorded. In other words, (test) tests are carried out on the basis of the optimized parameters. The experimental data determined in this way are used to further optimize the method parameters. In principle, the method can be continued as often as desired, although in general a few optimization steps are sufficient to obtain very suitable method parameters.
Besonders bevorzugt sieht das Verfahren vor, daß die optimierten Methodenparameter, vorzugsweise in Form eines optimierten charakteristischen Datensatzes, in der Datenbank abgelegt werden. Dies hat den Vorteil, daß einmal optimierte Methodenparameter auch für künftige ähnliche Analyseverfahren zur Verfügung stehen. So ist es beispielsweise möglich, für verschiedene häufig vorkommende biologische Proben Versuche für verschiedene Vorsäulentypen und für verschiede- ne Konzentrationen des Lösungsmittels mit verschiedenen Analyten durchzuführen und die so optimierten Methodenparameter in eine Datenbank einzutragen. Für die eigentliche Analyse ist dann das Durchführen von weiteren Testversuchen nicht mehr notwendig, da mittels des Verfah- rens sofort ausreichend optimierte Methodenparameter zur Verfügung stehen, um eine HPLC- Analyse mit hervorragender Qualität durchführen zu können.The method particularly preferably provides that the optimized method parameters, preferably in the form of an optimized characteristic data set, are stored in the database. This has the advantage that method parameters that have been optimized once are also available for future similar analysis methods. For example, it is possible to carry out tests for different types of precolumn and for different concentrations of the solvent with different analytes for different frequently occurring biological samples and to record the method parameters thus optimized in a database. It is then no longer necessary to carry out further test trials for the actual analysis, since by means of the method sufficiently optimized method parameters are immediately available to carry out an HPLC analysis with excellent quality.
Die vorliegende Erfindung erlaubt es, die HPLC-Analyse als standardmäßiges Analyseverfahren auch für biologische Proben einzusetzen. Dadurch, daß die sonst notwendige sehr aufwendige Abtrennprozedur mit Hilfe des Verfahrens deutlich abgekürzt werden kann, kann eine HPLC- Analyse an biologischen Proben sehr kostengünstig verwirklicht werden.The present invention allows HPLC analysis to be used as a standard analysis method also for biological samples. Because the otherwise very expensive separation procedure can be significantly shortened with the aid of the method, an HPLC analysis on biological samples can be carried out very inexpensively.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung werden deutlich anhand der folgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform sowie der dazugehörigen Figur. Es zeigt:Further advantages, features and possible applications of the present invention will become clear from the following description of a preferred embodiment and the associated figure. It shows:
Figur 1 A und 1 B eine schematische Prinzipskizze des Analyseverfahrens.Figure 1 A and 1 B is a schematic diagram of the analysis method.
Eine Chromatographievorrichtung, in der das erfindungsgemäße System bzw. das erfindungsgemäße Verfahren verwendet, ist in den Figuren 1A und 1B schematisch dargestellt. Zu erkennen sind die Vorsäule VS und die analytische Säule AS. In der in Figur 1A gezeigten Anordnung wird eine erste mobile Phase A mittels einer ersten Pumpe P1 über die Öffnungen 6 und 1 des Schaltventils SV in die Vorsäule VS gepumpt. Der stromabwärtige Teil der Vorsäule ist über die Öffnun- gen 4, 5 des Schaltventils mit einem Abfallsammelbehälter 7 verbunden. Zwischen der Pumpe P1 und der Vorsäule VS ist der Injektor IN vorgesehen, über den die biologische Probe für die Analyse injiziert wird. Mit Vorteil wird die biologische Probe vor der Injizierung zentrifugiert. In dem in Figur 1A gezeigten ersten Schritt wird die biologische Probe über den Injektor IN injiziert und die Fraktionierung, d.h. die Abtrennung des Analyten von der Probenmatrix erfolgt. Die Injektion kann manuell oder über einen automatischen Probengeber erfolgen. Die von der ersten Pumpe P1 geförderte mobile Phase spült die Probe über die Ventilpositionen 1-6 in die Vorsäule. Die Vorsäule ist mit einem speziellen Trägermaterial für die Probenaufbereitung von biologischen Flüssigkeiten als Sorbens bestückt. Dieses spezielle Trägermaterial ist porös mit einem Porendurchmesser von etwa 6 nm. Dies hat zur Folge, daß Makromoleküle (zum Beispiel Proteine) mit einem großen Mo- lekulargewicht nicht in die Poren eindringen können und daher im Totvolumen der Säule eluieren. Das verwendet Sorbens besitzt zwei chemisch unterschiedliche Oberflächen. So sind zum einen auf der äußeren Oberfläche der im allgemeinen sphärischen Teile hydrophile, elektroneutrale Di- olgruppen gebunden. Wie bereits erwähnt, kann aber die Modifizierung der inneren Oberflächen auch durch lonenaustauschergruppen erfolgen. Diese Schicht dient dazu, jegliche Wechselwirkung zwischen dem Sorbens und der Proteinmatrix zu unterbinden und dadurch die Kontamination der Vorsäule bei mehrfachem Einsatz zu minimieren. Die inneren Flächen der Poren der porösen Teilchen besitzen zum anderen eine hydrophobe Verteilungsphase (C -, C8- oder Cι8-Alkylketten). Diese auf der Oberfläche im Poreninneren gebundenen Adsorptionszentren sind im allgemeinen für die niedermolekularen Probenkomponenten, d.h. den eigentlichen Analyten, frei zugänglich. Dies hat zur Folge, daß die in der biologischen Probe enthaltenen Analyte in den Poren des Sorbens zurückgehalten werden, während die Probenmatrix nahezu ungehindert über die Ventilposi- tionen 4-5 direkt in den Abfallbehälter 7 gespült werden. Nachdem die Proteinmatrix vollständig eluiert ist, wird das Schaltventil SV umgeschaltet, so daß die in Figur 1 B gezeigte Anordnung realisiert wird. Dem Umschaltzeitpunkt des Schaltventils kommt hierbei eine wesentliche Rolle zu. So darf zum einen die Umschaltung nicht zu früh erfolgen, da die Probenmatrix vollständig eluiert sein muß. Befindet sich nämlich noch Proteinmatrix in der Vorsäule, so wird diese, wenn das Schalt- ventil SV geschaltet wird, auf die analytische Säule übertragen und kontaminiert diese mit Proteinen. Dies führt zu einem allgemein irreversiblen Druckanstieg, sowie zu einem Verlust an Kapazität und Selektivität. Zum anderen darf das Schaltventil SV auch nicht zu spät geschaltet werden, da die Vorsäule VS den Analyten in der biologischen Probe lediglich verzögert, so daß dann, wenn die in Figur 1A gezeigte Position zu lange beibehalten wird, der Analyt ebenfalls über die Schalt- ventilstellung 4-5 in den Abfallbehälter 7 gespült wird.A chromatography device in which the system according to the invention and the method according to the invention are used is shown schematically in FIGS. 1A and 1B. You can see the guard column VS and the analytical column AS. In the arrangement shown in FIG. 1A, a first mobile phase A is pumped into the precolumn VS via the openings 6 and 1 of the switching valve SV by means of a first pump P1. The downstream part of the guard column is connected to a waste collecting container 7 via the openings 4, 5 of the switching valve. The injector IN, through which the biological sample is injected for analysis, is provided between the pump P1 and the precolumn VS. The biological sample is advantageously centrifuged before injection. In the first step shown in FIG. 1A, the biological sample is injected via the injector IN and the fractionation, ie the separation of the analyte from the sample matrix, is carried out. The injection can be done manually or via an automatic sampler. The mobile phase conveyed by the first pump P1 rinses the sample into the guard column via valve positions 1-6. The guard column is equipped with a special carrier material for the sample preparation of biological liquids as a sorbent. This special carrier material is porous with a pore diameter of about 6 nm. This has the consequence that macromolecules (for example proteins) with a large molecular weight cannot penetrate into the pores and therefore elute in the dead volume of the column. The sorbent used has two chemically different surfaces. On the one hand, hydrophilic, electroneutral diol groups are bound on the outer surface of the generally spherical parts. As already mentioned, the modification of the inner surfaces can also be carried out by ion exchange groups. This layer serves to prevent any interaction between the sorbent and the protein matrix and thereby minimize contamination of the guard column when used multiple times. The inner surfaces of the pores of the porous particles also have a hydrophobic distribution phase (C, C 8 or C 8 alkyl chains). These adsorption centers bound on the surface inside the pore are generally freely accessible for the low molecular weight sample components, ie the actual analyte. The result of this is that the analytes contained in the biological sample are retained in the pores of the sorbent, while the sample matrix is flushed almost unhindered directly into the waste container 7 via the valve positions 4-5. After the protein matrix has been completely eluted, the switching valve SV is switched over, so that the arrangement shown in FIG. 1B is realized. The switching time of the switching valve plays an important role here. On the one hand, the switchover must not take place too early, since the sample matrix must be completely eluted. If there is still protein matrix in the guard column, this is transferred to the analytical column when the switching valve SV is switched and contaminates it with proteins. This leads to a generally irreversible increase in pressure, as well as a loss of capacity and selectivity. On the other hand, the switching valve SV must also not be switched too late, since the precolumn VS only delays the analyte in the biological sample, so that if the position shown in FIG. 1A is maintained too long, the analyte also moves via the switching valve position 4-5 is flushed into the waste container 7.
Um diesen Ventilschaltzeitpunkt zu ermitteln, wird daher zunächst das Elutionsprofil der Probenmatrix ermittelt. Dabei wird die Vorsäule direkt an einen Detektor, beispielsweise einen UV- Detektor, angeschlossen. Nach Injektion der Probe über den Injektor IN wird dann das Eluti- onsprofil der Proteinmatrix ermittelt. Der Trennungsvorgang, d.h. die vollständige Elution der Proteinmatrix, ist dann abgeschlossen, wenn der Proteinpeak die Basislinie erreicht. Die Zeit bis zur vollständigen Fraktionierung sei im folgenden mit tM bezeichnet.To determine this valve switching time, the elution profile of the sample matrix is therefore first determined. The guard column is connected directly to a detector, for example a UV detector. After the sample has been injected via the IN injector, the elution profile of the protein matrix is then determined. The separation process, ie the complete elution of the protein matrix, is complete when the protein peak reaches the baseline. The time until complete fractionation is referred to as t M below.
Als nächstes wird das Elutionsprofil des Analyten bestimmt. Dabei erfolgt die Elution des Analyten mit derselben mobilen Phase und Flußrate, wie sie für die Elution der Probenmatrix verwendet wurde. Es sei tA die Zeit, nach der der Analyt beginnt zu eluieren. Um eine optimale Abtrennung der Proteinmatrix von dem Analyten zu gewährleisten, ist auf jeden Fall sicherzustellen, daß tA > tM ist. Dies kann durch geeignete Wahl des Sorbens und der mobilen Phase erfolgen.Next, the analyte elution profile is determined. The analyte is eluted with the same mobile phase and flow rate as was used for the elution of the sample matrix. Let t A be the time after which the analyte begins to elute. In order to ensure optimal separation of the protein matrix from the analyte, it must be ensured in any case that t A > t M. This can be done by a suitable choice of the sorbent and the mobile phase.
Nachdem die Probenmatrix von dem Analyten abgetrennt worden ist und in den Abfallbehälter 7 gespült wurde, wird, wie bereits erwähnt, das Schaltventil SV geschaltet, so daß die in Figur 1 B gezeigte Anordnung entsteht.After the sample matrix has been separated from the analyte and rinsed into the waste container 7, the switching valve SV is switched, as already mentioned, so that the arrangement shown in FIG. 1B is produced.
Hier wird nun mit Hilfe einer zweiten Pumpe P2 eine zweite mobile Phase B über die Schaltventil- Stellung 3-4 auf die Vorsäule gegeben, die wiederum über die Schaltventil SV Stellung 1-2 mit der analytischen Säule AS verbunden ist. Am Ausgang der analytischen Säule AS ist wiederum derHere, with the help of a second pump P2, a second mobile phase B is transferred to the precolumn via the switching valve position 3-4, which in turn is connected to the analytical column AS via the switching valve SV position 1-2. At the exit of the analytical column AS is again the
Abfallbehälter 7 angeordnet. Zwischen analytischer Säule AS und Abfallbehälter 7 ist ein Detektor D vorgesehen. In dieser Stellung wird der Analyt aus der Vorsäule ausgespült und auf die analytische Säule gegeben. Nachdem der Analyt vollständig übertragen worden ist, wird das Schaltventil SV wieder geschaltet, so daß sich erneut die in der Figur 1A gezeigte Anordnung ergibt. Der Analyt befindet sich nun auf der analytischen Säule und die eigentliche Analyse kann in der bekannten Art und Weise erfolgen. In der in Figur 1A gezeigten Anordnung wird die mobile Phase B mit Hilfe der Pumpe P2 über die Ventilstellung 2-3 auf die analytische Säule gegeben, die wiederum über den Detektor D mit dem Abfallbehälter 7 verbunden ist. Auch dem zweiten Ventilschaltpunkt kommt entscheidende Bedeutung zu. Um hier einen optimalen Schaltzeitpunkt zu finden, wird das Elutionsprofil des Analytentransfers gemessen. Hierzu wird in einem Vorversuch vorzugsweise der Analyt ohne Probenmatrix direkt auf die Vorsäule gegeben. An einem Detektor, der vorzugsweise direkt vor der analytischen Säule angeordnet wird, wird dann in der Anordnung von Figur 1 B das Elutionsprofil des Analyten aus der Vorsäule gemessen. Der Zeitpunkt, bei dem das Elutionsprofil des Analytentransfers die Basislinie erreicht, sei mit tτ bezeichnet. Dies ist der früheste Zeitpunkt, bei dem das Schaltventil SV wieder in die in Figur 1A gezeigte Position geschaltet werden kann, da erst zu diesem Zeitpunkt der Analyt vollständig auf die analytische Säule transferiert worden ist. Aus den Meßergebnissen können die optimalen Ventilschaltzeiten berechnet werden, so ergibt sich vorzugsweise für Analyte, die für tA einen Wert von < 10 min besitzen, eine erste Ventilschaltzeit, die von der in Figur 1A gezeigten Anordnung auf die in Figur 1B gezeigte Anordnung umschaltet vonWaste container 7 arranged. There is a detector between the analytical column AS and the waste container 7 D provided. In this position, the analyte is rinsed out of the guard column and placed on the analytical column. After the analyte has been completely transmitted, the switching valve SV is switched again, so that the arrangement shown in FIG. 1A results again. The analyte is now on the analytical column and the actual analysis can be carried out in the known manner. In the arrangement shown in FIG. 1A, the mobile phase B is transferred to the analytical column by means of the pump P2 via the valve position 2-3, which in turn is connected to the waste container 7 via the detector D. The second valve switching point is also of crucial importance. In order to find an optimal switching time here, the elution profile of the analyte transfer is measured. For this purpose, the analyte is preferably applied directly to the precolumn without a sample matrix in a preliminary test. The elution profile of the analyte from the precolumn is then measured on a detector, which is preferably arranged directly in front of the analytical column, in the arrangement of FIG. 1B. The point in time at which the elution profile of the analyte transfer reaches the baseline is denoted by t τ . This is the earliest point in time at which the switching valve SV can be switched back to the position shown in FIG. 1A, since only then has the analyte been completely transferred to the analytical column. The optimum valve switching times can be calculated from the measurement results, so that for analytes which have a value of <10 min for t A , a first valve switching time results which switches from the arrangement shown in FIG. 1A to the arrangement shown in FIG. 1B
tv1 = y2 (tM + tA).t v1 = y 2 (t M + t A ).
Für Analyte, die für tA einen Wert von > 10 min besitzen, sollte t ι mindestens tM + 5 min sei. Dabei ist zu beachten, daß tM < tA ist. Ist dies nicht der Fall, muß das Sorbensmaterial der Vorsäule oder die mobile Phase der Vorsäule verändert werden. Die zweite Ventilschaltzeit tV2 , bei der die Vorsäule wieder von der analytischen Säule getrennt wird, beträgt vorzugsweise mindestens tτ+1min. Dieses recht aufwendige Vorbereitungsverfahren zur Probenaufbereitung wird durch das erfindungsgemäße System bzw. das erfindungsgemäße Verfahren optimiert. So ist beispielsweise in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Systems vorgesehen, daß der Anwender, der einen bestimm- ten Analyten in einer bestimmten Probenmatrix nachweisen will, dem System die chemische Strukturformel des Analyten und/oder der Probenmatrix mitteilt. Das System schlägt daraufhin dem Benutzer einen Vorsäulentyp sowie eine optimierte Konzentration der mobilen Phase für die Vorsäule vor. Auf Basis des Vorschlages kann nun der Anwender das Elutionsprofil des Analyten und der Probenmatrix experimentell bestimmen. Nach Eingabe der experimentellen Daten in das System berechnet das System die Ventilschaltzeit für den Matrixabtrennungsschritt tv1. Auf Grundlage der experimentellen Ergebnisse und gegebenenfalls von Datenbankeinträgen, die auf Erfahrungswerten bzw. auf bereits durchgeführten experimentellen Daten beruhen, wird von dem System die Konzen- tration des organischen Lösungsmittels für die Übertragung des Analyten bestimmt. Der Benutzer bestimmt nun das Elutionsprofil für den Transfer des Analyten. Aus den experimentellen Daten bestimmt das System die Ventilschaltzeit tV2 für den Transferschritt des Analyten. Auf Grundlage der Ergebnisse werden von dem System die optimierten Methodenparameter durchgeführt. Des weite- ren ist das System in der Lage, die optimierten Parameter in eine Datenbank einzutragen, so daß für den Fall, daß zu einem späteren Zeitpunkt der Anwender die Analyse eines gleichen oder chemisch ähnlichen Analyten in einer gleichen oder chemisch ähnlichen Proteinmatrix analysieren möchte, auf die Vorversuche völlig verzichtet werden kann und das System lediglich die bereits vorher optimierten Methodenparameter vorschlägt. So ist erfindungsgemäß beispielsweise möglich, auf die Vorver- suche völlig zu verzichten, sofern in der Datenbank Einträge vorhanden sind, die bereits in Vorversuchen optimierte Methodenparameter umfassen.For analytes which have a value of> 10 min for t A , t ι should be at least t M + 5 min. It should be noted that t M <t A. If this is not the case, the sorbent material of the guard column or the mobile phase of the guard column must be changed. The second valve switching time t V2 , at which the guard column is again separated from the analytical column, is preferably at least t τ + 1min. This rather complex preparation process for sample preparation is optimized by the system according to the invention or the method according to the invention. For example, one embodiment of the system according to the invention provides that the user who wants to detect a certain analyte in a certain sample matrix informs the system of the chemical structural formula of the analyte and / or the sample matrix. The system then suggests a type of guard column and an optimized concentration of the mobile phase for the guard column to the user. Based on the proposal, the user can now experimentally determine the elution profile of the analyte and the sample matrix. After entering the experimental data into the system, the system calculates the valve switching time for the matrix separation step t v1 . On the basis of the experimental results and, if applicable, of database entries based on empirical values or on experimental data already carried out, the system tration of the organic solvent for the transfer of the analyte determined. The user now determines the elution profile for the transfer of the analyte. The system uses the experimental data to determine the valve switching time t V2 for the transfer step of the analyte. Based on the results, the system performs the optimized method parameters. Furthermore, the system is able to enter the optimized parameters in a database, so that in the event that the user later wants to analyze the analysis of an identical or chemically similar analyte in an identical or chemically similar protein matrix, Preliminary tests can be completely dispensed with and the system only suggests the method parameters that have already been optimized. For example, according to the invention it is possible to completely do without the preliminary tests, provided that there are entries in the database which already include method parameters which have been optimized in preliminary tests.
Durch die vorliegende Erfindung ist es daher erstmals möglich, die Chromatographie generell, insbesondere die HPLC-Chromatographie, einfach und preisgünstig auch für in einer biologischen Pro- be enthaltene Analyten einzusetzen. Damit steht die HPLC-Chromatographie auch für biologische Proben als Standardanalyseverfahren zur Verfügung. The present invention therefore makes it possible for the first time to use chromatography in general, in particular HPLC chromatography, in a simple and inexpensive manner also for analytes contained in a biological sample. This means that HPLC chromatography is also available as the standard analysis method for biological samples.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patent claims
1. System zur Methodenoptimierung der Chromatographie, insbesondere der HPLC (High- Performance-Liquid-Chromatography), mit einer analytischen Säule (Trennsäule) und einer Vorsäule, die dafür vorgesehen ist, zur Probenvorbereitung beispielsweise Makromoleküle von biologischen Proben abzutrennen, wobei das System aufweist: eine Einrichtung zur Eingabe von Daten, für die Erfassung von experimentellen Daten und/oder von chemischen Strukturformeln des Analyten und/oder der Probenmatrix, eine Recheneinheit, die Zugriff auf eine Datenbank hat, wobei die Recheneinheit dafür vorgesehen ist, in Abhängigkeit von den erfaßten Daten zumindest einen Methodenparameter zu optimieren, eine Ausgabeeinheit, die dafür vorgesehen ist, den zumindest einen optimierten Methodenparameter auszugeben, wobei zumindest ein optimierter Methodenparameter ein Parameter der Vorsäule ist.1. System for method optimization of chromatography, in particular HPLC (high-performance liquid chromatography), with an analytical column (separation column) and a guard column, which is intended for sample preparation, for example, to separate macromolecules from biological samples, the system having : a device for inputting data, for the acquisition of experimental data and / or chemical structural formulas of the analyte and / or the sample matrix, a computing unit which has access to a database, the computing unit being provided depending on the data acquired To optimize data of at least one method parameter, an output unit which is intended to output the at least one optimized method parameter, at least one optimized method parameter being a parameter of the guard column.
2. System nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein optimierter Methodenparameter ein Parameter aus der Gruppe umfassend Vorsäulentyp, Art des Lösungsmittels für die Vorsäule, Konzentration des Lösungsmittels für die Vorsäule, Abtrenndauer, Art des Lösungsmittels für die Übertragung auf die analytische Säule, Konzentration des Lösungsmittels für die Übertragung auf die analytische Säule und Übertragungsdauer ist.2. System according to claim 1, characterized in that at least one optimized method parameter is a parameter from the group comprising guard column type, type of solvent for the guard column, concentration of solvent for the guard column, separation time, type of solvent for transfer to the analytical column, Concentration of solvent for transfer to the analytical column and transfer time is.
3. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für die Eingabe von chemischen Strukturformeln ein Editor für chemische Formeln vorgesehen ist und/oder das Laden einer Datei, welche die entsprechende Formel in einem üblichen For- mat enthält, vorgesehen ist.3. System according to any one of the preceding claims, characterized in that an editor for chemical formulas is provided for the input of chemical structural formulas and / or the loading of a file which contains the corresponding formula in a conventional format is provided.
4. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Datenbank Parameter von unterschiedlichen Vorsäulen und unterschiedlichen analytischen Säulen (Trennsäulen) vorzugsweise für mehrere Konzentrationen einer mobilen Phase von vorzugsweise Methanol-Wasser und/oder Acetonitril-Wasser enthält.4. System according to any one of the preceding claims, characterized in that the database contains parameters of different guard columns and different analytical columns (separation columns) preferably for several concentrations of a mobile phase, preferably methanol-water and / or acetonitrile-water.
5. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Datenbank optimierte Methodenparameter, die auf Erfahrungswerten beruhen, enthält.5. System according to any one of the preceding claims, characterized in that the database contains optimized method parameters based on empirical values.
6. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vorgesehen ist, die Optimierung auf Basis eines mathematischen Modells und/oder auf Basis der Datenbankeinträge durchzuführen. 6. System according to one of the preceding claims, characterized in that it is provided to carry out the optimization on the basis of a mathematical model and / or on the basis of the database entries.
7. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Recheneinheit dafür vorgesehen ist, im Falle, daß keine experimentellen Daten erfaßt wurden, sondern lediglich Strukturformeln und gegebenenfalls Methodenparameter eingegeben wurden, zumindest einen weiteren Methodenparameter zu optimieren.7. System according to any one of the preceding claims, characterized in that the computing unit is intended to optimize at least one further method parameter in the event that no experimental data have been recorded, but only structural formulas and possibly method parameters have been entered.
8. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine An- steuereinheit für die Ansteuerung eines Schaltventils, welches die Vorsäule mit der analytischen Säule verbindet, vorgesehen ist.8. System according to any one of the preceding claims, characterized in that a control unit for controlling a switching valve which connects the guard column with the analytical column is provided.
9. System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Schaltzeiten des Schaltventils in Abhängigkeit von den experimentellen Daten und/oder auf Basis der Datenbankeinträge optimiert werden.9. System according to claim 8, characterized in that the switching times of the switching valve are optimized as a function of the experimental data and / or on the basis of the database entries.
10. Chromatographieeinrichtung, insbesondere eine HPLC-Chromatographieeinrichtung (High- Performance-Liquid-Chromatography), mit einer analytischen Säule und einer Vorsäule und einem der Vorsäule zugeordneten Detektor, wobei die Trennsäule dafür vorgesehen ist, zur Probenvorbereitung beispielsweise Makromoleküle von biologischen Proben abzutrennen, dadurch gekennzeichnet, daß ein System nach einem der Ansprüche 1 bis 10 vorgesehen ist.10. Chromatography device, in particular an HPLC chromatography device (high-performance liquid chromatography), with an analytical column and a precolumn and a detector assigned to the precolumn, the separating column being intended, for example, to separate macromolecules from biological samples for sample preparation, thereby characterized in that a system according to one of claims 1 to 10 is provided.
11. Chromatographieeinrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorsäule ein poröses Trägermaterial vorzugsweise mit einem Porendurchmesser von etwa 4 bis 8 nm aufweist.11. Chromatography device according to claim 10, characterized in that the guard column preferably has a porous carrier material with a pore diameter of approximately 4 to 8 nm.
12. Chromatographieeinrichtung nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß ein Schaltventil vorgesehen ist, wodurch die Vorsäule mit der analytischen Säule verbindbar ist.12. Chromatography device according to claim 10 or 11, characterized in that a switching valve is provided, whereby the guard column can be connected to the analytical column.
13. Chromatographieeinrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Schaltventil die Vorsäule wahlweise mit einer Pumpe für das Vorsäulenlösungsmittel oder mit der analytischen Säule verbindet.13. Chromatography device according to claim 12, characterized in that the switching valve connects the guard column either with a pump for the guard column solvent or with the analytical column.
14. Verfahren zur Methodenoptimierung in der Chromatographie, das die folgenden Schritte aufweist: a) Zumindest teilweises Erfassen eines charakteristischen Datensatzes bestehend aus einer oder mehreren Strukturformeln eines oder mehrerer Analyten, des Typs der biologischen Matrix, Methodenparametem und experimentellen Daten und b) Bestimmen von mindestens einem optimierten Parameter der Vorsäule und gege- benenfalls weiterer optimierter Methodenparameter in Abhängigkeit von dem zumindest teilweise erfaßten charakteristischen Datensatz.14. A method for method optimization in chromatography, which comprises the following steps: a) at least partially recording a characteristic data set consisting of one or more structural formulas of one or more analytes, the type of the biological matrix, method parameters and experimental data, and b) determining at least one optimized parameter of the guard column and, if appropriate, further optimized method parameters depending on the at least partially recorded characteristic data set.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß zum Bestimmen von mindestens einem optimierten Parameter auf eine Datenbank zugegriffen wird, in der inhärente Säulenparameter für eine Mehrzahl von verschiedenen Vorsäulentypen gegebenenfalls in15. The method according to claim 14, characterized in that a database is accessed to determine at least one optimized parameter in which inherent column parameters for a plurality of different guard column types, if appropriate
Abhängigkeit von verschiedenen Lösungsmitteltypen und deren Konzentration und/oder charakteristische Datensätze, die auf Erfahrungswerten beruhen, abgelegt sind.Dependency on different types of solvents and their concentration and / or characteristic data records based on empirical values are stored.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß dann, wenn von dem charakteristischen Datensatz lediglich eine oder mehrere Strukturformeln erfaßt wurden, das Bestimmen des mindestens einen optimierten Parameters auf Basis von in der Datenbank abgelegten Erfahrungswerten und/oder in Abhängigkeit von dem molekularen Volumen des oder der Analyten und/oder in Abhängigkeit von der Wechselwirkungsenergie des oder der Analyten mit H2O und/oder in Abhängigkeit von den in der Datenbank abgelegten inhärenten Säulenparametern erfolgt.16. The method according to claim 14 or 15, characterized in that when only one or more structural formulas have been recorded from the characteristic data set, the determination of the at least one optimized parameter on the basis of empirical values stored in the database and / or depending on the molecular volume of the analyte or analytes and / or depending on the interaction energy of the analyte or analytes with H 2 O and / or depending on the inherent column parameters stored in the database.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß dann, wenn von dem charakteristischen Datensatz lediglich eine oder mehrere Strukturformeln erfaßt wurden, die optimierten Parameter der Vorsäulentyp, die Art des Lösungsmittels für die Vorsäule, die Kon- zentration des Lösungsmittels für die Vorsäule, gegebenenfalls die Art und die Konzentration des Übertragungslösungsmittels für die Übertragung des oder der Analyten von der Vorsäule auf die analytische Säule und gegebenenfalls den Typ der analytischen Säule sind.17. The method according to claim 16, characterized in that when only one or more structural formulas have been recorded from the characteristic data set, the optimized parameters of the precolumn type, the type of solvent for the precolumn, the concentration of the solvent for the precolumn, where appropriate, the type and concentration of the transfer solvent for the transfer of the analyte or analytes from the precolumn to the analytical column and, if appropriate, the type of the analytical column.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß dann, wenn von dem charakteristischen Datensatz lediglich die Strukturformel, der Vorsäulentyp und gegebenenfalls die Art des Lösungsmittels erfaßt wurden, die optimierten Parameter die Konzentration des Lösungsmittels für die Vorsäule und gegebenenfalls die Art des Lösungsmittels für die Vorsäule sind.18. The method according to any one of claims 14 to 17, characterized in that when only the structural formula, the precolumn type and possibly the type of solvent have been recorded from the characteristic data set, the optimized parameters the concentration of the solvent for the precolumn and possibly the Type of solvent for the guard column are.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte a) und b) zumindest einmal wiederholt werden, wobei beim wiederholten Durchlaufen von Schritt a) experimentelle Daten, die auf Basis der im vorherigen Schritt b) bestimmten optimierten Methodenparameter gewonnen wurden, erfaßt werden.19. The method according to any one of claims 14 to 18, characterized in that steps a) and b) are repeated at least once, with the repeated passage of Step a) experimental data obtained on the basis of the optimized method parameters determined in the previous step b) are recorded.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die optimierten Methodenparameter, vorzugsweise in Form eines optimierten charakteristischen Datensatzes, in der Datenbank abgelegt werden. 20. The method according to any one of claims 15 to 19, characterized in that the optimized method parameters, preferably in the form of an optimized characteristic data set, are stored in the database.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10128546A1 (en) * 2001-06-13 2002-12-19 Merck Patent Gmbh Process for automatically carrying out chromatographic investigations comprises acquiring data, calculating retention times, optimizing retention times
US20060096924A1 (en) * 2002-09-19 2006-05-11 Hartmut Schlueter Method for discovering suitable chromatography conditions for the separation of biological molecules
US20060186028A1 (en) 2004-02-06 2006-08-24 Micromass Uk Limited Mass spectrometer
EP2633306B1 (en) * 2010-10-27 2016-03-23 GE Healthcare Bio-Sciences AB Chromatography system with guard columns

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4130475A1 (en) * 1991-09-13 1993-03-18 Merck Patent Gmbh MODIFIED CHROMATOGRAPHIC SUPPLY MATERIALS
IT1277749B1 (en) * 1995-12-29 1997-11-12 Fisons Instr Spa DEVICE AND METHOD FOR PERFORMING THE SEPARATION OF A SAMPLE INTO SINGLE COMPONENTS IN A CAPILLARY DUCT OF AN EQUIPMENT FOR

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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