Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Analyseverfahren mit hohem Durchsatz zur parallelen Charakterisierung von Polymorphismen, insbesondere SNPs. Gleichzeitig oder in einem separaten Experiment kann das Verfahren zur Analyse von DNA-Methylierung eingesetzt werden.
Das Humangenomprojekt, die Erstsequenzierung des menschlichen Genoms, wird in den nächsten Jahren abgeschlossen sein. Durch dieses Projekt wird es möglich werden, alle etwa 100.000 Gene zu identifizieren. Die Sequenzinformation öffnet ungeahnte Möglichkeiten für die Aufklärung der Genfunktionen. Dies wiederum eröffnet die Möglichkeit, Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zu betreiben. Die Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zielt auf den Einsatz von Medikamenten in Abhängigkeit eines Genotypen. Dadurch soll die Effektivität von Medikamenten gesteigert werden. Der notwendige Zwischenschritt ist die Bestimmung der Polymorphismen und Genotypen, die mit einem bestimmten Ansprechen assoziiert sind. Verlangt werden deshalb immer effizientere Genotypisierungsmethoden.
Derzeit gibt es zwei Kategorien von polymorphen Markern, die zur Genotypisierung eingesetzt werden, Mikrosatelli- ten und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) . Mikrosa- telliten sind hoch polymorph, d.h. sie haben eine Vielzahl von Allelen. Sie sind dadurch charakterisiert, dass ein repetitives Sequenzelement, mit einer unterschiedlichen Anzahl Wiederholungen für unterschiedliche Allele, von konservierten Sequenzen flankiert ist. Durchschnittlich gibt es einen Mikrosatellitenmarker pro 1 Million Basen. Eine Karte von 5.000 positionierten Mikrosatelli- tenmarkern wurde von CEPH publiziert (Dil. C. , et al. Nature, March 14, 1994) . Mikrosatelliten werden durch
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verwendet, die einen bekannten SNP abdecken. Ein Oligo- nukleotid deckt die Sequenz von der 5' -Seite bis unmittelbar zum SNP hin ab, so dass sich der SNP an das 3'- Ende dieses Oligonukleotids anschliesst. Meistens werden zwei weitere Oligonukleotide, von denen jeder ein Allel des Polymorphismus abdeckt und einen unterschiedliche 5'- Überhang hat, an das System hybridisiert. Eine strukturaktive Endonuklease entfernt vom vollständig komplementären Oligonukleotid den 5' -Überhang. Der abgekappte Über- hang wird mittels Massenspektrometrie analysiert und zur Identifikation des Allels verwendet. Ein Nachteil der gezeigten Methode ist, dass die Produkte vor der mas- senspektrometrische Analyse gründlich gereinigt werden müssen. Für diese Aufreinigung werden magnetic beads ver- wendet, die nicht einfach in der Handhabung sind. Dies ist ein wesentlicher Nachteil von vielen Genotypisie- rungsmethoden, die Massenspektrometrie zur Analyse verwenden.
Eine weitere Genotypisierungsmethode ist der Taq Man As- say. In diesem wird allelspezifisch enzymatisch ein Fluo- rezenzlöscher von einem fluoreszenzfarbstofftragenden 0- ligonukleotid getrennt.
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight Massenspektrometrie (MALDI) hat die Analytik von Biomolekülen revolutioniert (Karas, M. & Hillenkamp, F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)). MALDI ist in verschiedenen Varianten zur Analyse von DNA eingesetzt worden. Die Varianten reichen von primer extension bis Sequenzierung (Liu, Y.-H., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 735-743 (1995); Ch'ang, L.-Y., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 772-774 (1995); Little, D.P., et al. J. Mol, Med. 75, 745-750 (1997); Haff, L. & Smirnov, I.P. Genome Res. 7, 378-388 (1997), Fei, Z., Ono, T. & Smith, L.M.
Nucleic Acids Res. 26, 2827-2828 (1998); Ross, P., Hall,
L., Smirnov, I. & Haff, L. Nature Biotech. 16, 1347-1351 (1998);Ross, P.L., Lee, K. & Belgrader, P. Anal. Chem. 69, 4197-4202 (1997); Griffin, T.J., Tang, W. & Smith, L.M. Nature Biotech. 15, 1368-1372 (1997)). Der grösste Nachteil dieser Methoden ist, dass alle eine gründliche Aufreinigung der Produkte vor der MALDI Analyse bedingen, Spin column Aufreinigung oder der Einsatz von magnetic bead technology oder reversed-phase Aufreinigung sind notwendig.
Die Analyse von DNA im MALDI ist stark abhängig vom Ladungszustand des Produktes. Eine 100-fache Verbesserung der Empfindlichkeit in der MALDI Analyse kann dadurch erzielt werden, dass der Ladungszustand auf dem zu analy- sierenden Produkt so kontrolliert wird, dass nur eine einzige positive oder negative Überschussladung vorhanden ist. So modifizierte Produkte sind auch wesentlich weniger anfällig auf die Ausbildung von Addukten (z.B. mit Na und K, Gut, I.G. and Beck, S. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 1367-1373; Gut, I.G., Jeffery, W.A., Pappin, D.J.C. and Beck, S. Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43-50 (1997)). Ein SNP Genotypisierungsverfahren, welches von diesen Bedingungen Gebrauch macht, mit dem Namen "GOOD Assay" wurde kürzlich vorgestellt (Sauer, S. et al., Nuc- leic Acids Research, Methods online, 2000, 28, el3) .
Nachteil ist, dass das gesamte Verfahren einen beschränkten Multiplexierungsgrad zulässt, und die Probenvorbereitung immer den Einsatz modernster und teurer Pipettier- technologie bedingt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur hochparallelen Genotypisierung von Polymorphismen zur Verfügung zustellen.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen gelöst, wobei man
die folgenden Schritte ausführt: a) man bindet einen Satz von Sonden, der mit mindestens einer für die jeweilige Sonde charakteristischen nachweisbaren Markierung versehen ist, an eine adressierte Oberfläche, wobei die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche photochemisch, chemisch oder enzymatisch wieder spaltbar ist; b) man hybridisiert eine zu untersuchende Nukleinsäure an diese Sonden; c) man verändert die Sonden in einer allelspezifischen enzymatischen Reaktion; d) man entfernt einen Teil der Sonden, der für die Analyse der allelspezifischen Reaktion bedeutungslos ist; e) man analysiert die allelespezifischen Produkte anhand der nachweisbaren Markierungen und führt eine Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäure- probe durch.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren wobei die Ad- resse der Oberfläche in Schritt a) die Position (Oligo- nukleotidarray) , eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isotopische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Markierung ist.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Sonden Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs) , Chimäre dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen sind, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.
Auch ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche bindet.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass die zu untersu- chende Nukleinsäuren in Schritt b) genomische DNA, klo-
nierte DNA, cDNA, RNA, PCR Produkte oder Ligationsproduk- te sind.
Bevorzugt ist ferner, dass die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotidbausteinen zu spezifischen Produkten, entsprechend Schritt c) umgesetzt werden.
Besonders bevorzugt ist auch, dass man durch gleichzeitigen Einsatz von Desoxy- und Didesoxynukleotidbausteinen eine Sequenzierung durchführt und nicht nur Polymorphismen detektiert.
Insbesondere ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Ligase und einem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezifischen Produkten, entsprechend Schritt c) umsetzt.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels eines Helferoligo- nukleotids und einer strukturaktiven Endonuklease al- lelspezifisch schneidet. Weiterhin bevorzugt ist auch, dass man die allelspezifischen Produkte mittels Massenspektrometrie analysiert.
Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder Elektrospray Ionisations Massenspektrometrie zur Analyse verwendet wird.
Dabei ist es bevorzugt, dass die allelspezifischen Pro- dukte in einer Art vorliegen, die sich besonders gut zur massenspektrometrischen Analyse eignen.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die allelspezifischen Produkte gemäss Schritt d) mittels einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt. Dabei ist besonders bevorzugt, dass die besonders gute Eignung zur massenspektrometrischen Analyse dadurch zustande kommt, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach positiv oder einfach negativ geladen sind. Weiterhin ist hierbei bevorzugt, dass eine chemische Reaktion zur Neutralisie- rung von Ladungen eingesetzt wird, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produktes beitragen würden. Somit ist auch bevorzugt, dass man Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen, oder Dithi- ophosphatgruppen des Oligonukleotidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreaktion ladungsneutralisiert . Besonders ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass die einfache Ladung erfindungsgemäß dadurch zu stände kommt, dass man eine chemische Funktion einbringt, welche die Ladung trägt .
Bevorzugt ist insbesondere auch, dass die reversible Bindungschemie durch einen induzierten Bruch die einfache Ladung zum Produkt beisteuert. Dabei ist bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zustande kommt. Weiterhin ist dabei bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch während eines Desorptionsprozes- ses des Analysevorgangs stattfindet.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist es, dass man eine Matrix auf die Oberfläche aufbringt, welche die De- sorption im MALDI Prozess unterstützt. Dabei ist wiederum bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch durch die Matrix induziert wird.
Bevorzugt ist erfindungsgemäß ferner, dass auf einem adressierten Analysepunkt der Oberfläche eine Vielzahl von
unterschiedlichen Sonden sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Schritt c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markierung ergeben. Außerdem ist bevorzugt, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Schritt c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse ein eindeutiges Muster von Fragmentmassen als nachweisbare Markierung ergeben. Insbesondere bevorzugt ist hierbei, dass die Massen aller Produkte oder Produktfragmente der allelspezifischen Reaktionen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der abgefragten Nukleinsäure vorhandenen Allele zulassen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass bekannte Polymorphismen in der zu untersuchenden DNA genotypisiert werden.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man un- bekannte Polymorphismen in der zu untersuchenden DNA i- dentifiziert .
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass man Cytosin- Methylierungen detektiert und visualisiert .
Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung der DNA mit einer Bisulfitlösung (Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
Bevorzugt ist auch, dass die Amplifikation mittels der Polymerasereaktion (PCR) erfolgt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass bekannte Methylierungs- muster in der zu analysierenden Probe nach der erfin- dungsgemäß vorbehandelten DNA untersucht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren übertrifft die Effizienz bestehender Verfahren, in Bezug auf die Einfachkeit der Handhabung, die Kosten, die Qualität und den Durchsatz, bei weitem.
Die Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen.
Im ersten Schritt des Verfahrens wird ein Satz von Sonden an eine adressierte Oberfläche gebunden.
Man setzt als Sonden vorzugsweise Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs) , Chimäre dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen ein, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.
Die jeweilige Sonde ist mit einer charakteristischen nachweisbaren Markierung versehen. Besonders bevorzugt ist diese Markierung die Masse eines Fragments der Sonde.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Adressierung der Oberfläche die Position (Oligonukleotidar- ray) , eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isotopische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Markierung.
Die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche ist photochemisch, chemisch oder enzymatisch wieder spaltbar.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche gebunden.
Im zweiten Verfahrensschritt hybridisiert man die zu un- tersuchende Nukleinsäure, die vorzugsweise aus genomischer DNA, klonierter DNA, vorbehandelter DNA, cDNA, RNA,
PCR Produkten oder Ligationsprodukten besteht, an die besagten Sonden.
Bevorzugt wird die DNA zuvor mit einer Bisulfitlösung (Disulfit, Hydrogensulfit) behandelt.
Im dritten Verfahrensschritt verändert man die Sonden in einer allelspezifischen enzymatischen Reaktion.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotidbausteinen zu spezifischen Produkten umgesetzt.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels einer Li- gase und einem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezi- fischen Produkten umgesetzt.
Anschließend werden die Sonden bevorzugt in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mit einem Helferoligonukleotid und einer struk- turaktiven Endonuklease allelspezifisch geschnitten.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens lassen sich dabei Methylierungsmuster in der zu analysierenden vorbehandelten DNA untersuchen.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden SNPs in der zu analysierenden vorbehandelten DNA untersucht.
Auf einem adressierten Analysepunkt der Oberfläche befinden sich vorzugsweise eine Vielzahl von unterschiedlichen Sonden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man einen Teil der Sonden, der für die Analyse der allelspezifischen Reaktion bedeutungslos ist.
Die allelspezifischen Produkte werden dabei vorzugsweise mit einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt.
Im fünften Verfahrensschritt analysiert man die allelspezifischen Produkte anhand der nachweisbaren Markierungen und führt die Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäureprobe durch.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die allelspezifischen Produkte mittels Massenspektrometrie analysiert.
Die allelspezifischen Produkte liegen vorzugsweise in einer Art vor, die sich besonders gut zur massenspektro- metrischen Analyse eignet.
Bevorzugt kommt die besonders gute Eignung zur mas- senspektrometrischen Analyse dadurch zustande, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach positiv oder einfach negativ geladen sind.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird eine chemische Reaktion zur Neutralisierung von Ladungen eingesetzt, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produktes beitragen würde.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen oder Dithi-
ophosphatgruppen des Oligonukleotidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreaktion ladungsneutralisiert .
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens kommt die einfache Ladung dadurch zustande, dass eine chemische Funktion eingebracht wird, die die Ladung trägt.
Die reversible Bindungschemie steuert vorzugsweise die einfache Ladung durch einen induzierten Bruch zum Produkt bei.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens kommt der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zustande.
In einer weiteren bevorzugten Variante findet der induzierte Bindungsbruch während des Desorptionsprozesses des Analysenvorgangs statt.
Eine Matrix wird bevorzugt auf die Oberfläche aufgebracht, die die Desorption im MALDI Prozess unterstützt.
In einer weiteren bevorzugten Variante wird der induzierte Bindungsbruch durch die Matrix induziert.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder Elektronenspray Ionisa- tions Massenspektrometrie zur Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ergeben die Verlängerungs-produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markie- rung. Bekannte Polymorphismen lassen sich damit vorzugsweise in der zu untersuchenden DNA identifizieren.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens ergeben die Verlängerungsprodukte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Abspaltung von der Oberflä- ehe in der Analyse ein eindeutiges Muster von Fragmentmassen als nachweisbare Markierung. Unbekannte Polymorphismen lassen sich damit vorzugsweise in der zu untersuchenden DNA identifizieren.
Die Massen aller Produkte der Reaktionen lassen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der abgefragten Nuk- leinsäure vorhandenen Allele zu.
Das Verfahren wird abschließend durch die Abbildungen er- läutert.
Anhand der der Figuren 1 und 2 wird die Erfindung näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. la und lb eine Veranschaulichung der Verfahrensschritte an einem Beispiel und
Fig. 2 ein mögliche Immobilisierung der Sonden an der 0- berflache umfassend einen photolabilen Linker.
In den Figuren la und lb werden folgende Schritte dargestellt:
1. Zuerst wird eine Sonde an die adressierte Oberfläche gebunden.
2. Dann hybridisiert man die zu untersuchende Nuklein- säure an die Sonde.
3. Darauf verlängert man die Sonden in einer allelspezifischen Reaktion. 4. Die zu untersuchende Nukleinsäure wird entfernt.
5. Nachfolgend entfernt man einen Teil der Sonden, der für die allelspezifische Reaktion bedeutungslos ist.
6. Abschließend analysiert man den verbleibenden Teil der verlängerten Sonden. Bevorzugt wird zur Analyse ein Massenspektrometer verwendet, das die verlängerten Sonden anhand ihrer Massen identifiziert und das gleichzeitig die Ablösung von der Oberfläche ermöglicht (z. B. photo- lytische Reaktion in einem Laser-Desorptions- Massenspektrometer) .
Figur 2 stellt die eine mögliche Verknüpfung der Primer mit der Oberfläche dar. Das abgebildete Nukleotid ist Teil des Primers, welcher der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt ist.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Anwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Analyse des Methylie- rungstatus der ersten Methylierungsposition im Exon 14 des Faktor-VIII-Gens. Dazu wird die zu analysierende genomische DNA-Probe zunächst einer Bisulfitreaktion unterzogen, bei der, wie dem Fachmann bekannt, nichtmethylier- te Cytosin- in Uracilreste umgewandelt werden. Anschlie- ßend wird das zu analysierende Fragment der bisulfitier- ten DNA durch eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert .
1. Beispiel
Im ersten Schritt des Assays wird eine durch Thermoseque- nase katalysierte templatgerichtete Verlängerung des Primers TCTATTTACTTCATTCCACTTAAsT*sC durchgeführt. Als Templat für die Primerverlängerung dient das bisulfitbe- handelte und mittels einer PCR-Reaktion amplifizierte
DNA-Fragment, das den aus der Bisulfitumwandlung methy-
lierter bzw. unmethylierter genomischer DNA resultierenden und durch den Assay zu analysierenden Polymorphismus aufweist. Der Primer weist am 3 '-Ende zwei durch „s" besonders gekennzeichnete Phosphothioatbindungen auf. Au- ßerdem ist die Base des vorletzten Monomers, hier durch „*λ besonders gekennzeichnet, mit einem eine quaternäre Aminofunktion tragenden Substituenten modifiziert. Die Primerverlängerung erfolgt in Gegenwart einer Mischung phosphothioatmodifizierter Didesoxynucleotide, deren Ein- bau zur Ausbildung einer dritten Phosphothioatbindung am 3 '-Ende des um einen Nucleotidbaustein verlängerten Primers führt. Im vorliegenden Beispiel wird eine Mischung aus α-sddATP undα-sddGTP eingesetzt, so das entsprechend dem Methylierungsstatus der dem Templat zugrundeliegenden genomischen DNA-Probe eine Mischung der Verlängerungsprodukte TCTATTTACTTCATTCCACTTAAsT*sCsA und TCTATTTACTT- CATTCCACTTAAsT*sCsG, die keine 3 ' -Hydroxylgruppe aufweisen, resultiert. Die Reaktion wird durch einen dreiminütigen Denaturierungsschritt bei 95°C eingeleitet und anschließend analog einer PCR-Reaktion in vierzig Zyklen durchgeführt.
Nach Beendigung der Primerverlängerungsreaktion wird der pH durch Zugabe von Essigsäure auf unter 7.0 gesenkt. Nach Zugabe einer 5 '-Phosphodiesterase wird die Reaktionslösung 45 Minuten bei 37 °C inkubiert. In dieser Zeit erfolgt ein vollständiger Verdau des DNA-Te plats, während der verlängerte Primer unter Erhalt der Phosphothio- atbindungenen unter Bildung der Hydrolyseprodukte AsT*sCsA und AsT*sCsG nur unvollständig verdaut wird.
Nach dem Verdau wird der Reaktionslösung eine Mischung aus Acetonitril, einem schwach basischen wässrigen Puffer und Methyljodid zugesetzt. Die Lösung wird in einem ge- schlossenen Gefäß für 25 Minuten bei 40°C inkubiert, was
zur Methylierung der Schwefelatome der Phosphothioatbin- dung führt.
Da die methylierten Phosphothioatbindungen keine Negativ- ladungen aufweisen, führt die Anwesenheit der quaternären Aminofunktion in beiden Verlängerungsprodukten zum Vorhandensein einer einfach positiven Überschußladung, die die hochsensitive Identifizierung durch MALDI-TOF ermöglicht. Zur Analyse wird ein Aliquot der Reaktionslösung mit einem Aliquot einer Matrixlösung, im vorliegenden
Beispiel α-Cyano-4-hydroxyzimtsäuremethylester, gemischt, und auf ein MALDI-Target aufgetragen. Die Messung erfolgte im vorliegenden Beispiel an einem Bruker Reflex II TOF Massenspektrometer im positiven Ionenmodus. In Figur 3 sind Spektren, die unterschiedlichen Methylierungsgraden der untersuchten Methylierungsstelle in der genomischen DNA-Probe zugeordnet werden können, dargestellt.
Die Figuren 3-5 zeigen MALDI-TOF Spektren, die nach Ana- lyse des Methylierungsstatus der ersten Methylierungsstelle von Exon 14 des Faktor VIII-Gens entsprechend Beispiel 1 erhalten wurden:
Fig 3: Methylierungsposition lag in der genomischen DNA vollständig methyliert vor (Primerverlängerung durch α- sddGTP)
Fig. 4: Methylierungsposition lag in der genomischen DNA teilweise methyliert vor (Primerverlängerung sowohl durch α-sddGTP als auch durch α-sddATP)
Fig. 5: Methylierungsposition lag in der genomischen DNA nicht methyliert vor (Primerverlängerung durch α-sddATP)
2 . Beispiel
Das Beispiel beschreibt die Durchführung des im 1. Beispiel dargelegten Assays im Objektträgerformat. Ein we- sentlicher Vorteil der Durchführung des Assays auf der
Oberfläche von Objektträgern besteht in der Möglichkeit, überschüssige Reagenzien nach jedem Einzelschritt durch geeignete Waschvorgänge vollständig zu entfernen.
ünbehandelte Objektträger werden gewaschen und mit einen Aminosilan chemisch behandelt. Zur weiteren Modifizierung der Oberfläche können unter Anwendung geeigneter chemischer Methoden ein oder mehrere Spacer wie zum Beispiel Aminoethoxyethoxyessigsäure (AEEA) angekuppelt werden. Anschließend wird die terminale Aminogruppe mit einer photochemisch spaltbaren Linkergruppe, vorzugsweise mit 4- [4- (1- (Fmocamino) ethyl) -2-methoxy-5-nitrophenoxy) - buttersäure versehen. Nach Abspaltung der Fmoc-Funktion wird die Slideoberfläche mit einem Überschuß eines homo- bifunktionalen Reagenz wie zum Beispiel Ethylenglykol- bis-succinimidylsuccinat (Pierce) entsprechend den Angaben des Herstellers behandelt. Auf die erhaltene Oberfläche können nun verschiedene aminomodifizierte Primer wie zum Beispiel TCTATTTACTTCATTCCACTTAAsT^C, kovalent immo- bilisiert werden. Vorraussetzung für die Anwendung im
Sinne des Patents sind eine mit „s" gekennzeichnete Thio- atmodifikation der vorletzten Phophorsäurediesterbindung am 3 '-Ende sowie eine mit „#λ indizierte Modifikation der vorletzten Nucleotidbase am 3 '-Ende mit einem Substituen- ten, der eine terminale primäre od er sekundäre Aminogruppe enthält, über die die kovalente Anbindung an die Oberfläche erfolgt.
Die Primerverlängerung erfolgt auf der Slideoberfläche in Analogie zum 1. Beispiel unter Bildung einer oberflächengebundenen Mischung der Verlängerungsprodukte TCTATT-
TACTTCATTCCACTTAAsT*CsA und TCTATTTACTTCATTCCACT- TAAsTffCsG. Der 5 '-Phosphordiesteraseverdau sowie die nachfolgende Methylierung der in den Abbauprodukten verbliebenen Phophothioatbindungen werden ebenfalls analog zum ersten Beispiel durchgeführt, wobei jeweils der gesamte Objektträger oder ein definierter Ausschnitt seiner Oberfläche mit den entsprechenden Reagenzien in Kontakt gebracht wird. Nach erfolgter Methylierung wird der Objektträger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, bevor der Photoliker durch Bestrahlung mit UV-Licht geeigneter Wellenlänge gespalten wird. Die resultierenden Spaltprodukte enthalten zwei Positionen vom 3 '-Ende en- fernt eine unter den Alkylierungsbedingungen nicht methy- lierte Phosphodiesterbindung, deren negative Ladung einen hochempfindlichen Nachweis der Reaktionsprodukte durch
MALDI-TOF ermöglicht. Die MALDI-Messung wird im negativen Ionenmodus direkt auf der Objektträgeroberfläche durchgeführt. Dazu wird vor der Messung auf Positionen, die Pri- merverlängerungsprodukte aufweisen, ein Aliquot einer Matrixlösung wie zum Beispiel Hydroxypicolinsäure oder Trihydroxyacetophenon aufgetragen. Die gemessene Massen der aus den Primerverlängerungsprodukten resultierenden Fragmente erlauben in Verbindung mit ihrer relativen Intensität in Analogie zum ersten Beispiel die Ermittlung des Methylierungsstatus der untersuchten Methylierungsposition in der Ursprungs-DNA.
3. Beispiel .-
Dieses Beispiel beschreibt eine weitere Möglichkeit zur
Durchführung des Assays auf der Oberfläche von Objektträgern. Die Objektträger werden gewaschen und analog dem 2. Beispiel mit einem Aminosilan und einer variablen Anzahl von AEEA-Spacereinheiten versehen. Anschließend erfolgt eine Aktivierung der terminalen Aminofunktion durch ein bifunktionales Reagenz wie beispielsweise Phenylen-1, 4-
diisothiocyanat . An die resultierende aktivierte Oberfläche werden 5 '-aminomodifizierte Primer wie zum Beispiel NH2-TCTATTTACTTCATTCCACTTAAsT*sC kovalent gebunden, wobei „s" und „*Xλ dieselbe Bedeutung wie im 1. Beispiel haben. Die Primerverlängerung erfolgt wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. Im vorliegenden Beispiel wird die Methylierung der Phosphothioatbindungen in den Primerver- längerungsprodukten direkt nach der Verlängerungsreaktion durchgeführt. Beim anschließenden partiellen Verdau der Primerverlängerungsprodukte wird der in den Beispielen 1 und 2 verwendeten 5'-Phosphodiesterase eine nicht sequenzspezifische Endonuclease wie zum Beispiel Nuclease Sl zugestetzt. Der Verdau wird positionsspezifisch durch punktgenaues Auftragen eines Tröpfchens Enzymlösung auf eine frei wählbare Position der Objektträgeroberfläche und anschließende Inkubation bei 100 Prozent Luftfeuchte durchgeführt. Der Nucleaseverdau resultiert zum einen in der Ablösung der alkylierten Primerverlängerungsprodukte von der Objektträgeroberfläche und zum anderen in der Bildung der derselben Produkte wie unter Beispiel 1, welche mit hoher Empfindlichkeit durch MALDI-TOF-Messung im positiven Ionenmodus nachgewiesen werden können.