EP1339860A2 - Novel targets for herbicides and transgenic plants resistant to said herbicides - Google Patents

Novel targets for herbicides and transgenic plants resistant to said herbicides

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EP1339860A2
EP1339860A2 EP01999658A EP01999658A EP1339860A2 EP 1339860 A2 EP1339860 A2 EP 1339860A2 EP 01999658 A EP01999658 A EP 01999658A EP 01999658 A EP01999658 A EP 01999658A EP 1339860 A2 EP1339860 A2 EP 1339860A2
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polynucleotide
plants
dehydrogenase
prephenate
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EP01999658A
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Michel Matringe
Pascal Rippert
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Bayer CropScience SA
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Publication date
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Definitions

  • Such promoters are known, such as, for example, the promoter of the plant O-methyltransferase class II (COMT II) gene described in patent application FR 99 03700, the PR-1 promoter from Arabidopsis (Lebel et al. , 1998, Plant J. 16 (2): 223-233), the EAS4 promoter of the tobacco sesquiterpene synthase gene (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115 (2), 437-451), or the promoter of the gene coding for 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al, 1994, Plant Mol. Biol. 25 (3): 401-412).
  • COMP O-methyltransferase class II
  • compound is meant according to the invention any chemical compound or mixture of chemical compounds, including peptides and proteins.
  • mixture of compounds is understood according to the invention at least two different compounds, such as for example the (dia) stereoisomers of a molecule, mixtures of natural origin resulting from the extraction of biological material (plants, plant tissues, culture bacteria, yeast or fungal cultures, insects, animal tissue, etc.) or unpurified reaction mixtures or totally or partially purified, or mixtures of products from combinatorial chemistry techniques.
  • the herbicidal agrochemical compositions according to the invention comprise a herbicidal compound according to the invention or one of its acceptable salts in agriculture or a complex metallic or metalloid of this compound, in combination with a solid or liquid support, acceptable in agriculture and / or a surfactant also acceptable in agriculture.
  • a solid or liquid support acceptable in agriculture and / or a surfactant also acceptable in agriculture.
  • the usual inert supports and the usual surfactants can be used.
  • These compositions cover not only the compositions ready to be applied to a plant or a seed to be treated by means of a suitable device, such as a spraying or dusting device, but also the concentrated commercial compositions which must be diluted before application. on culture.
  • the complete coding sequence was reconstituted by assembling the missing 5 'end of the first exon with a partial TyrA-AT cDNA (1.5 kb), obtained by PCR amplification of the Arabidopsis cDNA with the oligonucleotide P8 (5 '-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') starting at position 513 bp from the first ATG codon and the 3 'oligonucleotide P7.
  • An EcoRV restriction site located at position 812 bp from the first ATG codon and present in the 5 ′ end of the partial cDNA of TyrA-AT was used for the reconstruction.

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Abstract

The invention concerns novel enzymes having an arogenate dehydrogenase activity, in particular arogenate dehydrogenase enzymes of plants, and the genes encoding said enzymes. The inventive arogenate dehydrogenase enzymes catalyze the last stage of the metabolic pathway of tyrosine biosynthesis, and constitute, as such, potential targets of herbicides. Hence the invention also concerns a method for identifying herbicide compounds targeting said enzymes, said herbicide compounds preventing tyrosine biosynthesis by being fixed on said enzymes. The invention further concerns transgenic plants tolerant to herbicide compounds targeting an enzyme involved in the tyrosine biosynthesis pathway, in particular an enzyme involved in the transformation of L-tyrosine prephenate, in particular an arogenate dehydrogenase enzyme. Said plants become tolerant by expression in their tissues of a prephenate dehydrogenase enzyme, said enzyme being insensitive to said herbicide compounds and enabling the plant to synthetize tyrosine despite being treated with said herbicide compounds.

Description

Nouvelles cibles pour herbicides et plantes transgéniques résistantes à ces herbicides New targets for herbicides and transgenic plants resistant to these herbicides
La présente invention a pour objet de nouvelles enzymes possédant une activité arogenate dehydrogenase, en particulier des enzymes arogenate dehydrogenase de plantes, ainsi que les gènes codant ces enzymes. Les enzymes arogenate dehydrogenase selon l'invention catalysent la dernière étape de la voie métabolique de biosynthèse de la tyrosine, et constituent, à ce titre, des cibles potentielles d'herbicides. La présente invention concerne donc également un procédé d'identification de composés herbicides ayant pour cible ces enzymes, lesdits composés herbicides empêchant la biosynthèse de tyrosine en se fixant sur lesdites enzymes. L'invention a également pour objet des plantes transgénique tolérantes à des composés herbicides ayant pour cible une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la tyrosine, en particulier une enzyme impliquée dans la transformation du prephenate en L-tyrosine, en particulier une enzyme arogenate dehydrogenase. Ces plantes deviennent tolérantes par expression dans leurs tissus d'une enzyme prephenate dehydrogenase, cette enzyme étant insensible aux dits composés herbicides et permettant à la plante de synthétiser la tyrosine malgré un traitement par lesdits composés herbicides.The present invention relates to new enzymes having arogenate dehydrogenase activity, in particular plant arogenate dehydrogenase enzymes, as well as the genes encoding these enzymes. The arogenate dehydrogenase enzymes according to the invention catalyze the last step of the metabolic pathway of tyrosine biosynthesis, and therefore constitute potential targets for herbicides. The present invention therefore also relates to a method of identifying herbicidal compounds targeting these enzymes, said herbicidal compounds preventing the biosynthesis of tyrosine by binding to said enzymes. The subject of the invention is also transgenic plants tolerant to herbicidal compounds targeting an enzyme involved in the biosynthetic pathway of tyrosine, in particular an enzyme involved in the transformation of prephenate into L-tyrosine, in particular an arogenate enzyme. dehydrogenase. These plants become tolerant by expression in their tissues of a prephenate dehydrogenase enzyme, this enzyme being insensitive to said herbicidal compounds and allowing the plant to synthesize tyrosine despite treatment with said herbicidal compounds.
La voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques constitue une voie métabolique vitale pour les plantes, les bactéries et les champignons. En plus de la biosynthèse de la tyrosine, de la phénylalanine et du tryptophane, cette voie métabolique joue un rôle essentiel dans la production de nombreux métabolites aromatiques secondaires impliqués dans des processus tels que les interactions plantes-microbes, la biosynthèse de biopolymères structuraux comme la lignine et la subérine, la synthèse hormonale, ou la synthèse des quinones. Parmi l'ensemble des organismes vivants possédant cette voie métabolique, deux voies ont été identifiées pour la transformation du prephenate en tyrosine (Figure 1; Stenmark et al., 1974). Chez la plupart des bactéries chlorophylliennes, quelques microorganismes, et chez la plupart des plantes, la L-tyrosine est synthétisée par la voie de l'arogénate (Abou-Zeid et al, 1995; Byng et al., 1981; Connely and Conn 1986; Frazel and Jensen 1979; Gaines et al., 1982; Hall et al, 1982; Keller et al, 1985; Mayer et al, 1985). Dans cette voie, le prephenate est transaminé en arogenate par une transaminase spécifique, la prephenate aminotransférase (EC 2.6.1.57), puis l'arogénate est transformé en L-tyrosine par une arogenate dehydrogenase (EC 1.3.1.43; ADH sur la Figure 1). D'une manière différente, chez des organismes comme la bactérie Escherichia coli ou les levures, le prephenate est dans un premier temps transformé en p-hydroxyphenylpyruvate par une prephenate dehydrogenase (EC 1.3.1.12, EC 1.3.1.13), lequel p-hydroxyphenylpyruvate est transaminé en L-tyrosine (Lingens et al., 1967). De par son rôle dans la voie de biosynthèse de la tyrosine chez les plantes, l'enzyme arogenate dehydrogenase constitue une cible potentielle pour de nouveaux herbicides.The biosynthetic pathway for aromatic amino acids is a vital metabolic pathway for plants, bacteria and fungi. In addition to the biosynthesis of tyrosine, phenylalanine and tryptophan, this metabolic pathway plays an essential role in the production of many secondary aromatic metabolites involved in processes such as plant-microbe interactions, the biosynthesis of structural biopolymers such as lignin and suberin, hormone synthesis, or the synthesis of quinones. Among all living organisms with this metabolic pathway, two pathways have been identified for the transformation of prephenate into tyrosine (Figure 1; Stenmark et al., 1974). In most chlorophyll bacteria, a few microorganisms, and in most plants, L-tyrosine is synthesized by the arogenate pathway (Abou-Zeid et al, 1995; Byng et al., 1981; Connely and Conn 1986 ; Frazel and Jensen 1979; Gaines et al., 1982; Hall et al, 1982; Keller et al, 1985; Mayer et al, 1985). In this way, the prephenate is transformed into arogenate by a specific transaminase, the prephenate aminotransferase (EC 2.6.1.57), then the arogenate is transformed into L-tyrosine by an arogenate dehydrogenase (EC 1.3.1.43; ADH in Figure 1 ). In a different way, in organisms like the Escherichia coli bacteria or yeasts, prephenate is first transformed into p-hydroxyphenylpyruvate by a prephenate dehydrogenase (EC 1.3.1.12, EC 1.3.1.13), which p-hydroxyphenylpyruvate is transformed into L-tyrosine (Lingens et al., 1967). Due to its role in the biosynthetic pathway of tyrosine in plants, the enzyme arogenate dehydrogenase constitutes a potential target for new herbicides.
D'autres enzymes impliquées dans cette voie métabolique constituent déjà des cibles d'herbicides majeurs. On peut citer par exemple l'enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS), intervenant en amont de la synthèse du prephenate, qui est la cible de l'herbicide total glyphosate. On peut également citer l'enzyme p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) impliquée dans la transformation du p-hydroxyphenylpyruvate en homogentisate. L'HPPD est la cible de nouvelles familles d'herbicides dont l'activité conduit au blanchiment des feuilles (Schulz et al., 1993; Secor 1994). Ces herbicides sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-Sθ2 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3- dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-l-(2-Sθ2 CH_3-4-2,3 CI2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou encore les pyrazolinates.Other enzymes involved in this metabolic pathway are already targets for major herbicides. We can quote for example the enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS), intervening upstream of the synthesis of prephenate, which is the target of the total herbicide glyphosate. Mention may also be made of the enzyme p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) involved in the transformation of p-hydroxyphenylpyruvate into homogentisate. HPPD is the target of new families of herbicides whose activity leads to bleaching of the leaves (Schulz et al., 1993; Secor 1994). These herbicides are in particular isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) in particular isoxaflutole, a selective corn herbicide, diketonitriles ( EP 496 630, EP 496 631), in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-Sθ2 CH3-4-CF3 phenyl) propane-1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl- l- (2-Sθ2 CH_3-4-2,3 CI2 phenyl) propane-1, 3-dione, triketones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), in particular sulcotrione or mesotrione, or pyrazolinates.
Un des avantages des herbicides ayant pour cible des enzymes impliquées .dans les voies métaboliques vitales des plantes est leur large spectre d'activité sur des plantes d'origines phylogénétiques éloignées. Toutefois, de tels herbicides présentent également l'inconvénient majeur, lorsqu'ils sont appliqués sur des cultures pour éliminer les végétaux indésirables ou "mauvaises herbes", d'agir également sur les plantes cultivées. Cet inconvénient peut être pallié par l'utilisation de plantes cultivées tolérantes aux dits herbicides. De telles plantes sont généralement obtenues par génie génétique en introduisant dans leur génome un gène codant une enzyme de résistance audit herbicide de manière à ce qu'elles surexpriment ladite enzyme dans leurs tissus. Jusqu'à présent trois principales stratégies utilisant le génie génétique ont été employée pour rendre des plantes tolérantes aux herbicides. La première consiste à détoxifier l'herbicide par transformation de la plante avec un gène codant une enzyme de détoxification. Cette enzyme transforme l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxique, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899). La seconde stratégie consiste à transformer la plante avec un gène codant l'enzyme cible mutée de manière à ce qu'elle soit moins sensible à l'herbicide, ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S. R. & al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991). La troisième stratégie consiste à surexprimer l'enzyme cible sensible, de manière à produire dans la plante des quantités importantes d'enzyme cible, si possible bien supérieures à la quantité d'herbicide pénétrant la plante. Cette stratégie, qui a été employée pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), permet de maintenir un niveau suffisant d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.One of the advantages of herbicides targeting enzymes involved in the vital metabolic pathways of plants is their broad spectrum of activity on plants of distant phylogenetic origins. However, such herbicides also have the major drawback, when applied to crops to eliminate unwanted plants or "weeds", to act also on cultivated plants. This drawback can be overcome by the use of cultivated plants tolerant to said herbicides. Such plants are generally obtained by genetic engineering by introducing into their genome a gene encoding an enzyme for resistance to said herbicide so that they overexpress said enzyme in their tissues. So far, three main strategies using genetic engineering have been used to make plants tolerant to herbicides. The first is to detoxify the herbicide by transforming the plant with a gene encoding a detoxifying enzyme. This enzyme transforms the herbicide, or its active metabolite, into non-degrading products. toxic, such as the enzymes for tolerance to bromoxynil or basta (EP 242 236, EP 337 899). The second strategy consists in transforming the plant with a gene coding for the mutated target enzyme so that it is less sensitive to the herbicide, or its active metabolite, such as, for example, the glyphosate tolerance enzymes (EP 293 356 , Padgette SR & al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991). The third strategy consists in overexpressing the sensitive target enzyme, so as to produce in the plant large quantities of target enzyme, if possible much greater than the quantity of herbicide penetrating the plant. This strategy, which has been used to successfully obtain plants tolerant to HPPD inhibitors (WO 96/38567), makes it possible to maintain a sufficient level of functional enzyme, despite the presence of its inhibitor.
Le fait que deux voies de biosynthèse de la L-tyrosine existent dans des groupes taxonomiques différents, et en particulier que la voie transformant directement le prephenate en p-hydroxyphenylpyruvate ne se retrouve pas chez les plantes permet d'envisager une quatrième stratégie pour rendre des plantes tolérantes aux herbicides. En effet, dans le cas de l'utilisation d'un composé herbicide ayant pour cible l'enzyme arogenate dehydrogenase chez les plantes, la transformation des plantes que l'on souhaite rendre tolérantes avec un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase de bactérie ou de levure permettra aux dites plantes de synthétiser de la L-tyrosine, donc de tolérer la présence du composé herbicide, malgré l'inhibition de l'enzyme arogenate dehydrogenase par ledit composé herbicide. Cette nouvelle stratégie consiste donc à créer chez les plantes que l'on souhaite rendre résistantes un contournement de la voie métabolique naturelle de biosynthèse de la tyrosine, laquelle voie utilise l'enzyme arogenate dehydrogenase, par implantation artificielle chez ces plantes d'une nouvelle voie métabolique de biosynthèse de la tyrosine utilisant l'enzyme prephenate dehydrogenase. Un tel contournement permet aux plantes le possédant, de préférence les plantes d'intérêt agronomique, de tolérer la présence du composé herbicide inhibant la voie métabolique naturelle, alors que les plantes ne possédant pas ce contournement, en particulier les végétaux indésirables, seront sensibles audit composé herbicide. DescriptionThe fact that two pathways for biosynthesis of L-tyrosine exist in different taxonomic groups, and in particular that the pathway directly transforming prephenate into p-hydroxyphenylpyruvate is not found in plants makes it possible to envisage a fourth strategy for rendering herbicide tolerant plants. Indeed, in the case of the use of a herbicidal compound having for target the enzyme arogenate dehydrogenase in plants, the transformation of plants which one wishes to make tolerant with a gene coding a prephenate dehydrogenase enzyme of bacteria or of yeast will allow said plants to synthesize L-tyrosine, therefore to tolerate the presence of the herbicidal compound, despite the inhibition of the arogenate dehydrogenase enzyme by said herbicidal compound. This new strategy therefore consists in creating in plants which one wishes to make resistant a bypass of the natural metabolic pathway of biosynthesis of tyrosine, which pathway uses the enzyme arogenate dehydrogenase, by artificial implantation in these plants of a new pathway. metabolic biosynthesis of tyrosine using the enzyme prephenate dehydrogenase. Such bypass allows plants having it, preferably plants of agronomic interest, to tolerate the presence of the herbicidal compound inhibiting the natural metabolic pathway, while plants not having this bypass, in particular undesirable plants, will be sensitive to said herbicide compound. Description
La présente invention concerne donc de nouveaux polynucléotides isolés codant pour une enzymese possédant une activité arogenate dehydrogenase. Selon la présente invention, on entend par "polynucléotide" une séquence nucléotidique naturelle ou artificielle pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin. Par enzymes possédant une activité arogenate dehydrogenase, on entend les enzymes capables de transformer l'arogénate en L-tyrosine. La mesure de l'activité arogenate dehydrogenase est réalisée par toute méthode permettant soit de mesurer la diminution de la quantité du substrat arogenate, soit de mesurer l'accumulation d'un produit issu de la réaction enzymatique, à savoir la L-tyrosine ou le cofacteur NADPH. En particulier, la mesure de l'activité arogenate dehydrogenase peut être réalisée par la méthode décrite à l'exemple 4.The present invention therefore relates to novel isolated polynucleotides encoding an enzyme having arogenate dehydrogenase activity. According to the present invention, the term "polynucleotide" means a natural or artificial nucleotide sequence which may be of DNA or RNA type, preferably of DNA type, in particular double strand. By enzymes having arogenate dehydrogenase activity is meant the enzymes capable of transforming the arogenate into L-tyrosine. The measurement of the arogenate dehydrogenase activity is carried out by any method making it possible either to measure the reduction in the amount of the arogenate substrate, or to measure the accumulation of a product resulting from the enzymatic reaction, namely L-tyrosine or NADPH cofactor. In particular, the measurement of the arogenate dehydrogenase activity can be carried out by the method described in Example 4.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides codant pour une enzyme arogenate dehydrogenase comprennent des polynucléotides codant pour la séquence polypeptidique sélectionnée parmi la séquence décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:l 1 ou SEQ ID NO: 13. Il est bien connu de l'homme du métier que cette définition inclus tous les polynucléotides qui, bien que comprenant des séquences nucléotidiques différentes comme résultat de la dégénérescence du code génétique, codent pour une même séquence d'acides aminés, laquelle est représentée par les identificateurs de séquences SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:ll ou SEQ ID NO:13.According to a particular embodiment of the invention, the polynucleotides coding for an arogenate dehydrogenase enzyme comprise polynucleotides coding for the polypeptide sequence selected from the sequence described by the sequence identifier SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. It is well known to those skilled in the art that this definition includes all polynucleotides which, although comprising nucleotide sequences as a result of the degeneracy of the genetic code, code for the same amino acid sequence, which is represented by the sequence identifiers SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: ll or SEQ ID NO: 13.
La présente invention comprend également des polynucléotides isolés codant pour des enzymes arogenate dehydrogenase et capables de s'hybrider de manière sélective à un des polynucléotides précédemment décrits, ou un fragment de ces polynucléotides constituant une sonde. Par "polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective", on entend selon l'invention les polynucléotides qui, par une des méthodes usuelles de l'état de la technique (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), s'hybrident avec les polynucléotides ci-dessus, ou avec les sondes qui en sont dérivées, à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres polynucléotides présents, par exemple d'autres ADNc présents dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre le polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective et les polynucléotides définis par les séquences SEQ ID NO: ci-dessus selon l'invention, ou les sondes, est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui généré par l'interaction avec d'autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple, par marquage des polynucléotides décrits ci-dessus ou des sondes avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C- 60°C).The present invention also comprises isolated polynucleotides encoding arogenate dehydrogenase enzymes and capable of hybridizing selectively to one of the polynucleotides previously described, or a fragment of these polynucleotides constituting a probe. By "polynucleotide capable of hybridizing selectively" is meant according to the invention the polynucleotides which, by one of the usual methods of the prior art (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), hybridize with the above polynucleotides, or with the probes derived from them, at a level significantly above background. The background noise can be linked to the hybridization of other polynucleotides present, for example other cDNAs present in a cDNA library. The level of the signal generated by the interaction between the polynucleotide capable of selective hybridization and the polynucleotides defined by the sequences SEQ ID NO: above according to the invention, or the probes, is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that generated by the interaction with other DNA sequences generating background noise. The level of interaction can be measured, for example, by labeling the polynucleotides described above or probes with radioactive elements, such as 32 P. Selective hybridization is generally obtained by using very harsh environmental conditions (for example 0.03 M NaCl and 0.03 M sodium citrate at about 50 ° C- 60 ° C).
L'invention comprend également des polynucléotides isolés codant pour des enzymes arogenate dehydrogenase et homologues des polynucléotides précédemment décrits. Par "homologue", on entend selon l'invention des polynucléotides présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport aux séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et codant pour une enzyme à activité arogenate dehydrogenase fonctionnelle. Ces modifications peuvent être naturelle ou obtenues artificiellement selon les techniques usuelles de mutation conduisant notamment à l'addition, la délétion, ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par rapport aux séquences de l'invention. Ces modifications déterminent un degré d'homologie vis-à-vis des séquences ci-dessus décrites. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport aux séquences décrites, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10; voir aussi http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).The invention also includes isolated polynucleotides encoding arogenate dehydrogenase enzymes and homologs of the polynucleotides previously described. By "homologous" is meant according to the invention polynucleotides having one or more sequence modifications compared to the nucleotide sequences described above and coding for an enzyme with functional arogenate dehydrogenase activity. These modifications may be natural or obtained artificially according to the usual mutation techniques leading in particular to the addition, deletion, or substitution of one or more nucleotides with respect to the sequences of the invention. These modifications determine a degree of homology with respect to the sequences described above. Advantageously, the degree of homology will be at least 70% relative to the sequences described, preferably at least 80%, more preferably at least 90%. The methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art. One can use for example the PILEUP or BLAST programs (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10; see also http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
La présente invention concerne également des fragments des polynucléotides décrits ci- dessus. Le terme "fragment" désigne notamment un fragment d'au moins 20 nucléotides, en particulier d'au moins 50 nucléotides, et de préférence d'au moins 100 nucléotides. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polynucléotide selon l'invention est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.The present invention also relates to fragments of the polynucleotides described above. The term "fragment" denotes in particular a fragment of at least 20 nucleotides, in particular of at least 50 nucleotides, and preferably of at least 100 nucleotides. According to a particular embodiment of the invention, the polynucleotide according to the invention is represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
La présente invention concerne également des polynucléotides comprenant au moins un des polynucléotides tels que décrits précédemment.The present invention also relates to polynucleotides comprising at least one of the polynucleotides as described above.
Tous les polynucléotides décrits ci-dessus codent des enzymes arogenate dehydrogenase. En conséquence, l'invention s'étend donc à toutes les enzymes arogenate dehydrogenase codées par l'ensemble de ces polynucléotides.All of the polynucleotides described above encode arogenate dehydrogenase enzymes. Consequently, the invention therefore extends to all the arogenate dehydrogenase enzymes encoded by all of these polynucleotides.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'enzyme arogenate dehydrogenase est une enzyme dont la séquence peptidique est sélectionnée parmi la séquence décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13, ou un fragment de ces séquences. Par fragment, on entend essentiellement un fragment biologiquement actif, c'est-à-dire un fragment de la séquence d'une enzyme arogenate dehydrogenase possédant la même activité qu'une enzyme arogenate dehydrogenase complète.According to a particular embodiment of the invention, the enzyme arogenate dehydrogenase is an enzyme whose peptide sequence is selected from the sequence described by the sequence identifier SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a fragment of these sequences. By fragment is meant essentially a biologically active fragment, that is to say a fragment of the sequence of an arogenate dehydrogenase enzyme having the same activity as a complete arogenate dehydrogenase enzyme.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides et les enzymes arogenate dehydrogenase décrits ci-dessus proviennent de plantes. Plus particulièrement, ils proviennent de plantes du genre Arabidopsis, de préférence du genre A. thaliana, ou de plantes du genre Picea, de préférence Picea glauca.According to a particular embodiment of the invention, the polynucleotides and the arogenate dehydrogenase enzymes described above come from plants. More particularly, they come from plants of the genus Arabidopsis, preferably of the genus A. thaliana, or from plants of the genus Picea, preferably Picea glauca.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides et les enzymes arogenate dehydrogenase décrits ci-dessus proviennent de bactéries. Plus particulièrement, ils proviennent de bactéries du genre Synechocystis.According to another particular embodiment of the invention, the polynucleotides and the arogenate dehydrogenase enzymes described above come from bacteria. More particularly, they come from bacteria of the genus Synechocystis.
La présente invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour une enzyme arogenate dehydrogenase tel que défini dans la présente invention, et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont, d'une part, des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou un peptide de transit, ou un élément terminateur constituant un signal de polyadénylation, et d'autre part un polynucléotide codant pour une protéine. L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de l'espèce hôte dans laquelle ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans un organisme hôte donné. Par "fonctionnels", on entend capables de fonctionner dans un organisme hôte donné.The present invention also relates to a chimeric gene comprising at least, operably linked, a promoter functional in a host organism, a polynucleotide encoding an arogenate dehydrogenase enzyme as defined in the present invention, and a functional terminator in this same host organism. The different elements that a chimeric gene can contain are, on the one hand, regulatory elements for the transcription, translation and maturation of proteins, such as a promoter, a sequence coding for a signal peptide or a peptide transit, or a terminator constituting a polyadenylation signal, and on the other hand a polynucleotide coding for a protein. The expression "operably linked to one another" means that said elements of the chimeric gene are linked to each other so that the functioning of one of these elements is affected by that of another. By way of example, a promoter is operably linked to a coding sequence when it is able to affect the expression of said coding sequence. The construction of the chimeric gene according to the invention and the assembly of its different elements is achievable by the use of techniques well known to those skilled in the art, in particular those described in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). The choice of regulatory elements constituting the chimeric gene is essentially a function of the host species in which they must function, and those skilled in the art are capable of selecting functional regulatory elements in a given host organism. By "functional" is meant capable of functioning in a given host organism.
Les promoteurs que peut contenir le gène chimère selon l'invention sont soit constitutifs, soit inductibles. Un promoteur constitutif selon la présente invention est un promoteur qui induit l'expression d'une séquence codante dans tous les tissus d'un organisme hôte et en permanence, c'est-à-dire durant toute la durée du cycle vital dudit organisme hôte. Certains de ces promoteurs peuvent être tissu-spécifiques, c'est-à-dire exprimer la séquence codante en permanence, mais uniquement dans un tissu particulier de l'organisme hôte. Des promoteurs constitutifs peuvent provenir de tout type d'organisme. Parmi les promoteurs constitutifs qui peuvent être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple, des promoteurs bactériens, comme celui du gène de l'octopine synthase ou celui du gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme celui du gène contrôlant la transcription des ARN19S ou 35S du virus de la mosaïque du Choux-Fleur (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810- 812), ou les promoteurs du virus de la mosaïque de la nervure du Manioc (tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/48819). Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO), le promoteur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'un gène d'açtine de riz (US 5,641,876).The promoters which the chimeric gene according to the invention may contain are either constitutive or inducible. A constitutive promoter according to the present invention is a promoter which induces the expression of a coding sequence in all the tissues of a host organism and permanently, that is to say throughout the duration of the life cycle of said host organism . Some of these promoters can be tissue-specific, that is to say express the coding sequence permanently, but only in a particular tissue of the host organism. Constituent promoters can come from any type of organism. Among the constitutive promoters which can be used in the chimeric gene of the present invention, we can cite by way of example, bacterial promoters, such as that of the octopine synthase gene or that of the nopaline synthase gene, promoters viral, such as that of the gene controlling the transcription of RNA19S or 35S of the cauliflower mosaic virus (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), or the promoters of the rib mosaic virus Cassava (as described in patent application WO 97/48819). Among the promoters of plant origin, mention will be made of the promoter of the gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase subunit (RuBisCO), the promoter of a histone gene as described in application EP 0 507 698, or the promoter of a rice actin gene (US 5,641,876).
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur inductible. Un promoteur inductible est un promoteur qui ne fonctionne, c'est-à-dire qui n'induit l'expression d'une séquence codante, que lorsqu'il est lui-même induit par un agent inducteur. Cet agent inducteur est en général une substance qui peut être synthétisée dans l'organisme hôte suite à un stimulus externe audit organisme, ce stimulus externe pouvant être par exemple un agent pathogène. L'agent inducteur peut également être une substance externe à cet organisme hôte capable de pénétrer à l'intérieur de celui-ci. De manière avantageuse, le promoteur utilisé dans la présente invention est inductible suite à l'agression de l'organisme hôte par un agent pathogène. De tels promoteurs sont connus, comme par exemple le promoteur du gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante décrit dans la demande de brevet FR 99 03700, le promoteur PR-1 d'Arabidopsis (Lebel et al., 1998, Plant J. 16(2):223-233), le promoteur EAS4 du gène de la sesquiterpène synthase du Tabac (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115(2), 437-451), ou le promoteur du gène codant la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al, 1994, Plant Mol. Biol. 25(3):401-412).According to another particular embodiment of the invention, the chimeric gene contains an inducible promoter. An inducible promoter is a promoter which functions, that is to say which induces the expression of a coding sequence, only when it is itself induced by an inducing agent. This inducing agent is generally a substance which can be synthesized in the host organism following a stimulus external to said organism, this external stimulus possibly being for example a pathogenic agent. The inducing agent can also be a substance external to this host organism capable of penetrating inside of it. Advantageously, the promoter used in the present invention is inducible following the aggression of the host organism by a pathogenic agent. Such promoters are known, such as, for example, the promoter of the plant O-methyltransferase class II (COMT II) gene described in patent application FR 99 03700, the PR-1 promoter from Arabidopsis (Lebel et al. , 1998, Plant J. 16 (2): 223-233), the EAS4 promoter of the tobacco sesquiterpene synthase gene (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115 (2), 437-451), or the promoter of the gene coding for 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al, 1994, Plant Mol. Biol. 25 (3): 401-412).
Parmi les éléments terminateurs pouvant être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple l'élément terminateur nos du gène codant la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11(2),Among the terminating elements which can be used in the chimeric gene of the present invention, we can cite by way of example the terminating element nos of the gene coding for nopaline synthase from Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res 11 (2),
369-385), ou l'élément terminateur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633369-385), or the terminator of a histone gene as described in application EP 0 633
317.317.
Il apparaît également important que le gène chimère comprenne aussi un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de l'enzyme arogenate dehydrogenase de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, comme par exemple le cytoplasme, un compartiment particulier du cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires, par exemple les chloroplastes, ou dans la matrice extracellulaire. Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles. Les peptides de transit doubles sont éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire qu'ils comprennent, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. De tels peptides de transit doubles sont par exemple décrits dans la demande de brevet EP 0 508 909.It also appears important that the chimeric gene also comprises a signal peptide or a transit peptide which makes it possible to control and direct the production of the enzyme arogenate dehydrogenase in a specific way in a part of the host organism, such as for example the cytoplasm, a particular compartment of the cytoplasm, the cell membrane, or in the case of plants in a particular type of cell compartment, for example chloroplasts, or in the extracellular matrix. Transit peptides can be either single or double. The double transit peptides are optionally separated by an intermediate sequence, that is to say that they comprise, in the direction of transcription, a sequence coding for a transit peptide of a plant gene coding for a plastid localizing enzyme. , a part of the sequence of the mature N-terminal part of a plant gene coding for an enzyme with plastid location, then a sequence coding for a second transit peptide of a plant gene coding for an enzyme with plastid location. Such double transit peptides are for example described in patent application EP 0 508 909.
Comme peptide signal utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-lα du tabac décrit par Cornelissen et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15, 6799-6811) en particulier lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des cellules végétales ou des plantes, ou le peptide signal du précurseur du facteur Mat αl (Brake et al., 1985, In: Gething M.-J. (eds.); Protein transport and sécrétion, pp.103-108, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des levures.As signal peptide useful according to the invention, there may be mentioned in particular the signal peptide of the PR-lα gene from tobacco described by Cornelissen et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15, 6799-6811) in particular when the chimeric gene according to the invention is introduced into plant cells or plants, or the signal peptide of the precursor of the factor factor αl (Brake et al., 1985 , In: Gething M.-J. (eds.); Protein transport and secretion, pp.103-108, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) when the chimeric gene according to the invention is introduced into yeasts.
La présente invention concerne également un vecteur contenant un gène chimère selon l'invention. Le vecteur selon l'invention est utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans celui-ci une enzyme arogenate dehydrogenase. Ce vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer une enzyme arogenate dehydrogenase. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci du gène chimère selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière avantageuse, le vecteur utilisé dans la présente invention contient également, en plus du gène chimère de l'invention, un gène codant pour un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte à transformer est un microorganisme, en particulier une levure, une bactérie, un champignon, ou un virus. Selon un autre mode de réalisation, l'organisme hôte est une plante ou une cellule végétale. Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection utilisables, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que, par exemple, le gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gène 25:179-188), mais également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, et WO 97/04103.The present invention also relates to a vector containing a chimeric gene according to the invention. The vector according to the invention is useful for transforming a host organism and expressing therein an arogenate dehydrogenase enzyme. This vector can be a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus. In general, the main qualities of this vector must be an ability to maintain and self-replicate in the cells of the host organism, in particular thanks to the presence of an origin of replication, and to express an arogenate enzyme there. dehydrogenase. The choice of such a vector as well as the techniques for inserting into it the chimeric gene according to the invention are widely described in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) and are part of the general knowledge of a person skilled in the art. Advantageously, the vector used in the present invention also contains, in addition to the chimeric gene of the invention, a gene coding for a selection marker. This selection marker makes it possible to select the host organisms actually transformed, that is to say those which have incorporated the vector. According to a particular embodiment of the invention, the host organism to be transformed is a microorganism, in particular a yeast, a bacterium, a fungus, or a virus. According to another embodiment, the host organism is a plant or a plant cell. Among the genes coding for usable selection markers, mention may be made of antibiotic resistance genes such as, for example, the hygromycin phosphotransferase gene (Gritz et al., 1983, Gene 25: 179-188), but also herbicide tolerance genes such as the bar gene (White et al., NAR 18: 1062, 1990) for bialaphos tolerance, the EPSPS gene (US 5,188,642) for glyphosate tolerance or the HPPD gene (WO 96/38567) for tolerance to isoxazoles. Mention may also be made of genes coding for easily identifiable enzymes such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells. Such selection marker genes are described in particular in patent applications WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, and WO 97/04103.
La présente invention concerne également des organismes hôte transformés, contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'enzyme arogenate dehydrogenase. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple Escherichia coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, ou Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de préférence de cellules végétales et de plantes.The present invention also relates to transformed host organisms, containing a vector as described above. By host organism is meant any mono or multicellular organism, lower or higher, into which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the production of arogenate dehydrogenase enzyme. These are in particular bacteria, for example Escherichia coli, yeasts, in particular of the genera Saccharomyces, Kluyveromyces, or Pichia, fungi, in particular Aspergillus, a baculovirus, or preferably plant cells and plants.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.By "plant cell" is meant according to the invention any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones.The term "plant" according to the invention means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocotyledons or dicotyledons.
On entend par "organisme hôte transformé", un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence une enzyme arogenate dehydrogenase dans ses tissus, ou dans un milieu de culture. Pour obtenir les organismes hôtes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues.The term "transformed host organism" means a host organism which has incorporated into its genome the chimeric gene of the invention, and consequently produces an arogenate dehydrogenase enzyme in its tissues, or in a culture medium. To obtain the host organisms according to the invention, those skilled in the art can use one of the many known transformation methods.
Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genêt. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules ou les tissus hôtes par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gène 33(2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de "biolistique" pourra être utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules ou des tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; US Patent No. 4,945,050). De manière préférentielle, la transformation de plantes se fera à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par __4. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al, 1983, Gène 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genêt. 16:357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750).One of these methods consists in placing the cells to be transformed in the presence of polyethylene glycol (PEG) and of the vectors of the invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genêt. 168 (1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochemistry 70 (4), 503-517). Electroporation is another method which consists in subjecting the cells or tissues to be transformed and the vectors of the invention to an electric field (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989 , Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62). Another method is to directly inject the vectors into host cells or tissues by micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). Advantageously, the so-called "biolistic" method can be used. It consists in bombarding cells or tissues with particles on which the vectors of the invention are adsorbed (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696; Klein and al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291; US Patent No. 4,945,050). Preferably, the transformation of plants will be carried out using bacteria of the genus Agrobacterium, preferably by infection of the cells or tissues of said plants with __4. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al, 1983, Gene 23 (3): 315-330) or A. rhizogenes (Bevan and Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16 : 357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4 (1), 24-28). Preferably, the transformation of plant cells by Agrobacterium tumefaciens is carried out according to the protocol described by Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), 745-750).
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte à transformer.Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the nature of the host organism to be transformed.
La présente invention concerne donc également un procédé de préparation de l'enzyme arogenate dehydrogenase, comprenant les étapes de culture d'un organisme hôte transformé comprenant un gène codant pour une enzyme arogenate dehydrogenase tel que défini ci-dessus dans un milieu de culture approprié, de récupération de l'enzyme arogenate dehydrogenase produite dans le milieu de culture par centrifugation ou par filtration, puis de purification de l'enzyme récupérée par un passage au travers d'au moins une colonne de chromatographie. Ces étapes conduisent à l'extraction et à la purification totale ou partielle de l'enzyme arogenate dehydrogenase obtenue. De manière préférentielle, l'organisme transformé est un microorganisme, en particulier une bactérie, une levure, un champignon, ou un virus.The present invention therefore also relates to a process for the preparation of the arogenate dehydrogenase enzyme, comprising the steps of culturing a transformed host organism comprising a gene coding for an arogenate dehydrogenase enzyme as defined above in an appropriate culture medium, recovering the enzyme arogenate dehydrogenase produced in the culture medium by centrifugation or by filtration, then purifying the recovered enzyme by passing through at least one chromatography column. These steps lead to the extraction and total or partial purification of the arogenate dehydrogenase enzyme obtained. Preferably, the transformed organism is a microorganism, in particular a bacterium, a yeast, a fungus, or a virus.
La présente invention comprend également un procédé d'identification d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase, caractérisé en ce que: (a) on prépare au moins deux échantillons contenant chacun une quantité équivalente d'enzymes arogenate dehydrogenase en solutionThe present invention also comprises a method of identifying a herbicidal compound having for target an arogenate dehydrogenase enzyme, characterized in that: (a) at least two samples are prepared each containing an equivalent amount of arogenate dehydrogenase enzymes in solution
(b) on traite un des échantillons avec un composé(b) one of the samples is treated with a compound
(c) on mesure l'activité arogenate dehydrogenase dans chacun desdits échantillons(c) the arogenate dehydrogenase activity is measured in each of said samples
(d) on identifie le composé utilisé à l'étape (b) comme étant un composé herbicide lorsque l'activité mesurée à l'étape (c) est sigmficativement inférieure dans l'échantillon traité par rapport à l'échantillon non traité(d) the compound used in step (b) is identified as a herbicidal compound when the activity measured in step (c) is significantly lower in the treated sample compared to the untreated sample
(e) on valide l'activité herbicide du composé identifié à l'étape (d) en traitant des plantes avec ledit composé(e) validating the herbicidal activity of the compound identified in step (d) by treating plants with said compound
Selon le présent procédé, la mesure de l'activité arogenate dehydrogenase est réalisée par toute méthode permettant soit de mesurer la diminution de la quantité du substrat arogenate, soit de mesurer l'accumulation d'un produit issu de la réaction enzymatique, à savoir la L-tyrosine ou le cofacteur NADPH. En particulier, la mesure de l'activité arogenate dehydrogenase peut être réalisée par la méthode décrite à l'exemple 4. De plus, l'activité herbicide validée à l'étape (e) du présent procédé peut être une activité mortelle se traduisant par la mort de la plante traitée, ou une activité de ralentissement significatif de la croissance de la plante traitée.According to the present method, the measurement of the arogenate dehydrogenase activity is carried out by any method making it possible either to measure the decrease in the amount of the arogenate substrate, or to measure the accumulation of a product resulting from the enzymatic reaction, namely the L-tyrosine or the cofactor NADPH. In particular, the measurement of the arogenate dehydrogenase activity can be carried out by the method described in Example 4. In addition, the herbicidal activity validated in step (e) of the present process can be a lethal activity resulting in death of the treated plant, or activity significantly slowing the growth of the treated plant.
Par composé, on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines. Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia)stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc.) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire.By compound is meant according to the invention any chemical compound or mixture of chemical compounds, including peptides and proteins. By mixture of compounds is understood according to the invention at least two different compounds, such as for example the (dia) stereoisomers of a molecule, mixtures of natural origin resulting from the extraction of biological material (plants, plant tissues, culture bacteria, yeast or fungal cultures, insects, animal tissue, etc.) or unpurified reaction mixtures or totally or partially purified, or mixtures of products from combinatorial chemistry techniques.
Selon un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, les enzymes arogenate dehydrogenase employées proviennent de plantes, de préférence d'Arabidopsis thaliana.According to a particular embodiment of the method according to the invention, the arogenate dehydrogenase enzymes used come from plants, preferably from Arabidopsis thaliana.
Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, les enzymes arogenate dehydrogenase employées proviennent de bactéries, de préférence de bactéries du genre Synechocystis.According to another embodiment of the method according to the invention, the arogenate dehydrogenase enzymes used come from bacteria, preferably bacteria of the genus Synechocystis.
De préférence, les enzymes arogenate dehydrogenase employées dans le procédé selon l'invention sont les enzymes selon la présente invention, en particulier celles représentées par les SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO:13.Preferably, the arogenate dehydrogenase enzymes used in the process according to the invention are the enzymes according to the present invention, in particular those represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13.
L'invention s'étend également aux composés herbicides identifiés par le procédé ci-dessus mentionné, en particulier les composés herbicides ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase, c'est-à-dire ceux qui inhibent l'activité de cette enzyme. De manière préférentielle, les composés herbicides ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle les composés herbicides selon l'invention ne sont pas des composés déjà connus pour avoir une activité herbicide.The invention also extends to the herbicidal compounds identified by the above-mentioned method, in particular the herbicidal compounds which target an arogenate dehydrogenase enzyme, that is to say those which inhibit the activity of this enzyme. Preferably, the herbicidal compounds are not general inhibitors of enzymes. Also preferably, the herbicidal compounds according to the invention are not compounds already known to have herbicidal activity.
La présente invention concerne également des compositions agrochimiques herbicides comprenant comme matière active au moins une quantité efficace d'un composé herbicide selon l'invention.The present invention also relates to herbicidal agrochemical compositions comprising as active material at least an effective amount of a herbicidal compound according to the invention.
Par composition agrochimique herbicide, on entend selon l'invention une composition applicable de manière préventive ou curative sur les surfaces sur lesquelles des végétaux cultivés sont ou doivent être cultivés, afin d'empêcher le développement de végétaux indésirables ou "mauvaises herbes" sur les surfaces sur lesquelles sont mis en culture lesdits végétaux cultivés, quel que soit leur stade de développement. Une quantité efficace de composé herbicide selon l'invention correspond à une quantité de composé permettant de détruire ou d'inhiber la croissance des végétaux indésirables.The term “herbicide agrochemical composition” is understood to mean, according to the invention, a composition which can be applied preventively or curatively on the surfaces on which cultivated plants are or must be cultivated, in order to prevent the development of undesirable plants or "weeds" on the surfaces. on which said cultivated plants are cultivated, whatever their stage of development. An effective amount of herbicidal compound according to the invention corresponds to an amount of compound making it possible to destroy or inhibit the growth of undesirable plants.
Les compositions agrochimiques herbicides selon l'invention comprennent un composé herbicide selon l'invention ou un de ses sels acceptables en agriculture ou un complexe métallique ou métalloïdique de ce composé, en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture. En particulier sont utilisables les supports inertes usuels et les agents tensioactifs usuels. Ces compositions recouvrent non seulement les compositions prêtes à être appliquées sur une plante ou une semence à traiter au moyen d'un dispositif adapté, tel qu'un dispositif de pulvérisation ou de poudrage, mais également les compositions concentrées commerciales qui doivent être diluées avant application sur la culture.The herbicidal agrochemical compositions according to the invention comprise a herbicidal compound according to the invention or one of its acceptable salts in agriculture or a complex metallic or metalloid of this compound, in combination with a solid or liquid support, acceptable in agriculture and / or a surfactant also acceptable in agriculture. In particular, the usual inert supports and the usual surfactants can be used. These compositions cover not only the compositions ready to be applied to a plant or a seed to be treated by means of a suitable device, such as a spraying or dusting device, but also the concentrated commercial compositions which must be diluted before application. on culture.
Les compositions herbicides selon l'invention peuvent contenir aussi de nombreux autres ingrédients tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des stabilisants, des séquestrants. Plus généralement, les matières actives peuvent être combinées à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation.The herbicidal compositions according to the invention can also contain many other ingredients such as, for example, protective colloids, adhesives, thickeners, thixotropic agents, penetrating agents, stabilizers, sequestering agents. More generally, the active ingredients can be combined with any solid or liquid additive corresponding to the usual techniques of formulation.
Par le terme "support", on désigne selon la présente invention une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est combinée pour faciliter son application sur les parties de la plante. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture. Le support peut être solide (par exemple des argiles, silicates naturels ou synthétiques, silice, résines, cires, engrais solides) ou liquide (par exemple de l'eau, des alcools, notamment le butanol).By the term "support" is meant according to the present invention an organic or mineral, natural or synthetic material, with which the active material is combined to facilitate its application to the parts of the plant. This support is therefore generally inert and it must be acceptable in agriculture. The support can be solid (for example clays, natural or synthetic silicates, silica, resins, waxes, solid fertilizers) or liquid (for example water, alcohols, in particular butanol).
L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique ou un mélange de tels agents tensioactifs. On peut citer par exemple des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylène sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des aminés grasses, des phénols substitués (notamment des alkylphénols ou des arylphénols), des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine (notamment des alkyltaurates), des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés, des esters d'acides gras et de polyols, les dérivés à fonction sulfates, sulfonates et phosphates des composés précédents. La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement indispensable lorsque la matière active et/ou le support inerte ne sont pas solubles dans l'eau et que l'agent vecteur de l'application est l'eau.The surfactant can be an emulsifying, dispersing or wetting agent of ionic or nonionic type or a mixture of such surfactants. Mention may be made, for example, of salts of polyacrylic acids, salts of lignosulfonic acids, salts of phenolsulfonic or naphthalene sulfonic acids, polycondensates of ethylene oxide on fatty alcohols or on fatty acids or on fatty amines , substituted phenols (in particular alkylphenols or arylphenols), ester salts of sulfosuccinic acids, taurine derivatives (in particular alkyltaurates), phosphoric esters of polyoxyethylated alcohols or phenols, esters of acids fatty acids and polyols, the derivatives containing sulfates, sulfonates and phosphates of the preceding compounds. The presence of at least one surfactant is generally essential when the active material and / or the inert support are not soluble in water and the vector agent for the application is water.
La présente invention concerne également des plantes transgéniques tolérantes à un composé herbicide ayant pour cible une enzyme impliquée dans l'une des étapes métaboliques de transformation du prephenate en L-tyrosine, caractérisées en ce qu'elles contiennent un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase et expriment ladite enzyme dans leurs tissus. Une enzyme prephenate dehydrogenase est une enzyme catalysant la réaction de transformation du prephenate en p-hydroxyphénylpyruvate. L'identification d'une enzyme à activité prephenate dehydrogenase peut être réalisée par toute méthode permettant soit de mesurer la diminution de la quantité du substrat prephenate, soit de mesurer l'accumulation d'un produit issu de la réaction enzymatique, à savoir le p-hydroxyphénylpyruvate ou un des cofacteurs NADH ou NADPH. En particulier, la mesure de l'activité prephenate dehydrogenase peut être réalisée par la méthode décrite à l'exemple 4. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transgéniques selon l'invention sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase, de préférence une enzyme arogenate dehydrogenase telle que décrite dans la présente invention.The present invention also relates to transgenic plants tolerant to a herbicidal compound targeting an enzyme involved in one of the metabolic stages of transformation of prephenate into L-tyrosine, characterized in that they contain a gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme and express said enzyme in their tissues. A prephenate dehydrogenase enzyme is an enzyme catalyzing the reaction to transform prephenate into p-hydroxyphenylpyruvate. The identification of an enzyme with prephenate dehydrogenase activity can be carried out by any method making it possible either to measure the reduction in the amount of the prephenate substrate, or to measure the accumulation of a product resulting from the enzymatic reaction, namely p -hydroxyphenylpyruvate or one of the NADH or NADPH cofactors. In particular, the measurement of the prephenate dehydrogenase activity can be carried out by the method described in Example 4. According to a particular embodiment of the invention, the transgenic plants according to the invention are tolerant with regard to a herbicidal compound targeting an arogenate dehydrogenase enzyme, preferably an arogenate dehydrogenase enzyme as described in the present invention.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transgéniques selon l'invention sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme prephenate aminotransférase.According to another particular embodiment of the invention, the transgenic plants according to the invention are tolerant with respect to a herbicidal compound having for target a prephenate aminotransferase enzyme.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène codant l'enzyme prephenate dehydrogenase exprimée dans les plantes tolérantes selon l'invention est un gène de levure. De préférence, il s'agit du gène codant l'enzyme prephenate dehydrogenase de Saccharomyces cerevisiae (No. d'accession NC001134) tel que décrit dans Mannhaupt et al. (1989, Gène 85, 303-311) et représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 14.According to a particular embodiment of the invention, the gene coding for the enzyme prephenate dehydrogenase expressed in the tolerant plants according to the invention is a yeast gene. Preferably, it is the gene encoding the enzyme prephenate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae (Accession No. NC001134) as described in Mannhaupt et al. (1989, Gene 85, 303-311) and represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 14.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène codant l'enzyme prephenate dehydrogenase exprimée dans les plantes tolérantes selon l'invention est un gène de bactérie. De préférence, il s'agit d'un gène de bactérie du genre Bacïllus, en particulier de l'espèce B. subtilis (No. d'accession M80245) tel que représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 16. De préférence, il s'agit d'un gène de bactérie du genre Escherichia, en particulier de l'espèce E. coli (No. d'accession Ml 0431) telle que décrit dans Hudson et al. (1984, J. Mol. Biol. 180(4), 1023-1051) et représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 18. De préférence, il s'agit d'un gène de bactérie du genre Erwinia, en particulier de l'espèce d'E. herbicola (No. d'accession 43343) tel que représenté par l'identificateur de séquence SΕQ ID NO: 20.According to another particular embodiment of the invention, the gene coding for the enzyme prephenate dehydrogenase expressed in the tolerant plants according to the invention is a gene of bacteria. Preferably, it is a bacterium gene of the genus Bacillus, in particular of the species B. subtilis (Accession No. M80245) as represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 16. De preferably, it is a bacterium gene of the genus Escherichia, in particular of the species E. coli (Accession No. Ml 0431) as described in Hudson et al. (1984, J. Mol. Biol. 180 (4), 1023-1051) and represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 18. Preferably, it is a bacterium gene of the genus Erwinia, in particular of the species of E. herbicola (Accession No. 43343) as represented by the sequence identifier SΕQ ID NO: 20.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène codant l'enzyme prephenate dehydrogenase exprimée dans les plantes tolérantes selon l'invention est un gène de champignon.According to a particular embodiment of the invention, the gene coding for the enzyme prephenate dehydrogenase expressed in the tolerant plants according to the invention is a gene for mushroom.
Les plantes transgéniques selon l'invention sont obtenues par transformation génétique avec un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase. De préférence, ce gène est un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour une enzyme prephenate dehydrogenase, et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Ce gène est généralement introduit dans un vecteur, lequel est utilisé pour introduire ledit gène dans lesdites plantes par une des méthodes de transformation décrites ci-dessus.The transgenic plants according to the invention are obtained by genetic transformation with a gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme. Preferably, this gene is a chimeric gene comprising at least, operatively linked to each other, a promoter functional in a host organism, a polynucleotide coding for a prephenate dehydrogenase enzyme, and a functional terminator in this same host organism. This gene is generally introduced into a vector, which is used to introduce said gene into said plants by one of the transformation methods described above.
La présente invention concerne également un procédé de production de plantes tolérantes vis-à-vis de composés herbicides ayant pour cible une enzyme impliquée dans l'une des étapes métaboliques de transformation du prephenate en L-tyrosine, caractérisé en ce que l'on transforme lesdites plantes avec un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase de manière à ce qu'elles l'expriment dans leurs tissus.The present invention also relates to a process for the production of plants tolerant towards herbicidal compounds having as target an enzyme involved in one of the metabolic stages of transformation of prephenate into L-tyrosine, characterized in that one transforms said plants with a gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme so that they express it in their tissues.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le présent procédé s'applique à la production de plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase telle que décrite dans la présente invention.According to a particular embodiment of the invention, the present method is applicable to the production of plants tolerant with respect to a herbicidal compound having for target an arogenate dehydrogenase enzyme as described in the present invention.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le présent procédé s'applique à la production de plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme prephenate aminotransférase.According to another particular embodiment of the invention, the present method applies to the production of plants tolerant with respect to a herbicidal compound having as target a prephenate aminotransferase enzyme.
Le présent procédé comprend donc également un procédé de production de plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase, caractérisé en ce que l'on transforme lesdites plantes avec un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase de manière à ce qu'elles l'expriment dans leurs tissus.The present process therefore also comprises a process for the production of plants tolerant with respect to a herbicidal compound having for target an arogenate dehydrogenase enzyme, characterized in that said plants are transformed with a gene coding for a prephenate dehydrogenase enzyme from so that they express it in their tissues.
Les plantes transgéniques selon l'invention peuvent également contenir, en plus d'un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase, au moins un autre gène contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt. Parmi les polynucléotides codant pour une protéine d'intérêt, on peut citer des polynucléotides codant une enzyme de résistance à un herbicide, par exemple le polynucléotide codant pour l'enzyme bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le polynucléotide codant pour l'enzyme EPSPS (US 5,188,642; WO 97/04103) pour la tolérance au glyphosate ou encore le polynucléotide codant pour l'enzyme HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer un polynucléotide codant pour une toxine insecticide, par exemple un polynucléotide codant pour une toxine de la bactérie Bacïllus thuringiensis (pour exemple, voir International Patent Application WO 98/40490). Peuvent également être contenus dans ces plantes d'autres polynucléotides de résistance aux maladies, par exemple un polynucléotide codant pour l'enzyme oxalate oxydase tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 531 498 ou le brevet US 5,866,778, ou un polynucléotide codant pour un autre peptide antibactérien et/ou antifongique tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et WO99/91089. On peut également citer des polynucléotides codant pour des caractères agronomiques de la plante, en particulier un polynucléotide codant pour une enzyme delta-6 désaturase tel que décrit dans les brevets US 5,552,306, US 5,614,313, et demandes de brevets WO 98/46763 et WO 98/46764, ou un polynucléotide codant pour une enzyme serine acétyltransférase (S AT) tel que décrit dans les demandes de brevets WO 00/01833 et PCT/FR 99/03179. The transgenic plants according to the invention may also contain, in addition to a gene coding for a prephenate dehydrogenase enzyme, at least one other gene containing a polynucleotide coding for a protein of interest. Among the polynucleotides coding for a protein of interest, mention may be made of polynucleotides coding for an enzyme for resistance to a herbicide, for example the polynucleotide coding for the enzyme bar (White et al., NAR 18: 1062, 1990) tolerance to bialaphos, the polynucleotide encoding the enzyme EPSPS (US 5,188,642; WO 97/04103) for tolerance to glyphosate or also the polynucleotide coding for the enzyme HPPD (WO 96/38567) for tolerance to isoxazoles. Mention may also be made of a polynucleotide coding for an insecticidal toxin, for example a polynucleotide coding for a toxin of the bacterium Bacillus thuringiensis (for example, see International Patent Application WO 98/40490). Other disease-resistant polynucleotides may also be contained in these plants, for example a polynucleotide coding for the enzyme oxalate oxidase as described in patent application EP 0 531 498 or US patent 5,866,778, or a polynucleotide coding for another antibacterial and / or antifungal peptide such as those described in patent applications WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, and WO99 / 91089. Mention may also be made of polynucleotides coding for agronomic characteristics of the plant, in particular a polynucleotide coding for a delta-6 desaturase enzyme as described in patents US 5,552,306, US 5,614,313, and patent applications WO 98/46763 and WO 98 / 46764, or a polynucleotide encoding a serine acetyltransferase (S AT) enzyme as described in patent applications WO 00/01833 and PCT / FR 99/03179.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.The examples below illustrate the present invention without, however, limiting its scope.
Exemple 1: Identification du gène codant l'enzyme arogenate dehydrogenase ά'Arabidpsis thalianaExample 1 Identification of the gene coding for the enzyme arogenate dehydrogenase ά'Arabidpsis thaliana
Une comparaison des séquences de toutes les enzymes prephenate dehydrogenase et arogenate dehydrogenase actuellement disponibles dans les bases de données publiques (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) a révélé quatre courtes portions de séquences homologues. Les enzymes comparées sont la prephenate dehydrogenase de levure (numéro d'accession: Z36065), la prephenate dehydrogenase de Bacillus subtilis (numéro d'accession: M80245), et la prephenate dehydrogenase de Synechocystis (numéro d'accession: D90910). Ces portions d'homologie ont permis d'identifier un gène d'A. thaliana (numéro d'accession: AF096371) initialement annoté comme codant une enzyme "similaire à la D-isomer spécifique 2-hydroxyacid dehydrogenase". Ce gène est constitué de deux exons séparés par un intron de 94 bp. Le premier exon comporte un cadre ouvert de lecture de 1.08 kb contenant une séquence putative de peptide de transit chloroplastique située en aval du premier codon ATG. Le second exon code potentiellement pour un cadre ouvert de lecture de 892 bp. Une très forte homologie d'environ 60 % existe entre les séquences protéiques déduites des deux exons. Cette homologie s'étend à 70% si la séquence putative de peptide de transit chloroplastique située dans le premier exon n'est pas prise en compte. De plus, chacune des deux séquences protéiques prédites a la taille et possède les quatre portions homologues caractéristiques des enzymes préphénate/arogénate déhydrogénases. Ce gène a été appelé TyrA (SEQ ID NO:l).A sequence comparison of all prephenate dehydrogenase and arogenate dehydrogenase enzymes currently available in public databases (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) revealed four short portions of homologous sequences. The enzymes compared are yeast prephenate dehydrogenase (accession number: Z36065), prephenate dehydrogenase from Bacillus subtilis (accession number: M80245), and prephenate dehydrogenase from Synechocystis (accession number: D90910). These portions of homology made it possible to identify an A. gene. thaliana (accession number: AF096371) initially annotated as encoding an enzyme "similar to the specific D-isomer 2-hydroxyacid dehydrogenase". This gene consists of two exons separated by a 94 bp intron. The first exon has an open reading frame of 1.08 kb containing a putative chloroplast transit peptide sequence located downstream of the first ATG codon. The second exon potentially codes for an open reading frame of 892 bp. A very strong homology of around 60% exists between the protein sequences deduced from the two exons. This homology extends to 70% if the putative chloroplast transit peptide sequence located in the first exon is not taken into account. In addition, each of the two protein sequences predicted in size and has the four homologous portions characteristic of the prephenate / arogenate dehydrogenase enzymes. This gene was called TyrA (SEQ ID NO: 1).
Exemple 2: Caractérisation transcriptionnelle de TyrA La taille du transcrit du gène TyrA a été déterminée par les techniques de Northern Blot etExample 2 Transcriptional Characterization of TyrA The size of the transcript of the TyrA gene was determined by the techniques of Northern Blot and
PCR. Des ARNm purifiés extraits de jeunes feuilles d!A. thaliana ont été hybridées avec des sondes radiomarquées au 32P correspondant à des fragments d'ADN des deux exons de TyrA. Cette analyse a permis d'identifier un transcrit de 1.8-1.9 kb très proche de la taille présumée d'un ARNm contenant les deux exons. De plus, bien que l'ADNc complet n'aie pas pu être amplifié par PCR, un fragment PCR de 1.5 kb a été obtenu. Ce fragment comprend l'oligonucléotide 5' (P8 = 5'-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') commençant en position 513 bp, et l'oligonucléotide 3' (P7 = 5'-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG- 3') complémentaire du 3'UTR et commençant en position 2053 bp. Ce fragment contient une partie de la première séquence codante {TyrA-ATl) et la séquence complète de la seconde séquence codante {TyrA-AT2). L'analyse de la séquence de cet ADNc a confirmé l'épissage de l'intron. Les résultats des analyses par Northern Blot et PCR suggèrent fortement l'existence d'un transcrit ARNm contenant les deux régions codantes TyrA-ATl (SEQ ID NO:4) et TyrA-AT2 (SEQ ID NO:6).PCR. Purified mRNAs extracted from young leaves of A! thaliana were hybridized with 32 P radiolabeled probes corresponding to DNA fragments from the two exons of TyrA. This analysis made it possible to identify a 1.8-1.9 kb transcript very close to the presumed size of an mRNA containing the two exons. In addition, although the complete cDNA could not be amplified by PCR, a 1.5 kb PCR fragment was obtained. This fragment includes the 5 'oligonucleotide (P8 = 5'-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') starting at position 513 bp, and the 3 'oligonucleotide (P7 = 5'-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG- 3 ') complementary to the 3'UTR and starting at position 2053 bp. This fragment contains part of the first coding sequence (TyrA-AT1) and the complete sequence of the second coding sequence (TyrA-AT2). Analysis of the sequence of this cDNA confirmed the splicing of the intron. The results of the analyzes by Northern Blot and PCR strongly suggest the existence of an mRNA transcript containing the two coding regions TyrA-AT1 (SEQ ID NO: 4) and TyrA-AT2 (SEQ ID NO: 6).
Exemple 3: Préparation de construits contenant les différentes séquences codantes de l'arogénate dehydrogenase dΑ thaliana Le premier exon TyrA-ATl a été obtenu par amplification PCR de l'ADN génomique d'A. thaliana avec l'oligonucléotide PI (5'-TCTCÇATATGATCTTTCAATCTCATTCTCATC-3') qui introduit un site de restriction Nde I (souligné) au niveau du premier codon ATG, et l'oligonucléotide P2 (5'-CTAACTAAÇTAACTACATACCTCATCATATCC-3') qui est complémentaire de l'extrémité 3' du premier exon et de l'extrémité 5' de l'intron et introduit un codon stop (souligné). Trois construits exempts de la séquence codant le peptide de transit ont également été réalisés avec l'oligonucléotide P3 (5 '-CCTCTCTTTCCATATGCTCCCTTCTC-3 •) qui introduit un site de restriction Nde I (souligné) au niveau du second codon ATG (M43) en position 127, l'oligonucléotide P4 (5'-CCGCCAGCCACCTCÇATATGACCGACACCATCC- 3') qui introduit un codon initiateur ATG et un site de restriction Nde I (souligné) en position 174 depuis le premier codon ATG (N58M), et l'oligonucléotide P5 (5'-CGCCACCCCTÇATATGCGTATCGCC-3') qui introduit un codon initiateur ATG et un site de restriction Nde I (souligné) en position 222 depuis le premier codon ATG (L75M). Tous les fragments PCR correspondant au premier exon, codant un peptide de transit ou non, ont été clones dans le plasmide pPCR-Script (Stratagène). Des fragments d'ADN Nde I-BamH I contenant les séquences codantes, avec ou sans la séquence de peptide de transit, ont ensuite été clones dans le plasmide pET21 a(+) (Novagen), conduisant à l'élaboration des plasmides pET21 -TyrA-ATl , avec et sans séquence de peptide de transit ET21-TyrA-ATl- Ml, pEΥ21-TyrA-ATl-M43, vET21-TyrA-ATl-M58, et pET21 -TyrA-ATl -M7 '5). Deux autres oligonucléotides ont été utilisés pour amplifier la deuxième séquence codante {TyrA- AT2). L'oligonucléotide P6 (5'-GATGCATCTTTGÇATATGATGAGGTCAGAAGATG-3') introduit un site de restriction Nde I (souligné) au niveau du codon ATG du second cadre ouvert de lecture (en position 1081 depuis le premier codon ATG), et l'oligonucléotide P7 (5'-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3') complémentaire du début du 3'-UTR qui introduit un site de restriction BamHl (souligné). Le fragment PCR correspondant à la deuxième séquence codante a été digéré par Nde 1-BamH I, puis clone dans le plasmide pET21 a(+), donnant la plasmide pET21 -TyrA-AT2.Example 3 Preparation of Constructs Containing the Different Coding Sequences of the Thaliana Arogenate Dehydrogenase The first TyrA-AT1 exon was obtained by PCR amplification of A. genomic DNA. thaliana with the oligonucleotide PI (5'-TCTCÇATATGATCTTTCAATCTCATTCTCATC-3 ') which introduces an Nde I restriction site (underlined) at the level of the first ATG codon, and the oligonucleotide P2 (5'-CTAACTAAÇTAACTACATACCTCATCATATCC-3') which is complementary from the 3 'end of the first exon and the 5' end of the intron and introduces a stop codon (underlined). Three constructs free from the sequence encoding the transit peptide were also produced with the oligonucleotide P3 (5 '-CCTCTCTTTCCATATGCTCCCTTCTC-3 • ) which introduces an Nde I restriction site (underlined) at the second ATG codon (M43) position 127, the oligonucleotide P4 (5'-CCGCCAGCCACCTCÇATATGACCGACACCATCC- 3 ') which introduces an ATG initiator codon and an Nde I restriction site (underlined) in position 174 from the first ATG codon (N58M), and the oligonucleotide P5 ( 5'-CGCCACCCCTÇATATGCGTATCGCC-3 ') which introduces an ATG initiator codon and an Nde I restriction site (underlined) in position 222 from the first ATG codon (L75M). All the PCR fragments corresponding to the first exon, coding for a transit peptide or not, were cloned into the plasmid pPCR-Script (Stratagene). Nde I-BamH I DNA fragments containing the coding sequences, with or without the transit peptide sequence, were then cloned into the plasmid pET21 a (+) (Novagen), leading to the production of the plasmids pET21 - TyrA-AT1, with and without ET21-TyrA-AT1- M1 transit peptide sequence, pEΥ21-TyrA-ATl-M43, vET21-TyrA-ATl-M58, and pET21 -TyrA-ATl -M7 '5). Two other oligonucleotides were used to amplify the second coding sequence (TyrA-AT2). The oligonucleotide P6 (5'-GATGCATCTTTGÇATATGATGAGGTCAGAAGATG-3 ') introduces an Nde I restriction site (underlined) at the ATG codon of the second open reading frame (at position 1081 from the first ATG codon), and the oligonucleotide P7 (5'-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3 ') complementary to the start of the 3'-UTR which introduces a BamHI restriction site (underlined). The PCR fragment corresponding to the second coding sequence was digested with Nde 1-BamH I, then cloned into the plasmid pET21 a (+), giving the plasmid pET21 -TyrA-AT2.
La séquence codante complète a été reconstituée par assemblage de l'extrémité 5' manquante du premier exon avec un ADNc de TyrA-AT partiel (1.5 kb), obtenu par amplification PCR de l'ADNc d'Arabidopsis avec l'oligonucléotide P8 (5'-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') commençant en position 513 bp depuis le premier codon ATG et l'oligonucléotide 3' P7. Un site de restriction EcoRV situé en position 812 bp depuis le premier codon ATG et présent dans l'extrémité 5' de l'ADNc partiel de TyrA-AT a été utilisé pour la reconstitution. L'ADNc partiel de TyrA-AT a été clone dans le plasmide pPCR-Script. Un fragment EcoRN-EcoRN a été obtenu du plasmide pPCR-Script-7yr._4-.4-r puis clone dans le plasmide pPCR-Scήpt-TyrA-ATl préalablement digéré par EcoRV. Cette manipulation a conduit à l'obtention du plasmide pPCR- Scήpt-TyrA-ATc. Un fragment Ndel-BamHl contenant la séquence codante complète a été excisé du plasmide pPCR-Script-TJ'r^-^Tc, puis clone dans un plasmide pΕT21a(+) (Novagen), préalablement digéré par Ndel et BamHl, conduisant au plasmide pΕT21a{+)-TyrA-ATc. Puis, de la même manière que pour le premier exon, quatre plasmides pET21a.{+)-TyrA-ATc ont été obtenus. Un plasmide contenant la séquence codante complète avec la séquence codant le peptide de transit putatif, et trois plasmides dénués de cette séquence de peptide de transit qui a été clivée à trois sites différents (M43, V58, et L75, voir ci-dessus). Pour tous les construits décrits ci-dessus, les inserts d'ADNc ont été séquences afin de s'assurer qu'aucune mutation indésirable n'a été introduite qu cours des amplifications PCR.The complete coding sequence was reconstituted by assembling the missing 5 'end of the first exon with a partial TyrA-AT cDNA (1.5 kb), obtained by PCR amplification of the Arabidopsis cDNA with the oligonucleotide P8 (5 '-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') starting at position 513 bp from the first ATG codon and the 3 'oligonucleotide P7. An EcoRV restriction site located at position 812 bp from the first ATG codon and present in the 5 ′ end of the partial cDNA of TyrA-AT was used for the reconstruction. The partial TyrA-AT cDNA was cloned into the plasmid pPCR-Script. An EcoRN-EcoRN fragment was obtained from the plasmid pPCR-Script-7yr._4-.4-r and then cloned into the plasmid pPCR-Scήpt-TyrA-AT1 previously digested with EcoRV. This manipulation led to the obtaining of the plasmid pPCR-Scήpt-TyrA-ATc. An Ndel-BamHI fragment containing the complete coding sequence was excised from the plasmid pPCR-Script-TJ'r ^ - ^ Tc, then cloned into a plasmid pΕT21a (+) (Novagen), previously digested with Ndel and BamHI, leading to the plasmid pΕT21a {+) - TyrA-ATc. Then, in the same way as for the first exon, four plasmids pET21a. {+) - TyrA-ATc were obtained. A plasmid containing the complete coding sequence with the sequence coding for the putative transit peptide, and three plasmids devoid of this transit peptide sequence which has been cleaved at three different sites (M43, V58, and L75, see above). For all of the constructs described above, the cDNA inserts were sequenced to ensure that no unwanted mutation was introduced during the PCR amplifications.
Exemple 4: Mesure des activités enzymatiquesExample 4: Measurement of the enzymatic activities
L'activité arogenate deshydrogénase est mesurée à 25 °C par suivi spectrophotométrique à 340 nm de la formation de NADH ou NADPH dans une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 8.6, 300 μM d'arogénate, et 1 mM de NAD ou NADP dans un volume total de 200 μl.The arogenate dehydrogenase activity is measured at 25 ° C. by spectrophotometric monitoring at 340 nm of the formation of NADH or NADPH in a solution containing 50 mM Tris-HCl, pH 8.6, 300 μM arogenate, and 1 mM NAD or NADP in a total volume of 200 μl.
L'activité prephenate deshydrogénase est mesurée à 25°C par suivi spectrophotométrique à 340 nm de la formation de NADH ou NADPH dans une solution contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 8.6, 300 μM de prephenate, et 1 mM de NAD ou NADP dans un volume total de 200 μl.The prephenate dehydrogenase activity is measured at 25 ° C. by spectrophotometric monitoring at 340 nm of the formation of NADH or NADPH in a solution containing 50 mM of Tris-HCl, pH 8.6, 300 μM of prephenate, and 1 mM of NAD or NADP in a total volume of 200 μl.
Exemple 5: Production d'arogénate dehydrogenase recombinante Des cellules d'Escherichia coli AT2471 ont été transformées avec chacun des plasmides ιpET21-TyrA-AT obtenus à l'exemple 3, puis cultivée à 37°C dans 2 litres de milieu Luria-Bertani supplémenté avec 100 μg/ml de carbeniciline. Lorsque la culture a atteint l'équivalent d'une absorbance à 600nm (A600) de 0,6, 1 mM d'isopropyl-β-D-thiogalactoside a été ajouté au milieu de culture afin d'induire le synthèse des protéines recombinantes. Les cellules ont ensuite été cultivées pendant 16h à 28°C, récoltées, puis centrifugées 20 min à 40 000 g. Le culot a ensuite été resuspendu dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM benzamidine HC1, 5 mM amino caproic acid, puis soniqué (100 impulsions toutes les 3 secondes à la puissance 5) avec un disrupteur Vibra-Cell (Sonics and Materials, Danbury, CT, USA). Les extraits bruts ainsi obtenus sont ensuite centrifugés 20 min à 40 000 g, et les surnageant sont utilisés directement pour les tests enzymatiques.EXAMPLE 5 Production of Recombinant Arogenate Dehydrogenase Escherichia coli AT2471 cells were transformed with each of the ιpET21-TyrA-AT plasmids obtained in Example 3, then cultured at 37 ° C. in 2 liters of Luria-Bertani medium supplemented with 100 μg / ml of carbenicilin. When the culture has reached the equivalent of an absorbance at 600 nm (A600) of 0.6, 1 mM of isopropyl-β-D-thiogalactoside was added to the culture medium in order to induce the synthesis of the recombinant proteins. The cells were then cultured for 16 h at 28 ° C., harvested and then centrifuged for 20 min at 40,000 g. The pellet was then resuspended in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM benzamidine HC1, 5 mM amino caproic acid, then sonicated (100 pulses every 3 seconds at power 5 ) with a Vibra-Cell disruptor (Sonics and Materials, Danbury, CT, USA). The crude extracts thus obtained are then centrifuged for 20 min at 40,000 g, and the supernatants are used directly for the enzymatic tests.
Les analyses par SDS-PAGE d'extraits protéiques totaux de la souche E. coli AT 2471 contenant les différents construits pEI21-TyrA-Atct pET21-TyrA-ATl , et pET21-TyrA-AT2, ont révélé la présence de trois protéines recombinantes possédant des masses moléculaires de 66-68 kDa, 35 kDa, et 33-34 kDa respectivement. Ces masses moléculaires correspondent bien avec les masses déduites de leurs séquences codantes respectives (68786 Da pour TyrA-ATc, 34966 Da pour TyrA-ATl, et 34069 Da pour Tyr-A-AT2). Pour les transformants contenant la séquence codante complète {TyrA-Atc) et la première séquence codante {TyrA-ATl), des protéines recombinantes n'ont été observées qu'avec les construits codant les protéines M58-TyrA-Atc et M58-TyrA-ATl. Les trois protéines recombinantes ont principalement été retrouvées dans les corps protéiques. Toutefois, la présence de faibles quantités de protéines recombinantes dans les extraits protéiques solubles d'E. coli ont permis une caractérisation de leurs propriétés biochimiques.SDS-PAGE analyzes of total protein extracts of the E. coli AT 2471 strain containing the different constructs pEI21-TyrA-Atc t pET21-TyrA-ATl, and pET21-TyrA-AT2, revealed the presence of three recombinant proteins with molecular weights of 66-68 kDa, 35 kDa, and 33-34 kDa respectively. These molecular weights correspond well with the masses deduced from their respective coding sequences (68786 Da for TyrA-ATc, 34966 Da for TyrA-ATl, and 34069 Da for Tyr-A-AT2). For transformants containing the complete coding sequence (TyrA-Atc) and the first coding sequence (TyrA-AT1), recombinant proteins were only observed with the constructs coding for the proteins M58-TyrA-Atc and M58-TyrA- ATl. The three recombinant proteins have mainly been found in protein bodies. However, the presence of small amounts of recombinant proteins in the soluble protein extracts of E. coli allowed a characterization of their biochemical properties.
Exemple 6: Identification et caractérisation biochimique des enzymes arogenate dehydrogenase d'Arabidopsis thalianaExample 6 Identification and biochemical characterization of the arogenate dehydrogenase enzymes of Arabidopsis thaliana
La caractérisation biochimique des enzymes arogenate dehydrogenase recombinantes a été mise en œuvre à partir des extraits protéiques solubles des souches d'E.coli transformées. L'activité arogenate dehydrogenase a été mesurée selon la méthode décrite à l'exemple 4. Une activité arogenate dehydrogenase strictement NADP-dépendante a été mise en évidence pour chacune des trois enzymes recombinantes. Aucune activité arogenate dehydrogenase n'a été détectée en présence de NAD, et aucune activité prephenate dehydrogenase n'a été détectée quel que soit le cofacteur utilisé (NADP ou NAD) et quelle que soit la protéine testée (TyrA-ATc, TyrA-ATl, ou TyrA-AT2). De plus, le prephenate à une concentration de 1 mM n'inhibe pas l'activité arogenate dehydrogenase des trois enzymes recombinantes. Chacune de ces enzymes a un comportement de type Michaelis-Menten, et leur valeur de Km pour l'arogénate et le NADP est peu différent (Figures 2 et 3). Les constantes de Michaelis pour le NADP sont respectivement de 40 μM pour TyrA-Atc, 60 μM pour TyrA-ATl, et 20 μM pour TyrA-AT2. Les constantes de Michaelis pour l'arogénate sont respectivement de 70 μM pour TyrA-Atc, 45 μM pour TyrA- ATl, et 45 μM pour TyrA-AT2. De plus, comme les autres arogénates déhydrogénases de plantes (Byng et al., 1981, Phytochemistry 6, 1289-1292; Connelly and Conn, 1986, Z. Naturforsch 41c, 69-78; Gaines et al., 1982Planta 156, 233-240), les arogénates déhydrogénases d'Arabidopsis sont toutes très sensibles à la tyrosine, le produit de la réaction enzymatique, et insensibles à 1 mM de phénylalanine et 1 mM de p-hydroxyphenylpyruvate. L'inhibition par la tyrosine est compétitive vis-à-vis de l'arogénate (Ki de 14 μM pour TyrA-Atc, 8 μM pour TyrA-ATl, et 12 μM pour TyrA-AT2), et non-compétitive vis-à-vis du NADP.The biochemical characterization of the recombinant arogenate dehydrogenase enzymes was carried out using soluble protein extracts from the transformed E. coli strains. The arogenate dehydrogenase activity was measured according to the method described in Example 4. A strictly NADP-dependent arogenate dehydrogenase activity was demonstrated for each of the three recombinant enzymes. No arogenate dehydrogenase activity was detected in the presence of NAD, and no prephenate dehydrogenase activity was detected whatever the cofactor used (NADP or NAD) and whatever the protein tested (TyrA-ATc, TyrA-ATl, or TyrA-AT2). In addition, prephenate at a concentration of 1 mM does not inhibit the arogenate dehydrogenase activity of the three recombinant enzymes. Each of these enzymes has a Michaelis-Menten type behavior, and their Km value for the arogenate and the NADP is little different (Figures 2 and 3). The Michaelis constants for NADP are 40 μM for TyrA-Atc, 60 μM for TyrA-ATl, and 20 μM for TyrA-AT2, respectively. The Michaelis constants for the arogenate are respectively 70 μM for TyrA-Atc, 45 μM for TyrA-ATl, and 45 μM for TyrA-AT2. In addition, like other plant arogenates dehydrogenases (Byng et al., 1981, Phytochemistry 6, 1289-1292; Connelly and Conn, 1986, Z. Naturforsch 41c, 69-78; Gaines et al., 1982 Planta 156, 233- 240), the aridate dehydrogenases of Arabidopsis are all very sensitive to tyrosine, the product of the enzymatic reaction, and insensitive to 1 mM of phenylalanine and 1 mM of p-hydroxyphenylpyruvate. Inhibition by tyrosine is competitive with respect to the arogenate (Ki of 14 μM for TyrA-Atc, 8 μM for TyrA-ATl, and 12 μM for TyrA-AT2), and non-competitive with -vis the NADP.
Exemple 7: Identification et caractérisation biochimique de l'enzyme arogenate dehydrogenase de SynechocystisEXAMPLE 7 Identification and Biochemical Characterization of the Arogenate Dehydrogenase Enzyme of Synechocystis
La séquence du gène codant l'arogénate dehydrogenase d'A. thaliana identifiée à l'exemple 1 {TyrA) a permis d'identifier un gène d'arogénate dehydrogenase chez la bactérie Synechocystis (numéro d'accession: 1652956). Ce gène était originellement décrit comme codant une enzyme "prephenate dehydrogenase". Il a été isolé à partir de d'une banque génomique de Synechocystis, et l'enzyme a été produite de la même manière que l'enzyme d'A. thaliana selon le protocole décrit à l'exemple 5. Une caractérisation biochimique de l'enzyme produite a permis de démontrer qu'il s'agit d'une enzyme arogenate dehydrogenase et non pas d'une enzyme prephenate dehydrogenase. Cette caractérisation biochimique de l'enzyme arogenate dehydrogenase de Synechocystis a été mise en œuvre à partir des extraits protéiques solubles purifiés des souches d'E.coli transformées. L'activité arogenate dehydrogenase a été mesurée selon la méthode décrite à l'exemple 4. Une activité arogenate dehydrogenase strictement NADP-dépendante a été mise en évidence pour cette enzyme. Aucune activité arogenate dehydrogenase n'a été détectée en présence de NAD, et aucune activité prephenate dehydrogenase n'a été détectée quel que soit le cofacteur utilisé (NADP ou NAD). De plus, le prephenate à une concentration de 1 mM n'inhibe pas l'activité arogenate dehydrogenase de cette enzyme. L'arogénate dehydrogenase de Synechocystis a un comportement de type Michaelis-Menten (Figure 4). La constante de Michaelis est de 6 μM pour le NADP, et de 107 μM pour l'arogénate.The sequence of the gene encoding the arogenate dehydrogenase of A. thaliana identified in Example 1 (TyrA) made it possible to identify an arogenate dehydrogenase gene in the Synechocystis bacterium (accession number: 1652956). This gene was originally described as coding for a "prephenate dehydrogenase" enzyme. It was isolated from a Synechocystis genomic library, and the enzyme was produced in the same manner as the A enzyme. thaliana according to the protocol described in example 5. A biochemical characterization of the enzyme produced has made it possible to demonstrate that it is an arogenate dehydrogenase enzyme and not a prephenate dehydrogenase enzyme. This biochemical characterization of the arogenate dehydrogenase enzyme from Synechocystis was implemented using purified soluble protein extracts from the transformed E. coli strains. The arogenate dehydrogenase activity was measured according to the method described in Example 4. A strictly NADP-dependent arogenate dehydrogenase activity was demonstrated for this enzyme. No arogenate dehydrogenase activity was detected in the presence of NAD, and no prephenate dehydrogenase activity was detected regardless of the cofactor used (NADP or NAD). In addition, prephenate at a concentration of 1 mM does not inhibit the arogenate dehydrogenase activity of this enzyme. Arogenate dehydrogenase Synechocystis has a Michaelis-Menten type behavior (Figure 4). The Michaelis constant is 6 μM for NADP, and 107 μM for the arogenate.
Exemple 8: Identification d'autres enzymes arogenate dehydrogenase de plantes La séquence du gène codant l'arogénate dehydrogenase d'A. thaliana identifiée à l'exempleExample 8 Identification of Other Plant Arogenate Dehydrogenase Enzymes The sequence of the gene encoding the arogenate dehydrogenase from A. thaliana identified by example
I {TyrA) a permis d'identifier un autre gène d'arogénate dehydrogenase chez A. thaliana. Ce nouveau gène (Numéro d'accession: AC034256; SEQ ID NO:8) était initialement annoté comme "contenant une similarité avec la protéine d'abondance de l'embryon (EMB20) de Picea glauca".I (TyrA) made it possible to identify another arogenate dehydrogenase gene in A. thaliana. This new gene (Accession number: AC034256; SEQ ID NO: 8) was initially annotated as "containing a similarity to the embryonic abundance protein (EMB20) of Picea glauca".
II possède également une séquence de peptide de transit chloroplastique putative, mais pas de région répétée.It also has a putative chloroplast transit peptide sequence, but no repeat region.
La séquence du gène TyrA a également permis d'identifier deux autres ADNc codant pour des enzymes arogenate dehydrogenase dans les bases de données d'EST (Expressed Séquence Tags) publiques. Une de ces ADNc, qui n'est pas complet, correspond à un ADNc de Tomate (TC41067; SEQ ID NO:22). Le caractère incomplet de cet ADNc ne permet pas de déterminer s'il est dupliqué comme TyrA car son extrémité 3' s'arrête juste après le codon correspondant au D356 de Tyr-ATl. Le second ADNc correspond à un ADNc complet de Picea glauca (Numéro d'accession: L47749; SEQ ID NO: 10), et ne possède pas de région répétée. Cet ADNc de Picea glauca était annoté comme étant une protéine d'abondance de l'embryon". The TyrA gene sequence also identified two other cDNAs encoding arogenate dehydrogenase enzymes in public EST (Expressed Sequence Tag) databases. One of these cDNAs, which is not complete, corresponds to a Tomato cDNA (TC41067; SEQ ID NO: 22). The incomplete nature of this cDNA does not make it possible to determine whether it is duplicated as TyrA because its 3 'end stops just after the codon corresponding to D356 of Tyr-AT1. The second cDNA corresponds to a complete Picea glauca cDNA (Accession number: L47749; SEQ ID NO: 10), and does not have a repeat region. This Picea glauca cDNA was annotated as an embryo abundance protein ".

Claims

Revendicationsclaims
1- Polynucléotide isolé codant pour une enzyme possédant une activité arogenate dehydrogenase1- Isolated polynucleotide encoding an enzyme having arogenate dehydrogenase activity
2- Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi le groupe consistant en:2- Polynucleotide according to claim 1, characterized in that it comprises a polynucleotide selected from the group consisting of:
(a) un polynucléotide isolé codant pour le polypeptide décrit par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9 (b) un polynucléotide isolé s'hybridant au polynucléotide selon (a)(a) an isolated polynucleotide encoding the polypeptide described by the sequence identifier SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 (b) an isolated polynucleotide hybridizing to polynucleotide according to (a)
(c) un polynucléotide isolé homologue d'un polynucléotide selon (a) ou (b)(c) an isolated polynucleotide homologous to a polynucleotide according to (a) or (b)
(d) un fragment d'un polynucléotide selon (a), (b), ou (c)(d) a fragment of a polynucleotide according to (a), (b), or (c)
3- Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi les identificateurs de séquences SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2,3- Polynucleotide according to claim 2, characterized in that it comprises a polynucleotide selected from the sequence identifiers SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 8SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8
4- Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi le groupe consistant en: (a) un polynucléotide isolé codant pour le polypeptide décrit par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 114- Polynucleotide according to claim 1, characterized in that it comprises a polynucleotide selected from the group consisting of: (a) an isolated polynucleotide encoding the polypeptide described by the sequence identifier SEQ ID NO: 11
(b) un polynucléotide isolé s'hybridant au polynucléotide selon (a)(b) an isolated polynucleotide hybridizing to the polynucleotide according to (a)
(c) un polynucléotide isolé homologue d'un polynucléotide selon (a) ou (b)(c) an isolated polynucleotide homologous to a polynucleotide according to (a) or (b)
(d) un fragment d'un polynucléotide selon (a), (b), ou (c)(d) a fragment of a polynucleotide according to (a), (b), or (c)
5- Polynucléotide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi les identificateurs de séquences SEQ ID NO: 105- Polynucleotide according to claim 4, characterized in that it comprises a polynucleotide selected from the sequence identifiers SEQ ID NO: 10
6- Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il provient de plantes 7- Polynucléotide isolé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il provient d'Arabidopsis thaliana6- Isolated polynucleotide according to one of claims 1 to 5, characterized in that it comes from plants 7- Isolated polynucleotide according to claim 3, characterized in that it comes from Arabidopsis thaliana
8- Polynucléotide isolé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il provient de Picea glauca8- Polynucleotide isolated according to claim 5, characterized in that it comes from Picea glauca
9- Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi le groupe consistant en:9- Polynucleotide according to claim 1, characterized in that it comprises a polynucleotide selected from the group consisting of:
(a) un polynucléotide isolé codant pour le polypeptide décrit par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 13(a) an isolated polynucleotide encoding the polypeptide described by the sequence identifier SEQ ID NO: 13
(b) un polynucléotide isolé s'hybridant au polynucléotide selon (a)(b) an isolated polynucleotide hybridizing to the polynucleotide according to (a)
(c) un polynucléotide isolé homologue d'un polynucléotide selon (a) ou (b)(c) an isolated polynucleotide homologous to a polynucleotide according to (a) or (b)
(d) un fragment d'un polynucléotide selon (a), (b), ou (c)(d) a fragment of a polynucleotide according to (a), (b), or (c)
10- Polynucléotide selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi les identificateurs de séquences SEQ ID NO:l 110- Polynucleotide according to claim 9, characterized in that it comprises a polynucleotide selected from the sequence identifiers SEQ ID NO: l 1
11- Polynucléotide isolé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il provient d'une bactérie11- Polynucleotide isolated according to one of claims 9 or 10, characterized in that it comes from a bacterium
12- Polynucléotide isolé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il provient d'une bactérie du genre Synechocystis12- Polynucleotide isolated according to claim 11, characterized in that it comes from a bacterium of the genus Synechocystis
13- Enzyme à activité arogenate dehydrogenase, caractérisée en ce qu'elle est codée par un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 813- Enzyme with arogenate dehydrogenase activity, characterized in that it is coded by a polynucleotide according to one of claims 1 to 8
14- Enzyme à activité arogenate dehydrogenase selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle provient d'une plante14- Enzyme with arogenate dehydrogenase activity according to claim 13, characterized in that it comes from a plant
15- Enzyme à activité arogenate dehydrogenase, caractérisée en ce qu'elle est codée par un polynucléotide selon l'une des revendications 9 à 12 16- Enzyme à activité arogenate dehydrogenase selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle provient d'une bactérie15- Enzyme with arogenate dehydrogenase activity, characterized in that it is coded by a polynucleotide according to one of claims 9 to 12 16- Enzyme with arogenate dehydrogenase activity according to claim 15, characterized in that it comes from a bacterium
17- Gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle: (a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte17- Chimeric gene comprising at least, operatively linked to each other: (a) a functional promoter in a host organism
(b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 12(b) a polynucleotide according to one of claims 1 to 12
(c) un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte(c) a functional terminator in a host organism
18- Gène chimère selon la revendication 17, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur constitutif18- chimeric gene according to claim 17, characterized in that the promoter is a constitutive promoter
19- Gène chimère selon la revendication 17, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible19- chimeric gene according to claim 17, characterized in that the promoter is an inducible promoter
20- Gène chimère selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend, en plus, un peptide signal ou un peptide de transit fonctionnel dans ledit organisme hôte20- chimeric gene according to one of claims 17 to 19, characterized in that it further comprises a signal peptide or a transit peptide functional in said host organism
21- Gène chimère selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que l'organisme hôte est un microorganisme21- chimeric gene according to one of claims 17 to 20, characterized in that the host organism is a microorganism
22- Gène chimère selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante22- chimeric gene according to one of claims 17 to 20, characterized in that the host organism is a plant cell or a plant
23- Necteur d'expression ou de transformation contenant un gène chimère selon l'une des revendications 17 à 2223- expression or transformation nector containing a chimeric gene according to one of claims 17 to 22
24- Necteur selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il est un plasmide, un phage ou un virus24- Nector according to claim 23, characterized in that it is a plasmid, a phage or a virus
25- Organisme hôte transformé avec l'un des vecteurs selon l'une des revendications 23 ou25- Host organism transformed with one of the vectors according to one of claims 23 or
24 26- Organisme hôte selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un microorganisme24 26- Host organism according to claim 25, characterized in that it is a microorganism
27- Organisme hôte selon la revendication 26, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie de l'espèce Escherichia coli27- Host organism according to claim 26, characterized in that the microorganism is a bacterium of the species Escherichia coli
28- Organisme hôte selon la revendication 26, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure du genre Saccharomyces, Kluyveromyces ou Pichia28- Host organism according to claim 26, characterized in that the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces or Pichia
29- Organisme hôte selon la revendication 26, caractérisé en ce que le microorganisme est un baculovirus29- Host organism according to claim 26, characterized in that the microorganism is a baculovirus
30- Cellule végétale transformée contenant un gène chimère selon l'une des revendications 17 à 2230- Transformed plant cell containing a chimeric gene according to one of claims 17 to 22
31- Procédé de préparation d'enzyme arogenate dehydrogenase caractérisé en ce que31- Process for the preparation of arogenate dehydrogenase enzyme characterized in that
(a) on cultive un organisme ou une cellule végétale transformés selon l'une des revendications 25 à 30 dans un milieu de culture approprié(a) cultivating a transformed organism or plant cell according to one of claims 25 to 30 in an appropriate culture medium
(b) on récupère l'enzyme arogenate dehydrogenase produite dans le milieu de culture par centrifugation ou par filtration(b) the enzyme arogenate dehydrogenase produced is recovered in the culture medium by centrifugation or by filtration
(c) on purifie l'enzyme récupérée à l'étape (b) par un passage au travers d'au moins une colonne de chromatographie(c) the enzyme recovered in step (b) is purified by passing through at least one chromatography column
32- Procédé d'identification d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme à activité arogenate dehydrogenase, caractérisé en ce que32- Method for identifying a herbicidal compound targeting an enzyme with arogenate dehydrogenase activity, characterized in that
(a) on prépare au moins deux échantillons contenant chacun une quantité équivalente d'une enzyme arogenate dehydrogenase en solution(a) at least two samples are prepared, each containing an equivalent amount of an arogenate dehydrogenase enzyme in solution
(b) on traite un des échantillons avec un composé(b) one of the samples is treated with a compound
(c) on mesure l'activité arogenate dehydrogenase dans chacun desdits échantillons (d) on identifie le composé utilisé à l'étape (b) comme étant un composé herbicide lorsque l'activité mesurée à l'étape (c) est significativement inférieure dans l'échantillon traité par rapport à l'échantillon non traité (e) on valide l'activité herbicide du composé identifié à l'étape (d) en traitant des plantes avec ledit composé(c) the arogenate dehydrogenase activity is measured in each of said samples (d) the compound used in step (b) is identified as being a herbicidal compound when the activity measured in step (c) is significantly lower in the treated sample versus the untreated sample (e) validating the herbicidal activity of the compound identified in step (d) by treating plants with said compound
33- Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que l'enzyme à activité arogenate dehydrogenase utilisée à l'étape (a) est une enzyme selon l'une des revendications 13 à 1633- Method according to claim 32, characterized in that the enzyme with arogenate dehydrogenase activity used in step (a) is an enzyme according to one of claims 13 to 16
34- Composés herbicides, caractérisés en ce qu'ils ont pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase34- Herbicidal compounds, characterized in that they target an arogenate dehydrogenase enzyme
35- Composés herbicides selon la revendication 34, caractérisés en ce qu'ils ont pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase selon l'une des revendications 13 à 1635- herbicidal compounds according to claim 34, characterized in that they target an arogenate dehydrogenase enzyme according to one of claims 13 to 16
36- Composés herbicides selon l'une des revendications 34 ou 35, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une des revendications 32 ou 3336- herbicidal compounds according to one of claims 34 or 35, characterized in that they are obtained by the process according to one of claims 32 or 33
37- Plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme impliquée dans l'une des étapes métaboliques de transformation du prephenate en L-tyrosine, caractérisé en ce qu'elles contiennent un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase et expriment ladite enzyme dans leurs tissus37- Plants tolerant towards a herbicidal compound targeting an enzyme involved in one of the metabolic stages of transformation of prephenate into L-tyrosine, characterized in that they contain a gene encoding an enzyme prephenate dehydrogenase and express that enzyme in their tissues
38- Plantes selon la revendication 37, caractérisées en ce qu'elles sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogenase38- Plants according to claim 37, characterized in that they are tolerant with respect to a herbicidal compound having for target an arogenate dehydrogenase enzyme
39- Plantes selon la revendication 38, caractérisées en ce qu'elles sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide selon l'une revendications 34 à 3639- Plants according to claim 38, characterized in that they are tolerant with respect to a herbicidal compound according to one of claims 34 to 36
40- Plantes selon la revendication 37, caractérisées en ce qu'elles sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme prephenate aminotransférase40- Plants according to claim 37, characterized in that they are tolerant with respect to a herbicidal compound having for target a enzyme prephenate aminotransferase
41- Plantes tolérantes selon l'une revendications 37 à 40, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase est un gène de levure 42- Plantes tolérantes selon la revendication 41, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une levure du genre Saccharomyces41- Tolerant plants according to one of claims 37 to 40, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme is a yeast gene 42- Tolerant plants according to claim 41, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme comes from a yeast of the genus Saccharomyces
43- Plantes tolérantes selon la revendication 42, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1443- Tolerant plants according to claim 42, characterized in that the gene coding for a prephenate dehydrogenase enzyme is represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 14
44- Plantes tolérantes l'une revendications 37 à 40, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une bactérie44- tolerant plants one of claims 37 to 40, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme comes from a bacterium
45- Plantes tolérantes selon la revendication 44, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une bactérie du genre Bacillus45- tolerant plants according to claim 44, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme comes from a bacterium of the genus Bacillus
46- Plantes tolérantes selon la revendication 45, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1646- Tolerant plants according to claim 45, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme is represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 16
47- Plantes tolérantes selon la revendication 44, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une bactérie du genre Escherichia47- Tolerant plants according to claim 44, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme comes from a bacterium of the genus Escherichia
48- Plantes tolérantes selon la revendication 47, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1848- Tolerant plants according to claim 47, characterized in that the gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme is represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 18
49- Plantes tolérantes selon la revendication 44, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une bactérie du genre Erwinia49- Tolerant plants according to claim 44, characterized in that the gene coding for a prephenate dehydrogenase enzyme comes from a bacterium of the genus Erwinia
50- Plantes tolérantes selon la revendication 49, caractérisées en ce que le gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO:2050- Tolerant plants according to claim 49, characterized in that the gene coding for a prephenate dehydrogenase enzyme is represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 20
51- Procédé de production de plantes tolérantes vis-à-vis de composés herbicides ayant pour cible une enzyme impliquée dans l'une des étapes métaboliques de transformation du prephenate en L-tyrosine, caractérisé en ce que l'on transforme lesdites plantes avec un gène codant une enzyme prephenate dehydrogenase de manière à ce qu'elles l'expriment dans leurs tissus. 52- Procédé selon la revendication 51, caractérisé en ce qu'il s'applique à la production de plantes tolérantes vis-à-vis de composés herbicides ayant pour cible l'enzyme arogenate dehydrogenase51- Process for the production of plants tolerant with respect to herbicidal compounds targeting an enzyme involved in one of the metabolic stages of transformation of prephenate into L-tyrosine, characterized in that said plants are transformed with a gene encoding a prephenate dehydrogenase enzyme so that they express it in their tissues. 52- A method according to claim 51, characterized in that it applies to the production of plants tolerant with respect to herbicidal compounds having for target the enzyme arogenate dehydrogenase
53- Procédé selon la revendication 51, caractérisé en ce qu'il s'applique à la production de plantes tolérantes vis-à-vis de composés herbicides ayant pour cible l'enzyme prephenate aminotransférase53- Method according to claim 51, characterized in that it applies to the production of plants tolerant with respect to herbicidal compounds having for target the enzyme prephenate aminotransferase
54- Procédé selon l'une des revendications 51 à 53, caractérisé en ce que l'enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une levure54- Method according to one of claims 51 to 53, characterized in that the enzyme prephenate dehydrogenase comes from a yeast
55- Procédé selon l'une des revendications 51 à 53, caractérisé en ce que l'enzyme prephenate dehydrogenase provient d'un champignon55- Method according to one of claims 51 to 53, characterized in that the enzyme prephenate dehydrogenase comes from a fungus
56- Procédé selon l'une des revendications 51 à 53, caractérisé en ce que l'enzyme prephenate dehydrogenase provient d'une bactérie56- Method according to one of claims 51 to 53, characterized in that the enzyme prephenate dehydrogenase comes from a bacterium
57- Plantes tolérantes selon l'une des revendications 37 à 50, caractérisée en ce qu'elle contient, en plus d'un gène chimère selon l'une des revendications 17 à 22, au moins un autre gène contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt 57- Tolerant plants according to one of claims 37 to 50, characterized in that it contains, in addition to a chimeric gene according to one of claims 17 to 22, at least one other gene containing a polynucleotide encoding a protein of interest
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