EP1297009A2 - Tumor-assoziiertes antigen b132 - Google Patents

Tumor-assoziiertes antigen b132

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Publication number
EP1297009A2
EP1297009A2 EP01945170A EP01945170A EP1297009A2 EP 1297009 A2 EP1297009 A2 EP 1297009A2 EP 01945170 A EP01945170 A EP 01945170A EP 01945170 A EP01945170 A EP 01945170A EP 1297009 A2 EP1297009 A2 EP 1297009A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tumor
peptides
peptide
immunogenic
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01945170A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Günther Adolf
Karl-Heinz Heider
Ulrich Koenig
Wolfgang Sommergruber
Agnes Gruenfelder
Roger Abseher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International GmbH filed Critical Boehringer Ingelheim International GmbH
Publication of EP1297009A2 publication Critical patent/EP1297009A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the invention relates to the immunotherapy and chemotherapy of tumor diseases.
  • the immune system's task is to protect the organism from a variety of different microorganisms or to actively combat them.
  • the importance of an intact immune system is particularly evident in inherited or acquired immunodeficiencies.
  • the use of prophylactic vaccine programs has proven to be an extremely effective and successful immunological intervention in the fight against viral or bacterial infectious diseases.
  • the immune system is also significantly involved in the elimination of tumor cells.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • PBMC peripheral mononuclear blood cells
  • the T cell response against tumor cells could be enhanced by transfection of the tumor cells with cytokines (van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).
  • cytokines van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993.
  • TAA tumor-associated antigens
  • MHC-I Major histocompatibility complex
  • antigen processing "antigen processing”
  • Peptide MHC-I complexes are recognized by CD8-positive CTLs.
  • MHC-II molecules only occur on so-called “professional antigen-presenting cells” (APC) and present peptides of exogenous proteins that are absorbed and processed by APC during the endocytosis.
  • APC professional antigen-presenting cells
  • MHC-II complexes are used by CD4 helpers Interaction between T cell receptor and peptide: MHC complex can trigger various effector mechanisms that lead to apoptosis of the target cell in the case of CTLs. This happens when either the MHC (eg in the case of the
  • the antigen can either be used as a recombinant protein with suitable adjuvants or carrier systems, or as a cDNA coding for the antigen in plasmid (DNA vaccine; Tighe et al., 1998) , or viral vectors (Restifo, 1997) are applied.
  • recombinant bacteria eg Listeria, Salmonella
  • the antigens or their epitopes recognized by the tumor-specific CTLs include molecules that can originate from all protein classes (eg transcription factors, receptors, enzymes; For an overview, see Rammenee et al., 1995; Robbins and Kawakami, 1996). These proteins do not necessarily have to be located on the cell surface, as is required for detection by antibodies. In order to act as a tumor-specific antigen for recognition by CTLs or to be used for therapy, the proteins must meet certain conditions: firstly, the antigen should be expressed mainly by tumor cells and not or only to a lesser extent in so-called "critical" normal tissues Concentration than in tumors. Critical normal tissues are essential tissues; an immune response against them could have serious, sometimes fatal, consequences.
  • the antigen should not only be present in the primary tumor, but also in the metastases. Furthermore, in view of a wide clinical use of the antigen, it is desirable if it is present in high concentration in several types of tumor.
  • Another prerequisite for the suitability of a TAA as an effective component of a vaccine is the presence of T cell epitopes in the amino acid sequence of the antigen; Peptides derived from TAA are said to lead to an in vitro / in vivo T cell response ("immunogenic" peptide). Another one
  • the selection criterion for a clinically widely applicable immunogenic peptide is the frequency with which the antigen can be found in a given patient population.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • viral proteins mutated proteins
  • overexpressed proteins fusion proteins formed by chromosomal translocation
  • differentiation antigens oncofetal antigens (Van den Eynde and Brichard, 1995; van den Eynde and van der Bruggen, 1997).
  • the methods for identifying and characterizing TAAs are based on the one hand on the use of CTLs (cellular immune response) or antibodies (humoral immune response) that have already been induced in patients, or are based on the creation of differential transcription profiles between tumors and normal tissues.
  • CTLs cellular immune response
  • antibodies humoral immune response
  • patient CTLs are used for screening eukaryotic tumor cDNA expression libraries which present the CTL epitopes via MHC-I molecules (Boon et al., 1994), while using high-affinity patient antisera prokaryotic cDNA expression libraries, directly via an immunoblot
  • TAAs which are based on the comparison of the transcription profile of normal with tumor tissue, are diverse; these include differential hybridization, the creation of subtraction cDNA banks ("representational difference analysis”; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) and the use of DNA chip technology or the SAGE method (Velculescu et al., 1995).
  • the object of the present invention was to provide a new protein, preferably expressed by tumor cells, which, on the one hand, due to its
  • TAA tumor associated antigen
  • the human B132 cDNA was cloned, the sequence obtained is shown in SEQ ID NO: 1. Sequence analysis of the cloned human B132 CDNA showed that from position 160 to position 1206 (excluding stop codon) there is a continuous open reading frame which, at the nucleotide and protein level, has no homology or identity in the sequences of the databases known to date. It can be concluded from the data obtained from Northern blot experiments that the B132 transcript has a length of approximately 4.1 kb.
  • the cloned region of the Bl32 cDNA is 4057 bp (exclusive polyA region), the presence of a polyA tail at the 3 'end of the sequence indicating the completeness of the cDNA in this region. Due to the fact that there is no continuous reading frame in the 5 'region of the cloned cDNA from position 1 to 160, it can be concluded that the ATG at position 160 is the start codon of B132.
  • RNA preferably mRNA
  • RNA is reverse transcribed from cells or tissues in which B132 is transcribed (eg colon carcinoma tissue or cell lines derived from lung adenocarcinoma such as A549) and then ligated with an adapter of known sequence, PCR with an adapter primer (specifically binds to the adapter on
  • 5 'end is the screening of cDNA libraries by hybridization with DNA probes or antisera specific for B132.
  • Clones can be isolated which contain the sequence information located upstream from the 5 'end of the cDNA obtained, e.g. contain the promoter region of B132.
  • the isolated cDNA codes for the tumor-associated antigen (TAA) or tumor-specific protein
  • Designation B132 with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 (B132).
  • the sequence of B132 is defined by the start codon at position 160 of the isolated B132 CDNA.
  • the invention thus relates in a first aspect to a tumor-associated antigen of the designation B132 with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may have deviations, for example those caused by Exchange of amino acids are required if the B132 derivative has the immunogenic properties desired for use in a tumor vaccine.
  • the natural amino acid sequence of B132 (or correspondingly the sequences of the B132 cDNA) can optionally be modified by exchanging individual amino acids in a B132 CTL epitope in order to increase the affinity of B132 compared to the natural B132 CTL epitope -Peptides to MHC-I molecules and thus an increased immunogenicity and ultimately an increased reactivity to tumors.
  • Modifications in the area of the B132 epitopes can be carried out on the Bl32 total protein (this is processed by the APCs into the corresponding peptides) or on larger Bl32 protein fragments or on B132 peptides (see below).
  • the present invention relates to immunogenic fragments and peptides derived from B132.
  • B132 peptides A first group are B132 peptides that trigger a humoral immune response (induction of antibodies).
  • Such peptides are selected sections of B132 (at least 12 to 15 amino acids), which by means of so-called prediction algorithms such as the "surface probability blot” (Emini et al., 1985), the “hydrophobicity blot” ( Kyte and Doolittle, 1982) and the “antigenic index” (Jameson and Wolf, 1988).
  • B132 peptides which are preferred in the context of the present invention are those which are presented by MHC molecules and bring about a cellular immune response.
  • MHC molecules There are two classes of MHC molecules, namely MHC-I molecules that are recognized by CD8-positive CTLs and MHC-II molecules that are recognized by CD4-positive T helper cells.
  • a peptide In order for a peptide to trigger a cellular immune response, it must bind to an MHC molecule, with the patient to be treated having the MHC molecule in his
  • the determination of the MHC subtype of the patient thus represents one of the essential prerequisites for the effective application of a peptide to this patient with regard to triggering a cellular immune response.
  • the sequence of a B132 peptide to be used therapeutically is predetermined by the respective MHC molecule with regard to anchor amino acids and length. Defined anchor positions and lengths ensure that a peptide fits into the peptide binding groove of the patient's respective MHC molecule. As a result, the immune system is stimulated and a cellular immune response is generated which, in the case of using one of a tumor antigen derived peptide against the patient's tumor cells.
  • Immunogenic Bl32 peptides can be identified by known methods, one of the bases for this is the relationship between MHC binding and CTL induction.
  • Bl32 peptides which represent CTL epitopes can be identified and synthesized on the basis of the Bl32 protein sequence.
  • Various methods are suitable for this, which have been used to identify CTL epitopes of known protein antigens; e.g. the method described by Stauss et al., 1992, for the identification of T cell epitopes in human papillomavirus.
  • the peptide candidates can also be examined for non-anchor residues which have a negative or positive effect on the binding or which make this possible (Ruppert et al., 1993). With this approach, however, it should be considered that the peptide-binding motif is not the only decisive factor in the search for natural ligands; other aspects, such as enzyme specificity during antigen processing, also contribute to the identity of the ligand, in addition to the specificity of the MHC binding.
  • the peptides can also be selected for their ability to bind to MHC-II molecules.
  • the MHC-II binding motif which extends over nine amino acids, has a higher degree of degeneration in the anchor positions than the MHC-I binding motif.
  • Methods have recently been developed, based on the X-ray structure analysis of MHC-II molecules, which allow the precise analysis of the MHC-II binding motifs, and on the basis thereof, variations of the peptide sequence (Rammenee et al., 1995, and the original literature cited therein ).
  • Peptides that bind to MHC-II molecules are typically presented to CD4-T cells by dendritic cells, macrophages or B cells.
  • the CD4-T cells then in turn then directly activate CTLs by, for example, cytokine release and enhance the efficiency of the antigen presentation by APC (dendritic cells, macrophages and B cells).
  • HLA-Al HLA-Al
  • -A * 0201 HLA-A3, -B7 , -B14 and -B * 4403
  • candidate peptides which are expected to bind to the corresponding HLA molecules and are therefore immunogenic CTL epitopes; the peptides found are listed in Table 2.
  • the different characteristics the peptides (hydrophobicity, charge, size) or requirements on the peptides, for example the 3D structure of the HLA molecule, take into account further potential peptide epitopes are determined; this also applies to peptide epitopes of other HLA types.
  • Variations can be made based on the minimum requirements regarding anchor positions and length based on the original peptide sequence, provided that these variations result in the effective immunogenicity of the peptide, which is composed of its binding affinity for the MHC molecule and its ability to stimulate T cell receptors , is not only not impaired, but is preferably reinforced.
  • artificial peptides or peptide equivalents are used, which are designed according to the requirements of the binding ability to an MHC molecule.
  • heteroclitic peptides Peptides modified in this way are referred to as “heteroclitic peptides”. They can be obtained by the following methods:
  • the length of the peptide preferably corresponds to one if it is tuned to MHC-I molecules
  • the peptide can also be extended at the C- and / or at the N-terminus, provided that this extension does not impair the ability to bind to the MHC molecule or the extended peptide can be processed cellularly for the minimal sequence.
  • TILs tumor-infiltrating lymphocytes
  • Another method suitable for the purposes of the present invention for finding peptides with a greater immunogenicity than that of natural B132 peptides consists in screening peptide libraries with CTLs which recognize the naturally occurring B132 peptides on tumors, as described by Blake et al. , 1996, described; in this context, the use of combinatorial peptide libraries is proposed to design molecules that mimic tumor epitopes recognized by MHC-I restricted CTLs.
  • the B132 polypeptides of the present invention or immunogenic fragments or peptides derived therefrom can be produced recombinantly or by means of peptide synthesis, as described in WO 96/10413, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the corresponding DNA molecule is inserted into an expression vector according to standard methods, transfected into a suitable host cell, the host is cultivated under suitable expression conditions and the protein is purified.
  • Conventional methods can be used for the chemical synthesis of B132 peptides, e.g. commercially available automatic peptide synthesizers.
  • the TAA of the designation B132 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, e.g. to induce an immune response against tumor cells that express the corresponding antigenic determinants. They are preferably used for the therapy of B132-positive tumors, in particular for renal cell, lung, colon and breast carcinoma.
  • the immune response in the form of induction of CTLs can be brought about in vivo or ex vivo.
  • a pharmaceutical composition containing the active component TAA B132 or fragments or peptide (s) derived therefrom is administered to a patient suffering from a tumor disease associated with the TAA, the amount of TAA ( Peptide) must be sufficient to achieve an effective CTL response to the antigen-bearing tumor.
  • the invention thus relates to a pharmaceutical composition for parenteral, topical, oral or local administration.
  • the composition is preferably used for parenteral administration, for example for subcutaneous, intradermal or intramuscular use.
  • the Bl32 TAAs / peptides are in a pharmaceutically acceptable, preferably aqueous, carrier dissolved or suspended.
  • the composition can also contain conventional auxiliaries such as buffers, etc.
  • the TAAs / peptides can be used alone or in combination with adjuvants, for example incomplete Freund's adjuvant, saponins, aluminum salts or, in a preferred embodiment, polycations such as polyarginine or polylysine.
  • the peptides can also be bound to components which support CTL induction or activation, for example to T helper peptides, lipids or liposomes, or they are used together with these substances and / or together with immunostimulating substances, for example cytokines (IL -2, IFN- ⁇ ) administered.
  • immunostimulating substances for example cytokines (IL -2, IFN- ⁇ ) administered.
  • B132 (fragments) or B132 peptides can also be used to trigger a CTL response ex vivo.
  • An ex vivo CTL response to a tumor expressing B132 is induced by incubating the CTL progenitor cells together with APCs and B132 peptides or Bl32 protein. The activated CTLs are then allowed to expand, after which they are re-administered to the patient.
  • APCs can be loaded with Bl32 peptides, which can lead to an efficient activation of cellular immune responses against B132 positive tumors (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996).
  • a suitable method for placing peptides on cells e.g. Loading dendritic cells is disclosed in WO 97/19169.
  • Bl32 peptides In one embodiment of the invention, a combination of several different Bl32 peptides or B132 peptide equivalents is used. In another embodiment, a combination of several different Bl32 peptides or B132 peptide equivalents is used. In another embodiment of the invention, a combination of several different Bl32 peptides or B132 peptide equivalents is used. In another embodiment, a combination of several different Bl32 peptides or B132 peptide equivalents is used. In another
  • B132 peptides are combined with peptides derived from other TAAs.
  • the selection of peptides for such combinations is made with a view to the detection of different MHC types in order to cover the widest possible population of patients, and / or it is based on the widest possible range of indications by combining peptides from several different tumor antigens.
  • the number of peptides in a pharmaceutical composition can vary over a wide range, typically a clinically applicable vaccine contains 1 to 15, preferably 3 to 10 different peptides.
  • the peptides according to the invention can also be used as diagnostic reagents.
  • the peptides can be used to test a patient's response to the humoral or cellular immune response elicited by the immunogenic peptide. This makes it possible to improve a treatment protocol.
  • the dosage form (peptide, total protein or DNA vaccine) of the TAA the increase in precursor T cells in the PBLs that are reactive to the defined peptide epitope can be investigated (Robbins and Kawakami, 1996 and references cited therein) .
  • the peptides or the Whole protein or antibodies directed against the TAA can be used to predict or predict the risk of a patient with a B132-associated tumor or to characterize the course of the disease of a B132-positive tumor (eg by immunohistochemical analyzes of primary tumor and metastases).
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • the present invention relates to isolated DNA molecules coding for a protein with the immunogenic properties of B132 or for fragments thereof.
  • the present invention relates to an isolated DNA molecule which contains a polynucleotide with the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or which contains a polynucleotide which hybridizes with a polynucleotide of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions , “Stringent conditions” mean, for example: overnight incubation at 65 ° C.-68 ° C.
  • DNA molecules or fragments thereof according to the invention code for (poly) peptides of the designation B132 with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or for protein fragments or peptides derived therefrom; this also includes DNA molecules which, due to the degeneration of the genetic code, deviate from the sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to DNA molecules which, due to the conservative exchange of amino acids, have deviations from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, provided that they are for a B132 derivative or fragments or peptides with the immunogenic properties desired for use as tumor vaccines encode.
  • the present invention like the encoded (poly) peptides, are used for the immunotherapy of cancer.
  • DNA molecules coding for the natural B132- Polypeptide or used for fragments thereof are used for fragments thereof.
  • modified derivatives can be used as an alternative to the natural B132-CDNA or fragments thereof. These include sequences with modifications for a protein (fragment) or peptides with stronger ones
  • Coding immunogenicity with the same considerations for the modifications at the DNA level as for the peptides described above.
  • Another type of modification is the stringing together of numerous sequences, coding for immunologically relevant peptides, in the manner of a string of pearls ("string-of-beads"; Toes et al., 1997).
  • the sequences can also be modified by adding auxiliary elements, e.g. Functions that ensure more efficient delivery and processing of the immunogen (Wu et al., 1995). For example, by adding a localization sequence into the endoplasmic reticulum ("ER targetting sequence”), the processing and thus the presentation and ultimately the immunogenicity of the antigen can be increased.
  • the present invention relates to a recombinant DNA molecule which contains B132 DNA.
  • the Bl32 DNA molecule of the present invention preferably in recombinant form as a plasmid, can be administered directly or as part of a recombinant virus or bacterium.
  • any gene therapy method for the immunotherapy of cancer based on DNA (“DNA vaccine") on B132-DNA can be used, both in vivo and ex vivo.
  • in vivo administration are the direct injection of "naked" DNA, either intramuscularly or by means of a gene gun, which has been shown to lead to the formation of CTLs against tumor antigens.
  • Examples of recombinant organisms are vaccinia virus, adenovirus or Listeria monocytogenes (an overview was given by Coulie, 1997).
  • nucleic acid molecules such as cationic lipids, microspheres, microspheres or liposomes
  • synthetic carriers for nucleic acids can be used for the in vivo administration of nucleic acid molecules, coding for Bl32 peptide.
  • various adjuvants that enhance the immune response can be co-administered, for example cytokines, either in the form of proteins or plasmids encoding them.
  • the application can optionally be combined with physical methods, eg electroporation.
  • ex vivo administration is the transfection of dendritic cells, such as from Tuting,
  • the present invention thus relates to the use of cells which express B132, either on their own or, in optionally modified form, after transfection with the corresponding coding sequence, for the production of a cancer vaccine.
  • the invention relates to antibodies against B132 or fragments thereof.
  • polyclonal Antibodies can be obtained in a conventional manner by immunizing animals, in particular rabbits, by injecting the antigen or fragments thereof, and then purifying the immunoglobulin.
  • Monoclonal anti-B132 antibodies can be obtained according to standard protocols according to the principle described by Koehler and Milstein, 1975, by immunizing animals, in particular mice, then immortalizing antibody-producing cells of the immunized animals, e.g. by fusion with myeloma cells, and the supernatant of the hybridomas obtained is screened for monoclonal anti-B132 antibodies by means of standard immunological assays.
  • these animal antibodies can optionally be chimerized in a conventional manner (Neuberger et al., 1984, Boulianne et al., 1984) or humanized (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) ,
  • Human monoclonal anti-B132 antibodies can also be obtained from so-called “phage display libraries” (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al., 1995, Mc Guiness et al., 1996 ) and by means of transgenic animals (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995).
  • the anti-B132 antibodies according to the invention can be used in immunohistochemical analyzes for diagnostic purposes.
  • the invention relates to the use of B132-specific antibodies in order to selectively bring any substances into or into a tumor which expresses B132.
  • examples of such substances are cytotoxic agents or radioactive nuclides, the effect of which is to damage the tumor on site. Due to the relatively tumor-specific expression of B132, only minor side effects are expected.
  • substances can be used to visualize tumors that express B132 using B132 antibodies. This is useful for the diagnosis and evaluation of the course of therapy. Therapeutic and diagnostic uses of antibodies which are suitable for anti-Bl32 antibodies are described in WO 95/33771 for.
  • the TAA of the designation B132 according to the present invention and the protein fragments, peptides or peptide equivalents or peptidomimetics derived therefrom can be used in cancer therapy, e.g. B. to induce an immune response against tumor cells that express the corresponding antigen determinants. They are preferably used for the therapy of B132-positive tumors, in particular for renal cell, lung, colon and breast carcinoma.
  • tumor-associated antigens can have tumor-specific mutations that contribute to an immunological differentiation between tumor and normal tissue (Mandruzzato et al., 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al., 1995 ).
  • the presence of tumor-specific B132 mutations to determine, expediently with the aid of probes from the isolated cDNA according to the invention the B132 cDNA is cloned from one or more different tumors and the sequences obtained are compared with normal tissue Bl32 cDNA.
  • tumor B132 peptides from a sequence section mutated compared to normal tissue B132 have an increased immunogenicity in comparison to normal tissue Bl32 peptides from the corresponding section.
  • antibodies against these areas can be generated and tumor cells can be examined for the expression of possible mutations.
  • the present invention thus relates to B132 peptides derived from regions of a tumor-expressed B132 which have tumor-specific mutations.
  • Chemotherapy is the administration of substances that are either cytostatic or cytotoxic-cytolytic by interfering with metabolism, signal transduction and cell division processes of malignant cells.
  • Chemotherapy drugs are divided into different categories depending on how they affect specific targets in the tumor cell, which cellular processes they interact with and which cell cycle phase they influence. Genes upregulated in tumor tissues represent points of attack and thus potential target structures ("targets") for chemotherapy.
  • B132 Due to the preferred expression of B132 in tumor cells it can be assumed that this protein has an important function for the tumor, e.g. for emergence, infiltration and growth and thus a target for chemotherapeutic intervention.
  • B132 With regard to its use as a target in targeted chemotherapy, B132 is characterized in more detail in order to develop the appropriate strategy for the intervention with this function.
  • a bioinformatic analysis is expediently carried out in a first step, which is trend-setting for the experimental validation of B132 as a target.
  • bioinformatics concepts based on similarity and modular structure represent an essential basis for this analysis.
  • the secondary structure prediction can support functional hypotheses, for example if the structure of the suspected homologue is known.
  • B132 is subjected to a biochemical and biological analysis.
  • Nucleic acid interaction is related. In order to demonstrate the direct and / or indirect interaction of B132 with nucleic acids, methods such as “mobility shift”, southwestern, UV crosslinking etc. can be carried out, and standard methods known from the literature (eg Ausubel et al., 1994) are used to carry them out ) can be used.
  • the function of B132 for the tumor process is elucidated; eg by proliferation assays in vi tro or in animal models that overexpress the B132 gene to be examined (constitutive or inducible) and, as a control, either express it in a deleted (inactive) form or downregulate via antisense (see, for example, Grosveld and Kollias, 1992).
  • B132 can be used in screening assays to identify substances that modulate, particularly inhibit, the activity of this protein.
  • an assay may e.g. B. consist of introducing the B132 protein, or an active fragment thereof, into cells which react to the activity of B132 with proliferation or to express the corresponding B132 cDNA in the cell, and the proliferation of the cells in the presence and to determine in the absence of a test substance.
  • test cells are cells with a low division rate, e.g. primary cells that do not have endogenous B132.
  • B132 cDNA e.g. IL-12
  • standard assays e.g. Thymidine incorporation
  • test cells e.g. in High Throughput Screening Proliferation Assays.
  • proliferation assays in high throughput format e.g. based on the MTS assay are described in WO 98/00713.
  • Substances with an anti-proliferative effect can be used to treat tumors with strong B132 expression can be used, especially for kidney, lung, colon and breast cancer.
  • Fig. 1 RT-PCR analysis of various tumors
  • Fig. 2A Northern blot analysis of various
  • Fig. 2B Northern blot analysis of various
  • Fig. 3 In situ hybridization with Bl32 antisense and B132 sense probes in different tissue sections.
  • the s-sample (sense) always corresponds to the negative control.
  • RDA Representative Difference Analysis
  • the human lung adenocarcinoma cell line A549 (CCL 185) obtained from ATCC was in T150
  • the 4 ml were transferred into a 15 ml falcon tube, mixed with 8 ml PBS, centrifuged at 1200 rp in a Haereus table centrifuge (Megafuge 2.0R) for 5 min at 4 ° C, the cell pellet with 1 ml lysis buffer (10 mm TrisHCl pH8, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5% NP40) were added, shaken vigorously and centrifuged in a 2 ml Eppendorf tube at 12,000 rpm and 4 ° C. for 5 min in a Sigma table centrifuge (Sigma 202 MK).
  • 1 ml lysis buffer (10 mm TrisHCl pH8, 140 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5% NP40
  • the supernatant was transferred to a new Eppendorf tube and, after addition of 55 ⁇ l 20% SDS solution, extracted twice with twice the volume of a CHCl 3 / phenol (1: 1 v / v) mixture and once with the single volume of CHC1 3 .
  • the aqueous RNA-containing phase was mixed with 1/10 volume of 3M NaAc (pH5) and twice the volume of 96% EtOH and the RNA was precipitated overnight at -20 ° C.
  • the PolyATtract Kit Promega was used to isolate poly-A (+) RNA in accordance with the manufacturer's protocol.
  • the A549 poly-A (+) RNA with a concentration of 1 mg / ml in DEPC-treated H 2 0 was stored in aliquots at -80 ° C.
  • the poly-A (+) RNA of the lung adenocarcinoma cell line A549 was called "tester", that of normal lung tissue (1 mg / ml; Clontech, Palo Alto; # 6524-1) as the "driver”.
  • the RDA was carried out using the PCR-select TM kit (Clontech, Palo Alto) according to the manufacturer's protocol, with the exception of that a modified primer / adapter-2
  • Oligonucleotide system was used: adapter-2-alt-1 (SEQ ID NO: 3) and nested-PCR-primer-2-old (SEQ ID NO: 4) and adapter-2-alt-2 (SEQ ID NO: 5 ).
  • the newly generated primer / adapter sequences enable the presence of three new ones
  • Restriction enzyme interfaces (Kpn I, Sac I and Xho I) in the sequence of the nested PCR primer-2-alt after cloning the subtracted cDNA fragments into the pPCRII vector and subsequently cutting out the respective cDNA fragments.
  • the design of a primer / adapter sequence with several available restriction enzyme interfaces was necessary because point mutations could often be observed especially in the primer sequences due to the PCR amplification steps.
  • the cDNA obtained was digested by "tester” and "driver” with -Rsal (Rsal is a 4-base-recognizing restriction enzyme and provides a statistical average of 256 bp long cDNA fragments).
  • tester cDNA Identical parts of "tester cDNA” were ligated either with adapters 1 or 2 and then hybridized separately with an excess of "driver cDNA” at 65 ° C. The two approaches were then combined and subjected to a second hybridization with freshly denatured "driver cDNA”. The enriched "tester” -specific cDNAs were then amplified exponentially by PCR with primers specific for adapters 1 or 2. For further enrichment, an aliquot of this reaction was subjected to a second PCR with specific nested primers.
  • the exponentially amplified cDNA fragments resulting from this reaction were directly inserted into the pCRII vector (Invitrogen; carefulTA cloning vector ”) and then transfected a third of the ligation mixture into competent E. coli (OneShot TM, Invitrogen),
  • Obtained subtraction library which was available both in the form of E. coli glycerol stock cultures and in the form of purified plasmids.
  • the isolated plasmid DNA of all 712 clones was analyzed using the Sanger method ABI-Prism device sequenced. The sequences obtained were annotated using the BioScout software (LION, Heidelberg) and subjected to database comparisons (Genbank). From 712 clones, 678 could be sequenced and annotated. The rest (34) had either only poly (A) sequences as an insert or corresponded to a religious vector or could not be sequenced. Of the 678 annotable sequences, 357 proved to be genes with a known function. The remaining 321 represented clones encoding genes with unknown function; 59 of them did not even have entries in the human EST database. Known genes were not further treated.
  • the expression profile was estimated for those unknown genes for which an EST entry was available: all those ESTs with> 95% identity (BLAST) that belonged to the experimentally determined sequence of the subtraction libraries were checked.
  • the annotation was subdivided into a) critical normal tissue, b) fetal, "dispensable” and immune-privileged tissue and c) tumors and tumor cell lines.
  • This "virtual mRNA profile"("virtual Northern blot") 200 clones for which no ESTs were found in group a) were selected for further experimental analyzes (including the 59 clones for which there was no EST entry).
  • the cDNA libraries used in this connection came from tissue from the heart (# 10419-018), liver (# 10422-012 ), Leukocytes (# 10421-022), kidneys (# 10420-016), lungs (# 10424-018), testis (# 10426-013), brain (# 10418-010) and fetal brain (# 10662-013)
  • the PCR conditions were as follows: 20 ⁇ l total volume per PCR mixture contained 1 ⁇ TaqPol buffer (50 mM KC1, 10 mM TrisHCl pH9, 0.1% Triton X-100), 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs (Promega), 0.025 U / ⁇ l Taq DNA polymerase (Promega), 5 pM each of specific oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 6 and 7) or (SEQ ID NO: 8 and 9) and 100 ng of each plasmid DNA to be examined, specific primers for GAPDH
  • Elimination criteria defined. Using this qualitative PCR analysis, the number of candidates was able to narrowed down to 56; Clone B132 was in this pre-selected group of candidates.
  • RNA was isolated from frozen tissue using trizole in accordance with Gibco's manufacturer's protocol. To remove any contaminating DNA, the prepared RNA was digested with DNAase I as follows: 3 ⁇ g of total RNA were combined with 20 ⁇ l of 5 ⁇ AMV buffer (Promega), 1 ⁇ l of RNasin (Promega) and 2 ⁇ l of DNase I (Boehringer Mannheim) Total volume of 80 ul incubated at 37 ° C for 15 minutes. 120 ⁇ l phenol: chloroform:
  • RNA was ethanol-precipitated and dissolved in water.
  • AMV reverse transcriptase 1 ⁇ l of oligo dT primer (Promega) was added to 3 ⁇ g of total RNA and brought to a final volume of 10 ⁇ l with water. After incuba
  • a TaqMan PCR run contained samples of GAPDH control plasmid with 10 2 , 10 3 , 10 5 and 10 6 copies / ⁇ l (Perkin Elmer) to determine the standard curve, a negative control without DNA and the cDNA pools to be quantified. All samples were analyzed in triplicate.
  • Carboxymethylrhodamine 1 ⁇ l per primer (20 ⁇ M each, Perkin Elmer GAPDH forward: pos. 1453-1486 from J04038 (SEQ ID NO: 13)); GAPDH reverse: pos. 3764-3741 of J04038 (SEQ ID NO: 14), 0.25 ⁇ l AmpErase uracil N-glycosylase "UNG” (1 U / ⁇ l, Perkin Elmer), and 0.125 ⁇ l AmpliTaq gold (5 U / ⁇ l, Perkin Elmer) mixed, transferred to MicroAmp Optical Tubes (Perkin Elmer) and sealed with MicroAmp Optical Caps.
  • GAPDH forward pos. 1453-1486 from J04038 (SEQ ID NO: 13)
  • GAPDH reverse pos. 3764-3741 of J04038 (SEQ ID NO: 14)
  • 0.25 ⁇ l AmpErase uracil N-glycosylase "UNG” (1 U / ⁇ l, Perkin
  • the PCR was carried out as follows: a cycle with 2 minutes 50 ° C for the UNG reaction, a cycle 10 minutes 95 ° C to activate the AmpliTaq, 40 cycles with 15 seconds each 95 ° and 1 minute 60 ° C. The samples were then kept at 25 ° C. The data is evaluated with the program "Sequence Detection System 1.5bl" (PE Applied Biosystems), whereby in principle the
  • Fluorescence signals of the cDNA samples to be quantified were compared with the signals of the control plasmid dilutions of known concentration.
  • SybrGreen PCR see manufacturer information (Perkin Elmer).
  • a SybrGreen PCR run contained samples of tubulin control plasmid with 10, 10 3 , 10 4 , 10 and 10 copies / ⁇ l (Perkin Elmer) to determine the standard curve, a negative control without DNA and the cDNA pools to be quantified. All samples were analyzed in triplicate.
  • a PCR with primers was carried out specifically for an intron region of the GAPDH gene (GAPDH insert forward, 200 ng / ⁇ l pos. 1531-1553 from J04038 (SEQ ID NO: 17) ; GAPDH insert reverse, 200 ng / ⁇ l, pos. 1962-1939 from J04038 (SEQ ID NO: 18)).
  • Genomic DNA (6 ng / ⁇ l, Perkin Elmer) served as a positive control.
  • PCR For a 25 ul PCR approach, 1 ul of the cDNA pool or genomic DNA with 2.5 ul lOxTaq buffer (Promega), 1.5 ul MgCl 2 (25 mM, Promega), 0.5 ul dNTPs (10 mM each) , Boehringer Mannheim), 1 ⁇ l primer mixture (20 ⁇ M each), 0.15 ⁇ l Taq polymerase (Promega) mixed in water.
  • the PCR was carried out as follows: 1 ⁇ 94 ° C. for 3 minutes; 30x 94 ° C 30 seconds, 55 ° C 30 seconds, 72 ° C 1 minute; keep at 4 ° C.
  • the PCR was analyzed on a 1.5% agarose gel.
  • the cDNA pools were set to a certain number of copies of household genes. In detail was for everyone Pool the mean of Tubulin and GAPDH copy number formed and adjusted to a value of 2, lxl0 4 copies / ⁇ l by dilution with water. These set cDNAs were used to create the expression profile of B132.
  • the RT-PCR with the primers was carried out in 17 different cDNA pools.
  • the B132 plasmid DNA of the original cDNA fragment served as a positive control.
  • Each 1 ul cDNA was with 2.5 ul Taq buffer (lOx, Promega), 1.5 ul MgCl 2 (25 mM, Promega), 0.5 ul dNTPs (10 mM each, Boehringer Mannheim), 0.5 ul each Primer (20 ⁇ M), 1.25 ⁇ l Taq polymerase (5U / ⁇ l, Promega) and water added to 25 ⁇ l.
  • Samples 1-9 were amplified with 35 cycles, 10-18 with 40 cycles.
  • B132 plasmid DNA of known copy number was used as standard. The results are listed in Tab. 1A and 1B.
  • PCR PCR analysis
  • ISH in situ hybridization
  • TaqMan quantitative PCR
  • PCR PCR analysis
  • ISH in situ hybridization
  • TaqMan quantitative PCR
  • the candidate gene B132 shows strong signals in pooled samples of colon carcinoma, Hodgekin lymphoma, lung adenocarcinoma; Signals in renal cell carcinoma (RCC) are not as strong as in the pools of the tumor samples listed above, but they can be detected consistently in all examined RCC samples (Tab. 1B).
  • RCC renal cell carcinoma
  • the cerebellum, skin, testis and spleen in particular proved to be positive based on PCR, ISH and TaqMan analysis.
  • a B132 transcript may also have to be expected in the bladder.
  • 2A and 2B show the result of this analysis: of 24 normal tissues (pancreas, adrenal medulla, thyroid, adrenal cortex, testes, thymus, small intestine, stomach, brain, heart, skeletal muscle, colon, spleen, kidney, liver, placenta, lungs, leukocytes, tonsils, appendix, lymph nodes, gallbladder, prostate Ovaries)
  • TAA B132 in cell lines and in squamous cell carcinoma of the lungs is good
  • the cloning of the human B132-CDNA was carried out as follows: The rapid-screen cDNA Library Panel: Human Testis Master Plate (OriGene) was screened with the primer pair (SEQ ID NO: 6 and 7) under the following PCR conditions: 35 cycles ( 1 '94 ° C, 1' 59 ° C, 1 '72 ° C). The subplate was ordered for the positive well and also screened under the PCR conditions described above. Bacteria from the positive well were plated and 2x96 colonies were screened.
  • Chromosome X precursor, Acession Number: Q10905 shows.
  • RNA labeling Kit The reagents of Boehringer Mannheim's DIG RNA Labeling Kit were used to label RNA with digoxigenin.
  • the original cDNA fragment from B132 (position number 3756-3978 in SEQ NO ID: 1) was cloned into the vector pBluescript and the plasmid DNA was linearized with the restriction enzyme BamHI or Hindill.
  • the restriction enzyme the synthesis of the RNA was carried out with the T3 or T7 RNA polymerase and thus a sense (negative control) and an antisense RNA probe (for detecting the RNA in the tissue) were produced.
  • probes for in situ hybridization were determined by comparison with a DIG-labeled control RNA via "dot blot".
  • a dilution series of the control RNA was prepared in 1: 5 dilution steps from 100 ng / ⁇ l to 6.4 pg / ⁇ l; the sample was diluted according to the same scheme. 2 ⁇ l of each dilution stage were applied to nylon membrane (Hybond N +), air dried and immobilized on the membrane by UV light.
  • ISH buffer 2 Boehringer Mannheim
  • the membrane was incubated for 30 minutes in a solution of alkaline phosphatase-conjugated anti-DIG antibody diluted 1: 5000 in ISH buffer 2, twice in ISH for 15 minutes Buffer 1 (Boehringer Mannheim) washed and equilibrated in ISH buffer 3 (Boehringer Mannheim) for 2 minutes.
  • the membrane was placed in a solution of 100 ⁇ l NBT / BCIP (Boehringer Mannheim) in 10 ml ISH buffer 1 in the dark and washed in water after sufficient staining. The concentration of labeled RNA in the sample was determined by comparing the color intensity of the control with the sample.
  • Flash frozen tissue samples were made on a cryo-microtome (Jung CM 1800) at -20 ° C freezing sections of 6 ⁇ m thickness and transferred to microscope slides. The sections were air dried at room temperature for 15 minutes and then fixed in DEPC-PBS with 4% paraformaldehyde for 10 minutes. After washing twice in DEPC-PBS for three minutes, the sections were acetylated with stirring for 10 minutes in a solution of 0.5% acetic anhydride and 0.1 M Tris, pH 8. After washing again twice in DEPC-PBS for 3 minutes, dehydration was carried out in an ascending alcohol series (30%, 50%, 75%, three times 96% and chloroform). The sections were edged with a fat pen (DAKO-pen), used directly for hybridization or stored at -70 ° C until use.
  • DAKO-pen fat pen
  • the sections with the chromogenic substrate BCIP / NBT (200 ⁇ l in ISH buffer 3 from Boehringer Mannheim) were kept at 4 ° for up to one week. If the development time was longer, the enzyme substrate was exchanged. After color development was complete, the sections were briefly rinsed in water with hematoxylin
  • FIG. 3 shows the in situ hybridization with B132 antisense (as) and B132 (s) samples in different tissue sections.
  • the s-sample always corresponds to that
  • a and B striped muscle C and D: heart E and F: normal kidney G and H: renal cell carcinoma (RCC) I: RCC 1604, 10-fold magnification J: RCC 1604; 40x magnification
  • Tissues in images A, C, E, G, I and J were hybridized with as-B132 sample; in B, D, F, and H hybridized with s-B132 sample (corresponds to negative control).
  • B132 has two conserved sequence motifs: an N-terminal poly (A) -specific RNA binding motif and a C-terminal 3 * '-5 * ' exonuclease domain.
  • Exonuclease domain was identified by a search against the Pfam database (Bateman et al., 2000) (Pfam-A HMM 00929, E value: 0.076); In addition, a BLAST search (Altschul et al., 1997) provides Bl32 homologs Thermotoga maritima DNA polymerase III (E value: 0.042) which contains a proofreading exonuclease. The poly (A) -specific RNA binding motif was detected by characterizing the poly (A) -binding proteins from Mus musculus and H.
  • 3 '-5' exonucleases have three well-preserved sequence segments, which are referred to as Exol, ExoII and ExoIII and contain five amino acid residues required for the enzymatic activity (Moser et al., 1997). These residues forming the active center can be found in B132 (D134, E136, D234, H293, D298). It is therefore to be expected that it is an active 3 '-5' exonuclease. Proteins that contain 3 '-5' exonuclease domains recognize DNA or RNA substrates and are in DNA replication, repair and recombination or in RNA processing and translation initiation involved. The exonuclease domain in combination with the poly (A) binding motif in B132 suggests mRNA deadenylation as a probable function. The stability and translation competence of the mRNA is controlled via deadenylation.
  • PSI-BLAST search (Altschul et al., 1997) identified PAN2 as a relative of B132. Since PAN2 controls the translation of mRNA substrates, PAN2 was expected to be a target of signal transduction (Sachs & Deardorff, 1992). Indeed, at least two human proteins that contain an exonuclease domain (and no other domains) are hormone-regulated: The expression of ISG20 is induced by interferons (Gongora et al., 1997) and that of HEM45 by estrogen (Pentecost, 1998). These proteins are also found by a PSI-BALST search using B132. HEM45 is also expressed in tumor cell lines (Pentecost, 1998). Other human proteins involved in diseases that contain an exonuclease domain are these
  • Paterson Y Ikonomidis G (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 664-9
  • van Elsas A., van der Minne, CE, Borghi, M., van der Spek, CW, Braakman, E., Osanto, S., and Schrier, PI (1996), CTL Recognition of an IL-2 Producing Melanoma vaccine.
  • Immunology of human melanoma Tumor-host interaction and immunotherapy, edited by M. Maio, Amsterdam: IOS, 1996, p. 165-173
  • van Elsas A., Aarnoudse, C, van der Minne, C.E., van der Spek, C.W., Brouwenstijn, N., Osanto, S., and Schrier, P.I. (1997), J. Immunother. 2_0: 343-353.

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Abstract

Tumorassoziiertes Antigen B132, davon abgeleitete immunogene Peptide und dafür kodierende DNA-Moleküle sowie deren Verwendung in der Immuntherapie von Krebserkrankungen sowie als Zielmolekül für die chemotherapeutische Intervention.

Description

Tumor-assoziiertes Antigen B132
Die Erfindung bezieht sich auf die Immun- und Chemotherapie von Tumorerkrankungen.
Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen zu schützen bzw. diese aktiv zu bekämpfen. Die Bedeutung eines intakten Immunsystems zeigt sich vor allem bei vererbten oder erworbenen Immundefizienzen. Der Einsatz von prophylaktischen Vakzinprogrammen erwies sich in vielen Fällen als äußerst zielführende und erfolgreiche immunologische Intervention im Kampf gegen virale oder bakterielle Infektionserkrankungen. Weiters hat sich gezeigt, dass das Immunsystem auch an der Eliminierung von Tumorzellen maßgeblich beteiligt ist. Dabei spielt die Erkennung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) durch Komponenten des Immunsystems eine wesentliche Rolle. Im weitesten Sinn kann jede (peptidische oder nicht peptidische) Komponente einer Tumorzelle, die von einem Element des Immunsystems erkannt und zur Stimulation einer immunologischen Antwort führt, als immunogenes Tumorantigen fungieren. Besondere Bedeutung kommt dabei jenen Tumorantigenen zu, die nicht nur eine immunologische Reaktion hervorrufen, sondern auch eine Abstoßung des Tumors bewirken. Die Identifizierung definierter Antigene, die solch eine immunologische Reaktion bewirken können, stellt einen wichtigen Schritt für die Entwicklung einer molekular definierten Tumorvakzine dar. Obwohl noch nicht ganz geklärt ist, welche Elemente des Immunsystems für eine Abstoßung des Tumors verantwortlich sind, besteht doch ein Konsens darüber, dass dabei CD8-exprimierende zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) eine Hauptrolle spielen (Coulie, 1997). Besonders bei jenen Tumorarten (z.B. Melanom und Nierenkarzinom) , die eine relativ hohe Spontanremissionsrate aufweisen, konnte eine Korrelation zwischen klinischem Verlauf und dem vermehrten Auftreten von CD8+- und CD4+-T-Zellen festgestellt werden (Schendel et al., 1993; Mackensen et al., 1993; Halliday et al., 1995; Kawakami et al., 1995; Kawakami et al., 1996; Wang, 1997; Celluzzi und Falo, 1998) . Dabei wurden spezifische CTL-Klone entweder aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) oder peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) nach Kokultivierung mit meist autologen Tumorzellen und Zytokinstimulierung in vitro erhalten. Sowohl in Tiermodellen als auch in in vi tro kultivierten humanen Zellkultursystemen konnte die T-Zell-Antwort gegen Tumorzellen durch Transfektion der Tumorzellen mit Zytokinen verstärkt werden (van Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).
Aufgrund der Korrelation zwischen Remission und Beteiligung von CD8+-T-Zellen ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA) , die durch CD8-positive CTLs erkannt werden, ein erklärtes Hauptziel auf dem Weg zur Entwicklung einer Tumorvakzine (Pardoll, 1998; Robbins und Kawakami, 1996) . Ob auch andere Zelltypen des Immunsystems wie z.B. CD4+-T-Helferzellen eine wesentliche Rolle spielen ist noch unklar; einige Studien mit MAGE-3/HLA-A1 Peptiden in Melanompatienten deuten darauf hin (Marchand et al., 1995; Boon et al . , 1998). In den vergangenen Jahren ist eine Reihe von TAAs, die durch CTLs erkannt werden, identifiziert worden (Boon et al., 1994; van den Eynde und van der Bruggen, 1997) .
T-Zellen erkennen Antigene als Peptidfragmente, die an Zelloberflächen von MHC-Molekülen („major histocompatibility complex" , im Menschen „HLA" = „human leukocyte antigen") präsentiert werden. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-I Moleküle kommen auf den meisten Zellen mit Kern vor und präsentieren Peptide (üblicherweise 8-10-mere) , die durch proteolytischen Abbau endogener Proteine entstehen (sog. Antigen-Verarbeitung, „antigen processing" ) . Peptid:MHC-I Komplexe werden von CD8-positiven CTLs erkannt. MHC-II Moleküle kommen nur auf sog. „professionellen antigen-präsentierenden Zellen" (APC) vor, und präsentieren Peptide exogener Proteine, die im Zuge der Endocytose von APC aufgenommen und verarbeitet werden. Peptid:MHC-II Komplexe werden von CD4-Helfer-T- Zellen erkannt. Durch eine Interaktion zwischen T-Zellrezeptor und Peptid:MHC Komplex können verschiedene Effektormechanismen ausgelöst werden, die im Fall von CTLs zur Apoptose der Zielzelle führen. Das geschieht, wenn entweder der MHC (z.B. im Fall der
Transplantatabstoßung) , oder das Peptid (z.B. im Fall intrazellulärer Pathogene) als fremd erkannt wird. Allerdings erfüllen nicht alle präsentierten Peptide die strukturellen und funktioneilen Anforderungen für eine effektive Interaktion mit T-Zellen (wie von
Rammensee et al . , 1995 und weiter unten beschrieben). Für den Einsatz von TAAs in einer Tumorvakzine sind grundsätzlich mehrere Applikationsformen möglich: Das Antigen kann entweder als rekombinantes Protein mit geeigneten Adjuvantien bzw. Trägersystemen, oder als für das Antigen kodierende cDNA in Plasmid- (DNA- Vakzine; Tighe et al., 1998), bzw. viralen Vektoren (Restifo, 1997) appliziert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz von rekombinanten Bakterien (z.B. Listeria, Salmonella) , die das humane Antigen rekombinant exprimieren und durch ihre zusätzlichen Komponenten eine adjuvative Wirkung haben (Paterson, 1996; Pardoll, 1998). In allen diesen Fällen ist eine Verarbeitung und Präsentation des Antigens durch sog. „professionelle antigen-präsentierende Zellen" (APC) notwendig. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz synthetischer Peptide (Melief et al . , 1996) , die den korrespondierenden T-Zell-Epitopen des Antigens entsprechen und die entweder von außen auf die APC geladen (Buschle et al., 1997; Schmidt et al., 1997) oder von den APC aufgenommen und intrazellulär auf die MHC I Moleküle transferiert werden. Die therapeutisch effizienteste Applikationsform für ein definiertes Antigen wird im allgemeinen in klinischen Studien bestimmt. Jüngste klinische Studien über den Einsatz rekombinanter und synthetischer Vakzine bei der Behandlung von Melanomen wurden kürzlich in einem Artikel zusammengefasst und diskutiert (Restifo und Rosenberg, 1999) .
Zu den von den tumorspezifischen CTLs erkannten Antigenen bzw. deren Epitopen zählen Moleküle, die aus sämtlichen Proteinklassen stammen können (z.B. Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren, Enzyme; zur Übersicht siehe Rammensee et al., 1995; Robbins und Kawakami, 1996) . Diese Proteine müssen nicht notwendigerweise an der Zelloberfläche lokalisiert sein, wie dies bei der Erkennung durch Antikörper erforderlich ist. Um für die Erkennung durch CTLs als tumorspezifisches Antigen zu fungieren bzw. um für die Therapie eingesetzt zu werden, müssen die Proteine bestimmte Bedingungen erfüllen: erstens soll das Antigen hauptsächlich von Tumorzellen exprimiert werden und in sog. "kritischen" Normalgeweben nicht oder nur in geringerer Konzentration als in Tumoren vorkommen. Kritische Normalgewebe sind essentielle Gewebe; eine gegen sie gerichtete Immunreaktion könnte unter Umständen schwerwiegende, zum Teil letale Folgen haben. Zweitens soll das Antigen nicht nur im Primärtumor, sondern auch in den Metastasen vorhanden sein. Des weiteren ist es im Hinblick auf eine breite klinische Anwendung des Antigens erstrebenswert, wenn es in mehreren Tumorarten in hoher Konzentration vorhanden ist. Eine weitere Vorbedingung für die Eignung eines TAA als wirksamer Bestandteil einer Vakzine ist das Vorhandensein von T-Zell-Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens; vom TAA abgeleitete Peptide sollen zu einer in vi tro/in vivo T-Zell Antwort führen (" immunogenes" Peptid) . Ein weiteres
Selektionskriterium für ein klinisch breit anwendbares immunogenes Peptid ist die Häufigkeit, mit der das Antigen in einer gegebenen Patientenpopulation anzutreffen ist.
Die immunogenen tumorassoziierten Antigene (TAAs) , von denen größtenteils bereits gezeigt wurde, dass sie T-Zell Epitope besitzen, lassen sich in mehrere Kategorien einteilen, u.a. virale Proteine, mutierte Proteine, überexprimierte Proteine, durch chromosomale Translokation gebildete Fusionsproteine, Differenzierungsantigene, onkofötale Antigene (Van den Eynde und Brichard, 1995; van den Eynde und van der Bruggen, 1997) .
Die Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von TAAs, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung einer Tumorvakzine darstellen, beruhen einerseits auf dem Einsatz von in Patienten bereits induzierten CTLs (zelluläre Immunantwort) oder Antikörpern (humorale Immunantwort) , oder basieren auf der Erstellung differenzieller Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Im ersten Fall, dem immunologischen Ansatz, werden Patienten-CTLs für ein Screening eukaryotischer Tumor-cDNA-Expressionsbibliotheken, die über MHC-I Moleküle die CTL-Epitope präsentieren, eingesetzt (Boon et al., 1994), während mittels hochaffiner Patienten-Antiseren prokaryotische-cDNA- Expressionsbibliotheken, direkt über eine Immunoblot-
Analyse der einzelnen Plaques auf das Vorhandensein von TAAs untersucht werden (Sahin et al., 1995). Eine Kombination von CTL-Reaktivität und proteinchemischen Verfahren stellt die Isolierung von aus MHC-I isolierten Peptiden von Tumorzellen dar, die über
Reaktivität mit Patienten-CTLs vorselektioniert wurden. Die Peptide werden aus dem MHC-I Komplex ausgewaschen und mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert (Falk et al., 1991; Woelfel et al . , 1994; Cox et al., 1994) . Die Ansätze, welche CTLs zum Charakterisieren von Antigenen verwenden, sind aufgrund der erforderlichen Kultivierung und Aktivierung von CTLs mit einem erheblichen Aufwand verbunden bzw. nicht immer erfolgreich.
Methoden zur Identifizierung von TAAs, welche auf dem Vergleich des Transkriptionsprofils von Normal- mit Tumorgewebe beruhen, sind vielfältig; dazu zählen die differenzielle Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken (" representational difference analysis" ; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al . , 1996) und der Einsatz der DNA-Chip Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al . , 1995). Im Gegensatz zur oben erwähnten immunologischen Methode mit Hilfe von Patienten-CTLs muss beim Einsatz von molekularbiologischen Methoden gezeigt werden, dass die damit gefundenen potentiellen Antigenkandidaten tumorspezifisch (tumorassoziiert) sind und tatsächlich T-Zell Epitope besitzen, die eine zytotoxische T-Zell Antwort auslösen können. In zumindest einem Fall (NY-ESO/LAGE-1) wurde ein Antigen sowohl durch die Verwendung von Patientenseren als auch durch RDA identifiziert (Chen et al., 1997; Lethe et al . 1998), außerdem wurden CTL-Epitope dieses Antigens und eine gleichzeitige spontane humorale und T-Zell Antwort in einem Patienten beschrieben (Jager et al., 1998). In weiterer Folge wurde dann mit Hilfe von Melanom- spezifischen T-Zellen ein TAA (CAMEL) identifiziert, das von einem alternativen Leserahmen von LAGE-1 abgeleitet ist (Corlien et al., 1999).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues, bevorzugt von Tumorzellen exprimiertes Protein bereitzustellen, das einerseits aufgrund seiner
Eigenschaft als tumorassoziiertes Antigen (TAA) im Rahmen einer Immuntherapie von Krebs eingesetzt werden kann und welches andererseits ein Zielmolekül für die Intervention mittels chemotherapeutischer Methoden darstellt .
Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA („representational difference analysis" ) zwischen einer Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie (A549) und Normallungengewebe eine cDNA-Substraktionsbibliothek hergestellt wurde. Zur Selektion der im Tumor überexprimierten Antigene wurden anschließend die erhaltenen cDNA-Klone sequenziert und mit in Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei annotierten Genen befanden sich 321 unbekannte, zu denen größtenteils ESTs („expressed sequence tags") -Einträge in der Datenbank existierten. Nach einer weiteren qualitativen PCR-Analyse in cDNA-Bibliotheken von kritischen Normalgeweben und immunprivilegierten Geweben sowie detaillierteren Datenbankrecherchen wurde die Anzahl der Kandidatenklone auf 56 eingeschränkt, deren ESTs nicht aus kritischen Normalgeweben stammen.
Mittels RT-PCR wurde festgestellt, dass drei der 56 untersuchten Klone eine Expression hauptsächlich in verschiedenen Tumorgeweben und keine oder geringe Expression in Normalgeweben aufweisen. Der qualitative Vergleich (mittels PCR) der Expression eines der Klone (B132) zwischen Tumor- und Normalgewebe zeigte eine Überexpression der B132-cDNA in verschiedenen Tumoren. Das mittels Northern Blot analysierte Expressionsprofil zeigte ergänzend, dass B132 in den untersuchten Normalgeweben keine oder nur eine schwache
Transkription aufwies. Die humane B132-cDNA wurde kloniert, die erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO:l dargestellt. Die Sequenzanalyse der klonierten humanen B132-CDNA ergab, dass von Position 160 bis Position 1206 (exklusive Stopcodon) ein durchgehender offener Leserahmen vorliegt, der, auf Nukleotid- und Proteinebene, in den bis dato bekannten Sequenzen der Datenbanken keine Homologie oder Identität aufweist. Aus den aus Northern Blot Experimenten gewonnenen Daten ist zu schließen, dass das B132-Transkript eine Länge von ca. 4,1 kb hat. Der klonierte Bereich der Bl32-cDNA beträgt 4057 bp (exklusive polyA-Region) , wobei das Vorhandensein eines PolyA-Schwanzes am 3 '-Ende der Sequenz für die Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich spricht. Aufgrund der Tatsache, dass im 5 '-Bereich der klonierten cDNA von Position 1 bis 160 kein durchgehender Leserahmen vorhanden ist, kann gefolgert werden, dass es sich bei dem ATG an Position 160 um das Startkodon von B132 handelt.
Zusätzliche Information über die weiter stromaufwärts liegende Sequenz von B132 kann durch molekularbiologische Standardmethoden gewonnen werden, z.B. mittels 5'-RACE („rapid amplification of cDNA ends" ) . Bei dieser Methode wird RNA, vorzugsweise mRNA, aus Zellen oder Geweben, in denen B132 transkribiert wird (z.B. Kolonkarzinom-Gewebe oder von Lungenadenokarzinom abgeleitete Zelllinien wie A549) revers transkribiert und anschließend mit einem Adaptor bekannter Sequenz ligiert. Eine PCR mit einem Adaptorprimer (bindet spezifisch an den Adaptor am
5 '-Ende der cDNA) und einem B132-spezifischen Primer erlaubt die Amplifikation entsprechender B132- Fragmente. Diese PCR-Produkte können, wie in Beispiel 4 beschrieben, nach Standardmethoden kloniert und, insbesondere durch DNA Sequenzierung, charakterisiert werden.
Eine alternative Methode zur Charakterisierung des
5 '-Endes ist das Screenen von cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit für B132 spezifischen DNA-Sonden oder Antiseren.
Führt das Screenen von cDNA-Bibliotheken aufgrund methodisch bedingter Beschränkungen, z.B. ineffiziente reverse Transkription bedingt durch ausgeprägte Sekundärstrukturen der RNA, nicht zum gewünschten Ziel, können genomische Bibliotheken untersucht werden, indem z.B., wie beim Screenen von cDNA-Bibliotheken, durch Hybridisierung mit für B132 spezifischen DNA-Sonden
Klone isoliert werden können, die die stromaufwärts vom erhaltenen 5 '-Ende der cDNA liegende Sequenzinformation z.B. die Promotorregion von B132 enthalten.
Die isolierte cDNA kodiert für das tumorassoziierte Antigen (TAA) bzw. tumorspezifisches Protein der
Bezeichnung B132 mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz (B132) . Die Sequenz von B132 wird definiert durch das Startcodon an Position 160 der isolierten B132-CDNA.
Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B132, mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz.
Die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz kann Abweichungen aufweisen, z.B. solche, die durch Austausch von Aminosäuren bedingt sind, sofern das B132-Derivat die für die Anwendung in einer Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften aufweist .
Die natürliche Aminosäuresequenz von B132 (bzw. entsprechend die Sequenzen der B132-cDNA) kann gegebenenfalls modifiziert sein, indem einzelne Aminosäuren in einem B132 CTL-Epitop ausgetauscht werden, um, im Vergleich zum natürlichen B132 CTL- Epitop, eine Steigerung der Affinität von B132-Peptiden zu MHC-I-Molekülen und damit eine erhöhte Immunogenität und letztlich eine verstärkte Reaktivität gegenüber Tumoren zu bewirken. Modifikationen im Bereich der B132-Epitope können am Bl32-Gesamtprotein (dieses wird von den APCs zu den entsprechenden Peptiden prozessiert) bzw. an größeren Bl32-Proteinfragmenten oder an B132-Peptiden (vgl. unten) vorgenommen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung immunogene Fragmente und Peptide, die von B132 abgeleitet sind. Letztere werden im folgenden als "B132-Peptide" bezeichnet. Eine erste Gruppe sind B132-Peptide, die eine humorale Immunantwort (Induktion von Antikörpern) auslösen. Derartige Peptide sind ausgewählte Abschnitte von B132 (mindestens 12 bis 15 Aminosäuren) , die mittels sogenannter Vorhersage- Algorithmen ("prediction algorithms") wie z.B. dem "surface probability blot" (Emini et al . , 1985), dem "hydrophobicity blot" (Kyte and Doolittle, 1982) und dem "antigenic index" (Jameson and Wolf, 1988) ermittelt werden können. B132-Peptide werden direkt oder in modifizierter Form (z.B. an KLH = "keyhole limpet hemocyanine" gekoppelt) verabreicht und die Bildung von Antikörpern mittels gängiger immunologischer Assays, z.B. mittels ELISA, bestimmt.
Weitere, im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte, B132-Peptide sind diejenigen, die durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort bewirken. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, nämlich MHC-I-Moleküle, die von CD8-positiven CTLs und MHC-II-Moleküle, die von CD4-positiven T-Helferzellen erkannt werden.
Damit ein Peptid eine zelluläre Immunantwort auslöst, muss es an ein MHC-Molekül binden, wobei der zu behandelnde Patient das MHC-Molekül in seinem
Repertoire aufweisen muss. Die Bestimmung des MHC- Subtyps des Patienten stellt somit, im Hinblick auf die Auslösung einer zellulären Immunantwort, eine der wesentlichen Voraussetzungen für die wirksame Anwendung eines Peptids an diesem Patienten dar.
Die Sequenz eines therapeutisch einzusetzenden B132- Peptids wird durch das jeweilige MHC-Molekül hinsichtlich Ankeraminosäuren und Länge vorgegeben. Definierte Ankerpositionen und Länge gewährleisten, dass ein Peptid in die Peptid-Bindungsfurche des jeweiligen MHC-Moleküls des Patienten passt. Dies hat zur Folge, dass das Immunsystem stimuliert wird und eine zelluläre Immunreaktion erzeugt wird, die sich, im Falle der Verwendung eines von einem Tumorantigen abgeleiteten Peptids, gegen die Tumorzellen des Patienten richtet.
Immunogene Bl32-Peptide können nach bekannten Methoden identifiziert werden, eine der Grundlagen dafür ist die Beziehung zwischen MHC-Bindung und CTL-Induktion.
Da also die Sequenz immunogener Peptide aufgrund ihres Peptidbindungsmotivs vorherbestimmbar ist, können Bl32-Peptide, die CTL-Epitope darstellen, aufgrund der Bl32-Proteinsequenz identifiziert und synthetisiert werden. Dazu sind verschiedene Methoden geeignet, die zur Identifizierung von CTL-Epitopen von bekannten Protein-Antigenen verwendet wurden; z.B. die von Stauss et al., 1992, für die Identifizierung von T-Zell- Epitopen in humanem Papillomavirus beschriebene Methode.
Die allelspezifischen Anforderungen jedes MHC-I Allel- Produkts an ein Peptid, das an das MHC-Molekül bindet und von diesem präsentiert wird, wurden als Motiv zusammengefasst (z.B. Falk et al., 1991). Bisher ist eine große Anzahl sowohl von MHC-Peptid-Motiven als auch von MHC-Liganden bekannt. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Suche nach Epitopen eines bekannten Proteins, das in ein bestimmtes MHC-I-Molekül passt, wurde in einem Übersichtsartikel von Rammensee et al., 1995, beschrieben. Sie umfasst die folgenden Schritte: zunächst wird die Protein-Sequenz auf Abschnitte untersucht, die dem Anker-Motiv entsprechen, wobei gewisse Variationen hinsichtlich Peptidlänge und Ankerbesetzung möglich sind. Wenn z.B. ein Motiv ein 9-mer mit Ile oder Leu am Ende vorschreibt, können auch 10-mere mit einem entsprechenden C-Terminus in Betracht gezogen werden, ebenso Peptide mit anderen aliphatischen Resten, wie Val oder Met am C-Terminus. Auf diese Weise wird eine Reihe von Peptid-Kandidaten erhalten. Diese werden auf das Vorhandensein möglichst vieler Ankerreste, die sie gemeinsam mit bereits bekannten Liganden haben, untersucht und/oder daraufhin, ob sie für verschiedene MHC-Moleküle "bevorzugte" Reste haben (entsprechend der Tabelle von Rammensee et al., 1995). Um schwach bindende Peptide auszuschließen, werden zweckmäßig Bindungs-Assays durchgeführt. Wenn die Anforderungen an die Peptid- Bindung für bestimmte MHC-Moleküle bekannt sind, können die Peptid-Kandidaten auch auf Nicht-Ankerreste untersucht werden, die sich negativ oder positiv auf die Bindung auswirken, oder die diese erst ermöglichen (Ruppert et al., 1993). Bei dieser Vorgangsweise ist jedoch in Betracht zu ziehen, dass das Peptid-Bindungs- Motiv für die Suche nach natürlichen Liganden nicht allein ausschlaggebend ist; auch andere Aspekte, z.B. die Enzymspezifität während der Antigenprozessierung, tragen - zusätzlich zur Spezifität der MHC-Bindung - zur Identität des Liganden bei. Eine Methode, die diese Aspekte berücksichtigt, und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von immunogenen Bl32-Peptiden geeignet ist, wurde u.a. von Kawakami et al., 1995, angewendet, um auf der Grundlage bekannter HLA-A*0201 Motive gplOO Epitope zu identifizieren.
Die Peptide können auch im Hinblick auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-II-Moleküle ausgewählt werden. Das MHC-II-Bindungsmotiv, das sich über neun Aminosäuren erstreckt, weist einen höheren Grad an Degeneration in den Ankerpositionen auf als das MHC-I- Bindungsmotiv. Es wurden kürzlich, ausgehend von der Röntgenstrukturanalyse von MHC-II-Molekülen, Methoden entwickelt, die die genaue Analyse der MHC-II- Bindungsmotive, und ausgehend davon, Variationen der Peptidsequenz erlauben (Rammensee et al., 1995, und die dort zitierte Originalliteratur) . Peptide, die an MHC-II-Moleküle binden, werden den CD4-T-Zellen typischerweise von dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen präsentiert. Die CD4-T-Zellen wiederum aktivieren dann in der Folge direkt CTLs durch z.B. Cytokin-Ausschüttung und Verstärken die Effizienz der Antigen-Präsentation durch APC (dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen) .
Seit kurzem sind Datenbanken und Vorhersage-Algorithmen verfügbar, die mit großer Verlässlichkeit die Vorhersage von Peptid-Epitopen erlauben, die an ein bestimmtes MHC-Molekül binden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden, unter Verwendung des von Parker et al., 1994 und Rammensee et al., 1995 beschriebenen Algorithmus, für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, dass sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 2 aufgelistet. Auf ähnliche Weise können, gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Algorithmen, die den unterschiedlichen Charakteristika der Peptide (Hydrophobizität, Ladung, Größe) bzw. Anforderungen an die Peptide, z.B. die 3D-Struktur des HLA-Moleküls, Rechnung tragen, weitere potentielle Peptid-Epitope ermittelt werden; dies gilt auch für Peptid-Epitope anderer HLA-Typen.
Nach Auswahl von B132-Peptid-Kandidaten mit Hilfe der angeführten Methoden wird deren MHC-Bindung mittels Peptidbindungs-Assays getestet. Als nächstes wird die Immunogenität der Peptide mit guten Bindungseigenschaften bestimmt (Stabilität der Peptid- MHC-Wechselwirkung korreliert in den meisten Fällen mit Immunogenität; van der Burg et al., 1996). Um die Immunogenität des ausgewählten Peptids oder Peptid- Äquivalents zu bestimmen, können Methoden, wie z.B. von Sette et al., 1994, beschrieben, in Kombination mit quantitativen MHC-Bindungs-Assays verwendet werden. Alternativ kann die Immunogenität des ausgewählten Peptids über in vi tro CTL-Induktion mittels bekannter Methoden (wie weiter unten für ex vivo CTL-Induktion beschrieben) getestet werden. Das Prinzip der in mehreren Schritten durchgeführten Methode für die Auswahl von Peptiden, die zur Auslösung einer zellulären Immunantwort fähig sind, ist in der WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben. Eine allgemeine
Strategie zum Erhalt effizienter immunogener Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde außerdem von Schweighoffer, 1997, beschrieben.
Statt die Originalpeptide zu verwenden, die in die Bindungsfurche von MHC-I -oder MHC-II-Molekülen passen, also Peptide, die unverändert von B132 abgeleitet sind, können anhand der auf der Grundlage der Originalpeptidsequenz angegebenen Minimalanforderungen bezüglich Ankerpositionen und Länge Variationen vorgenommen werden, sofern durch diese Variationen die effektive Immunogenität des Peptids, die sich zusammensetzt aus seiner Bindungsaffinität an das MHC-Molekül und seiner Fähigkeit, T-Zell-Rezeptoren zu stimulieren, nicht nur nicht beeinträchtigt ist, sondern vorzugsweise verstärkt wird. In diesem Fall werden also künstliche Peptide oder Peptid-Äquivalente verwendet, die entsprechend den Anforderungen der Bindungsfähigkeit an ein MHC-Molekül entworfen sind.
Solchermaßen veränderte Peptide werden als „heteroclitische Peptide" bezeichnet. Sie können nach folgenden Methoden erhalten werden:
Zunächst werden die Epitope von MHC-I- bzw. MHC-II- Liganden bzw. deren Variation z.B. nach dem von Rammensee et al., 1995, beschriebenen Prinzip vorgenommen. Die Länge des Peptids entspricht im Falle seiner Abstimmung auf MHC-I Moleküle vorzugsweise einer
Minimalsequenz von 8 bis 10 Aminosäuren mit den erforderlichen Ankeraminosäuren.
Gegebenenfalls kann das Peptid auch am C- und/oder am N-Terminus verlängert sein, sofern diese Verlängerung die Bindungsfähigkeit an das MHC-Molekül nicht beeinträchtigt bzw. das verlängerte Peptid auf die Minimalsequenz zellulär prozessiert werden kann.
Die modifizierten Peptide werden daraufhin auf ihre Erkennung durch TILs („tumor-infiltrating lymphocytes"), auf CTL-Induktion sowie auf verstärkte MHC-Bindung und Immunogenität geprüft, wie von Parkhurst et al . , 1996, und Becker et al., 1997, beschrieben.
Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Auffindung von Peptiden mit stärkerer Immunogenität als die der natürlichen B132-Peptide besteht im Screenen von Peptid- Bibliotheken mit CTLs, die die natürlich auf Tumoren vorkommenden B132-Peptide erkennen, wie von Blake et al., 1996, beschrieben; in diesem Zusammenhang wird die Verwendung kombinatorischer Peptid-Bibliotheken vorgeschlagen, um Moleküle zu entwerfen, welche von MHC-I-restringierten CTLs erkannte Tumorepitope nachahmen.
Die B132-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder davon abgeleitete immunogene Fragmente oder Peptide können rekombinant oder mittels Peptid-Synthese hergestellt werden, wie in der WO 96/10413 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Für die rekombinante Herstellung wird das entsprechende DNA-Molekül nach Standardmethoden in einen Expressionsvektor eingefügt, in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, der Wirt unter geeigneten Expressionsbedingungen kultiviert und das Protein gereinigt. Für die chemische Synthese von B132-Peptiden können herkömmliche Methoden verwendet werden, z.B. im Handel erhältliche automatische Peptid-Synthesizer.
Alternativ zu natürlichen B132-Peptiden oder heteroclitischen Peptiden können Substanzen, die solche Peptide vortäuschen, z.B. "Peptidomimetica" oder "retro- inverse-Peptide" , verwendet werden. Zur Testung dieser Moleküle im Hinblick auf die therapeutische Verwendbarkeit in einer Tumorvakzine werden dieselben Methoden angewendet wie oben für die natürlichen B132-Peptide oder B132-Peptidäquivalente.
Das TAA der Bezeichnung B132 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z.B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B132- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Nierenzeil-, Lungen-, Kolon- und Mammakarzinom.
Die Immunantwort in Form einer Induktion von CTLs kann in vivo oder ex vivo bewirkt werden.
Für die in vivo Induktion von CTLs wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksame Komponente das TAA B132 bzw. davon abgeleitete Fragmente oder Peptid (e), einem Patienten verabreicht, der an einer mit dem TAA assoziierten Tumorerkrankung leidet, wobei die Menge an TAA (Peptid) ausreichen muss, um eine wirksame CTL-Antwort auf den Antigen-tragenden Tumor zu erzielen.
Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung. Vorzugsweise dient die Zusammensetzung der parenteralen Verabreichung, z.B. für die subkutane, intradermale oder intramuskuläre Anwendung. Die Bl32-TAAs/Peptide sind in einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise wässerigen, Träger gelöst oder suspendiert. Die Zusammensetzung kann außerdem übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, etc. enthalten. Die TAAs/Peptide können allein oder in Kombination mit Adjuvantien, z.B. inkomplettem Freund' s Adjuvans, Saponinen, Aluminiumsalzen oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, Polykationen wie Polyarginin oder Polylysin, verwendet werden. Die Peptide können auch an Komponenten, die die CTL-Induktion oder CTL-Aktivierung unterstützen, gebunden werden, z.B. an T-Helferpeptide, Lipide oder Liposomen, oder sie werden gemeinsam mit diesen Substanzen und/oder gemeinsam mit immunstimulierenden Substanzen, z.B. Zytokinen (IL-2, IFN-γ) verabreicht. Methoden und Formulierungen, die zur Herstellung und Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sind, sind in der WO 95/04542 und WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, beschrieben.
B132 (Fragmente) bzw. B132-Peptide können auch verwendet werden, um eine CTL-Antwort ex vivo auszulösen. Eine ex vivo CTL-Antwort auf einen Tumor, der B132 exprimiert, wird induziert, indem man die CTL-Vorläuferzellen zusammen mit APCs und B132-Peptiden bzw. Bl32-Protein inkubiert. Dann lässt man die aktivierten CTLs expandieren, worauf sie dem Patienten wieder verabreicht werden. Alternativ können APCs mit Bl32-Peptiden beladen werden, was zu einer effizienten Aktivierung zellulärer Immunreaktionen gegen B132 positive Tumoren führen kann (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996). Eine geeignete Methode um Peptide auf Zellen, z.B. dendritische Zellen, zu laden, wird in der WO 97/19169 geoffenbart.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Kombination mehrerer verschiedener Bl32-Peptide oder B132-Peptidäquivalente angewendet. In einer weiteren
Ausführungsform werden B132-Peptide mit von anderen TAAs abgeleiteten Peptiden kombiniert. Die Auswahl von Peptiden für derartige Kombinationen wird im Hinblick auf die Erfassung unterschiedlicher MHC-Typen getroffen, um eine möglichst breite Patientenpopulation abzudecken, und/oder sie wird auf ein möglichst breites Indikationsspektrum abgestellt, indem Peptide mehrerer unterschiedlicher Tumorantigene kombiniert werden. Die Anzahl der Peptide in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann über einen weiten Bereich schwanken, typischerweise enthält eine klinisch anwendbare Vakzine 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10 verschiedene Peptide.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch als diagnostische Reagentien eingesetzt werden.
Beispielsweise können die Peptide dazu benutzt werden, um das Ansprechen eines Patienten auf die durch das immunogene Peptid hervorgerufene humorale oder zelluläre Immunantwort zu testen. Dadurch besteht die Möglichkeit, ein Behandlungsprotokoll zu verbessern. Beispielsweise kann in Abhängigkeit der Darreichungsform (Peptid, Gesamtprotein oder DNA-Vakzine) des TAA die Zunahme von Vorläufer T-Zellen in den PBLs, die eine Reaktivität gegen das definierte Peptidepitop aufweisen, untersucht werden (Robbins und Kawakami, 1996 sowie darin zitierte Referenzen) . Außerdem können die Peptide oder das Gesamtprotein bzw. gegen das TAA gerichtete Antikörper dazu verwendet werden, um das Risiko eines Patienten an einem B132-assoziierten Tumor zu erkranken, vorherzusagen bzw. den Krankheitsverlauf eines B132- positiven Tumors zu charakterisieren (z.B. durch immunhistochemische Analysen von Primärtumor und Metastasen) . Eine derartige Strategie hat sich schon mehrfach als erfolgreich erwiesen, z.B. der Nachweis des Östrogenrezeptors als Entscheidungsgrundlage zur Endokrintherapie bei Brustkrebs; c-erbB-2 als relevanter Marker bei Prognostik und Therapieverlauf bei Brustkrebs (Ravaioli et al., 1998; Revillion et al., 1998); PSMA ( prostate specific membrane antigen") als Marker für Epithelialzellen des Prostatakarzinoms im Serum bzw. durch Einsatz eines nιIn-markierten monoklonalen
Antikörpers gegen PSMA bei der Immunoscintigraphie auf Prostatakarzinom (Murphy et al . , 1998 und inkludierte Referenzen); CEA ("carcinoembryonic antigen") als serologischer Marker für die Prognose und Verlauf bei Patienten des kolorektalen Karzinoms (Jessup und Loda, 1998) .
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt isolierte DNA-Moleküle, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften von B132 oder für Fragmente davon.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Unter „stringenten Bedingungen" wird z.B. verstanden: Inkubation über Nacht bei 65 °C - 68 °C mit 6xSSC (lx SSC = 150 mM NaCl, 15mM Tri-Natriumcitrat) , 5xDenhardt's Lösung, 0.2%SDS, 50 μg/ml Lachsspermien- DNA, daran anschließend Waschen: zweimal 30 min mit 2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C, einmal 30 min mit 0.2xSSC, 0.1% SDS bei 65°C und gegebenenfalls abschließendes Spülen mit O.lxSSC, 0.1%SDS bei 65°C, oder äquivalente Bedingungen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle bzw. Fragmente davon kodieren für (Poly) peptide der Bezeichnung B132 mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide; damit sind DNA Moleküle mitumfasst, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch DNA-Moleküle, die durch konservativen Austausch von Aminosäuren bedingte Abweichungen von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz aufweisen, sofern sie für ein B132-Derivat bzw. Fragmente oder Peptide mit den für die Anwendung als Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften kodieren.
Die B132-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung oder die entsprechenden RNA-Moleküle, die ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden, wie die davon kodierten (Poly) Peptide, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen eingesetzt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden DNA-Moleküle, kodierend für das natürliche B132- Polypeptid bzw. für Fragmente davon verwendet. Alternativ zur natürlichen B132-CDNA bzw. Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein (fragment) bzw. Peptide mit stärkerer
Immunogenität kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Aneinanderreihung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of- beads" ; Toes et al., 1997). Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z.B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewährleisten (Wu et al., 1995) . Beispielsweise kann durch Anfügen einer Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targetting sequence" ) die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenität des Antigens erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekül, das B132-DNA enthält .
Das Bl32-DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung kann, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmid, direkt oder als Bestandteil eines rekombinanten Virus oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf B132-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vivo. Beispiele für die in vivo Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, dass sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene führt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben). Des weiteren können synthetische Träger für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide, Mikrosphären, Mikrokügelchen oder Liposomen für die in vivo Verabreichung von Nukleinsäure-Molekülen, kodierend für Bl32-Peptid verwendet werden. Ähnlich wie für Peptide können verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, mitverabreicht werden, z.B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z.B. Elektroporation, kombiniert werden.
Ein Beispiel für die ex vivo Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting,
1997, beschrieben, oder anderer APCs, die als zelluläre Krebsvakzine zur Anwendung kommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die B132 exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen B132 bzw. Fragmente davon. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.
Monoklonale anti-B132-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem Tiere, insbesondere Mäuse, immunisiert, anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-B132-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al . , 1984, Boulianne et al., 1984) oder humanisiert (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) werden.
Humane monoklonale anti-B132-Antikörper (frag ente) können auch von sog. „Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruif et al . , 1995, Mc Guiness et al., 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.
Die erfindungsgemäßen anti-B132-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von B132-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der B132 exprimiert. Beispiele für solche Substanzen sind zytotoxische Agentien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor vorort zu schädigen. Aufgrund der relativ tumorspezifischen Expression von B132 sind dabei nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von B132-Antikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die B132 exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen. Therapeutische und diagnostische Anwendungen von Antikörpern, die für anti-Bl32-Antikörper in Frage kommen, sind in der WO 95/33771 für beschrieben.
Das TAA der Bezeichnung B132 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B132- positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Nierenzell-, Lungen-, Kolon- und Mammakarzinom.
Es ist bekannt, dass tumorassoziierte Antigene tumorspezifische Mutationen aufweisen können, die zu einer immunologischen Unterscheidung zwischen Tumor und Normalgewebe beitragen (Mandruzzato et al., 1997; Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al.,1995). Um das Vorhandensein tumorspezifischer B132-Mutationen festzustellen, wird, zweckmäßig mit Hilfe von Sonden aus der erfindungsgemäßen isolierten cDNA, die B132-cDNA aus einem oder mehreren unterschiedlichen Tumoren kloniert und die erhaltenen Sequenzen mit Normalgewebs-Bl32-cDNA verglichen. Es ist zu erwarten, dass Tumor-B132-Peptide aus einem gegenüber Normalgewebs-B132 mutierten Sequenzabschnitt im Vergleich zu Normalgewebs-Bl32- Peptiden aus dem entsprechenden Abschnitt eine verstärkte Immunogenität aufweisen. Um zu bestätigen, dass etwaige Mutationen tumorspezifisch sind, können Antikörper gegen diese Bereiche generiert und Tumorzellen auf Expression von möglichen Mutationen untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt B132-Peptide, abgeleitet von Bereichen eines tumorexprimierten B132, die tumorspezifische Mutationen aufweisen.
Neben immuntherapeutischen Ansätzen kommt der gezielten Chemotherapie eine wesentliche Rolle bei der Behandlung von Krebs zu. Unter Chemotherapie versteht man die Verabreichung von Substanzen, die durch Eingriff in Stoffwechsel, Signaltransduktion und Zellteilungsvorgänge maligner Zellen entweder zytostatisch oder zytotoxisch-zytolytisch wirken. Chemotherapeutika werden je nachdem, auf welche Weise sie spezifische Targets in der Tumorzelle beeinflussen, mit welchen zellulären Prozessen sie interagieren und welche Zellzyklusphase sie beeinflussen, in verschiedene Kategorien unterteilt. In Tumorgeweben hochregulierte Gene stellen Angriffspunkte und somit potentielle Zielstrukturen („Targets") für die Chemotherapie dar.
Auf Grund der bevorzugten Expression von B132 in Tumorzellen kann angenommen werden, dass dieses Protein eine wichtige Funktion für den Tumor hat, z.B. für Entstehung, Infiltration und Wachstum und somit ein Target für die chemotherapeutische Intervention darstellt .
Im Hinblick auf seinen Einsatz als Target in der gezielten Chemotherapie wird B132 näher charakterisiert, um die geeignete Strategie für die Intervention mit dieser Funktion zu entwickeln.
Als ersten Schritt bei der sog. „down-stream" Funktionsanalyse von B132 führt man zweckmäßig in einem ersten Schritt eine bioinformatische Analyse durch, die den für die experimentelle Validierung von B132 als Target richtungweisend ist.
Für diese Analyse stellen die auf Ähnlichkeit und modularer Struktur beruhenden Bioinformatik-Konzepte eine wesentliche Grundlage dar. Etablierte bioinformatische Hilfsmittel zur Feststellung von
Ähnlichkeiten sind BLAST
(http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, Altschul et al., 1997) oder FASTA (Pearson & Lipman, 1988), die spezialisierten Datenbanken wie Pfam
(http: //www. sanger. ac.uk/Pfam, Bateman et al . , 2000) und SMART (http: //smart . embl-heidelberg. de, Schultz et al., 2000), welche Domänenstrukturen berücksichtigen. Zur Verfeinerung der Analyse können Applikationen wie Clustal (http: //www2. ebi . ac.uk/clustalw, Higgins et al., 1996) HMMer (http://hmmer.wustl.edu) , PSI-BLAST (Altschul et al., 1997) und die PROSITE Datenbank (http : //www. expasy. ch/prosite, Hofmann et al., 1999) herangezogen werden. Statistische Analysemethoden, die nicht auf Homologien beruhen, gestatten die Vorhersage weiterer Struktur- und funktionsrelevanter Eigenschaften wie der Sekundärstruktur und des Auftretens von Transmembransegmenten und Helix-Turn- Helix-Motiven. Methoden zur Vorhersage der
Sekundärstruktur von Proteinen sind verfügbar; besonders erwähnenswert ist Jpred
(http: //barton. ebi. ac.uk/servers/jpred.html, Cuff et al., 1998). Die Sekundärstrukturvorhersage kann Funktionshypothesen untermauern, etwa wenn die Struktur des vermuteten Homologen bekannt ist.
In weiterer Folge wird B132 einer biochemischen und biologischen Analyse unterworfen.
Die Bioinformatikanalyse von B132 lässt darauf schließen, dass dieses Protein mit
Nukleinsäureinteraktion im Zusammenhang steht. Um die direkte und/oder indirekte Wechselwirkung von B132 mit Nukleinsäuren nachzuweisen, können Methoden wie „mobility shift" , South-Western, UV-crosslinking etc. durchgeführt werden, zu deren Durchführung aus der Literatur bekannte Standardmethoden (z.B. Ausubel et al., 1994) verwendet werden können.
In einem nächsten Schritt wird die Funktion von B132 für das Tumorgeschehen aufgeklärt; z.B. durch Proliferationsassays in vi tro oder in Tiermodellen, die das zu untersuchende B132-Gen überexprimieren (konstitutiv oder induzierbar) und als Kontrolle entweder in deletierter (inaktiver) Form exprimieren oder über Antisense hinunteregulieren (siehe z.B. Grosveld und Kollias, 1992) .
B132kann in Screening-Assays verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität dieses Proteins modulieren, insbesondere inhibieren. In einer Ausführungsform kann ein derartiger Assay z. B. darin bestehen, das B132 Protein, oder ein aktives Fragment davon, in Zellen, die auf die Aktivität von B132 mit Proliferation reagieren, einzubringen bzw. die entsprechende B132 cDNA in der Zelle zur Expression zu bringen, und die Proliferation der Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testsubstanz zu bestimmen.
Ein Beispiel für Testzellen sind Zellen mit niedriger Teilungsrate, z.B. primäre Zellen, die kein endogenes B132 aufweisen. Um die Eignung der Zellen für einen Screening-Assay festzustellen, werden diese mit B132- cDNA transformiert, gezüchtet und mit Standard-Assays, z.B. Thymidin-Einbau, auf ihre Proliferationsfähigkeit getestet. Auf Grund einer nach B132-Expression signifikanten Erhöhung ihrer Proliferationseigenschaft können sie als Testzellen eingesetzt werden, z.B. in High Throughput Screening Proliferations Assays.
Beispiele für Proliferationsassays im High Throughput Format, z.B. auf Grundlage des MTS-Assays, sind in der WO 98/00713 beschrieben.
Substanzen mit proliferationshemmender Wirkung können zur Behandlung von Tumoren mit starker B132-Expression verwendet werden, insbesondere beim Nierenzeil-, Lungen-, Kolon- und Mammakarzinom.
Figurenübersicht :
Fig. 1: RT-PCR-Analyse von verschiedenen Tumoren
Fig. 2A: Northern Blot Analyse verschiedener
Normalgewebe und Tumorzelllinien mit einem cDNA-Fragment von B132
Fig. 2B: Northern Blot Analyse verschiedener
Normalgewebe und des Plattenepithelkarzinoms der Lunge mit einem cDNA-Fragment von B132
Fig. 3: In situ Hybridisierung mit Bl32-Antisense und B132-Sense-Sonden in verschiedenen Gewebsschnitten. Die s-Probe (Sense) entspricht immer der Negativkontrolle.
Beispiel 1
RDA („Representational Difference Analysis" ) von der humanen Adenokarzinomzelllinie der Lunge (A549) und normalem Lungengewebe
Die von ATCC bezogene humane Lungenadenokarzinom- Zellinie A549 (CCL 185) wurde in T150
Zellkulturflaschen hochgezüchtet. Als Nährmedium diente MEM mit 10% hitze-inaktiviertem, fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinisieren 1:5 bis 1:10 zur Propagation gespalten. Nach Erreichen von etwa 80% Konfluenz wurden pro T150 Zellkulturflasche 4 ml einer Trypsinlösung (Angaben pro Liter: 8g NaCl, 0,2g KC1, 1,13g Na2HP04-wasserfrei, 0,2g KH2P04, 100ml 2,5% Trypsinlösung, lg EDTA-Na-Salz; p H7, 2-7, 4) zum Ernten der Zellen eingesetzt. Die 4 ml wurden in ein 15 ml Falconröhrchen transferiert, mit 8 ml PBS versetzt, bei 1200 rp in einer Haereus Tischzentrifuge (Megafuge 2.0R) 5 min bei 4°C zentrifugiert, das Zellpellet mit 1 ml Lysis-Puffer (lOmM TrisHCl pH8, 140mM NaCl, 1,5 m-M MgCl2, 0,5% NP40) versetzt, kräftig geschüttelt und in einem 2 ml Eppendorfgefäß bei 12 000 rpm und 4°C 5 min in einer Sigma Tischzentrifuge (Sigma 202 MK) abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß transferiert und nach Zusatz von 55 μl 20% SDS-Lösung zweimal mit dem doppelten Volumen an einer CHCl3/Phenol (1:1 v/v) Mischung und einmal mit dem einfachen Volumen an CHC13 extrahiert. Die wässrige RNA-enthaltende Phase wurde mit 1/10 Volumen an 3M NaAc (pH5) und dem zweifachen Volumen an 96% EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C die RNA präzipitiert . Ausgehend von 1 mg Gesamt-RNA wurde für die Isolierung von poly-A (+) RNA mittels des PolyATtract Kit (Promega) entsprechend dem Hersteller-Protokoll vergegangen. Die Lagerung der A549 poly-A (+) RNA mit einer Konzentration von 1 mg/ml in DEPC-behandeltem H20 erfolgte in Aliquots bei -80°C.
Zur Durchführung der repräsentativen Differenzanalyse (RDA; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) wurde die poly-A (+) RNA der Lungenadenokarzinom-Zellinie A549 als „tester" , die von normalem Lungengewebe (1 mg/ml; Clontech, Palo Alto; #6524-1) als „driver" eingesetzt. Die RDA wurde unter Verwendung des PCR-select™ kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem Hersteller-Protokoll durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein modifiziertes Primer/Adaptor-2-
Oligonukleotidsystem zum Einsatz kam: Adaptor-2-alt-l (SEQ ID NO: 3) und nested-PCR-primer-2-alt (SEQ ID NO: 4) und Adaptor-2-alt-2 (SEQ ID NO: 5) . Die neu generierten Primer/Adaptor-Sequenzen ermöglichen durch die Anwesenheit von drei neuen
Restriktionsenzymschnittstellen (Kpn I, Sac I und Xho I) in der Sequenz des nested-PCR-primer-2-alt nach Klonierung der subtrahierten cDNA-Fragmente in den pPCRII-Vektor ein nachträgliches Herausschneiden der jeweiligen cDNA-Fragmente . Das Designen einer Primer/Adaptorsequenz mit mehreren verfügbaren Restriktionsenzymschnittstellen war deshalb notwendig, weil besonders in den Primersequenzen - bedingt durch die PCR-Amplifikationsschritte- oft Punktmutationen zu beobachten waren.
Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT wurde die erhaltene cDNA von „tester" und „driver" mit -Rsal verdaut (Rsal ist ein 4-Basen erkennendes Restriktionsenzym und liefert im statistischen Mittel 256 bp lange cDNA-Fragmente) .
Gleiche Teile von „tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren 1 oder 2 ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuss an „driver-cDNA" bei 65 °C hybridisiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter „driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten „tester" -spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR mit für die Adaptoren 1 bzw. 2 spezifischen Primern exponentiell amplifiziert . Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten („nested") Primern unterworfen. Die aus dieser Reaktion resultierenden, exponentiell amplifizierten cDNA-Fragmente wurden direkt in den pCRII-Vektor (Invitrogen; „TA-cloning vector" ) ligiert und anschließend ein Drittel des Ligationsansatzes in kompetente E. coli (OneShot™, Invitrogen) transfiziert,
712 positive Transformanten (Blau-Weiß-Selektion) wurden erhalten und in 96-Napf Blöcken in LB-Amp Medium (1,3 ml pro Napf) für 48 h bei 37°C kultiviert. Pro Napf wurden 750 μl der E. coli Suspensionen für die
Präparation der Plasmid-DNA eingesetzt (96-Napf- Minipräparationsmethode von QIAgen nach Vorschrift des Herstellers) . Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Gycerinstammkulturen bei -80 °C gelagert.
Es wurde eine aus 712 Einzelklonen bestehende cDNA-
Subtraktionsbibliothek erhalten, die sowohl in Form von E. coli Glycerin-Stammkulturen als auch in Form gereinigter Plasmide vorlag.
Beispiel 2
DNA-Sequenzierung und Annotation von TAA-Kandidaten
Die isolierte Plasmid-DNA sämtlicher 712 Klone (siehe Beispiel 1) wurde nach der Sanger-Methode auf einem ABI-Prism Gerät sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels der BioScout-Software (LION, Heidelberg) annotiert und Datenbankvergleichen (Genbank) unterzogen. Von 712 Klonen konnten 678 sequenziert und annotiert werden. Der Rest (34) wies als Insert entweder nur poly(A) Sequenzen auf oder entsprach einem religierten Vektor oder war nicht sequenzierbar. Von den 678 annotierbaren Sequenzen erwiesen sich 357 als Gene mit bekannter Funktion. Die restlichen 321 repräsentierten Klone, kodierend für Gene mit unbekannter Funktion; 59 davon wiesen nicht einmal Einträge in der humanen EST-Datenbank auf. Bekannte Gene wurden nicht weiter behandelt. Für jene unbekannten Gene, für die ein EST-Eintrag verfügbar war, wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurden all jene ESTs mit > 95% Identität (BLAST) , die zur entsprechend experimentell ermittelten Sequenz der Subtraktionsbibliotheken gehörten, überprüft. Bei der Annotation wurde eine Unterteilung in a) kritische Normalgewebe, b) fötale, „verzichtbare" und immunprivilegierte Gewebe und c) Tumore und Tumor-Zellinien vorgenommen. Auf der Basis dieses „virtuellen mRNA-Profils" („virtueller Northern blot") wurden 200 Klone, für die keine ESTs in der Gruppe a) gefunden wurden, für weitere experimentelle Analysen ausgewählt (inklusive der 59 Klone, für die keine EST-Eintragung vorlag) . Zur weiteren Einengung der Kandidatenklone wurden aus den von den 200 ausgewählten Klonen ermittelten Sequenzen Oligonukleotidprimerpaare entworfen und synthetisiert. Es wurden zunächst 8 verschiedene, von humanem Gewebe abgeleitete cDNA-Bibliotheken (GibcoBRL „SUPERSCRIPT™"), welche direktional in pCMV-SPORT kloniert sind, mittels qualitativer PCR auf das Vorhandensein der jeweiligen Kandidaten getestet. Die dabei eingesetzten cDNA-Bibliotheken stammten aus Gewebe von Herz (#10419-018), Leber (#10422-012), Leukozyten (#10421-022), Niere (#10420-016), Lunge (#10424-018), Testis (#10426-013), Gehirn (#10418-010) und fötalem Gehirn (#10662-013) . Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 20 μl Gesamtvolumen pro PCR-Ansatz enthielten lx TaqPol-Puffer (50mM KC1, 10 mM TrisHCl pH9, 0,1% Triton X-100) , 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (Promega), 0,025 U/μl Taq-DNA-Polymerase (Promega), jeweils 5 pM an spezifischen Oligonukleotidprimer (SEQ ID NO: 6 und 7 ) oder (SEQ ID NO: 8 und 9 ) sowie 100 ng der jeweils zu untersuchenden Plasmid-DNA. Zur Kontrolle wurden spezifische Primer für GAPDH (SEQ ID NO: 10 und 11) eingesetzt. Zur Überprüfung des selektiven Nachweises wurden die jeweiligen B132 spezifischen Primerpaare Oligonukleotidprimer (SEQ ID NO: 6und 7 ) und (SEQ ID NO: 8 und 9 ) parallel auch auf das isolierte Plasmid mit dem B132 „original Fragment" hin ausgetestet (ursprünglich isoliertes cDNA-Fragment von B132) . Die Nachweisbarkeit von Fragmenten der zu erwartenden Länge mit starkem Signal in einem der kritischen Normalgewebe (Herz, Leber,
Lunge, Niere und Leukozyten) , nicht jedoch in den cDNA- Bibliotheken aus immunprivilegierten Geweben (Gehirn, fötales Gehirn und Testis) unter diesen PCR-Bedingungen (1 Zyklus: 3' 94°C; 35 Zyklen: 1' 94°C - 1' 55°C - 1' 72°C; 1 Zyklus: 7' 72°C) wurde als
Ausscheidungskriterium definiert. Mittels dieser qualitativen PCR-Analyse konnte die Zahl der Kandidaten auf 56 eingeengt werden; Klon B132 befand sich in dieser bereits vorselektionierten Kandidatengruppe.
Beispiel 3
Analyse des Expressionsprofiles von B132 auf RNA-Ebene mittels qualitativer RT-PCR und quantitativer TaqMan- Analyse.
Die Isolierung der RNA aus Gefriergewebe erfolgte mit Trizol gemäß dem Herstellerprotokoll von Gibco. Zur Entfernung von etwaig kontaminierender DNA wurde die präparierte RNA wie folgt mit DNAase I verdaut: 3 μg Gesamt-RNA wurden mit 20 μl 5x AMV Puffer (Promega) , 1 μl RNasin (Promega) und 2 μl DNase I (Boehringer Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 80 μl 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. 120 μl Phenol : Chloroform :
Isoamylalcohol (25:24:1) wurden zugegeben, auf einem Vortexer gemischt und kurz abzentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen, mit 120 μl Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) versetzt und wie vorher zentrifugiert . Die gereinigte RNA wurde Ethanol-gefällt und in Wasser gelöst.
Anschließend wurde die Gesamt-RNA mit AMV-reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben: Zu 3 μg Gesamt-RNA wurden 1 μl Oligo dT primer (Promega) zugegeben und mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 μl gebracht. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 70 °C wurde die Lösung 5 Minuten bei Zimmertemperatur abgekühlt. 5 μl AMV reaction buffer (5x, Promega), 2,5 μl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 1 μl RNAsin (lOU/μl, Promega), 1,5 μl AMV-RT (10 U/μl, Promega) und 5 μl Wasser wurden hinzugegeben und 1 Stunde bei 42 °C inkubiert und die Reaktion durch 3 Minuten bei 95 °C beendet .
Zur Herstellung eines cDNA-pools eines bestimmten Gewebe oder Tumortyps wurden 3 bis 10 verschiedene Einzelpräparationen von unterschiedlichen Patienten in gleichen Anteilen gemischt.
Zur quantitativen Bestimmung der beiden Haushaltsgene GAPDH und Tubulin in cDNA-Pools wurde wie folgt vorgegangen:
A) GAPDH-TaqMan PCR (Perkin Eimer)
Details über das Prinzip der TaqMan Methode siehe Herstellerinformation (Perkin Eimer) . Ein TaqMan PCR Lauf beinhaltete Proben an GAPDH-Kontrollplasmid mit je 102, 103, 105 und 106 Kopien/μl (Perkin Eimer) zur Bestimmung der Standardkurve, eine Negativkontrolle ohne DNA und die zu quantifizierenden cDNA-Pools. Alle Proben wurden in Triplikaten analysiert. Für einen 25 μl Reaktionsansatz wurden 1 μl cDNA, 2,5 μl lOx Puffer A (Perkin Eimer), 4 μl MgCl2 (25 mM, (Perkin Eimer)), 0,5 μl je Nukleotid (10 mM dATP, dCTP, dGTP; 20 mM dUTP) , 0,125 μl TaqMan Sonde (20 μM; TaqMan Sonde für GAPDH (SEQ ID NO: 12; fluoreszenzmarkiert am 5 ' - Ende mit Tetrachlorfluorescein; am 3 '-Ende mit
Carboxymethylrhodamin) , 1 μl je Primer (je 20 μM, Perkin Eimer GAPDH forward: pos. 1453-1486 von J04038 (SEQ ID NO: 13)); GAPDH reverse: pos. 3764-3741 von J04038 (SEQ ID NO: 14), 0,25 μl AmpErase uracil N-glycosylase „UNG" (1 U/μl, Perkin Eimer), und 0,125 μl AmpliTaq gold (5 U/μl, Perkin Eimer) gemischt, in MicroAmp Optical Tubes (Perkin Eimer) überführt und mit MicroAmp Optical Caps verschlossen. Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus mit 2 Minuten 50°C für die UNG Reaktion, ein Zyklus 10 Minuten 95°C zur Aktivierung der AmpliTaq, 40 Zyklen mit je 15 Sekunden 95° und 1 Minute 60°C. Anschließend wurden die Proben auf 25°C gehalten. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm "Sequence Detection System 1.5bl" (PE Applied Biosystems), wobei im Prinzip die
Fluoreszenzsignale der zu quantifizierenden cDNA-Proben mit den Signalen der Kontrollplasmidverdünnungen bekannter Konzentration verglichen wurden.
B) Tubulin-SybrGreen PCR (Perkin Eimer)
Prinzip der SybrGreen PCR siehe Herstellerinformation (Perkin Eimer) . Ein SybrGreen PCR Lauf beinhaltete Proben an Tubulin-Kontrollplasmid mit je 10 , 103, 104, 10 und 10 Kopien/μl (Perkin Eimer) zur Bestimmung der Standardkurve, eine Negativkontrolle ohne DNA und die zu quantifizierenden cDNA-Pools. Alle Proben wurden in Triplikaten analysiert. Für einen 25 μl Reaktionsansatz wurden 1 μl cDNA, 2,5 μl lOx SybrGreen Puffer (Perkin Eimer), 3,5 μl MgCl2 (25 mM, Perkin Eimer) ), 0,5 μl je Primer (je 20 μM, Perkin Eimer, Tubulin forward (SEQ ID NO: 15 ); Tubulin reverse (SEQ ID NO: 16 ) ) , 0,25 μl AmpErase uracil N-glycosylase „UNG" (1 U/μl, Perkin Eimer), und 0,25 μl AmpliTaq gold (5 U/μl, Perkin Eimer) gemischt, in MicroAmp Optical Tubes (Perkin Eimer) überführt und mit MicroAmp Optical Caps verschlossen. Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus mit 2 Minuten 50 °C für die UNG Reaktion, ein Zyklus 10 Minuten 95°C zur Aktivierung der AmpliTaq, 40 Zyklen mit je 15 Sekunden 95° und 1 Minute 60 °C. Anschließend wurden die Proben auf 25 °C gehalten. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm "Sequence Detection System 1.5bl" (PE Applied Biosystems) , wobei im Prinzip die Fluoreszenzsignale der zu quantifizierenden cDNA-Proben mit den Signalen der Kontrollplasmidverdünnungen bekannter Konzentration verglichen wurden.
Zur Überprüfung auf eine mögliche Kontamination der cDNA-Pools mit genomischer DNA wurde eine PCR mit Primern spezifisch für eine Intronregion des GAPDH- Genes durchgeführt (GAPDH insert forward, 200 ng/μl pos. 1531-1553 von J04038 (SEQ ID NO: 17); GAPDH insert reverse, 200 ng/μl, pos. 1962-1939 von J04038 (SEQ ID NO:18)). Als Positivkontrolle diente genomische DNA (6 ng/μl, Perkin Eimer) .
Für einen 25 μl PCR Ansatz wurden 1 μl des cDNA-Pools bzw. genomische DNA mit 2,5 μl lOxTaq Puffer (Promega), 1,5 μl MgCl2 (25 mM, Promega), 0,5 μl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 1 μl Primermischung (je 20 μM) , 0,15 μl Taq Polymerase (Promega) in Wasser gemischt. Die PCR wurde folgenderweise durchgeführt: lx 94°C 3 Minuten; 30x 94°C 30 Sekunden, 55°C 30 Sekunden, 72°C 1 Minute; auf 4°C halten. Die PCR wurde auf einem 1,5% Agarosegel analysiert.
Um eine gute Vergleichbarkeit der RT-PCR Ergebnisse in verschiedenen Geweben zu gewährleisten, wurden die cDNA-Pools auf eine bestimmte Kopienzahl von Haushaltsgenen eingestellt. Im Detail wurde für jeden Pool der Mittelwert aus Tubulin- und GAPDH-Kopienzahl gebildet und durch Verdünnung mit Wasser auf einen Wert von 2,lxl04 Kopien/μl eingestellt. Diese eingestellten cDNAs wurden zur Erstellung des Expressionsprofiles von B132 verwendet.
Zur Bestimmung des Expressionsprofiles von B132 auf mRNA-Ebene wurde die RT-PCR mit den Primern (SEQ ID NO: 6 und 19) in 17 verschiedenen cDNA-Pools durchgeführt. Als Positivkontrolle diente die B132- Plasmid-DNA des ursprünglichen cDNA Fragments. Je 1 μl cDNA wurde mit 2,5 μl Taq Puffer (lOx, Promega), 1,5 μl MgCl2 (25 mM, Promega), 0,5 μl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 0,5 μl je Primer (20 μM) , 1,25 μl Taq Polymerase (5U/μl, Promega) und Wasser auf 25 μl versetzt. Folgendes PCR Programm wurde durchgeführt: lx 94°C 3 Minuten; 35x 94°C 15 Sekunden, 55°C 30 Sekunden, 72°C 1 Minute; auf 4°C halten. Die PCR- Produkte wurden anschließend auf einem 1.5 % Agarosegel mittels Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen; die RT- PCR-Analyse ist in Fig. 1 sowie (im Vergleich mit anderen Daten) in Tab. 1A und 1B dargestellt:
Fig. 1:
M Größenmarker (Boehringer Mannheim Marker 6) P Plasmidkontrolle mit B132 Insert (cDNA-Fragment) 1, 10 Testis
2, 11 Lungen-Adenokarzinom
3, 12 Lungen-Plattenepithelkarzinom
4, 13 Colonkarzinom
5, 14 Mammakarzinom 6, 15 Nierenzellkarzinom (RCC) 7, 16 Hodgkinlymphom
8, 17 Melanom
9, 18 SW60 (Colonkarzinom-Zelllinie)
Proben 1 - 9 wurden mit 35 Zyklen, 10 - 18 mit 40 Zyklen amplifiziert .
Die quantitative TaqMan-PCR-Analyse von B132 wurde wie für die beiden Haushaltsgene beschrieben durchgeführt; nur mit B132 spezifischen Primern (SEQ ID NO: 6 und 19) (200 ng/μl) und einer B132 spezifischen Sonde (SEQ ID NO: 20; fluoreszenzmarkiert am 5 '-Ende mit Fluorescein, am 3'-Ende mit Carboxymethylrhodamin) (20 μM) . Als Standard wurde B132-Plasmid DNA bekannter Kopienzahl verwendet. Die Ergebnisse sind in Tab. 1A und 1B aufgelistet.
Tab. 1A:
Zusammenfassung der Daten der PCR-Analyse (PCR) , der in situ-Hybridisierung (ISH) und der quantitativen PCR (TaqMan) von B132 in verschiedenen Normalgeweben.
Tab. 1B:
Zusammenfassung der Daten der PCR-Analyse (PCR) , der in situ-Hybridisierung (ISH) und der quantitativen PCR (TaqMan) von B132 in verschiedenen Tumorgeweben.
Fettgedruckte Gewebe kennzeichnen den Einsatz von verschiedenen, gepoolten Gewebsproben; nicht fettgedruckte weisen auf einzelne Gewebsproben hin.
+++ extrem positiv ++ stark positiv + positiv (+) schwach positiv negativ
Freie Kästchen zeigen an, dass der entsprechende Test in dem vorliegendem Fall nicht durchgeführt wurde.
Das Kandidatengen B132 zeigt starke Signale in gepoolten Proben von Kolon-Karzinom, Hodgekin-Lymphom, Lungen-Adenokarzinom; Signale im Nierenzellenkarzinom (RCC) sind zwar nicht so stark wie in den Pools der oben angeführten Tumorproben, dafür aber konstant in allen untersuchten RCC-Proben nachzuweisen (Tab. 1B) . Von den Normalgeweben erweisen sich vor allem Cerebellum, Haut, Testis und Milz aufgrund von PCR- , ISH- und TaqMan-Analyse als positiv. Bezüglich der TaqMan-Daten (nicht aber der PCR-Daten) muss möglicherweise auch in Harnblase mit einem B132 Transkript gerechnet werden.
Im weiteren Verlauf wurde der Kandidat B132 genauer evaluiert .
Beispiel 4
Transkriptionsprofil von B132 in Tumor- und Normalgeweben
Für die Northern Blot Analyse wurden Human Multiple Tissue Northern Blots (Clontech und Invitrogen) mit dem [α-32P]dCTP (NEN, Boston) markierten 209 bp langen B132 PCR Produkt der Primer (SEQ ID NO: 21 und 22 ) bei 68° für 2 h hybridisiert. Die Visualisierung erfolgte durch Standard-Autoradiografie (Hyperfilm, Amersham) . Fig. 2A und Fig. 2B zeigen das Ergebnis dieser Analyse: von 24 Normalgeweben (Pankreas, Adrenal Medulla, Schilddrüse, Adrenal Cortex, Testes, Thymus, Dünndarm, Magen, Hirn, Herz, Skelettmuskel, Kolon, Milz, Niere, Leber, Plazenta, Lunge, Leukozyten, Tonsilen, Appendix, Lymphknoten, Gallenblase, Prostata, Ovarien ) ,
8 Zelllinien (HL-60, HeLa S3, K-562, MOLT-4, Burkitt 's Lymphoma, SW480, A549, G361) und
3 Plattenepithelkarzinomen der Lunge. Für B132 zeigt sich im Tumorgewebe des Plattenepithelkarzinoms der Lunge ein Transkript bei 2,4 kb und eines bei 4,4 kb. In Normalgeweben findet man in Testis ein Transkript von 2,4 kb Länge. Von zwei getesteten normalen Lungengewebsproben zeigt lediglich eine Transkripte bei 2,4 kb und 4,4 kb (Abb. 2B) . Diese Probe stammt allerdings von normalem Lungengewebe eines
Tumorpatienten nahe dem Tumor, bei dem histologisch noch kein Tumorwachstum festgestellt werden kann, das sich aber bereits in einem Übergangsstadium zur Erkrankung (Transformation) befinden kann. Die zweite normale Lungengewebsprobe und alle anderen Normalgewebe zeigen keine Expression dieses Gens. In den Zelllinien HeLa S3, K-562 und MOLT-4 ist ein Transkript von 4,4 kb Länge erkennbar (Abb. 2B) .
Die Präsenz des TAA B132 in Zelllinien und im Plattenepithelkarzinom der Lunge ist in guter
Übereinstimmung mit dem ursprünglich für die RDA eingesetzten Ausgangsmaterial (Zelllinie eines Plattenepithelkarzinoms der Lunge) . Basierend auf dieser Studie entspricht das 4,4 kb Transkript der tumorassoziierten Form von B132. Beispiel 5
Klonierung der B132-CDNA
Zur Klonierung der humanen B132-CDNA wurde wie folgt vorgegangen: Mit dem Primerpaar (SEQ ID NO: 6 und 7 ) wurde das Rapid-Screen cDNA Library Panel : Human Testis Master Plate (OriGene) unter folgenden PCR- Bedingungen gescreent: 35 Zyklen (1' 94°C, 1' 59°C, 1' 72 °C) . Zu dem positiven Napf wurde die Subplatte bestellt und ebenfalls unter den oben beschriebenen PCR-Bedingungen gescreent. Bakterien aus dem positiven Napf wurden ausplattiert und 2x96 Kolonien gescreent.
Es konnten 6 positive Klone identifiziert werden. Die Sequenzierung einiger dieser Klone mit den Primern (SEQ ID NO: 6, 7, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 und 32) ergab eine 4077 nt lange cDNA (SEQ ID NO: 1 ), welche am 3 'Ende zwischen den Basen 3756 und 3978 vollständig mit dem B132 "original" -Fragment überlappt. Sie besitzt einen offenen Leserahmen, welcher für ein 349 AS langes Protein codiert (SEQ ID NO: 2) , das Homologie zu dem C. elegans hypothetical 34,6 kDa protein AH9.2 in
Chromosome X precursor, Acession Number: Q10905 zeigt.
Beispiel 6
In si tu Hybridisierung mit Bl32-Antisense- und B132- Sense-Sonden in verschiedenen Gewebsschnitten
Zur Markierung von RNA mit Digoxigenin wurden die Reagenzien des DIG RNA Labeling Kits von Boehringer Mannheim verwendet. Das ursprüngliche cDNA Fragment von B132 (Positionsnummer 3756 - 3978 in SEQ NO ID: 1) wurde in den Vektor pBluescript kloniert und die Plasmid DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI bzw. Hindill linearisiert . Synthese der RNA wurde je nach Restriktionsenzym mit der T3- bzw. T7-RNA Polymerase durchgeführt und somit eine Sense- (Negativkontrolle) und eine Antisense-RNA-Sonde (zur Detektion der RNA im Gewebe) hergestellt. Im Detail wurden 1 μg Plasmid DNA mit 2 μl NTP-Markierungsmischung (10 mM ATP, 10 mM GTP, 10 mM CTP, 6 M UTP und 3,5 mM DIG-UTP) , 2 μl
Transkriptionspuffer, 1 μl RNase Inhibitor (20U/μl) und 2 μl T3- bzw. T7- RNA Polymerase in einem Endvolumen von 20 μl gemischt und 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die markierte Sonde wurde durch eine Zentrifugation über eine Sephadex G50 Säule aufgereinigt, präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 100 μl DEPC-Wasser gelöst.
Die Markierungseffizienz von Sonden für die in situ Hybridisierung wurde durch Vergleich mit einer DIG- markierten Kontroll-RNA über „dot blot" bestimmt.
Hierfür wurde eine Verdünnungsreihe der Kontroll-RNA in 1:5 Verdünnungsschritten von 100 ng/μl bis 6,4 pg/μl hergestellt; die Probe wurden nach demselben Schema verdünnt. 2μl jeder Verdünnungsstufe wurden auf Nylonmembran (Hybond N+) aufgebracht, luftgetrocknet und durch UV Licht auf der Membran immoblilisiert . Nach einer 30-minütigen Blockierung in ISH Puffer 2 (Boehringer Mannheim) bei Zimmertemperatur, wurde die Membran 30 Minuten lang in einer Lösung aus alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-DIG Antikörper 1:5000 verdünnt in ISH Puffer 2 inkubiert, zweimal je 15 Minuten in ISH Puffer 1 (Boehringer Mannheim) gewaschen und in ISH Puffer 3 (Boehringer Mannheim) 2 Minuten lang equilibriert . Zur Farbentwicklung wurde die Membran in eine Lösung aus 100 μl NBT/BCIP (Boehringer Mannheim) in 10 ml ISH Puffer 1 in der Dunkelheit gegeben und nach ausreichender Färbung in Wasser gewaschen. Durch Vergleichen der Farbintensität der Kontrolle mit der Probe wurde die Konzentration an markierter RNA in der Probe bestimmt.
Aus schockgefrorenen Gewebeproben wurden auf einem Cryo-Microtom (Jung CM 1800) bei -20°C Gefrierschnitte von 6 μm Dicke hergestellt und auf Objektträger überführt. Die Schnitte wurden bei Zimmertemperatur 15 Minuten luftgetrocknet und anschließend 10 Minuten in DEPC-PBS mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach zweimaligem je dreiminütigen Waschen in DEPC-PBS wurden die Schnitte unter Rühren 10 Minuten azetyliert in einer Lösung aus 0,5 % Azetanhydrid und 0,1 M Tris, pH 8. Nach neuerlichem zweimaligen Waschen ä 3 Minuten in DEPC-PBS wurde eine Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30%, 50%, 75%, dreimal 96% und Chloroform) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit einem Fettstift (DAKO-pen) umrandet, direkt zur Hybridisierung eingesetzt oder bis zur Verwendung bei -70°C gelagert.
Kurz vor der Hybridisierung wurden die Schnitte in einer feuchten Kammer (DEPC-Wasser) 30 min bei 52°C re-hydriert. Etwa 100 μl Hybridisierungslösung pro Schnitt wurden vorsichtig auf das Gewebe pipettiert. Sense- und Antisense-Sonden wurden parallel, auf aufeinanderfolgenden Schnitten verwendet. RNA wurde
4 Minuten bei 95°C auf einer Heizplatte denaturiert und anschließend über Nacht in einer feuchten Kammer bei 55°C ohne Deckglas hybridisiert. Die Objektträger wurden kurz in 2x SSC bei Zimmertemperatur gewaschen, zweimal je 10 Minuten in 2x SSC bei 52°C im Schüttelwasserbad und einmal 10 Minuten in lx SSC bei Zimmertemperatur. Nach Spülen in DEPC-Wasser wurden die Schnitte 15 Minuten in Blockierlösung (ISH-Puffer 2 von Boehringer Mannheim, 10% FKS, 3% Ziegenserum) blockiert. Zur Detektion des Digoxigenins wurde ein 1-stündiger Inkubationsschritt mit Anti-DIG Antikörper konjugiert an alkalische Phosphatase 1:500 in Blockierlösung bei Zimmertemperatur durchgeführt. Ungebundene Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen in DEPC-Wasser entfernt. Zur Farbentwicklung wurden die Schnitte mit dem chromogenen Substrat BCIP/NBT (200 μl in ISH-Puffer 3 von Boehringer Mannheim) bei 4° bis zu einer Woche lang aufbewahrt. Bei längerer Entwicklungszeit wurde das Enzymsubstrat getauscht. Nach abgeschlossener Farbentwicklung wurden die Schnitte kurz in Wasser gespült, mit Hämatoxylin
10 Sekunden gegengefärbt, in Leitungswasser gewaschen und mit Deckgläsern, welche mit Entellan Eindeckmedium versehen waren, eingedeckt.
Dabei zeigen z.B. Herzmuskel, gestreifter Muskel und Normalniere (bei Normalniere nur vereinzelte Zellen schwach positiv) kein Signal während die RCC-Gewebsschnitte hoch positiv sind.
Fig. 3 zeigt die in situ Hybridisierung mit B132 antisense (as) und B132 (s) Proben in verschiedenen Gewebsschnitten. Die s-Probe entspricht immer der
Negativkontrolle . A und B: gestreifter Muskel C und D: Herz E und F: Normalniere G und H: Nierenzellkarzinom (RCC) I: RCC 1604, 10-fache Vergrößerung J: RCC 1604; 40-fache Vergrößerung
Gewebe in Bildern A, C, E, G, I und J wurden mit as-B132-Probe hybridisiert; in B, D, F, und H mit s-B132-Probe (entspricht Negativkontrolle) hybridisiert.
Beispiel 8
Potentielle MHC-Bindungspeptide in der kodierenden Region von B132
Potentielle Peptid-Epitope innerhalb der kodierenden Region von B132 gemäß SEQ ID NO: 2 wurden mittels den von Parker et. al., 1994 beschriebenen Algorithmen unter Zugrundelegung bekannter Motive (Rammensee et al. 1995) durchgeführt. Für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-Al, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und
-B*4403, wurden 9-mer Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, dass sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 2 aufgelistet. Durch analoges Vorgehen können weitere potentielle Peptid-Epitope für andere HLA-Typen bzw. 8- und 10-mer Peptide ermittelt werden. Tabelle 2
Immunogene B132-Peρtid-Kandidaten
Beispiel 10
Bioinformatik-Analyse: Mögliche Funktion von B132
B132 weist zwei konservierte Sequenzmotive auf: ein N-terminales Poly (A) -spezifisches RNA-Bindungsmotiv und eine C-terminale 3*' -5*' Exonukleasedomäne . Die
Exonukleasedomäne wurde über eine Suche gegen die Pfam- Datenbank (Bateman et al., 2000) identifiziert (Pfam-A HMM 00929, E-Wert: 0.076); überdies liefert eine BLAST- Suche (Altschul et al . , 1997) nach Bl32-Homologen Thermotoga maritima DNA-Polymerase III (E-Wert: 0.042), die eine Proofreading-Exonuklease enthält. Die Detektion des Poly (A) -spezifischen RNA-Bindungsmotivs erfolgte über eine Charakterisierung der Poly(A)- bindenden Proteine aus Mus musculus und H. sapiens (Blast E-Werte für Homologie zu B132: 0.12 bzw. 0.36) mittels Pfam im Bereich der zu B132 homologen Abschnitte (Pfam-B HMM 9063, Motiv spezifisch für Poly (A) -bindende Proteine, E-Werte: 6'10~37 bzw. 2.9-10"36) .
3' -5' Exonukleasen weisen drei ausgeprägt konservierte Sequenzabschnitte auf, die als Exol, ExoII und ExoIII bezeichnet werden und fünf für die enzymatische Aktivität erforderliche Aminosäurereste enthalten (Moser et al., 1997). Diese das aktive Zentrum bildenden Reste sind in B132 anzutreffen (D134, E136, D234, H293, D298) . Es ist daher zu erwarten, dass es sich um eine aktive 3' -5' Exonuklease handelt. Proteine, die 3' -5' Exonukleasedomänen enthalten, erkennen DNA- oder RNA-Substrate und sind in der DNA Replikation, Reparatur und Rekombination bzw. in der RNA Prozessierung sowie der Translationsinitiation involviert. Die Exonukleasedomäne in Kombination mit dem Poly (A) -Bindungsmotiv in B132 lässt mRNA- Deadenylierung als wahrscheinliche Funktion erwarten. Über Deadenylierung wird die Stabilität und Translationskompetenz der mRNA kontrolliert.
In Saccharomyces cerevisiae sind die Funktionen
Poly (A) -Bindung und Poly (A) -spezifische Exonuklease auf zwei getrennten Proteinen lokalisiert (PAB und PAN2) (Boeck et al., 1996; Sachs & Deardorff, 1992). Eine
PSI-BLAST-Suche (Altschul et al., 1997) identifiziert PAN2 als Verwandten von B132. Da PAN2 die Translation von mRNA-Substraten kontrolliert, wurde erwartet, dass PAN2 seinerseits ein Zielmolekül der Signaltransduktion darstellt (Sachs & Deardorff, 1992) . In der Tat sind zumindest zwei humane Proteine, die eine Exonukleasedomäne (und keine weiteren Domänen) enthalten, hormonreguliert: Die Expression von ISG20 wird durch Interferone (Gongora et al . , 1997) und die von HEM45 durch Östrogen induziert (Pentecost, 1998) . Auch diese Proteine werden von einer PSI-BALST-Suche mit B132 gefunden. HEM45 ist überdies in Tumorzelllinien exprimiert (Pentecost, 1998). Weitere menschliche Proteine, die in Krankheiten involviert sind und eine Exonukleasedomäne enthalten, sind das
Werner-Syndrom-Protein (vorzeitiges Altern) und PM-SCL (Polymyositis-Skleroderma-Autoantigen) (Moser et al., 1997; Mushegian et al., 1997). Literatur
Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J. , Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs . Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997) .
Ausbel, F. M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons, Inc. (1994) .
Bateman, A. , Birney, E., Durbin, R. , Eddy, S. R., Howe, K. L. and Sonnhammer, E. L. The Pfam Protein Families Database. Nucleic Acids Res. 28, 263-266 (2000).
Becker, D., Kuhn, U., Lempertz, U., Enk, A. , Saloga, J. , and Knop, J. (1997), J. Immunol. Methods 203, 171-180.
Blake, J. , Johnston, J.V., Hellström, K.E., Marquardt, H., and, Chen, L. (1996), J. Exp. Med. 184, 121-130.
Boeck, R., Tarun Jr., S., Rieger, M., Deardorff, J. A. , Müller-Auer, S. and Sachs, A. B. The Yeast Pan2 Protein Is Required for Poly (A) -binding Protein- stimulated Poly (A) -nuclease Activity. J. Biol. Che . 271, 432-438 (1996) .
Boon, T, J. C. Cerottini, B. Van den Eynde, P. van der Bruggen, and A. Van Pel (1994), Annu. Rev. Immunol . 12: 337-365 Boon T , (1998) . Tumor antigens recognized by cytolytic T cells. Cancer Vaccine Week - Interantional Symposium, New York, Oct 1998; abstract SOI
Bork, P. et al . (1992). What ' s in a genome? Nature 358: 287.
Bork, P. and Koonin, E. V. (1998) . Predicting functions from protein sequences - where are the bottlenecks? Nature Genetics _18: 313-318.
Boulianne, G. L., et al . , (1984), Nature 312: 643-646
Brüggemann, M. und Neuberger, M.S., (1996), Immunol. Today 17: 391-397
Buschle M, Schmidt W, Zauner W, Mechtler K, Trska B, Kirlappos H, Birnstiel M (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94:3256-3261
Celluzzi, CM and Falo, LD, Jr. (1998), J. Immunol. 160: 3081-3085
Chen, Y.T., Scanlan, M.J., Sahin, U., Tureci, 0., Gure, A.O., Tsang, S., Williamson, B., Stockert, E., Pfreundschuh, M., and Old, L.J. (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 94, 1914-1918.
Cuff, J. A., Clamp, M. E., Siddiqui, A. S., Finlay, M. and Barton, G. J. Jpred: a consensus secondary strueture prediction Server. Bioinformatics 14, 892- 893 (1998) .
Corlien, A.A., van den Doel, PB, Heemskerk, B., and Schrier, P. (1999), Int. J. Cancer 82: 442-448 Coulie, P.G. (1997), Mol. Med. Today 3: 261-268
Cox, AL, Skipper, J, Chen, Y, Henderson, RA, Darrow, TL, Shabanowitz, J, Engelhard, VH, Hunt, DF, and Slingluff, CL, Jr. (1994), Science 264: 716-719
Diatchenko, L., Lau, Y.F., Campbell, A.P., Chenchik, A. , Moqadam, F., Huang, B. , Lukyanov, S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E.D., and Siebert, P.D. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93, 6025- 6030.
Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A. , Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K., Jackson, V., Hamada, H., Pardoll, D. , and Mulligan, R. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 90: 3539-3543.
Eddy, S. R. Hidden Markov modeis. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 361-365 (1996).
Emini, EA, Hughes, J, Perlow, D, and Boger, J (1985), J. Virol. 55: 836-839
Falk, K., Rötzschke, 0., Stevanovi'c, S., Jung, G., and Rammensee, H-G (1991), Nature 351: 290-296.
Fearon, E.R., Pardoll, D.M., Itaya, T., Golumbek, P., Levitsky, H.I., Simons, J.W. , Karasuyama, H., Vogelstein, B., and Frost, P. (1990), Cell 60: 397-403.
Gansbacher, B., Zier, K. , Daniels, B., Cronin, K., Bannerji, R. , and Gilboa, E. (1990), J. Exp. Med. 172: 1217-1224. Gaudi C, Kremer F, Angevin E, Scott V, Triebel F (1999), J Immunol 162:1730-1738
Gongora, C, David G., Pintard, L., Tissot C, Hua, T. D., Dejean, A. and Mechti, N. Molecular Cloning of a New Interferon-induced PML Nuclear Body-associated Protein. J. Biol. Chem. 272, 19457-19463 (1997).
Graziano, R.F., et al., (1995), J. Immunol. 155: 4996-5002
Griffiths, A.D., et al . , (1994), EMBO J. 13: 3245-3260
Grosveld, F. and Kollias, G. Transgenic Animals, Academic Press (1992)
Halliday, GM, Patel, A, Hunt, MJ, Tefany, FJ, and Barnetson RS (1995), World J. Surg. 19: 352-358
Higgins, D. G., Thompson, J. D. and Gibson, T. J. Using CLUSTAL for Multiple Sequence Alignments. Methods Enzymol. 266, 383-402 (1996).
Hogan KT, Eisinger DP, Cupp SBC, Lekstrom KJ, Deacon DD, Shabanowitz J, Hunt DF, Engelhard VH, Slingluff CL, Ross MM (1998), Cancer Res 58:5144-5150
Hofmann, K. , Buchner, P., Falquet, L. and Bairoch, A. The PROSITE database, its status in 1999. Nucleic Acids Res. 27, 215-219 (1999). Hubank, M. and Schatz, D.G., (1994), Nucleic. Acids. Res. 22, 5640-5648.
Jager, E., Chen, Y.T., Drijfhout, J.W., Karbach, J. , Ringhoffer, M., Jager, D., Arand, M. , Wada, H., Noguchi, Y., Stockert, E., Old, L.J., and Knuth, A. (1998), J. Exp. Med. 187, 265-270.
Jakobovits, A. , (1995), Curr. Opin. Biotechnol . 6: 561-566
Jameson, BA and Wolf, H (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants . Comput . Appl . Biosci. 4_: 181-186
Jessup, JM and Loda, M (1998) Prognostic markers in rectal carcinoma. Semin. Surg. Oncol. 15_: 131-140.
Kaghad, M. et al., (1997). Monoallelically expressed gene related to p53 at lp36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. Cell 90: 809-819.
Kastan , M. B. (ed.) „Genetic Instability and
Tumorigenesis" in Curr. Top. Microbiol. Immunol. 221 (1997)
Kawakami, Y., Eliyahu, S., Jennings, C, Sakaguchi, K. , King, X., Southwood, S., Robbins, P.F., Sette, A. , Appella, E., and Rosenberg, S.A. (1995), J. Immunol. 154: 3961-3968.
Kawakami, Y, Robbins, PF, and Rosenberg, SA (1996) , Keio J. Med. 45: 100-108
Köhler, G. und Milstein, C. (1975), Nature 265, 495-497 Koonin, E. V., Bork, P., and Sander, C. (1994). Yeast chromosome III: New gene functions. EMBO J. _13: 493- 503.
Kruif, J., et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 3938-3942
Kyte, J and Doolittle, RF (1982), J. Mol. Biol. 157: 105-132
Lethe, B, Lucas, S, Michaux, L, De Smet, C, Godelaine, D, Serrano, A, De Plaen, E, and Boon, T (1998), Int. J. Cancer 76: 903-908
Mackensen A, Ferradini L, Carcelain G, Triebel F, Faure F, Viel S, and Hercend T (1993), Cancer Res. 53: 3569-3573
Madej, T., Boguski, M.S., and Bryant, S.H. (1995). Threading analysis suggests that the obese gene produet may be a helical cytokine. FEBS Lett . 373 : 13-18
Mandruzzato S, Brasseur F, Andry G, Boon T, van der Bruggen P (1997) , J Exp Med 186:785-793
Marchand M, Weynants P, Rankin E et al (1995), Int. J. Cancer 63:883-885
Mayordomo, J.I., Zorina, T., Storkus, W.J., Zitvogel, L., Celluzzi, C, Falo, L.D., Melief, C.J., Ildstad, S.T., Käst, W.M., DeLeo, A.B., and Lotze, M.T. (1995), Nature Medicine 1, 1297-1302.
McGuinnes, B.T., et al . , (1996), Nature Biotechnol. 14, 1149 Melief CJ, Offringa R, Toes RE, Käst WM (1996), Curr. Opin. Immunol. _8: 651-657
Murphy, G.P., Elga al, A.A., Su, S.L., Bostwick, D.G., and Holmes, E.H. (1998), Cancer 83, 2259-2269
Neuberger, M.S., et al . , (1984), Nature 312: 604-608
Pardoll, D. M. (1998) Nature Medcine 4: 525-531
Parker, K. C, M. A. Bednarek, and J. E. Coligan. (1994), J. Immunol. 152:163.
Parkhurst, M.R., Salgaller, M.L., Southwood, S., Robbins, P.F., Sette, A. , Rosenberg, S.A., and
Kawakami, Y. (1996), J. Immunol. 157, 2539-2548.
Paterson Y, Ikonomidis G (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 664-9
Pearson, W. R. and Lipman, D. J. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 2444-2448 (1988).
Pusztai, L., Lewis, C. E., and Yap, E. (eds.) „Cell Proliferation in Cancer" Oxford University Press (1996) .
Rammensee HG, Friede T, Stevanovic S (1995), Immunogenetics 41 : 178-228
Rapellino, M, Pecchio, F, Baldi, S, Scappaticci, E, and Cavallo, A (1995), Anticancer Res. 15: 1065-1070 Ravaioli, A. , Bagli, L., Zucchini, A. , and Monti, F. (1998), Cell. Prolif. 31, 113-126
Revillion, F, Bonneterre, J, and Peyrat, JP (1998), Eur. J. Cancer 34: 791-808
Restifo NP (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 658-63
Restifo, NP and Rosenberg, SA (1999), Curr. Opin. Oncol. 11: 50-57
Riechmann, L., et al . , (1988), Nature 332: 323-327
Robbins, PF and Kawakami, Y (1996), Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636
Ruppert, J. , Sidney, J. , Celis, E., Kubo, R.T., Grey, H.M., and Sette, A. (1993), Cell 74 929-937.
Sahin, U., Türeci, Ö., Schmitt, H., Cochlovius, B., Johannes, T., Schmits, R. , Stenner, F., Luo, G. , Schobert, I., and Pfreundschuh, M. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92, 11810-11813
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989
Schendel DJ, Gansbacher B, Oberneder R, Kriegmair M,
Hofstetter A, Riethmuller G, and Segurado OG (1993), J. Immunol. 151: 4209-4220
Schmale, H. and Bamberger, C. (1997) . A novel protein with strong homology to the tumor supressor p53. Oncogene 15: 1363-1367 Schmidt W, Buschle M, Zauner W, Kirlappos H, Meehtler K, Trska B, Birnstiel M (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 94:3262-3267
Schultz, J., Ponting, C. P., Hofmann, K. , and Bork, P. (1997) . SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation. Prot . Sei. _6: 249-253
Schultz, J. , Copley, R. R. , Doerks, T., Ponting, C. P. and Bork, P. SMART: A Web-based tool for the study of genetically mobile domains . Nucleic Acids Res. 28, 231-234 (2000) .
Schweighoffer, T. (1997), One. Res. 3, 164-176
Seeber, S. and Schütte, J. (Hrsg.) „Therapiekonzepte Onkologie" Springer Verlag 1998
Sharp, P.M. and Lloyd, A. T. (1993) . Regional base composition Variation along yeast chromosome III: Evolution of chromosome primary strueture. Nucleic Acids Res. 21: 179-183.
Sette, A. , Vitiello, A. , Reherman, B., Fowler, P. , Nayersina, R. , Käst, W.M., Melief, C.J.M., Oseroff, C, Yuan, L., Ruppert, J. , Sidney, J. , del Guercio, M.-F., Southwood, S., Kubo, R.T., Chesmut, R.W., Grey, H.M., and Chisari, F.V. (1994), J. Immunol. 153, 5586-5592.
Stauss, H.J., Davies, H., Sadovnikova, E., Chain, B., Horowitz, N., and Sinclair, C. (1992), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 89, 7871-7875. Su, J. Y. and Maller, J. L. Cloning and expression of a Xenopus gene that prevents mitotic catastrophe fission in yeast. Mol. Gen. Genet . 246, 387-396 (1995) .
Tepper, R.I., Pattengale, P.K., and Leder, P. (1989), Cell 57: 503-512.
Tighe H, Corr, M, Roman M, and Raz E (1998), Immunol. Today 19:89-97
Toes, R.E., Hoeben, R.C., Van der Voort, E., Ressing, M.E., Van-der-Eb, A.J. Melief, C.J.M., and Offringa, R. (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94 (26) : 14660-14665
Tuting, T., DeLeo, A.B., Lotze, M.T., and Storkus, W.J., (1997), Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707,.
Van den Eynde, B. and Brichard, V.G. (1995), Curr. Opin. Immunol. 7_, 674-681.
Van den Eynde, BJ, and van der Bruggen, P (1997), Curr. Opin. Immunol. 9:684-693
van der Bruggen, P., C. Traversari, P. Chomez, C. Lurquin, E. De Plaen, B. Van den Eynde, A. Knuth, and T. Boon. (1991, Science 254:1643-1647
van der Burg, S.H., et al . , (1996), J. Immunol. 156, 3308-3314
van Elsas, A. , van der Minne, C.E., Borghi, M., van der Spek, C.W., Braakman, E., Osanto, S., and Schrier, P.I. (1996), CTL Recognition of an IL-2 Producing Melanoma Vaccine. In: Immunology of human melanoma. Tumor-host interaction and immunotherapy, edited by M. Maio, Amsterdam: IOS, 1996, p. 165-173
van Elsas, A. , Aarnoudse, C, van der Minne, C.E., van der Spek, C.W., Brouwenstijn, N., Osanto, S., and Schrier, P.I. (1997), J. Immunother. 2_0: 343-353.
Vaughan, T.J., et al., (1998), Nature Biotechnol. 16, 535-539
Veleuleseu, VE, Zhang, L, Vogelstein, B, and Kinzler, KW (1995), Science 270: 484-487
Wang, L. , et al., (1997), Mol. Immunol. 34: 609-618
Wang, RF (1997), Mol. Med. 3: 716-731
Wax, S.D., Rosenfield, C.L., and Taubman, M.B., (1994), J. Biol. Chem. 269_, 13041-13047.
Wax, S.D., Tsao, L., Lieb, M.E., Fallon, J.T., and Taubman, M.B. (1996), Lab. Invest. 74, 797-808.
Winter, G. , et al., (1994), Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455
Woelfel, T, Schneider, J, Zum Buschenfelde, Meyer, KH, Rammensee, HG, Rotzschke, 0, and Falk, K (1994), Int. J. Cancer 57: 413-418
Wu, T.C., Guarnieri, F.G., Staveley-0 ' Carroll, K.F., Viscidi, R.P., Levitsky, H.I., Hedrick, L., Cho, K.R., August, J.T., and Pardoll, D.M. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92(25): 11671-11675. Zhang, Y. et al. (1994) . Positional cloning of the mouse obese gene and its human momologue. Nature 372 : 425-432.
Zitvogel, L., Mayordomo, J.I., Tjandrawan, T., DeLeo, A.B., Clarke, M.R., Lotze, M.T., and Storkus, W.J. (1996), J. Exp. Med. 183, 87-97.

Claims

Patentansprüche
1. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B132, mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz .
2. Immunogenes Proteinfragment oder Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von einem in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigen abgeleitet ist .
3. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 1 oder 2, das eine humorale Immunantwort auslöst.
4. Immunogenes (Poly) peptid nach Anspruch 1 oder 2, das bzw. dessen Abbauprodukte durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.
5. Immunogenes Peptid nach Anspruch 4, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 33 - 113.
6. Immunogenes (Poly) peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Immuntherapie von Krebserkrankungen in vivo oder ex vivo, wobei das (Poly) peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die B132 exprimieren.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente ein oder mehrere immunogene (Poly) peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie verschiedene von B132 abgeleitete immunogene Peptide enthält.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere von B132 abgeleitete Peptide in Mischung mit von anderen tumorassoziierten Antigenen abgeleiteten Peptiden enthält.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide an mindestens zwei verschiedene HLA-Typen binden.
11. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften eines in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigens oder für Fragmente davon.
12. DNA-Molekül nach Anspruch 12, kodierend für ein immunogenes Polypeptid der Bezeichnung B132 mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide.
13. DNA-Molekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz ist oder mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO:l dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
14. Reko binantes DNA-Molekül, enthaltend ein DNA- Molekül gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13.
15. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 11 bis 14, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen, wobei das von dem DNA-Molekül exprimierte B132-
( Poly) peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die B132 exprimieren.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksamen Bestandteil ein oder mehrere der in einem der Ansprüche 11 bis 15 definierten DNA- Moleküle.
17. Verwendung von Zellen, die das in Anspruch 1 definierte tumorassoziierte Antigen exprimieren, für die Herstellung einer Krebsvakzine.
18. Antikörper gegen ein in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiertes (Poly) peptid.
19. Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er monoklonal ist.
20. Antikörper nach Anspruch 18 oder 19 für die
Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von B132 assoziiert sind.
21. Verfahren zur Identifizierung einer Substanz mit proliferationshemmender Wirkung auf Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, dass man das B132 Protein, oder ein aktives Fragment davon, in Zellen, die auf die Aktivität von B132 mit Proliferation reagieren, einbringt bzw. die entsprechende B132 cDNA in der Zelle zur Expression bringt, und die Proliferation der Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit der Testsubstanz bestimmt.
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