EP1315804A2 - Neue mmp-2-derivate als inhibitoren des integrins alpha v beta 3 - Google Patents

Neue mmp-2-derivate als inhibitoren des integrins alpha v beta 3

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Publication number
EP1315804A2
EP1315804A2 EP01980289A EP01980289A EP1315804A2 EP 1315804 A2 EP1315804 A2 EP 1315804A2 EP 01980289 A EP01980289 A EP 01980289A EP 01980289 A EP01980289 A EP 01980289A EP 1315804 A2 EP1315804 A2 EP 1315804A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mmp
amino acids
peptide fragment
physiologically acceptable
human pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01980289A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alfred Jonczyk
Beate Diefenbach
Ulrich Groth
Gunther Zischinsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1315804A2 publication Critical patent/EP1315804A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Definitions

  • the invention relates to novel compounds of the formula I.
  • Amino acids A alkyl with 1-10 C atoms
  • the primary amino groups can also be provided with conventional amino protecting groups, and their physiologically acceptable salts and solvates.
  • the invention was based on the task of finding new compounds with valuable properties, in particular those which can be used for the production of medicaments.
  • the compounds of the formula I and their salts have very valuable pharmacological properties with good tolerability. Above all, they act as integrin inhibitors, in particular the interactions of the ⁇ y-integrin receptors with ligands, e.g.
  • the compounds according to the invention are ligands in particular of
  • Integrins ⁇ ß 3 which do not contain the sequence RGD and were derived from the C-terminal fragment PEX of the matrix metalloproteinase 2 (MMP-2).
  • MMP-2 is a matrix-degrading enzyme that facilitates cell migration in invasive processes, e.g. in tumor metastasis and angiogenesis.
  • MMPs are secreted as inactive proenzymes ("latent enzyme", “zymogen”), so enzymatically inactive Pro-MMP-2 is also known:
  • MMPs allow tumor cell invasion and metastasis through at least 3 mechanisms. They remove the physical barrier by breaking down the ECM, they modulate cell adhesion since the cells have to adhere to the ECM but have to break bonds to the ECM again, and they produce other biologically active protein fragments by breaking down proteins.
  • invadopodia and lamellipodia on the migration front, which mediate contact with the underlying extracellular matrix (ECM), have different expression and localization of MT1-MMP, MMP-2, and TIMP-2.
  • ECM extracellular matrix
  • Pro-MMP-2 and MT1-MMP are responsible for the dismantling of the ECM, since MMP activation takes place here.
  • lamellipodia have a similar structure, there is no ECM degradation here, since they are easily accessible to circulating inhibitors such as TIMP-2 on the cellular periphery. It was developed by Chen-WT et al. in Ann-N-Y-Acad-Sci. 1999 Jun 30; 878: 361-71 showed that TIMP-2 with MMP-2 and MT1-MMP is colocalized on lamellipodia but not on Invadopodia. The authors Nakahara-H; et al. proc
  • MMP-2 occurs in normal and diseased human joints:
  • Carcinoma was developed by Davidson-B et al. in Gynecol-Oncol. 1999 Jun; 73 (3):
  • MMP-2 and its activation play a role in neointima formation in restenosis: Wang-H; Keizer-JA J-Vasc-Res. 1998 Jan-Feb; 35 (1): 45-
  • MMP-2 modulates glioma adhesion and migration: Deryugina-El; et al. J Cell Sci. 1997 Oct; 110 (Pt 19): 2473-82.
  • the compounds are particularly effective in the case of the integrins' ⁇ vß 3 and vßs-
  • the compounds are particularly effective as adhesion receptor antagonists for the receptor ⁇ vß ß .
  • This effect can be demonstrated, for example, by the method described by B. Diefenbach et al. in Biology of Vitronectins and Their Receptors, Eds. KT Preissner et al., Exerpta Medica, Interntl. Congress Series 1042, Elsevier Sei. Publishers 1993, p. 149-156 is described.
  • the compounds of the formula I according to the invention can therefore be used as active pharmaceutical ingredients, in particular for the treatment of tumor diseases, osteoporoses and other osteolytic diseases and for the suppression of angiogenesis.
  • micro-aggregates microthrombi
  • the spread of tumor cells from a local tumor into the vascular system takes place through the formation of micro-aggregates (microthrombi) through the interaction of the tumor cells with platelets.
  • the tumor cells are shielded by the protection in the micro-aggregate and are not recognized by the cells of the immune system.
  • the micro-aggregates can attach themselves to the vessel walls, which facilitates further penetration of tumor cells into the tissue. Since the formation of the microthrombi is mediated by fibrinogen binding to the fibrinogen receptors on activated platelets, the GPIIb / llla antagonists are considered to be effective metastasis inhibitors.
  • Platelets also bind other adhesive proteins, such as vitonectin, collagen and laminin, to the corresponding receptors on the surface of various cell types. In particular, they prevent the formation of platelet thrombi and can therefore be used to treat thrombosis, apoplexy, heart attack, inflammation and arteriosclerosis.
  • adhesive proteins such as vitonectin, collagen and laminin
  • the properties of the compounds can also be demonstrated by methods which are described in EP-A1-0462 960.
  • the inhibition of fibrinogen binding to the fibrinogen receptor can be demonstrated by the method specified in EP-A1-0 381 033.
  • the antiplatelet effect can be demonstrated in vitro by the method of Born (Nature 4832, 927-929, 1962).
  • the bone resorption can be inhibited by the compounds according to the invention with the aid of an osteoclast absorption test analogous to WO 95/32710.
  • Matrix metalloproteinase 2 is a member of the zinc-dependent endoprotease family, which are secreted as pro-enzymes, latent MMPs or zymogens and for the degradation of extracellular matrix proteins and other proteins are responsible to enable cell migration and invasion.
  • the MMPs play a role in physiological as well as pathological situations, in embryonic development, in inflammation, wound healing, tumor cell invasion and metastasis. Inhibitors of the enzymatic
  • the enzyme cleaves various types of collagen, elastin, fibronectin and laminin. Binding to collagen takes place by means of 3 repeat units homologous to fibronectin type II modules, which are inserted into the catalytic domain near the active site.
  • CTD C-Terminal Domain
  • PEX Cheresh et al.
  • Goldberg has described the amino acid sequence of Pro-MMP-2 (72 kDa) in US Pat. No. 4,923,818; the complex with TIMP-2 is documented by Goldberg in EP 404,750.
  • Soluble Pro-MMP-2 is bound to cell surfaces and is there by the membrane-bound enzyme MT1-MMP by proteolysis of the ProFragmentes in position Asn66-Leu67 in the first step and subsequent MT1-MMP-independent digestion at position Asn109-Tyr110 activated. This activation is not possible if the C-terminus of Pro-MMP-2 is missing. Possible binding partners are MT1-MMP, integrin ⁇ v ß3 and Fetuin.
  • WO 98/12309 Washington University St. Louis, describes binding sequences from CTD (PEX) to TIMP-2. It is mentioned that the addition of an excess of TIMP-2 (but not TIMP-1) or recombinant CTD (PEX) suppresses the activation of Pro-MMP-2 on the cell surface.
  • the invention accordingly relates to compounds of the formula I according to claim 1 and / or their physiologically acceptable salts for the preparation of a medicament for use as integrin inhibitors.
  • the invention relates in particular to compounds of the formula I according to Claim 1 and / or their harmless salts for the production of a medicament for combating pathologically angiogenic diseases, tumors, osteoporosis, inflammation and infections.
  • the compounds of formula I can be used as active pharmaceutical ingredients in human and veterinary medicine, for the prophylaxis and / or therapy of thrombosis, myocardial infarction, arteriosclerosis, inflammation, apoplexy, angina pectoris, tumor diseases, osteolytic diseases such as osteoporosis, hypercalcaemia, pathologically angiogenic diseases such as B.
  • inflammation ophthalmic diseases, diabetic retinopathy, macular degeneration, myopia, ocular histoplasmosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, rubeotic glaucoma, ulcerative colitis, Crohn's disease, atherosclerosis, psoriasis, restenosis after angioplasty, infection, with infection, viral infection acute kidney failure and wound healing to support the healing processes.
  • the compounds of formula I can be used as antimicrobial substances in operations where biomaterials, implants, catheters or pacemakers are used. They have an antiseptic effect.
  • the effectiveness of the antimicrobial activity can be by P.Valentin-Weigund et al., in Infection and Immunity, 2851-2855 (1988).
  • the invention also relates to the hydrates and solvates, e.g. Alcoholates, these compounds.
  • the invention furthermore relates to a process for the preparation of compounds of the formula I according to claim 1 and their salts, characterized in that a compound of the formula I is liberated from one of its functional derivatives by treatment with a solvolysing, reducing or hydrogenolysing agent, and / or converts a base or acid of the formula I into one of its salts.
  • the compounds of the formula I can have one or more chiral centers and can therefore occur in several stereoisomeric forms. All of these forms (e.g. D and L forms) and their mixtures (e.g. the DL forms) are included in Formula I. So-called prodrug derivatives are also included in the compounds according to the invention, i. H. with z. B. alkyl or acyl groups, sugars or oligopeptides modified compounds of formula I, which are quickly cleaved in the organism to the active compounds of the invention.
  • Trt trityl (triphenylmethyl).
  • MMP-2 The sequence of human Pro-M P-2 (MMP-2) taken from publicly available databases (e.g. available from www.expasy.ch) is as follows:
  • the C-terminal, hemopexin-like region also known in the literature as PEX, from position 466-660 is marked dark.
  • the integrin ⁇ v ⁇ 3 binding peptide sequences according to the invention are underlined.
  • A is alkyl and has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms and is preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl or tert.
  • Butyl also for pentyl, 1-, 2- or 3-methylbutyl, 1,1-, 1, 2- or 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, 1-, 2-, 3- or 4 - methylpentyl, 1, 1-, 1, 2-, 1, 3-, 2,2-, 2,3- or 3,3-dimethylbutyl, 1- or
  • 2-ethylbutyl 1-ethyl-1-methylpropyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, 1, 1, 2-, 1, 2,2-trimethylpropyl, heptyl, octyl, nonyl or decyl, undecyl.
  • A also means alkyl substituted by halogen, preferably CF 3 .
  • Acyl means alkanoyl with 1-10 C atoms, preferably e.g. Formyl, acetyl, propionyl or butyryl, further e.g. Benzoyl.
  • Amino protecting group preferably means formyl, acetyl, propionyl, butyryl, phenylacetyl, benzoyl, toluyl, POA, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, BOG, 2-iodoethoxycarbonyl, CBZ ("carbobenzoxy"), 4-methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC, Mtr or benzyl.
  • the invention relates in particular to those compounds of the formula I in which at least one of the radicals mentioned has one of the preferred meanings indicated above.
  • Some preferred groups of compounds can be expressed by the following sub-formulas la to le, which correspond to the formula I and in which the radicals not specified have the meaning given for the formula I, but in which
  • Amino acids selected from the peptide sequence of human Pro-MMP-2;
  • Amino acids selected from the peptide sequence of human Pro-MMP-2,
  • X H acyl or a peptide fragment with 1 to 20 amino acids, selected from the peptide sequence of human Pro-MMP-2,
  • Y is a peptide fragment selected from the sequence region 489-497 and / or 570-585 and / or 588-597 of human Pro-MMP-2,
  • Amino acids selected from the peptide sequence of human Pro-MMP-2, Y a peptide fragment selected from the sequence range 489-497 and / or 570-585 and / or 588 597 of human Pro-MMP-2,
  • Z is OH, NH 2 , NHA, NA 2 or Cys
  • the primary amino groups can also be provided with conventional amino protecting groups, and their physiologically acceptable salts and solvates.
  • the peptides of the C-terminal sequence of MMP-2 were synthesized as fragments of 8 with 2 amino acid overlaps on paper in an Fmoc strategy.
  • the quality of the synthesis was assessed using an incident light / fluorescence reader from SLT Tecan and the quantity of the Fmoc signal was evaluated after coupling steps (much fluorescence) and after splitting steps (no fluorescence).
  • These peptide-loaded papers were incubated with fluorescence-labeled integrin ⁇ v ⁇ 3 , washed and evaluated with an incident light fluorescence reader from SLT-Tecan.
  • the peptide sequences of the positive “SPOTs” were prepared conventionally on the resin in separate syntheses and thereby labeled with a C-terminal cysteine.
  • the purified, isolated cysteine peptides were tested in a covalent binding test for binding of biotinylated integrin ⁇ v ⁇ 3 using an anti-biotin / phosphatase Reaction checked, the v ß 3 -binding, RGD-independent activity was confirmed.Of the active compounds, 2 peptides are in a consecutive sequence which is derived from the known X-ray structure of the MMP-2 C-terminus the surface of PEX.
  • the compounds according to the invention prepared by way of example were produced in accordance with the prior art in a Milligen 9050 automatic synthesizer of polystyrene.
  • the process can be understood by a specialist on the basis of textbook knowledge, such as in the appendix to the Novabiochem To find catalog.
  • Chlorine-trityl (o-CI) anchors were used.
  • Fmoc-protected amino acids with acid-labile side protection were coupled.
  • the side-protected derivatives Fmoc-Ser (But), Thr (But),
  • the starting materials can also be formed in situ, so that they are not isolated from the reaction mixture, but instead are immediately reacted further to give the compounds of the formula I.
  • Compounds of formula I can preferably be obtained by liberating compounds of formula I from one of their functional derivatives by treatment with a solvolysing or hydrogenolysing agent.
  • Preferred starting materials for solvolysis or hydrogenolysis are those which otherwise correspond to the formula I, but instead of one or more free amino and / or hydroxyl groups contain corresponding protected amino and / or hydroxyl groups, preferably those which instead of an H atom, which is connected to an N atom carry an amino protective group, in particular those which carry an R'-N group instead of an HN group, in which R 'represents an amino protective group, and / or those which have one instead of the H atom hydroxy carry a hydroxyl protective group, for example those which correspond to the formula I, but instead of a group -COOH carry a group -COOR "in which R" denotes a hydroxyl protective group.
  • amino protecting group is generally known and refers to groups which are suitable for protecting (blocking) an amino group from chemical reactions, but which are easily removable after the desired chemical reaction has been carried out at other locations in the molecule. Unsubstituted or substituted acyl, aryl, aralkoxymethyl or aralkyl groups are particularly typical of such groups. Since the amino protective groups are removed after the desired reaction (or reaction sequence), their type and size is otherwise not critical; however, those with 1-20, in particular 1-8, carbon atoms are preferred.
  • acyl group is to be understood in the broadest sense in connection with the present process.
  • acyl groups derived from aliphatic, araliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic acids or sulfonic acids and, in particular, alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl and especially aralkoxycarbonyl groups.
  • acyl groups are formyl or alkanoyl such as acetyl, propionyl, butyryl; Aralkanoyl such as phenylacetyl; Aroyl such as benzoyl or toluyl; Aryloxyalkanoyl such as POA; Alkoxycarbonyl such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, BOG, 2-iodoethoxycarbonyl; Aralkyloxycarbonyl such as CBZ ("carbobenzoxy"), 4-methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC; Arylsulfonyl such as Mtr.
  • Preferred amino protective groups are BOC and Mtr, furthermore CBZ, Fmoc, benzyl, formyl and acetyl.
  • the amino protective group is split off, depending on the protective group used, e.g. B. with strong acids, suitably with TFA or perchloric acid, but also with other strong inorganic acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid, strong organic carboxylic acids such as Trichloroacetic acid or sulfonic acids such as benzene or p-toluenesulfonic acid.
  • strong acids suitably with TFA or perchloric acid
  • other strong inorganic acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid
  • strong organic carboxylic acids such as Trichloroacetic acid or sulfonic acids
  • benzene or p-toluenesulfonic acid strong organic carboxylic acids
  • the presence of an additional inert solvent is possible, but not always necessary.
  • Suitable inert solvents are preferably organic, for example carboxylic acids such as acetic acid, ethers such as tetrahydrofuran or dioxane, amides such as DMF, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, and also alcohols such as methanol, ethanol or isopropanol, and water. Mixtures of the abovementioned solvents are also suitable. TFA is preferably used in excess without the addition of another solvent, perchloric acid in the form of a mixture of acetic acid and 70% perchloric acid in a ratio of 9: 1.
  • the reaction temperatures for the cleavage are advantageously between about 0 and about 50 °, preferably between 15 and 30 ° (room temperature).
  • the groups BOC, OBut, Pmc, Pbf and Mtr can e.g. B. preferably with TFA in dichloromethane or with about 3 to 5N HCl in dioxane at 15-30 °, the FMOC group with an about 5 to 50% solution of sec. Amines such as dimethylamine, diethylamine or piperidine in DMF at 15-30 °.
  • Hydrogenolytically removable protective groups can e.g. B. by treatment with hydrogen in the presence of a catalyst (z. B. a noble metal catalyst such as palladium, advantageously on a support such as coal).
  • a catalyst z. B. a noble metal catalyst such as palladium, advantageously on a support such as coal.
  • Suitable solvents are the above, especially z. B. alcohols such as
  • Methanol or ethanol or amides such as DMF Methanol or ethanol or amides such as DMF.
  • the hydrogenolysis is generally carried out at temperatures between about 0 and 100 ° and pressures between about 1 and 200 bar, preferably at 20-30 ° and 1-10 bar.
  • Hydrogenolysis of the CBZ group succeeds e.g. B. good on 5 to 10% Pd / C in methanol or with ammonium formate (instead of hydrogen) on Pd / C in methanol / DMF at 20-30 °.
  • Suitable inert solvents are, for example, hydrocarbons such as hexane, petroleum ether, benzene, toluene or xylene; chlorinated hydrocarbons such as trichlorethylene, 1, 2-dichloroethane, carbon tetrachloride, chloroform or dichloromethane; Alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol or tert-butanol; Ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF) or dioxane; Glycol ethers such as ethylene glycol monomethyl or monoethyl ether (methyl glycol or ethyl glycol), ethylene glycol dimethyl ether (diglyme); Ketones such as acetone or butanone; Amides such as acetamide, dimethylacetamide or dimethylformamide (DMF); Ni
  • estonify an ester of the formula I is conveniently done by solvolysis or hydrogenolysis, as indicated above, e.g. with LioH in methanol, NaOH or KOH in dioxane water at temperatures between 0 and 60 ° C, preferably between 10 and 40 ° C.
  • a base of the formula I can be converted into the associated acid addition salt using an acid, for example by reacting equivalent amounts of the base and the acid in an inert solvent such as ethanol and subsequent evaporation.
  • an inert solvent such as ethanol and subsequent evaporation.
  • acids that provide physiologically acceptable salts are suitable for this implementation.
  • inorganic acids can be used, for example sulfuric acid, nitric acid, hydrohalic acids such as hydrochloric acid or hydrobromic acid, phosphoric acids such as orthophosphoric acid, sulfamic acid, and also organic acids, in particular aliphatic, alicyclic, aromatic, heterocyclic, mono- or polycarbonate, sulfone - or sulfuric acids, for example formic acid, acetic acid, propionic acid, pivalic acid, diethyl acetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, citric acid, gluconic acid, Ascorbic acid, nicotinic acid, isonicotinic acid, methane or ethanesulfonic acid, ethanedisulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic
  • an acid of the formula I can be converted into one of its physiologically acceptable metal or ammonium salts by reaction with a base.
  • Suitable salts are in particular the sodium, potassium, magnesium, calcium and ammonium salts, and also substituted ammonium salts, e.g. B. the dimethyl, diethyl or diisopropyl ammonium salts, monoethanol, diethanol or diisopropylammonium salts, cyclohexyl, dicyclohexylammonium salts, di- [benzylethylenediammonium salts, z. B. salts with arginine or lysine.
  • the compounds of the formula I contain one or more chiral centers and can therefore be present in racemic or in optically active form. Racemates obtained can be separated mechanically or chemically into the enantiomers by methods known per se. Diastereomers are preferably formed from the racemic mixture by reaction with an optically active release agent. Suitable release agents are e.g. optically active acids, such as the D and L forms of tartaric acid, diacetyltartaric acid, dibenzoyltartaric acid, mandelic acid, malic acid, lactic acid or the various optically active camphorsulfonic acids such as ß-camphorsulfonic acid. Enantiomer separation using a column filled with an optically active separating agent (e.g.
  • a suitable solvent is e.g. a mixture of hexane / isopropanol / acetonitrile, e.g. in the volume ratio 82: 15: 3.
  • optically active compounds of the formula I by the methods described above by using starting materials which are already optically active.
  • the invention includes not only the compounds mentioned, but also mixtures and preparations which, in addition to these compounds according to the invention, also include other pharmacological active ingredients or
  • Contain adjuvants which can influence the primary pharmacological action of the compounds according to the invention in a desired manner. These can be used as therapeutic agents, diagnostic agents or as reagents
  • Find use They can be given to humans or animals locally or systemically, orally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, transdermally, nasally, buccally, or iontophoretically, which includes formulations in suspensions, emulsions or solutions, liposomes, ointments, pastes, biodegradable polymers or as nanoparticles, tablets, capsules or pills, granules or powder, as an aerosol for inhalation, as intranasal drops or sprays. It is also possible to combine the new products with other technologies such as surgery, radiation, diagnosis, radiotherapy, photodynamic therapy and gene therapy, as well as with other medications.
  • Such drugs can e.g. from the areas of cardiovascular,
  • Tumor agents such as angiogenesis inhibitors or cytostatics
  • Substances can be low molecular weight and high molecular weight. It can be
  • Lipids Lipids, carbohydrates or proteins. This includes cytokines,
  • Toxins fusion proteins, monoclonal antibodies and vaccines.
  • the invention accordingly relates to compounds of the formulas defined above and below and in the claims, including their physiologically acceptable salts, as medicaments, diagnostic agents or reagents.
  • these are drugs for combating diseases based on an interaction of ligands, for example of MMP-2 with the v ß 3
  • Integrin receptor based Integrin receptor based.
  • the drugs are suitable for fighting thrombosis
  • Heart attack coronary heart disease, arteriosclerosis, tumors,
  • Corresponding pharmaceutical preparations which contain at least one medicament of the formula I and, if appropriate, carriers and / or auxiliaries are also an object.
  • the invention furthermore relates to the use of the compounds according to the invention and / or their physiologically harmless
  • the invention further relates to the use of the compounds according to the invention and / or their physiologically acceptable salts and / or solvates for the manufacture of a medicament for combating diseases which are based on an interaction of a ligand, for example the matrix metalloproteinase (MMP-2) with the v ß 3 integrin receptor based. - '
  • MMP-2 matrix metalloproteinase
  • the invention furthermore relates to the use of the compounds according to the invention and / or their physiologically acceptable salts and / or solvates for the production of a medicament for combating pathological processes which are maintained or propagated by angiogenesis.
  • the invention furthermore relates to the use of the compounds according to the invention and / or their physiologically acceptable salts and / or solvates for the manufacture of a medicament for combating thromboses, heart attacks, coronary heart diseases, arteriosclerosis, tumors, osteoporosis, fibrosis, inflammation, Infections, psoriasis and to influence wound healing processes.
  • Suitable carriers are organic or inorganic substances which are suitable for enteral (e.g. oral), parenteral, topical application or for application in the form of a
  • 10 inhalation sprays are suitable and do not react with the new compounds, for example water, vegetable oils, benzyl alcohols, alkylene glycols, polyethylene glycols, glycerol triacetate, gelatin, carbohydrates such as lactose or starch, magnesium stearate, talc, petroleum jelly.
  • water vegetable oils, benzyl alcohols, alkylene glycols, polyethylene glycols, glycerol triacetate, gelatin, carbohydrates such as lactose or starch, magnesium stearate, talc, petroleum jelly.
  • ⁇ C application are used in particular tablets, pills, dragees, capsules, powders, granules, syrups, juices or drops, for rectal application positorien Sup-, for parenteral application of solutions, preferably oily or aqueous solutions, furthermore suspensions, emulsions or implants, and for topical application ointments, creams or powder.
  • solutions preferably oily or aqueous solutions, furthermore suspensions, emulsions or implants, and for topical application ointments, creams or powder.
  • 20 compounds can also be lyophilized and the resulting lyophilisates e.g. can be used for the production of injectables.
  • the specified preparations can be sterilized and / or auxiliaries such as lubricants, preservatives, stabilizers and / or wetting agents, emulsifiers.
  • Sprays can be used for the application as an inhalation spray,
  • OQ which contain the active substance either dissolved or suspended in a propellant gas or propellant gas mixture (e.g. C0 2 or chlorofluorocarbons).
  • a propellant gas or propellant gas mixture e.g. C0 2 or chlorofluorocarbons.
  • the active ingredient is expediently used in micronized form, with one or more additional physiologically tolerable ones
  • Solvents may be present, e.g. B. ethanol. inhalation solutions
  • the substances according to the invention can generally be administered in analogy to other known, commercially available preparations (for example described in US Pat. No. 4,472,305), preferably in doses between about 0.05 and 500 mg, in particular between 0.5 and 100 mg per dosage unit.
  • the daily dosage is preferably between about 0.01 and 20 mg / kg body weight.
  • the specific dose for each patient depends on a variety of factors, for example on the effectiveness of the particular compound used, on the age, body weight, general health, sex, on the diet, on the time and route of administration, on the rate of elimination, combination of drugs and severity the respective disease to which the therapy applies. Parenteral administration is preferred.
  • HPLC analyzes (retention time Rt) were carried out in the following system:
  • Trifluoroacetic acid at a flow of 1 ml / min and detection at 215 nm.
  • Production and purification of peptides according to the invention In principle, production and purification is carried out by means of the Fmoc strategy while protecting acid-labile side chains on acid-labile resins using a commercially available "continuous flow" peptide synthesizer in accordance with the information provided by Haubner et al. (J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 17703).
  • VKKKMDPGC MMP-2 (594 603) -Cys, M 1005.23;
  • LERGYPKPLTSLGLC MMP-2 (548 561) -Cys, M 1646.94;
  • KPMGPLLVC MMP-2 (502 • 509) -Cys, M 957.24;
  • AGDKFWRYNC MMP-2 (585 • 593) -Cys, M 1259.42;
  • RGYPKPLTSLC MMP-2 (550 • 559) -Cys, M 1234.5;
  • PGFPKLIAC MMP-2 (600 • 607) -Cys, M 945.19;
  • WRTVTPRDC MMP-2 (494 • 501) -Cys, M 1133.31;
  • Placenta can be cleaned as described by Smith et al. J. Biol. Chem. 263, 18726-
  • Soluble ⁇ v ß 3 is like in RJ
  • Binding test is S. Kraft et al. J. Biol. Chem. 274, 1979-1985 (1999).
  • the receptor binding test on covalently bound peptides 5 can be carried out analogously to: B. Diefenbach et al. in Biology of Vitronectins and Their Receptors; eds. KT Preissner et al. from Exerpta Medica International Congress Series 1042, Elsevier Science Publishers Amsterdam 1993, p. 149-156.
  • fluorescein-labeled integrin ⁇ vß 3 0 was used, which interacts directly with the cellulose-bound peptide. The evaluation was carried out by measuring the fluorescence.
  • BSA coated in microtiter plates was activated with sulfo-SMPB and the thiopeptides were covalently bound to it. After 5 incubations with biotinylated ⁇ vß 3 , bound receptor with alkaline-phosphatase-coupled goat anti-biotin antibody and coloring by a phosphatase substrate was detected.
  • the binding of the PEX peptides to ⁇ vß 3 is an RGD-independent binding. This was verified in a further test which was carried out analogously to 1..
  • the receptor was incubated with and without the soluble peptide cyclo- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Val). While the binding of the cyclo-RGD peptide "cyclo- (RGDfK (mercapto-propionyl))" to ⁇ vß 3 was inhibited by cyclo- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Val), the binding was of the PEX peptide AAFNWSKNKKTYIFAGC regardless of this.
  • Example A Injection glasses
  • a solution of 100 g of Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys and 5 g of disodium hydrogen phosphate is adjusted to pH 6.5 in 3 l of double-distilled water with 2 N hydrochloric acid, sterile filtered, in Injection glasses filled, lyophilized under sterile conditions and sealed sterile. Each injection jar contains 5 mg of active ingredient.
  • a mixture of 20 g of Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys is melted with 100 g of soy lecithin and 1400 g of cocoa butter, poured into molds and allowed to cool.
  • Each suppository contains 20 mg of active ingredient.
  • a solution is prepared from 1 g of Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys, 9.38 g of NaH 2 P0 4 ⁇ 2 H 2 0, 28.48 g Na 2 HP0 4 • 12 H 2 0 and 0.1 g
  • Benzalkonium chloride in 940 ml of double distilled water. It is adjusted to pH 6.8, made up to 1 I and sterilized by irradiation. This solution can be used in the form of eye drops.
  • Example D ointment
  • Example F coated tablets
  • Example E tablets are pressed, which are then coated in a conventional manner with a coating of sucrose, potato starch, talc, tragacanth and colorant.
  • a solution of 1 kg of Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys in 60 l of double-distilled water is sterile filtered, filled into ampoules, lyophilized under sterile conditions and sealed sterile. Each ampoule contains 10 mg of active ingredient.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt neuartige Verbindungen der Formel (I), welche als Liganden des Integrins alpha v beta 3 biologisch wirksam sind, worin X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren, Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 466-660 von humanem Pro-MMP-2, Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden Aminosäuren, A Alkyl mit 1-10 C-Atomen, Acyl Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen, bedeuten, wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

Description

Neue M P-2-Derivate als Inhibitoren des Integrins αvß3
Die Erfindung betrifft neuartige Verbindungen der Formel I
X-Y-Z I worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden
Aminosäuren, Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich
466 - 660 von humanem Pro-MMP-2, Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden
Aminosäuren, A Alkyl mit 1-10 C-Atomen,
Acyl Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino- schutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvollen Eigenschaften aufzufinden, insbesondere solche, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können.
Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel I und ihre Salze bei guter Verträglichkeit sehr wertvolle pharmakologische Eigenschaften besitzen. Vor allem wirken sie als Integrin-Inhibitoren, wobei sie insbesondere die Wechselwirkungen der αy-Integrin-Rezeptoren mit Liganden, z.B.
MMP-2, hemmen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Liganden insbesondere des
Integrins α ß3, die nicht die Sequenz RGD enthalten und aus dem C- terminalen Fragment PEX der Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP-2) abgeleitet wurden.
Literaturbekannt ist die Bindung von PEX an das Integrin αvßß.
MMP-2 ist ein Matrix-abbauendes Enzym, das die Zellwanderung in invasiven Prozessen erleichert, wie z.B. bei Tumormetastasierung und Angiogenese.
Es gibt zahlreiche Reviews zu Matrix-Metallo-Proteinasen, wie z.B. Birkedahl-Hansen H. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4, 197-250 (1993), Borkakoti N.Curr. Opin. Drug Descovery & Development 2,449-462 (1999), Whittaker M. et al. Chem. Rev. 99, 2735-2776 (1999), Stetler-Stevenson W.G. J. Clin. Invest. 103, 1237-1241 (1999), Siletti S. & Cheresh D.A. Fibrinolysis & Proteolysis 13, 226-238 (1999), Kleiner-DE & Stetler- Stevenson-WG in Cancer-Chemother-Pharmacol. 1999; 43 SuppI: S42-51.
MMPs werden als inaktive Proenzyme („latentes Enzym", „Zymogen") sekretiert, so ist auch enzymatisch inaktives Pro-MMP-2 bekannt:
Woessner-JF Jr FASEB-J. 1991 May; 5(8): 2145-54.
Verschiedene Arten der Aktivierung von Pro-MM P-2 zu MMP-2 sind bekannt (autokatalytische, chemische, enzymatische). Die Aktivierung durch Tumorzellen konnte mit Hilfe von Osteopontin, Bone Sialoprotein oder RGD-Peptiden erreicht werden. Hierbei wird die Rolle des C- Terminus von MMP-2 und die Formation des trimeren Komplexes aus
MT1-MMP, TIMP-2 und Pro-MMP-2 mitdiskutiert: Teti-A et al. Int-J-Cancer. 1998 Jul 3; 77(1): 82-93.
MMPs ermöglichen Tumorzellinvasion und Metastasierung durch mindestens 3 Mechanismen. Sie beseitigen die physikalische Barriere durch Abbau der ECM, sie modulieren Zelladhäsion, da die Zellen an ECM anhaften müssen, aber Bindungen zur ECM wieder brechen müssen, und sie produzieren andere biologisch aktive Proteinfragmente durch Abbau von Proteinen.
Die Inhibierung von αvßß durch den Antikörper LM609 induzierte die Aktivierung von Pro-MMP-2 von humanen Rhabdomyosarcomazellen: Kubota-S; et al. Int-J-Cancer. 1997 Jan 6; 70(1): 106-11. Die Expression von Integrinen moduliert die Expression und Sekretion von MMP-2 und das invasive Verhalten von Tumorzellen, wie von Seftor-RE. et al. in Cancer-Res. 1993 Jul 15; 53(14): 3411-5 beschrieben.
Zur Relevanz von MMPs gibt es unterschiedliche Beiträge. Eine Auswahl zeigt die Bedeutung in der Embryonalentwicklung, Kinoh-H. et al., J-Cell-
Sci. 1996 May; 109 ( Pt 5): 953-9; bei Zähnen: Heikinheimo-K; Salo-T J-
Dent-Res. 1995 May; 74(5): 1226-34; und bei der Entwicklung der Niere:
Kanwar-YS; et al. Am-J-Physiol. 1999 Dec; 277(6 Pt 2): F934-47.
Bei invasiven Zellen haben „Invadopodien" und „Lamellipodien" an der Wanderungsfront, die den Kontakt zur darunterliegenden extrazellulären Matrix (ECM) vermitteln, unterschiedliche Expression und Lokalisation von MT1-MMP, MMP-2, und TIMP-2. An den Invadopodien sind Pro-MMP-2 und MT1-MMP für den Abbau der ECM zuständig, da hier MMP- Aktivierung erfolgt. Obwohl Lamellipodien ähnlich aufgebaut sind, erfolgt hier kein ECM-Abau, da sie an der zellulären Peripherie den zirkulierenden Inhibitoren wie TIMP-2 leicht zugänglich sind. Es wurde von Chen-WT et al. in Ann-N-Y-Acad-Sci. 1999 Jun 30; 878: 361-71 gezeigt, daß TIMP-2 mit MMP-2 und MT1-MMP an Lamellipodien aber nicht an Invadopodien kolokalisiert ist. Ähnliches wird von den Autoren Nakahara-H; et al. Proc-
Natl-Acad-Sci-U-S-A. 1997 Jul 22; 94(15): 7959-64 berichtet. MMP-2 kommt in normalen und erkrankten Gelenken des Menschen vor:
Chubinskaya-S et al. Lab-Invest. 1999 Dec; 79(12): 1669-77 und wird in der Synovialmembran bei Rheumatoider Arthritis von Konttinen-Y et al.
Ann-Rheum-Dis. 1999 Nov; 58(11 ): 691-7 diskutiert.
Die klinische Relevanz von MMP-2 als prognostischer Marker beim Cervix-
Karzinom wurde von Davidson-B et al. in Gynecol-Oncol. 1999 Jun; 73(3):
372-82 aufgezeigt. MMP-2 und seine Aktivierung spielt eine Rolle bei der Neointimabildung bei Restenose: Wang-H; Keiser-JA J-Vasc-Res. 1998 Jan-Feb; 35(1): 45-
54.
MMP-2 moduliert Gliomzellanhaftung und Migration: Deryugina-El; et al. J- Cell-Sci. 1997 Oct; 110 ( Pt 19): 2473-82.
Besondere Wirksamkeit zeigen die Verbindungen im Fall der Integrine ' αvß3 und vßs- Ganz besonders wirksam sind die Verbindungen als Adhäsionsrezeptor-Antagonisten für den Rezeptor αvßß . Diese Wirkung kann z.B. nach der Methode nachgewiesen werden, wie sie von B. Diefenbach et al. in Biology of Vitronectins and Their Receptors, Eds. KT Preissner et al., Exerpta Medica, Interntl. Congress Series 1042, Elsevier Sei. Publishers 1993, p. 149-156 beschrieben wird.
Die Bindung an den Vitronektin-Rezeptor αvßß wurde für einige erfindungsgemäße Peptide experimentell bewiesen.
B. Felding-Habermann und D.A. Cheresh beschreiben in Curr. Opin. Cell. Biol. 5, 864 (1993) die Bedeutungen der Integrine als Adhäsionsrezep- toren für die unterschiedlichsten Phänomene und Krankheitsbilder, speziell in Bezug auf den Rezeptor αvß3-
Die Abhängigkeit der Entstehung von Angiogenese von der Wechselwirkung zwischen vaskulären Integrinen und extrazellulären Matrix- proteinen ist von P.C. Brooks, R.A. Clark und D.A. Cheresh in Science 264, 569-71 (1994) beschrieben. Die Möglichkeit der Inhibierung dieser Wechselwirkung und damit zum Einleiten von Apoptose (programmierter Zelltod) angiogener vaskulärer Zellen durch ein cyclisches Peptid ist von P.C. Brooks, A.M. Montgomery, M. Rosenfeld, R.A. Reisfeld, T.-Hu, G. Klier und D.A. Cheresh in Cell 79,
1157-64 (1994) beschrieben.
Der experimentelle Nachweis, daß auch die erfindungsgemäßen Verbindungen die Anheftung von lebenden Zellen auf den entsprechenden Matrixproteinen verhindern und dementsprechend auch die Anheftung von Tumorzellen an Matrixproteine verhindern, kann in einem Zelladhäsions- test erbracht werden, der analog der Methode von F. Mitjans et al., J. Cell Science 108, 2825-2838 (1995) durchgeführt wird.
P.C. Brooks et al. beschreiben in J. Clin. Invest. 96, 1815-1822 (1995) αvß3 -Antagonisten zur Krebsbekämpfung und zur Behandlung tumorinduzierter angiogener Krankheiten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können daher als Arzneimittelwirkstoffe insbesondere zur Behandlung von Tumorerkran- kungen, Osteoporosen und anderen osteolytischen Erkrankungen sowie zur Unterdrückung der Angiogenese eingesetzt werden.
Verbindungen der Formel I, die die Wechselwirkung von Integrinrezep- toren und Liganden, wie z. B. von Fibrinogen an den Fibrinogenrezeptor (Glycoprotein llb/llla) blockieren, verhindern als GPIIb/llla-Antagonisten die Ausbreitung von Tumorzellen durch Metastase. Dies wird durch folgende Beobachtungen belegt:
Die Verbreitung von Tumorzellen von einem lokalen Tumor in das vaskuläre System erfolgt durch die Bildung von Mikroaggregaten (Mikro- thromben) durch Wechselwirkung der Tumorzellen mit Blutplättchen. Die Tumorzellen sind durch den Schutz im Mikroaggregat abgeschirmt und werden von den Zellen des Immunsystems nicht erkannt. (
Die Mikroaggregate können sich an Gefäßwandungen festsetzen, wodurch ein weiteres Eindringen von Tumorzellen in das Gewebe erleichtert wird. Da die Bildung der Mikrothromben durch Fibrinogenbindung an die Fibrino- genrezeptoren auf aktivierten Blutplättchen vermittelt wird, können die GPIIb/llla-Antagonisten als wirksame Metastase-Hemmer angesehen werden.
Verbindungen der Formel I hemmen neben der Bindung von Fibrinogen, Fibronectin und des Willebrand-Faktors an den Fibrinogenrezeptor der
Blutplättchen auch die Bindung weiterer adhäsiver Proteine, wie Vitro- nectin, Kollagen und Laminin, an die entsprechenden Rezeptoren auf der Oberflache verschiedener Zelltypen. Sie verhindern insbesondere die Entstehung von Blutplättchenthromben und können daher zur Behandlung von Thrombosen, Apoplexie, Herzinfarkt, Entzündungen und Arterio- sklerose eingesetzt werden.
Die Eigenschaften der Verbindungen können auch nach Methoden nachgewiesen werden, die in der EP-A1-0462 960 beschrieben sind. Die Hemmung der Fibrinogenbindung an den Fibrinogenrezeptor kann nach der Methode nachgewiesen werden, die in der EP-A1-0 381 033 angegeben ist.
Die thrombozytenaggregationshemmende Wirkung läßt sich in vitro nach der Methode von Born (Nature 4832, 927-929, 1962) nachweisen. Die Hemmung der Knochenresorption durch die erfindungsgemäßen Verbindungen kann mit Hilfe eines Osteoclasten-Resorptionstests analog WO 95/32710 erfolgen.
Matrix Metalloproteinase 2 (MMP-2, auch Gelatinase A, GelA, 72 kDa type IV Collagenase) ist ein Mitglied der Zink-abhängigen Endoproteasen- familie, die als Pro-Enzyme, latente MMPs oder Zymogene sekretiert werden und für den Abbau extrazellulärer Matrixproteine und anderer Proteinen zuständig sind, um Zellwanderung und Invasion zu ermöglichen. Die Balance zwischen Aktivierung aus dem Pro-Enzym und der Inak- tivierung durch körpereigene Inhibitoren, wie TIMP-2, oder durch erweiterten enzymatischen Verdau, reguliert die Aktivität von MMP-2. Die MMPs spielen eine Rolle in physiologischen, wie auch pathologischen Situationen, in der Embryonalentwicklung, bei Entzündungen, Wundheilung, Tumorzellinvasion und Metastasierung. Inhibitoren der enzymatischen
Tasche, der Expression auf Zeilebene oder der Aktivierung aus dem Pro- Enzym können diagnostische und therapeutische Verwendung bei Mensch und Tier finden.
Das Enzym spaltet verschiedene Typen von Collagen, Elastin, Fibronectin und Laminin. Die Bindung an Collagen erfolgt mittels 3 zu Fibronectin Typ II Modulen homologen Wiederholungseinheiten, die in die katalytische Domäne in der Nähe der active site insertiert sind.
Der C-Terminus von MMP-2 ist in der Literatur als „C-Terminal Domain" CTD (Goldberg et al., Overall et al.) oder PEX (Cheresh et al.) bekannt.
Literatur:
Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin alpha v beta 3. Brooks-PC; Stromblad-S; Sanders-LC; von-Schalscha-TL; Aimes-RT; Stetler-Stevenson-WG; Quigley-JP; Cheresh-DA Cell. 1996 May 31 ; 85(5): 683-93
Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity. Brooks-PC; Silletti-S; von- Schalscha-TL; Friedlander-M; Cheresh-DA Cell. 1998 Feb 6; 92(3): 391- 400
In US 4,923,818 hat Goldberg die Aminosäuresequenz von Pro-MMP-2 (72 kDa) beschrieben, der Komplex mit TIMP-2 ist von Goldberg in EP 404,750 dokumentiert.
Lösliche Pro-MMP-2 wird an Zelloberflächen gebunden und wird dort durch das membranständige Enzym MT1-MMP durch Proteolyse des ProFragmentes in Position Asn66-Leu67 im ersten Schritt und folgendem MT1-MMP-unabhängigem Selbstverdau an Position Asn109-Tyr110 aktiviert. Diese Aktivierung ist nicht möglich, wenn der C-Terminus von Pro-MMP-2 fehlt. Als Bindungspartner kommen in Frage MT1-MMP, Integrin αvß3 und Fetuin.
In WO 98/12309, Washington University St. Louis, sind bindende Sequenzen von CTD (PEX) an TIMP-2 beschrieben. Es ist erwähnt, daß die Addition eines Überschusses von TIMP-2 (nicht aber TIMP-1) oder rekombinantem CTD (PEX) die Aktivierung von Pro-MMP-2 an der Zelloberfläche unterdrückt.
Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als Integrin-Inhibitoren. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und/oder ihrer unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von pathologisch angiogenen Erkrankungen, Tumoren, Osteoporose, Entzündungen und Infektionen.
Die Verbindungen der Formel I können als Arzneimittelwirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden, zur Prophylaxe und/oder Therapie von Thrombose, myocardialem Infarkt, Arteriosklerose, Entzündungen, Apoplexie, Angina pectoris, Tumorerkrankungen, osteolytischen Krankheiten wie Osteoporose, Hypercalcämie, pathologisch angiogenen Krankheiten wie z. B. Entzündungen, ophthalmologischen Krankheiten, diabetischer Retinopathie, makularer Degeneration, Myopia, okularer Histoplasmose, rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis, rubeotischem Glaukom, ulcerativer Colitis, Morbus Crohn, Atherosklerose, Psoriasis, Restenose nach Angioplastie, viraler Infektion, bakterieller Infektion, I Pilzinfektion, bei akutem Nierenversagen und bei der Wundheilung zur Unterstützung der Heilungsprozesse.
Die Verbindungen der Formel I können als antimikrobiell wirkende Substanzen bei Operationen eingesetzt werden, wo Biomaterialien, Implantate, Katheter oder Herzschrittmacher verwendet werden. Dabei wirken sie antiseptisch. Die Wirksamkeit der antimikrobiellen Aktivität kann durch das von P.Valentin-Weigund et al., in Infection and Immunity, 2851-2855 (1988) beschriebene Verfahren nachgewiesen werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch die Hydrate und Solvate, z.B. Alkoholate, dieser Verbindungen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 sowie ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel l aus einem ihrer funktioneilen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden, reduzierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt, und/oder eine Base oder Säure der Formel I in eines ihrer Salze umwandelt.
Die Verbindungen der Formel I können ein chirale oder mehrere chirale Zentren besitzen und können daher in mehreren stereoisomeren Formen auftreten. Alle diese Formen (z. B. D- und L-Formen) und deren Gemische (z. B. die DL-Formen) sind in der Formel I eingeschlossen. In die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch sogenannte Prodrug- Derivate eingeschlossen, d. h. mit z. B. Alkyl- oder Acylgruppen, Zuckern oder Oligopeptiden abgewandelte Verbindungen der Formel I, die im Organismus rasch zu den wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen gespalten werden.
Die vor- und nachstehend aufgeführten Abkürzungen stehen für:
Ac Acetyl
BOC tert.-Butoxycarbonyl
CBZ oder Z Benzyloxycarbonyl
DCCI Dicyclohexylcarbodiimid
DMF Dimethylformamid
EDCI N-Ethyl-N,N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid
Et Ethyl
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt 1 -Hydroxybenzotriazol Me Methyl
Mtr 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl-sulfonyl
HONSu N-Hydroxysuccinimid
OBut tert.-Butylester Oct Octanoyl
OMe Methylester
OEt Ethylester
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Pmc 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl POA Phenoxyacetyl
TFA Trifluoressigsäure
Trt Trityl (Triphenylmethyl).
Die vor- und nachstehend aufgeführten Abkürzungen von Aminosäure- resten stehen für die Reste folgender natürlich vorkommender Aminosäuren:
Ala, A Alanin
Asn, N Asparagin
Asp, D Asparaginsäure
Arg. R Arginin
Cys, C Cystein
Gin, Q Glutamin
Glu, E Glutaminsäure
Gly. G Glycin
His. H Histidin ' lle, I Isoleucin
Leu, L Leucin
Lys, K Lysin
Met, M Methionin
Phe, F Phenylalanin
Pro, P Prolin
Ser, S Serin
Thr. T Threonin
Trp. W Tryptophan
Tyr. Y Tyrosin Val, V Valin.
Die Sequenz von humanem Pro-M P-2 (MMP-2), entnommen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken (z.B. über www.expasy.ch erhältlich) ist wie folgt:
1 MEALMARGAL TGPLRALCLL GCLLSHAAAA PSPIIKFPGD VAPKTDKELA 51 VQYLNTFYGC PKESCMLFVL KDTLKKMQKF FGLPQTGDLD QNTIETMRKP 101 RCGNPDVANYNFFPRKPKWD KNQITYRIIG YTPDLDPETV DDAFARAFQV
151 WSDVTPLRFS RIHDGEADIM INFGRWEHGD GYPFDGKDGL LAHAFAPGTG 201 VGGDSHFDDD ELWTLGEGQV VRVKYGNADG EYCKFPFLFN GKEYNSCTDT 251 GRSDGFLWCS TTYNFEKDGK YGFCPHEALF TMGGNAEGQP CKFPFRFQGT 301 SYDSCTTEGR TDGYRWCGTT EDYDRDKKYG FCPETAMSTV GGNSEGAPCV
351 FPFTFLGNKY ESCTSAGRSD GKMWCATTAN YDDDRKWGFC PDQGYSLFLV 401 AAHEFGHAMG LEHSQDPGAL MAPIYTYTKN FRLSQDDIKG lQELYGASPD 451 IDLGTGPTPT LGPVTPEICK QDIVFDGIAQ IRGEIFFFKD RFIWRTVTPR 501 DKPMGPLLVATFWPELPEKI DAVYEAPQEE KAVFFAGNEY WIYSASTLER 551 GYPKPLTSLG LPPDVQRVDA AFNWSKNKKT YIFAGDKFWR YNEVKKKMDP 601 GFPKLIADAW NAIPDNLDAV VDLQGGGHSY FFKGAYYLKL ENQSLKSVKF 651 GSIKSDWLGC
Hierbei ist der C-terminale, Hemopexin-ähnliche, in der Literatur auch als PEX bekannte Bereich von Position 466-660 dunkel markiert. Die erfindungsgemässen Integrin αvß3 bindenden Peptidsequenzen sind unterstrichen.
Für die gesamte Erfindung gilt, daß sämtliche Reste, die mehrfach auftreten, wie z.B. A, gleich oder verschieden sein können, d.h. unabhängig voneinander sind. A ist Alkyl und hat 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atome und steht vorzugsweise für Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch für Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl, 1,1- , 1 ,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1- , 2- , 3- oder 4- Methylpentyl, 1 ,1- , 1 ,2- , 1 ,3- , 2,2- , 2,3- oder 3,3-Dimethylbutyl, 1- oder
2-Ethylbutyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1 ,1 ,2-, 1 ,2,2- Trimethylpropyl, Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl, Undecyl. A bedeutet auch durch Halogen substituiertes Alkyl, vorzugsweise CF3.
Acyl bedeutet Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen, vorzugsweise z.B. Formyl, Acetyl, Propionyl oder Butyryl, ferner z.B. Benzoyl.
Aminoschutzgruppe bedeutet vorzugsweise Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Phenylacetyl, Benzoyl, Toluyl, POA, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, BOG, 2-lodethoxycarbonyl, CBZ ("Carbobenzoxy"), 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC, Mtr oder Benzyl.
Dementsprechend sind Gegenstand der Erfindung insbesondere diejeni- gen Verbindungen der Formel I, in denen mindestens einer der genannten Reste eine der vorstehend angegebenen bevorzugten Bedeutungen hat. Einige bevorzugte Gruppen von Verbindungen können durch die folgenden Teilformeln la bis le ausgedrückt werden, die der Formel I entsprechen und worin die nicht näher bezeichneten Reste die bei der Formel I angegebene Bedeutung haben, worin jedoch
in a) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2 bedeutet;
in b) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem
Pro-MMP-2, Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis
20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2, bedeuten;
in c) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 480 - 598 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH , NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis
20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem
Pro-MMP-2 bedeuten,
in d) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 489 - 497 und/oder 570 - 585 und/oder 588 - 597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis
20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem
Pro-MMP-2, bedeuten,
in e) X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2, Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich 489 - 497 und/oder 570 - 585 und/oder 588 597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH2, NHA, NA2 oder Cys bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino- schutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
Die Peptide der C-terminalen Sequenz von MMP-2 sind als 8er Fragmente mit je 2 Aminosäuren Überlappung auf Papier in einer Fmoc-Strategie synthetisiert worden.
Die Qualität der Synthese wurde mittels eines Auflicht/Fluoreszenzlesegerätes von SLT Tecan beurteilt und so die Quantität des Fmoc-Signals nach Kupplungsschritten (viel Fluoreszenz) und nach Abspaltungsschritten (keine Fluoreszenz) ausgewertet. Diese peptidbeladenen Papiere wurden mit fluoreszenzmarkiertem Integrin αvß3 inkubiert, gewaschen und mit einem Auflicht Fluoreszenzlesegerät von SLT-Tecan ausgewertet. Die Peptidsequenzen der positiven „SPOTs" wurden in separaten Synthesen konventionell am Harz hergestellt und dabei mit einem C- terminalen Cystein markiert. Die gereinigten, isolierten Cysteinpeptide wurden in einem kovalenten Bindungstest auf Bindung von biotinyliertem Integrin αvß3 mittels einer antiBiotin/Phosphatase-Reaktion überprüft, dabei wurde die vß3-bindende, RGD-unabhängige Aktivität bestätigt. Von den aktiven Verbindungen befinden sich 2 Peptide in einer konsekutiven Sequenz, die sich, abgeleitet von der bekannten Röntgen- struktur des MMP-2 C-Terminus, an der Oberfläche von PEX befindet.
Die beispielhaft hergestellten erfindungsgemäßen Verbindungen wurden nach Stand der Technik in einem Syntheseautomaten Milligen 9050 an Polystyrol hergestellt. Das Verfahren ist für einen Fachmann anhand von Lehrbuchwissen nachvollziehbar, wie z.B. im Anhang des Novabiochem- Kataloges zu finden. Es wurden Chlor-Trityl(o-CI)-Anker eingesetzt. Fmoc- geschützte Aminosäuren mit säurelabilem Seitenschutz wurden gekuppelt. Es kamen die seitengeschützten Derivate Fmoc-Ser(But), Thr(But),
Tyr(But), His(Trt), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg(Pmc) oder Arg(Pbf), Lys(Boc),
Asp(OBut), Glu(OBut), Cys(Trt) zum Einsatz. Nach Abspaltung der Fmoc- gruppen wird das Peptid mit TFA/Wasser (98:2) vom Harz abgespalten, wobei gleichzeitig die Schutzgruppen der Seitenketten mit abgespalten werden.
Die Verbindungen der Formel l und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer Herstellung werden im übrigen nach an sich bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur (z.B. in den Standardwerken wie Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart;) beschrieben sind, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die für die genannten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch machen.
Die Ausgangsstoffe können, falls erwünscht, auch in situ gebildet werden, so daß man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den Verbindungen der Formel I umsetzt.
Verbindungen der Formel I können vorzugsweise erhalten werden, indem man Verbindungen der Formel I aus einem ihrer funktioneilen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt.
Bevorzugte Ausgangsstoffe für die Solvolyse bzw. Hydrogenolyse sind solche, die sonst der Formel I entsprechen, aber anstelle einer oder mehrerer freier Amino- und/oder Hydroxygruppen entsprechende geschützte Amino- und/oder Hydroxygruppen enthalten, vorzugsweise solche, die anstelle eines H-Atoms, das mit einem N-Atom verbunden ist, eine Aminoschutzgruppe tragen, insbesondere solche, die anstelle einer HN-Gruppe eine R'-N-Gruppe tragen, worin R' eine Aminoschutzgruppe bedeutet, und/oder solche, die anstelle des H-Atoms einer Hydroxygruppe eine Hydroxyschutzgruppe tragen, z.B. solche, die der Formel I entsprechen, jedoch anstelle einer Gruppe -COOH eine Gruppe -COOR" tragen, worin R" eine Hydroxyschutzgruppe bedeutet.
Es können auch mehrere - gleiche oder verschiedene - geschützte Amino- und/oder Hydroxygruppen im Molekül des Ausgangsstoffes vorhanden sein. Falls die vorhandenen Schutzgruppen voneinander verschieden sind, können sie in vielen Fällen selektiv abgespalten werden.
Der Ausdruck "Aminoschutzgruppe" ist allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine Aminogruppe vor chemischen Umsetzungen zu schützen (zu blockieren), die aber leicht entfernbar sind, nachdem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen des Moleküls durchgeführt worden ist. Typisch für solche Gruppen sind ins- besondere unsubstituierte oder substituierte Acyl-, Aryl-, Aralkoxymethyl- oder Aralkylgruppen. Da die Aminoschutzgruppen nach der gewünschten Reaktion (oder Reaktionsfolge) entfernt werden, ist ihre Art und Größe im übrigen nicht kritisch; bevorzugt werden jedoch solche mit 1-20, insbesondere 1-8 C-Atomen. Der Ausdruck "Acylgruppe" ist im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren in weitestem Sinne aufzufassen. Er umschließt von aliphatischen, araliphatischen, aromatischen oder hetero- cyclischen Carbonsäuren oder Sulfonsäuren abgeleitete Acylgruppen sowie insbesondere Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und vor allem Aralkoxycarbonylgruppen. Beispiele für derartige Acylgruppen sind Formyl oder Alkanoyl wie Acetyl, Propionyl, Butyryl; Aralkanoyl wie Phenylacetyl; Aroyl wie Benzoyl oder Toluyl; Aryloxyalkanoyl wie POA; Alkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, BOG, 2-lodethoxycarbonyl; Aralkyloxycarbonyl wie CBZ ("Carbobenzoxy"), 4- Methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC; Arylsulfonyl wie Mtr. Bevorzugte Aminoschutzgruppen sind BOC und Mtr, ferner CBZ, Fmoc, Benzyl, Formyl und Acetyl.
Die Abspaltung der Aminoschutzgruppe gelingt - je nach der benutzten Schutzgruppe - z. B. mit starken Säuren, zweckmäßig mit TFA oder Per- Chlorsäure, aber auch mit anderen starken anorganischen Säuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure, starken organischen Carbonsäuren wie Trichloressigsäure oder Sulfonsäuren wie Benzol- oder p-Toluolsulfon- säure. Die Anwesenheit eines zusätzlichen inerten Lösungsmittels ist möglich, aber nicht immer erforderlich. Als inerte Lösungsmittel eignen sich vorzugsweise organische, beispielsweise Carbonsäuren wie Essig- säure, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, Amide wie DMF, haloge- nierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, ferner auch Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, sowie Wasser. Ferner kommen Gemische der vorgenannten Lösungsmittel in Frage. TFA wird vorzugsweise im Überschuß ohne Zusatz eines weiteren Lösungsmittels verwen- det, Perchlorsäure in Form eines Gemisches aus Essigsäure und 70 %iger Perchlorsäure im Verhältnis 9:1. Die Reaktionstemperaturen für die Spaltung liegen zweckmäßig zwischen etwa 0 und etwa 50°, vorzugsweise arbeitet man zwischen 15 und 30° (Raumtemperatur).
Die Gruppen BOC, OBut, Pmc, Pbf und Mtr können z. B. bevorzugt mit TFA in Dichlormethan oder mit etwa 3 bis 5n HCI in Dioxan bei 15-30° abgespalten werden, die FMOC-Gruppe mit einer etwa 5- bis 50 %igen Lösung von sek. Aminen, wie Dimethylamin, Diethylamin oder Piperidin in DMF bei 15-30°.
Hydrogenolytisch entfernbare Schutzgruppen (z. B. CBZ oder Benzyl) können z. B. durch Behandeln mit Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators (z. B. eines Edelmetallkatalysators wie Palladium, zweckmäßig auf einem Träger wie Kohle) abgespalten werden. Als Lösungsmittel eignen sich dabei die oben angegebenen, insbesondere z. B. Alkohole wie
Methanol oder Ethanol oder Amide wie DMF. Die Hydrogenolyse wird in der Regel bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 100° und Drucken zwischen etwa 1 und 200 bar, bevorzugt bei 20-30° und 1-10 bar durchgeführt. Eine Hydrogenolyse der CBZ-Gruppe gelingt z. B. gut an 5 bis 10 %igem Pd/C in Methanol oder mit Ammoniumformiat (anstelle von Wasserstoff) an Pd/C in Methanol/DMF bei 20-30°.
Als inerte Lösungsmittel eignen sich z.B. Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Petrolether, Benzol, Toluol oder Xylol; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Trichlorethylen, 1 ,2-Dichlorethan,Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol; Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran (THF) oder Dioxan; Glykolether wie Ethylenglykolmono- methyl- oder -monoethylether (Methylglykol oder Ethylglykol), Ethylen- glykoldimethylether (Diglyme); Ketone wie Aceton oder Butanon; Amide wie Acetamid, Dimethylacetamid oder Dimethylformamid (DMF); Nitrile wie Acetonitril; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid (DMSO); Schwefelkohlenstoff; Carbonsäuren wie Ameisensäure oder Essigsäure; Nitroverbindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol; Ester wie Ethylacetat, Wasser oder Gemische der genannten Lösungsmittel.
Weiterhin ist es möglich, einen Ester der Formel I zu verseifen. Zweckmäßig erfolgt dies durch Solvolyse oder Hydrogenolyse, wie oben angegeben, z.B. mit LioH in Methanol, NaOH oder KOH in Dioxan-Wasser bei Temperaturen zwischen 0 und 60° C, vorzugsweise zwischen 10 und 40° C.
Ferner ist es möglich, eine konventionelle Aminoschutzgruppe durch Wasserstoff zu ersetzen, indem die Schutzgruppe, wie oben beschrieben, solvolytisch oder hydrogenolytisch abgespalten wird oder daß man eine durch eine konventionelle Schutzgruppe geschützte Aminogruppe durch Solvolyse oder Hydrogenolyse in Freiheit setzt.
Eine Base der Formel I kann mit einer Säure in das zugehörige Säureadditionssalz übergeführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äqui- valenter Mengen der Base und der Säure in einem inerten Lösungsmittel wie Ethanol und anschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kommen insbesondere Säuren in Frage, die physiologisch unbedenkliche Salze liefern. So können anorganische Säuren verwendet werden, z.B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Halogenwasserstoffsäuren wie Chlor- wasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäuren wie Ortho- phosphorsäure, Sulfaminsäure, ferner organische Säuren, insbesondere aliphatische, alicyclische, araüphatische, aromatische oder heterocyclische ein- oder mehrbasige Carbon-, Sulfon- oder Schwefelsäuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, Diethylessigsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Methan- oder Ethansulfon- säure, Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfon- säure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalin-mono- und Disulfonsäuren, Lauryl- schwefelsäure. Salze mit physiologisch nicht unbedenklichen Säuren, z.B. Pikrate, können zur Isolierung und /oder Aufreinigung der Verbindungen der Formel I verwendet werden.
Andererseits kann eine Säure der Formel I durch Umsetzung mit einer Base in eines ihrer physiologisch unbedenklichen Metall- oder Ammonium- salze übergeführt werden. Als Salze kommen dabei insbesondere die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium- und Ammoniumsalze in Betracht, ferner substituierte Ammoniumsalze, z. B. die Dimethyl-, Diethyl- oder Diisopropyl-ammoniumsalze, Monoethanol-, Diethanol- oder Diiso- propylammoniumsalze, Cyclohexyl-, Dicyclohexylammoniumsalze, Di- [ benzylethylendiammoniumsalze, weiterhin z. B. Salze mit Arginin oder Lysin.
Die Verbindungen der Formel I enthalten ein oder mehrere chirale Zentren und können daher in racemischer oder in optisch-aktiver Form vorliegen. Erhaltene Racemate können nach an sich bekannten Methoden mechanisch oder chemisch in die Enantiomeren getrennt werden. Vorzugsweise werden aus dem racemischen Gemisch durch Umsetzung mit einem optisch aktiven Trennmittel Diastereomere gebildet. Als Trennmittel eignen sich z.B. optisch aktive Säuren, wie die D- und L-Formen von Weinsäure, Diacetylweinsäure, Dibenzoylweinsäure, Mandelsäure, Äpfelsäure, Milchsäure oder die verschiedenen optisch aktiven Camphersulfonsäuren wie ß- Camphersulfonsäure. Vorteilhaft ist auch eine Enantiomerentrennung mit Hilfe einer mit einem optisch aktiven Trennmittel (z.B. Dinitrobenzoyl- phenylglycin) gefüllten Säule; als Laufmittel eignet sich z.B. ein Gemisch Hexan/Isopropanol/Acetonitril, z.B. im Volumenverhältnis 82:15:3.
Natürlich ist es auch möglich, optisch aktive Verbindungen der Formel I nach den oben beschriebenen Methoden zu erhalten, indem man Ausgangsstoffe verwendet, die bereits optisch aktiv sind. Die Erfindung umfaßt nicht nur die genannten Verbindungen, sondern auch Mischungen und Zubereitungen, welche neben diesen erfindungsgemäßen Verbindungen auch andere pharmakologische Wirkstoffe oder
Adjuvantien enthalten, die die primäre pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen in gewünschter Weise beinflussen können. Diese können als Therapeutika, Diagnostika oder als Reagenzien
Verwendung finden. Sie können an Mensch oder Tier lokal oder systemisch, oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, transdermal, nasal, buccal, oder iontophoretisch gegeben werden, das schließt Formulierungen in Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen, Liposomen, Salben, Pasten, bioabbaubaren Polymeren oder als Nanopartikel, Tabletten, Kapseln oder Pillen, Granulate oder Puder, als Aerosol zum Inhalieren, als intranasale Tropfen oder Sprays ein. Auch eine Kombination der neuen Produkte mit anderen Techniken, wie Chirurgie, Bestrahlung, Diagnose, Radiotherapie, photodynamischer Therapie und Gentherapie, sowie mit anderen Medikamenten ist möglich.
Solche Medikamente können z.B. aus den Gebieten Herzkreislauf,
Zentralnervensystem oder der Onkologie stammen. Es können
Tumormittel sein, wie Angiogeneseinhibitoren oder Cytostatika,
Chemotherapeutika der Gruppen alkylierende Agenzien, Antibiotika,
Antimetaboliten, Biologika und Immunmodulatoren, Hormone und deren Antagonisten, Senfgasderivaten, Alkaloiden und anderen, wobei diese
Substanzen niedermolekular und hochmolekular sein können. Es können
Lipide, Kohlehydrate oder Proteine sein. Darunter fallen auch Zytokine,
Toxine, Fusionsproteine, monoklonale Antikörper und Vaccine.
Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Verbindungen der oben und unten sowie in den Ansprüchen definierten Formeln einschließlich ihrer physiologisch unbedenklichen Salze als Arzneimittel, Diagnostika oder Reagenzien. Insbesondere sind dies Arzneimittel zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung von Liganden, z.B. von MMP-2 mit dem vß3
Integrinrezeptor beruhen.
Die Arzneimittel eignen sich zur Bekämpfung von Thrombosen,
Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren,
Osteoporose, Fibrösen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur
Beeinflussung von Wundheilungsprozessen.
Gegenstand sind auch entsprechende pharmazeutische Zubereitungen, welche mindestens ein Arzneimittel der Formel I sowie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten. Ferner ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen
Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Integrinrezeptors αvß3-
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung eines Liganden, z.B. der Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) mit dem vß3 Integrinrezeptor beruhen. -'
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung pathologischer Vorgängen, die durch Angiogenese unterhalten oder propagiert werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrösen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungs- prozessen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimitte) bzw. sie enthaltende pharma- zeutische Zubereitungen können in der Human- oder Veterinärmedizin verwendet werden. Als Trägerstoffe kommen organische oder anorganische Substanzen in Frage, die sich für die enterale (z.B. orale), paren- terale, topische Applikation oder für eine Applikation in Form eines
10 Inhalation-Sprays eignen und mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Alkylengly- kole, Polyethylenglykole, Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlehydrate wie Lactose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline. Zur oralen An-
^ c wendung dienen insbesondere Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Pulver, Granulate, Sirupe, Säfte oder Tropfen, zur rektalen Anwendung Sup- positorien, zur parenteralen Anwendung Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, ferner Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, für die topische Anwendung Salben, Cremes oder Puder. Die neuen
20 Verbindungen können auch lyophilisiert und die erhaltenen Lyophilisate z.B. zur Herstellung von Injektionspräparaten verwendet werden. Die angegebenen Zubereitungen können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe wie Gleit-, Konservierungs-, Stabilisierungs- und/oder Netzmittel, Emul-
25 gatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffersubstanzen, Färb-, Geschmacks- und /oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten, z. B. ein oder mehrere Vitamine. Für die Applikation als Inhalationsspray können Sprays verwendet werden,
OQ die den Wirkstoff entweder gelöst oder suspendiert in einem Treibgas oder Treibgasgemisch (z. B. C02 oder Fluorchlorkohlenwasserstoffen) enthalten. Zweckmäßig verwendet man den Wirkstoff dabei in mikronisierter Form, wobei ein oder mehrere zusätzliche physiologisch verträgliche
Lösungsmittel zugegen sein können, z. B. Ethanol. Inhalationslösungen
35 können mit Hilfe üblicher Inhalatoren verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Substanzen können in der Regel in Analogie zu anderen bekannten, im Handel befindlichen Präparaten (z.B. beschrieben in der US-A-4 472 305 ) verabreicht werden, vorzugsweise in Dosierungen zwischen etwa 0,05 und 500 mg, insbesondere zwischen 0,5 und 100 mg pro Dosierungseinheit verabreicht. Die tägliche Dosierung liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,01 und 20 mg/kg Körpergewicht. Die spezielle Dosis für jeden Patienten hängt jedoch von den verschiedensten Faktoren ab, beispielsweise von der Wirksamkeit der eingesetzten speziellen Verbindung, vom Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, von der Kost, vom Verabreichungszeitpunkt und -weg, von der Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneistoffkombination und Schwere der jeweiligen Erkrankung, welcher die Therapie gilt. Die parenterale Applikation ist bevorzugt.
Vor- und nachstehend sind alle Temperaturen in °C angegeben.
Die HPLC-Analysen (Retentionszeit Rt) erfolgten in dem folgenden System:
Säule 250x4 mm Lichrospher 100RP 18 (Merck KGaA) mit einem 50 Minuten Gradienten von 0-80% 2-Propanol in Wasser (mit 0,3%
Trifluoressigsäure) bei einem Fluss von 1 ml/min und Detektion bei 215 nm.
Massenspektrometrie (MS): El (Elektronenstoß-Ionisation) M+
FAB (Fast Atom Bombardment) (M+H)+
Beispiele
Herstellung und Aufreinigung erfindungsgemäßer Peptide: Prinzipiell erfolgt die Herstellung und Aufreinigung mittels Fmoc-Strategie unter Protektion säurelabiler Seitenketten auf säurelabilen Harzen unter Benutzung eines kommerziell erhältlichen "continuous flow" Peptid- synthesizers entsprechend den Angaben von Haubner et al. (J. Am. Chem. Soc. 118, 1996, 17703).
Folgende Verbindungen wurden erhalten
Synonym dazu sind die nachstehende Bezeichnungen
KDRFIWRTVC MMP-2(489-497)-Cys
AAFNWSKNKKTYIFAGC MMP-2(570-585)-Cys
FWRYNEVKKKC MMP-2(588-597)-Cys
Weiter wurden folgende Verbindungen erhalten
Einbuchstabencode Synonym
VKKKMDPGC MMP-2(594 603)-Cys, M 1005.23;
LERGYPKPLTSLGLC MMP-2(548 561 )-Cys, M 1646.94;
KPMGPLLVC MMP-2(502 •509)-Cys, M 957.24;
IAQIRGC MMP-2(478483)-Cys, M 759.94;
LKSVKFGSIC MMP-2(645 653)-Cys, M 1081.34;
AGDKFWRYNC MMP-2(585 •593)-Cys, M 1259.42;
RGYPKPLTSLC MMP-2(550 •559)-Cys, M 1234.5;
PGFPKLIAC MMP-2(600 •607)-Cys, M 945.19;
WRTVTPRDC MMP-2(494 •501)-Cys, M 1133.31 ;
AYYLKLENC MMP-2(635 •642)-Cys, M 1116.31. Beispiele für Material und Methoden:
Rekombinantes MMP-2 ist von Chemicon erhältlich. Integrin αvß3 kann aus
Placenta gereinigt werden, wie von Smith et al. J. Biol. Chem. 263, 18726-
18731 (1988) mit den Modifikationen laut F.C. Mitjans et al. J. Cell Sei.
108, 2825-2838 (1995) beschrieben ist. Lösliches αvß3 ist wie in R.J.
Mehta et al. Biochem.J. 330, 861-869(1998) beschrieben erhältlich, dort ist auch die Markierung mit Biotin, die Durchführung eines Liganden-
' Bindungstest und Kompetitionsassays ausgeführt, ein anderes Zitat für die
Bindungstests ist S. Kraft et al. J. Biol. Chem. 274, 1979-1985 (1999).
1. Der Rezeptorbindungstest an kovalent gebundenen Peptiden ist 5 analog durchführbar zu: B. Diefenbach et al. in Biology of Vitronectins and Their Receptors; eds. KT Preissner et al. aus Exerpta Medica International Congress Series 1042, Elsevier Science Publishers Amsterdam 1993, p. 149-156.
Beim Rezeptorbindungstest wurde Fluoreszein-markiertes Integrin αvß3 0 verwendet, das direkt mit dem Cellulose-gebundenen Peptid interagiert. Die Auswertung erfolgte durch Messen der Fluoreszenz. In einer anderen Variante wurde in Mikrotiterplatten beschichtetes BSA mit sulfo-SMPB aktiviert und die Thiopeptide daran kovalent gebunden. Nach 5 Inkubation mit biotinyliertem αvß3 wurde gebundener Rezeptor mit alkalischer-Phosphatase-gekoppeltem Ziege-anti-Biotin-Antikörper und Farbgebung durch ein Phosphatasesubstrat nachgewiesen.
0
Peptid Spot- Sequenz humMMP-2 EC50 [μM]
Nr. sren: 7 cyclo-(RGDfK(mercapto- - 0,2! propionyl))
1 53-57 AAFNWSKNKKTYIFAGC 570-585 8
2 62-63 FWRYNEVKKKC 588-597 5 5 3 12-13 KDRFIWRTVC 489-497 10 Die pharmakologischen Daten beweisen die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen als Liganden für den Rezeptor ctvß3.
2. Bei der Bindung der PEX-Peptide an αvß3 handelt es sich um eine RGD-unabhängige Bindung. Dies wurde in einem weiteren Test nachgewiesen, der analog 1. durchgeführt wurde. Der Rezeptor wurde mit und ohne das lösliche Peptid cyclo-(Arg-Gly-Asp- D-Phe-N-Me-Val) inkubiert. Während die Bindung des cyclo-RGD-Peptides "cyclo-(RGDfK(mercapto-propionyl))" an αvß3 durch cyclo-(Arg-Gly-Asp-D- Phe-N-Me-Val) inhibiert wurde, war die Bindung des PEX-Peptides AAFNWSKNKKTYIFAGC davon unabhängig.
Die nachfolgenden Beispiele betreffen pharmazeutische Zubereitungen:
Beispiel A: Injektionsgläser
Eine Lösung von 100 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys und 5 g Dinatriumhydrogenphosphat wird in 3 l zweifach destilliertem Wasser mit 2 n Salzsäure auf pH 6,5 eingestellt, steril filtriert, in Injektionsgläser abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jedes Injektionsglas enthält 5 mg Wirkstoff.
Beispiel B: Suppositorien
Man schmilzt ein Gemisch von 20 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val- Cys mit 100 g Sojalecithin und 1400 g Kakaobutter, gießt in Formen und läßt erkalten. Jedes Suppositorium enthält 20 mg Wirkstoff.
Beispiel C: Lösung
Man bereitet eine Lösung aus 1 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val- Cys, 9,38 g NaH2P04 ■ 2 H20, 28,48 g Na2HP04 • 12 H20 und 0,1 g
Benzalkoniumchlorid in 940 ml zweifach destilliertem Wasser. Man stellt auf pH 6,8 ein, füllt auf 1 I auf und sterilisiert durch Bestrahlung. Diese Lösung kann in Form von Augentropfen verwendet werden.
Beispiel D: Salbe
Man mischt 500 mg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys mit 99,5 g Vaseline unter aseptischen Bedingungen.
Beispiel E: Tabletten
Ein Gemisch von 1 kg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys, 4 kg Lactose, 1 ,2 kg Kartoffelstärke, 0,2 kg Talk und 0,1 kg Magnesiumstearat wird in üblicher Weise zu Tabletten verpreßt, derart, daß jede Tablette 10 mg Wirkstoff enthält. Beispiel F: Dragees
Analog Beispiel E werden Tabletten gepreßt, die anschließend in üblicher Weise mit einem Überzug aus Saccharose, Kartoffelstärke, Talk, Tragant und Farbstoff überzogen werden.
Beispiel G: Kapsein
2 kg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys werden in üblicher weise in Hartgelatinekapseln gefüllt, so daß jede Kapsel 20 mg des Wirkstoffs enthält.
Beispiel H: Ampullen
Eine Lösung von 1 kg Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys in 60 I zweifach destilliertem Wasser wird steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jede Ampulle enthält 10 mg Wirkstoff.
Beispiel I: Inhalations-Spray
Man löst 14 g Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys in 10 I isotonischer NaCI-Lösung und füllt die Lösung in handelsübliche Sprühgefäße mit Pump-Mechanismus. Die Lösung kann in Mund oder Nase gesprüht werden. Ein Sprühstoß (etwa 0,1 ml) entspricht einer Dosis von etwa 0,14 mg.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der Formel I I
X-Y-Z I
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden
Aminosäuren, Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich
466 - 660 von humanem Pro-MMP-2, Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Liste der natürlich vorkommenden
Aminosäuren, A Alkyl mit 1 -10 C-Atomen, Acyl Alkanoyl mit 1-10 C-Atomen,
bedeuten
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Amino- schutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 ,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MM P-2
bedeutet, wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 , ~
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
4. Verbindungen nach Anspruch 1 ,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem
Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich
480 - 598 von humanem Pro-MMP-2, Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20
Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, ι sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
5. Verbindungen nach Anspruch 1 ,
worin
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich
489 - 497 und/oder 570 - 585 und/oder 588 - 597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH2, NHA, NA2 oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
6. Verbindungen nach Anspruch 1 , woπn ,
X H, Acyl oder ein Peptidfragment mit 1 bis 20 Aminosäuren, ausgewählt aus der Peptidsequenz von humanem Pro-MMP-2,
Y ein Peptidfragment ausgewählt aus dem Sequenzbereich
489 - 497 und/oder 570 - 585 und/oder 588 - 597 von humanem Pro-MMP-2,
Z OH, NH2, NHA, NA2 oder Cys
bedeuten,
wobei die primären Aminogruppen auch mit konventionellen Aminoschutzgruppen versehen sein können, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
0 7. Verbindungen nach Anspruch 1 a) Lys-Asp-Arg-Phe-Ile-Trp-Arg-Thr-Val-Cys, b) Ala-Ala-Phe-Asn-Trp-Ser-Lys-Asn-Lys-Lys-Thr-Tyr-Ile-Phe-Ala- Gly-Cys, c) Phe-Trp-Arg-Tyr-Asn-Glu-Val-Lys-Lys-Lys-Cys 5 sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.
8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I nach Q Anspruch 1 sowie ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Verbindung der Formel I aus einem ihrer funktioneilen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden, reduzierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt, 5 und/oder eine Base oder Säure der Formel I in eines ihrer Salze umwandelt.
9. Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1 - 6 und die Verbindungen gemäß Anspruch 7 sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate als Arzneimittel.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9 als Inhibitor des Integrinrezeptors αvß3.
11. Arzneimittel nach Anspruch 10 zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung von Liganden mit dem αvß3 Integrinrezeptor beruhen.
12. Arzneimittel nach Anspruch 11 zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung der Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) mit dem αvß3 Integrinrezeptor beruhen.
13. Arzneimittel nach Anspruch 12 zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrösen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungsprozessen.
14. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens ein Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 sowie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe und gegebenenfalls andere Wirkstoffe.
15. Verwendung von Verbindungen gemäß der Ansprüche 1 bis 7 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Integrinrezeptors αvß3.
16. Verwendung von Verbindungen gemäß der Ansprüche 1 bis 7 und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung von Liganden mit dem αvß3 Integrinrezeptor beruhen.
17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf einer Wechselwirkung der Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) mit dem αvß3 Integrinrezeptor beruhen.
18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung pathologischer Vorgängen, die durch Angiogenese unterhalten oder propagiert werden.
19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Thrombosen, Herzinfarkt, koronaren Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Tumoren, Osteoporose, Fibrösen, Entzündungen, Infektionen, Psoriasis sowie zur Beeinflussung von Wundheilungsprozessen.
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