EP1325016A2 - Nucleosidderivate und verfahren zu deren herstellung - Google Patents
Nucleosidderivate und verfahren zu deren herstellungInfo
- Publication number
- EP1325016A2 EP1325016A2 EP00962214A EP00962214A EP1325016A2 EP 1325016 A2 EP1325016 A2 EP 1325016A2 EP 00962214 A EP00962214 A EP 00962214A EP 00962214 A EP00962214 A EP 00962214A EP 1325016 A2 EP1325016 A2 EP 1325016A2
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- atom
- group
- atoms
- nucleoside derivatives
- alkyl radical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00722—Nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Definitions
- the present invention relates to new nucleoside derivatives and a process for their preparation.
- Photolabile protecting groups have been described many times, especially for the synthesis of oligomers. Their use for the synthesis of peptides and in the field of combinatorial organic synthesis is particularly popular.
- the photolysis of the protective groups is a comparatively mild alternative to traditional basic or acidic deprotection and is therefore particularly suitable for the synthesis of sensitive biomolecules.
- numerous derivatives with ortho-nitro-benzyl functions have been used successfully, for example for the synthesis of oligonucleotides.
- Photosplitable protecting groups should also be stable to basic and acidic reagents, which are used in a multi-stage synthesis, and above all should not form highly reactive by-products.
- nucleoside derivatives have been used for the synthesis of oligonucleotides using photolabile protective groups, which were protected at the 5 'position with a derivatized o-nitrobenzyloxycarbonyl or a 2- (o-nitrophenyl) ethoxycarbonyl function. These can be effectively split off, for example, by irradiation with an Hg lamp, the emission line at 313 nm being decisive.
- o-nitrobenzyloxycarbonyl-protected nucleoside derivatives are also known for the commercial synthesis of oligomer arrays.
- Nucleoside building blocks with photolabile protective groups of the 2- (o-nitrophenyl) ethoxycarbonyl type are also known. The protective groups described, however, still require a relatively long time for complete cleavage from the nucleoside building block, and irradiation times of a few minutes are usually required, with side reactions also having to be expected for sensitive biomolecules such as DNA.
- WO-A-94/10128 describes photoreactive protective groups which are of the 2- (o-nitrophenyl) methoxy type. These connections can then u. a. also contain thiocarbonyl functions. However, the general formula does not include compounds of the 2- (o-nitrophenyl) ethoxy-thiocarbonyl type.
- the object of the present invention is therefore to provide nucleoside derivatives which can be easily photolyzed.
- Ri represents a nucleobase or a nucleobase provided with at least one protective group
- R is an H atom or a diisopropylamino (2-cyanoethoxy) phosphinyl group of the formula IV
- R 3 is an H atom or an alkyl radical with up to 4 C atoms
- R 4 represents an H atom, a nitro group or an alkyl radical with up to 4 C atoms
- R 5 and R 6 independently of one another represent an H atom, an alkyl radical with up to 4 C atoms or an alkoxy radical with up to 4 C atoms or together represent a methylenedioxy group and
- R 7 is an H atom or an alkyl radical with up to 4 C atoms.
- R i is adenine, cytosine, guanine, thymine, uracil or hypoxanthine, which optionally carry a protective group.
- R 3 is an H atom, a methyl or an ethyl group.
- R 4 is an H atom, a nitro group or a methyl group.
- R 5 and R e independently of one another are an H atom or a represent thyl, ethyl, methoxy or ethoxy group or together form a methylenedioxy group.
- Another object of the present invention is a method for producing a nucleoside derivative of the general formula I
- the present invention describes a new type of photolabile protective groups on nucleoside derivatives (general formula I) which can be split off very efficiently.
- the thiocarbonic acid esters corresponding to formula I can be prepared in two steps analogously to the carbonic acid esters. First, a nitrobenzyl alcohol or a 2-phenylethanol derivative is reacted with thiophosgene to form the corresponding thiocarbonyl chloride and then coupled with the respective nucleoside building block.
- the nucleobase and protective groups of the nucleoside building block have little influence on the synthesis. After the photolabile protective group has been attached, the nucleoside building block can be converted into its phosphoramidite so that it is accessible to the established amidite chemistry, as it also takes place on commercial DNA synthesizers.
- the protective groups of the nucleoside derivatives according to formula I are cleaved off by means of irradiation with a high-pressure mercury lamp.
- Another object of the present invention is the use of the nucleoside derivatives according to the invention for the automatic synthesis of oligonucleotides.
- known synthesis machines and / or pipetting robots are used in order to build up the desired oligonucleotides.
- the present invention therefore also relates to a kit for the automatic synthesis of oligonucleotides comprising at least one nucleoside derivative according to the invention, if appropriate together with further nucleoside derivatives and reagents and auxiliaries, as well as solvents and solvent, and a work instruction.
- the work instructions can also be in the form of a computer program for programming the automatic sequence of the individual synthesis steps.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Beschrieben werden neue Nucleosidderivate der allgemeinen Formel (I), worin R1 eine Nucleobase oder eine mit mindestens einer Schutzgruppe versehene Nucleobase darstellt, R2 ein H-Atom oder eine Diisopropylamino-(2-cyanoethoxy)-phosphinyl-Gruppe bedeutet, R3 ein H-Atom oder ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen ist, R4 ein H-Atom, eine Nitrogruppe oder einen Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen darstellt, R5 und R6 unabhängig voneinander ein H-Atom, ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen oder ein Alkoxyrest mit bis zu 4 C-Atomen bedeuten oder zusammen eine Methylendioxygruppe darstellen und R7 ein H-Atom oder ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen ist. Die neuen Nucleosidderivate lassen sich mittels UV-Licht leicht spalten und werden für die Synthese von Oligonucleotiden verwendet.
Description
Nucleosidderivate und Verfahren zu deren Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleosidderivate sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Photolabile Schutzgruppen wurden vor allem für die Synthese von Oligomeren bereits vielfach beschrieben. Besonders populär ist ihr Einsatz für die Synthese von Pepti- den und im Gebiet der kombinatorischen organischen Synthese. Die Photolyse der Schutzgruppen ist eine vergleichsweise milde Alternative zur traditionellen basischen oder sauren Entschützung und ist deshalb vor allem auch für die Synthese empfindlicher Biomoleküle besonders geeignet. In diesem Zusammenhang wurden vor allem zahlreiche Derivate mit ortho-Nitro-benzyl-Funktionen erfolgreich eingesetzt, so auch für die Synthese von Oligo- nukleotiden z. B. auf Oberflächen zur Herstellung von 0- ligonukleotid Arrays (sogenannte Biochips) . Photospaltba- re Schutzgruppen sollten zudem stabil gegenüber basischen und sauren Reagenzien sein, die in einer mehrstufigen Synthese zur Anwendung kommen, und vor allem keine hochreaktiven Nebenprodukte bilden.
Zur Synthese von Oligonukleotiden unter Verwendung photolabiler Schutzgruppen wurden bislang fast ausschließlich Nukleosidderivate verwendet, die an der 5 '-Position mit einer derivatisierten o-Nitrobenzyloxycarbonyl oder einer 2- (o-Nitrophenyl) ethoxycarbonyl-Funktion geschützt waren. Diese lassen sich beispielsweise durch Bestrahlung mit einer Hg-Lampe effektiv abspalten, wobei die Emissionslinie bei 313 nm entscheidend ist. Bekannt sind beispielsweise für die kommerzielle Synthese von Oligomer Arrays ebenfalls o-Nitrobenzyloxycarbonyl-geschützte Nukleoside- rivate. Nukleosidbausteine mit photolabilen Schutzgruppen des 2- (o-Nitrophenyl) ethoxycarbonyl-Typs sind gleichfalls
bekannt. Die beschriebenen Schutzgruppen benötigen jedoch für eine vollständige Abspaltung vom Nukleosidbaustein noch immer relativ lange, meist werden Bestahlungszeiten von einigen Minuten benötigt, wobei bei empfindlichen Biomolekülen wie DNA auch mit Nebenreaktionen gerechnet werden muss.
Giegrich, H. et al. (Nucleosides & Nucleotides 17 (1998), s. 1987-1996) beschreiben die erwähnten photolabilen Schutzgruppen des 2- (o-Nitrophenyl) ethoxycarbonyl-Typs .
Es wird jedoch kein Hinweis darauf gegeben, dass anstelle der Carbonyl-Funktion auch eine Thiocarbonyl-Funktion verwendet werden kann.
In der WO-A-94/10128 werden photoreaktive Schutzgruppen beschrieben, welche vom 2- (o-Nitrophenyl) methoxy-Typ sind. Diese Verbindungen können dann u. a. auch Thiocar- bonyl-Funktionen enthalten. Die allgemeine Formel umfasst jedoch keine Verbindungen des 2- (o-Nitrophenyl) ethoxy- thiocarbonyl-Typs .
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher Nucleosidderivate zur Verfügung zu stellen, welche sich leicht photolysieren lassen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass Nucleosidderivate der allgemeinen Formel I geschaffen werden,
worin
Ri eine Nucleobase oder eine mit mindestens einer Schutzgruppe versehene Nucleobase darstellt,
R ein H-Atom oder eine Diisopropylamino- (2-cyanoethoxy) - phosphinyl-Gruppe der Formel IV
bedeutet,
R3 ein H-Atom oder ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen ist, R4 ein H-Atom, eine Nitrogruppe oder einen Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen darstellt,
R5 und R6 unabhängig voneinander ein H-Atom, ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen oder ein Alkoxyrest mit bis zu 4 C-Atomen bedeuten oder zusammen eine Methylendioxygrup- pe darstellen und
R7 ein H-Atom oder ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es dabei, dass Ri Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder Hypo- xanthin ist, welche gegebenenfalls eine Schutzgruppe tragen.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass R3 ein H-Atom, eine Methyl- oder eine Ethylgruppe ist.
Es ist ferner bevorzugt, dass
R4 ein H-Atom , eine Nitrogruppe oder eine Methylgruppe ist.
Weiterhin ist bevorzugt, dass
R5 und Re unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine Me-
thyl-, Ethyl-, Methoxy- oder Ethoxygruppe darstellen oder zusammen eine Methylendioxygruppe bilden.
Ein weitere Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleosidderivats der allgemeinen Formel I
worin die Reste Ri, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 die oben an- gegebene Bedeutung haben, wobei man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel II
worin die Reste R3, R4, R5, R6 und R7 die oben angegebene
Bedeutung haben, mit Thiophosgen umsetzt und die so erhaltenen Thiocarbo- nylchloride mit einer Verbindung der allgemeinen Formel
III
worin die Reste Ri und R2 die oben angegebene Bedeutung haben, umsetzt .
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen neuen Typ von photolabilen Schutzgruppen an Nukleosidderivaten (allgemeine Formel I) , die sich sehr effizient abspalten lassen.
Die Thiokohlensäureester entsprechend der Formel I lassen sich analog zu den Kohlensäureestern in zwei Schritten herstellen. Zunächst wird ein Nitrobenzylalkohol- oder ein 2-Phenylethanolderivat mit Thiophosgen zum entspre- chenden Thiocarbonylchlorid umgesetzt und anschließend mit dem jeweiligen Nukleosidbaustein gekoppelt. Dabei nehmen Nukleobase und Schutzgruppen des Nukleosid- bausteins auf die Synthese wenig Einfluß. Nach dem Anbringen der photolabilen Schutzgruppe kann der Nukleosid- baustein in sein Phosphoramidit überführt werden, so dass er der etablierten Amidit-Chemie, wie sie auch auf kommerziellen DNA-Synthesizern stattfindet, zugänglich ist. Die Abspaltung der Schutzgruppen der Nukleosidderivate nach Formel I erfolgt mittels Bestahlung mit einer Hg- Hochdrucklampe.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleosidderivate zur automatischen Synthese von Oligonucleotiden. Hierbei werden an sich bekannte Syntheseautomaten und/oder Pipet- tierroboter verwendet, um die gewünschten Oligonucleotide aufzubauen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Kit zur automatischen Synthese von Oligonucleotiden umfassend mindestens ein erfmdungsgemaßes Nucleosidderi- vat, gegebenenfalls zusammen mit weiteren erfmdungsgema- ßen oder bereits bekannten Nucleosiddeπvaten und Reagenz- und Hilfsstoffen sowie Losemitteln und einer Arbeitsanweisung. Die Arbeitsanweisung kann dabei auch in Form eines Computerprogramms zur Programmierung des auto- matischen Ablaufs der einzelnen Syntheseschritte vorliegen. Mittels dieses Kits lassen sich die gewünschten Oligonucleotide leicht mittels automatisch arbeitender Vorrichtungen herstellen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1:
(5 '- (2- (2, 6-Dιnιtrophenyl) ethoxyth ocarbonyl) thymidm)
a) Darstellung von 2- (2, β-Dinitrophenyl) -1-ethanol
In einem ausgeheizten Rundkolben werden 18.2g Dinitroto- luol in 50ml absolutem DMSO vorgelegt und langsam mit einer Losung von 1.8g Kalium-tert . -butylat in 20ml t- Butanol versetzt. Die anfangs leicht gelbliche Losung färbt sich dabei intensiv violett. Das Reaktionsgemisch wird zunächst bei Raumtemperatur 5 Minuten und anschließend bei 70°C für 10 Minuten gerührt. Man lasst abkühlen und rührt über Nacht bei Raumtemperatur weiter. Zur Aufarbeitung neutralisiert man mit konzentrierter HC1 und fugt 300ml Aqua dest. hinzu. Zu der Losung wird solange NaCl gegeben, bis die Losung gesattigt ist. Die organische Phase wird abgetrennt und die wassrige mehrmals mit EtOAc nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgS04 getrocknet. Nachdem das Trockenmittel abfiltriert und das Losungsmittel abgezogen worden ist, wird der Ruckstand in etwas heißem EtOAc aufgenommen, mit
100ml Petrolether uberschichtet und zum Auskπstallisie- ren über Nacht m den Tiefkuhlschrank gestellt. Der Petrolether wird abdekantiert, der Ruckstand mit wenigen Tropfen Toluol verdünnt und auf eine Kieselgelsaule auf- getragen. Als Laufmittel dient Toluol/EtOAc (5:1), die Polarität des Laufmittels kann bei nicht ausreichender Trennleistung wahrend der Eluierung auf bis zu 3:1 gesteigert werden. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und das Losungsmittel abdestilliert . Die Reaktion ergab das reine Produkt in einer Ausbeute von 10.6g (50%). Rf-Wert (SilicaβO, Laufmittel Toluol/EtOAc 8:1) = 0,36
b) Darstellung von 2- (2, 6-Dιnιtrophenyl) ethoxythio- carbonylchloπd
In einem ausgeheizten, mit Argon befluteten und mit einem Septum versehenen Rundkolben werden 400μl Thiophosgen in 2.5ml absolutem THF vorgelegt, auf 0°C gek hlt und langsam mit einer Losung von lg 2- (2, 6-Dιnιtrophenyl) ethanol in 7.5ml absolutem THF versetzt. Man lasst 20 Minuten unter Eiskuhlung und anschließend 13/4h bei Raumtemperatur rühren und zieht ein Kontroll-DC (Laufmittel: Chloroform) . Die trübe Losung wird über Celite abflltπert und der Filterkuchen nochmals mit THF nachgewaschen. Nachdem das Losungsmittel abgezogen wurde, bleibt ein tiefbrauner öliger Ruckstand, der im Vakuum weiter getrocknet wird und direkt unter der Annahme einer 100%ιgen Umsetzung mit 2 Λ-Desoxythymιdιn umgesetzt wird.
c) Darstellung von 5 ■- (2- (2, 6-Dιnιtrophenyl) ethoxythio- carbonyl) thymidm
583 mg 2 Λ-Desoxythymιdιn wird dreimal mit je 1,5ml absolutem Pyridin koevaporiert , m 5ml absolutem Pyπdm aufgenommen und mittels eines Isopropanol/N2~Bades auf -50°C gekühlt. Eine Losung von lg des Thiocarbonylchloπds in absolutem Methylenchlorid wird langsam zugetropft, die
Temperatur darf dabei nicht über -20 °C ansteigen. Über Nacht wird bei Raumtemperatur weitergerührt. Eine DC- Kontrolle (Laufmittel Dichlormethan/Methanol = 100:5) zeigt einen deutlichen Produktspot, woraufhin die Reakti- on abgebrochen wurde. Zur Aufarbeitung wird der Kolbeninhalt mit 50ml Dichlormethan in einen Schütteltrichter ü- berführt und mit 50ml Aqua dest. gewaschen. Die wässrige Phase wird mit dreimal mit jeweils 50ml Methylenchorid nachgewaschen, die vereinigten organischen Phasen über MgS04 getrocknet. Das bis zur Trockne eingeengte Rohprodukt wird in Dichlormethan/Methanol (2:1) aufgenommen auf eine Kieselgelsäule aufgetragen, als Laufmittel dient zunächst CH2Cl2/Me0H = 100:5, der MeOH-Gradient kann zum Ende der Eluierung auf 100:7 gesteigert werden. Die Reak- tion ergab das Produkt in einer Ausbeute von 363mg (30%) als hellbraunes Pulver. Rf-Wert (Silica60, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) = 0,88
Beispiel 2:
5 λ-0- (2- (2-Nitrophenyl) propoxythiocarbonyl) thymidin
a) Darstellung von 2- (2-Nitrophenyl) propanol
In einem ausgeheizten und mit Argon befluteten Rundkolben werden 3,02g (2,69ml)
2-Nitroethylbenzol und 600mg Paraformaldehyd in 10ml DMSO vorgelegt und tropfenweise mit einer Lösung von 360mg Ka- lium-t-Butylat in 4ml t-Butanol versetzt. Nach beendeter Zugabe rührt man 15 Minuten bei Raumtemperatur und er- hitzt anschließend für 13/4h auf 70°C. Nachdem die Lösung abgekühlt ist, wird diese mit EtOAc in einen Schütteltrichter überführt und mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wird zweimal mit EtOAc nachgewaschen, die vereinigten organischen Phasen über MgS04 getrocknet. Das Rohprodukt wird durch Säulenchroma- togrphie aufgereinigt . Als Laufmittel dient Toluol/EtOAc
(8:1), der Gradient kann zum Ende der Chromatographie auf 6:1 gesteigert werden. Das Produkt wird erst sehr spät eluiert und schmiert über einen weiten Bereich auf der Säule. Die Reaktion lieferte das Reinprodukt in einer Ausbeu-te von 2,06g (50%) als rötliches Öl. Rf-Wert (Si- lica60, Laufmittel Toluol/EtOAc 8:1) = 0,28
b) 2- (2-Nitrophenyl) propoxythiocarbonylchlorid
In einem ausgeheizten, mit Argon befluteten und mit Sep- turn versehenden Rundkolben werden 754ml Thiophosgen in
15ml absolutem THF vorgelegt und tropfenweise unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1,5g des Alkohols und 1,536g (1,115ml) Triethylamin in 15ml THF versetzt. Man rührt eine Stunde unter Eiskühlung sowie eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Die Lösung wird über Celite filtriert und der Filterkuchen mit THF nachgewaschen. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer abdestilliert und der Rückstand bei -20°C gelagert. Die Reaktion liefert das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 2,09g (97%) als hellbraunes Öl.
c) Darstellung von 5 '-0- (2- (2-Nitrophenyl) propoxythiocar- bonyl) thymidin
1.48g 2 --Desoxythymidin werden dreimal mit jeweils 15ml absolutem Pyridin koevaporiert , in weiteren 15ml Pyridin aufgenommen und anschließend mittels eines Isopropa- nol/N2~Kältebades auf -60 °C abgekühlt. Eine Lösung von 2,09g Thiocarbonylchlorids in 20 ml absolutem Dichlor- methan wird langsam zugespritzt, die Lösung wird zunächst für 6 Stunden bei -60 °C und anschließend über Nacht bei
Raumtemperatur weitergerührt. Eine DC-Kontrolle (Laufmittel Dichlormethan/Methanol = 9:1) zeigt einen deutlichen Produktspot, woraufhin die Reaktion abgebrochen wurde. Zur Aufarbeitung wird der Kolbeninhalt mit 50ml Dichlor- methan in einen Schütteltrichter überführt und mit 50ml
Aqua dest. gewaschen. Die wässrige Phase wird dreimal mit
jeweils 50ml Dichlormethan nachgewaschen, die vereinigten organischen Phasen über Na2S04 getrocknet. Zur Reinigung wird das Rohprodukt in etwas Dichlormethan/Methanol aufgenommen und auf eine Kieselgelsäule aufgetragen. Als Laufmittel dient zunächst Dichlormethan/Methanol = 100:1, der MeOH-Gradient kann zum Ende der Eluierung auf 100:4 gesteigert werden. Die Reaktion ergab das Produkt in einer Ausbeute von 937mg (25%) als hellbraunen Schaum. Rf- Wert (SilicaδO, Laufmittel CH2Cl2/MeOH 9:1) = 0,89
Beispiel 3: Abspaltung der Schutzgruppe
Zersetzung von 5 ' -0- (2- (2-Nitrophenyl) ethoxythiocarbo- nyl)thymidin durch Bestrahlung mit UV-Licht
Zur Untersuchung der Zersetzungsgeschwindigkeit von 5 ' -O- (2- (2-Nitrophenyl) -ethoxythiocarbonyl) thymidin wird 1 mg der Verbindung eingewogen, in 1ml Methanol gelöst und in eine Quarzglasküvette (Durchlässigkeit im Wellenlängenbereich von 200nm - 2500nm, Schichtdicke lern) gefüllt. Die Bestrahlung erfolgt durch eine Quecksilberdampflampe der Firma ORIEL Instruments, Model 66057 (Leistung 250 W) . Um ein übermäßiges Aufheizen der Küvette zu vermeiden, wird ein mit Wasser gefülltes IR-Filter vorgeschaltet. Die Küvette wird in einer Entfernung von etwa 20cm von der Lampenoptik in den Strahlengang gebracht. Im Abstand von je einer halben Minute werden der Lösung lOμl entnommen und mittels HPLC analysiert. Die Messwerte sind in Figur 1 dargestellt.
Claims
Patentansprüche
Nucleosidderivate der allgemeinen Formel I
worin
Ri eine Nucleobase oder eine mit mindestens einer
Schutzgruppe versehene Nucleobase darstellt,
R2 ein H-Atom oder eine Diisopropylamino- (2- cyanoethoxy) -phosphinyl-Gruppe der Formel IV
bedeutet,
R3 ein H-Atom oder ein Alkylrest mit bis zu 4 C- Atomen ist,
R4 ein H-Atom, eine Nitrogruppe oder einen Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen darstellt,
R5 und R6 unabhängig voneinander ein H-Atom, ein Alkylrest mit bis zu 4 C-Atomen oder ein Alkoxyrest mit bis zu 4 C-Atomen bedeuten oder zusammen eine Methy- lendioxygruppe darstellen,
R7 ein H-Atom oder ein Alkylrest mit bis zu 4 C- Atomen ist.
Nucleosidderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
Ri Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder Hypo- xanthin ist, welche gegebenenfalls eine Schutzgruppe tragen.
Nucleosidderivate gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
R3 ein H-Atom, eine Methyl- oder eine Ethylgruppe ist .
Nucleosidderivate gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R4 ein H-Atom , eine Nitrogruppe oder eine Methylgruppe ist.
Nucleosidderivate gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R5 und Re unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine Methyl-, Ethyl-, Methoxy- oder Ethoxygruppe darstellen oder zusammen eine Methylendioxygruppe bilden.
Verfahren zur Herstellung eines Nucleosidderivats der allgemeinen Formel I
worin die Reste Rχ r R2, R3, R4, R5, R6 und R7 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, wobei man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel II
worin die Reste R3, R4, R5, R6 und R7 sowie n die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, mit Thiophosgen umsetzt und die so erhaltenen Thio- carbonylchloride mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III
worin die Reste Ri und R2 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, umsetzt .
Verwendung der Nucleosidderivate gemäß Anspruch 1 zur automatischen Synthese von Oligonucleotiden.
Kit zur automatischen Synthese von Oligonucleotiden umfassend mindestens ein Nucleosidderivat gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Nucle- osidderivaten gemäß Anspruch 1 und Reagenz- und Hilfsstoffen sowie Lösemitteln und einer Arbeitsanweisung.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19938092 | 1999-08-12 | ||
DE19938092A DE19938092A1 (de) | 1999-08-12 | 1999-08-12 | Nucleosidderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
PCT/DE2000/002755 WO2001012642A2 (de) | 1999-08-12 | 2000-08-10 | Nucleosidderivate und verfahren zu deren herstellung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EP1325016A2 true EP1325016A2 (de) | 2003-07-09 |
Family
ID=7918075
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EP00962214A Withdrawn EP1325016A2 (de) | 1999-08-12 | 2000-08-10 | Nucleosidderivate und verfahren zu deren herstellung |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1325016A2 (de) |
AU (1) | AU7402800A (de) |
DE (1) | DE19938092A1 (de) |
WO (1) | WO2001012642A2 (de) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10133779A1 (de) * | 2001-07-16 | 2003-02-06 | Chemogenix Gmbh | Multimerpolynukleotidsynthese |
DE10209203A1 (de) | 2002-03-04 | 2003-09-25 | Ulrich Steiner | Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus chemischen Verbindungen |
DE10247790A1 (de) | 2002-10-14 | 2004-04-22 | Chemogenix Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotidkonjugaten |
US7759513B2 (en) * | 2003-02-21 | 2010-07-20 | Nigu Chemie Gmbh | Photolabile protective groups for improved processes to prepare oligonucleotide arrays |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU5449094A (en) * | 1992-11-02 | 1994-05-24 | Affymax Technologies N.V. | Novel photoreactive protecting groups |
-
1999
- 1999-08-12 DE DE19938092A patent/DE19938092A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-08-10 AU AU74028/00A patent/AU7402800A/en not_active Abandoned
- 2000-08-10 WO PCT/DE2000/002755 patent/WO2001012642A2/de not_active Application Discontinuation
- 2000-08-10 EP EP00962214A patent/EP1325016A2/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
See references of WO0112642A3 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU7402800A (en) | 2001-03-13 |
DE19938092A1 (de) | 2001-02-22 |
WO2001012642A2 (de) | 2001-02-22 |
WO2001012642A3 (de) | 2001-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69924930T2 (de) | Synthese von Oligonukleotiden | |
EP0524997B1 (de) | 2'-o-alkylnukleotide sowie polymere, die solche nukleotide enthalten | |
EP0797580B1 (de) | Nucleosid-derivate mit photolabilen schutzgruppen | |
EP0152459A1 (de) | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden. | |
EP0563010B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Nukleosiden | |
EP0661291B1 (de) | Festphasensynthese von Oligoribonucleotiden | |
EP0195277B1 (de) | Verfahren und Mittel zur Phosphorylierung | |
Damha et al. | Synthesis and spectroscopic analysis of branched RNA fragments: messenger RNA splicing intermediates | |
WO1990010011A1 (de) | Verwendung von 2-tert.-alkylimino-2-di-c1-4-alkylamino-1,3-di-c1-3-alkyl-perhydro-1,3,2-diazaphosphorin für o-substituierungsreaktionen von ribonukleosiden | |
DE60103145T2 (de) | Verfahren zur herstellung von phoshphorothioate triestere | |
EP0901501B1 (de) | Nucleosid-derivate mit photolabilen schutzgruppen | |
DE112004000265T5 (de) | Neuartige photolabile Schutzgruppen für verbesserte Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotid-Arrays | |
DE4213703A1 (de) | Fluoreszenzmarkierte Verbindungen, ihre Herstellung und Verwendung | |
EP1212338B1 (de) | Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen | |
DE60109047T2 (de) | Synthone zur herstellung von oligonukleotiden | |
WO2001012642A2 (de) | Nucleosidderivate und verfahren zu deren herstellung | |
Bergmann et al. | Nucleotides. Part XLI. The 2‐dansylethoxycarbonyl ( 2‐{[5‐(dimethylamino) naphthalen‐1‐yl] sulfonyl} ethoxycarbonyl; dnseoc) group for protection of the 5′‐hydroxy function in oligodeoxyribonucleotide synthesis | |
DE19815901A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden | |
WO2003004510A1 (de) | Zweistufige schutzgruppen für die synthese von biopolymeren | |
DE3928900A1 (de) | Neue nucleotidderivate, ihre herstellung und ihre verwendung | |
WO2001032671A1 (de) | Nucleosid-derivate mit photolabilen schutzgruppen | |
DE102004019098A1 (de) | Photolabile Schutzgruppen | |
EP1311516A1 (de) | Neue amiditderivate zur synthese von polymeren auf oberflächen | |
DE2426279A1 (de) | Derivate von hydrazinozuckern | |
Matulic‐Adamic et al. | A Practical Synthesis of 3′‐Thioguanosine and of Its 3′‐Phosphoramidothioite (a Thiophosphoramidite) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
GRAP | Despatch of communication of intention to grant a patent |
Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1 |
|
17P | Request for examination filed |
Effective date: 20020517 |
|
AK | Designated contracting states |
Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE |
|
AX | Request for extension of the european patent |
Extension state: AL LT LV MK RO SI |
|
RTI1 | Title (correction) |
Free format text: NUCLEOSIDE DERIVATIVES AND A METHOD FOR PRODUCING THE SAME |
|
STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 20031118 |