EP1299554A1 - Sequences d'adn codant pour un transporteur de polyols et leur utilisation, notamment pour la preparation de plantes transgeniques - Google Patents

Sequences d'adn codant pour un transporteur de polyols et leur utilisation, notamment pour la preparation de plantes transgeniques

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Publication number
EP1299554A1
EP1299554A1 EP01947588A EP01947588A EP1299554A1 EP 1299554 A1 EP1299554 A1 EP 1299554A1 EP 01947588 A EP01947588 A EP 01947588A EP 01947588 A EP01947588 A EP 01947588A EP 1299554 A1 EP1299554 A1 EP 1299554A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
plants
sequence
nucleotide sequence
mannitol
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01947588A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Rémi René Paul LEMOINE
Nathalie Eliane Jacqueline Noiraud
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique
Publication of EP1299554A1 publication Critical patent/EP1299554A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance

Definitions

  • the invention relates to DNA sequences coding for a polyol transporter and their use, in particular for the preparation of transgenic plants.
  • Plants are able to synthesize, through photosynthesis, primary compounds like carbohydrates using light energy. Only certain organs of the plant, mainly the adult leaves, are able to manufacture and export carbohydrates to reserve organs, such as tubers, seeds and fruits, used in food and feed.
  • sucrose In most plants, the main carbohydrate transported is sucrose, but in many plants, other compounds are also transported, such as polyols, of which mannitol is an example.
  • Polyols are, like sucrose, primary products of photosynthesis. It has also been estimated that around 30% of the global production of primary carbon is used for the synthesis of polyols.
  • Polyols, cyclic or not, are very common in plants; these are low molecular weight, highly soluble and non-reducing compounds.
  • the three most common non-cyclic polyols (alditols) in Angiosperms are galactitol, sorbitol and mannitol.
  • Sorbitol is the main photosynthetic product in several Rosaceae species such as apple, pear, peach and plum.
  • Mannitol the most common alditol, is present in more than 100 species of higher plants, in particular in Rubiaceae (coffee), Oleaceae (privet, fen, olive) and Apiaceae (celery, carrot, parsley) (Lewis, 1984). It is produced in mesophyll cells (cells containing chlorophyll). To circulate, it must enter the screened tubes (ribs). However, there is no continuity between the mesophyll cells and the screened tubes: we therefore need a mannitol transporter. Thus, mannitol exits mesophyll cells and uses the transporter to enter the screened tubes.
  • the compounds synthesized in the adult leaves are transported to the reserve organs and cross a certain number of membranes using the specialized proteins that are the transporters. These transporters play a considerable role in the plant because they are essential for its growth.
  • the existence of a mannitol transporter in a plant such as celery has been demonstrated by various biochemical experiments (Salmon et al., 1995). This publication demonstrated that there is a mannitol transporter in celery and that expression of this transporter is very important in phloem tissue. However, nothing is said about the identification of the mannitol transporter.
  • the invention relates to polyol transporters in plants and fungi, and their DNA sequences.
  • a subject of the invention is also the use of the polyol transporter DNA sequences for obtaining transgenic plants.
  • a subject of the invention is also the use of polyol transporter DNA sequences, in particular in the context of obtaining plants resistant to pathogens or plants resistant to salt stress.
  • the invention also relates to the use of polyol transporter DNA sequences in the context of a method for screening genetically modified plants.
  • the invention relates to the use of a DNA sequence coding for a transporter of linear polyols, in plants and fungi, such as polyols having a main chain containing 5 to 8 carbon atoms, in particular 5 to 7 atoms. carbon, in particular 6 carbon atoms, which polyols are advantageously chosen from mannitol, sorbitol, dulcitol, galactitol, inositol, ribitol and xylitol, and in particular being mannitol, for the preparation of transgenic plants .
  • plants and fungi includes algae, mosses (Bryophytes), ferns (Pteridophytes), higher plants (Gymnosperms and Angiosperms) and fungi.
  • a polyol is a "polyalcohol” containing as many alcohol functions as carbon atoms. It is also specified that the terms polyol, polyalcohol and sugar alcohol are equivalent.
  • the invention relates to the use, for the preparation of transgenic plants, of a DNA sequence chosen from one of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 1 is a new nucleic acid sequence identified in celery (Apium graveolens L.), coding for a mannitol transporter.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 are sequences of nucleic acids coding for proteins of as yet unknown function.
  • SEQ ID NO: 3 (Beet 1) and SEQ ID NO: 4 (Beet 2) come from Beet (Beta vulgaris).
  • SEQ ID NO: 5 (Pst 1), SEQ ID NO: 6 (Pst 2), SEQ ID NO: 7 (Pst 3), SEQ ID NO: 8 (Pst 4) and SEQ ID NO: 9 (Pst 5) come from of Arabidopsis thaliana.
  • SEQ ID NO: 10 comes from Bacillus subtilis.
  • the invention also relates to a new protein, characterized in that it comprises or consists of:
  • linear polyols such as polyols having a main chain containing 5 to 8 carbon atoms, in particular 5 to 7 carbon atoms, in particular 6 carbon atoms, which polyols being advantageously chosen from mannitol, sorbitol, dulcitol, galactitol, inositol, ribitol and xylitol, and in particular being mannitol,
  • any homologous sequence of SEQ ID NO: 2 preferably having a homology of at least about 50% with the sequence SEQ ID NO: 2 and having the property of transporting, in plants and fungi, polyols as defined above, - or any fragment of one of the sequences defined above, provided that it has the property of transporting, in plants and fungi, polyols as defined above, in particular any fragment consisting of at least approximately 10 contiguous amino acids in the sequence SEQ ID NO: 2.
  • polyol transport property presented by a polyol transporter can be verified by any of the following tests:
  • yeast S. cerevisiae the use of yeast S. cerevisiae or
  • yeast Saccharomyces cerevisiae (Noiraud et al., 2000) includes the transformation of yeasts with the nucleotide sequence to be tested, which yeasts are capable of growing on said polyol. To verify that the polyol is transported in these yeasts, radioactive labeled polyol can be used. For each experiment, a control is developed with a yeast strain incapable of growing on the polyol, and which does not transport said polyol.
  • the test using a purified plasma membrane of phloem vesicles is that described by Salmon et al. (1995).
  • the protein of the invention is characterized in that it consists of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to the protein fragments as defined above, chosen from the following sequences:
  • the invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein as defined above.
  • nucleotide sequence derived by degeneration of the genetic code, from the sequence SEQ ID NO: 1 coding for a protein represented by SEQ rr> NO: 2, - or any nucleotide sequence derived, in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, of the sequence SEQ ID NO: 1 coding for a protein derived from SEQ ID NO: 2, as defined above,
  • nucleotide sequence homologous to SEQ ID NO: 1 preferably having a homology of at least about 35% with the sequence SEQ ID NO: 1 coding for a protein homologous to SEQ ID NO: 2, as defined above above,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or of the nucleotide sequences defined above said fragment preferably consisting of at least about 30 contiguous nucleotides in said sequence
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the complementary sequence of one of the sequences or of one of the abovementioned fragments.
  • the invention also relates to the fragments of nucleotide sequences as defined above, chosen from the following sequences:
  • GGT ATT GAT GCT GTT GTT TTA (SEQ ID NO: 29) delimited from the nucleotide in position (857) to the nucleotide in position (922) of the sequence SEQ ID NO: 1,
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 23 codes for the protein fragment SEQ ID NO: ll.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 24 codes for the protein fragment SEQ ED NO: 12.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 25 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 13.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 26 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 14.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 27 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 15.
  • the nucleic acid sequence SEQ ED NO: 28 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 16.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 29 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 17.
  • the nucleic acid sequence SEQ ED NO: 30 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 18.
  • the nucleic acid sequence SEQ ED NO: 31 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 19.
  • the nucleic acid sequence SEQ ED NO: 32 codes for the protein fragment SEQ ED NO: 20.
  • the nucleic acid sequence SEQ ED NO: 33 codes for the protein fragment SEQ ID NO: 21.
  • the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 34 codes for the protein fragment SEQ ED NO: 22.
  • the invention also relates to a recombinant vector, in particular plasmid, cosmid, phage or virus DNA, containing a nucleotide sequence as mentioned above.
  • the invention also relates to a recombinant vector as defined above, containing the elements necessary for the expression in a host cell of the polypeptides encoded by the nucleic acids as defined above, inserted into said vector.
  • the recombinant vector defined above contains in particular a promoter recognized by the RNA polymerase of the host cell, in particular an inducible promoter and optionally a transcription, termination sequence, and optionally a signal and / or anchor sequence.
  • the recombinant vector, as defined above contains the elements which allow the expression of a nucleotide sequence, as defined above, as a mature protein or fusion protein.
  • the invention also relates to a host cell, chosen in particular from bacteria, viruses, yeasts, fungi, plants or mammalian cells, said host cell being transformed, in particular using a recombinant vector such as defined above.
  • the host cell contains the regulatory elements allowing the expression of the nucleotide sequence as defined above.
  • the invention also relates to the expression product of a nucleic acid expressed by a transformed host cell as defined above.
  • the invention also relates to an antico ⁇ s characterized in that it is directed specifically against a protein of the invention.
  • the invention also relates to any monoclonal antico ⁇ s produced by any hybridoma capable of being formed according to conventional methods from, on the one hand, spleen cells of animals, in particular mice or rats, the ranimai cells being immunized against the protein of the invention, and on the other hand of cells of a myeloma cell line, said hybridoma being capable of being chosen according to the capacity of the cell line to produce monoclonal antibodies recognizing the protein used beforehand for animal immunization.
  • the invention also relates to a nucleotide probe capable of hybridizing with any of the nucleic acid sequences of the invention.
  • the invention also relates to the antisense oligonucleotides or antisense messenger RNA derived from the nucleotide sequences as defined above.
  • the invention also relates to plant cells containing in their genome a nucleotide sequence as defined above.
  • the invention also relates to transgenic plants, parts of plants, plant seeds or plant propagation material containing cells as defined above.
  • the invention relates in particular to transgenic plants which, in their native state, do not contain or express the gene for the mannitol transporter, into the genome of which said nucleotide sequence is introduced.
  • the invention relates in particular to transgenic plants which, in their native state, contain or express the gene for the mannitol transporter, into the genome of which said nucleotide sequence is introduced.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a recombinant protein as defined above, comprising the following steps:
  • a process for preparing a transgenic celery as defined above comprises the following steps:
  • the nucleotide sequences of the invention can be introduced into plasmids and be combined with regulatory elements for expression in eukaryotic cells. These regulatory elements are on the one hand transcription promoters and on the other hand transcription terminators. With the nucleotide sequences of the invention contained in the plasmids, it is possible to transform eukaryotic cells with the intention of expressing a translatable mRNA which makes possible the synthesis of a polyol transporter in the cells or with the intention of express an untranslatable mRNA, which prevents the synthesis of an endogenous polyol transporter in cells.
  • the methods of genetic modification of dicots and monocots are already known (Gasser et al., 1989).
  • the nucleotide sequences of the invention must be coupled with elements for regulating transcription. Such elements, called promoters, are already known (EP 375091).
  • the coding regions must be provided with the transcription termination signals with which they can be correctly transcribed. Such elements are also described (Gielen et al, 1989).
  • the transcription initiation region can be native and / or homologous as well as foreign and / or heterologous to the host plant. If desired, the termination regions are interchangeable with each other.
  • the DNA sequence of the initiation and termination regions of the transcription can be prepared synthetically or obtained naturally, or obtained from a mixture of constituents of natural or synthetic DNA.
  • cloning vectors which include a replication signal for E.coli and a marker which allows selection of the transformed cells.
  • nucleotide sequences of the invention into a plant cell host, in addition to the transformation using Agrobacteria, there are many other techniques. These techniques include protoplast fusion, DNA microinjection and electroporation, as well as ballistic methods and virus infection. From the transformed plant material, whole plants can be regenerated in a suitable medium, containing antibiotics or biocides for selection. The resulting plants can then be tested for the presence of the introduced DNA. There is no specific requirement for plasmids with regard to injection and electroporation. Simple plasmids such as pUC derivatives can be used. The presence of a marker gene is necessary for the regeneration of whole plants from such transformed cells. The transformed cells grow in plants in the usual way (McCormick et al., 1986). These plants can develop normally and be crossed with plants that have the same or different genes. The resulting hybrids have the corresponding phenotypic properties.
  • DNA sequences of the invention can also be introduced into plasmids and be combined with regulatory elements for expression in prokaryotic cells.
  • the DNA sequences of the invention can also be introduced into plasmids which allow mutagenesis or sequence modification by means of recombination of the DNA sequences in prokaryotic or eukaryotic systems.
  • the transgenic plants of the invention are in particular characterized by an increase in the capacity to transport a polyol of the invention and to accumulate it in the organs from which it is extracted. They can be used to direct the flows of said polyol using said transporter towards the organs which accumulate little salt, thus facilitating extraction.
  • the invention also relates to a method for screening genetically modified plants with at least one nucleotide sequence of interest which comprises the following steps:
  • This process concerns plants which do not synthesize polyol or plants which synthesize it.
  • a polyol transporter in particular mannitol.
  • the screening then takes place on a medium containing said polyol as the sole carbon source. Plants expressing the polyol transporter thus have a growth advantage over unprocessed plants. At this stage, it can be assumed that any plant is capable of using said polyol as a carbon source. However, it may prove necessary to make a co-transformation with a gene coding for a protein capable of degrading said polyol.
  • the use of a promoter active only in the initial phases of regeneration or inducible by a simple compound makes it possible to restrict the expression of the polyol transporter to the selection phases.
  • the invention also relates to a process for obtaining transgenic plants resistant to pathogens, which comprises the following steps: the transformation of plant cells with a nucleotide sequence coding for a polyol transporter as defined above,
  • This process relates to the transformation of plants which do not synthesize polyol or of plants which synthesize it, with a nucleotide sequence of a polyol transporter, in particular of mannitol, placed either under the control of a ubiquitous promoter (type CaMV 35S) or under the control of an inducible promoter in response to the attack of the pathogen.
  • a polyol transporter in particular of mannitol
  • the advantage is that the plant, by transporting more polyol, emitted by the pathogen to its own cells, removes one of the defenses put in place by the pathogen to fight against the activated oxygen released by the plant in response to this attack.
  • the invention relates to a process for obtaining transgenic plants resistant to salt stress, which comprises the following steps:
  • This method relates to the transformation of plants which do not synthesize polyol or of plants which synthesize it with a nucleotide sequence coding for a polyol transporter placed under the control of a specific promoter of the phloem (or of the promoter of the polyol transporter). If the plant synthesizes said polyol, increasing the transport of said polyol could lead to increased tolerance to salt stress. Otherwise, it is also appropriate to introduce genes allowing the synthesis of said polyol, but by limiting this synthesis to the leaves in order to avoid harmful effects on the growth of the plant.
  • Figure 1 represents the growth test of the yeast MaDH4 expressing the protein sequence AgMaTl.
  • the cDNA of AgMaTl under the control of the promoter ADH1, was introduced into the cells of the strain MaDH4, and the growth of the cells transfused with mannitol has been studied.
  • the transformed cells were cultured on liquid SC (complete synthetic) medium without tryptophan containing either 2% glucose (SC-glu) or 2% mannitol (SC-mann).
  • MaDH4-YEP112AlXE MaDH4 containing the empty plasmid
  • MaDH4-AgMaTl MaDH4 containing the plasmid with the nucleic acid of AgMaTl.
  • the white squares correspond to MaDH4 yeasts transformed with the empty plasmid YEP112A1XE (defined below) and cultured on SC-glucose medium.
  • the black squares correspond to MaDH4 yeasts transformed with the empty plasmid YEP112A1XE (defined below) and cultured on SC-mannitol medium.
  • the white circles correspond to MaDH4 yeasts transformed with AgMaTl / YEP112AlXE (plasmid YEP112A1XE containing the nucleic acid of AgMaTl) and cultured on SC-glucose medium.
  • the black circles correspond to MaDH4 yeasts transformed with AgMaTl / YEP112AlXE (plasmid YEP112A1XE containing the nucleic acid of AgMaTl) and cultured on SC-mannitol medium.
  • the curves represent the evolution over time of the absorbance (at 600 nm) of the yeast cultures.
  • This increase in absorbance corresponds in fact to an increase in the number of yeasts in the culture medium and is representative of the growth rate of the yeasts.
  • the yeasts transformed with the plasmids YEP112A1XE and AgMaTl / YEP112AlXE grow on glucose but only the yeasts transformed with the plasmid AgMaTl / YEP112AlXE are capable of growing on mannitol. This is therefore proof that AgMaTl codes for a mannitol transporter.
  • Figure 2 shows the abso ⁇ tion of manmtol in S. cerevisiae cells.
  • the external mannitol H concentration is 500 ⁇ M and the pH 4.5.
  • the squares represent the abso ⁇ tion in cells transformed with the nucleic acid of AgMaTl while the circles represent the abso ⁇ tion in control cells transformed with the empty plasmid YEP112A1XE. Only cells transformed with the plasmid AgMaTl / YEPl 12A1XE are capable of absorbing mannitol 3 H placed in the external medium.
  • Celery plants (Apium graveolens L. variety dulce, Green Elne cultivar) were grown in greenhouses according to the conditions described by Davis et al. (1988). The phloem bundles were isolated from adult petioles according to the technique described by Daie (1987).
  • Escherichia coli strains DH5 ⁇ (supE44, ⁇ lacU169 ( ⁇ 80, lacZM15), hsdR17, recA, endAl, gyrA96, thi-1, relAl) (strains sold by Clontech).
  • XLlBlue MRF '(Stratagene) and SOLR (Stratagene) were cultivated according to standard techniques (Sambrook et al., 1989).
  • the strain of Saccharomyces cerevisiae MaDH4 (ura3, trpl, LEU2, gapl-l, put4-l, uga4-1), the preparation of which is indicated below, expresses the yeast mannitol dehydrogenase gene and was used for the functional characterization of the AgMaTl cDNA.
  • the strain 2a was obtained by crossing between the strains ⁇ (MAT ⁇ , ura3, trpl, leu2) (Marcireau et al., 1992) and ⁇ 22574d (MATa, ura3-l, gapl-1, put4-l, uga4-T ) (Jauniaux et al., 1987).
  • Plasmid YEP 128A1 described in Riesmeier et al., Was used. (1992).
  • the yeast mannitol dehydrogenase gene (YEL070) was amplified by PCR (polymerase chain reaction) using the oligonucleotides MDHPST5 (5- GACTCGA- GATGACAAAATCAGACGAAACAAC-3) and MDHBGL3 (5- GAAGATCTTCACA- CTTGGTCTAAA) Genomic DNA of the Saccharomyces ⁇ strain.
  • the PCR product was cloned into the vector pBluescript SK digested beforehand with Pstl and BamRl.
  • the PCR product was digested with Pstl and Xbal and cloned into the sites Pstl / Xbal of YIP128A1.
  • the construct was integrated into the genome of S. cerevisiae by the EcoV site in the leu2 gene to obtain the MaDH4 strain.
  • RNA from celery leaves were isolated according to the method of Kay et al. (1987).
  • the first strand of cDNA was inversely transcribed from total RNA with the degenerate primer (5'-CCNACNCC (G / A) AANGGNA (G / A) NA (G / A) -3) derived from the LLGFGVG sequence using SuperScript TM II reverse transcriptase (Stratagene).
  • an attachment primer (dC) 16 was created at the 3 'end of the single-stranded cDNA by a deoxynucleotydil transferase (GibcoBRL).
  • PCR amplification was carried out using primers (dG) 16 and LLGFGVG under the following conditions: 2 min at 95 ° C then 30 cycles including denaturation of 2 min at 95 ° C, 2 min fixation at 55 ° C and an elongation of 2 min at 72 ° C.
  • the PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis and then cloned into the plasmid pGEM-T Easy (Promega).
  • RNAs of the phloem beams were isolated according to the method described by Kay et al. (1987).
  • the polyA + RNAs were purified with the PolyATtract mRNA isolation system (Promega).
  • a one-way EcoRl / Xhol bank was constructed in the phage Uni-ZapXR (Stratagene).
  • the recombinant phages (900,000) were screened with, as probe, the 5'RACE-PCR product radioactively labeled, in accordance with the manufacturer's protocol (Stratagene).
  • the HybondTM-N nylon filters (Amersham) were hybridized overnight at 42 ° C according to standard conditions (Stratagene).
  • Excision in vivo was performed on the 24 clones which had given a positive signal during the 3 successive rounds of screening.
  • the identified cDNAs have been partially sequenced. Sequence comparisons were made on the website of the National Center for Biotechnology Information. The regions transmembrane have been predicted with the Tmpred program (Hofmann and Stoffel,
  • the AgMaTl cDNA was ligated into the Pstl-Xhol sites of the yeast vector YEP112A1XE (Riesmeier et al., 1992). This vector allows the expression of cDNAs under the control of the yeast promoter ADH1. MaDH4 yeast cells were made competent and transformed according to the protocol described by Dohmen et al. (1991).
  • the yeast cultures grew on SC medium comprising either 2% glucose or 2% mannitol. Aliquots were taken regularly from the cultures and their absorbance was measured at 600 nm.
  • the cells were cultured until the logarithmic growth phase, rinsed in distilled water and resuspended at 80% (weight / volume) in extraction buffer (50 mM potassium phosphate pH 7.5, DTT 1 mM and Triton X100 at 0.5%). The cells were broken by vortexing with glass beads. Cell debris was removed by centrifugation and the crude extract used for the enzyme assay. Mannitol dehydrogenase activity was measured at 30 ° C according to Quain and
  • the cells were cultured until the start of the log phase (corresponding to an absorbance of 0.6 at 600 nm), washed in distilled water and resuspended at 1% (weight / volume) in SC medium buffered to pH 4.5 with MES 25 mM. An aliquot of 100 ⁇ l of the cell suspension was incubated for 60, 120, 180 and 300 s in 100 ⁇ l of a solution containing 500 ⁇ M [H] -mannitol. The reaction was stopped by adding 8 ml of water at 4 ° C and by filtration through glass fiber filters (Sartorius). The inco ⁇ orated radioactivity in the yeast cells was determined by counting in liquid scintillation (Packard). For experiments with inhibitors or competitors, the product was added 30s before the radioactive mannitol.
  • RNAs were isolated according to the method of Kay et al. (1987). The first strand of cDNA was inversely transcribed from total RNA with the oligo dT primer using SuperScript TM II reverse transcriptase (Stratagene). After degradation of the template RNA by RNaseH (Eurogentec), a PCR amplification was carried out using the primers 5 '(ATTCTGGTGTGTTGCTCG) and 3' (CAATGAACAGTATGATGTG) which allow the amplification of a fragment of 661 nucleotides.
  • the PCR conditions are as follows: 2 minutes at 95 ° C then 30 cycles including denaturation of 30 seconds at 95 ° C, fixation of one minute at 47 ° C and elongation of 45 seconds at 72 ° C.
  • the PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis and the intensity of the signal obtained quantified using Photoshop 5.0 software (Adobe Systems Inc.).
  • the elongation factor elF4A (10) was. used as a control gene whose expression is invariable.
  • the first strand of cDNA was reverse transcribed from the whole RNA of mature celery leaves, primed with a degenerate primer LLGFGVG. After amplification, a 1 kb band was observed on the agarose gel. All the fragments of this PCR reaction were cloned into a vector pGEM-T Easy (Promega), and several clones were obtained.
  • a cDNA library from phloem bundles isolated from petioles of mature celery was constructed and this library was screened with the clone 5'RACE-PCR. After screening 900,000 transformants, 24 positive clones were identified. Positive transformants with inserts of approximately 1.8-2.0 kb were chosen and partially sequenced.
  • AgMaTl was chosen for detailed analysis. It contains 1778 bp with an open reading frame which codes for a protein containing 513 amino acids with an estimated molecular mass of 56 kDa.
  • mannitol transporter is a bacteria mannitol phospho transferase (Boer et al, 1994) which carries out both the transport and the phosphorylation of mannitol.
  • This combined system is present in bacteria for many substrates, but it does not exist in eukaryotic organisms.
  • a first screening of the cDNA library was carried out with the part of the mannitolphospho-transferase gene corresponding to the transmembrane domain. This screening did not make it possible to obtain a result, which is justified a posteriori by the absence of significant homology between AgMaTl and the mannitol-phospho-transferase.
  • a second strategy which has been found to be inoperative, was inspired by that used to identify the transporter of oligosaccharides in plants (patent EP 0 647 273). It involved complementing Saccharomyces cerevisiae cells with a cDNA library in an expression vector. Yeasts are indeed capable of using mannitol as a carbon source, but they require a fairly long induction period on mannitol. As already stated, no mannitol transporter has been identified in yeast. The reasoning was that if a yeast expressed a mannitol transporter. vegetable, this would give it a growth advantage and that therefore, it would grow faster on a medium containing mannitol. This was done but none of the cDNAs obtained exhibited any of the characteristics of membrane proteins and actually resembled transcription factors. The selection system in fact made it possible to identify cDNAs which intervened in the expression of the yeast genes and not of the transporters.
  • the inventors formulated an a priori unlikely probability that the mannitol transporter is part of the super family of carbohydrate transporters described by Marger and Saier (1993). To do this, we used a species, celery, in which the existence of a mannitol transporter had been demonstrated (Salmon et al., 1995) and to build a cDNA library from tissue (the phloem ) in which the carrier is most expressed. The second step was the selection of the cDNAs obtained on their capacity to confer on yeasts the possibility of transporting mannitol. In these experiments the witness was the yeast strain transformed with the empty expression plasmid. This is how the mannitol transporter function of the AgMaTl cDNA was demonstrated.
  • the AgMaTl cDNA was subcloned into the Pstl / Xhol sites of the shuttle vector YEP 112A1XE which has a promoter / terminator box for the alcohol dehydrogenase gene ADH1 of S. cerevisiae (Riesmeier et al, 1992). Competent MaDH4 cells were transformed with this construct and YEP 112A1XE was used as a control. All of the constructs were first tested for their ability to grow on mannitol as the sole source of carbon. As indicated in FIG.
  • the MaDH4 strain transformed with the empty plasmid YEP 112A1XE, is not capable of growing on mannitol.
  • Cells expressing AgMaTl could very well grow on this polyol.
  • the yeast cells were incubated in a medium containing [ 3 H] - mannitol for a few seconds to several minutes, the cells were washed and the radioactivity absorbed was measured by electric scintillation counting.
  • Figure 2 indicates that the transport of mannitol in control cells of S. cerevisiae is negligible.
  • yeast strains MaDH4 expressing AgMaTl, transport [H] -mannitol at high speeds when they grow on a medium containing mannitol.
  • the same result was obtained with transformed yeast cells growing on glycerol (data not indicated).
  • polyols such as dulcitol, sorbitol, xylitol, myo-inositol seem to be able to inhibit the absorption of mannitol by half.
  • Celery branch plants (about 10 cm high) regenerated from embryogenic cells are used as plant material for processing.
  • Agrobacterium tumefaciens bacteria are cultivated for 24 h at 28 ° C. with stirring in LB medium (Liquid Broth: tryptone 1%, autolytic yeast extract 0.5%), NaCl 0.5%)) with the appropriate antibiotic.
  • the petioles of celery plants are fragmented in sections of about 0.5 cm. For each fragment, a longitudinal section is made.
  • the celery segments are incubated in 1 ⁇ MS medium (Murashige & Skoog) (normal concentration, that is to say no dilution) liquid containing 1/25 me of the culture of Agrobacterium tumefaciens bacteria for 60 min at temperature. room.
  • the excess bacteria is then removed from the celery segments by placing them on paper towels for 2-3 min.
  • the side of the celery segments is placed in contact with the RM agar regeneration medium.
  • the Petri dishes are placed in an air-conditioned room at 25 ° C and subjected to light / dark cycles 16 h / 8 h.
  • the celery segments are removed from the boxes of RM medium and transferred to liquid MS 1 X supplemented with cefotaxime at a final concentration of 250 ⁇ g / ml. After a 60 min incubation, the celery segments are dried on paper towels for 2-3 min.
  • the cambial surface of the celery segments is placed in contact with the CIM agar callogenesis initiation medium.
  • CEM Petri dishes are placed in an air-conditioned room at 25 ° C and subjected to light / dark cycles 16 h / 8 h until callus development (2-3 weeks).
  • the celery segments are then transferred to an OEM agar induction medium (2-3 weeks). After the appearance of the buds, these are removed and placed on the EM agar rooting medium. A few weeks (3-4 weeks) are necessary for the development of young celery shoots. Composition of media

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une châine principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques.

Description

SEQUENCES D'ADN CODANT POUR UN TRANSPORTEUR DE POLYOLS ET LEUR UTILISATION, NOTAMMENT POUR LA PREPARATION DE PLANTES TRANSGENIQUES
L'invention concerne des séquences d'ADN codant pour un transporteur de polyols et leur utilisation, notamment pour la préparation de plantes transgéniques.
Les plantes sont capables de synthétiser, par l'intermédiaire de la photosynthèse, des composés primaires comme les glucides en utilisant l'énergie lumineuse. Seuls certains organes de la plante, principalement les feuilles adultes, sont aptes à fabriquer et à exporter les glucides vers les organes de réserve, comme les tubercules, les graines et les fruits, utilisés dans l'alimentation humaine et animale.
Chez la plupart des plantes, le principal glucide transporté est le saccharose, mais chez de très nombreux végétaux, d'autres composés sont également transportés comme les polyols dont le mannitol est un exemple.
Les polyols sont, comme le saccharose, des produits primaires de la photosynthèse. On a d'ailleurs estimé qu'environ 30% de la production globale de carbone primaire était utilisé pour la synthèse des polyols.
Les polyols, cycliques ou non, sont très répandus chez les plantes ; ce sont des composés de faible poids moléculaire, très solubles et non réducteurs. Les trois polyols non cycliques (alditols) les plus répandus chez les Angiospermes sont le galactitol, le sorbitol et le mannitol. Le sorbitol est le produit photosynthétique principal chez plusieurs espèces de Rosacées telles que la pomme, la poire, la pêche et la prune.
Le mannitol, le plus répandu des alditols, est présent chez plus de 100 espèces de ' végétaux supérieurs, en particulier chez les Rubiacées (café), les Oléacées (troène, f êne, olive) et les Apiacées (céleri, carotte, persil) (Lewis, 1984). Il est produit dans les cellules de mésophylle (cellules contenant la chlorophylle). Pour circuler, il doit rentrer dans les tubes criblés (nervures). Cependant, il n'y a pas de continuité entre les cellules mésophylles et les tubes criblés : on a donc besoin d'un transporteur de mannitol. Ainsi, le mannitol sort des cellules mésophylles et utilise le transporteur pour pénétrer dans les tubes criblés.
Les composés synthétisés dans les feuilles adultes sont transportés vers les organes de réserve et traversent un certain nombre de membranes à l'aide des protéines spécialisées que sont les transporteurs. Ces transporteurs jouent un rôle considérable dans la plante car ils sont indispensables à sa croissance. L'existence d'un transporteur de mannitol chez une plante telle que le céleri a été démontrée par différentes expériences biochimiques (Salmon et al., 1995). Cette publication a démontré qu'il existait un transporteur de mannitol chez le céleri et que l'expression de ce transporteur était très importante dans les tissus du phloème. Cependant, rien n'est dit quant à l'identification du transporteur de mannitol.
Si de nombreux transporteurs de sucres, comme le saccharose et les hexoses ont été clones au cours des dernières années, aucun de ceux-ci n'est capable de transporter de polyol.
A l'heure actuelle, aucun transporteur de polyol linéaire n'a été identifié chez un organisme vivant. Chez les bactéries, un système multienzymatique capable de transporter et de phosphoryler à la fois le mannitol a été décrit (Boer et al., 1994). Toutefois, de tels systèmes n'ont jamais été décrits chez les organismes supérieurs.
L'invention a pour objet des transporteurs de polyols chez les plantes et les champignons, et leurs séquences d'ADN.
L'invention a également pour objet l'utilisation des séquences d'ADN de transporteur de polyol pour l'obtention de plantes transgéniques.
L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences d'ADN de transporteur de polyol, notamment dans le cadre de l'obtention de plantes résistantes aux pathogènes ou de plantes résistantes au stress salin.
L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences d'ADN de transporteur de polyol dans le cadre d'une méthode de criblage de plantes génétiquement modifiées.
L'invention concerne l'utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols linéaires, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques.
Dans l'expression "plantes et champignons", on englobe les algues, les mousses (Bryophytes), les fougères (Ptéridophytes), les plantes supérieures (Gymnospermes et Angiospermes) et les champignons. On rappelle que, par définition, un polyol est un "polyalcool" contenant autant de fonctions alcool que d'atomes de carbone. On précise également que les termes polyol, polyalcool et sucre alcool sont équivalents.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation, pour la préparation de plantes transgéniques, d'une séquence d'ADN choisie parmi l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10.
SEQ ID NO : 1 est une nouvelle séquence d'acide nucléique identifiée chez le céleri (Apium graveolens L.), codant pour un transporteur de mannitol.
SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 sont des séquences d'acides nucléiques codant pour des protéines de fonction jusqu'à ce jour inconnue.
SEQ ID NO : 3 (Beet 1) et SEQ ID NO : 4 (Beet 2) proviennent de la Betterave (Beta vulgaris).
SEQ ID NO : 5 (Pst 1), SEQ ID NO : 6 (Pst 2), SEQ ID NO : 7 (Pst 3), SEQ ID NO : 8 (Pst 4) et SEQ ID NO : 9 (Pst 5) proviennent d'Arabidopsis thaliana.
SEQ ID NO : 10 (Bs) provient de Bacillus subtilis.
L'invention concerne également une nouvelle protéine, caractérisée par le fait qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence SEQ ID NO : 2,
- ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO : 2, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ayant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols linéaires, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol,
- toute séquence homologue de SEQ ID NO : 2, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 50% avec la séquence SEQ ID NO : 2 et possédant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il possède la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 10 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 2.
La propriété de transport de polyols présentée par un transporteur de polyols peut être vérifiée par l'un ou l'autre des tests suivants :
- l'utilisation de levure S.cerevisiae ou
- l'utilisation de membrane plasmique purifiée de vésicules du phloème. L'utilisation de la levure Saccharomyces cerevisiae (Noiraud et al., 2000) comprend la transformation des levures avec la séquence nucléotidique à tester, lesquelles levures sont capables de croître sur ledit polyol. Pour vérifier que le polyol est transporté dans ces levures, on peut utiliser du polyol marqué radioactivement. Pour chaque expérience, un contrôle est mis au point avec une souche de levure incapable de pousser sur le polyol, et qui ne transporte pas ledit polyol.
Le test ayant recours à une membrane plasmique purifiée de vésicules du phloème est celui décrit par Salmon et al. (1995).
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine de l'invention, telle que définie ci-dessus, est caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2.
L'invention concerne également les fragments de protéine telle que définie ci- dessus, choisis parmi les séquences suivantes :
- Ala Cys Ala Leu Leu. Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Thr Gly Val Leu Ser Gly Ala Ser Ile (SEQ ID NO : 11) délimitée de l'acide aminé en position (26) à l'acide aminé en position (50) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Gin Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile Ile Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Gly Ser Ala Ile Ala Gly (SEQ ID NO : 12) délimitée de l'acide aminé en position (62) à l'acide aminé en position (82) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Tyr Thr Met Val Leu Ala Gly Ile Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe Met Gly Leu Ala (SEQ ID NO : 13) délimitée de l'acide aminé en position (92) à l'acide aminé en position (111) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala (SEQ ID NO : 14) délimitée de l'acide aminé en position (116) à l'acide aminé en position (140) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala Phe Ala (SEQ ID NO : 15) délimitée de l'acide aminé en position (150) à l'acide aminé en position (174) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Ile Met Leu Gly Ile Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile Val Leu Tyr Met (SEQ ID NO : 16) délimitée de l'acide aminé en position (184) à l'acide aminé en position (203) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Ala Ala Ile Thr Gly Ile Gly Ile His Phe Phe Gin Gin Ala Cys Gly Ile Asp Ala Val Val Leu (SEQ ID NO : 17) délimitée de l'acide aminé en position (281) à l'acide aminé en position (302) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val Phe Ile Leu Ile Ser Thr Phe (SEQ ID NO : 18) délimitée de l'acide aminé en position (320) à l'acide aminé en position (339) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu Ala Gly Ser Leu Thr Val (SEQ ID NO : 19) délimitée de l'acide aminé en position (349) à l'acide aminé en position (370) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Gly Gly Leu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe Ser Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Tφ Val Tyr (SEQ ID NO : 20) délimitée de l'acide aminé en position (382) à l'acide aminé en position (407) de la séquence SEQ ID NO : 2,
- Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn Arg Gly Met Ser Gly Ile Ile Gly Met Thr Phe Ile Ser (SEQ ID NO : 21) délimitée de l'acide aminé en position (421) à l'acide aminé en position (441) de la séquence SEQ ID NO : 2, et
- Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser Ile Gly Tφ Val Phe Met Tyr Thr Met Phe (SEQ ID NO : 22) délimitée de l'acide aminé en position (451) à l'acide aminé en position (470) de la séquence SEQ ID NO : 2,
L'invention concerne également une , séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus.
Une séquence d'ADN avantageuse de l'invention comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine représentée par SEQ rr> NO : 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 35% avec la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus,
- ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 30 nucléotides contigus dans ladite séquence,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés,
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés.
Par conditions stringentes d'hybridation on entend :
- température d'hybridation : 65°C,
- milieu d'hybridation : tampon phosphate de sodium 250 mM, pH 7,2 ; 6,6% (p/v) de SDS ; 1 mM EDTA ; 1% (p/v) d'albumine serine de bœuf,
- température de lavage : 65 °C,
- milieux de rinçage successifs :
2x SSC (1,75% NaCl ; 0,88% citrate de sodium), SDS 0,1% lx SSC (0,875% NaCl ; 0,44% citrate de sodium), SDS 0,1% 0,5x SSC (0,44% NaCl ; 0,22% citrate de sodium), SDS 0,1%. L'invention concerne également les fragments de séquences nucléotidiques telle que définies ci-dessus, choisis parmi les séquences suivantes :
- GCT TGT GCT CTT TTA GCT TCC ATG AAT TCC ATC TTA CTC GGC TAT GAC ACC GGA GTG TTG AGT GGA GCA TCA ATA (SEQ ID NO : 23) délimitée du nucléotide en position (92) au nucléotide en position (166) de la séquence SEQ ID NO : 1,
- CAA ATC GAA ATA ATC ATC GGA ATC ATC AAC ATC TAC TCT CTT CTT GGT TCG GCC ATA GCC GGA (SEQ ID NO : 24) délimitée du nucléotide en position (200) au nucléotide en position (262) de la séquence SEQ ID NO : 1, TAC ACCATG GTA CTA GCT GGT ATC ATATTT TTT CTA GGA GCC ATT
TTC ATG GGG CTT GCT (SEQ ID NO : 25) délimitée du nucléotide en position
(290) au nucléotide en position (349) de la séquence SEQ ID NO : 1,
TTT CTC ATG TTT GGT CGC TTT GTT GCT GGA ATT GGT GTC GGT TAT
GCC ATG ATG ATC GCT CCC GTC TAC ACT GCC (SEQ ID NO : 26) délimitée du nucléotide en position (362) au nucléotide en position (436) de la séquence SEQ
ID NO : l,
TTC CTC ACT TCT TTT CCT GAG GTT TTC ATT AAT TCT GGT GTG TTG
CTC GGG TAT GTA TCC AAC TTT GCA TTT GCC (SEQ ID NO : 27) délimitée du nucléotide en position (464) au nucléotide en position (538) de la séquence SEQ
ID NO : l,
ATT ATG CTG GGAATT GGA GCA TTT CCT TCA GTT GCC TTG GCC ATA
ATT GTG TTA TAT ATG (SEQ ID NO : 28) délimitée du nucléotide en position
(566) au nucléotide en position (625) de la séquence SEQ ID NO : 1,
GCT GCAATT ACG GGT ATT GGT ATT CAT TTC TTC CAA CAG GCT TGT
GGT ATT GAT GCT GTT GTT TTA (SEQ ID NO : 29) délimitée du nucléotide en position (857) au nucléotide en position (922) de la séquence SEQ ID NO : 1,
CTC CTT GCG ACA ATT GCT GTT GGA GTC TGC AAA ACA GTC TTT ATT
CTG ATA TCA ACG TTT (SEQ JD NO : 30) délimitée du nucléotide en position
(974) au nucléotide en position (1033) de la séquence SEQ ID NO : 1,
CTG ATG CTA ACA AGT ATG GGG GGT ATG GTT ATT GCT CTA TTT GTA
CTG GCA GGC TCA TTG ACG GTT (SEQ ID NO : 31) délimitée du nucléotide en position (1061) au nucléotide en position (1126) de la séquence SEQ ID NO : 1,
GGT GGT TTG GCA ATA TTT ACA GTG TAT GCT T^TT GTG TCG ATA TTT
TCA AGT GGC ATG GGT CCA ATT GCT TGG GTC TAT (SEQ ID NO : 32) délimitée du nucléotide en position (1160) au nucléotide en position (1237) de la séquence SEQ ID NO : 1,
TGTAGTATC GGAGTGGCAGTTAAC CGT GGCATGAGT GGCATAATT
GGA ATG ACA TTT ATA TCG (SEQ ID NO : 33) délimitée du nucléotide en position (1277) au nucléotide en position (1339) de la séquence SEQ ID NO : 1,
GCA TTC CTT TTA TTT GCT GTG GTT GCA TCT ATC GGA TGG GTC TTT
ATG TAC ACA ATG TTC (SEQ ID NO : 34) délimitée du nucléotide en position
(1367) au nucléotide en position (1426) de la séquence SEQ ID NO : 1, La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 23 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : ll.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 24 code pour le fragment de protéine SEQ ED NO : 12.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 25 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 13.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 26 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 14.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 27 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 15.
La séquence d'acide nucléique SEQ ED NO : 28 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 16.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 29 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 17.
La séquence d'acide nucléique SEQ ED NO : 30 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 18.
La séquence d'acide nucléique SEQ ED NO : 31 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 19.
La séquence d'acide nucléique SEQ ED NO : 32 code pour le fragment de protéine SEQ ED NO : 20.
La séquence d'acide nucléique SEQ ED NO : 33 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 21.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 34 code pour le fragment de protéine SEQ ED NO : 22.
L'invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que mentionnée ci-dessus.
L'invention concerne également un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques tels que définis ci-dessus, insérés dans ledit vecteur.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant défini ci-dessus contient notamment un promoteur reconnu par l'ARN polymérase de la cellule hôte, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence de transcription, de terminaison, et éventuellement une séquence signal et/ou d'ancrage. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant, tel que défini ci-dessus, contient les éléments qui permettent l'expression d'une séquence nucléotidique, telle que définie ci-dessus, en tant que protéine mature ou protéine de fusion.
L'invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cellule hôte, telle que définie ci-dessus, contient les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également le produit de l'expression d'un acide nucléique exprimé par une cellule hôte transformée telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également un anticoφs caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine de l'invention.
On ne se limite pas aux anticoφs polyclonaux ; l'invention concerne également tout anticoφs monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé selon les méthodes classiques à partir, d'une part, de cellules de rate d'animaux, en particulier de souris ou de rat, les cellules de ranimai étant immunisées contre la protéine de l'invention, et d'autre part de cellules d'une lignée cellulaire de myélome, ledit hybridome étant susceptible d'être choisi selon la capacité de la lignée cellulaire à produire des anticoφs monoclonaux reconnaissant la protéine utilisée au préalable pour l'immunisation des animaux.
L'invention concerne également une sonde nucléotidique capable d'hybrider avec l'une quelconque des séquences nucléiques de l'invention.
L'invention concerne également les oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques tels que définis ci-dessus.
Par modification de l'expression du transporteur de mannitol, en utilisant des oligonucléotides antisens, on peut alors déterminer si une diminution de l'expression du transporteur de mannitol a pour conséquence une diminution de la tolérance au stress salin.
L'invention concerne également les cellules de plantes contenant dans leur génome une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également les plantes transgéniques, parties de plantes, semences de plantes ou matériel de propagation de plantes contenant des cellules telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne en particulier les plantes transgéniques qui, à l'état natif, ne contiennent pas ou n'expriment pas le gène du transporteur de mannitol, dans le génome desquelles est introduit ladite séquence nucléotidique.
L'invention concerne en particulier les plantes transgéniques qui, à l'état natif, contiennent ou expriment le gène du transporteur de mannitol, dans le génome desquelles est introduit ladite séquence nucléotidique.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une protéine recombinante telle que définie ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- la culture dans un milieu approprié d'une cellule hôte qui a été auparavant transformée par un vecteur approprié contenant un acide nucléique de l'invention, et
- la récupération de la protéine produite par la susdite cellule hôte transformée à partir du susdit milieu de culture ou à partir de la cellule hôte.
Par exemple, un procédé de préparation d'un céleri transgénique tel que défini ci- dessus, comprend les étapes suivantes :
- l'inoculation des tissus de Céleri,
- la coculture des segments de Céleri et des bactéries A. tumefaciens,
- Y élimination des bactéries A. tumefaciens,
- la régénération des plants de Céleri transformés (Nadel et al., 1989).
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être introduites dans des plasmides et être combinées avec des éléments de régulation pour l'expression dans des cellules eucaryotes. Ces éléments de régulation sont d'une part des promoteurs de transcription et d'autre part des terminateurs de transcription. Avec les séquences nucléotidiques de l'invention contenues dans les plasmides, on peut transformer les cellules eucaryotes dans l'intention d'exprimer un ARNm traduisible qui rend possible la synthèse d'un transporteur de polyol dans les cellules ou dans l'intention d'exprimer un ARNm non traduisible, qui empêche la synthèse d'un transporteur de polyol endogène dans les cellules.
Les procédés de modification génétique des dicotylédones et monocotylédones sont déjà connus (Gasser et al., 1989). Pour l'expression dans les plantes, les séquences nucléotidiques de l'invention doivent être couplées avec des éléments de régulation de la transcription. De tels éléments, appelés promoteurs, sont déjà connus (EP 375091). De plus, il faut fournir les régions codantes avec les signaux de terminaison de la transcription avec lesquels ils peuvent être correctement transcrits. De tels éléments sont également décrits (Gielen et al, 1989). La région d'initiation de la transcription peut être native et/ou homologue de même qu'étrangère et/ou hétérologue à la plante hôte. Si on le souhaite, les régions de terminaison sont interchangeables entre elles. La séquence d'ADN des régions d'initiation et de terminaison de la transcription peut être préparée synthétiquement ou obtenue naturellement, ou obtenue à partir d'un mélange de constituants d'ADN naturel ou synthétique. Pour introduire des gènes étrangers dans des plantes supérieures, un grand nombre de vecteurs de clonage sont disponibles qui incluent un signal de réplication pour E.coli et un marqueur qui permet une sélection des cellules transformées.
Pour l'introduction des séquences nucléotidiques de l'invention dans un hôte cellulaire de plante, en plus de la transformation utilisant Agrobacteria, il existe beaucoup d'autres techniques. Ces techniques incluent la fusion de protoplastes, la microinjection d'ADN et l'électroporation, ainsi que des méthodes balistiques et l'infection de virus. A partir du matériel de plante transformé, les plantes entières peuvent être régénérées dans un milieu adapté, contenant des antibiotiques ou des biocides pour la sélection. Les plantes résultantes peuvent ensuite être testées pour la présence de l'ADN introduit. Il n'y a pas d'exigence particulière pour les plasmides en ce qui concerne l'injection et l'électroporation. On peut utiliser de simples plasmides tels que les dérivés pUC. La présence d'un gène marqueur est nécessaire pour la régénération de plantes entières à partir de telles cellules transformées. Les cellules transformées se développent dans les plantes de manière usuelle (McCormick et al., 1986). Ces plantes peuvent se développer normalement et être croisées avec des plantes qui possèdent les mêmes gènes transformés ou des gènes différents. Les hybrides résultants ont les propriété phénotypiques correspondantes.
Les séquences d'ADN de l'invention peuvent également être introduites dans des plasmides et être combinées avec des éléments de régulation pour une expression dans des cellules procaryotes.
Les séquences d'ADN de l'invention peuvent également être introduites dans des plasmides qui permettent une mutagenèse ou une modification de séquence au moyen d'une recombinaison des séquences d'ADN dans les systèmes procaryotes ou eucaryotes. Les plantes transgéniques de l'invention sont notamment caractérisées par une augmentation de la capacité à transporter un polyol de l'invention et à l'accumuler dans les organes à partir desquels il est extrait. Elles peuvent être utilisées pour orienter les flux dudit polyol à l'aide dudit transporteur vers les organes qui accumulent peu de sel, facilitant ainsi l'extraction.
L'invention concerne également un procédé de criblage de plantes génétiquement modifiées avec au moins une séquence nucléotidique d'intérêt qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec un vecteur contenant une séquence d'insertion, ladite séquence d'insertion comprenant la séquence nucléotidique d'intérêt et une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus,
- la mise en culture des cellules ainsi transformées sur un milieu contenant ledit polyol comme unique source de carbone, pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques contenant ladite séquence d'insertion.
Ce procédé concerne les plantes ne synthétisant pas de polyol ou les plantes qui le synthétisent.
Il s'agit, plus particulièrement, de transformer des fragments ou des cellules de plantes avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol, notamment de mannitol. Le criblage s'opère ensuite sur un milieu contenant ledit polyol comme seule source de carbone. Les plantes exprimant le transporteur de polyol ont ainsi un avantage de croissance sur les plantes non transformées. A ce stade, on peut supposer que toute plante est capable d'utiliser ledit polyol comme source de carbone. Toutefois, il peut s'avérer nécessaire de faire une co-transformation avec un gène codant une protéine capable de dégrader ledit polyol. L'utilisation d'un promoteur actif uniquement dans les phases initiales de régénération ou inductible par un composé simple permet de restreindre l'expression du transporteur de polyol aux phases de sélection.
Il s'agit donc d'un système de sélection simple basé sur un gène de plante qui n'est plus nécessaire une fois la sélection terminée et sur l'utilisation d'un produit naturel comme agent de sélection. Ce système évite d'avoir recours à l'utilisation de produits susceptibles d'être toxiques, tels que des antibiotiques.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes, qui comprend les étapes suivantes : - la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus,
- la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
Ce procédé concerne la transformation de plantes ne synthétisant pas de polyol ou de plantes qui le synthétisent, avec une séquence nucléotidique d'un transporteur de polyol, notamment de mannitol, placé soit sous le contrôle d'un promoteur ubiquiste (type CaMV 35S) soit sous le contrôle d'un promoteur inductible en réponse à l'attaque du pathogène. L'intérêt réside en ce que la plante, en transportant vers ses propres cellules davantage de polyol, émis par le pathogène, supprime un des moyens de défense mis en place par le pathogène pour lutter contre l'oxygène activé libéré par la plante en réponse à cette attaque.
On peut, pour augmenter l'efficacité du procédé, coupler l'expression du transporteur de polyol avec une enzyme dégradant ledit polyol.
L'invention concerne un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes au stress salin, qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus,
- la mise en culture" des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
Ce procédé concerne la transformation de plantes ne synthétisant pas de polyol ou de plantes qui le synthétisent avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol placé sous contrôle d'un promoteur spécifique du phloème (ou du promoteur du transporteur de polyol). Si la plante synthétise ledit polyol, l'augmentation du transport dudit polyol pourrait conduire à une tolérance accrue au stress salin. Dans le cas contraire, il convient également d'introduire des gènes permettant la synthèse dudit polyol, mais en limitant cette synthèse aux feuilles afin d'éviter des effets néfastes sur la croissance de la plante.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente le test de croissance de la levure MaDH4 exprimant la séquence protéique AgMaTl. L'ADNc de AgMaTl, sous contrôle du promoteur ADH1, a été introduit dans les cellules de la souche MaDH4, et la croissance des cellules transfonnées sur mannitol a été étudiée. Les cellules transformées ont été cultivées sur du milieu SC (synthétique complet) liquide sans tryptophane contenant soit du glucose 2% (SC-glu) soit du mannitol 2% (SC-mann).
MaDH4-YEP112AlXE : MaDH4 contenant le plasmide vide ;
MaDH4-AgMaTl : MaDH4 contenant le plasmide avec l'acide nucléique de AgMaTl.
Les carrés blancs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec le plasmide vide YEP112A1XE (défini ci-après) et cultivées sur du milieu SC-glucose.
Les carrés noirs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec le plasmide vide YEP112A1XE (défini ci-après) et cultivées sur du milieu SC-mannitol.
Les cercles blancs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec AgMaTl/YEP112AlXE (plasmide YEP112A1XE contenant l'acide nucléique de AgMaTl) et cultivées sur du milieu SC-glucose.
Les cercles noirs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec AgMaTl/YEP112AlXE (plasmide YEP112A1XE contenant l'acide nucléique de AgMaTl) et cultivées sur du milieu SC-mannitol.
Les courbes représentent l'évolution en fonction du temps de l'absorbance (à 600 nm) des cultures de levure. Cette augmentation de l'absorbance correspond en fait à une augmentation du nombre de levures dans le milieu de culture et est représentative de la vitesse de croissance des levures. Ainsi les levures transformées avec les plasmides YEP112A1XE et AgMaTl/YEP112AlXE poussent sur du glucose mais seules les levures transformées avec le plasmide AgMaTl/YEP112AlXE sont capables de pousser sur du mannitol. Il s'agit donc d'une preuve que AgMaTl code un transporteur de mannitol.
La Figure 2 représente l'absoφtion de manmtol dans des cellules de S. cerevisiae. La concentration externe en mannitol H est de 500 μM et le pH de 4,5. Les carrés représentent l'absoφtion dans des cellules transformées avec l'acide nucléique de AgMaTl tandis que les cercles représentent l'absoφtion dans des cellules témoins transformées avec le plasmide YEP112A1XE vide. Seules les cellules transformées avec le plasmide AgMaTl/YEPl 12A1XE sont capables d'absorber le mannitol 3H placé dans le milieu externe. MATERIEL ET METHODES
Matériel végétal
Des plants de Céleri (Apium graveolens L. variété dulce, cultivar Vert d'Elne) ont été cultivés en serres selon les conditions décrites par Davis et al. (1988). Les faisceaux phloémiens ont été isolés à partir de pétioles adultes selon la technique décrite par Daie (1987).
Souches bactériennes et de levures
Les souches suivantes ont été utilisées dans cette étude : Escherichia coli souches DH5α (supE44, ΔlacU169 (φ80, lacZM15), hsdR17, recA, endAl, gyrA96, thi-1, relAl) (souches commercialisées par Clontech). XLlBlue MRF' (Stratagene) et SOLR (Stratagene) ont été cultivées selon les techniques standard (Sambrook et al., 1989). La souche de Saccharomyces cerevisiae MaDH4 (ura3, trpl, LEU2, gapl-l,put4-l, uga4- 1), dont la préparation est indiquée ci-après, exprime le gène de la mannitol déshydrogénase de levure et a été utilisée pour la caractérisation fonctionnelle de l'ADNc de AgMaTl. La souche 2a a été obtenue par croisement entre les souches Δα (MATα, ura3, trpl, leu2) (Marcireau et al., 1992) et ∑22574d (MATa, ura3-l, gapl-1, put4-l, uga4-T) (Jauniaux et al., 1987).
Vecteur d'expression dans les levures
On a utilisé le plasmide YEP 128A1, décrit dans Riesmeier et al. (1992). Le gène de la mannitol déshydrogénase de levure (YEL070) a été amplifié par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) en utilisant les oligonucléotides MDHPST5 (5- GACTCGA- GATGACAAAATCAGACGAAACAAC-3) et MDHBGL3 (5- GAAGATCTTCACA- CTTGGTCTAAAATTTCC-3) sur l'ADN génomique de la souche de Saccharomyces Δα. Le produit de la PCR a été clone dans le vecteur pBluescript SK digéré préalablement par Pstl et BamRl. Après sequençage pour confirmer la séquence du gène amplifié, le produit de PCR a été digéré par Pstl et Xbal et clone dans les sites Pstl/Xbal de YIP128A1. La construction a été intégrée dans le génome de S. cerevisiae par le site EcoV dans le gène leu2 pour obtenir la souche MaDH4.
5'RACE-PCR f Amplification rapide des extrémités d'ADNc par PCR),
Des ARN totaux de feuilles de céleri ont été isolés selon la méthode de Kay et al. (1987). Le premier brin d'ADNc à été inversement transcrit à partir de l'ARN total avec l'amorce dégénérée (5'-CCNACNCC(G/A)AANGGNA(G/A)NA(G/A)-3) dérivée de la séquence LLGFGVG en utilisant la transcriptase inverse SuperScript™ II (Stratagene). Après dégradation de la matrice ARN par la RNaseH (Eurogentec), une amorce d'accrochage (dC)16 a été créée à l'extrémité 3' de l'ADNc simple brin par une déoxynucleotydil transférase (GibcoBRL). Une amplification PCR a été réalisée en utilisant les amorces (dG)16 et LLGFGVG dans les conditions suivantes : 2 min à 95°C puis 30 cycles comprenant une denaturation de 2 min à 95 °C, une fixation de 2 min à 55°C et une élongation de 2 min à 72°C. Les produits de la PCR ont été analysés par électrophorèse en gel d'agarose puis clones dans le plasmide pGEM-T Easy (Promega).
Construction et criblage d'une banque d'ADNc de phloème de céleri
Les ARN totaux des faisceaux de phloème ont été isolés selon la méthode décrite par Kay et al. (1987). Les ARN polyA+ ont été purifiés avec le système PolyATtract mRNA isolation (Promega). Une banque unidirectionnelle EcoRl/Xhol a été construite dans le phage Uni-ZapXR (Stratagene).
Les phages recombinants (900 000) ont été criblés avec^comme sonde, le produit de 5'RACE-PCR marqué radioactivement, en accord avec le protocole du fabricant (Stratagene). Les filtres en nylon HybondTM-N (Amersham) ont été hybrides pendant une nuit à 42°C selon les conditions standard (Stratagene). Les filtres ont ensuite été rincés pendant 15 min à 42°C dans du SSC 2x (SSC lx = 0,15 M NaCl ; 0,015 M citrate de sodium) avec du SDS à 0,1%, puis 15 min dans le même milieu mais à 50°C et 30 min à 50°C dans du SSC lx et du SDS à 0,1%. L'excision in vivo a été réalisée sur les 24 clones qui avaient donné un signal positif lors des 3 tours successifs de criblage. Les ADNc identifiés ont été partiellement séquences. Les comparaisons de séquence ont été réalisées sur le site du National Center for Biotechnology Information. Les régions transmembranaires ont été prédites avec le programme Tmpred (Hofmann et Stoffel, 1993).
Expression d' AgMaTl dans Saccharomyces cerevisiae
L'ADNc de AgMaTl a été ligué dans les sites Pstl-Xhol du vecteur de levure YEP112A1XE (Riesmeier et al., 1992). Ce vecteur permet l'expression des ADNc sous le contrôle du promoteur de levure ADH1. Les cellules de levures MaDH4 ont été rendues compétentes et transformées selon le protocole décrit par Dohmen et al. (1991).
Détermination de la vitesse de croissance
Les cultures de levures ont poussé sur du milieu SC comprenant soit du glucose à 2%, soit du mannitol à 2%. Des fractions aliquotes ont été prélevées régulièrement dans les cultures et leur absorbance a été mesurée à 600 nm.
Détermination de l'activité mannitol déshydrogénase
Les cellules ont été cultivées jusqu'en phase de croissance logarithmique, rincées dans de l'eau distillée et remises en suspension à 80% (poids/volume) dans du tampon d'extraction (phosphate de potassium 50 mM pH 7,5, DTT 1 mM et Triton XlOO à 0,5%). Les cellules ont été cassées par vortex avec des billes de verre. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation et l'extrait brut utilisé pour le dosage enzymatique. L'activité mannitol déshydrogénase a été mesurée à 30°C selon Quain et
Boulton (1987).
Mesure de transport de mannitol radiomarqué
Les cellules ont été cultivées jusqu'en début de phase logarithmique (correspondant à une absorbance de 0,6 à 600 nm), lavées dans de l'eau distillée et resuspendues à 1% (poids/volume) dans du milieu SC tamponné à pH 4,5 avec du MES 25 mM. Une fraction aliquote de 100 μl de la suspension cellulaire a été incubée pendant 60, 120, 180 et 300 s dans 100 μl d'une solution contenant du [ H]-mannitol 500 μM. La réaction a été arrêtée par addition de 8 ml d'eau à 4°C et par filtration sur des filtres en fibres de verre (Sartorius). La radioactivité incoφorée dans les cellules de levure a été déterminée par comptage en scintillation liquide (Packard). Pour les expériences avec des inhibiteurs ou des compétiteurs, le produit a été ajouté 30s avant le mannitol radioactif.
Etude de l'expression d' AgMaTl par RT-PCR (transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérase)
Des ARN totaux de phloème de céleri ont été isolés selon la méthode de Kay et al. (1987). Le premier brin d'ADNc a été inversement transcrit à partir de l'ARN total avec l'amorce oligo dT en utilisant la transcriptase inverse SuperScript™ II (Stratagene). Après dégradation de l'ARN matrice par la RNaseH (Eurogentec), une amplification PCR a été effectuée en utilisant les amorces 5' (ATTCTGGTGTGTTGCTCG) et 3' (CAATGAACAGTATGATGTG) qui permettent l'amplification d'un fragment de 661 nucléotides. Les conditions de PCR sont les suivantes : 2 minutes à 95°C puis 30 cycles comprenant une denaturation de 30 secondes à 95°C, une fixation d'une minute à 47°C et une élongation de 45 secondes à 72°C. Les produits de la PCR ont été analysés par électrophorese en gel d' agarose et l'intensité du signal obtenu quantifié à l'aide du logiciel Photoshop 5.0 (Adobe Systems Inc.). Le facteur d'élongatiôn elF4A(10) (Mandel et al., 1995) a été . utilisé comme gène de contrôle dont l'expression est invariable.
RESULTATS
Clonage moléculaire de AgMaTl
Un certain nombre de protéines qui transportent des sucres ou des métabolites font preuve de similitudes dans leurs séquences. Il a été suggéré que ces protéines de transport ont évolué à partir de la duplication d'une protéine ancestrale avec 6 régions transmembranaires (Maiden et al., 1987). Plusieurs régions d'acides aminés conservés ont été identifiées telles que les séquences d'acides aminés aux extrémités des 6e et 12e domaines transmembranaires, respectivement PESPR et PETKG (Griffith et al, 1992). Une comparaison entre les différents transporteurs de glucose (MST1, STP1, STP4, HUPl, HUP3, GLUTl), le transporteur de D-xylose de L.brevis, le transporteur d'arabinose ôHE.coli (ARAE), le transporteur de galactose dΕ.coli (GALP) et les transporteurs de myo-inositol de levure (gènes ITRl et ITR2) indique une région conservée LLGFGVG. On a choisi cette séquence comme matrice pour concevoir l'amorce dégénérée 5'RACE pour la PCR.
Le premier brin d'ADNc a été transcrit inversement à partir de l'ARN entier des feuilles de céleri mature, amorcé avec une amorce dégénérée LLGFGVG. Après amplification, on a observé une bande de 1 kb sur le gel d'agarose. On a clone tous les fragments de cette réaction de PCR dans un vecteur pGEM-T Easy (Promega), et on a obtenu plusieurs clones.
Pour obtenir un clone entier, on a construit une bibliothèque d'ADNc provenant de faisceaux de phloème isolés à partir de pétioles de céleri mature et on a criblé cette bibliothèque avec le clone 5'RACE-PCR. Après avoir criblé 900 000 transformants, on a identifié 24 clones positifs. Des transformants positifs avec des inserts d'approximativement 1,8-2,0 kb ont été choisis et partiellement séquences. L'un de ces clones, nommé AgMaTl, a été choisi pour une analyse détaillée. Il contient 1778 pb avec un cadre ouvert de lecture qui code pour une protéine contenant 513 acides aminés avec une masse moléculaire estimée à 56 kDa. L'analyse hydropathique de la séquence déduite d'acides aminés indique que AgMaTl contient 12 domaines transmembranaires et une région centrale hydrophile longue de 77 résidus acides aminés. La séquence d'acides aminés de AgMaTl a été comparée avec celles des bases de données et on a trouvé que cette séquence était apparentée aux transporteurs de sucres dans de nombreux organismes. Le pourcentage d'identité des acides aminés est approximativement égal à 50%ι. Cependant, on a trouvé un plus grand pourcentage d'identité (65%) avec deux éventuels transporteurs de sucre de Beta vulgaris (Beet 1 et Beet 2). Un résidu d'asparagine, qui est une partie d'une séquence consensus de N- glycosylation (Asn372), est situé sur le côté externe et devrait ainsi être glycosylé. De plus, les séquences consensus, qui sont les caractéristiques communes du sous-groupe des transporteurs de sucre de la MFS, sont présentes dans AgMaTl. Nous avons trouvé les séquences de PESPRXL et PETQGRXXXE respectivement aux extrémités des 6e et 12e domaines transmembranaires, ou le motif (R/K)XGR(R/K) entre le 2e et le 3e et également les 8e et 9e hélices transmembranaires (Griffith et al., 1992). Remarque :
La principale difficulté rencontrée au cours du clonage a été l'absence totale de caractérisation d'un tel transporteur chez aucun organisme vivant. En effet le seul transporteur de mannitol est une mannitol-phospho-transférase de bactérie (Boer et al, 1994) qui effectue à la fois le transport et la phosphorylation du mannitol. Ce système combiné est présent chez les bactéries pour de nombreux substrats mais il n'existe pas chez les organismes Eucaryotes. Toutefois, selon une première stratégie, un premier criblage de la banque d'ADNc a été effectué avec la partie du gène de la mannitol- phospho-transférase correspondant au domaine transmembranaire. Ce criblage n'a pas permis d'obtenir de résultat, ce qui se justifie a posteriori par l'absence d'homologie significative entre AgMaTl et la mannitol-phospho-transférase.
Une seconde stratégie, qui s'est révélée inopérationnelle, s'est inspirée de celle utilisée pour identifier le transporteur d'oligosaccharides chez les végétaux (brevet EP 0 647 273). Il s'agissait de complémenter des cellules de Saccharomyces cerevisiae avec une banque d'ADNc dans un vecteur d'expression. Les levures sont en effet capables d'utiliser le mannitol comme source de carbone, mais elles nécessitent une période d'induction assez longue sur mannitol. Comme il a déjà été précisé, aucun transporteur de mannitol n'a été identifié chez la levure. Le raisonnement était que si une levure exprimait un transporteur de mannitol. végétal, cela lui conférerait un avantage de croissance et que donc, elle pousserait plus vite sur un milieu contenant du mannitol. On a procédé ainsi mais aucun des ADNc obtenus ne présentait aucunes des caractéristiques de protéines membranaires et ressemblaient en fait à des facteurs de transcription. Le système de sélection permettait en fait d'identifier des ADNc qui intervenaient sur l'expression des gènes de la levure et non pas des transporteurs.
Devant les difficultés rencontrées, les Inventeurs ont formulé une hypothèse a priori peu probable selon laquelle le transporteur de mannitol ferait partie de la super famille des transporteurs de glucides décrite par Marger et Saier (1993). Pour ce faire, on a utilisé une espèce, le céleri, chez laquelle l'existence d'un transporteur de mannitol avait été démontrée (Salmon et al., 1995) et à construire une banque d'ADNc à partir du tissu (le phloème) dans lequel le transporteur est le plus exprimé. La seconde étape a été la sélection des ADNc obtenus sur leur capacité à conférer à des levures la possibilité de transporter du mannitol. Dans ces expériences le témoin était la souche de levure transformée avec le plasmide d'expression vide. C'est ainsi que la fonction de transporteur de mannitol de l'ADNc de AgMaTl a été démontrée.
Lors de cette expérience, on a identifié d'autres séquences : on a en tout obtenu 24 clones. Parmi tous ces clones, on en a séquence deux qui présentaient des profils d'hydropathie de transporteurs. Le premier, M22 (AgMaTl), conférait à des levures la capacité de transporter du mannitol alors que le second, M7, ne la conférait pas.
Construction d'une souche de levure susceptible de métaboliser le mannitol intracellulaire
Des études initiales ont été réalisées afin de caractériser la capacité d'une levure à absorber et à métaboliser le mannitol (Quain et Boulton, 1987). Sur les 40 souches polyploïdes de S. cerevisiae criblées, la moitié d'entre elles ont fait preuve d'une bonne croissance sur du mannitol 5% après une adaptation à long terme (Quain et Boulton, 1987). Par conséquent, on a décidé de tester différentes souches de levures pour leur capacité à transporter et à métaboliser le mannitol et on a retenu 2 souches. Cela a d'abord été effectué en analysant les caractéristiques de croissance sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone. ∑22574d, en général déficiente en transporteur général d'acides aminés et en transporteur de proline, est incapable de croître sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone. Au contraire, Δα était capable de croître sur du mannitol après une adaptation à long terme. Après adaptation, la souche pouvait être maintenue avec succès sur un milieu solide contenant du mannitol 5%. Mais le maintien de la souche adaptée Δα sur un milieu solide contenant seulement du glucose a conduit à la perte totale de la croissance adaptée. Une telle adaptation de la croissance sur du mannitol est probablement due à l'induction des enzymes clés de dégradation ou des perméases de transport. En accord avec les observations précédentes, on a pu détecter une D-mannitol déshydrogénase dépendante de NAD chez les levures Δα (Tableau 1). TABLEAU 1 : Activité de mannitol déshydrogénase dans différentes souches de levures.
Les souches se sont développées dans un milieu liquide contenant soit de glucose 2% soit du mannitol 2%. Les résultats sont les moyennes ± SD des trois expériences indépendantes. ND, non détecté.
Pour obtenir une auxotrophie au tryptophane, on a croisé la souche Δα (Tφ") avec la souche ∑22574d (Tφ+). On a choisi la levure 2a qui ne peut pas croître sur un milieu contenant du mannitol, avec une auxotrophie au tryptophane et à la leucine. Aucune activité de mannitol déshydrogénase n'a été détectée dans les cellules 2a (Tableau 1). Il a fallu introduire une activité d'hydrolyse du mannitol limitée à l'intérieur de la levure. On a clone l'ADNc du gène de la mannitol déshydrogénase de la levure dans YIP128A1 sous le contrôle du promoteur ADHl et on l'a intégré de manière stable dans le gène leu2 de 2a. Plusieurs transformants ont fait preuve d'une activité mannitol déshydrogénase. La souche avec l'activité la plus importante, nommée MaDH4, a été utilisée pour des analyses ultérieures (Tableau 1).
Expression hétérologue de la protéine AgMaTl
Pour une caractérisation ultérieure de la fonction de la protéine AgMaTl, il a été nécessaire d'exprimer le transporteur de manière fonctionnelle dans un système hétérologue comme des cellules de levure. L'ADNc de AgMaTl a été souscloné dans les sites Pstl/Xhol du vecteur navette YEP 112A1XE qui a une boîte promoteur/terminateur du gène de l'alcool déshydrogénase ADHl de S. cerevisiae (Riesmeier et al, 1992). Les cellules de MaDH4 compétentes ont été transformées avec cette construction et YEP 112A1XE a été utilisé comme témoin. Toutes les constructions ont d'abord été testées pour leur capacité à croître sur du mannitol comme unique source de carbone. Comme indiqué dans la Figure 1, la souche MaDH4, transformée avec le plasmide vide YEP 112A1XE n'est pas capable de croître sur le mannitol. Les cellules exprimant AgMaTl pouvaient très bien croître sur ce polyol. Afin de tester directement la capacité des cellules transfonnées à transporter le mannitol, les cellules de levure ont été incubées dans un milieu contenant du [3H]- mannitol pendant quelques secondes à plusieurs minutes, les cellules ont été lavées et la radioactivité absorbée a été mesurée par comptage en scintillation électrique. La Figure 2 indique que le transport du mannitol dans les cellules témoins de S. cerevisiae est négligeable. Cependant, les souches de levure MaDH4, exprimant AgMaTl, transportent le [ H]-mannitol à des vitesses élevées lorsqu'elles croissent sur un milieu contenant du mannitol. On a obtenu le même résultat avec des cellules de levure transformées croissant sur du glycérol (donnée non indiquée).
D'autres polyols comme le dulcitol, le sorbitol, le xylitol, le myo-inositol semblent être capables d'inhiber de moitié l'absoφtion du mannitol. La forme oside du mannitol, le mannose, semble être reconnue par AgMaTl.
Variation de l'expression d' AgMaTl lors d'un stress salin
L'expression d' AgMaTl a été suivie dans des plantes ayant été soumises à un stress salin pendant 4 semaines (arrosage quotidien avec 300 mM de NaCl, Noiraud et al., 2000). Le phloème de ces plantes ainsi que des plantes témoins correspondantes (arrosées avec de l'eau ne contenant pas de NaCl) a été prélevé pour extraire des ARN qui ont été utilisés pour effectuer des réactions de RT-PCR., Si l'on prend l'expression d' AgMaTl dans le phloème de plantes témoins comme base 100, l'expression d'AgMaTl dans le phloème de plantes traitées au NaCl est de 500%, ce qui représente une stimulation très importante et est en accord avec un rôle d'AgMaTl dans la tolérance au stress salin chez le céleri. PROTOCOLE DE TRANSFORMATION DE PETIOLES OU DE FEUILLES DE CELERI BRANCHE
Des plants de Céleri branche (environ 10 cm de hauteur) régénérés à partir de cellules embryogènes sont utilisés comme matériel végétal pour la transformation.
Inoculation des tissus de Céleri
Des bactéries Agrobacterium tumefaciens sont cultivées pendant 24 h à 28°C sous agitation dans du milieu LB (Liquid Broth : tryptone 1%, extrait autolytique de levure 0,5%), NaCl 0,5%)) avec l'antibiotique approprié.
Les pétioles des plants de Céleri sont fragmentés en section de 0,5 cm environ. Pour chaque fragment, une section longitudinale est faite. Les segments de Céleri sont incubés dans du milieu MS (Murashige & Skoog) 1 X (concentration nonnale, c'est-à- dire pas de dilution) liquide contenant 1/25 me de la culture de bactéries Agrobacterium tumefaciens pendant 60 min à température ambiante.
Composition du milieu MS
L'excès de bactéries est ensuite enlevé des segments de Céleri en les déposant sur du papier absorbant pendant 2-3 min.
Coculture des segments de Céleri et des bactéries A. tumefaciens
La face cambiale des segments de Céleri est déposée en contact du milieu de régénération RM gélose. Durant 48 h, les boîtes de Pétri sont placées dans une chambre climatisée à 25°C et soumises à des cycles lumière/obscurité 16 h/ 8 h.
Elimination des bactéries A. tumefaciens
Après 48 h de coculture, les segments de Céleri sont prélevés des boîtes de milieu RM et transférés dans du MS 1 X liquide supplémenté avec de la céfotaxime à une concentration finale de 250 μg/mL. Après une incubation de 60 min, les segments de Céleri sont séchés sur du papier absorbant pendant 2-3 min.
Régénération de plants de Céleri transformés
La face cambiale des segments de Céleri est déposée en contact du milieu d'initiation de la callogenèse CIM gélose. Les boîtes de Pétri CEM sont placées dans une chambre climatisée à 25°C et soumises à des cycles lumière/obscurité 16 h/8 h jusqu'au développement de cals (2-3 semaines). Les segments de Céleri sont alors transférés sur un milieu d'induction de l'organogenese OEM gélose (2-3 semaines). Après l'apparition des bourgeons, ceux-ci sont prélevés et placés sur le milieu d'enracinement EM gélose. Quelques semaines (3-4 semaines) sont nécessaires pour le développement de jeunes pousses de Céleri. Composition des milieux
Milieu de régénération RM
Milieu d'enracinement (EM)
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols linéaires, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques.
2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la séquence d'ADN est choisie parmi l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO ; 7, SEQ ED NO : 8, SEQ ED NO : 9 et SEQ ED NO : 10.
3. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence SEQ ID NO : 2,
- ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO : 2, notamment par" substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ayant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols linéaires, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le, mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol,
- toute séquence homologue de SEQ ID NO : 2, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 50% avec la séquence SEQ ED NO : 2 et possédant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus,
- ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il possède la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, notamment tout fragment étant constitué d'au moins environ 10 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ED NO : 2.
4. Séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie dans la revendication 3.
5. Séquence d'ADN qui comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ED NO : 1,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine représentée par SEQ ED NO : 2,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2, telle que définie dans la revendication 3,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 35% avec la séquence SEQ ED NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ED NO : 2, telle que définie dans la revendication 3,
- ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 30 nucléotides contigus dans ladite séquence,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés, ?
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés.
6. Vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5.
7. Vecteur recombinant selon la revendication 6, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques selon l'une des revendications 4 ou 5, insérés dans ledit vecteur.
8. Cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 6 ou 7.
9. Oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 4 ou 5.
10. Cellules de plantes contenant dans leur génome une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5.
11. Plantes transgéniques, parties de plantes, semences de plantes ou matériel de propagation de plantes contenant des cellules selon la revendication 10.
12. Plante transgénique selon la revendication 11, qui, à l'état natif, ne contient pas ou n'exprime pas le gène du transporteur de mannitol, dans le génome de laquelle est introduit une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5.
13. Plante transgénique selon la revendication 11, qui, à l'état natif, contient ou exprime le gène du transporteur de mannitol, dans le génome de laquelle est introduit une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 4 ou 5.
14. Procédé de criblage de plantes génétiquement modifiées avec au moins une séquence nucléotidique d'intérêt qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec un vecteur contenant une séquence d'insertion, ladite séquence d'insertion comprenant la séquence nucléotidique d'intérêt et une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol telle que définie dans l'une des revendications 1, 2, 4 et 5, - la mise en culture des cellules ainsi transformées sur un milieu contenant ledit polyol comme unique source de carbone, pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques contenant ladite séquence d'insertion.
15. Procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes, qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol telle que définie dans l'une des revendications 1, 2, 4 et 5,
- la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
16. Procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes au stress salin, qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol telle que définie dans l'une des revendications 1, 2, 4 et 5,
- la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
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